synthese von industriell relevanten alkohol-, keton- und ...svenja... · synthese von industriell...
TRANSCRIPT
Synthese von industriell relevanten
Alkohol-, Keton- und Lacton-Verbindungen
durch Redoxreaktionen mit
Biokatalysatoren
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Svenja Staudt
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung: 12. August 2014
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth
Gutachter: Prof. Dr. Harald Gröger
apl. Prof. Dr. Norbert Jux
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie des Departments Chemie und
Pharmazie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg unter Leitung von Prof. Dr. Harald
Gröger in der Zeit von März 2010 bis September 2013 erstellt.
Veröffentlichungen
Teile dieser Arbeit sind bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht:
S. Staudt, C. A. Müller, J. Marienhagen, C. Böing, S. Buchholz, U. Schwaneberg, H. Gröger
“Biocatalytic hydroxylation of n-butane with in situ cofactor regeneration at low temperature and
under normal pressure”
Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 186-191.
S. Staudt, E. Burda, C. Giese, C. A. Müller, J. Marienhagen, U. Schwaneberg, W. Hummel, K. Drauz,
H. Gröger
„Direktoxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen mit Sauerstoff in Wasser“
Angew. Chem. 2013, 125, 2415-2419, Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2359-2363.
S. Staudt, U. T. Bornscheuer, U. Menyes, W. Hummel, H. Gröger
“Direct biocatalytic one-pot-transformation of cyclohexanol with molecular oxygen into ε-capro-
lactone”
Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 288-293.
C. A. Müller, B. Akkapurathu, S. Staudt, W. Hummel, H. Gröger, U. Schwaneberg
“In vitro double-oxidation of n-heptane with direct co-factor regeneration”
Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 1787-1798.
Poster:
S. Staudt, C. A. Müller, J. Marienhagen, C. Böing, S. Buchholz, U. Schwaneberg, H. Gröger
“Biocatalytic hydroxylation of n-butane with in situ cofactor regeneration at low temperature and
under normal pressure”
Biotrans 2011, 02. Oktober - 06. Oktober 2011, Giardini Naxos (Messina), Sizilien, Italien.
Danksagung
Ich möchte mich in erster Linie bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Harald Gröger für die
intensive und sehr kompetente Betreuung, seine große fachliche Unterstützung, sein Verständnis
und sein stetiges Interesse an meiner Forschungsarbeit während meiner Promotion danken.
Desweiteren danke ich der „Deutschen Bundesstiftung Umwelt“ für die großzügige Förderung des
Verbundprojekts „Nachhaltige, biokatalytische Oxidationsprozesse“ (AZ-13234-32) sowie allen
Kooperationspartnern dieses Projekts.
Vor allem danke ich Herrn Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg von Institut für Biotechnologie von der
Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen, Herrn Prof. Dr. Werner Hummel vom
Institut für Molekulare Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf und der Firma
Enzymicals AG aus Greifswald für die Bereitstellung der Enzyme. Ganz besonders danke ich hierbei
Dr. Christina Müller, die zur gleichen Zeit Ihre Promotion unter der Leitung von Prof. Dr. Ulrich
Schwaneberg anfertigte. Sie stellte die verschiedenen P450-Monooxygenasen aus Bacillus
megaterium her, die meiner Arbeit zur Verfügung standen und betreute mich äußerst sympathisch
während des Forschungsaufenthalts in der Biotechnologie der RWTH Aachen.
Ich danke der Evonik Oxeno GmbH für die großzügige Hochschulspende in Form des gasförmigen
n-Butans und das Ermöglichen eines Forschungsaufenthalts im Industriepark Marl.
Mein Dank gilt allen derzeitigen und ehemaligen Labor- und Arbeitskollegen Dr. Sabine Simon,
Carolin Giese, Sonja Borchert, Dr. Giuseppe Rulli, Jürgen Wittmann, Marcel Heidlindemann,
Dr. Marina Krausser, Dr. Maria Alfaro Blasco, Dr. Philipp Böhm, Richard Metzner, Wilko Greschner,
Tina Ress, Dr. Edyta Burda, Dr. Friedrich Dietz, Dr. Markus Weiß, Tobias Huber, Dr. Stefan Huber,
Anna Reimann, Katharina Tenbrink, Ingo Schnapperelle, Xenia Kostrov, Oliver Pham für die große
Hilfsbereitschaft und die positive Laboratmosphäre.
Ganz besonders möchte ich mich bei Carolin, Bine und Sonja bedanken, die mir auch außerhalb des
Laboralltags sehr ans Herz gewachsen sind und die mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen.
Ich möchte mich ganz herzlich bei den Angestellten des technischen Bereichs des Instituts der
Organischen Chemie der FAU Erlangen-Nürnberg für die Unterstützung im Laboralltag bedanken.
Mein Dank gilt hierbei Wilfried Schätzke, Christian Placht und Dr. Harald Maid (NMR-Spektroskopie),
Hannelore Oschmann, Detlef Schagen und Robert Panzer (Chemikalienausgabe), Erwin Schreier,
Eberhard Ruprecht und Horst Mayer (Mechanische Werkstatt), Holger Wohlfahrt (Elektriker), Stefan
Danksagung
Fronius und Bahram Saberi (Glasbläserei), Wolfgang Donaubauer und Margarete Dzialach
(Massenspektroskopie) und Eva Hergenröder (Elementaranalyse).
Ich möchte mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Jürgen Schatz und Dr. Michael Brettreich für die
Unterstützung in der Lehrtätigkeit bedanken.
Mein großer Dank gilt Dr. Marcus Speck, Dr. Frank Hampel und den Sekretärinnen Frau Erna Erhard,
Frau Christiane Brandl-Rittel, Frau Heike Fischer und Frau Pamela Hampel für die freundliche
Unterstützung in Verwaltungsangelegenheiten.
Vielen Dank an Steffi, André, Moni, Stephan, Steff, Lisa, Katrin, Jeannette, Simone, Birgit und Nina für
Eure tolle Freundschaft, die wunderbare Unterstützung und die schönen Stunden, die wir zusammen
verbracht haben.
Ich danke von ganzem Herzen meinem Papa, Gudrun, Christa und Gerd für den moralischen Beistand
und ein jederzeit offenes Ohr.
Und zuletzt und von ganzem Herzen möchte ich meiner Mama und meinem Lebensgefährten
Stephan für die immerwährende moralische Unterstützung, die Geduld, das Verständnis und den
Beistand danken.
I Inhaltsverzeichnis
I
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... I
II Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII
III Tabellenverzeichnis ............................................................................................... XVIII
IV Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XXIII
1. Einleitung ................................................................................................................................. 1
2. Motivation und Zielsetzung....................................................................................................... 4
2.1 Enzymatische Oxidation von aliphatischen und cyclischen Alkanen zur Synthese der
entsprechenden Alkohole .................................................................................................................... 5
2.2 Enzymatische Doppeloxidation von cyclischen Alkanen zur Synthese der entsprechenden
Ketone und enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von ε-Caprolacton ....... 6
2.3 Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols durch die Kombination der Palladium-
katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit enzymatischer Reduktion .................................................... 8
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als
Katalysatoren ............................................................................................................................... 9
3.1 Einleitung ...................................................................................................................................... 9
3.2 Stand der Wissenschaft ................................................................................................................ 9
3.2.1 Aufbau der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (BM-3) ....................................... 9
3.2.2 Mechanismus der P450-Monooxygenase-katalysierten Reaktionen ...................................... 11
3.2.3 Natürliche Substrate und Eigenschaften der P450-Monooxygenase BM-3 ............................ 12
3.2.4 Oxidationsreaktionen .............................................................................................................. 13
3.2.5 Optimierung der P450-Monooxygenase BM-3 durch Mutation ............................................. 14
3.2.6 Hydroxylierung von gasförmigen n-Alkanen ........................................................................... 16
3.2.7 Syntheseanwendungen der P450-Monooxygenasen .............................................................. 17
3.2.7.1 Hydroxylierung von Alkanen, Cycloalkanen und Fettsäuren................................................ 17
3.2.7.2 Anwendung als Katalysator in der Steroid-Synthese ........................................................... 18
3.2.7.3 Epoxidierung von Alkenen und Aromaten ........................................................................... 20
I Inhaltsverzeichnis
II
3.2.7.4 Einsatz der P450-Monooxygenase bei der chemoenzymatischen Fluorierung von inaktiven
organischen Substanzen ..................................................................................................................... 21
3.2.7.5 Hydroxylierung von (monosubstituierten) Benzolen ........................................................... 21
3.2.8 Alkoholdehydrogenase ............................................................................................................ 22
3.2.8.1 Aufbau der Alkoholdehydrogenasen .................................................................................... 22
3.2.8.2 Anwendung .......................................................................................................................... 23
3.3 Aspekt der Zielprodukte: Alkohole und Cycloalkanone in der Bulkindustrie ............................. 26
3.3.1 Industrielle Herstellung der Verbindungen ............................................................................. 26
3.3.1.1 2-Butanol .............................................................................................................................. 26
3.3.1.2 Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole ...................................................................................... 26
3.3.1.3 Cyclische Alkohole und Ketone ............................................................................................ 27
3.3.1.3.1 Industrielle Herstellung von Cycloalkanonen .................................................................... 28
3.3.2 Industrielle Verwendung der hergestellten Produkte ............................................................. 29
3.3.2.1 2-Butanol .............................................................................................................................. 31
3.3.2.2 Lineare C6-C18-Alkohole ........................................................................................................ 31
3.3.2.3 Cyclische Alkohole ................................................................................................................ 32
3.3.2.4 Cycloalkanone ...................................................................................................................... 33
3.4 Hydroxylierung von n-Alkanen durch eine Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer in situ-
Cofaktorregenerierung unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase ................................................. 35
3.4.1 Ziel der Arbeit .......................................................................................................................... 35
3.4.2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................................... 36
3.4.2.1 Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen ........................................................... 36
3.4.2.2 Spektrophotometrische Vorarbeiten ................................................................................... 37
3.4.2.2.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium 37
3.4.2.2.2 Stabilitäten der 19A12- und F87V-Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase aus
Bacillus megaterium ........................................................................................................................... 39
3.4.2.3 Analytische Vorarbeiten ....................................................................................................... 42
3.4.2.3.1 Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters .................................................................. 43
I Inhaltsverzeichnis
III
3.4.2.3.2 Aufarbeitung mit Hilfe von Eppendorf-Gefäßen ............................................................... 44
3.4.2.4 Hydroxylierung von n-Oktan ................................................................................................ 45
3.4.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................... 45
3.4.2.4.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung .............................. 46
3.4.2.4.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ ............................................ 48
3.4.3.4.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................... 49
3.4.2.4.5 Einfluss der Reaktionstemperatur ..................................................................................... 50
3.4.2.5 Hydroxylierungsreaktion von n-Butan.................................................................................. 51
3.4.2.5.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................... 51
3.4.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur ..................................................................................... 52
3.4.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit .................................................................................................. 53
3.4.3 Zusammenfassung ................................................................................................................... 54
3.4.3.1 Hydroxylierung von n-Oktan ................................................................................................ 54
3.4.3.2 Hydroxylierung von n-Butan ................................................................................................. 56
3.5 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Synthese von Cycloalkanonen .............................. 57
3.5.1 Ziel der Arbeit .......................................................................................................................... 57
3.5.2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................................... 58
3.5.2.1 Spektrophotometrische Vorarbeiten ................................................................................... 58
3.5.2.1.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium 58
3.5.2.2 Analytische Vorarbeiten ....................................................................................................... 59
3.5.2.3 Hydroxylierung von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanol ......................................... 60
3.5.2.3.1 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung .............................. 60
3.5.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung in Abhängigkeit vom
Reaktionsvolumen und der Menge der P450-Monooxygenase ......................................................... 62
3.5.2.4 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon ............. 63
3.5.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation ............................................ 64
3.5.2.4.2 Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-
genase auf die Doppeloxidation ......................................................................................................... 65
I Inhaltsverzeichnis
IV
3.5.2.4.3 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation ..... 66
3.5.2.5 Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ............................................. 67
3.5.2.5.1 Einfluss des Additivs Isopropanol auf die Doppeloxidation .............................................. 69
3.5.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropan-
ol als Additiv ....................................................................................................................................... 70
3.5.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als
Additiv ................................................................................................................................................ 71
3.5.2.5.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
25 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ................................... 72
3.5.2.5.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Iso-
propanol als Additiv ........................................................................................................................... 74
3.5.2.5.6 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ................................ 76
3.5.2.5.7 Einfluss der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv .............................................................................................. 77
3.5.2.5.8 Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv .............................................................................................. 78
3.5.3 Zusammenfassung ................................................................................................................... 79
3.5.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan ........................................................................................... 79
3.5.3.2 Doppeloxidation von Cyclooktan......................................................................................... 80
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator
zur Herstellung von εεεε-Caprolacton .............................................................................................. 83
4.1 Einleitung .................................................................................................................................... 83
4.2 Stand der Wissenschaft .............................................................................................................. 84
4.2.1 Verwendung von ε-Caprolacton in der Industrie .................................................................... 84
4.2.1.1. Polycaprolacton (PCL) .......................................................................................................... 84
4.2.1.2 Herstellung von Polycaprolacton durch anionische Polymerisation von ε-Caprolacton .... 84
4.2.2 Herstellung von ε-Caprolacton ................................................................................................ 85
4.2.2.1 Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclohexanon unter Verwendung von Persäuren .............. 85
I Inhaltsverzeichnis
V
4.2.2.2 Industrielle Herstellung durch den UCC-Prozess .................................................................. 86
4.2.3 Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase ................................................................ 86
4.2.4 Präparative Anwendungen der BVMO .................................................................................... 87
4.2.4.1 Enantioselektive Sulfoxidation von prochiralen Thioestern ................................................ 87
4.2.4.2 Katalytische kinetische Racematspaltung von 4-Hydroxy-2-ketonen .................................. 89
4.2.4.3 Synthese von β-Aminosäuren und β-Aminoalkoholen durch Nutzen der Regioselektivität
der BVMO ........................................................................................................................................... 89
4.2.4.4 Verwendung in der Synthese von Esomeprazol ................................................................... 91
4.3 Ziel der Arbeit ............................................................................................................................. 91
4.4 Ergebnisse und Diskussion ......................................................................................................... 92
4.4.1 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Aktivitätsbestimmung der Alkoholdehydro-
genase aus Lactobacillus kefir für die Oxidation von Cyclohexanol zu Cyclohexanon....................... 92
4.4.2 Synthese von ε-Caprolacton ausgehend von Cyclohexanol unter Kombination einer Alkohol-
dehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase .............................................................. 93
4.4.2.1 Einfluss der Cofaktormenge ................................................................................................. 93
4.4.2.2 Einfluss der Substratkonzentration ...................................................................................... 94
4.4.3 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Inhibierung und Stabilität der Baeyer-Villiger-
Monooxygenase ................................................................................................................................. 96
4.4.3.1 Inhibierung ........................................................................................................................... 96
4.4.3.2 Stabilitätstests ...................................................................................................................... 98
4.4 Zusammenfassung .................................................................................................................... 100
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktions-
reaktionen ................................................................................................................................ 102
5.1 Einleitung .................................................................................................................................. 102
5.2 Stand der Wissenschaft ............................................................................................................ 102
5.2.1 Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen .............................................................................. 102
5.2.1.1 Bekannte Palladium-katalysierte Kupplungsreaktionen .................................................... 103
5.2.1.2 Mechanismus der Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen ..................................... 103
5.2.1.3 Suzuki-Kreuzkupplung ........................................................................................................ 105
I Inhaltsverzeichnis
VI
5.2.2 Enzymatische Reduktion von Ketonen zur Synthese stereoselektiver Alkohole .................. 106
5.3 Ziel der Arbeit ........................................................................................................................... 107
5.4 Ergebnisse und Diskussion ....................................................................................................... 108
5.4.1 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von 4´-Iodacetophenon zur Synthese von 4´-Phenylaceto-
phenon ............................................................................................................................................. 108
5.4.1.1 Benchmark .......................................................................................................................... 109
5.4.1.2 Einfluss der Proteinkonzentration ...................................................................................... 110
5.4.1.3 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................... 111
5.4.1.4 pH-Verlauf der Reaktion ..................................................................................................... 112
5.4.2 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol zur Synthese von rac-4´-
Biphenylethan-1-ol ........................................................................................................................... 113
5.4.2.1 Natriumborhydrid-Reduktion zur Synthese von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol .................... 113
5.4.2.2 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................... 114
5.4.2.3 Einfluss der Proteinmenge ................................................................................................. 115
5.4.3 Enzymatische Reduktion von 4´-Iodacetophenon unter Verwendung einer Alkoholdehydro-
genase .............................................................................................................................................. 116
5.4.3.1 Einfluss der Proteinkonzentration ...................................................................................... 118
5.4.3.2 pH-Verlauf der Reaktion ..................................................................................................... 118
5.4.4 Enzymatische Reduktion von 4´-Phenylacetophenon unter Verwendung einer Alkohol-
dehydrogenase ................................................................................................................................. 120
5.4.5 Tandemreaktionen der Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen Reduktion ........... 122
5.4.5.1 Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration ................................................................ 124
5.4.5.2 pH-Verlauf der Reaktionen ................................................................................................. 125
5.4.5.3 Einfluss des einsetzten Cofaktors ....................................................................................... 127
5.6 Zusammenfassung .................................................................................................................... 129
5.6.1. Suzuki-Kupplung ................................................................................................................... 129
5.6.1.1 Benchmark-Versuch ........................................................................................................... 129
5.6.1.2 Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung .......................................................... 129
I Inhaltsverzeichnis
VII
5.6.2 Enzymatische Reduktion ....................................................................................................... 130
5.6.3. Tandem-Reaktion .................................................................................................................. 130
6. Zusammenfassung ................................................................................................................. 132
6.1. Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen zur Synthese von Alkoholen durch Einsatz einer
P450-Monooxygenase ...................................................................................................................... 132
6.2. Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon durch die
Kombination einer P450-Monooxygenase mit einer Alkoholdehydrogenase ................................. 134
6.3. Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von ε-Caprolacton durch
Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase ................. 135
6.4. Kombination einer metallkatalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer enzymatischen Reduk-
tion zur Synthese eines Biarylalkohols aus 4‘-Iodacetophenon ....................................................... 137
7. Summary ............................................................................................................................... 141
7.1. Biocatalytic hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase ............................. 141
7.2. Biocatalytic double oxidation of cyclooctane to synthesize cyclooctanone by using a combi-
nation of a P450-monooxygenase and an alcohol dehydrogenase ................................................. 143
7.3. Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol in order to synthesize ε-caprolactone by using a
combination of an alcohol dehydrogenase and a Baeyer-Villiger-monooxygenase ........................ 144
7.4. Combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling and an enzymatic reduction in order
to synthesize a biarylalcohol ............................................................................................................ 146
7.5. Outlook ..................................................................................................................................... 149
8. Experimenteller Teil ............................................................................................................... 150
8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte ...................................................................................... 150
8.2 Synthesen und spektroskopische Daten .................................................................................. 152
8.2.1 Hydroxylierung von n-Alkanen zur Darstellung von Alkoholen ............................................. 152
8.2.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 für die Herstellung des LB-Mediums (AAV 1) ................... 152
8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 für die Herstellung des TB-Mediums (AAV 2) ................... 152
8.2.1.2.1 Herstellung des TB-Mediums .......................................................................................... 152
8.2.1.2.2 Herstellung des TB-Mediums für einen Fermenter-Versuch .......................................... 152
8.2.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 für die Herstellung des M9-Minimal-Mediums (AAV 3) .. 153
I Inhaltsverzeichnis
VIII
8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 für die Herstellung der Mutanten für die P450-
Monooxygenase BM-3 (AAV 4) ........................................................................................................ 153
8.2.1.4.1 Herstellung des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3............................................ 154
8.2.1.4.2 Herstellung der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ................................ 155
8.2.1.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 für die Fermentation der 19A12-Mutante der P450-
Monooxygenase BM-3 (AAV 5) ........................................................................................................ 155
8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 zur spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der
P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 6) ............................................................................................... 156
8.2.1.6.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung des Wildtyps der P450-Monooxygenase
BM-3 ................................................................................................................................................. 157
8.2.1.6.2 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der 19A12-Mutante der P450-Monooxy-
genase BM-3 ..................................................................................................................................... 157
8.2.1.6.3 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der F87V-Mutante der P450-Monooxy-
genase BM-3 ..................................................................................................................................... 158
8.2.1.7 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 zur spektrophotometrischen Bestimmung der Stabilität von
P450-Monooxygenasen BM-3 (AAV 7) ............................................................................................. 159
8.2.1.7.1 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden ....................................................................................................................................... 159
8.2.1.7.2 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und
anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur .......................................................................... 160
8.2.1.7.3 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden ....................................................................................................................................... 161
8.2.1.7.4 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und
anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur .......................................................................... 161
8.2.1.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch
verschiedene Aufarbeitungsmethoden (AAV 8) .............................................................................. 162
8.2.1.8.1 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die Aufarbeitung mit
Hilfe eines Schütteltrichters ............................................................................................................. 163
8.2.1.8.2 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die Aufarbeitung mit
Eppendorf-Gefäßen .......................................................................................................................... 164
I Inhaltsverzeichnis
IX
8.2.1.9 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 zur biokatalytischen Hydroxylierung von n-Oktan (AAV 9)
.......................................................................................................................................................... 165
8.2.1.9.1 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................. 166
8.2.1.9.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung ............................ 167
8.2.1.9.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ .......................................... 169
8.2.1.9.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................. 170
8.2.1.9.5 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................... 171
8.2.1.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 zur biokatalytischen Hydroxylierung von n-Butan (AAV 10)
.......................................................................................................................................................... 173
8.2.1.10.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 ................................................ 174
8.2.1.10.2 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................. 175
8.2.1.10.3 Einfluss der Reaktionszeit .............................................................................................. 177
8.2.2 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Darstellung von Cycloalkanonen ..................... 178
8.2.2.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung verschiedener P450-Monooxygenasen BM-3
.......................................................................................................................................................... 178
8.2.2.2. Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 zur Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards
(AAV 11)............................................................................................................................................ 179
8.2.2.2.1 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von
1 ml ................................................................................................................................................... 179
8.2.2.2.2 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von
4 ml ................................................................................................................................................... 180
8.2.2.2.3 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von
5 ml ................................................................................................................................................... 180
8.2.2.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 zur Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregener-
ierung zum Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der Monooxygenase (AAV 12) .... 181
8.2.2.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 1 ml Reaktionsvolumen
und 38.2 U/mmol Monooxygenase ................................................................................................. 182
8.2.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung in 4 ml Reaktionsvolumen
und 7.64 U/mmol Monooxygenase ................................................................................................. 182
I Inhaltsverzeichnis
X
8.2.2.3.3 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 5 ml Reaktionsvolumen
und 38.2 U/mmol Monooxygenase ................................................................................................. 183
8.2.2.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 zur Doppeloxidation von Cyclooktan (AAV 13) .............. 185
8.2.2.4.1 Einfluss des Substratkonzentration ................................................................................. 185
8.2.2.4.2 Doppeloxidation von Cyclooktan mit 4 ml Reaktionsvolumen und 7.64 U/mmol P450-
Monooxygenase ............................................................................................................................... 187
8.2.2.4.3 Doppeloxidation von Cyclooctan mit 5 ml Reaktionsvolumen und 38.2 U/mmol P450-
Monooxygenase ............................................................................................................................... 187
8.2.2.4.4 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase .......................................... 189
8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 zur Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als
Additiv (AAV 14) ............................................................................................................................... 190
8.2.2.5.1 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................... 192
8.2.2.5.2 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................ 194
8.2.2.5.3 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einem Reaktionsvolumen von 4 ml
.......................................................................................................................................................... 195
8.2.2.5.4 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................ 196
8.2.2.5.5 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM ............................................................................................................................................ 198
8.2.2.5.6 Einfluss von der Präsens der P450-Monooxygenase ...................................................... 199
8.2.2.5.7 Einfluss von der Präsens der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir ................ 201
8.2.3 Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator
zur Herstellung von ε-Caprolacton ................................................................................................... 203
8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 für die spektrophotometrische Bestimmung der Alkohol-
dehydrogenase aus Lactobacillus kefir (AAV 15) ............................................................................. 203
8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol
zur Synthese von ε-Caprolacton (AAV 16)........................................................................................ 203
8.2.3.2.1. Einfluss der Cofaktormenge ........................................................................................... 204
8.2.3.2.2 Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration ........................................... 206
8.2.3.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 zur Inhibierung der BVMO ECS-MO1 durch Cyclohexanon
und das Produkt ε-Caprolacton (AAV 17) ......................................................................................... 208
I Inhaltsverzeichnis
XI
8.2.3.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 zur Stabilität der BVMO ECS-MO1 (AAV 18) .................. 209
8.2.4 Palladium-katalysierte Kreuzkupplung in Kombination mit einer enzymatischen Reduktions-
reaktion ............................................................................................................................................ 213
8.2.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 zur Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon zur
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (AAV 19) ............................................................................... 213
8.2.4.1.1 Einfluss der Proteinkonzentration ................................................................................... 213
8.2.4.1.2 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................ 215
8.2.4.1.3 pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon............................................... 216
8.2.4.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 für die Synthese des rac-Iodphenylethan-1-ols durch
Reduktion mit Natriumborhydrid (AAV 20) ..................................................................................... 217
8.2.4.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 für die Suzuki-Kupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol zur
Synthese von rac-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV 21) ........................................................................... 218
8.2.4.3.1 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................ 219
8.2.4.3.2 Einfluss der Proteinmenge .............................................................................................. 220
8.2.4.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 für die biokatalytische Reduktion (AAV 22) ................... 221
8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon . 221
8.2.4.4.2 pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon ............................. 222
8.2.4.4.3 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon
.......................................................................................................................................................... 223
8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 für die Tandem-Reaktion zur Synthese von (R)-4'-
Biphenylethan-1-ol (AAV 23) ............................................................................................................ 225
8.2.4.5.1 Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion ......................................... 225
8.2.4.5.2 pH-Verlauf der Tandem-Reaktion .................................................................................... 227
8.2.4.5.3 Einfluss des Cofaktors ...................................................................................................... 229
9. Literaturverzeichnis .............................................................................................................. 231
II Abbildungsverzeichnis
XII
II Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Anwendungshäufigkeit der Enzymklassen [4b] ................................................................... 3
Abbildung 2: Unterschied der klassischen Synthese zur Eintopfsynthese ............................................. 4
Abbildung 3: Oxidation zu industriell wichtigen Produkten unter Cofaktorregenerierung in einer Ein-
topfreaktion............................................................................................................................................. 6
Abbildung 4: Doppeloxidation zu industriell relevanten Produkten in einer Eintopfreaktion ............... 6
Abbildung 5: Biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen in einer Eintopf-
Zweistufen-Synthese [13] .......................................................................................................................... 7
Abbildung 6: Kombination einer metallkatalysierten Reaktion mit einer Biotransformation zur Syn-
these pharmazeutisch relevanter Bausteine in einer Eintopf-Reaktion ................................................. 8
Abbildung 7: Darstellung des aktiven Zentrums einer Cytochrom P450-Monooxygenase .................. 10
Abbildung 8: System bei der P450-Monooxygenase BM-3 [35] ............................................................. 10
Abbildung 9: Dreikomponenten-System [35] ......................................................................................... 10
Abbildung 10: Katalysezyklus einer P450-Monooxygenase [36] ............................................................ 11
Abbildung 11: Rebound-Mechanismus der Hydroxylierungsreaktion [36,40] ......................................... 12
Abbildung 12: Reaktionsprinzip einer Cytochrom P450-Monooxygenase ........................................... 13
Abbildung 13: Screening-Assay für die Aktivität bei der Oxidation von Alkanen mit
p-Nitrophenoxyoktan (9) [29] .................................................................................................................. 15
Abbildung 14: Die chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 [54] ........................................ 17
Abbildung 15: Hydroxylierung von Cyclohexan (15) zu Cyclohexanol (16) in einem Zweiphasen-
system[27] ............................................................................................................................................... 18
Abbildung 16: Konventionelle chemische Synthese von Cortison (18) [55] ........................................... 18
Abbildung 17: Chemisch-mikrobiologische Synthese von Cortison (18) [55] ......................................... 19
Abbildung 18: Abbau des Steroids 22 zu Androstendion (23) und Reduktion zu Testosteron (24) [55] 20
Abbildung 19: Biokatalytische, asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 durch eine
Pseudomonas sp. Styrol-Monooxygenase [45] ........................................................................................ 20
Abbildung 20: Chemoenzymatische Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen [58] .............. 21
Abbildung 21: Röntgenstruktur der katalytischen Tetrade (in magenta) und des Protonenüber-
tragungssystems (gestrichelte Linien) von RADH-G37D [S] [64] ............................................................. 23
Abbildung 22: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen 27a zu sekundären chiralen
Alkoholen 28a ........................................................................................................................................ 24
Abbildung 23: Oxidation von sekundären chiralen Alkoholen 28a zu Ketonen 27a ............................ 24
Abbildung 24: Konzept der in situ-Cofaktorregenerierung durch Kombination einer Cytochrom P450-
Monooxygenase mit einer ADH [13] ....................................................................................................... 24
II Abbildungsverzeichnis
XIII
Abbildung 25: Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung mit einer ADH [6,10,13,69] ...... 25
Abbildung 26: Konzept der enzymgekoppelten Cofaktorregenerierung durch Kombination einer
Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer GDH [10,13,69] ..................................................................... 25
Abbildung 27: Säurekatalysierte Hydratisierung von 2-Buten (34) zur Synthese von 2-Butanol (35) [21]
............................................................................................................................................................... 26
Abbildung 28: Bruttoreaktionsgleichung der partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach
BASHKIROV [21] .......................................................................................................................................... 26
Abbildung 29: Partielle Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV [21] ............................................. 27
Abbildung 30: Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan 15 zu KA-Öl [21] ..................................... 27
Abbildung 31: Oxidation von Cyclohexan 15 nach BASHKIROV [21].......................................................... 28
Abbildung 32: Industriell wichtige Produkte, die aus 2-Butanol (35), linearen Alkoholen und dem
cyclischen Alkohol 16 hergestellt werden [21,22]..................................................................................... 29
Abbildung 33: Industriell wichtige Produkte, die aus den cyclischen Ketonen 41 und 50 und dem
Lacton 53 hergestellt werden [21]........................................................................................................... 30
Abbildung 34: Ethoxylierung von linearen Alkoholen zu Fettalkoholpolyglykolethern 45 [21,22] .......... 31
Abbildung 35: Darstellung von Fettalkoholsulfaten 47 aus linearen Alkoholen [21,22] .......................... 31
Abbildung 36: Darstellung von Fettalkoholethersulfaten 45 aus Fettalkoholpolyglykolethern 46 [21,22]
............................................................................................................................................................... 32
Abbildung 37: Darstellung von Adipinsäure (48) aus KA-Öl [21] ............................................................ 32
Abbildung 38: Darstellung von Nylon-6.6 52 und Nylon-6.8 58 [21] ...................................................... 33
Abbildung 39: Darstellung von Nylon-6 (51) aus Cyclohexanon (41) ................................................... 33
Abbildung 40: Retrosynthesen von Nylon-6 (51) und Nylon-12 (52) ................................................... 34
Abbildung 41: Die bei der biokatalytischen Hydrierung eingesetzten n-Alkane .................................. 35
Abbildung 42: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen unter Einsatz einer GDH und D-Glucose
............................................................................................................................................................... 35
Abbildung 43: Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen .................................................... 36
Abbildung 44: Strukturformeln der Referenzsubstanzen ..................................................................... 37
Abbildung 45: Reaktionsgleichungen der Photometertests mit einer P450-Monooxygenase BM-3 ... 40
Abbildung 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur 40
Abbildung 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ........................................................................ 41
Abbildung 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur . 41
Abbildung 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ........................................................................ 42
II Abbildungsverzeichnis
XIV
Abbildung 50: Strukturformeln der verschiedenen Oktanole und von Pyridin (72) ............................. 42
Abbildung 51: Formel für die Berechnung des Faktors ........................................................................ 43
Abbildung 52: Hydroxylierung von n-Oktan (64) .................................................................................. 45
Abbildung 53: Hydroxylierung von n-Oktan (64) unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur in
situ-Cofaktorregenerierung ................................................................................................................... 47
Abbildung 54: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) unter in situ-Cofaktorregenerierung
mit einer GDH ........................................................................................................................................ 51
Abbildung 55: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) ......................................................... 56
Abbildung 56: Biokatalytische Hydroxylierung von gasförmigen n-Butan (65) .................................... 57
Abbildung 57: Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation von Cycloalkanen ............................... 58
Abbildung 58: Biokatalytische Reaktion, die mit Hilfe des UV/Vis-Spektrometers beobachtet wird .. 58
Abbildung 59: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) .................. 60
Abbildung 60: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) ohne Cofaktorregenerierung ..... 61
Abbildung 61: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit in situ-Cofaktorregenerierung
durch Einsatz einer GDH und D-Glucose ............................................................................................... 61
Abbildung 62: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) durch Kombination einer P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium und einer ADH aus Lactobacillus kefir ............................... 64
Abbildung 63: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv
............................................................................................................................................................... 68
Abbildung 64: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase und der Substratkonzentration auf die
biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als
Additiv ................................................................................................................................................... 74
Abbildung 65: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) mit einer
Produktbildung von 0.328 g/l ................................................................................................................ 80
Abbildung 66: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) mit einer
Produktbildung im Bereich von 0.09 bis 0.14 g/l .................................................................................. 81
Abbildung 67: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung im Bereich von 0.80 g/l ................ 82
Abbildung 68: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) in einem Eintopf-Zweistufen-
Verfahren im wässrigen Medium zu ε-Caprolacton (53) ...................................................................... 83
Abbildung 69: Das Polymer Polycaprolacton (PCL, 54)......................................................................... 84
Abbildung 70: Anionische Polymerisation von ε-Caprolacton (53) zur Synthese von Polycapro-
lactonen [92] ............................................................................................................................................ 85
II Abbildungsverzeichnis
XV
Abbildung 71: Synthese von ε-Caprolacton (53) durch die Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclo-
hexanon (41) unter Verwendung von Persäuren 78 [94] ........................................................................ 85
Abbildung 72: Industrielle Herstellung von ε-Caprolacton (53) durch den UCC-Prozess [21] ................ 86
Abbildung 73: Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase [1,96,97] ............................................ 87
Abbildung 74: Enantioselektive Sulfoxidation eines prochiralen Thioesters 83 mit Hilfe einer
CHMO [98] ............................................................................................................................................... 88
Abbildung 75: Kinetische Spaltung des racemischen Sulfoxids rac-84 mit Hilfe einer CHMO [98] ........ 88
Abbildung 76: Kinetische Racematspaltung von racemischen 4-Hydroxyketonen rac-86 [89] .............. 89
Abbildung 77: BVMO-katalysierte kinetische Racematspaltung des N-geschützten β-Aminoketons .. 90
Abbildung 78: Synthese einer N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 und eines N-geschützten β-
Aminoalkohols 93 [90] ............................................................................................................................. 90
Abbildung 79: Synthese des Protonenpumpenhemmers Esomeprazol (95) durch enantioselektive
Sulfoxidation aus Omeprazol (94) mit einer BVMO [99] ......................................................................... 91
Abbildung 80: Biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 unter Synthese von ε-Caprolacton
(53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium ....................................................... 92
Abbildung 81: Die bei der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH eingesetzten
sekundären Alkohole 1-Phenylethanol (96) und Cyclohexanol (16) ..................................................... 92
Abbildung 82: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Substrats ................................................................................................ 96
Abbildung 83: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ......................................................... 97
Abbildung 84: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53) ......................................................... 97
Abbildung 85: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanol (16) ........ 98
Abbildung 86: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanon (41) ...... 99
Abbildung 87: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von ε-Caprolacton (53) .... 100
Abbildung 88: „Proof of Concept“ für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu
ε-Caprolacton (53) ............................................................................................................................... 101
Abbildung 89: Der Kathepsin-K-Inhibitor Odanacatib (97) [104] ........................................................... 102
Abbildung 90: Allgemein gültiger Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Kupplungsreak-
tionen [94,127] ......................................................................................................................................... 104
Abbildung 91: Allgemeine Reaktionsgleichung der Suzuki-Kreuzkupplung [94] .................................. 105
Abbildung 92: Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung [94] ....................... 105
Abbildung 93: Der wasserlösliche Ligand TPPTS (105) [129] ................................................................. 105
Abbildung 94: Mögliche Produkte aus der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bzw. rac-4'-
Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ............................................................ 106
II Abbildungsverzeichnis
XVI
Abbildung 95: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen zu sekundären chiralen Alkoholen
............................................................................................................................................................. 106
Abbildung 96: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) durch die Verwendung der
(R)-selektiven LK-ADH.......................................................................................................................... 107
Abbildung 97: Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (107) durch die Verwendung der
(R)-selektiven LK-ADH.......................................................................................................................... 107
Abbildung 98: Tandem-Reaktion durch Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer
Reduktion ............................................................................................................................................ 108
Abbildung 99: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b) . 109
Abbildung 100: Benchmark der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-
boronsäure (101b) ............................................................................................................................... 109
Abbildung 101: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodaceto-
phenon (106) mit Phenylboronsäure (101b) ....................................................................................... 111
Abbildung 102: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) ...................... 112
Abbildung 103: Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboron-
säure (101b) ........................................................................................................................................ 113
Abbildung 104: Synthese des racemischen Alkohols rac-107 durch Reduktion des Ketons 106 mit
Natriumborhydrid (110) ...................................................................................................................... 114
Abbildung 105: Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) .............................................................................................. 116
Abbildung 106: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Hilfe der LK-ADH ......... 117
Abbildung 107: Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol
(rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule .............................................................................................. 117
Abbildung 108: pH-Verlauf der enzymatischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) ................ 119
Abbildung 109: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm von racemischen 4‘-Biphenylethan-1-ol
(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ............................................................................................ 122
Abbildung 110: Tandem-Reaktion durch Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer
Reduktion ............................................................................................................................................ 123
Abbildung 111: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm von racemischen 4‘-Biphenylethan-1-ol
(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ............................................................................................ 123
Abbildung 112: pH-Verläufe der Tandem-Reaktion bei unterschiedlichen Mengen an LK-ADH ....... 125
Abbildung 113: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)
unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von über 95% ......................... 129
II Abbildungsverzeichnis
XVII
Abbildung 114: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodaceto-
phenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ................ 130
Abbildung 115: Tandem-Reaktion mit 4‘-Iodacetophenon (106) als Substrat zur Herstellung des
gewünschten (R)-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) .............................................................................. 131
Abbildung 116: Biokatalytische Hydroxylierung der n-Alkane 64 und 65 zu den korrespondierenden
Alkoholen............................................................................................................................................. 132
Abbildung 117: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) ..................................................... 133
Abbildung 118: Biokatalytische Hydroxylierung des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35) .... 133
Abbildung 119: Biokatalytische Doppeloxidation des Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75 ............ 134
Abbildung 120: Optimierte biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon
(75) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung von 0.80 g/l ............... 135
Abbildung 121: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) unter Synthese von ε-Capro-
lacton (53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium .......................................... 136
Abbildung 122: „Proof of Concept“ der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu
ε-Caprolacton (53) (optimiertes Verfahren) ....................................................................................... 136
Abbildung 123: Einfluss der Konzentration des eingesetzten Cyclohexanols (16) auf den Umsatz ... 137
Abbildung 124: Konzept der Tandem-Reaktionen durch Kombination der Suzuki-Kreuzkupplung mit
einer biokatalytischen Reduktion ........................................................................................................ 138
Abbildung 125: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodaceto-
phenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ................ 139
Abbildung 126: Ergebnisse der Tandemreaktion ............................................................................... 139
Abbildung 127: Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung ......................................... 156
Abbildung 128: Hydroxylierung von n-Oktan (64) unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur in
situ-Cofaktorregenerierung ................................................................................................................. 167
Abbildung 129: Hydroxylierung von n-Oktan (64) ohne Cofaktorregenerierung ............................... 168
Abbildung 130: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit der 19A12-
Mutante und Isopropanol (30) als Additiv .......................................................................................... 192
Abbildung 131: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) ....................... 206
Abbildung 132: 1H-NMR-Spektrum der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-
boronsäure (101b) (Benchmark-Versuch) ........................................................................................... 214
Abbildung 133: 1H-NMR-Spektrum der Natriumborhydrid-Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)217
III Tabellenverzeichnis
XVIII
III Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht über die sechs Enzymklassen [1,5] ........................................................................... 2
Tabelle 2: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3 ..................... 38
Tabelle 3: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3 .......... 38
Tabelle 4: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3 ............ 39
Tabelle 5: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Hilfe eines
Schütteltrichters .................................................................................................................................... 43
Tabelle 6: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Eppendorf-
Gefäßen ................................................................................................................................................. 44
Tabelle 7: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
............................................................................................................................................................... 46
Tabelle 8: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64) .......................................................................................................... 47
Tabelle 9: Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64) .......................................................................................................... 48
Tabelle 10: Einfluss eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung von
n-Oktan (64) .......................................................................................................................................... 49
Tabelle 11: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
............................................................................................................................................................... 50
Tabelle 12: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung
von n-Butan (65) .................................................................................................................................... 51
Tabelle 13: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
............................................................................................................................................................... 53
Tabelle 14: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) ........ 54
Tabelle 15: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der Substrat-
konzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase ............................................. 63
Tabelle 16: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-
oktan (73) .............................................................................................................................................. 65
Tabelle 17: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-
genase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................. 66
Tabelle 18: Einfluss der eingesetzten Menge der P450-Monooxygenase auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................................................................... 67
Tabelle 19: Unterschied von der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ohne Einsatz
des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz .......................................................................... 69
III Tabellenverzeichnis
XIX
Tabelle 20: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-
oktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................. 71
Tabelle 21: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................... 72
Tabelle 22: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenasen bei einer Substratkonzentration von
25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol
(30) als Additiv ....................................................................................................................................... 73
Tabelle 23: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................... 75
Tabelle 24: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................... 75
Tabelle 25: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
............................................................................................................................................................... 76
Tabelle 26: Einfluss der P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................................... 77
Tabelle 27: Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ........................................................... 78
Tabelle 28: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH ............................................... 93
Tabelle 29: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der Stoff-
menge des eingesetzten Cofaktors ....................................................................................................... 94
Tabelle 30: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der Stoff-
menge des eingesetzten Substrats ........................................................................................................ 95
Tabelle 31: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon
(106) .................................................................................................................................................... 110
Tabelle 32: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) 111
Tabelle 33: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bei verschiedenen
Reaktionszeiten ................................................................................................................................... 112
Tabelle 34: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107) .............................................................................................................................................. 114
Tabelle 35: Einfluss der eingesetzten Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-
Iodphenylethanol (rac-107)................................................................................................................. 115
Tabelle 36: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodaceto-
phenon (106) ....................................................................................................................................... 118
III Tabellenverzeichnis
XX
Tabelle 37: pH-Verläufe der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei unter-
schiedlichen Mengen von LK-ADH ...................................................................................................... 119
Tabelle 38: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylaceto-
phenon (108) ....................................................................................................................................... 121
Tabelle 39: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion .................... 124
Tabelle 40: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l................ 126
Tabelle 41: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l................ 127
Tabelle 42: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion .................................................. 128
Tabelle 43: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3.................. 157
Tabelle 44: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3 ...... 158
Tabelle 45: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3 ........ 158
Tabelle 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden .......................................................................................................................................... 160
Tabelle 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ...................................................................... 160
Tabelle 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden .......................................................................................................................................... 161
Tabelle 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und
anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ............................................................................. 162
Tabelle 50: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Hilfe eines
Schütteltrichters .................................................................................................................................. 163
Tabelle 51: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Eppendorf-
Gefäßen ............................................................................................................................................... 164
Tabelle 52: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von
n-Oktan (64) ........................................................................................................................................ 167
Tabelle 53: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die bio-
katalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) .................................................................................... 169
Tabelle 54: Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64) ........................................................................................................ 170
Tabelle 55: Einfluss eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung von
n-Oktan (64) ........................................................................................................................................ 171
Tabelle 56: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
............................................................................................................................................................. 172
III Tabellenverzeichnis
XXI
Tabelle 57: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung
von n-Butan (65) .................................................................................................................................. 175
Tabelle 58: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
............................................................................................................................................................. 176
Tabelle 59: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) ...... 177
Tabelle 60: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten verschiedener P450-Monooxygenasen
bezogen auf Cyclooktan (73) ............................................................................................................... 178
Tabelle 61: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der Substrat-
konzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase ........................................... 184
Tabelle 62: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-
oktan (73) ............................................................................................................................................ 186
Tabelle 63: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-
genase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ............................................... 188
Tabelle 64: Einfluss der eingesetzten Menge der P450-Monooxygenase auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................................................................. 189
Tabelle 65: Unterschied von der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ohne Einsatz
des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz ........................................................................ 191
Tabelle 66: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-
oktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ........................................................... 193
Tabelle 67: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................. 194
Tabelle 68: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenasen bei einer Substratkonzentration von
25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Iso-
propanol (30) als Additiv ..................................................................................................................... 196
Tabelle 69: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische .... 197
Tabelle 70: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppel-
oxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv .................................. 198
Tabelle 71: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
............................................................................................................................................................. 199
Tabelle 72: Einfluss der P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................................. 200
Tabelle 73: Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................................................... 202
III Tabellenverzeichnis
XXII
Tabelle 74: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH ............................................. 203
Tabelle 75: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors ............................................................................................. 205
Tabelle 76: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Substrats .............................................................................................. 207
Tabelle 77: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ............................................................ 208
Tabelle 78: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53) ............................................................ 209
Tabelle 79: Stabilität der BVMO ohne Zusatz ..................................................................................... 210
Tabelle 80: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanol (16) ................. 210
Tabelle 81: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanol (16) ................. 210
Tabelle 82: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanol (16) ............... 211
Tabelle 83: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanon (41) ................ 211
Tabelle 84: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanon (41) ................ 211
Tabelle 85: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanon (41) .............. 212
Tabelle 86: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53)................... 212
Tabelle 87: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.25 M ε-Caprolacton (53) ................ 212
Tabelle 88: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon
(106) .................................................................................................................................................... 214
Tabelle 89: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) 215
Tabelle 90: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) ............................. 216
Tabelle 91: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107) .............................................................................................................................................. 219
Tabelle 92: Einfluss der eingesetzten Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-
Iodphenylethanol (rac-107)................................................................................................................. 220
Tabelle 93: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodaceto-
phenon (106) ....................................................................................................................................... 222
Tabelle 94: pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei unter-
schiedlichen Mengen von LK-ADH ...................................................................................................... 223
Tabelle 95: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylaceto-
phenon (108) ....................................................................................................................................... 224
Tabelle 96: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion .................... 226
Tabelle 97: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l................ 228
Tabelle 98: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l................ 228
Tabelle 99: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion .................................................. 229
IV Abkürzungsverzeichnis
XXIII
IV Abkürzungsverzeichnis
ADH Alkoholdehydrogenase
ADH-Säule CHIRALPAK® Amolyse tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)
ALA Aminolävulinsäure
aq. wässrig
ATP Adenosintriphosphat
c Konzentration
CDCl3 deuteriertes Chloroform
d [cm] Küvettendicke
d Dublett
δ [ppm] chemische Verschiebung
DBU Deutsche Bundesstiftung Umwelt
ee Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess)
EC enzyme commission
EFB European Federation of Biotechnology
eq. equivalent
F Einbuchstabencode für Phenylalanin
f Probenverdünnungsfaktor
FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid
FMN Flavinmononukleotid
F87V an Position 87 wurde Phenylalanin durch Valin ersetzt
g Gramm
GDH Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.
h Stunde
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HSA human serum albumin
Hz Hertz
IPA Isopropanol
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
J skalare Kopplungskonstante
jato Jahrestonnen
KA Keton - Alkohol
LB lysogeny broth
LK-ADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir
IV Abkürzungsverzeichnis
XXIV
m Multiplett
MeOD deuteriertes Methanol
mg Milligramm
MHz Megahertz
min Minute
ml Milliliter
mmol Millimol
n Stoffmenge
NADH, NAD+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NADPH, NADP+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NMR Kernmagnetische Resonanz
OJ-H-Säule CHIRALCEL®-Säule OJ-H, Cellulose tris-(4-methylbenzoat)
P450 BM-3 Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium
ppm parts per million
R Substituent
RF Retentionsfaktor
rac racemisch
rel. relativ
rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RT Raumtemperatur
rt room temperature
s Singulett
Sdp. Siedepunkt
SEL Spurenelemente-Lösung
sp. species
T [°C] Temperatur
t Triplett
t Zeit
tr Retentionszeit
TB terrific broth
TPP Thiaminpyrophosphat
TPPTS Triphenylphosphin-3,3’,3’’-trisulfonsäure
U Units
U/ml volumetrische Enzymaktivität
IV Abkürzungsverzeichnis
XXV
U/mg Units/Stoffmenge n(Substrat)
UV/Vis Ultraviolett/Visible
V Volumen
µl Mikroliter
V Einbuchstabencode für Valin
Vg [ml] Gesamtprobenvolumen
Vp [ml] Probenvolumen
WT Wildtyp
1. Einleitung
1
1. Einleitung
Die Enzym-Technologie wurde 1989 gemäß der European Federation of Biotechnology (EFB) als ein
Teilbereich der Biotechnologie definiert.[1] Die Biotechnologie stellt eine Schnittstelle der Disziplinen
Mikro- und Molekularbiologie, Chemie, Biochemie, Bioverfahrenstechnik, Materialwissenschaften
und Bioinformatik dar.[2] Hierbei ist ein attraktives Anwendungsfeld die weiße oder auch industrielle
Biotechnologie, die eine nachhaltige Synthese von (Fein-)Chemikalien, Aminosäuren (v.a. L-Glutamat,
L-Lysin, L-Asparaginsäure, usw.), Vitamine (v.a. Ascorbinsäure), Antibiotika (v.a. Penicilline) und
Building Blocks unter Einsatz von Biokatalysatoren darstellt, was bedeutet, dass biologische
Stoffumwandlungen chemisch-industriell genutzt werden.[2]
Als Biokatalysatoren kommen intakte Mikroorganismen wie Ganzzellbiokatalysatoren oder auch
deren isolierte Enzyme in Betracht.[2,3] Dabei bedient man sich zweier unterschiedlicher Methoden:
der Biokatalyse und der Fermentation. Die Biokatalyse nutzt Enzyme als Katalysatoren bei der
Durchführung verschiedener Reaktionen wie z.B. bei der Hydroxylierung. Bei der Fermentation
werden lebende Mikroorganismen als Ganzzellbiokatalysatoren eingesetzt, um aus nachwachsenden
Rohstoffen Chemikalien oder die für die Biokatalyse benötigten Enzyme herzustellen, wobei der der
Metabolismus der Zelle genutzt wird.[2] Enzyme sind Proteine, die für alle Lebewesen notwendig sind.
Sie katalysieren alle chemischen Reaktionen, die das Überleben und die Reproduktion sichern.[1] Sie
bestehen aus L-Aminosäuren und sind daher chirale Katalysatoren.[4a] Der Einsatz von Bio-
katalysatoren bringt viele Vorteile. Biokatalysatoren sind sehr effiziente Katalysatoren, was sich in
deren katalytischen Aktivitäten widerspiegelt. Biokatalysierte Reaktionen sind 108-1010 mal schneller
als nicht-katalysierte Reaktionen, was zur Folge hat, dass in der Regel bezogen auf das Edukt nur 10-3
bis 10-4 mol% an Biokatalysatoren eingesetzt werden, während in der konventionellen chemischen
Synthese 0.1 bis 1 mol% an Katalysatoren zugefügt werden müssen.[4a] Biokatalysatoren sind im
Allgemeinen nicht so problematisch für die Umwelt wie beispielsweise Schwermetallkatalysatoren,
da sie komplett biologisch abbaubar sind.[4a] Die Biokatalyse kann unter milden
Reaktionsbedingungen durchgeführt werden.[1,3,4a.,5,6] Der pH-Bereich liegt für gewöhnlich bei pH 5
bis 8, wobei das Optimum oftmals bei pH 7 liegt.[4a] Es sind aber auch Biokatalysatoren bekannt, die
bei pH 2 bzw. pH 12 noch katalytisch aktiv sind.[1] Der Temperatur-Bereich liegt zwischen 20 und 40°C
mit einem Optimum bei 30°C,[4a] wobei es aber auch Biokatalysatoren gibt, die bei 0°C bzw. 110°C
noch aktiv sind.[1] Dadurch kann die Anzahl von Nebenreaktionen wie die Zersetzung oder die
Isomerisierung minimiert werden.[4a] Desweiteren sind Biokatalysatoren unter atmosphärischen
Druck katalytisch aktiv.[3] Biokatalysatoren zeichnen sich vor allem durch ihre hohe Enantio-, Chemo-,
Regio- und Diastereoselektvität aus,[1-5] was bei der Pharmaindustrie, die hochreine Produkte mit
1. Einleitung
2
einer Enantioselektivität von über 99% ee herstellt, zu einer Erhöhung der Produktsicherheit führt.[2]
Bei der Durchführung von Biokatalyse-Prozessen werden in der Regel weniger Schritte zur Synthese
des Zielprodukts benötigt als bei konventionellen Synthesen, da ein Schützen und Entschützen
funktioneller Gruppen meist nicht nötig ist.[6] Biokatalysatoren sind in der Regel bei richtiger
Handhabung ungiftig.[1] Der Einsatz von Biokatalysatoren hat auch einige Nachteile. Biokatalysatoren
können unter drastischeren Bedingungen wie hohe Temperatur, extreme pH-Werte, Verwendung
meist aggressiver Solventien nicht eingesetzt werden,[1,4a] da z.B. bei zu hoher Temperatur die
Proteine denaturiert werden.[4a] Manche Metallionen können inhibierend auf die Biokatalysatoren
wirken.[1] Bei der Verwendung von zahlreichen Enzymen wie z.B. aus der Klasse der Oxidoreduktasen
(Redoxenzyme) werden teure Cofaktoren eingesetzt.[1,4a] Ausgenommen sind hierbei die Hydrolasen,
die keine Cofaktoren benötigen. Desweiteren können manche Enzyme auch Allergien auslösen.[4a]
Enzyme werden nach dem EC-Nummern-System (Enzyme Commission) in sechs Klassen unterteilt.[1,5]
Das EC-Nummern-System beinhaltet je vier Zahlen, die durch Punkte voneinander getrennt sind
(1.2.3.4). Die erste Zahl gibt den Reaktionstyp an, der von den Enzymen katalysiert werden kann, die
zweite Zahl gibt Aufschluss über die funktionellen Gruppen, die während der Katalyse verändert
werden, während die dritte Zahl entweder weitere Charakteristika der Reaktion oder weitere
Eigenschaften des Enzyms angibt. Die vierte Zahl wird als laufende Nummer bezeichnet.[1,5] In
Tabelle 1 sind die sechs Klassen mit ihren jeweiligen Namen, Reaktionen und mit Beispielen gezeigt.
Tabelle 1: Übersicht über die sechs Enzymklassen [1,5]
EC Name Reaktion Beispiele
1 Oxidoreduktasen Redoxreaktionen Monooxygenasen
Alkoholdehydrogenasen
2 Transferasen Übertragung von funktionellen
Gruppen Alanin-Transaminase [7]
3 Hydrolasen Hydrolysen Esterasen, Peptidasen,
Lipasen
4 Lyasen Addition und Eliminierung von
kleinen Molekülen Aldolasen, Decarboxylasen
5 Isomerasen Isomerisierungsreaktionen Alanin-Racemase
6 Ligasen Bindungsbildungsreaktionen Dithiobiotinsynthase [8]
1. Einleitung
3
Die erste Klasse stellen die Oxidoreduktasen, die mit 25% Anwendungshäufigkeit in der organischen
Synthese von allen Enzymen am zweithäufigsten verwendet werden. Die in dieser Doktorarbeit
eingesetzten Monooxygenasen und Alkoholdehydrogenasen sind Oxidoreduktasen (in der obigen
Tabelle 1 grün unterlegt). Diese Enzyme katalysieren Redoxreaktionen und sind abhängig von
Cofaktoren NAD(P)+ und FAD. Die zweite Klasse beinhaltet die Transferasen und die dritte Klasse von
Enzymen sind die Hydrolasen, die mit 60% Anwendungshäufigkeit in der organischen Synthese die
meistverwendeten Enzyme sind. Sie besitzen als einzige Klasse keine Cofaktoren und katalysieren die
Hydrolyse verschiedenster Bindungen. Die Lyasen bilden die vierte Klasse von Enzymen, während die
fünfte Klasse die Isomerasen darstellt. Die mit 1% in der organischen Synthese am wenigsten
angewandte sechste Enzym-Klasse sind die Ligasen.[4b] Die Anwendungshäufigkeit der einzelnen
Enzymklassen ist ein Abbildung 1 graphisch dargestellt.
Abbildung 1: Anwendungshäufigkeit der Enzymklassen[4b]
2. Motivation und Zielsetzung
4
2. Motivation und Zielsetzung
Die Motivation dieser Doktorarbeit war es, einen ökonomischen und ökologischen Zugangsweg zu
industriell wichtigen Produkten wie z. B. 2-Butanol, Cycloalkanone und ε-Caprolacton durch den
Einsatz von Biokatalysatoren in entsprechenden Reduktions- bzw. Oxidationsreaktionen zu
entwickeln. Am geeignetsten für ökologische und ökonomische Herstellungsprozesse hatte sich die
Eintopfreaktion in wässrigen Reaktionsmedien unter Einsatz von Biokatalysatoren erwiesen.[9-18] Ein
Beispiel für eine modulare chemoenzymatische Eintopfsynthese war die erfolgreiche Kombination
einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplung mit einer asymmetrischen Biotransformation zur
Herstellung von chiralen Biarylalkoholen.[11,13] Desweiteren wurden alle vier Stereoisomere eines 1,3-
Diols durch die Kombination von organokatalytischer Aldolreaktion unter Zuhilfenahme chiraler
Katalysatoren und Reduktion mit Hilfe einer (R)-selektiven und einer (S)-selektiven
Alkoholdehydrogenase in einer Eintopfreaktion hergestellt.[9,12-16] Eine Eintopfreaktion konnte auch
erfolgreich für die Synthese von chiralen, allylischen Alkoholen aus allylischen Aldehyden durch
Kombination einer Wittig-Reaktion mit einer Enoatreduktase eingesetzt werden.[14,17]
Im Folgenden Abschnitt wird der Unterschied zwischen einer klassisch-chemischen Synthese und
einer Eintopfsynthese aufgezeigt und durch Abbildung 2 veranschaulicht.
Abbildung 2: Unterschied der klassischen Synthese zur Eintopfsynthese
2. Motivation und Zielsetzung
5
Bei einer klassisch-chemischen Reaktion werden die verschiedenen Reaktionsschritte hintereinander
durchgeführt, wobei jeder einzelne Reaktionsschritt separat aufgearbeitet wird (Abbildung 2). Das
bringt einen großen Aufwand an Lösungsmitteln mit sich, die zur Extraktion der Produkte eingesetzt
werden. Daraus ergibt sich eine große Abfallmenge und hohe Kosten. Die klassisch-chemische
Reaktion hat sowohl in ökologischen als auch in ökonomischen Belangen seine Schwächen.[19,20] Der
Vorteil der Eintopfreaktion im Gegensatz zu einer klassischen Reaktion liegt u. a. in seiner
ökologischen Nachhaltigkeit. Die einzelnen Reaktionsschritte werden in einem Reaktionsgefäß
durchgeführt und ganz am Ende steht die Aufarbeitung des Zielprodukts (Abbildung 2). Die Menge an
Lösungsmitteln und deren Abfälle und somit hohen Kosten werden dadurch sehr reduziert.[19,20]
Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Durchführung von Eintopfreaktionen in einem wässrigen
Medium unter Zuhilfenahme von Biokatalysatoren für Redoxreaktionen, um industriell relevante
Produkte herzustellen. Es wurde dadurch auf gegebenenfalls giftige, umweltschädliche Katalysatoren
und Lösungsmittel verzichtet, was sich positiv auf die Umwelt auswirkte. Das langfristige Ziel besteht
in der Entwicklung von rentablen, technischen und ökologischen Prozessen aus dieser Biokatalyse-
Grundlagenforschung. Während dieser Doktorarbeit wurde der Schwerpunkt auf biokatalytische
Oxidationsreaktionen, vornehmlich von Alkanen im Bereich von C4 bis C8 gelegt. Es wurden aber auch
Oxidationsreaktionen von Alkoholen und Ketonen in diesem Kettenlängenbereich durchgeführt.
Dadurch ergeben sich als industriell wichtige Produkte die cyclischen und aliphatischen C4-C8-
Alkohole und –Ketone sowie ε-Caprolacton. Ein anderes Kapitel beschäftigt sich mit der Herstellung
von Biarylalkoholen aus Arylketonen, bei der eine biokatalytische Reduktionsreaktion eingesetzt
wird.
2.1 Enzymatische Oxidation von aliphatischen und cyclischen Alkanen zur Synthese
der entsprechenden Alkohole
Aliphatische und cyclische Alkohole können durch die Kombination einer Biotransformation, der
biokatalytischen Hydroxylierung durch Einsatz einer P450-Monooxygenase, mit einer in situ-
Cofaktorregenerierung in einem Eintopfverfahren erhalten werden (Abbildung 3).
2. Motivation und Zielsetzung
6
Abbildung 3: Oxidation zu industriell wichtigen Produkten unter Cofaktorregenerierung in einer
Eintopfreaktion
Das Ziel bestand in der Etablierung und Durchführung eines Eintopfverfahrens für die präparative
Biotransformation von Alkanen zu Alkoholen im wässrigen Medium mit einer P450-Monooxygenase.
Das Flüssiggas n-Butan kann biokatalytisch zu 2-Butanol hydroxyliert werden, das industriell zu
Methylketon umgesetzt wird.[21] Auf diesem Wege können aus n-Alkanen auch weitere, lineare
Alkohole erhalten werden, die wichtige Bausteine für Tenside sind.[21,22] Cycloalkanole können mit
eben dieser Eintopfreaktion aus Cyclolkanen erhalten werden, die Ausgangsstoffe für Polymeren wie
Nylon-6.6 oder Nylon-6.8 sind.[21,22]
2.2 Enzymatische Doppeloxidation von cyclischen Alkanen zur Synthese der
entsprechenden Ketone und enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur
Synthese von εεεε-Caprolacton
Cycloalkanone und Lactone werden durch die Kombination von zwei biokatalytischen Reaktionen in
einem wässrigen Medium in einer Eintopfreaktion miteinander kombiniert (Abbildung 4).
Abbildung 4: Doppeloxidation zu industriell relevanten Produkten in einer Eintopfreaktion
In diesem Abschnitt standen sowohl die Durchführung von biokatalytischen Doppeloxidationen im
wässrigen Medium in einem Eintopfverfahren als auch deren Prozessentwicklungen im Vordergrund.
Hierbei können eine P450-Monooxygenase und eine Alkoholdehydrogenase für die Doppeloxidation
von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen sowie eine Alkoholdehydrogenase und eine Baeyer-Villiger-
Monooxygenase für die Doppeloxidation von Cyclohexanol zu ε-Caprolacton eingesetzt werden. Zur
Herstellung der Cycloalkanone wird die biokatalytische Hydroxylierung mit einer biokatalytischen
2. Motivation und Zielsetzung
7
Oxidation kombiniert, die nachgeschaltet ist. Das Konzept dieser biokatalytischen Oxidation von
Cycloalkanen zu Cycloalkanonen im wässrigen Medium basiert auf einer Doppeloxidation durch
Zusammenspiel zweier Biokatalysatoren. Eine solche Umsetzung wurde bei Einsatz einer Cytochrom
P450-Monooxygenase sowie einer Alkoholdehydrogenase bereits demonstriert (Abbildung 5).[13]
Abbildung 5: Biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen in einer Eintopf-
Zweistufen-Synthese[13]
Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung, da das
eingesetzte NAD(P)H von der Monooxygenase zu NAD(P)+ oxidiert wird, das von der
Alkoholdehydrogenase wieder zu NAD(P)H reduziert wird. Der Katalysezyklus kann ab diesem Punkt
wieder von vorne starten. Der Cofaktor kann deshalb in katalytischen Mengen zugegeben werden
und wird nicht in stöchiometrischen Mengen benötigt. Die Monooxygenase ist für die Oxidation der
inaktiven Alkane zu reaktiveren Alkoholen verantwortlich, während die Aufgabe der
Alkoholdehydrogenase in der Oxidation der gebildeten Alkohole zu den gewünschten Ketonen
besteht. Dies soll in einer Eintopf-Zweistufen-Synthese im Reaktionsmedium Wasser erfolgen. Das
Konzept erfüllt Voraussetzungen einer sog. „Dream Reaction“.[6,19] Das Reaktionsmedium Wasser ist
kostengünstig und ökologisch unbedenklich. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und
bei richtiger Handhabung meist ungiftig.[1] Der für die Reaktion benötigte Sauerstoff kann durch
Luftsauerstoff zugeführt werden. Desweiteren sind Enzyme oftmals in relativ großer Menge
herstellbar, insbesondere bei Anwendung der Hochzelldichtefermentation von rekombinanten
Stämmen. Die Vorteile solcher Mehrschritt-Eintopfreaktionen liegen in der Vermeidung der
ansonsten anfallenden zeitaufwendigen und vor allem kostenintensiven Aufarbeitungsschritte.[23,24]
Bei der Aufarbeitung und Reinigung häufen sich meist große Mengen an organischen Lösungsmitteln
an. Die Kosten für die Entsorgung der organischen Abfälle und die Beschaffung solcher organischer
Solventien fallen in Mehrschritt-Eintopfsynthesen im Reaktionsmedium Wasser sehr viel geringer
aus, was neben ökonomischen Vorteilen auch ökologische Vorteile mit sich bringt.[23] Im Gegensatz
2. Motivation und Zielsetzung
8
zu einer sequenziellen Synthese werden hier keine weiteren Cosubstrate benötigt, was sich im
Bulkchemikalien-Bereich positiv auf die Kosten auswirkt. Dies wird durch die Cofaktorregenerierung
gewährleistet. Eintopfreaktionen steigern somit die Prozesseffizienz, verbessern die
Prozessökonomie und sind ökologisch viel unbedenklicher als organokatalysierte Prozesse. Cyclische
Ketone werden als Edukte für die Bildung von Polymeren wie Nylon-6 und Nylon-12, bei der
Darstellung von Lactonen oder in der Duftstoffindustrie eingesetzt.[25] Lactone können durch die
Kombination einer biokatalytischen Oxidation mit nachfolgender biokatalytischer Baeyer-Villiger-
Oxidation dargestellt werden. Hierbei spielt vor allem ε-Caprolacton eine Rolle, das zum Kunststoff
Polycaprolacton umgesetzt werden kann.[21]
2.3 Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols durch die Kombination
der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit enzymatischer Reduktion
Ferner sollte die Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols, der in einer bereits
etablierten Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung mit einer enzymatischen Reduktion hergestellt
wird, untersucht und verbessert werden.[11,13] Es handelt sich hierbei um eine Kombination einer
metallkatalysierten Reaktion und einer Biotransformation, die ebenfalls in einer Eintopfreaktion bzw.
Tandemreaktion durchgeführt wird (Abbildung 6).
Abbildung 6: Kombination einer metallkatalysierten Reaktion mit einer Biotransformation zur
Synthese pharmazeutisch relevanter Bausteine in einer Eintopf-Reaktion
Aus dem Biarylalkohol kann Odanacatib hergestellt werden. Hierbei handelt es sich um einen
selektiven Kathepsin-K-Inhibitor, der gegen Osteoporose eingesetzt wird.[26]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
9
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus
Bacillus megaterium als Katalysatoren
3.1 Einleitung
Mit Hilfe der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium können lineare und cyclische Alkane
hydroxyliert werden. Die entstehenden Alkohole können dann mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase
zu Ketonen weiteroxidiert werden. Lineare C6-C12-Alkohole sind wichtige Bausteine für nichtionische
und anionische Tenside [21,22] und die jeweiligen cyclischen Alkohole aus dem KA-Öl sind Ausgangs-
stoffe für Polymere wie Nylon-6.6 oder Nylon-6.8. Cycloalkanone sind Edukte für die Bildung von
Polymeren wie Nylon-6 und Nylon-12.[21] Als Modellsubstrate wurden n-Butan, n-Oktan und
Cyclooktan ausgewählt. Die Reaktionen sollten ökologisch und durchführbar sein. Dafür bat sich die
Biokatalyse im wässrigen Medium in einer Eintopfreaktion an. Das Modellsubstrat Cyclooktan wurde
hierbei einer Doppeloxidation zum Cyclooktanon unterworfen.
3.2 Stand der Wissenschaft
3.2.1 Aufbau der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (BM-3)
Cytochrom P450-Enzyme gehören zu der Häm-enthaltenden Enzymklasse der Monooxygenasen. Sie
kommen in der Natur häufig vor und spielen eine wichtige Rolle bei der Entgiftung von
xenobiotischen Komponenten.[27,28] Die Cytochrom P450-Monooxygenase kann z.B. aus Bacillus
megaterium (P450 BM-3) isoliert werden.[27,29] Diese Oxygenase ist ein farbiges Enzym mit einer Häm-
Gruppe und einem sechsfach koordinierten Eisen-Komplex, der ein Absorptionsmaximum bei 450 nm
aufweist.[28] Sie enthält im Ruhezustand ein low spin Eisen(III)-Ion in einer oktaedrischen
Koordinationsumgebung. Eine axiale Position wird von einem Cysteinyl-Thiolatoligand besetzt, die
andere axiale Position von einem Aqualiganden. Das aktive Zentrum einer P450-Monooxygenase ist
somit ein Eisen-Porphyrin mit einem Cystein-Rest als fünften Liganden (Abbildung 7).[29]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
10
Abbildung 7: Darstellung des aktiven Zentrums einer Cytochrom P450-Monooxygenase
Die hier vorgestellten Biotransformationen und Anwendungen basieren auf der Cytochrom P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium (EC 1.14.14.1).[29,30] Dieser Biokatalysator ist ein
wasserlösliches, 119 kDa schweres Enzym, das aus einer 55 kDa schweren Häm-enthaltenden
Monooxygenase Domäne und einer 66 kDa schweren FAD- und FMN-enthaltenden Reduktase-
Domäne besteht (Abbildung 8).[31,32] Diese Multi-Domänen-Anordnung gewährleistet die unab-
hängige Katalyse [33,34] bei dem Elektronentransfer vom Cofaktor NAD(P)H zu dem Eisen-Ion, da alle
funktionellen Domänen auf einem einzelnen Polypeptid-Strang angeordnet sind.[34]
Abbildung 8: System bei der P450-Monooxygenase BM-3 [35]
Im Gegensatz dazu steht ein Dreikomponenten-Protein-System mit einer Cytochrom P450-
Reduktase, einem Eisen-Schwefel-Elektronencarrier und einer Cytochrom P450-Monooxygenase vor
(Abbildung 9).[35]
Abbildung 9: Dreikomponenten-System [35]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
11
In dieser Doktorarbeit wurde der Wildtyp der P450-Monooxygenase, die 19A12-, F87V- und P2B10-
Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium verwendet.
3.2.2 Mechanismus der P450-Monooxygenase-katalysierten Reaktionen
Der Katalysezyklus der P450-Monooxygenase ist gut erforscht [36] und in Abbildung 10 dargestellt. Die
dicken Balken stehen, wie in Abbildung 7 gezeigt, für den Porpyhrin-Ring.
Abbildung 10: Katalysezyklus einer P450-Monooxygenase [36]
Im ersten Schritt erfolgt eine Substratanlagerung, d.h. aus dem sechsfach koordinierten Eisen(III)-
Komplex 1 wird der fünffach koordinierte Eisen(III)-Komplex 2 (Abbildung 10). Die Substratbindung
verdrängt alle in der substratbindenden Tasche vorhandenen Wassermoleküle und bewirkt durch
vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb des Proteins in der Nähe der sechsten
Koordinationsstelle des Häm-Systems einen Übergang zur Eisen(III)-Form mit offener
Koordinationsstelle und einer stark ausgeprägten out-of-plane Struktur mit gewölbten Porphyrin-
Ring. Im zweiten Schritt nimmt der Eisen(III)-Komplex 2 unter Bildung des Eisen(II)-Komplexes 3 ein
Elektron auf und ermöglicht dadurch die Bindung des Sauerstoffs. Die Aufnahme des Sauerstoffs
findet im dritten Schritt statt und führt zu einem Eisen(III)-Superoxid 4. Der vierte Schritt ist
vermutlich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Hier führt die Aufnahme eines Elektrons zu
einem Eisen(III)-Peroxid-Komplex 5. Anschließend erfolgt die Addition von Protonen, die zur Spaltung
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
12
der O-O-Bindung unter Bildung von Wasser benötigt werden, wobei der Eisen(III)-Hyperoxid-Komplex
6 erhalten wird. Darüber hinaus kann das π-System des Porphyrin-Rings selbst zu einem
Radikalkation oxidiert werden. Diese Einheit wird als Oxenoid 7 bezeichnet. Vor seiner Freisetzung in
die Lösung ist der Alkohol wahrscheinlich kurze Zeit an das Eisen(III)-Porphyrin-Zentrum unter
Ausbildung des Komplexes 8 koordiniert.[36,37,38] Neben dem regulären Katalysezyklus gibt es noch
drei Wege, durch die es zur Dissoziation der aktivierten Sauerstoffspezies vom katalytisch aktiven
Eisen kommen kann, die sogenannten „shunt pathways“. Beim „Peroxid Shunt“ kann aus dem
Komplex 2 durch externe starke Oxidationsmittel wie Periodat oder Peroxid schon der Komplex 6
erhalten werden.[36,39] Die Reaktionsprodukte können also auch ohne den Einsatz des Cofaktors
NAD(P)H erhalten werden. Die Rückreaktion führt zur Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Beim
„Autooxidation Shunt“ entsteht der Komplex 2 durch Dissoziation eines Superoxid-Moleküls aus dem
Komplex 4. Komplex 2 kann aber auch über den „Oxidase Shunt“ aus dem Komplex 7 erhalten
werden. Hierbei wird der Sauerstoff durch Verbrauch von NAD(P)H zu Wasser reduziert.[40] Am
einfachsten kann die Hydroxylierung von C-H-Gruppen über einen Zweischritt-Mechanismus, dem
Rebound-Mechanismus (Abbildung 11) erklärt werden. Zuerst wird aus dem Substrat ein
Wasserstoffatom abstrahiert und auf den Sauerstoff des Oxenoids übertragen. Die Spaltung erfolgt
homolytisch, so dass ein Radikal im Substrat entsteht. Im zweiten Schritt, der auch Rebound-Schritt
genannt wird, bindet das Radikal im Substrat an das Eisen(IV)-OH-Intermediat, wodurch Komplex 8
entsteht, aus dem das hydroxylierte Produkt dissoziieren kann.[36,40]
Abbildung 11: Rebound-Mechanismus der Hydroxylierungsreaktion [36,40]
3.2.3 Natürliche Substrate und Eigenschaften der P450-Monooxygenase BM-3
Von der Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 ist bekannt, dass sie in der natürlich vorliegenden
Form Sauerstoff in subterminale C-H-Bindungen von Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C12 bis C18
[29,41] mit einer hohen Aktivität und einer guten Stereoselektivität an den Positionen ω-1, ω-2 oder
ω-3 [33,34,43] einfügt. Desweiteren hydroxyliert sie langkettige Fettsäureamide [29] und Fettsäure-
alkohole [29,33,34,42,43] vor allem in der Position ω-1 [44] und kann aus ungesättigten Fettsäuren und
Alkenen Epoxide bilden.[29,45,46] Die Eigenschaften der Cytochrom P450-Monooxygenase, die sie für
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
13
organisch-synthetische Anwendungen attraktiv macht, sind die Fähigkeit, ein Sauerstoff-Atom in
aktivierte und nicht-aktivierte C-H-Bindungen einzuführen (Abbildung 12), die gute Wasserlöslichkeit,
da sie nicht membran-gebunden sind und die Multi-Domänen-Anordnung. Desweiteren sind
bakterielle P450-Monooxygenasen im Gegensatz zu eukaryotischen P450-Monooxygenasen leichter
in rekombinanter Form in bakteriellen Wirtsorganismen herzustellen und zu reinigen.[28] Die
Reinigung erfolgt in einem Schritt über eine Anionen-Austausch-Chromatographie in großem
Maßstab.[47] Die Nachteile von P450-Monooxygenasen sind die NAD(P)H-Abhängigkeit, was die
Reaktionen sehr kostenintensiv machen kann und die relative Instabilität bei Temperaturen im nicht
physiologischen Temperaturbereich. Die immobilisierten P450-Monooxygenasen verlieren bei
Raumtemperatur die Hälfte ihrer Aktivität in 35 Tagen und bei 50°C sinkt ihre Aktivität auf ca. 30%.[33]
Die P450-Monooxygenasen reagieren auf Zusätze, die die Löslichkeit der unpolaren Alkane in
wässrigem Medium erhöhen sollen, mit einem Verlust der Aktivität, sobald die Konzentration von 2%
an organischen Solvens überschritten wurden.[29] So werden bei Zusatz von 14% (v/v) DMSO zur
gereinigten Monooxygenase 70% der ursprünglichen Aktivität erhalten und bei Zusatz von 28% (v/v)
DMSO waren nur noch 10% vorhanden.[48]
3.2.4 Oxidationsreaktionen
Die kontrollierte, selektive Oxidation von nicht-aktivierten C-H-Bindungen ist eine der am meisten
gewünschten Transformationen der Katalyse.[44,49] Die Forschung der letzten Jahre konzentrierte sich
auch zunehmend auf die Hydroxylierung von n-Alkanen, Cycloalkanen und Aromaten mit Hilfe der
P450-Monooxygenase BM-3 und abgeleiteten Mutanten gemäß Abbildung 12.
Abbildung 12: Reaktionsprinzip einer Cytochrom P450-Monooxygenase
Allerdings zeigte der natürliche Typ kaum Aktivität gegenüber n-Alkanen und Cycloalkanen.
ADAM et al. zeigten im Jahr 2000 zum ersten Mal, dass eine P450-Monooxygenase BM-3 offenkettige
Alkane von n-Hexan bis n-Nonan und Cycloalkane von Cyclohexan bis Cyclooktan hydroxylieren
kann.[44] Diese Arbeitsgruppe bestimmte keinen Umsatz, sondern eine Produktbildung und machte
Angaben über die Regio- und Stereoselektivität der P450-Monooxygenase BM-3. Die Produktbildung
kann in mol/l oder in g/l angegeben werden. Die Hydroxylierungen von Alkanen sind meist regio- und
stereoselektiv, wobei keine Hydroxylierung an der ersten Position beobachtet wurde und nur
(S)-Produkte gebildet wurden.[44] Die Regioselektivität hing von der Kettenlänge ab, wobei sterische
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
14
Effekte bei längerkettigen Alkanen mit einer Kettenlänge von mehr als sechs Kohlenstoffatomen als
Grund identifiziert wurden. Bei n-Hexan wurden beispielsweise nur die beiden Produkte Hexan-2-ol
mit einer Enantioselektivität von 93% ee und Hexan-3-ol mit 54% ee gebildet, wobei die
3-substituierte Verbindung mit einer Regioselektivität von 57% das Hauptprodukt war.[44] Mit
n-Oktan als Substrat wurden insgesamt drei Oxidationsprodukte erhalten: Oktan-2-ol und Oktan-3-ol
wurden mit einer Enantioselektivität von über 99% ee erhalten, während Oktan-4-ol nur mit einer
niedrigen Enantioselektivität von 6% ee isoliert wurde. Das Hauptprodukt war die 2-substituierte
Verbindung mit einer Regioselektivität von 53%. Die Enantioselektivität stieg mit zunehmender
Kettenlänge auf bis zu 99% ee an.[44] Die Untersuchungen zeigten, dass bei Cycloalkanen generell die
größeren Ringe und bei offenkettigen Alkanen die längeren Ketten als bessere Substrate gelten, da
sie den natürlichen Substraten der P450-Monooxygenase BM-3 mehr ähneln.[44]
3.2.5 Optimierung der P450-Monooxygenase BM-3 durch Mutation
In den letzten Jahren wurde daran geforscht, geeignete Monooxygenase-Mutanten zu finden, die
eine höhere Aktivität als der Wildtyp aufweisen. Zur Verbesserung der Aktivität gegenüber Alkanen
durch gerichtete Evolution wurde ein schneller und reproduzierbarer Test benötigt.[29] Dabei wurde
zuerst eine Bibliothek von Genen aus Mutanten der P450-Monooxygenase BM-3 in E. coli
transformiert und auf eine Agar-Platte aufgebracht. Die entstehenden Kolonien wurden einzeln auf
eine Mikrotiter-Platte übergeimpft, auf der sie über Nacht wachsen konnten. Die Kolonien wurden
anschließend zur Expression auf eine neue Mikrotiter-Platte gegeben.[29] Danach wurde ein
kolorimetrischer Assay durchgeführt. Hierzu wurde das n-Oktan-Derivat p-Nitrophenoxyoktan (9)
eingesetzt, das unter Bildung eines instabilen Hemiacetals 10 hydroxyliert wurde. Das Hemiacetal
zerfiel zum gelben p-Nitrophenolat (11) und dem korrespondierenden Aldehyd 12 (Abbildung 13).
Durch die Bildung des gelben Phenolats konnte die Aktivität der einzelnen Mutanten bezüglich 9
berechnet werden. Durch diesen Test fanden FARINAS et al. heraus, dass die besten Mutanten mehr
als fünfmal aktiver gegenüber n-Oktan sind als der Wildtyp.[29] Anstelle von 9 konnten auch p-
Nitrophenoxycarbonsäuren, wie z. B. p-Nitrophenoxydodekansäure oder –pentadekansäure [42]
eingesetzt werden, die ebenfalls zum Chromophor p-Nitrophenolat (11) zerfielen.[42,43]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
15
Abbildung 13: Screening-Assay für die Aktivität bei der Oxidation von Alkanen mit
p-Nitrophenoxyoktan (9) [29]
ADAM et al. demonstrierten 2001, dass die P450-Monooxygenase BM-3 kürzerkettige, unverzweigte
Arylalkane wie Propylbenzol und Allylbenzol selektiv an der α-Position hydroxyliert. Bei
längerkettigen Arylalkanen wie Pentylbenzol wurde die Hydroxylierung an der α-, β-, γ- und δ-
Position beobachtet, was auf sterische Gründe zurückzuführen ist. Desweiteren zeigte diese
Arbeitsgruppe, dass die P450-Monooxygenase BM-3, die in Alginat-Gel immobilisiert wurde, eine
höhere Aktivität für die Oxidation dieser Substrate zeigte als das frei vorliegende Enzym.[50] Im
gleichen Jahr stellten APPEL et al. fest, dass eine dreifach mutierte P450-Monooxygenase aus Bacillus
megaterium (F87V/L188Q/A74G) eine hohe Aktivität gegenüber einigen Aromaten aufweist. Es ist
gelungen, den Heteroaromaten Indol zu hydroxylieren, der vom Wildtyp nicht akzeptiert wird. Als
weitere Beispiele sind Naphthalin und der Heteroaromat 8-Methylchinolin zu nennen.[32]
Die Mutante 139-3 der P450-Monooxygenase BM-3 wurde im Jahr 2003 von FARINAS et al. zur
Epoxidierung von Styrol, Benzol, Cyclohexen, 1-Hexen und Propylen eingesetzt. Die Substrate wurden
von dieser Mutante viel schneller umgesetzt als durch den Wildtyp.[46] Im selben Jahr setzte die
Arbeitsgruppe um ARNOLD die Mutante 1-12G ein, für die bei der Hydroxylierung von n-Oktan zu 2-
Oktanol eine Regioselektivität von 82% und 39% ee für das (R)-Enantiomer erhalten wurden.[51]
Eine Arbeit von WATANABE et al. aus dem Jahr 2007 beschrieb die Oxidation von acyclischen Terpenen
mit einer Dreifach-Mutanten der Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 (R47L/Y51F/F87V) mit einer
teilweise sehr hohen Effizienz.[52]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
16
Im Jahr 2011 verwendete die Arbeitsgruppe von URLACHER die Mutante F87A/A328V, bei der die
Substitution der größeren Phenylalanin-Gruppe durch die kleinere Alanin-Gruppe sich als vorteilhaft
im Bezug auf die Hydroxylierung von cyclischen C8-bis C12-Alkanen erwies. [53] Desweiteren wurde das
Substrat durch weitere Mutation während der Katalyse besser stabilisiert, da die Form der
Substratbindungstasche passender ist.[53] Diese Mutante konnte sowohl Cyclooktan, als auch
Cyclodekan und Cyclododekan hydroxylieren. Hierbei wurden Umsätze von 80% für die Bildung von
Cyclooktanol, 60% für die Bildung von Cyclodekanol und 46% für die Bildung von Cyclododekanol
erhalten.[53] Die von der Arbeitsgruppe verwendete Mutante F87V/A328F zeigte hohe Aktivitäten
sowohl für das Substrat Cyclooktan als auch für das Substrat n-Oktan. Hierbei wurde Cyclooktanol
mit einem Umsatz von 75% erhalten und 2-(R)-Oktanol mit einem Umsatz von 15%, einem ee-Wert
von 46% und sehr guter Regioselektivität von 92%.[53]
Zusammenfassend ist die Hydroxylierung von Alkanen und Aromaten mit Hilfe der Cytochrom P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium ein aktuelles Forschungsgebiet. Das Screening nach
wichtigen Mutanten ist eine gut etablierte Methode. Durch diese Mutanten konnten sogar nicht-
natürliche Substrate mit kurzer Kettenlänge umgesetzt werden.
3.2.6 Hydroxylierung von gasförmigen n-Alkanen
Im Jahr 2002 wurde von GLIEDER et al. gezeigt, dass eine modifizierte P450-Monooxygenase BM-3
auch gasförmige Alkane oxidieren konnte.[34] Das bis 2002 kleinste bisher hydroxylierte Alkan war
Propan, das mit einer Selektivität von über 95% an der zweiten Position unter Bildung von
Isopropanol von der Mutante 139-3 der P450-Monooxygenase BM-3 hydroxyliert wurde.[34] Die
Mutante hydroxylierte auch n-Butan mit einer Selektivität von 100% zu 2-Butanol, wobei
turnover rates von 1.830 erreicht wurden.[34] Die Reaktionen wurden ohne Cofaktorregenerierung
durchgeführt. Die Arbeitsgruppe um ARNOLD setzte im Jahr 2003 die Mutante 1-12G ein, die Propan
mit einer Regioselektivität von 97% zu 2-Propanol umsetzen konnte. Hierbei wurde eine TTN von
6000 erreicht.[51]
Eine 2011 erschiene Arbeit von ZILLY et al. beschäftigte sich mit der Oxidation von Methan, Propan
und n-Butan mit Hilfe der P450-Monooxygenase BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium.
Desweiteren wurde der Einfluss von chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren auf das P450-Enzym
untersucht.[54] Die Gesamtproduktkonzentration von 2-Butanol lag ohne Zugabe von Perfluoro-
carbonsäuren bei 1.2 mM bei einer TON von 527 und einem ee-Wert von 24%.[54] Die katalytische
Aktivität erhöhte sich durch Zugabe eben dieser Säuren für das System mit n-Butan. Die Gründe
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
17
lagen im Übergang des Fe/Häms von einem Low-Spin- in einen High-Spin-Zustand und die
Verkleinerung der Bindungstasche, aufgrund der sterisch anspruchsvollen CF3-Gruppe.[54] Dadurch
wurden die kleinen Substratmoleküle in der Bindungstasche besser fixiert. Es wurde im besten Fall
mit der Perfluorocarbonsäure 13 eine Gesamtproduktkonzentration von 8.4 mM erreicht. Die TON
betrug 3632 und der ee-Wert lag bei ebenso niedrigen 22%, d.h. die Perfluorocarbonsäure verbessert
nicht die Stereoselektivität, aber Bildung des Produkts.[54] Diese Arbeitsgruppe konnte auch
erfolgreich die Oxidation von Methan durchführen. Hierbei wurde mit der Perfluorocarbonsäure 14
eine Gesamtproduktkonzentration von 3.31 mM und einer TON von 2472 erhalten.[54] Die
Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 sind in Abbildung 14 dargestellt.
Abbildung 14: Die chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 [54]
3.2.7 Syntheseanwendungen der P450-Monooxygenasen
3.2.7.1 Hydroxylierung von Alkanen, Cycloalkanen und Fettsäuren
Es wurde gezeigt, dass Alkane und Cycloalkane von der P450-Monooxygenase aus Bacillus
megaterium (P450-BM3) hydroxyliert werden können, allerdings sind nur wenige organisch-
synthetische Arbeiten bekannt. Im Jahr 2000 experimentierten ADAM et al. mit dem Wildtyp dieser
Monooxygenase und testeten sie auf ihre Aktivität für die Oxidation von Alkanen.[44] Im Laufe der
Jahre erkannte man die Vorteile von Mutanten der P450-Monooxygenase BM-3, die viele Substrate,
oftmals auch nicht typische Substrate, schneller umsetzen konnten. Die erste bekannte Kombination
aus immobilisierter P450-Monooxygenase und einem kostengünstigeren Cofaktorregenerierungs-
system mit einer Formiatdehydrogenase (FDH) wurde 2003 durch MAURER et al. etabliert.[33] Bei
dieser Cofaktorregenerierung wurde Formiat unter Verbrauch von NADP+ zu Kohlendioxid abgebaut.
Dieses Gas wurde dem Gleichgewicht entzogen und somit das Gleichgewicht auf die Seite des
Alkohols verschoben.[33] Hier wurden sowohl Naphthalin als auch n-Oktan hydroxyliert.[33] Im Jahr
2005 verwendeten MAURER et al. ein Zweiphasen-System als Reaktionsmedium, wobei Cyclohexan 15
die organische Phase darstellte und auch als Solvens fungieren konnte.[27] Die eingesetzte Mutante
der P450-Monooxygenase BM-3 war NADH- und nicht NADPH-abhängig, weshalb für die enzym-
gekoppelte Cofaktorregenerierung eine NADH-abhängige Formiatdehydrogenase verwendet wurde.
Mit Hilfe dieses sehr stabilen Systems, das in Abbildung 15 dargestellt ist, konnten auch n-Oktan und
Myristinsäure umgesetzt werden. Die Aufarbeitung vereinfachte sich, da das Enzym und der Cofaktor
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
18
in der wässrigen Phase verblieben, während das Produkt in die organische Phase überging.[27] Die
Arbeitsgruppe bestimmte keinen Umsatz, sondern charakterisierte die Reaktion anhand der
Produktbildung.
Abbildung 15: Hydroxylierung von Cyclohexan (15) zu Cyclohexanol (16) in einem
Zweiphasensystem[27]
3.2.7.2 Anwendung als Katalysator in der Steroid-Synthese
Cortison (18) wird auf konventionellen, chemischen Wege aus der Gallensäure (17) über 30 Stufen
hergestellt (Abbildung 16).[55] Von diesen vielen Schritten benötigt man allein 12 Stufen, um die 12-
Hydroxyfunktion in die 11-Position umzulagern.
Abbildung 16: Konventionelle chemische Synthese von Cortison (18) [55]
In der Steroid-Synthese finden mehr als zehn verschiedene P450-Monooxygenasen Anwendung.
Besondere Bedeutung haben hierbei die 7α-, 9α-, 11α-, 11β- 14α- und 16α-Hydroxylierung
erlangt.[55] Das weibliche Sexualhormon Progesteron (20) [56] wird aus Diosgenin (19), das aus der
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
19
Barbasco-Wurzel isoliert wird, hergestellt. Progesteron (20) und seine 11α-hydroxylierte
Verbindung 21 sind Zwischenstufen in der chemisch-mikrobiologischen Synthese des Steroids 18
(Abbildung 17).
Abbildung 17: Chemisch-mikrobiologische Synthese von Cortison (18) [55]
Das Hormon 20 kann beispielsweise an der 11α-Position von P450-Monooxygenasen hydroxyliert
werden. Die Monooxygenasen, die diese Reaktion katalysieren, werden aus den Köpfchen-
schimmelpilzen Rhizopus nigrans und Rhizopus arrhizus gewonnen.[55] Durch die biokatalytische
Hydroxylierung von Progesteron (20) zu 11α-Hydroxyprogesteron (21) verkürzen sich die 30 Stufen
der konventionellen chemischen Synthese auf 15 Schritte, wodurch die Kosten erheblich reduziert
werden.[55]
Das C27-Steorid Cholesterin (22) ist eine Vorstufe von biologisch aktiven Steroidhormonen im
menschlichen Organismus.[57] Es wird zu Androstendion (23) abgebaut, das als Ausgangsbaustein
unterschiedlichster Synthesen verwendet wird. Es kann beispielsweise mikrobiologisch zum
Testosteron (24) reduziert werden (Abbildung 18).[55]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
20
Abbildung 18: Abbau des Steroids 22 zu Androstendion (23) und Reduktion zu Testosteron (24) [55]
3.2.7.3 Epoxidierung von Alkenen und Aromaten
Desweiteren sind P450-Monooxygenasen fähig, Doppelbindungen zu epoxidieren. Chirale Epoxide 26
können durch Verwendung von chiralen MnII-Salen-Katalysatoren erhalten werden.[45] Der Nachteil
ist die geringe Stabilität bezüglich der Autooxidation, was sich in den niedrigeren turnover numbers
(TON) bemerkbar macht. Die TON errechnet sich aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten
Produkts und der Stoffmenge des eingesetzten Katalysators. Im Gegensatz dazu ist die turnover
frequency (TOF) der Quotient aus TON und der Reaktionszeit.[4a] Ein Ansatzpunkt zur Lösung des
Stabilitätsproblems, das auf Autooxidation zurückzuführen ist, ist der Einsatz einer P450-
Monooxygenase. Für die asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 wurde eine NADH-
abhängige Styrol-Monooxygenase (StyAB) von Pseudomonas sp. verwendet. Diese bestand aus einer
Oxygenase-Einheit (StyA) und einer Reduktase-Einheit (StyB) (Abbildung 19). Die Reaktion lief in
einem Zweiphasen-System ab und erzielt hohe TON. Die Monooxygenase und die FDH, die den
Cofaktor NADH regenerierte, verblieben in der wässrigen Phase, während das entstehende Epoxid in
die organische Phase überführt wurde.[45]
Abbildung 19: Biokatalytische, asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 durch eine
Pseudomonas sp. Styrol-Monooxygenase [45]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
21
Eine Dreifach-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium wurde 2003 von FARINAS
et al. zur Epoxidierung von Styrol, Benzol, Cyclohexen, 1-Hexen und Propylen eingesetzt. Die
Substrate wurden von dieser Mutante viel schneller umgesetzt als vom Wildtyp.[46]
3.2.7.4 Einsatz der P450-Monooxygenase bei der chemoenzymatischen Fluorierung
von inaktiven organischen Substanzen
Ein neues Anwendungsgebiet von Monooxygenasen hatte sich 2009 in der Arbeitsgruppe um FASAN
in der chemoenzymatischen Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen ergeben
(Abbildung 20). Hier wurde die Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium in einem
Zweistufen-Prozess eingesetzt. Der erste Schritt war die enzymatische Hydroxylierung durch die
Monooxygenase und der zweite Schritt war die Deoxofluorierung mit Hilfe einer Substanz, die Fluorid
abgeben kann.[58] Durch die Substitution eines Wasserstoffatoms durch ein Fluoratom erhoffte man
sich in der pharmazeutischen Industrie große Fortschritte. Die Fluorierung erhöht die
Bioverfügbarkeit, verbessert die Affinität des Rezeptors bezüglich des Arzneimittels und erniedrigt
die Toxizität, da fluorierte Moleküle stabiler gegenüber dem Metabolismus sind.[59]
Abbildung 20: Chemoenzymatische Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen [58]
3.2.7.5 Hydroxylierung von (monosubstituierten) Benzolen
Monosubstituierte Benzole, wie Vanillin oder Guaicaol, werden in der Duftstoff- und in der
Pharmaindustrie verwendet.[60] Die Arbeitsgruppe um SCHWANEBERG entwickelte 2012 die P450 BM-3-
Variante M2 (R47S/Y51W/I401M) für die regioselektive und aromatische Hydroxylierung von p-
Xylol.[61] Mit dieser Mutante konnten die Kupplungseffizienzen gegenüber dem Wildtyp deutlich
gesteigert werden und sie setzte Anisol, Toluol, Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodbenzol um, während der
Wildtyp Fluor- und Iodbenzol nicht hydroxylieren konnte.[60] Die Mutante erreichte für alle
monosubstituierten Benzole mit Ausnahme des Fluorbenzol exzellente Regioselektivitäten für die
o-Hydroxylierung mit über 90%. Das beste Ergebnis wurde mit dem Substrat Anisol erzielt.[60] Hier
erreichte man eine iTOF (Anfangsumsatzgeschwindigkeit) von 38.6 s-1 und eine spezifische Aktivität
von 19.5 U/mgP450, was zu diesem Zeitpunkt die höchste Produktbildungsgeschwindigkeit für diese
Art von Reaktion darstellte.[60]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
22
Die Arbeitsgruppe um WATANABE beschäftigte sich mit der Hydroxylierung von Benzol mit Hilfe des
Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 durch Zugabe von Perfluorocarbonsäuren (PCF), die sich
nur in der Alkylkettenlängen unterschieden, und veröffentlichte im Jahr 2013 seine Ergebnisse.[62] Das
beste Ergebnis wurde durch Zugabe von PCF9 erhalten. Die Rate lag hier bei 120 min-1 bei einer
Kupplungseffizienz von 24%. Der Wildtyp wies im Gegensatz zu der Mutante F87A eine höhere
Regioselektivität zur Bildung des ortho-Produkts auf und erreichte für das Substrat Toluol TON von
220 min-1. Die Verschlechterung der ortho-Selektivität bei Einsatz der F87A-Mutante lag an den
Aminosäuren im aktiven Zentrum der Monooxygenase. Das auf der Distalseite des Häms liegende
Phe87 konnte mit Toluol reagieren und eine ortho-selektive Hydroxylierung induzieren. Durch den
Austausch der Mutante an Position 87 war das nicht mehr in dem Ausmaß gegeben.[62]
3.2.8 Alkoholdehydrogenase
Die Alkoholdehydrogenasen (ADH) zählen zur Gruppe der Dehydrogenasen. Diese verbrauchen bzw.
bilden NADH und NADPH. Die Alkoholdehydrogenasen, die die Oxidation von Alkoholen zu den
entsprechenden Aldehyden und Ketonen und die Reduktion der Ketone zu den entsprechenden
sekundären Alkoholen katalysieren, kann man grob in (S)- und (R)-selektive ADHs unterteilen.
Bekannte Vertreter von (S)-selektiven sind die Alkoholdehydrogenasen aus Rhodococcus erythropolis
bzw. aus Rhodococcus ruber. Die NADPH-abhängigen (R)-selektiven ADHs aus Lactobacillus brevis und
Lactobacillus kefir sind homotetramer und gehören zur Familie der kurzkettigen Dehydrogenasen /
Reduktasen (SDR).[63,64] In dieser Doktorarbeit wurde meist eine (R)-selektive Alkoholdehydrogenase
aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) verwendet.
3.2.8.1 Aufbau der Alkoholdehydrogenasen
Die beiden Alkoholdehydrogenasen aus Rhodococcus erythropolis und Lactobacillus kefir besitzen für
eine Reihe von Substraten eine sehr hohe spezifische Aktivität von mehr als 1000 U/mg.[65] Die
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) hat zwei Magnesium-Ionen, die von zwei (R)-
ADH-Ketten komplexiert werden, was eine Stabilisierung der Quartärstruktur zur Folge hat. Das
aktive Zentrum beinhaltet mehrere Wassermoleküle, die in einer hydrophilen Tasche zu finden sind.
Diese Tasche wird von mehreren Carbonyl-Sauerstoff-Atomen und den Hydroxy-Gruppen der
Seitenkette umgeben.[63] Die LK-ADH ist genau wie die LB-ADH (R)-selektiv und NADPH-abhängig. Die
beiden Alkoholdehydrogenasen besitzen verschiedene, gemeinsame Motive für die Cofaktor-
Bindungsstelle. Bei der LB-ADH kann durch Austausch von Glycin durch Asparaginsäure an
Position 37 die Abhängigkeit von NADPH in Richtung des billigeren Cofaktors NADH geschoben
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
23
werden (RADH-G37D). Die Reduktion vom Keton zum Alkohol erfolgt über die katalytische Tetrade
und das ausgedehnte Protonenübertragungssystem (Abbildung 21).[64]
Abbildung 21: Röntgenstruktur der katalytischen Tetrade (in magenta) und des
Protonenübertragungssystems (gestrichelte Linien) von RADH-G37D [S][64]
Die wichtigsten vier an der Reaktion beteiligten Aminosäuren sind hierbei Asn113 (Asparagin), Lys159
(Lysin), Ser142 (Serin) und Tyr155 (Tyrosin). Die Reaktion startet bei der katalytischen Säure Tyrosin,
die während der Reaktion deprotoniert wird und dadurch vom positiv geladenen Lysin stabilisiert
wird.[66] Die Seitenkette des Serins ist nötig, um das Substrat zu fixieren und darüber hinaus
beeinflusst Serin bei SDRs gemäß BLANKENFELDT et al. den pKa-Wert des Tyrosin-Rests und des
Substrats. Dadurch bildet sich eine energieärmere Wasserstoffbindung aus, in deren
Übergangszustand ein Wasserstoffatom von zwei Bindungspartnern geteilt wird.[67] FILLING et al.
zeigte, dass ein ausgedehntes Protonenübertragungssystem existiert, an dem die katalytische
Tetrade, Coenzyme, Wasser und das Substrat beteiligt sind. Bei der Alkoholdehydrogenase aus
Drosophila existiert ein großes wasserstoffgebundenes Lösungsmittelnetzwerk, in dem das Wasser
sowohl an den Asparagin-Rest als auch an den Lysin-Rest gebunden ist.[68]
3.2.8.2 Anwendung
Die wichtigste Funktion der Alkoholdehydrogenasen besteht in der Reduktion von prochiralen
Ketonen 27a zur Synthese chiraler sekundärer Alkohole 28a (Abbildung 22). Die Reduktionsreaktion
ist hochenantioselektiv. Hierbei werden ein Wasserstoffatom und zwei Elektronen von NADPH auf
das Keton übertragen.[1]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
24
Abbildung 22: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen 27a zu sekundären chiralen
Alkoholen 28a
In dieser Doktorarbeit wird die Alkoholdehydrogenase aber meist als Katalysator für die Oxidation
eines sekundären Alkohols zum korrespondierenden Keton verwendet (Abbildung 23).
Abbildung 23: Oxidation von sekundären chiralen Alkoholen 28a zu Ketonen 27a
In dieser Doktorarbeit werden die Alkoholdehydrogenasen sowohl für die Oxidations- bzw.
Reduktionsreaktion als auch für eine in situ-Cofaktorregenerierung angewendet. Unter Anderem
wird die Alkoholdehydrogenase mit einer Cytochrom P450-Monooxygenase gekoppelt. Die P450-
Monooxygenase bildet aus einem Cycloalkan oder einem n-Alkan 29 unter Verbrauch von NAD(P)H
und Bildung von NAD(P)+ den entsprechenden Alkohol 28b. Der gebildete Alkohol 28b wird von der
Alkoholdehydrogenase zum Keton 27b unter Verbrauch von NAD(P)+ und Bildung von NAD(P)H
oxidiert. Der reduzierte Cofaktor steht somit für den nächsten Katalysezyklus zur Verfügung
(Abbildung 24). Basierend auf diesem Konzept konnte auf den Zusatz eines Cosubstrats verzichtet
werden.[13]
Abbildung 24: Konzept der in situ-Cofaktorregenerierung durch Kombination einer Cytochrom P450-
Monooxygenase mit einer ADH [13]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
25
Bei dem Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung [10,13,69] (Abbildung 25) wird die
Fähigkeit der Alkoholdehydrogenase ausgenutzt, dass sie sowohl ein Keton 27c reduzieren, als auch
einen Alkohol 28c oxidieren kann. Die Alkoholdehydrogenase bildet aus Isopropanol (30) unter
Verbrauch des Cofaktors NADP+ Aceton (31). Das dadurch gebildete NADPH wird von der
Alkoholdehydrogenase verwendet, um aus einem Keton 27c den chiralen sekundären Alkohol 28c zu
bilden. Das Keton 31 kann im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden, wodurch das
Gleichgewicht in Richtung von 28c geschoben wird. Zusammenfassend entsteht aus Isopropanol (30)
und einem Keton 27c unter Einsatz des Cofaktors NADP+ Aceton (31) und der gewünschte chirale
sekundäre Alkohol 28c.[6]
Abbildung 25: Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung mit einer ADH [6,10,13,69]
Ein Beispiel für eine enzymgekoppelte Cofaktorregenerierung ist die Kombination einer
Glucosedehydrogenase (GDH) und D-Glucose (32) mit einer Cytochrom P450-Monooxygenase, die im
Laufe dieser Doktorarbeit auch Anwendung findet (Abbildung 26).
Abbildung 26: Konzept der enzymgekoppelten Cofaktorregenerierung durch Kombination einer
Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer GDH [10,13,69]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
26
3.3 Aspekt der Zielprodukte: Alkohole und Cycloalkanone in der Bulkindustrie
3.3.1 Industrielle Herstellung der Verbindungen
3.3.1.1 2-Butanol
Die Gesamtproduktion von Butanolen (1-Butanol, Isobutanol, 2-Butanol, tert-Butanol) lag 1999 in
den USA, Westeuropa, BRD und Japan bei insgesamt 3.14 Mio. Jahrestonnen (jato), wobei auf die
BRD im Jahr 1999 0.68 Mio. jato fallen.[21] 1-Butanol kann durch Propenhydroformylierung mit
anschließender Hydrierung, durch das REPPE-Verfahren (Umsetzung von Propen mit CO und Wasser
in Gegenwart einen modifizierten Eisenpentacarbonyl-Katalysators), durch eine Aldolkondensation
des Acetaldehyds mit nachfolgender Hydrierung des Crotonaldehyds und durch Fermentation von
Zucker oder Stärke gewonnen werden.[21] 2-Butanol (35) kann durch säurekatalysierte Hydratisierung
von 2-Buten (34), das durch Cracken aus dem Erdöl gewonnen wird, hergestellt werden
(Abbildung 27). Der sekundäre Alkohol 35 wird auch durch indirekte Hydratisierung aus 1-Buten und
der Verbindung 34 mit anschließender Hydrolyse hergestellt, kann aber auch durch die REPPE-
Hydrocarbonylierung hergestellt werden.[21]
Abbildung 27: Säurekatalysierte Hydratisierung von 2-Buten (34) zur Synthese von 2-Butanol (35) [21]
3.3.1.2 Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole
Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole 38 werden durch partielle Oxidation von Paraffinen 36, die aus
Kerosinfraktionen gewonnen werden, durch Einsatz von Borsäure (H3BO3, 37a) und Sauerstoff nach
BASHKIROV, erhalten (Abbildungen 28, 29). Die Oxidation verläuft ohne Kettenabbau oder Struktur-
isomerisierung und liefert bis zu 98% sekundäre Alkohole, die die gleiche Kettenlänge wie das
eingesetzte n-Alkan aufweisen. In der folgenden Abbildung 28 ist die Bruttoreaktionsgleichung der
partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV zu sehen.[21]
Abbildung 28: Bruttoreaktionsgleichung der partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach
BASHKIROV [21]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
27
Die Borsäure (37a) liegt bei den Reaktionsbedingungen zumeist als Metaborsäure (HBO2, 37b) vor.
Zuerst bildet das n-Alkan ein sekundäres Alkylhydroperoxid 39, das mit der Metaborsäure zum
Borsäureester 40 reagiert. Dadurch wird eine Folgeoxidation der Alkohole verhindert. Durch
anschließende Hydrolyse erhält man die sekundären Alkohole 38 und die Metaborsäure (37b), die
wieder dem Katalysezyklus zugeführt wird (Abbildung 29).[21]
Abbildung 29: Partielle Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV [21]
3.3.1.3 Cyclische Alkohole und Ketone
In den 1940er wurde die Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan (15) entwickelt. Hierbei
entstand ein Gemisch aus dem Alkohol Cyclohexanol (16) und dem Keton Cyclohexanon (41). Dieses
Gemisch nannte man KA-Öl, wobei das K für Keton und A für Alkohol stand. Als Katalysatoren wurden
z.B. Mangan- oder Cobalt-Salze eingesetzt (Abbildung 30).
Abbildung 30: Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan 15 zu KA-Öl [21]
Bei leicht veränderten Reaktionsbedingungen (140-180°C, 8-20 bar) [70] wurde neben einem Cobalt-
Katalysator auch er Einsatz eines Chrom-Katalysators untersucht, wodurch das Verhältnis von
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
28
Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41) beeinflusst werden konnte.[70] Bei der Verwendung eines
Cobalt-Katalysators wurde ein höheres Verhältnis des Alkohols 16 zum Keton 41 erhalten als bei der
Verwendung eines Chrom-Katalysators, da der Chrom-Katalysator die Dehydratisierung des
Zwischenprodukts Cyclohexylhydroperoxid (42) zu Cyclohexanon (41) begünstigt.[70]
3.3.1.3.1 Industrielle Herstellung von Cycloalkanonen
In den 1950er wurde Borsäure dem Prozess zugesetzt, die sie Selektivität der Reaktion erhöht.[6,21] In
diesem BASHKIROV-Prozess wurde in Anwesenheit von Borsäure, das zuerst entstehende
Cyclohexylhydroperoxid (42) direkt zum Cyclohexanolborsäureester (43) umgesetzt, das vor weiterer
Oxidation zu offenkettigen Produkten geschützt ist (Abbildung 31).[6,70]
Abbildung 31: Oxidation von Cyclohexan 15 nach BASHKIROV [21]
Der BASHKIROV-Prozess wird heutzutage zur großtechnischen Herstellung von Cycloalkanonen, die
mehr meist mehr als acht C-Atome besitzen, angewendet. Die Nachteile dieses mehrstufigen
Verfahrens liegen an dem hohen Bedarf an Borsäure, die stöchiometrisch eingesetzt werden muss,
an der nur bei Umsätzen unter 40% akzeptablen Selektivität der Reaktion und dem sich dadurch
notwendigen aufwändigen Trennprozess mittels Destillation, der einen hohen Verbrauch an
organischen Lösungsmitteln erfordert.[71] Desweiteren sind die entstehenden Borverbindungen
schwer zu entsorgen. In den Jahren 2008 und 2009 wurde ein neuer Prozess zur großtechnischen
Herstellung von Cycloalkanonen beschrieben. Hierbei wurden Cycloalkene zu Cycloalkanonen
umgesetzt. Als Oxidationsmittel wurde hierbei Distickstoffmonoxid statt Sauerstoff eingesetzt.[72,73]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
29
3.3.2 Industrielle Verwendung der hergestellten Produkte
Die in dieser Doktorarbeit hergestellten linearen und cyclischen Alkohole, Cycloalkanone und
ε-Caprolacton werden industriell als Edukte für weitere Verbindungen verwendet (Abbildung 32).
Abbildung 32: Industriell wichtige Produkte, die aus 2-Butanol (35), linearen Alkoholen und dem
cyclischen Alkohol 16 hergestellt werden [21,22]
Das n-Butan kann biokatalytisch zu 2-Butanol (35) hydroxyliert werden, das industriell zu Methyl-
keton (MEK, 44) umgesetzt wird. Lineare Alkohole sind wichtige Bausteine für Tenside und können
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
30
durch die biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen erhalten werden. Cycloalkanole können auf
dem gleichen Wege aus Cyclolkanen erhalten werden. Die Cycloalkanole können weiter zu
Dicarbonsäuren umgesetzt werden, die mit Diaminen zu Polymeren wie Nylon-6.6 (49) reagieren. So
kann aus Cyclohexanol (16) Adipinsäure (58) hergestellt werden, das weiter zum Polyamid 49
umgesetzt kann (Abbildung 32).[21,22] Cycloalkanone sind Ausgangsstoffe für die Bildung von Poly-
meren wie Nylon-6 51 und Nylon-12 52, Edukte bei der Darstellung von Lactonen oder Edukte in der
Duftstoffindustrie. Cyclododecanon (50) kann beispielsweise durch Behandlung mit elementarem
Brom zu 2-Bromcyclododecanon und 2-Dibromcyclododecanon umgesetzt werden, die als Ausgangs-
stoffe in der Duftstoff-Industrie verwendet werden.[25] Lactone können durch die Kombination einer
biokatalytischen Oxidation mit nachfolgender biokatalytischer Baeyer-Villiger-Oxidation dargestellt
werden. Hierbei ist als wichtigstes Lacton das ε-Caprolacton (53) zu nennen, das aus dem Cyclo-
alkanon 41 entsteht und zum Kunststoff Polycaprolacton (PCL, 54) umgesetzt werden kann
(Abbildung 33).[21]
Abbildung 33: Industriell wichtige Produkte, die aus den cyclischen Ketonen 41 und 50 und dem
Lacton 53 hergestellt werden[21]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
31
3.3.2.1 2-Butanol
Das 2-Butanol wird vor allem als Zwischenprodukt verwendet. Die wichtigste Verwendung findet der
Alkohol 35 als Edukt für die Herstellung des Ketons 44 von dem 1992 in den USA, Westeuropa und
Japan 0.59 Mio. jato hergestellt wurden, während es 2004 schon 1.2 Mio. jato waren.[21] Das
Methylketon (44) wird vor allem als Lösemittel für Lacke und Harze und zur Entparaffinierung von
Schmierölen eingesetzt. Durch die Umsetzung mit Wasserstoffperoxid entsteht Methylethylketon-
peroxid, das zur Härtung von ungesättigten Polyesterharzen verwendet wird.[21]
3.3.2.2 Lineare C6-C18-Alkohole
Bei linearen Alkoholen erfolgt eine Ethoxylierung zu Fettalkoholpolyglykolethern (FAE) 45, die
nichtionische Tenside sind (Abbildung 34). Dabei entsteht in einem Zwischenschritt der
Hydroxyalkylether 55.[21,22]
Abbildung 34: Ethoxylierung von linearen Alkoholen zu Fettalkoholpolyglykolethern 45 [21,22]
Diese Art von Tensiden zeichnet sich durch ihre inverse Löslichkeit aus, d.h. diese Verbindungen
lösen sich in kaltem Wasser besser als im warmen Wasser. Dieser Effekt kommt durch die Entstehung
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Sauerstoff der Etherbrücken und den Wasser-
molekülen zustande. Die Wasserstoffbrückenbindungen brechen bei höheren Temperaturen auf. Die
Fettalkoholpolyglykolether 45 finden deshalb vor allem Anwendung in Flüssigwaschmitteln bei
Niedrigtemperaturwäsche. Die linearen Alkohole können mit Schwefelsäure oder Schwefeltrioxid
direkt unter Darstellung von Fettalkoholsulfaten (FAS) 47 verestert werden (Abbildung 35). Die
entstehenden Sulfate sind als Alkalisalze anionischer Tenside.[21,22]
Abbildung 35: Darstellung von Fettalkoholsulfaten 47 aus linearen Alkoholen [21,22]
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
32
Eine andere Möglichkeit ist die Darstellung von Fettalkoholethersulfaten (FAES) 46, die ebenfalls als
Alkalisalze zu den anionischen Tensiden zählen. Hierzu wird der Alkohol erst ethoxyliert und
anschließend mit Schwefelsäure oder Schwefeltrioxid verestert (Abbildung 36).[21,22]
Abbildung 36: Darstellung von Fettalkoholethersulfaten 45 aus Fettalkoholpolyglykolethern 46 [21,22]
Anionische Tenside werden je nach Kettenlänge in Geschirrspülmitteln, in kosmetischen Produkten
oder in Waschmitteln eingesetzt werden.[21,22]
3.3.2.3 Cyclische Alkohole
Cyclische Alkohole spielen als Edukte für die Herstellung von Dicarbonsäuren, die für die
Polymerisation als Edukte eingesetzt werden, eine wichtige Rolle. Die größte Bedeutung hat hierbei
die Adipinsäure (48), die aus dem KA-Öl durch Verwendung eines Katalysators und Salpetersäure
hergestellt werden kann (Abbildung 37).[21]
Abbildung 37: Darstellung von Adipinsäure (48) aus KA-Öl [21]
Aus der Korksäure (56), die aus der Oxidation von Cyclooktan entsteht, kann Nylon-6.8 (58)
dargestellt werden. Allerdings geschieht das bisher in einem geringen Umfang.[21] Sowohl die
Verbindung 48 als auch die Dicarbonsäure 56 können in einer Kondensationsreaktion mit Hexa-
methylendiamin (57) polymerisieren. Die Dicarbonsäure 48 bildet mit dem Diamin 57 das sehr
bekannte Nylon-6.6 (49), das auch nur unter dem Namen Nylon bekannt ist und mit der
Dicarbonsäure 56 als Edukt wird das weniger bekannte Polymer 58 gebildet (Abbildung 38).[21] Aus
dem Polyamid 51 kann auch das für die Polymerisierung notwendige Hexamethylendiamin (57)
hergestellt werden. Das Polymer 51 wird in diesem Fall zum 1,6-Hexandiol hydriert, das mit
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
33
Ammoniak in Gegenwart von RANEY-Nickel mit einer Ausbeute von ca. 90% zu dem Polymer 58
reagiert.[21]
Abbildung 38: Darstellung von Nylon-6.6 52 und Nylon-6.8 58 [21]
3.3.2.4 Cycloalkanone
Es gibt noch einen zweiten Weg zur Herstellung von Polyamiden (Abbildung 39).
Abbildung 39: Darstellung von Nylon-6 (51) aus Cyclohexanon (41)
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
34
Das Lacton 41 wird zum Cyclooxim (59) umgesetzt, das in einer Beckmann-Umlagerung zu ε-
Caprolactam (60) umgesetzt wird. Durch Wassereinlagerung kommt es zur Ringöffnung, so dass die
lineare ε-Aminocapronsäure (61) gebildet wird, die die Amin-Gruppe und die Säure-Gruppe trägt.
Diese beiden Gruppen reagieren unter Kondensation zum Polymerisationsprodukt Nylon-6 (51)
(Abbildung 39).
Aus Cyclododecanon (50) kann analog Nylon-12 (52) hergestellt werden (Abbildung 40). Dazu wird
zuerst das Oxim 63 aus dem Keton 50 gebildet, das in einer Beckmann-Umlagerung zum Laurinlactam
(62) reagiert. Aus dem Lactam 62 kann dann das entsprechende Polyamid 52 hergestellt werden
(Abbildung 40).
Abbildung 40: Retrosynthesen von Nylon-6 (51) und Nylon-12 (52)
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
35
3.4 Hydroxylierung von n-Alkanen durch eine Cytochrom P450-Monooxygenase mit
einer in situ-Cofaktorregenerierung unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase
3.4.1 Ziel der Arbeit
Die Darstellung von Alkoholen sollte durch das Konzept der biokatalytischen Hydroxylierung von
n-Alkanen, hier n-Oktan (64) und n-Butan (65) (Abbildung 41), durch eine Cytochrom P450-Mono-
oxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) unter in situ-Cofaktorregenerierung mit einer
Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (GDH) in wässrigem Medium realisiert werden.
Abbildung 41: Die bei der biokatalytischen Hydrierung eingesetzten n-Alkane
Die Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 ist NADPH-abhängig und dieser Cofaktor wird bei der
Hydroxylierungsreaktion zu NADP+ oxidiert. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass der oxidierte Cofaktor
NADP+ günstiger als NADPH ist. Die Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. setzte im ersten Schritt
die D-Glucose unter Reduktion des eingesetzten NADP+ zu NADPH zu D-Gluconolacton um, das weiter
zur D-Gluconsäure umgewandelt wurde. Der gebildete reduzierte Cofaktor NADPH stand nun für die
Hydroxylierung des n-Alkans mit Hilfe der Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium
zur Verfügung und wurde im Laufe dieser Reaktion zu NADP+ oxidiert, das wieder von der
Glucosedehydrogenase reduziert wurde. Somit konnte ein weiterer Katalysezyklus von Neuem
beginnen (Abbildung 42).
Abbildung 42: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen unter Einsatz einer GDH und D-Glucose
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
36
Desweiteren ist das Reaktionsmedium Wasser kostengünstig und ökologisch unbedenklich, was auch
für D-Glucose gilt. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und bei richtiger Handhabung
meist ungiftig. Der für die Reaktion benötigte molekulare Sauerstoff wurde durch Luftsauerstoff
zugeführt. Alles in allem könnte das ein hocheffizienter Prozess werden, in dem später eventuell die
Ganzzellkatalyse eine wichtige Rolle spielen könnte.
3.4.2 Ergebnisse und Diskussion
3.4.2.1 Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen
Abbildung 43: Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen
Im Rahmen dieser Doktorarbeit ergab sich die Gelegenheit, in den S1-Laboratorien der
Partnergruppe von Prof. Schwaneberg, die Herstellung der benötigten Enzyme zu erlernen
(Abbildung 43). Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen Bedingungen und das eingesetzte
Antibiotikum Kanamycin, die Spurenelemente-Lösung (SEL), Aminolävulinsäure (ALA), Thiamin und
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurden steril über einen 0.2 μm-Filter filtriert. Die
eingesetzten Medien, das LB-Medium und das TB-Medium, wurden ebenfalls unter sterilen
Bedingungen hergestellt. Für die Herstellung der Übernachtkultur wurde ein Tropfen eines Glycerol-
Stocks der gewünschten P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium benötigt und das
Antibiotikum Kanamycin, die zum LB-Medium gegeben wurden. Diese Kultur wuchs über Nacht bei
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
37
37°C im Inkubationsschüttler. Die Übernachtkultur wurde am nächsten Tag zusammen mit
Kanamycin und SEL zum TB-Medium gegeben. Diese Vorkultur wuchs bei 30°C im
Inkubationsschüttler bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde. Anschließend wurden ALA,
Thiamin und IPTG zugegeben und die Enzyme ca. 20 Stunden bei 30°C im Inkubationsschüttler
exprimiert (Abbildung 43). Die anschließende Aufarbeitung erfolgte bei 4°C. Die Enzyme wurden am
Ende in Falcon Tubes lyophilisiert. Es wurden 584 mg der 19A12-Mutante [74,75] und 693 mg des
Wildtyps der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium erhalten Desweiteren wurde die 19A12-
Mutante auch in einem Fermenter-Ansatz hergestellt.
3.4.2.2 Spektrophotometrische Vorarbeiten
3.4.2.2.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus
megaterium
Zunächst wurden die Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen bezüglich n-Oktan
(64) als Substrat mit Hilfe eines UV/Vis-Spektrometers untersucht, um herauszufinden, welche
Monooxygenase am geeignetsten ist, um die Biotransformation zu den Oktanolen durchzuführen.
Hierzu wurden der Wildtyp, die 19A12-Mutante [74,75] und die F87V-Mutante der Cytochrom P450-
Monooxygenase getestet. Die gemessenen Aktivitäten für die jeweiligen Referenzsubstanzen
Dodekansäure (66) und n-Heptan (67) wurde auf 100% gesetzt und die relative Aktivität des
Substrats n-Oktan (64) darauf bezogen. Abbildung 44 zeigt die Strukturformeln der eingesetzten
Substanzen.
Abbildung 44: Strukturformeln der Referenzsubstanzen
Wildtyp der P450 BM-3
Als Referenzsubstrat für den Wildtyp der P450 BM-3 diente der C12-Körper Dodekansäure 66 und es
wurde eine Aktivität von 0.1748 U/mg bezüglich dieser Referenzsubstanz bestimmt. Die relative
Aktivität der Monooxygenase für das n-Alkan 64 lag mit 52% bei einem Wert von 0.0912 U/mg. Das
bedeutet, dass die Dodekansäure (66) im Vergleich zu dem für die Biotransformation eingesetzten
n-Oktan (64) doppelt so gut umgesetzt wurde. Desweiteren wurde die Aktivität bezüglich des
Substrats n-Heptan (67) untersucht, um einen Trend für kleinere Alkane vorhersagen zu können. Der
lineare C7-Körper 67 wurde mit einer Aktivität von 0.0215 U/mg vom Wildtyp der P450 BM-3
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
38
umgesetzt. Dies entsprach einer relativen Aktivität von 12% und war deutlich schlechter als für den
linearen C8-Körper 64 (Tabelle 2).
Tabelle 2: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3
Eintraga Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]b
1 Dodekansäure 0.1748 100
2 n-Oktan 0.0912 52
3 n-Heptan 0.0215 12 asiehe AAV 6,
bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Bei Einsatz des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 war eine abnehmende Aktivität mit
abnehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass Dodekansäure (66) am besten umgesetzt wurde.
19A12-Mutante der P450 BM-3 [74,75]
Das Referenzsubstrat für die 19A12-Mutante der P450 BM-3 war das n-Alkan 67 und es wurde eine
Aktivität von 0.1439 U/mg bezogen auf diese Referenzsubstanz gemessen. Die relative Aktivität der
Monooxygenase für das Substrat n-Oktan (64) lag bei einem Wert von 0.0632 U/mg, was einer
relativen Aktivität von 44% entspricht und damit unter der spektrophotometrisch bestimmten
Aktivität für das Referenzsubstrat n-Heptan (67) lag. Es wurde ferner die Aktivität bezogen auf die
Säure 66 untersucht, der von der 19A12-Mutante der P450 BM-3 überhaupt nicht umgesetzt wurde
(Tabelle 3).
Tabelle 3: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3
Eintraga Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]b
1 n-Heptan 0.1439 100
2 n-Oktan 0.0632 44
3 Dodekansäure 0.0000 <2 asiehe AAV 6,
bbezogen auf n-Heptan. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Bei Einsatz der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war eine abnehmende Aktivität mit
zunehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass n-Heptan (67) am besten umgesetzt wurde. Diese
Mutante erschien geeignet für die Biotransformation des Wunschsubstrates n-Butan (65).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
39
F87V-Mutante der P450 BM-3
Als Referenzsubstrat für die F87V-Mutante der P450 BM-3 wurde der C12-Körper 66 eingesetzt und
es wurde eine Aktivität von 0.1160 U/mg bezogen auf diese Referenzsubstanz bestimmt. Die relative
Aktivität der Monooxygenase auf das Substrat n-Oktan (64) lag mit 22% bei einem Wert von
0.0251 U/mg. Hier zeigte sich, dass das Referenzsubstrat Dodekansäure (66) deutlich besser
umgesetzt wurde, als der lineare C8-Körper 64 (Tabelle 4).
Tabelle 4: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3
Eintraga Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]b
1 Dodekansäure 0.1160 100
2 n-Oktan 0.0251 22 asiehe AAV 6,
bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Bei Einsatz der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war eine deutlich abnehmende
Aktivität mit abnehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass diese Mutante weniger geeignet für
die Biotransformation des Wunschsubstrates n-Butan (65) erschien.
3.4.2.2.2 Stabilitäten der 19A12- und F87V-Mutante der Cytochrom P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium
Im Hinblick auf die Hydroxylierung des Wunschsubstrats n-Butan (65), dessen Siedepunkt bei -0.5°C
liegt und das somit bei Raumtemperatur gasförmig ist [76], wurden die Stabilitäten der 19A12-
Mutante und der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium bei 8°C
untersucht. Bei dieser Temperatur liegt noch ein geringer Teil des n-Butans (65) als Flüssigkeit vor.
Die Bestimmung der Stabilitäten erfolgte mit Hilfe der UV/Vis-Spektroskopie. Dazu wurden
Enzymlösungen über 24 Stunden in einem geschlossenen Kolben gerührt und die Temperatur für die
Monooxygenasen entweder über 24 Stunden bei Raumtemperatur oder 8 Stunden bei 8°C mit einer
anschließenden Erwärmung in den verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Die
Ergebnisse mit der niedrigeren Temperatur wurden anschließend mit denen bei Raumtemperatur
verglichen. Bei der 19A12-Mutante wurde als Referenzsubstanz n-Heptan (67) verwendet und bei der
F87V-Mutante wurde Dodekansäure (66) eingesetzt (Abbildung 45).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
40
Abbildung 45: Reaktionsgleichungen der Photometertests mit einer P450-Monooxygenase BM-3
Stabilität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 bei Raumtemperatur
Bei Raumtemperatur lag die Aktivität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 nach einer Zeit von
8 Stunden nur noch bei 50%. Nach der angestrebten Reaktionszeit von 24 Stunden war keine
messbare Aktivität mehr vorhanden (Abbildung 46).
Abbildung 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur
Stabilität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 bei niedrigerer Temperatur
Es verhielt es sich etwas anders, wenn die Lösung der 19A12-Mutante eine konstante Temperatur
von 8°C für 8 Stunden mit einer anschließenden Erwärmung in den verbleibenden 16 Stunden auf
Raumtemperatur aufwies. Die Restaktivität der gekühlten 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase
BM-3 liegt nach 24 Stunden noch bei 73%. Die Ergebnisse sind in Abbildung 47 dargestellt.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
41
Abbildung 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Stabilität der F87V-Mutante der P450 BM-3 bei Raumtemperatur
Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur lag die Restaktivität der F87V-Mutante der P450 BM-3 nach
24 Stunden nur noch bei 27%, was einen deutlichen Verlust darstellt (Abbildung 48).
Abbildung 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur
Stabilität der F87V-Mutante der P450 BM-3 bei niedrigerer Temperatur
Auch hier verhielt es sich anders, wenn die Temperatur für 8 Stunden bei 8°C gehalten und in den
verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt wird. Die Restaktivität der gekühlten F87V-
Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 lag nach 24 Stunden noch bei guten 73% (Abbildung 49).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
42
Abbildung 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Diese Ergebnisse waren der Anlass die Reaktionstemperatur während der Hydroxylierung für
8 Stunden bei 8°C zu halten und anschließend innerhalb der verbleibenden 16 Stunden auf
Raumtemperatur zu erwärmen.
3.4.2.3 Analytische Vorarbeiten
Vor der Durchführung einer Eintopf-Zweistufen-Synthese wurde zunächst eine valide Analytik
etabliert. Hierzu wurden eine Methoden der Aufarbeitung untersucht, wobei bei einer Methode der
Schütteltrichter und bei der anderen Methode 2 ml-Eppendorf-Gefäße verwendet wurden. Als
Referenzsubstanzen wurden die bei Einsatz des Edukts n-Oktan (64, Sdp. 126°C)[77] möglichen
Oxidationsprodukte 1-Oktanol (68, Sdp. 196°C)[78], 2-Oktanol (69, Sdp. 174-181°C)[79], 3-Oktanol (70,
Sdp. 174-176°C)[80] und 4-Oktanol (71, Sdp. 174-176°C)[81] und als externer Standard der
Heteroaromat Pyridin (72, Sdp. 115°C)[82] verwendet (Abbildung 50).
Abbildung 50: Strukturformeln der verschiedenen Oktanole und von Pyridin (72)
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
43
Der externe Standard Pyridin (72) wurde vor der Aufarbeitung zur Reaktionsmischung dazugegeben.
Anhand dieser Versuche kann ein Faktor berechnet werden, der sich aus folgendem Quotienten
ergibt und der Auskunft über die Verlässlichkeit der jeweils untersuchten Aufarbeitungsmethode gibt
(Abbildung 51).
Abbildung 51: Formel für die Berechnung des Faktors
3.4.2.3.1 Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters
Die erste Aufarbeitungsmethode beinhaltet nach Zusatz von Pyridin (72) die Nutzung des
Schütteltrichters zur Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan und das anschließende
Trocknen über Magnesiumsulfat. Am Ende wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei
900 mbar entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Hilfe eines
Schütteltrichters
Eintraga Alkohol Dauerb [h] Ausbeute des Pyridins [%]
Ausbeute des Alkohols [%]
Faktor
1 1-Oktanol 24 97 82 1.18
2 1-Oktanol 0 86 74 1.16
3 2-Oktanol 24 92 82 1.12
4 2-Oktanol 0 94 85 1.11
5 3-Oktanol 24 85 76 1.12
6 3-Oktanol 0 96 95 1.01
7 4-Oktanol 24 95 75 1.27
8 4-Oktanol 0 90 79 1.14 asiehe AAV 8,
bReaktionszeit
Die Werte für den Faktor schwankten bei 24 Stunden bis zu 0.15 und bei 0 Stunden ebenfalls bis zu
0.15. Das sind zu hohe Schwankungen für eine präzise Auswertung. Die Ausbeute des eingesetzten
Pyridins (72) betrug bei 0 Stunden durchschnittlich 92% und bei 24 Stunden durchschnittlich
ebenfalls 92%. Die Werte der zurückerhaltenen Alkohole 68-71 lag bei 24 Stunden zwischen 74% und
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
44
82% und bei 0 Stunden wurde nur bei 3-Oktanol (70) mit 95% ein Wert über 90% erhalten. Die
Ausbeute der anderen Alkohole 68, 69, 71 schwankte bei 0 Stunden zwischen 79% und 85%. Diese
Methode der Aufarbeitung war aufgrund der relativ geringen Wiederfindungsrate insbesondere bei
den Alkoholen 68-71 für präparative Zwecke nicht geeignet, weshalb eine neue Methode der
Aufarbeitung untersucht wurde.
3.4.2.3.2 Aufarbeitung mit Hilfe von Eppendorf-Gefäßen
Bei der zweiten Methode wurden als Extraktionsgefäße nach Zusatz von Pyridin (72) 2 ml-Eppendorf-
Gefäße genutzt. Nach dreimaliger Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan und mit Hilfe
eines Thermomixers und Trennung der beiden Phasen durch eine Zentrifuge, wurde das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6
zusammengefasst.
Tabelle 6: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Eppendorf-
Gefäßen
Eintraga Alkohol Dauerb [h] Ausbeute des Pyridins [%]
Ausbeute des Alkohols [%]
Faktor
1 1-Oktanol 24 97 82 1.18
2 1-Oktanol 0 97 94 1.03
3 2-Oktanol 24 91 81 1.12
4 2-Oktanol 0 94 91 1.03
5 3-Oktanol 24 97 85 1.14
6 3-Oktanol 0 96 93 1.03
7 4-Oktanol 24 91 81 1.12
8 4-Oktanol 0 94 83 1.13 asiehe AAV 8,
bReaktionszeit
Die Werte für den Faktor schwankten bei 24 Stunden bis zu 0.06 und bei 0 Stunden sind bis auf
Eintrag 8, bei dem der Faktor um 0.08 abwich, drei Faktoren mit 1.03 gleich. Der Heteroaromat 72
wurde bei 0 Stunden zu durchschnittlich 95% zurück erhalten und bei 24 Stunden zu durchschnittlich
94%. Bei 0 Stunden wurde nur 4-Oktanol (71) mit 83% nicht zu über 90% wieder erhalten. Die Werte
der anderen zurückerhaltenen Alkohole 68-70 lagen bei 0 Stunden zwischen 91% und 94%. Der
Ausbeute der Alkohole 68-71 schwankte bei 24 Stunden zwischen 81% und 85%. Diese Methode der
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
45
Aufarbeitung ist für präparative Zwecke gut geeignet, da der Faktor relativ konstant blieb und die
Alkohole mit sehr guten Werten zurückerhalten wurden. Diese Methode der Aufarbeitung fand
dementsprechend für präparative Ansätze Anwendung. Der durchschnittliche Erhalt der Alkohole
68-71 lag nach 0 Stunden bei 91% und nach 24 Stunden bei 82%.Der durchschnittliche Faktor war
nach 0 Stunden bei 1.05 und nach 24 Stunden bei 1.14.
3.4.2.4 Hydroxylierung von n-Oktan
Die katalytische Aktivität der P450-Monooxygenase BM-3 kann durch den präparativen Ansatz des
ersten Reaktionsschrittes, also der Oxidation von n-Oktan (64) zu den Oktanolen, nachgewiesen
werden (Abbildung 52).
Abbildung 52: Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Die Verbindung n-Oktan (64) wurde als Modellsubstrat ausgewählt, da der Siedepunkt nicht zu
niedrig ist und deshalb nicht so viel verdampfen kann, wie bei niedrigen Homologen, die Toxizität
geringer ist, als beispielsweise bei n-Hexan[83] und die Menge an Isomeren analytisch noch gut
handhabbar ist. Die biokatalytische Hydroxylierung des n-Alkans 64 wurde anhand verschiedener
Gesichtspunkte untersucht. Es wurde die Abhängigkeit der Reaktion von der Substratkonzentration,
vom eingesetzten Cofaktor und der daraus resultierenden Cofaktorregenerierung, von der
Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors und von der Reaktionstemperatur analysiert. Die Ergebnisse
sind in den nachfolgenden Kapiteln dargestellt.
3.4.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration
In diesem Abschnitt wurden zwei verschiedene Substratkonzentrationen von n-Oktan (64)
untersucht. Bei einer Substratkonzentration von 100 mM, die durch eine Verringerung des
Reaktionsmediums gewährleistet wurde, erfolgte die Reaktion in einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß und
bei einer Konzentration von 20 mM erfolgte die Reaktion in einem 10 ml-Rundkolben. Das
Eppendorf-Gefäß wurde für 24 Stunden mit einem Thermomixer bei 25°C geschüttelt, der
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
46
Rundkolben wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7
zusammengefasst.
Tabelle 7: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintraga c (64) Umsatzb Produktbildungb
[mM] [%] [mol/l] [g/l]
1a 20 11 0.0029 0.38
1bc 20 14 0.0033 0.42
2 100 n.d. n.d. n.d. asiehe AAV 9,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
Bei einer Substratkonzentration von 100 mM n-Oktan (64) wurde kein Umsatz beobachtet, während
bei einer Substratkonzentration von 20 mM Umsätze von 11% bis 14% und eine Produktbildung von
0.38 g/l bis 0.42 g/l erzielt wurden. Die weiteren Reaktionen wurden dementsprechend mit einer
Substratkonzentration von 20 mM n-Oktan (64) durchgeführt. Eine eventuelle Erklärung dafür, dass
bei einer Substratkonzentration von 100 mM, die sich aus der Verringerung des Reaktionsvolumens
ergab, kein Umsatz stattfand, könnte in der zu hohen Enzymkonzentration und der daraus
resultierenden Dickflüssigkeit der Reaktionslösung liegen.
3.4.2.4.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung
In diesem Abschnitt werden zwei verschiedene Systeme untersucht. Bei der Oxidation des n-Oktans
(64) wurde die NADPH-abhängige F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium
(P450 BM-3) verwendet. Bei Einsatz des im Vergleich zu NADPH kostengünstigeren Cofaktors NADP+
am Anfang der Reaktion wurde zur Cofaktorregenerierung D-Glucose und das Enzym
Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus sp. eingesetzt. Durch diese in situ-Cofaktorregenerierung
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
47
konnte die Menge des Cofaktors NADPH gering gehalten werden, da die Glucosedehydrogenase das
durch die Oxidation entstehende NADP+ wieder zum NADPH umwandelte, das von der P450-
Monooxygenase für die Reaktion benötigt wurde (Abbildung 53).
Abbildung 53: Hydroxylierung von n-Oktan (64) unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur in
situ-Cofaktorregenerierung
Bei Einsatz des teureren NADPH am Anfang der Reaktion lag keine Cofaktorregenerierung vor. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintraga GDH Cofaktor Umsatzb Produktbildungb
[U/mmol] [mmol] [%] [mol/l] [g/l]
1a 36 0.010
NADP+ 11 0.0029 0.38
1bc 36 0.010
NADP+ 14 0.0033 0.42
2 0 0.010
NADPH n.d. n.d. n.d.
asiehe AAV 9,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) bei Raumtemperatur
über 24 Stunden durchgeführt. Beim System mit NADP+ und GDH als zusätzlichem Enzym lief die
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
48
Hydroxylierungsreaktion mit Umsätzen von 11% bis 14% und Produktbildungen von 0.38 g/l bis
0.42 g/l ab. Bei dem System ohne Cofaktorregenerierung war kein Umsatz zu erkennen, weshalb die
Reaktion die in situ-Cofaktorregenerierung benötigte. Es könnte ein Grund hierfür sein, dass durch
die Cofaktorregenerierung die Verluste des Cofaktors für die Nebenreaktionen der P450-
Monooxygenase („Shuntways“ siehe Kapitel 3.2.2, Abbildung 10) minimiert wurden, da NADPH
wieder durch die Reaktion der D-Glucose zu D-Gluconolacton mit Hilfe der GDH gebildet wurde und
für einen weiteren Zyklus zur Verfügung stand. Die weiteren Reaktionen wurden dementsprechend
mit einer Cofaktorregenerierung durchgeführt.
3.4.2.4.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+
Cofaktoren sind sehr teuer und sollten daher sparsam für die Reaktionen verwendet werden. Die
Stoffmenge des im vorher beschriebenen in situ-Cofaktorregenerierungssystem mit einer GDH und
D-Glucose verwendeten Cofaktors NADP+ wurde im Folgenden von 0.010 mmol auf 0.002 mmol
herabgesetzt. Die Hydroxylierung des n-Alkans 64 wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 mM
Substratkonzentration und Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt (Tabelle 9).
Tabelle 9: Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintraga NADP+ Umsatzb Produktbildungb
[mmol] [%] [mol/l] [g/l]
1a 0.010 11 0.0029 0.38
1bc 0.010 14 0.0033 0.42
2a 0.002 14 0.0031 0.41
2bd 0.002 13 0.0030 0.39 asiehe AAV 9,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
dWiederholungs-
versuch zu 2a zur Validierung
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
49
Die Reaktion zeigte durch die Zugabe von 0.002 mmol NADP+ ähnliche Ergebnisse, was aufgrund der
gut funktionierenden Cofaktorregenerierung zu erwarten war. Es wurden 13% bis 14% Umsatz und
eine Produktbildung von 0.39 g/l bis 0.41 g/l mit der niedrigeren Cofaktor-Stoffmenge erzielt,
während bei Zugabe von 0.010 mmol NADP+ Umsätze von 11% bis 14% und eine Produktbildung von
0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht wurden. Die weiteren Reaktionen wurden aufgrund dieser Ergebnisse
mit nur 0.002 mmol NADP+ als Cofaktor durchgeführt.
3.4.3.4.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3
In diesem wurden Abschnitt die verfügbaren P450-Monooxygenase BM-3 miteinander verglichen,
d.h. die F87V-Mutante, die 19A12-Mutante und der Wildtyp wurden auf ihre Fähigkeit zur
Produktbildung hinsichtlich der Hydroxylierung von n-Alkans 64 geprüft. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 10 dargestellt.
Tabelle 10: Einfluss eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung von
n-Oktan (64)
Eintraga P450 BM-3 Umsatzb Produktbildungb
[%] [mol/l] [g/l]
1 F87V 11 0.0029 0.38
2 19A12 5 0.0009 0.11
3 Wildtyp 16 0.0031 0.40 asiehe AAV 9,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
Man konnte erkennen, dass die Produktbildung bei der F87V-Mutante und dem Wildtyp in einem
ähnlichen Bereich lagen, die Produktbildung mit der 19A12-Mutante allerdings deutlich niedriger
war.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
50
3.4.2.4.5 Einfluss der Reaktionstemperatur
Die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ist, wie in Abschnitt 3.4.2.2.2 gezeigt wurde, bei
niedrigeren Reaktionstemperaturen stabiler als bei Raumtemperatur. Die katalytische Aktivität der
Monooxygenase konnte nun durch eine Reaktion bei 8°C über 8 Stunden und der anschließenden
Erwärmung über 16 Stunden auf Raumtemperatur bzw. 24 Stunden bei Raumtemperatur überprüft
werden. Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde mit einer Substratkonzentration von 20 mM und
Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt. Für die in situ-Cofaktorregenerierung wurden
0.002 mmol NADP+, D-Glucose und das Enzym Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. eingesetzt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintraga Temperatur Umsatzb Produktbildungb
[%] [mol/l] [g/l]
1a RT 14 0.0031 0.41
1bc RT 13 0.0030 0.39
2 8°C-RT 16 0.0036 0.47 asiehe AAV 9,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
Die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war in der Reaktion bei 8°C über 8 Stunden und
der anschließenden Erwärmung über 16 Stunden auf Raumtemperatur geringfügig aktiver als bei der
Reaktion über 24 Stunden bei Raumtemperatur. Es wurde ein Umsatz von 16% bei der niedrigeren
Temperatur erzielt, während die Reaktionen bei Raumtemperatur 13% bis 14% Umsatz zeigten.
Dieses Ergebnis ist insofern von Bedeutung, da er Siedepunkt des späteren Zielsubstrats n-Butan (65)
bei -0.5°C [76] ist und daher die Verdampfung bei 8°C geringer ist als bei Raumtemperatur.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
51
3.4.2.5 Hydroxylierungsreaktion von n-Butan
Die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) zu 2-Butanol (35) wurde zuerst mit Hilfe der für
kurzkettige n-Alkane geeigneten 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium
(P450 BM-3) durchgeführt.[75] Die P450 BM-3 ist NADPH-abhängig. Durch eine in situ-Cofaktor-
regenerierung mit Einsatz einer NADP+-abhängigen Glucosedehydrogenase (GDH) wurde die Menge
des kostenintensiven Cofaktors gering gehalten, da die Glucosedehydrogenase das durch die
Oxidation entstehende NADP+ in situ wieder zum NADPH umwandelt (Abbildung 54).
Abbildung 54: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) unter in situ-Cofaktorregenerierung
mit einer GDH
3.4.2.5.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3
Zusätzlich zur 19A12-Mutante wurden auch der Wildtyp (WT) und die F87V-Mutante der P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) auf ihre Eignung als Katalysator hin
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst.
Tabelle 12: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung
von n-Butan (65)
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
52
Eintraga P450 BM-3 Produktbildungb
[mol/l] [g/l]
1 19A12 0.0013 0.10
2 F87V n.d. n.d.
3 Wildtyp n.d. n.d. asiehe AAV 10,
bProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
Als Produkt wurde beim Einsatz der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ausschließlich
2-Butanol (35) erhalten. Die 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ist bekannt dafür, dass
sie auch kurzkettige n-Alkane, wie n-Propan, umsetzt.[75] Bei Verwendung der F87V-Mutante und des
Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 wurde kein Umsatz zum Alkohol 35 beobachtet. Bei der
biokatalytischen Hydroxylierung des n-Alkans 65 mit in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz
einer Glucosedehydrogenase mit Hilfe der für kurzkettigere n-Alkane selektiven Mutante 19A12 der
P450-Monooxygenase BM-3 wurde selektiv 2-Butanol mit bis zu 0.10 g/l und 0.0013 mol/l gebildet.
In der Literatur [27,44] wurden der Wildtyp und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 für
die Hydroxylierung von etwas längerkettigeren n-Alkanen verwendet und reagierten entsprechend
nicht mit n-Butan (65).
3.4.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur
Im vorangegangenen Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die NADPH-abhängige 19A12-Mutante
der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) für die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Butan (65) geeignet ist. Es wurde das System einer in situ-Cofaktor-
regenerierung mit Einsatz einer Glucosedehydrogenase (GDH) gewählt, um die die Menge des
kostenintensiven Cofaktors NADPH gering zu halten. In diesem Abschnitt wurde die Abhängigkeit der
Reaktion von der Reaktionstemperatur untersucht. Dabei wurde die Temperatur in einem Bereich
von -5°C bis Raumtemperatur für 8 Stunden konstant gehalten und anschließend erfolgte in den
verbleibenden 16 Stunden die langsame Erwärmung auf Raumtemperatur. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 13 dargestellt.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
53
Tabelle 13: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
Eintraga Temperatur Produktbildungb
[mol/l] [g/l]
1 RT 0.0008 0.06
2 8°C-RT 0.0013 0.10
3 0°C-RT 0.0021 0.16
4 -1/-2°C-RT 0.0017 0.13
5 -5°C-RT 0.0006 0.04 asiehe AAV 10,
bProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
Die Ergebnisse in Tabelle 13 zeigen, dass das Maximum der Produktbildung der 19A12-Mutante bei
0°C lag. Hier wurde eine Produktbildung von 0.16 g/l erreicht. Die Aktivität des Enzyms war bei dieser
Temperatur gut, die Reaktionsmischung war nicht gefroren wie bei -5°C oder sehr viskos wie bei
-1/-2°C. Die Temperatur von 0°C lag sehr nahe am Siedepunkt des Flüssiggases n-Butan (65). Dieser
liegt bei -0.5°C [76] und deshalb verdampft das n-Alkan 65 nicht so viel wie es bei Raumtemperatur
verdampft, so dass genug Substrat für die Biotransformation zur Verfügung steht. Sogar bei einer
Reaktionstemperatur von -5°C konnte 2-Butanol (35) mit einer Produktbildung von 0.04 g/l
synthetisiert werden, obwohl hier die Reaktionsmischung gefroren war. Gute Werte für die
Produktbildung wurden auch bei einer Temperatur von -1/-2°C und 8°C erhalten. Hier wurde der
Alkohol 35 mit 0.13 g/l für -1/-2°C und mit 0.10 g/l für 8°C gebildet. Die Produktbildung bei Raum-
temperatur lag bei 0.06 g/l im Bereich der Temperatur von -5°C.
3.4.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit
Zur Klärung, ob die Hydroxylierungsreaktion zu 2-Butanol (35) nur während der Aufwärmphase oder
tatsächlich bei 0°C stattfand, wurde der Aspekt der Reaktionszeit untersucht. Es wurde einmal sofort
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
54
nach den 8 Stunden bei 0°C aufgearbeitet und einmal nach 8 Stunden bei 0°C mit anschließenden
16 Stunden Erwärmung auf Raumtemperatur. Erfreulicherweise konnte bei einer Reaktionszeit von
8 Stunden und einer Reaktionstemperatur von 0°C ohne anschließendes Aufwärmen auf
Raumtemperatur eine Produktbildung von 0.14 g/l bzw. 0.0019 mol/l erzielt werden. Das belegt, dass
die 19A12-Mutante bei dieser Temperatur aktiv war und die Reaktion nicht nur während des
Aufwärmprozesses stattfand. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengefasst.
Tabelle 14: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
Eintraga Temperatur Dauerb Produktbildungc
[h] [mol/l] [g/l]
1 0°C-RT 24 0.0021 0.16
2 0°C 8 0.0019 0.14 asiehe AAV 10,
bReaktionszeit,
cProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
3.4.3 Zusammenfassung
Zuerst nach einem geeignetem Analytik-System geforscht. Als interner Standard wurde Pyridin (72)
ausgewählt, das vor der Aufarbeitung, aber nach der Reaktion hinzugegeben wurde. Hierbei erwies
sich die dreimalige Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan in 2 ml-Eppendorf-Gefäßen
mit Hilfe eines Thermomixers und anschließende Trennung der Phasen mit Hilfe einer Zentrifuge am
stabilsten. Anschließend erfolgte die Entfernung des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfer
bei definiertem Druck.
3.4.3.1 Hydroxylierung von n-Oktan
Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde unter verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Die
Startbedingungen waren der Einsatz der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
55
megaterium (P450 BM-3), die sich in vorbereitenden spektrophotometrischen Tests als geeignet für
die Biotransformation herausgestellt hat. Desweiteren wurde die Reaktion bei Raumtemperatur über
einen Zeitraum von 24 Stunden in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und mit 38.2 U/mmol
(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure) P450-Monooxygenase BM-3 durchgeführt. Zuerst wurde
ein geeignetes Reaktionsvolumen und daraus resultierend ein geeignetes Reaktionsgefäß untersucht.
Es stellte sich heraus, dass eine Konzentration von 20 mM n-Oktan (64) und ein 10 ml-Rundkolben
mit Umsätzen von 11% bis 14% und Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l sehr gut geeignet waren.
Anschließend wurde die Abhängigkeit vom Cofaktor untersucht. Theoretisch denkbare Cofaktoren
wären NADPH und NADP+. Bei Einsatz des reduzierten Cofaktors wurde die Reaktion ohne in situ-
Cofaktorregenerierung durchgeführt und lieferte keinen Umsatz. Diese wurde erst bei Einsatz des
oxidierten Cofaktors NADP+ sowie unter in situ-Cofaktorregenerierung erzielt. Der eingesetzte
Cofaktor NADP+ wurde von einer Glucosedehydrogenase, die D-Glucose in D-Gluconolacton
überführt, zu dem für die Hydroxylierungsreaktion benötigten Cofaktor NADPH reduziert. Dabei
wurden Umsätze von 11% bis 14% und Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht. Dies
bestätigte die Wahl des Cofaktors NADP+ mit einer in situ-Cofaktorregenerierung für die
darauffolgenden Versuche. Cofaktoren sind kostenintensiv, weshalb diese in katalytischen Mengen
eingesetzt werden sollten. Zu diesem Zweck wurde die eingesetzte Stoffmenge von NADP+
untersucht. Es stellte sich heraus, dass bei Einsatz von 0.010 mmol NADP+ Umsätze von 11% bis 14%
mit einer Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht wurden und bei Einsatz von 0.002 mmol
NADP+ 13% bis 14% Umsatz und 0.39 g/l bis 0.41 g/l Produktbildung. Demzufolge waren 0.002 mmol
des oxidierten Cofaktors für die Reaktion ausreichend. Als nächstes wurde der Einsatz des Wildtyps
und verschiedener Mutanten (F87V, 19A12) der P450-Monooxygenase BM-3 untersucht. Es stellte
sich heraus, dass die Produktbildungen, die mit der F87V-Mutante und dem Wildtyp erreicht wurden,
in einem vergleichbaren Bereich lagen und dass die 19A12-Mutante deutlich schlechter abschnitt.
Die F87V-Mutante, mit der die vorherigen Versuche bereits durchgeführt wurden, wurde eingesetzt.
Abschließend wurde die Abhängigkeit der Biotransformation von der Reaktionstemperatur
untersucht. In spektrophotometrischen Vorarbeiten zeigte sich, dass die F87V-Mutante eine höhere
Aktivität nach 24 Stunden beibehalten hatte, wenn die Reaktion nicht für 24 Stunden bei
Raumtemperatur, sondern für 8 Stunden bei 8°C und einer anschließenden Erwärmung während der
verbleibenden Stunden auf Raumtemperatur, durchgeführt wurde. Demzufolge wurde die
Reaktionstemperatur für 8 Stunden bei 8°C gehalten und in den anschließenden 16 Stunden erfolgte
die langsame Erwärmung auf Raumtemperatur. Mit der niedrigeren Reaktionstemperatur wurde das
bislang beste Ergebnis mit einem Umsatz von 16% und einer Produktbildung von 0.47 g/l erzielt
(Abbildung 55).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
56
Abbildung 55: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
3.4.3.2 Hydroxylierung von n-Butan
Aufgrund der erfreulichen Ergebnisse bei niedrigerer Temperatur konnte nun die Biotransformation
von n-Butan (65), das seinen Siedepunkt bei -0.5°C hat, [76] zu 2-Butanol (35) auf verschiedene
Einflüsse untersucht werden. In vorbereitenden spektrophotometrischen Untersuchungen hat sich
die 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium als am besten geeignet
herausgestellt. Desweiteren konnte durch die einleitenden spektrophotometrischen Messungen
gezeigt werden, dass sowohl die 19A12-Mutante als auch die Glucosedehydrogenase bei niedrigeren
Temperaturen nach 24 Stunden aktiver waren, als nach 24 Stunden bei Raumtemperatur. Dabei
wurden die Aktivität der Monooxygenase bei 8°C für 8 Stunden und anschließender Erwärmung
innerhalb der verbleibenden 16 Stunden und die Aktivität der Glucosedehydrogenase bei -10°C bzw. -
5°C über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Startbedingungen waren eine Reaktionszeit
von 24 Stunden und die Verwendung eines 100 ml-Rundkolbens mit 10 ml Phosphatpuffer
(pH 7.0, 50 mM) als Reaktionsvolumen. Aufgrund der Vorergebnisse mit n-Oktan (64) als Substrat
wurde auch hier eine in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz einer Glucosedehydrogenase, von
D-Glucose und durch Einsatz des oxidierten Cofaktors NADP+ eingeführt. Anschließend wurde nach
einer geeigneten Mutante für die Hydroxylierung von n-Alkans 65 geforscht. Dabei wurden der
Wildtyp, die 19A12- und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 untersucht. Bei Einsatz
der 19A12-Mutante wurde selektiv der Alkohol 35 mit einer Produktbildung bis zu 0.10 g/l und
0.0013 mol/l erhalten. Der Wildtyp und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 wurden
bei Hydroxylierung von längerkettigen n-Alkanen eingesetzt und reagierten nicht mit dem n-Alkan
65.[27,44] Der nächste Schritt stellte die Suche nach der geeigneten Reaktionstemperatur dar. Dafür
wurde die Temperatur über 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C oder 8°C mit anschließender Erwärmung
auf Raumtemperatur in den verbleibenden 16 Stunden bzw. über 24 Stunden bei Raumtemperatur
eingestellt. Das beste Ergebnis wurde mit einer 19A12-Mutante, 0.002 mmol NADP+, 24 Stunden
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
57
Reaktionszeit, wobei die Temperatur für 8 Stunden bei 0°C gehalten wurde und sich in den
verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt hat, erzielt. Hierbei wurde das Produkt 2-
Butanol (35) mit 0.16 g/l gebildet (Abbildung 56).
Abbildung 56: Biokatalytische Hydroxylierung von gasförmigen n-Butan (65)
3.5 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Synthese von Cycloalkanonen
3.5.1 Ziel der Arbeit
Das Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation [13] zur Herstellung von Cycloalkanen zu
Cycloalkanonen beruht auf dem Zusammenspiel zweier Biokatalysatoren, einer P450-
Monooxygenase und einer Alkoholdehydrogenase. Die NADPH-abhängige P450-Monooxygenase aus
Bacillus megaterium (P450 BM-3) ist für die Oxidation der Cycloalkane zu reaktiveren Alkoholen
verantwortlich, während die Aufgabe der Alkoholdehydrogenase in der Oxidation der gebildeten
Alkohole zu den gewünschten Ketonen besteht. Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte
Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung, da das eingesetzte NADPH von der P450-Monooxygenase zu
NADP+ oxidiert wird, das von der Alkoholdehydrogenase wieder zu NADPH reduziert wird
(Abbildung 57). Der Katalysezyklus kann nun wieder von vorne starten. Der Cofaktor kann deshalb in
katalytischen Mengen zugegeben werden und wird nicht in stöchiometrischen Mengen benötigt.
Dies soll in einer Eintopf-Zweistufen-Synthese im Reaktionsmedium Wasser erfolgen. Das Konzept
erfüllt einige Voraussetzungen einer „Dream Reaction“.[1] Das Reaktionsmedium Wasser ist
kostengünstig und ökologisch unbedenklich. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und
zumeist unbedenklich für den Menschen. Der für die Reaktion benötigte Sauerstoff kann durch
Luftsauerstoff zugeführt werden.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
58
Abbildung 57: Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation von Cycloalkanen
Als Edukt wurde in dieser Arbeit Cyclooktan (73) als Modellverbindung eingesetzt. Es besitzt einen
Siedepunkt von 150-152°C und ist schlecht wasserlöslich (7.9 mg/l).[84] Der cyclische C8-Körper 73
liegt bei Raumtemperatur als Flüssigkeit vor und wurde als Modellsubstrat ausgewählt, da er einen
höheren Siedepunkt als das mit 55.0 mg/ml besser wasserlösliche Cyclohexan (81°C) [85] besitzt.
3.5.2 Ergebnisse und Diskussion
3.5.2.1 Spektrophotometrische Vorarbeiten
3.5.2.1.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus
megaterium
Zunächst wurden die Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen bezüglich
Cyclooktan (73) mit Hilfe eines UV/Vis-Spektrometers untersucht, um herauszufinden, welche
Monooxygenase für die Biotransformation zum Cyclooktanol (74) am besten geeignet ist. Hierzu
wurden die 19A12-Mutante und die F87V-Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase getestet
(Abbildung 58).
Abbildung 58: Biokatalytische Reaktion, die mit Hilfe des UV/Vis-Spektrometers beobachtet wird
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
59
19A12-Mutante der P450 BM-3
Die spektrophotometrisch bestimmte Aktivität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus
Bacillus megaterium bezogen auf das Cycloalkan 73 lag bei einem Wert von 0.1749 U/mg, was einer
sehr guten Aktivität entspricht. Diese Mutante ist geeignet, die Biotransformation mit dem cyclischen
C8-Körper durchzuführen.
F87V-Mutante der P450 BM-3
Die spektrophotometrisch bestimmte Aktivität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3
bezogen auf Cyclooktan (73) lag bei nur 0.0074 U/mg und somit deutlich niedriger als die Aktivität
der 19A12-Mutante.
3.5.2.2 Analytische Vorarbeiten
Es wurde die Analytik mit Hilfe eines Standards für die Reaktionsvolumina von 1 ml, 4 ml und 5 ml
gemäß der AAV 11 untersucht. Als Standard wurde Pyridin (72) gewählt, das nach der Reaktionszeit
und vor der Aufarbeitung zugegeben wurde. Dabei wurden mit Hilfe von der 1H-NMR-Spektroskopie
und der Auswaage 95% bis 98% an Cyclooktanon (75) und 90% bis 97% des Heteroaromaten 72 als
Standard wiedergefunden.
Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 1 ml
Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 1 ml wurde
1 ml Phosphatpuffer und das Cycloalkanon 75 in einer Konzentration von 100 mM in ein 2 ml-Eppen-
dorf-Gefäß gegeben. Nach Zugabe des Standards Pyridin (72) wurde aufgearbeitet und
durchschnittlich 95% Cyclooktanon (75) und durchschnittlich 94% des Heteroaromaten 72 erhalten.
Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 4 ml
Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 4 ml wurden
4 ml Phosphatpuffer und 25 mM des Cycloalkanons 75 in einen 25 ml-Rundkolben gegeben. Die
Aufarbeitung erfolgte nach der Zugabe von Pyridin (72). Cyclooktanon (75) wurde mit 98%
zurückgewonnen und der Heteroaromat 72 mit 90%.
Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 5 ml
Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 5 ml wurden
5 ml Phosphatpuffer und 20 mM des Cycloalkanons 75 in einen 10 ml-Rundkolben gegeben. Nach
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
60
Zugabe des Standards Pyridin (72) wurde aufgearbeitet und durchschnittlich 95% Cyclooktanon (75)
und durchschnittlich 97% des Heteroaromaten 72 wiedergefunden.
3.5.2.3 Hydroxylierung von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanol
Abbildung 59: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74)
Die katalytische Aktivität der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium konnte durch den
präparativen Ansatz des ersten Reaktionsschrittes, also der Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu
Cyclooktanol (74) in wässrigem Reaktionsmedium, nachgewiesen werden. Hierbei wurde das
Cycloalkan 73 von der P450-Monooxygenase BM-3 unter Verbrauch von NADPH zum Cycloalkanol 74
hydroxyliert (Abbildung 59).
In den folgenden Kapiteln wurden die Abhängigkeit vom eingesetzten Cofaktor, der
Cofaktorregenerierung, von der eingesetzten Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten
P450-Monooxygense BM-3 untersucht.
3.5.2.3.1 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung
Prinzipiell existieren zwei mögliche Systeme: das System ohne Cofaktorregenerierung oder das
System mit in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz einer Glucosedehydrogenase und D-Glucose.
System ohne Cofaktorregenerierung
Der Einsatz des kostenintensiven Cofaktors NADPH war bei der Hydroxylierung ohne
Cofaktorregenerierung erforderlich. Hierbei wurde der reduzierte Cofaktor im Laufe der Reaktion zu
NADP+ oxidiert und stand dann nicht mehr für die Reaktion zur Verfügung (Abbildung 60). Hierbei
konnte weder bei einer Substratkonzentration von 20 mM noch von 100 mM ein Umsatz beobachtet
werden. Gründe hierfür könnten die geringe Aktivität der P450-Monooxygenase sein und der Verlust
des Cofaktors NADPH durch die Nebenreaktionen dieses Enzyms.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
61
Abbildung 60: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) ohne Cofaktorregenerierung
System mit einer in situ-Cofaktorregenerierung
Die Hydroxylierung mit einer in situ-Cofaktorregenerierung erfolgte unter Einsatz des Cofaktors
NADP+, einer Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus sp. als zusätzlichem Enzym und D-Glucose als
Cosubstrat. Das anfänglich eingesetzte NADP+ wurde von der Glucosedehydrogenase zu dem für die
Hydroxylierung benötigten Cofaktor NADPH reduziert. Im Laufe der Hydroxylierung wurde NADPH
wieder zu NADP+ oxidiert, wodurch der Katalysezyklus geschlossen wurde (Abbildung 61).
Abbildung 61: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit in situ-Cofaktorregenerierung
durch Einsatz einer GDH und D-Glucose
Hier konnte bei einer Enzymmenge von 3.82 U (bezogen auf Dodekansäure (66) und einem
Reaktionsvolumen von 1 ml, was einer Enzymkonzentration von 33.0 g/l entspricht, kein Umsatz
beobachtet werden. Bei gleicher Enzymmenge mit einem Reaktionsvolumen von 5 ml, was einer
geringeren Enzymkonzentration von 6.6 g/l entspricht, konnte ein Umsatz von 6% bis 7% mit einer
Produktbildung von 0.138 g/l bis 0.172 g/l erzielt werden. Es lag hierbei vermutlich an der hohen
Konzentration des Enzyms mit 33.0 g/l in 1 ml Reaktionsvolumen und der daraus resultierenden
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
62
Dickflüssigkeit der Lösung. Bei einem Reaktionsvolumen von 5 ml war die Lösung weniger viskos und
das Protein konnte sich deshalb mehr bewegen.
3.5.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung in
Abhängigkeit vom Reaktionsvolumen und der Menge der P450-Monooxygenase
In diesem Abschnitt wurde die Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit einer in situ-Cofaktor-
regenerierung unter den Aspekten der Konzentration an eingesetztem Cycloalkan 73 und der
eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase untersucht. Dazu wurden drei Modelle betrachtet.
Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung, 20 mM Substratkonzentration und
38.2 U/mmol P450-Monooxygenase
Die Hydroxylierung des Cycloalkans 73 mit einer Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66)) und einer Substratkonzentration von 20 mM wurde zuerst
betrachtet. Hierbei wurden bei einer Enzymkonzentration von 6.6 g/l ein Umsatz von durch-
schnittlichen 7% und eine Produktbildung von durchschnittlich 0.155 g/l erzielt (Tabelle 15).
Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung, 100 mM Substratkonzentration und
38.2 U/mmol P450-Monooxygenase
Die Konzentration von Cyclooktan (73) wurde auf 100 mM erhöht. Die Hydroxylierung wurde
desweiteren mit einer Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure
(66)) durchgeführt, um einen direkten Vergleich zu erhalten. Allerdings konnte kein Umsatz
beobachtet werden. Es lag hierbei vermutlich an der zu hohen Konzentration des Enzyms (33.0 g/l)
und der daraus resultierenden Dickflüssigkeit der Lösung (Tabelle 15).
Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung, 25 mM Substratkonzentration und
7.64 U/mmol P450-Monooxygenase
Die beiden vorher betrachteten Reaktionsmodelle gründeten auf der P450-Monooxygenase-Menge,
deren Aktivität sich auf Dodekansäure (66) bezog. Bei dem Substrat, das hier untersucht werden
sollte, handelte es sich jedoch um Cyclooktan (73). Deshalb wurde im nächsten Schritt die Menge der
P450-Monooxygenase auf diesen cyclischen C8-Körper 73 bezogen und auf Grund der niedrigeren
Aktivität auf dieses Substrat die Unitmenge auf 0.764 U (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)
herabgesetzt, da sonst sehr große Mengen an Enzym erforderlich gewesen wären. Zur Steigerung der
Produktbildung wurde die Substratkonzentration auf 25 mM erhöht. Erfreulicherweise konnte hier
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
63
bei einer Enzymkonzentration von 10.8 g/l ein Umsatz von 10% mit einer Produktbildung von
0.328 g/l erzielt werden. Das Ergebnis war somit besser als bei Einsatz einer Enzymmenge von 3.82 U
(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66) und einer Substratkonzentration von 25 mM, denn
das Produkt Cyclooktanol (74) wurde mit 0.138 g/l bis 0.172 g/l gebildet (Tabelle 15).
Tabelle 15: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der
Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase
asiehe AAV 12,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuch zu 1a zur
Validierung
3.5.2.4 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von
Cyclooktanon
Die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zur Synthese von Cyclooktanon (75) in
wässrigem Medium beruht auf dem Zusammenspiel einer P450-Monooxygenase und einer
Alkoholdehydrogenase (Abbildung 62).
Eintraga c (73) P450 BM-3 74b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mM] [U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 20 38.20 6.6 0.86 7 7 27 0.0017 0.172
1be 20 38.20 6.6 0.69 6 6 10 0.0013 0.138
2 100 38.20 33.0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3 25 7.64 10.8 1.31 10 10 27 0.0026 0.328
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
64
Abbildung 62: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) durch Kombination einer P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium und einer ADH aus Lactobacillus kefir
Der erste Schritt ist die Hydroxylierung des unreaktiveren Cycloalkans 73 zu dem reaktiveren
Cyclooktanol (74) mit Hilfe der NADPH-abhängigen P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium
(BM-3). Im Laufe der Reaktion wird NADPH zu NADP+ oxidiert. Der oxidierte Cofaktor NADP+ steht
somit für die anschließende Oxidation des Alkohols 74 zum Keton 75 durch die
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir zur Verfügung und wird im Laufe der Reaktion wieder
zu NADPH reduziert. Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte Cosubstrat-freie
Cofaktorregenerierung, da das eingesetzte NADPH von der P450-Monooxygenase zu NADP+ oxidiert
wird, das wiederum von der Alkoholdehydrogenase nachfolgend zu NADPH reduziert wird. Somit
steht ausreichend reduzierter Cofaktor für einen weiteren Katalysezyklus zur Verfügung.
3.5.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation
In diesem Teilkapitel wurde der Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation
untersucht. Die Reaktion wurde mit einer Enzymmenge von 3.82 U/mmol (Enzymaktivität bezogen
auf Dodekansäure (66) und mit einer Substratkonzentration von 20 mM und 100 mM durchgeführt,
um einen direkten Vergleich zu bekommen. Hierbei zeigte sich, dass bei einer Substratkonzentration
von 20 mM mit einer Produktbildung von 0.026 g/l ein deutlich niedrigerer Wert erhalten wurde, als
bei einer Substratkonzentration von 100 mM, bei eine Produktbildung von 0.130 g/l erzielt wurde
(Tabelle 16).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
65
Tabelle 16: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclooktan (73)
asiehe AAV 13,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH
3.5.2.4.2 Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-
Monooxygenase auf die Doppeloxidation
Im Hinblick auf das durchaus positive Ergebnis der Produktbildung von 0.328 g/l (Tabelle 15, Eintrag
3), das bei der Hydroxylierung mit 7.64 U/mmol P450-Monooxygenase (Enzymaktivität bezogen auf
Cyclooktan (73)) und einer Substratkonzentration von 25 mM erzielt wurde, wurden diese
Reaktionsbedingungen auf die Doppeloxidation angewendet. Sie wurden mit dem Ergebnis, das bei
einer Substratkonzentration von 20 mM und Einsatz von 38.2 U/mmol P450-Monooxygenase
(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), erhalten wurde, verglichen. Das Produkt wurde mit
0.09 g/l bis 0.14 g/l für die Konzentration von 25 mM Cyclooktan 73 und einer Enzymkonzentration
von 10.8 g/l gebildet und erzielte damit eine geringfügig höhere Produktbildung als bei einer
Substratkonzentration von 20 mM und einer Enzymkonzentration von 6.6 g/l, bei der eine Produkt-
bildung von 0.094 g/l erreicht wurden (Tabelle 17).
Eintraga
c (73) 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 20 0.13 1 1 2 0.0002 0.026
2 100 0.13 1 1 1 0.0010 0.130
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
66
Tabelle 17: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-
Monooxygenase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
asiehe AAV 13,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 2a zur
Validierung
3.5.2.4.3 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase auf die
Doppeloxidation
Es stellte sich die Frage, ob durch die Erhöhung der Menge an eingesetzter P450-Monooxygenase
BM-3 eine höhere Produktbildung erzielt werden könnte. Deshalb wurde die Enzymmenge auf
15.28 U/mmol verdoppelt bzw. auf 22.92 U/mmol verdreifacht und mit der einfachen Enzymmenge
von 7.64 U/mmol verglichen. Die Aktivität des Enzyms war hier auf Cyclooktan (73) bezogen. Bei allen
Reaktionen, die mit einer Substratkonzentration von 25 mM und über 24 Stunden durchgeführt
wurden, wurde ein Umsatz von 3% erzielt. Mit zweifacher Enzymmenge (Enzymkonzentration von
21.5 g/l) wurde das Produkt Cyclooktanon (75) mit 0.103 g/l gebildet, die mit der Produktbildung von
0.090 g/l bis 0.140 g/l bei einfacher Enzymmenge (Enzymkonzentration von 10.8 g/l) vergleichbar ist.
Lediglich bei Verdreifachung der Enzymmenge (Enzymkonzentration von 32.3 g/l) wurde mit einer
Eintraga
c (73) P450 BM-3 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mM] [U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 20 38.20 6.6 0.47 4 3 8 0.0007 0.094
2a 25 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
2be 25 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
2ce 25 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
67
Produktbildung von 0.93 g/l ein etwas niedrigerer Wert erhalten (Tabelle 18). Das Problem lag auch
hier vermutlich an der hohen Enzymkonzentration und der daraus resultierenden Erhöhung der
Viskosität.
Tabelle 18: Einfluss der eingesetzten Menge der P450-Monooxygenase auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
asiehe AAV 13,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung
3.5.2.5 Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv
Die sehr geringen Umsätze und die geringen Produktbildungen bis maximal 0.140 g/l waren Anlass
dafür, dass über die Einführung eines Additivs nachgedacht wurde. Wie in Kapitel 3.2.2 in Abbildung
10 gezeigt, wird im ersten Schritt, die Hydroxylierung mit einer P450-Monooxygenase, ein Teil des
Cofaktors NADPH kontinuierlich für die „Shuntway“-Reaktionen verbraucht, bis der Zyklus aufgrund
der komplett verbrauchten Menge NADPH zum Erliegen kommt. Je mehr der Cofaktor NADPH für die
Eintraga
P450 BM-3 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
1be 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
1ce 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
2 15.28 21.5 0.41 3 3 13 0.0008 0.103
3 22.92 32.3 0.37 3 3 10 0.0007 0.093
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
68
Nebenreaktionen verbraucht wird, desto niedriger ist die coupling efficiency. Es konnte in anderen
Arbeiten gezeigt werden, dass die Einführung eines zusätzlichen Cofaktorregenerierungssystems die
coupling efficiency erhöhen und somit auch die Produktbildungsrate der Doppeloxidation erhöhen
konnte.[86] Unter Einsatz einer enzymgekoppelten in situ-Cofaktorregenerierung mit einer Glucose-
dehydrogenase und D-Glucose konnte das während der Nebenreaktionen entstehende NADP+ wieder
zum NADPH umgewandelt werden. NADPH konnte daraufhin dem Zyklus wieder zugeführt werden
und der Katalysezyklus startete von Neuem. Die Produktbildungsrate konnte dadurch bis zu der
dreifachen Menge gesteigert werden.[86] Anstatt einer enzymgekoppelten in situ-Cofaktor-
regenerierung wurde bei der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) das Substrat
Isopropanol (30) als Additiv ausgewählt, das von der Alkoholdehydrogenase unter Reduktion von
NADP+ zu NADPH zu Aceton oxidiert werden konnte. Das durch diese substratgekoppelte in situ-
Cofaktorregenerierung entstehende NADPH stand dann wieder für den ersten Schritt der
Doppeloxidation, der Hydroxylierung des Cycloalkans 73 zu Cyclooktanol (74), zur Verfügung. Die
Verluste durch die Nebenreaktion der P450-Monooxygenase wurden dadurch minimiert.
Anschließend erfolgte die Oxidation des entstehenden Cycloalkanols 74 zum Cycloalkanon 75 unter
Bildung von NADPH und der Katalysezyklus konnte von Neuem beginnen (Abbildung 63).
Abbildung 63: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv
Durch den Einsatz des billigeren Cofaktors NADP+ konnten Kosten gespart werden und die Verluste
des Cofaktors durch Nebenreaktionen der P450-Monooxygenase BM-3 minimiert werden. Im
folgenden Abschnitt wurde das System mit Isopropanol 30 als Additiv mit der vorher diskutierten
Doppeloxidation ohne Additiv verglichen. Desweiteren wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur,
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
69
der Reaktionszeit, der Substratkonzentration und der Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase
auf die Doppeloxidation mit Isopropanol 30 als Additiv untersucht.
3.5.2.5.1 Einfluss des Additivs Isopropanol auf die Doppeloxidation
Zuerst wurde das System mit Isopropanol (30) als Additiv mit der vorher diskutierten Doppel-
oxidation ohne Additiv bei einer Substratkonzentration von 25 mM, einer Reaktionszeit von
24 Stunden und unter Einsatz von 7.64 U/mmol P450-Monooxygenase (Enzymaktivität bezogen auf
Cyclooktan (73)) bzw. 200 U/mmol Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (Enzymaktivität
bezogen auf Acetophenon) verglichen. Es wurden erfreulicherweise ein deutlich höherer Umsatz und
eine damit erhöhte Produktbildung bei Einsatz des Alkohols 30 als Additiv erhalten. Der Umsatz
belief sich auf 10% bis 11% bei einer Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l. Damit wurde ein
dreifach höheres Ergebnis erzielt, als bei der Doppeloxidation ohne das Additiv mit einem Umsatz
von 3% bis 4% und einer Produktbildung von 0.090 g/l bis 0.140 g/l. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19
dargestellt.
Tabelle 19: Unterschied von der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ohne Einsatz
des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
70
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 2a zur
Validierung
3.5.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Doppeloxidation von Cyclooktan
mit Isopropanol als Additiv
Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse wurde bei der Doppeloxidation mit Isopropanol (30) als
Additiv weitergearbeitet. Im nächsten Schritt wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur auf die
Doppeloxidation untersucht. Dazu wurde die Reaktion über 24 Stunden bei Raumtemperatur mit der
Reaktion verglichen, bei der in den ersten 8 Stunden konstant eine Temperatur von 8°C gehalten
wurde und bei der die Erwärmung auf Raumtemperatur in den verbleibenden 16 Stunden
durchgeführt wurde. Mit einem Umsatz von 11% und einer Produktbildung von 0.328 g/l lag das
Ergebnis bei der niedrigeren Temperatur im Bereich der Ergebnisse bei Raumtemperatur, bei denen
Umsätze von 10% bis 11% und eine Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l erzielt wurde. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 20 zusammengefasst.
Eintraga
IPA 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[µl] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 0 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
1b 0 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
1c 0 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
2a 10 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
2be 10 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
2ce 10 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
71
Tabelle 20: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung
3.5.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit
Isopropanol als Additiv
Als nächstes wurde der Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation untersucht, indem die
Reaktionszeit verlängert wurde. Hierbei wurde in 48 Stunden mit einem Umsatz von 11% und einer
Produktbildung von 0.345 g/l ein sehr ähnliches Ergebnis wie bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden
erreicht. Hier wurden Umsätze von 10% bis 11% und Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l
erreicht. Eine deutlich höhere Bildung an Produkt konnte also nicht durch eine Verlängerung der
Reaktionszeit erzielt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 dargestellt.
Eintraga T
75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a RT 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be RT 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce RT 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 8°C 1.31 11 12 27 0.0026 0.328
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
72
Tabelle 21: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bReaktionszeit,
cnach
1H-NMR und Auswaage,
dUmsatz nach IS,
eUmsatz nach ISH,
fWiederholungsversuche
zu 1a zur Validierung
3.5.2.5.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer
Substratkonzentration von 25 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit
Isopropanol als Additiv
Im nächsten Schritt wurde der Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv bei einer Substratkonzentration
von 25 mM und einer Reaktionszeit von 24 Stunden untersucht. Als P450-Monooxygenase wurden
die F87V-Mutante und die 19A12-Mutante miteinander verglichen. Mit der 19A12-Mutante wurde
mit einem Umsatz von 20% bis 22% und einer Produktbildung von 0.633 g/l bis 0.685 g/l ein deutlich
besseres Ergebnis erzielt als bei Verwendung der F87V-Mutante. Hier wurden Umsätze von 10% bis
Eintraga
Dauerb 75c Umsatzc Umsatzd Umsatze Produktbildungc
[h] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 24 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bf 24 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cf 24 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 48 1.38 11 11 40 0.0027 0.345
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
73
11% und eine Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22
zusammengefasst.
Tabelle 22: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenasen bei einer Substratkonzentration von
25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol
(30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung, fWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
Eintraga Mutante
75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
2bf 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
2cf 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
74
3.5.2.5.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv
In diesem Teilkapitel wurde der Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation
untersucht. Die Doppeloxidation wurde sowohl mit der 19A12-Mutante als auch mit der F87V-
Mutante bei einer Enzymmenge von 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)) und
einer Substratkonzentration von 25 mM bis 100 mM durchgeführt, um einen direkten Vergleich zu
erhalten. Bei Einsatz beider Mutanten zeigte sich durch die Erhöhung der Substratkonzentration eine
deutliche Verbesserung (Abbildung 64).
Abbildung 64: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase und der Substratkonzentration auf die
biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als
Additiv
Einsatz der 19A12-Mutante
Die Produktbildung von 0.633 g/l bis 0.685 g/l, die mit der 19A12-Mutante bei einer Substrat-
konzentration von 25 mM erzielt wurde, konnte durch die Erhöhung der des Cycloalkans 73 auf
100 mM auf eine Produktbildung von 0.800 g/l gesteigert werden, was einer Verbesserung um 22%
entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 dargestellt.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
75
Tabelle 23: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung
Einsatz der F87V-Mutante
Es konnte ein ähnlicher Trend bei Einsatz der F87V-Mutante verzeichnet werden wie bei Einsatz der
19A12-Mutante. Die Produktbildung nahm hier bei einer Substratkonzentration von 25 mM von
0.339 g/l bis 0.353 g/l auf 0.490 g/l bei einer Konzentration von 100 mM zu, was einer Steigerung von
45% entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengefasst.
Tabelle 24: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung
Eintraga
c (73) 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 25 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
1bd 25 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
1cd 25 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
2 100 0.80 6 6 14 0.0063 0.800
Eintraga
c (73) 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 4 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be 4 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce 4 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 1 0.49 4 4 10 0.0039 0.490
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
76
3.5.2.5.6 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer
Substratkonzentration von 100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit
Isopropanol als Additiv
Anschließend wurden die 19A12- und F87V-Mutante der P450-Monooxygenase bei einer
Substratkonzentration von 100 mM getestet. Die höchste Produktbildung wurde mit der 19A12-
Mutante erreicht. Sie betrug hier 0.80 g/l, während mit der F87V-Mutante 0.49 g/l des Cycloalkanons
75 gebildet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 dargestellt.
Tabelle 25: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH
Eintraga Mutante
75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 19A12 0.80 6 6 14 0.0063 0.80
2 F87V 0.49 4 4 10 0.0039 0.49
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
77
3.5.2.5.7 Einfluss der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium auf die
Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv
Bei den Mutanten der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium handelte es sich um
Rohextrakte, in denen noch andere aktive Substanzen enthalten ein könnten. Es wurde daher eine
Reaktion mit dem Leervektor der P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von 25 mM
den Reaktionen der 19A12- und der F87V-Mutante verglichen. Ein Leervektor ist der aus dem
Wirtsorganismus E. coli stammende Rohextrakt ohne Expression der P450-Monooxygenase BM-3.[87]
Im Gegensatz zu den Reaktionen mit den Mutanten, konnte kein Umsatz mit dem Leervektor
beobachtet werden, was beweist, dass die Hydroxylierung wirklich von den Mutanten der P450-
Monooxygenase katalysiert wurde und nicht von anderen Substanzen im Rohextrakt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 26 dargestellt.
Tabelle 26: Einfluss der P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
Eintraga Enzym
75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
78
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung, fWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
3.5.2.5.8 Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die
Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv
Im letzten Schritt wurde der Einfluss der katalytischen Aktivität der Alkoholdehydrogenase aus
Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv
untersucht. Dazu wurde diese Reaktion mit der 19A12- oder der F87V-Mutante der P450 BM-3 mit
sowie ohne Zusatz der Alkoholdehydrogenase durchgeführt. Erwartungsgemäß konnte ohne die
Alkoholdehydrogenase weder bei Einsatz der 19A12-Mutante noch bei Einsatz der F87V-Mutante ein
Umsatz beobachtet werden, da der am Anfang der Reaktion zugesetzte Cofaktor NADP+ von der
P450-Monooxygenase BM-3 nicht umgesetzt werden konnte (Tabelle 27).
Tabelle 27: Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
Eintraga Enzym
75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
2bf 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
2cf 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
3 Leer-
vektor n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
79
asiehe AAV 14,
bnach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a zur
Validierung, fWiederholungsversuche zu 3a zur Validierung
3.5.3 Zusammenfassung
Sowohl die Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) als auch die Doppeloxidation des
Cycloalkans 73 zur Synthese von Cyclooktanon (75) wurden unter verschiedenen Gesichtspunkten
mit dem Ziel der Etablierung von geeigneten biokatalytischen Eintopf-Verfahren im wässrigen
Medium mit molekularem Sauerstoff als Reagenz untersucht.
3.5.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan
Bei der Hydroxylierung von Cyclooktan (73) waren die Startbedingungen der Einsatz von
38.2 U/mmol (bezogen auf Dodekansäure) F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus
megaterium (P450 BM-3) bei einer Substratkonzentration von 20 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,
50 mM) und einer Reaktionszeit von 24 Stunden. Die Reaktion wurde zuerst mit dem Cofaktor
NADPH ohne Cofaktorregenerierung durchgeführt, was zu keinem Umsatz führte. Erst durch die
Einführung einer in situ-Cofaktorregenerierung konnte eine Produktbildung von 0.155 g/l erreicht
werden. Dazu wurde als Cofaktor NADP+, als Cosubstrat D-Glucose und als Zweitenzym die
Glucosedehydrogenase eingesetzt, die unter Bildung des für den Hydroxylierungsschritt benötigten
Cofaktors NADPH die D-Glucose in D-Gluconolacton umwandelt. Die Produktbildung konnte mit Hilfe
Eintraga Mutante
LK-ADH 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[U/mmol] [mg] [%] [%] [%] [mmol/ml] [mg/ml]
1a F87V 200 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be F87V 200 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce F87V 200 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 F87V 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3a 19A12 200 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
3bf 19A12 200 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
3cf 19A12 200 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
4 19A12 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
80
der in situ-Cofaktorregenerierung im abschließenden Schritt auf 0.328 g/l durch Änderung der
Substratkonzentration auf 25 mM und der Enzymmenge auf 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen
auf das Cycloalkan 73) verbessert werden (Abbildung 65).
Abbildung 65: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) mit einer
Produktbildung von 0.328 g/l
3.5.3.2 Doppeloxidation von Cyclooktan
Die Startbedingungen bei der Doppeloxidation waren der Einsatz von 0.1 Äquivalenten NADPH als
Cofaktor und 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) F87V-Mutante der P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden und einer
Substratkonzentration von 100 mM. Auf diese Reaktion wurde der Einfluss der Konzentration des
Edukts Cyclooktan (73) und der eingesetzten Enzymmenge untersucht. Durch eine Veränderung der
Substratkonzentration von 20 mM auf 25 mM mit einer einhergehenden Änderung der eingesetzten
Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf die Säure 66) auf 7.64 U/mmol
(Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) konnte eine Steigerung der Produktbildung von
0.094 g/l auf 0.110 g/l verzeichnet werden. Anschließend wurde der Einfluss der Enzymmenge auf die
Reaktion untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Doppeloxidation bei einer Substratkonzentration
von 25 mM und Enzymmengen von 7.64 U/mmol, 15.28 U/mmol und 22.92 U/mmol (Enzymaktivität
bezogen auf das Cycloalkan 73) durchgeführt. Die Produktbildung von 0.09 g/l bis 0.14 g/l bei
7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) P450-Monooxygenase nahm bei
Erhöhung der Enzymmenge ab (Abbildung 66). Die Produktbildung lag bei einer Enzymmenge von
15.28 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)) bei 0.103 g/l und von 22.92 U/mmol
(Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) bei 0.093 g/l.
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
81
Abbildung 66: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) mit einer
Produktbildung im Bereich von 0.09 bis 0.14 g/l
Die Doppeloxidation wurde anschließend mit und ohne Isopropanol 30 als Additiv untersucht. Dazu
wurde die Doppeloxidation einerseits ausgehend von Cyclooktan (73) und NADPH als Cofaktor und
andererseits ausgehend vom Cycloalkan 73, Isopropanol (30) und dem Cofaktor NADP+ untersucht.
Durch die Einführung des Alkohols 30 als Additiv und NADP+ als Cofaktor konnte die Produktbildung
von 0.090 g/l bis 0.14 g/l auf 0.323 g/l bis 0.353 g/l gesteigert werden. Fortan wurde die Doppel-
oxidation mit Isopropanol (30) als Additiv unter den Gesichtspunkten Reaktionstemperatur,
Reaktionszeit, Substratkonzentration und eingesetzter Mutante der P450-Monooxygenase unter-
sucht. Es wurde zuerst der Einfluss bei Verringerung der Reaktionstemperatur auf 8°C für 8 Stunden
mit anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur während der verbleibenden 16 Stunden auf die
Doppeloxidation mit dem Alkohol 30 als Additiv untersucht. Die Produktbildung lag mit 0.328 g/l in
einem vergleichbaren Bereich wie bei der Durchführung der Doppeloxidation mit Isopropanol (30) als
Additiv bei Raumtemperatur über 24 Stunden. Hier wurde eine Produktbildung von 0.323 g/l bis
0.353 g/l erzielt. Im nächsten Schritt wurde die Reaktionszeit von 24 Stunden auf 48 Stunden erhöht.
Auch hier wurde mit einer Produktbildung von 0.345 g/l ein Ergebnis im gleichen Bereich erzielt. Die
19A12-Mutante stellte sich als geeignete Mutante in der biokatalytischen Doppeloxidation des
Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75 heraus. Hierbei wurde eine Produktbildung von 0.651 g/l bei
einer Substratkonzentration von 25 mM erreicht. Zur Verbesserung der Produktbildung wurde die
Substratkonzentration von 25 mM auf 100 mM erhöht. Dadurch konnte die Produktbildung deutlich
auf 0.80 g/l verbessert werden, was auch das bisher beste Ergebnis darstellte (Abbildung 67).
3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren
82
Abbildung 67: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung im Bereich von 0.80 g/l
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
83
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-
Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
4.1 Einleitung
Baeyer-Villiger-Monooxygenasen, die zur Klasse der Oxidoreduktasen gehören, sind Flavoenzyme
und dafür bekannt, dass sie entsprechend einer Baeyer-Villiger-Oxidation lineare, cyclische und
aromatische Ketone zu den korrespondierenden Estern oder Lactonen oxidieren können.[88-90] Die
kommerziell erwerbliche NADPH-abhängige Baeyer-Villiger-Monooxygenase aus Acinetobacter
calcoaceticus (EC 1.14.13., BVMO ECS-MO1) [88] kann Cyclohexanon (41) unter Verbrauch von NADPH
zu ε-Caprolacton (53) umwandeln. Als vorhergehender Schritt kann die NADPH-abhängige
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (EC 1.1.1.2,[91] LK-ADH) unter Bildung von NADPH
Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41) oxidieren, so dass es möglich ist, in einem Eintopf-
Zweistufen-Verfahren im wässrigen Medium mit molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel das
ε-Caprolacton (53) aus dem cyclischen Alkohol 16 herzustellen. Hierbei kann auf den Zusatz eines
Cosubstrats verzichtet werden (Abbildung 68). Das Produkt ε-Caprolacton (53) kann zur Herstellung
von Polycaprolacton (PCL, 54) verwendet werden.[92,93]
Abbildung 68: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) in einem Eintopf-Zweistufen-
Verfahren im wässrigen Medium zu ε-Caprolacton (53)
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
84
4.2 Stand der Wissenschaft
4.2.1 Verwendung von εεεε-Caprolacton in der Industrie
4.2.1.1 Polycaprolacton (PCL)
Das Lacton 53 wird vor allem zur Herstellung von Polycaprolacton (PCL, 54) verwendet, ein farbloses
Polymer mit einer Schmelztemperatur im Bereich von 58 bis 65°C (Abbildung 69).[92]
Abbildung 69: Das Polymer Polycaprolacton (PCL, 54)
Polycaprolacton (54) kann mit anderen Polymeren Polymermischungen bilden. Daraus ergeben sich
neue Werkstoffe, die die verschiedenen Eigenschaften der einzelnen Polymere vereinen.
Polycaprolacton (54) kann aber auch als polymerer Weichmacher eingesetzt werden und ist
biologisch gut abbaubar, weshalb das Polymer auch in der Medizin Anwendung findet.[92]
4.2.1.2 Herstellung von Polycaprolacton durch anionische Polymerisation von
εεεε-Caprolacton
Es gibt mehrere Basen oder Lewis-Basen, die in der Lage sind, die anionische ringöffnende
Polymerisation zu initiieren. Dazu gehören Alkoholate, Alkoxide, Phosphine, Amine und
Metallalkyle.[92] Die Initiierung der anionischen ringöffnenden Polymerisation durch ein Alkoholat 76,
das nucleophil am Carbonyl-Kohlenstoffatom angreift und somit eine Ringöffnung unter Entstehung
eines Alkoxids 77 herbeiführt, wird in Abbildung 70 dargestellt. Das Alkoxidkettenende ermöglicht
das Kettenwachstum, bis das Wachstum durch Zugabe von Inhibitoren gestoppt wird.[92,93] Es
entstehen Polycaprolactone, die je nach ihrer Kettenlänge unterschiedliche Schmelztemperaturen
haben.[92]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
85
Abbildung 70: Anionische Polymerisation von ε-Caprolacton (53) zur Synthese von
Polycaprolactonen [92]
4.2.2 Herstellung von εεεε-Caprolacton
4.2.2.1 Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclohexanon unter Verwendung von
Persäuren
Bei der Baeyer-Villiger-Oxidation handelt es sich um eine Oxidationsreaktion von Ketonen zu Ester
bzw. Lactonen unter Einsatz von Persäuren. Als Persäuren 78 werden in der organischen Chemie
typischerweise Peressigsäure oder meta-Chlorperbenzoesäure (mCPBA) eingesetzt. Die Persäure
kann als Nucleophil das durch Protonierung entstehende Carbokation angreifen und das sogenannte
Criegee-Intermediat 79 bilden. Nach Abspaltung einer Carbonsäure und abschließender
Deprotonierung erhält man das Lacton 53 (Abbildung 71).[94]
Abbildung 71: Synthese von ε-Caprolacton (53) durch die Baeyer-Villiger-Oxidation von
Cyclohexanon (41) unter Verwendung von Persäuren 78 [94]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
86
4.2.2.2 Industrielle Herstellung durch den UCC-Prozess
Das ε-Caprolacton (53) spielt eine wichtige Rolle für die Herstellung von Polymeren und wird zu
mehreren 10.000 Tonnen jährlich produziert. Allein die Firma Interox in England betreibt seit 1975
eine 10.000 jato Anlage.[21] Beim industriellen UCC-Prozess (Union Carbide Corporation) wird das
Keton Cyclohexanon (41) bei 50°C unter Normaldruck mit Peressigsäure (78a) zu ε-Caprolacton (53)
oxidiert (Abbildung 72). Hierbei wird eine Selektivität von 85% bis 90% erreicht.[21]
Abbildung 72: Industrielle Herstellung von ε-Caprolacton (53) durch den UCC-Prozess [21]
Die als Oxidationsmittel eingesetzte Peressigsäure (78a) ist allerdings brandfördernd, ätzend,
gesundheitsschädlich und umweltgefährlich.[95] Aus toxikologischer und ökologischer Sicht ist diese
Chemikalie daher eher problematisch zu betrachten.
4.2.3 Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase
Baeyer-Villiger-Monooxygenasen benötigen den Cofaktor NADPH oder NADH und sind gewöhnlich
abhängig von Flavin (FAD oder FMN). Der in der Abbildung 73 dargestellte Mechanismus beschreibt
die Baeyer-Villiger-Oxidation unter Einsatz des Cofaktors NADPH und des Coenzyms Flavin-Adenin-
Dinukleotid (FAD, 80). Während der enzymatischen Baeyer-Villiger-Oxidation wird ein Sauerstoff-
Atom des Sauerstoff-Moleküls in das Ausgangsketon, hier Cyclohexanon (41), unter Bildung des
korrespondierenden Esters oder Lactons, hier ε-Caprolacton (53), eingeführt. Das zweite Sauerstoff-
atom wird in Wasser umgewandelt. Das FAD wird unter Oxidation von NADPH zu NADP+ zu FADH2
(81) reduziert. Die Oxidation verläuft dann über das Intermediat Peroxoflavin (82), das einen
nucleophilen Angriff auf das Carbonyl-Kohlenstoffatom des Ausgangsketons startet
(Abbildung 73).[1,96]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
87
Abbildung 73: Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase [1,96,97]
4.2.4 Präparative Anwendungen der BVMO
4.2.4.1 Enantioselektive Sulfoxidation von prochiralen Thioethern
Die Arbeitsgruppe von REETZ et al. veröffentlichte 2004 ihre Ergebnisse zur enantioselektiven
Sulfoxidation von prochiralen Thioethern. Die (R)-selektive Mutante 1-D10-F6 einer Cyclohexanon-
Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (EC 1.14.13.22) oxidierte unter Einsatz
von molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel das Substrat Methyl-p-methylbenzylthioether (83)
zum korrespondierenden (R)-Sulfoxid (R)-84 mit einer Ausbeute von 75% und einem ee-Wert von
98.9%.[98] Einen ähnlichen Erfolg erzielte die Gruppe bei der gleichen Reaktion unter Einsatz mit der
von ihnen entwickelten (S)-selektiven Mutante 1-H8-A1 einer Cyclohexanon-Monooxygenase aus
Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (EC 1.14.13.22) und Luftsauerstoff. Hierbei konnte das entsprechende
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
88
(S)-Sulfoxid (S)-84 mit einer Ausbeute von 52% und einem ee-Wert von 99.7% erhalten werden
(Abbildung 74).[98]
Abbildung 74: Enantioselektive Sulfoxidation eines prochiralen Thioethers 83 mit Hilfe einer
CHMO [98]
Darüber hinaus untersuchte die Gruppe das Potential von Mutanten für eine effiziente, kinetische
Spaltung der rac-Sulfoxide rac-84. Hierzu wurde ein racemisches Gemisch des Sulfoxids 84 mit
Luftsauerstoff und entweder der (R)-selektiven Mutante 1-D10-F6 oder der (S)-selektiven Mutante
1-H8-A1 versetzt. Bei der Oxidation des racemischen Sulfoxids rac-84 mit der 1-D10-F6-Mutante
unter der Synthese des Sulfons 85 wurde ein Umsatz von 43% erzielt. Der ee-Wert des verbleibenden
(R)-Sulfoxids (R)-84 lag bei 98.7%. Durch Einsatz der 1-H8-A1-Mutante konnte das racemische
Gemisch des Sulfoxids 84 mit einem Umsatz von 62% zum Sulfon 85 oxidiert werden. Das
verbleibende (S)-Sulfoxid (S)-84 wurde mit einem ee-Wert von 98.9% erhalten (Abbildung 75).[98]
Abbildung 75: Kinetische Spaltung des racemischen Sulfoxids rac-84 mit Hilfe einer CHMO [98]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
89
4.2.4.2 Katalytische kinetische Racematspaltung von 4-Hydroxy-2-ketonen
Im Jahre 2006 zeigte KIRSCHNER et al., dass acylierte (S)-1,2-Diole (S)-87a-c und (S)-88a-c aus
racemischen 4-Hydroxy-2-ketonen rac-86a-c durch eine BVMO aus P. fluorescens DSM 50106
erhalten werden konnte, wobei ein maximaler Umsatz von 48% erzielt wurde
(Abbildung 76).[89] Durch Acylwanderung von der primären zur sekundären Hydroxygruppe
entstanden die Verbindungen (S)-87a-c und (S)-88a-c als Mischung in einem Verhältnis von 4:1.[89]
Abbildung 76: Kinetische Racematspaltung von racemischen 4-Hydroxyketonen rac-86 [89]
4.2.4.3 Synthese von ββββ-Aminosäuren und ββββ-Aminoalkoholen durch Nutzen der
Regioselektivität der BVMO
REHDORF et al. fand 2010 einen Zugangsweg zu den wertvollen Bausteinen der β-Aminosäuren und β-
Aminoalkoholen, indem die Gruppe die Regioselektivität der BVMO ausnutzte. Hierzu wurde ein
racemisches, N-geschütztes β-Aminoketon rac-89 durch kinetische Racematspaltung mit einer BVMO
zu einem abnormalen N-geschützten β-Aminosäureester 90, bei dem der Sauerstoff am weniger
gehinderten Kohlenstoffatom eingefügt wurde, und zu einem normalen N-geschützten Baeyer-
Villiger-Ester 91 mit dem Sauerstoff am höher substituierten Kohlenstoffatom umgesetzt (Abbildung
77).[90] Es wurden insgesamt vier BMVOs gefunden, die in der Lage waren, das racemische β-
Aminoketon rac-89 als Substrat zu akzeptieren, wobei die Cyclododecanon-Monooxygenase aus
Rhodococcus ruber im Gegensatz zu den anderen untersuchten BVMOs das (+)-Enantiomer (+)-90
bildete.[90]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
90
Abbildung 77: BVMO-katalysierte kinetische Racematspaltung des N-geschützten β-Aminoketons
rac-89 [90]
Das Enzym Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B) war in der Lage den abnormalen N-geschützten
(+)-β-Aminosäureester (+)-90 zu der N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 zu hydrolysieren und
den normalen N-geschützten Ester 91 zu dem N-geschützten β-Aminoalkohol 93 (Abbildung 78).[90]
Abbildung 78: Synthese einer N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 und eines N-geschützten β-Aminoalkohols 93 [90]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
91
4.2.4.4 Verwendung in der Synthese von Esomeprazol
Darüber hinaus wurde die Fähigkeit der BVMO zur enantioselektiven Sulfoxidation genutzt, um den
Arzneistoff Esomeprazol (95) aus Omeprazol (94) mit Hilfe einer BVMO zu synthetisieren
(Abbildung 79).[99] Esomeprazol (95) ist ein Protonenpumpenhemmer, der zur Behandlung von
Ösophagitis (Speiseröhrenentzündung)[100] und gastro-ösophagealem Reflux eingesetzt wird.[101]
Abbildung 79: Synthese des Protonenpumpenhemmers Esomeprazol (95) durch enantioselektive
Sulfoxidation aus Omeprazol (94) mit einer BVMO [99]
4.3 Ziel der Arbeit
Das Ziel der Arbeit war die direkte biokatalytische Oxidation von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton
(53) unter Einsatz von molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel im Reaktionsmedium Wasser in
Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Hierbei wurde das Konzept der biokatalytischen
Doppeloxidation, das auf dem Zusammenspiel einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-
Villiger-Monooxygenase beruht, angewendet. Die Baeyer-Villiger-Monooxygenase ist NADPH-
abhängig. Dementsprechend musste die Alkoholdehydrogenase auch NADPH-abhängig sein, um
dadurch eine vorteilhafte Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung zu ermöglichen. Im ersten Schritt
wurde Cyclohexanol (16) von einer Alkoholdehydrogenase durch Reduktion des Cofaktors NADP+ zu
NADPH zum Cyclohexanon (41) oxidiert. Das entstehende NADPH wurde im Laufe der die Baeyer-
Villiger-Oxidation des Ketons 41 zu ε-Caprolacton (53) wieder zu NADP+ oxidiert. Der für einen
erneuten Katalysezyklus benötigte Cofaktor NADP+ stand somit wieder zur Verfügung und konnte
dementsprechend in katalytischen Mengen eingesetzt werden (Abbildung 80). Das Konzept erfüllt
einige Voraussetzungen einer „Dream Reaction“.[6] Das Reaktionsmedium Wasser ist kostengünstig
und ökologisch unbedenklich und der für die Reaktion benötigte molekulare Sauerstoff kann durch
Luftsauerstoff zugeführt werden.
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
92
Abbildung 80: Biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 unter Synthese von ε-Caprolacton
(53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium
Die Bearbeitung dieses Forschungsprojekts erfolgte im Rahmen des von der „Deutschen
Bundesstiftung Umwelt“ geförderten Verbundprojekts „Nachhaltige, biokatalytische Oxidations-
prozesse“ (AZ-13234-32).
4.4 Ergebnisse und Diskussion
4.4.1 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Aktivitätsbestimmung der
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir für die Oxidation von Cyclohexanol zu
Cyclohexanon
Die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) wurde aufgrund ihrer NADPH-
Abhängigkeit auf ihre Eignung bezogen auf die Oxidation von Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41)
getestet. Sie zeichnete sich durch eine hohe Substratbreite aus und reduzierte während der Reaktion
NADP+ zum für die Baeyer-Villiger-Oxidation benötigten NADPH. Als Referenzsubstrat für die
spektrophotometrischen Untersuchungen wurde 1-Phenylethanol (96) eingesetzt (Abbildung 81).
Abbildung 81: Die bei der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH eingesetzten
sekundären Alkohole 1-Phenylethanol (96) und Cyclohexanol (16)
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
93
Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH sind in Tabelle 28
dargestellt.
Tabelle 28: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH
Eintraga Substrat U/ml [μmol/min*ml] relative Aktivitätb [%]
1 1-Phenylethanol 79.4 100
2 Cyclohexanol 55.2 70
asiehe AAV 15,
bbezogen auf 1-Phenylethanol. Vg = 1 ml, f = 101, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
4.4.2 Synthese von εεεε-Caprolacton ausgehend von Cyclohexanol unter Kombination
einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase
In diesem Teilabschnitt wurde die Synthese von ε-Caprolacton (53) ausgehend von Cyclohexanol (16)
unter Kombination einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase unter den
Gesichtspunkten der Abhängigkeit von der der Cofaktor- und Substratmenge untersucht und ein
„Proof of Concept“ erstellt.
4.4.2.1 Einfluss der Cofaktormenge
Cofaktoren sind sehr kostenintensiv, weshalb aus ökonomischen Gründen nur eine geringe Menge
davon für die Reaktionen verwendet werden sollten. Die Stoffmenge an verwendeten NADP+ wurde
im Folgenden von 0.1 auf 0.02 Äquivalente herabgesetzt. Die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclohexanol (16) zur Synthese von ε-Caprolacton (53) wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und
Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt. Als Enzyme wurden 40 U LK-ADH und 3.82 U BVMO
eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 29 dargestellt.
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
94
Tabelle 29: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors
Eintraga
ADH BVMO NADP+ Umsatzb Produktbildungb
[U] [U] [Äq.] [%] [mol/l] [g/l]
1 40 3.82 0.02 97 0.0192 2.20
2 40 3.82 0.10 99 0.0197 2.25
asiehe AAV 16,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt.
Die Reaktion erzielte durch die Zugabe von 0.02 Äquivalenten NADP+ ähnliche Ergebnisse wie bei
höherer Cofaktorzugabe. Es wurden 97% Umsatz mit der niedrigeren Cofaktor-Stoffmenge erzielt,
während bei Zugabe von 0.1 Äquivalenten NADP+ ein Umsatz von 99% erreicht wurde. Die weiteren
Reaktionen werden mit nur 0.02 Äquivalenten NADP+ als Cofaktor durchgeführt. Die Reaktion mit
0.02 Äquivalenten NADP+ lieferte den „Proof of Concept“.
4.4.2.2 Einfluss der Substratkonzentration
Basierend auf den erfreulichen und vielversprechenden Ergebnissen erfolgte eine Prozess-
optimierung. Die Menge des Substrats Cyclohexanol (16) wurde sukzessive in 20 mM-Schritten von
20 mM auf 100 mM erhöht, in der Hoffnung, eine höhere Produktbildung zu erzielen. Alle anderen
Bedingungen wurden nicht verändert, sodass die Reaktionen in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) mit
einer Reaktionsdauer von 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Es wurden ferner
als Enzyme 40 U LK-ADH und 3.82 U BVMO eingesetzt. Die Ergebnisse in Tabelle 30 dargestellt.
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
95
Tabelle 30: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Substrats
Eintraga
ADH BVMO c (Cyclohexanol) Umsatzb Produktbildungb
[U] [U] [mM] [%] [mg/ml]
1a 40 3.82 20 97 2.20
1bb 40 3.82 20 99 2.25
2 40 3.82 40 97 4.41
3 40 3.82 60 94 6.45
4 40 3.82 80 36 3.21
5 40 3.82 100 24 2.72
asiehe AAV 16,
bnach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
Erfreulicherweise konnte bis zu einer Substratmenge von 60 mM eine Steigerung der Produktbildung
von 2.20 g/l auf 6.45 g/l erzielt werden. Der Umsatz nahm ganz leicht von 97% für 20 mM und 40 mM
auf 94% für 60 mM ab. Bei höheren Mengen an Cyclohexanol (16) konnte ein rapider Abfall sowohl
des Umsatzes als auch in der Produktbildung beobachtet werden. So wurden bei 80 mM
Cyclohexanol-Konzentration nur noch 36% Umsatz bei einer Produktbildung von 3.21 g/l erhalten,
bei 100 mM konnte nur noch 24% Umsatz und 2.72 g/l Produktbildung erzielt werden. Die Ergebnisse
sind graphisch in Abbildung 82 zu sehen.
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
96
Abbildung 82: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Substrats
Dieses Ergebnis veranlasste weiterführende spektrophotometrische Untersuchungen, um eine
Erklärung für den Abfall im Umsatz zu finden, da dieses Ergebnis auf eine Inhibierung und bzw. oder
ein Stabilitätsverlust der weniger stabilen BVMO hinwies. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des
Substrats Cyclohexanol (16), des Zwischenprodukts Cyclohexanon (41) und des Zielprodukts
ε-Caprolacton (53) auf die BVMO in Bezug auf Inhibierung und Stabilität untersucht.
4.4.3 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Inhibierung und Stabilität der
Baeyer-Villiger-Monooxygenase
Die spektrophotometrischen Untersuchungen wurden durchgeführt, um den Abfall des Umsatzes ab
einer Substrat-Konzentration von 60 mM infolge von Inhibierung oder Stabilität der BVMO erklären
zu können.
4.4.3.1 Inhibierung
Zuerst wurde die Inhibierung der Baeyer-Villiger-Monooxygenase (BVMO) durch Cyclohexanon (41)
mit Substratkonzentrationen von 0 bis 100 mM untersucht. Das Keton 41 stellt das Zwischenprodukt
in der Doppeloxidation dar und wird im Laufe der Reaktion schnell zum Lacton 53 umgesetzt,
weshalb der Einfluss von Keton 41 vernachlässigbar ist. Die höchste hierbei erreichte Aktivität der
BVMO wurde bei einer Konzentration von 12 mM Cyclohexanon (41) erzielt. Bei höheren
Konzentrationen fiel die Aktivität infolge einer Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ab. So
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
97
wurde bei einer Konzentration von 100 mM des Ketons 41 eine relative Aktivität von 57% erreicht.
Die Ergebnisse sind graphisch in Abbildung 83 dargestellt.
Abbildung 83: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41)
Anschließend wurde die Inhibierung der BVMO durch das ε-Caprolacton (53) mit Substrat-
konzentrationen von 0 bis 0.4 M untersucht (Abbildung 84). Das Lacton 53 ist das Zielprodukt der
Doppeloxidation und wird durch die Reaktion der BVMO mit Cyclohexanon erhalten.
Abbildung 84: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53)
Hier war deutlich eine sofortige Abnahme der relativen Aktivität zu verzeichnen, was auf eine
Inhibierung der BVMO durch das Produkt ε-Caprolacton (53) hindeutete. Bei einer Konzentration von
0.1 M an Lacton 53 wurde eine relative Aktivität der BVMO von 67% gemessen und diese Aktivität
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
98
nahm sukzessive bis auf 14% bei einer Konzentration von 0.4 M ε-Caprolacton (53) ab. Ein
wesentlicher Grund für die niedrigeren Umsätze bei Einsatz von höheren Konzentrationen von
Cyclohexanol (16) liegt offensichtlich in der Inhibierung der BVMO durch das ε-Caprolacton (53).
4.4.3.2 Stabilitätstests
Konsequenterweise wurde die BVMO auch auf ihre Stabilität in der Reaktionszeit von 24 Stunden
und Raumtemperatur untersucht. Als Benchmark-Versuch wurde eine Lösung der BVMO in
Phosphatpuffer (pH 7.0) über 24 Stunden gerührt und in definierten Abständen die jeweilige Aktivität
per Spektrophotometer überprüft. Hierbei nahm die Aktivität selbst in Abwesenheit der Additive
innerhalb von 24 Stunden auf 60% ab. In der Doppeloxidation liegt aber nicht nur die BVMO vor,
sondern auch das Edukt Cyclohexanol (16), das in sehr kleinen Mengen vorkommende
Zwischenprodukt Cyclohexanon (41) und das Zielprodukt ε-Caprolacton (53). Im Anschluss an diesen
Benchmark-Versuch wurde der Einfluss dieser drei Komponenten getrennt voneinander auf die
BVMO untersucht. Zur Überprüfung des Einflusses des Alkohols 16 auf das Enzym wurde jeweils eine
Enzymlösung mit entweder 25 mM, 50 mM oder 100 mM Cyclohexanol (16) versetzt und diese
Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierbei lag die relative Aktivität nach
24 Stunden für 25 mM und 50 mM Cyclohexanol (16) in einem ähnlichen Bereich wie beim
Benchmark-Versuch ohne Zusatz. Einen negativen Einfluss hatte eine Cyclohexanol-Konzentration
von 100 mM auf die relative Aktivität, die nach 24 Stunden nur noch 39% betrug (Abbildung 85). Für
die Prozessoptimierung stellten diese Ergebnisse keine große Herausforderung dar, da der
erforderliche Alkohol 16 in der optimalen Konzentration im Laufe des Prozesses immer wieder
zugegeben werden kann.
Abbildung 85: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanol (16)
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
99
Der Einfluss des Zwischenprodukts Cyclohexanon (41) auf die Aktivität der BVMO wurde untersucht,
indem man die Enzymlösung mit entweder 25 mM, 50 mM oder 100 mM Cyclohexanon (41)
versetzte und diese Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur rührte. Es zeigte sich, dass das
Keton 41 einen größeren negativen Einfluss auf die Aktivität der BVMO hat. Bei einer Konzentration
von 50 mM Cyclohexanon (41) sank die relative Aktivität auf 36% ab, bei einer Konzentration von
100 mM wurde sogar nur noch 21% erhalten (Abbildung 86). Das Keton 41 tritt in der Doppel-
oxidation allerdings nur als Zwischenprodukt auf, dessen Konzentration während der Reaktion sehr
gering ist und deshalb für die Prozessoptimierung vernachlässigbar.
Abbildung 86: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanon (41)
Zuletzt wurde der Einfluss des Zielprodukts ε-Caprolacton (53) auf die Aktivität der BVMO getestet.
Hierbei wurde jeweils eine Enzymlösung mit entweder 0.1 M, 0.25 M, 0.5 M oder 1.0 M
ε-Caprolacton (53) versetzt und diese Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es konnte
kein Einfluss auf die Enzymaktivität bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53) festgestellt
werden, jedoch bei einer Konzentration von 0.25 M konnte eine deutliche Abnahme der Aktivität auf
8% nach 24 Stunden (Abbildung 87). Bei Verwendung der höheren Konzentrationen 0.5 M und 1.0 M
konnte keine Aktivität der BVMO beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität der
BVMO durch Zugabe des Lactons 53 stark abnimmt.
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
100
Abbildung 87: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von ε-Caprolacton (53)
In Anbetracht dessen, dass das Lacton 53 sowohl inhibierend als auch negativ auf die Stabilität der
der BVMO wirkt, ist es für die Prozessoptimierung wichtig, Baeyer-Villiger-Monooxygenasen zu
identifizieren, die weniger oder gar von ε-Caprolacton (53) inhibiert oder deaktiviert werden.
Desweiteren muss nach geeigneten Methoden zur Entfernung des Zielprodukts während der
Reaktion geforscht werden, damit die Konzentration des Lactons 53 gering gehalten wird.
4.4 Zusammenfassung
Während dieser Doktorarbeit wurde die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zur
Synthese von ε-Caprolacton 53 in wässrigem Medium untersucht und ein „Proof of Concept“ erstellt.
Hierzu wurde der Alkohol 16 im ersten Schritt mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus
kefir unter Reduktion des Cofaktors NADP+ zu Cyclohexanon (41) oxidiert, das sofort unter Oxidation
des zuvor entstandenen Cofaktors NADPH mit Hilfe der Baeyer-Villiger-Monooxygenase zum
Lacton 53 oxidiert wurde. Es wurde der Einfluss der eingesetzten Konzentration des Alkohols 16 auf
die Reaktion untersucht, wobei der Bereich von 20 mM bis 100 mM Substratkonzentration
untersucht wurde. Hierbei wurde bei einer Konzentration von 40 mM Cyclohexanol (16) mit einem
Umsatz von 97% das beste Ergebnis erzielt (Abbildung 88).[102,103]
4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton
101
Abbildung 88: „Proof of Concept“ für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu
ε-Caprolacton (53)
Der Umsatz nahm bei den höheren Konzentrationen von 80 mM und 100 mM sukzessive auf 24% ab.
Deshalb wurden spektrophotometrisch die Inhibierung der Baeyer-Villiger-Monooxygenase und ihre
Stabilität intensiv untersucht. Es konnte hierbei eine deutliche Inhibierung und ein deutlicher
Stabilitätsverlust durch höhere Mengen des Zielprodukts ε-Caprolacton (53) auf die Baeyer-Villiger-
Monooxygenase beobachtet werden. Durch höhere Mengen des Alkohols 16 und des Ketons 41
konnte der gleiche Effekt beobachtet werden, jedoch im geringeren Ausmaß. Für die
Prozessoptimierung stellen die Mengen an Cyclohexanol (16) und Cyclohexanon (41) kaum ein
Problem dar, da der Alkohol 16 als Edukt zudosiert werden kann und die Cyclohexanon-
Konzentrationen während der Reaktion als vernachlässigbar betrachtet werden kann, da dieses
sofort zu ε-Caprolacton (53) umgesetzt werden kann. Ein Problem stellt die entstehende Menge an
Lacton 53 dar und für die Prozessoptimierung ist es wichtig, Baeyer-Villiger-Monooxygenasen zu
identifizieren, die weniger oder gar nicht vom Zielprodukt inhibiert oder deaktiviert werden. Ein
Augenmerk sollte auch auf einer geeignete Entfernung des Zielprodukts während der Reaktion sein
(in situ-product removal), um die Konzentration des Lactons 53 gering zu halten.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
102
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit
enzymatischen Reduktionsreaktionen
5.1 Einleitung
Die erste Bearbeitung dieses Themas erfolgte durch BORCHERT [11] und BURDA [13] aus dem Arbeitskreis
von Prof. Dr. GRÖGER. Aus den erzielten Ergebnissen ergaben sich die Fragen nach deren
Reproduzierbarkeit und nach weiteren Einflüssen (Einfluss der Proteinmenge, pH-Verläufe) auf die
Reaktion, deren Beantwortung Gegenstand dieser Arbeit war. Hierbei standen vor allem die beiden
Einzelreaktionen im Vordergrund. Die Biaryleinheit findet man z.B. in dem selektiven Kathepsin-K-
Inhibitor Odanacatib (97, Abbildung 89) wieder, der gegen Osteoporose eingesetzt wird. Das
Kathepsin K ist ein Enzym, das den Knochenabbau, insbesondere am Abbau der Proteinanteile in den
Knochen verantwortlich ist.[26]
Abbildung 89: Der Kathepsin-K-Inhibitor Odanacatib (97) [104]
5.2 Stand der Wissenschaft
5.2.1 Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen
In den 1970ern wurden die ersten Reaktionen zur Knüpfung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
publiziert.[105-111] Diese Kohlenstoff-Kohlenstoff-Kupplungen bereicherten in großem Ausmaß die
organische Synthesechemie. Die Katalyse erfolgte über ein Übergangsmetall und Palladium-
katalysierte Kreuzkupplungen nahmen schnell an Bedeutung zu.[112] Im folgenden Kapitel werden
kurz die Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen Suzuki-, Negishi-, Stille- und Heck-Kupplung
und deren allgemeinen Mechanismus vorgestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
103
5.2.1.1 Bekannte Palladium-katalysierte Kupplungsreaktionen
Unter Metall-katalysierten Kupplungsreaktionen versteht man eine metallorganisch katalysierte
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Knüpfung zwischen zwei verschiedenen Molekülen. Bei der Palladium-
katalysierten Kupplung ist das Metall des Katalysators Palladium. Es gibt verschiedene Palladium-
katalysierte Kupplungsreaktionen, die sich in der eingesetzten Organometallverbindung und in den
Edukten unterscheiden.[112] Die in dieser Arbeit betrachtete Suzuki-Kupplung wurde im Jahre 1979
unter SUZUKI entdeckt,[105,106] dessen Arbeit auf diesem Gebiet 2010 mit dem Nobelpreis für Chemie
gewürdigt wurde.[113] Die Suzuki-Kupplung ist eine Palladium-katalysierte Reaktion zur Alkenylierung
bzw. Arylierung von Bor-gebundenden Organylresten.[114] Hierbei werden Organoborverbindungen
mit organischen Elektrophilen, wie Aryl- oder Alkenylhalogeniden und -triflaten, in Anwesenheit
einer Base miteinander verknüpft.[115] Die Suzuki-Kreuzkupplung wird zur Synthese von
Biarylsystemen, wie in dieser Arbeit beschrieben, eingesetzt. Neben dieser Anwendung ist der
stereoselektive Aufbau von konjugierten Dienen und Polyenen von großer Bedeutung und spielt eine
Rolle bei der Synthese der Naturstoffe Dragmacidin F,[116] Michellamin B[117] und Diazonamid A.[118]
Die Suzuki-Kupplung zählt zu einer der am meisten angewendeten und zuverlässigsten Palladium-
katalysierten Kreuzkupplungsreaktionen, was auch daran liegen kann, dass die für die Suzuki-
Kreuzkupplung benötigten Organoborverbindungen leicht zu synthetisieren sind und darüber hinaus
eine hohe Beständigkeit gegenüber Luft und Wasser aufweisen. Es ergeben sich hieraus relativ milde
Reaktionsbedingungen und die entstehenden Nebenprodukte sind ungiftig.[119] Die nächste Reaktion
ist die ebenfalls 2010 mit dem Nobelpreis für Chemie gekrönte Negishi-Kupplung,[113] die 1977 unter
NEGISHI erstmals publiziert wurde. Hierbei werden Arylhalogenide oder –triflate mit Organozink-
verbindungen verknüpft.[107] Große Ähnlichkeit mit der Suzuki-Kupplung weist die Stille-Kupplung auf.
Hierbei handelt es sich um die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Kupplung einer Organozinnverbindung mit
einem Kohlenstoffelektrophil wie einem Alkylhalogenid.[108] Eine weitere bekannte Palladium-
katalysierte Kupplungsreaktion ist die von SONOGASHIRA entwickelte Sonogashira-Kupplung. Bei dieser
Reaktion werden Arylhalogenide mit endständigen Alkinen umgesetzt. Neben dem Palladium-
Katalysator wird ein Kupferhalogenid als weiterer Katalysator eingesetzt.[109,120]
5.2.1.2 Mechanismus der Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen
Die Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen haben einen allgemein gültigen Katalysezyklus der
aus den drei Schritten oxidative Addition, Transmetallierung und reduktive Eliminierung besteht. Bei
der oxidativen Addition handelt es sich um eine Umsetzung des Halogenids 99 mit einem
Palladium(0)-Komplex 98 unter Bildung der Palladium(II)-Spezies 100. Dabei wird der Palladium(0)-
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
104
Komplex 98 in die Kohlenstoff-Halogen-Bindung des Edukts insertiert.[94] Durch die Verwendung von
elektronenreichen Liganden im Palladium-Komplex wird die oxidative Addition begünstigt, da die
Insertion in die RX-Bindung erleichtert wird. Als Substrate eignen sich am besten Moleküle, die eine
schwache R-X-Bindungsenergie aufweisen.[120-124] Der nächste Schritt ist die Transmetallierung.
Voraussetzung hierbei ist die größere Affinität der Metalls M zu dem Liganden X, was auch die
Triebkraft der Reaktion darstellt.[125] Bei der Transmetallierung wird der Rest der
Organometallverbindung 101 auf das Palladium unter Bildung einer Palladium(II)-Spezies 102, die
beide zu verknüpfenden Reste enthält, übertragen. Desweiteren wird die stabile Metallhalogenid-
Verbindung 103 abgespalten.[94] Der letzte Schritt beinhaltet die reduktive Eliminierung zum Produkt
104 unter Regeneration des Katalysators zum Pd(0)-Komplex 98 (Abbildung 90).[94] Zwischen der
Transmetallierung und der reduktiven Eliminierung findet oft noch eine cis-trans-Isomerisierung
statt.[126]
Abbildung 90: Allgemein gültiger Katalysezyklus der Palladium-katalysierten
Kupplungsreaktionen [94,127]
Eine Ausnahme im Reaktionsmechanismus bildet die Heck-Reaktion, die mit dem Nobelpreis für
Chemie 2010 belohnt wurde.[113] Es handelt sich hierbei um die direkte Arylierung bzw. Vinylierung
von Olefinen. Bei dieser Reaktion sind ein Halogenid (meist ein Arylhalogenid) und ein Alken die
Edukte. Bei der Heck-Reaktion fällt der Schritt der Transmetallierung weg, stattdessen erfolgen eine
Olefin-Insertion und eine ß-Eliminierung des Arylpalladium-Komplexes unter Freisetzung des
substituierten Olefins.[110,111]
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
105
5.2.1.3 Suzuki-Kreuzkupplung
Die Suzuki-Kreuzkupplung ist eine Palladium-katalysierte Kreuzkupplung von Organoboran-
verbindungen 103a mit Aryl- oder Alkenylhalogeniden 99 unter Bildung einen C-C-verknüpften
Moleküls 104 (Abbildung 91).[94]
Abbildung 91: Allgemeine Reaktionsgleichung der Suzuki-Kreuzkupplung [94]
Im Folgenden ist der Katalysezyklus speziell für die Suzuki-Kreuzkupplung dargestellt (Abbildung 92).
Abbildung 92: Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung [94]
In dieser Arbeit wurde zuerst der Palladiumkatalysator aus dem Präkatalysator PdCl2 und dem
wasserlöslichen[128,129] Liganden TPPTS (105) gebildet (Abbildung 93).
Abbildung 93: Der wasserlösliche Ligand TPPTS (105) [129]
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
106
Bei der oxidativen Addition erfolgt die Umsetzung des Halogenids 99 mit dem Palladium(0)-Komplex
98 unter Bildung der Palladium(II)-Spezies 100. Bei der Suzuki-Kreuzkupplung findet bei der Trans-
metallierung ein Austausch der Liganden zwischen Palladium und Bor statt. Die in dieser Arbeit
verwendete Organoboranverbindung war Phenylboronsäure 101b und als Halogenid-Komponente
wurden entweder 4‘-Iodacetophenon (106) oder der korrespondierende Alkohol rac-4'-Iodphenyl-
ethan-1-ol (rac-107) eingesetzt. Das Natriumhydrogencarbonat wurde als Base in einem wässrigen
Medium eingesetzt. Die Herausforderung bestand darin, dass das als Edukt eingesetzte Keton 106
genau wie der in situ gebildete Alkohol 107 als Substrate für die Suzuki-Kupplung zur Verfügung
standen. Als Produkte der Suzuki-Kupplung wurden deshalb 4‘-Phenylacetophenon (108) bzw. rac-4´-
Biphenylethan-1-ol (rac-109) erhalten (Abbildung 94).
Abbildung 94: Mögliche Produkte aus der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bzw. rac-4'-
Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)
5.2.2 Enzymatische Reduktion von Ketonen zur Synthese stereoselektiver Alkohole
Für die Reduktion von prochiralen Ketonen zur Synthese chiraler sekundärer Alkohole werden
Alkoholdehydrogenasen eingesetzt (Abbildung 95). Die Reduktionsreaktion, bei der ein
Wasserstoffatom und zwei Elektronen von NADPH auf das Keton übertragen werden, ist
hochenantioselektiv.[1]
Abbildung 95: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen zu sekundären chiralen Alkoholen
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
107
Bei Verwendung der (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir wird der
korrespondierende (R)-Alkohol gebildet.[65] Die Herausforderung bestand darin, dass sowohl das in
situ gebildete Keton 108 als auch das als Edukt eingesetzte Keton 106 während der Tandem-Reaktion
als Substrate für die biokatalytische Reduktion zur Verfügung standen. Das 4‘-Iodacetophenon (106)
konnte mit Hilfe der LK-ADH zum korrespondierenden (R)-Alkohol (R)-107 reduziert werden
(Abbildung 96).
Abbildung 96: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) durch die Verwendung der
(R)-selektiven LK-ADH
Das aus der Suzuki-Kupplung entstehende 4‘-Phenylacetophenon (108) wurde von der LK-ADH zum
korrespondierenden (R)-Alkohol (R)-109 umgesetzt (Abbildung 97).
Abbildung 97: Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (107) durch die Verwendung der
(R)-selektiven LK-ADH
5.3 Ziel der Arbeit
Die Herausforderung bestand hierbei, dass die in der Tandem-Reaktion kombinierten
Einzelreaktionen verschiedene pH-Optima haben. Der pH-Bereich für enzymkatalysierte Reaktionen
liegt für gewöhnlich bei pH 5 bis 8, wobei das Optimum oftmals bei pH 7 liegt.[4] Im Gegensatz dazu
ist die Suzuki-Kreuzkupplung eine basenkatalysierte Reaktion mit einem pH-Optimum im alkalischen
Bereich.[105,106] Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der
enzymatischen Reduktion in Form einer Tandem-Reaktion können chirale Alkohole wie z.B. (R)-4´-
Biphenylethan-1-ol ((R)-109) aus einem Keton wie z.B. 4‘-Iodacetophenon (106) hergestellt werden.
Das Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) konnte sowohl biokatalytisch mit einer (R)-selektiven ADH zum
(R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) reduziert, als auch metallkatalytisch durch die Suzuki-Kupplung
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
108
zu 4‘-Phenylacetophenon (108) umgesetzt werden. Mit Hilfe einer (R)-selektiven ADH konnte das
Keton 108 dann biokatalytisch zu (R)-4´-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) reduziert werden, während der
chirale Alkohol (R)-107 durch die Suzuki-Kupplung zum chiralen Endprodukt (R)-4´-Biphenylethan-1-
ol ((R)-109) umgesetzt werden konnte (Abbildung 98).
Abbildung 98: Tandem-Reaktion durch Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer
Reduktion
Chirale Alkohole sind wichtige Bausteine für die Pharmaindustrie und daher von großer
Bedeutung.[124]Auch bei Naturstoffsynthesen findet die Suzuki-Kreuzkupplung Anwendung, z.B. bei
dem hocheffizienten Aufbau des Gerüsts von Palytoxin, das KISHI et al. 1989 vorgestellt haben.[125,130]
Dieses Gift kann aus der Weichkoralle der Gattung Palythoa gewonnen werden.[130] In dieser Arbeit
wurde der Einfluss der Proteinmenge auf beide Reaktionen und die pH-Verläufe untersucht, um ein
besseres Verständnis für den Ablauf der Reaktion zu bekommen.
5.4 Ergebnisse und Diskussion
5.4.1 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von 4´-Iodacetophenon zur Synthese von 4´-
Phenylacetophenon
Sowohl das als Edukt eingesetzte Keton 106 wie auch der während der Tandem-Reaktion in situ
gebildete Alkohol 107 standen als Reaktionspartner für die Phenylboronsäure 101b zur Verfügung.
Als Produkte der Suzuki-Kupplung wurden für das Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) dementsprechend
4‘-Phenylacetophenon (108) (Abbildung 99) bzw. für das in situ gebildete Edukt rac-4'-Iodphenyl-
ethan-1-ol (rac-107) wurde das korrespondierende rac-4´-Biphenylethan-1-ol (rac-109) erhalten. Auf
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
109
Grund dessen wurde die Suzuki-Kupplung für beide Edukte unter verschiedenen Gesichtspunkten
untersucht. Der Katalysator für die Suzuki-Kreuzkupplung wurde aus PdCl2 und dem wasserlöslichen
Liganden TPPTS 105 generiert.
Abbildung 99: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)
5.4.1.1 Benchmark
Der Benchmark-Versuch [11] (Abbildung 100) war eine Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon
(106) mit Phenylboronsäure (101b) unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108). Die Reaktion
wurde in einem geschlossenen 10 ml Rundkolben über 24 Stunden bei Raumtemperatur und
400 rpm Rührgeschwindigkeit durchgeführt. Das Reaktionsmedium bestand aus wässriger Natrium-
hydrogencarbonat-Lösung und Isopropanol in einem Mischungsverhältnis von 1:1. Es wurden 4 mol%
PdCl2 und 5 mol% TPPTS (105) als Katalysator eingesetzt. Hierbei wurde vollständiger Umsatz
erreicht.
Abbildung 100: Benchmark der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit
Phenylboronsäure (101b)
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
110
5.4.1.2 Einfluss der Proteinkonzentration
Das Ziel war die Tandemreaktion, d.h. die Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und
biokatalytischer Reduktion. Durch die Verwendung einer Alkoholdehydrogenase wurde eine Menge
an Protein in die Reaktion eingebracht. Es war daher notwendig, zu klären, ob die zugesetzte
Proteinmenge einen Einfluss auf die Suzuki-Kupplung des Ketons 106 mit Phenylboronsäure 101b
hat. Die Proteinkonzentration wurde durch die Zugabe von HSA auf 0 bis 10 g/l eingestellt. Bei
steigender Proteinkonzentration nahm der vollständige Umsatz ohne Protein bis auf 50% bei einer
Zugabe von 10 g/l Proteinkonzentration ab. Bei Zugabe der Konzentration von 1.0 g/l Protein wurde
noch vollständiger Umsatz erzielt. Das Ziel war es, in der Tandemreaktion die Proteinmenge gering zu
halten, um den größtmöglichen Umsatz zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 31 dargestellt.
Tabelle 31: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon
(106)
Eintraga HSA [g/l] Umsatz [%]
1 0 >95
2 1 >95
3 5 82
4 10 50 asiehe AAV 19.
Anhand der untenstehenden Grafik (Abbildung 101) konnte verdeutlicht werden, wie sehr die
Proteinzugabe die Suzuki-Reaktion inhibiert. Der optimale Proteinkonzentration für die Tandem-
Reaktion lag in dem Bereich zwischen 1.0 g/l und 2.5 g/l und die Menge an Alkoholdehydrogenase
wurde dementsprechend in der Tandem-Reaktion angepasst.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
111
Abbildung 101: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von
4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)
5.4.1.3 Einfluss der Reaktionszeit
4‘-Iodacetophenon (106) war ein sehr gutes Substrat für die Suzuki-Kupplung, da bereits nach
24 Stunden vollständiger Umsatz erzielt wurde. Es wurde daraufhin getestet, wie schnell diese
Reaktion beendet ist und deshalb wurde die Reaktion bei einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden
abgebrochen und aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 dargestellt.
Tabelle 32: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)
Eintraga Reaktionszeit [h] Umsatz [%]
1 5.5 89
2 24.0 >95 asiehe AAV 19.
Hierbei wurde nach einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden ein sehr guter Umsatz von 89% erzielt, was
beweist, dass die Reaktion schnell abläuft und die Vermutung, dass 4‘-Iodacetophenon (106) ein sehr
gutes Substrat ist, wurde bestätigt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
112
5.4.1.4 pH-Verlauf der Reaktion
Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Reaktionszeit wurden parallel die pH-Verläufe der
Reaktionen, deren Ergebnisse in Eintrag 1 und 2 der Tabelle 32 zu finden sind, mit Hilfe eines pH-
Meters detektiert (Abbildung 102).
Abbildung 102: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)
Hierbei wurde zuerst ein deutlicher Abfall des pH-Werts von 8.54 auf 8.18 bei einer Reaktionszeit von
24 Stunden bzw. von 8.56 auf 8.24 bei 5.5 Stunden Reaktionszeit verzeichnet. Anschließend stieg der
pH-Wert kontinuierlich auf 8.77 nach 5.5 Stunden und auf 9.94 nach 24 Stunden an. Der Anstieg des
pH-Werts nach Ende der Reaktion ist durch die Reaktion von NaHCO3 zu NaOH und CO2 zu
begründen. Die Ergebnisse die pH-Verläufe der Reaktionen von Tabelle 32, Eintrag 1 und 2 sind in
Tabelle 33 dargestellt. Hierbei wurde bei einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden ein Umsatz von 89%
zum 4‘-Phenylacetophenon (108) erhalten und bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden konnte ein
vollständiger Umsatz erzielt werden.
Tabelle 33: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bei verschiedenen
Reaktionszeiten
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
113
Eintraga Zeit pH-Wert bei 24 h
Reaktionszeit pH-Wert bei 5.5 h
Reaktionszeit
1 IPA + NaHCO3 + 106 9.48 9.39
2 + 101b 9.30 9.25
3 mit Katalysator 0 h 8.54 8.56
4 2.0 h 8.18 8.24
5 4.0 h 8.31 8.48
6 5.5 h 8.79 8.74
7 7.0 h 8.80
8 24.0 h 9.94 asiehe AAV 19.
5.4.2 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol zur Synthese
von rac-4´-Biphenylethan-1-ol
Wie in dem Kapitel 5.2.1.3 bereits angedeutet, stand in der Tandem-Reaktion neben dem
4‘-Iodacetophenon (106) als Edukt auch noch das bereits reduzierte rac-4`-Iodphenylethan-1-ol
(rac-107) als Kupplungspartner zur Verfügung. Bei der Verwendung des racemischen Alkohols
rac-107 als Edukt wurde in der entsprechenden Suzuki-Reaktion rac-4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109)
synthetisiert (Abbildung 103).
Abbildung 103: Suzuki-Kreuzkupplung von rac- 4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit
Phenylboronsäure (101b)
5.4.2.1 Natriumborhydrid-Reduktion zur Synthese von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol
Am Anfang wurde der racemische Alkohol rac-107 durch eine Reduktion des kommerziell
erwerblichen 4‘-Iodacetophenons (106) mit Natriumborhydrid (110) in Methanol hergestellt. Hierbei
wurde vollständiger Umsatz innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur erzielt (Abbildung 104).
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
114
Abbildung 104: Synthese des racemischen Alkohols rac-107 durch Reduktion des Ketons 106 mit
Natriumborhydrid (110)
5.4.2.2 Einfluss der Reaktionszeit
Das rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) war gegenüber dem Keton 106 das nicht favorisierte Edukt
für die Suzuki-Kupplung. Dementsprechend wurden nach 48 Stunden Reaktionszeit bei
Raumtemperatur maximal 80% und nach 24 Stunden maximal 75% Umsatz zu dem racemischen
Alkohol 4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) erreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 34 dargestellt.
Tabelle 34: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107)
asiehe AAV 21, b
Wiederholungsversuch zu 1a zur Validierung, cWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
Eintraga Reaktionszeit [h] Umsatz [%]
1a 24 75
1bb 24 69
2a 48 80
2bc 48 71
2cb 48 78
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
115
5.4.2.3 Einfluss der Proteinmenge
Der Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung von rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit
Phenylboronsäure (101b) zu dem racemischen Alkohol rac-109 war sehr deutlich. Durch die
steigende Proteinmenge in Form von HSA nahm der Umsatz von 80% ohne Protein bis auf nur noch
11% bei einer Konzentration von 10 g/l Protein ab. Der Rückgang des Umsatzes war mit maximal 75%
bei 1.0 g/l HSA-Konzentration sehr gering, aber bei einer Konzentration von 5 g/l mit einem Umsatz
von 51% zeichnete sich bereits der negative Einfluss auf die Reaktion ab. Auch hier gilt es, die
Proteinmenge in der Tandemreaktion gering zu halten, um den größtmöglichen Umsatz zu erzielen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 35 dargestellt.
Tabelle 35: Einfluss der eingesetzten Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-
Iodphenylethanol (rac-107)
asiehe AAV 21, b
Wiederholungsversuche zu 1a zur Validierung, cWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung,
dWiederholungsversuch zu 3a zur Validierung
Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung 105 graphisch dargestellt.
Eintraga HSA [g/l] Umsatz [%]
1a 0 80
1bb 0 71
1cb 0 78
2a 1 75
2bc 1 71
3a 5 51
3bd 5 51
4 10 11
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
116
Abbildung 105: Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)
5.4.3 Enzymatische Reduktion von 4´-Iodacetophenon unter Verwendung einer
Alkoholdehydrogenase
Die enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) zu (R)-4‘-Iodphenylethanol ((R)-107)
erfolgte durch Verwendung der (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir. Durch
den Einsatz von Isopropanol (IPA, 30) im Reaktionsmedium konnte hier auf eine substratgekoppelte
Cofaktorregenerierung zurückgegriffen werden. Der anfänglich eingesetzte Cofaktor NADP+ wurde
durch die Oxidation des Alkohols 30 zu Aceton (31) durch die LK-ADH in das für die Reduktion des
Ketons 106 benötigte NADPH umgewandelt. Bei der Reduktion zum Alkohol (R)-107 wurde der
reduzierte Cofaktor NADPH wieder in seine oxidierte Form NADP+ umgewandelt und somit konnte
ein weiterer Katalysezyklus von Neuem beginnen (Abbildung 106). In diesem Kapitel wurde die
Abhängigkeit von der eingesetzten Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l bzw. 2.5 g/l festgesetzt
wurde, auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) und der pH-Verlauf während
dieser Reaktion untersucht. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralcel® OJ-H,
Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-
Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule ist
in Abbildung 107 dargestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
117
Abbildung 106: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Hilfe der LK-ADH
Abbildung 107: Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol
(rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
118
5.4.3.1 Einfluss der Proteinkonzentration
Es wurde der Einfluss der Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l und 2.5 g/l festgesetzt wurde, auf die
biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) untersucht. Hierbei wurden vollständige
Umsätze für Proteinkonzentrationen von 1.0 g/l und 2.5 g/l (aus der LK-ADH) in 48 Stunden bei
Raumtemperatur erzielt (Tabelle 36).
Tabelle 36: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-
Iodacetophenon (106)
Eintraga Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]
1a 1.0 >99 >95
1bb 1.0 >99 >95
2a 2.5 >99 >95
2bc 2.5 >99 95
asiehe AAV 22,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
cWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung
5.4.3.2 pH-Verlauf der Reaktion
Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Proteinkonzentration wurden parallel die pH-Verläufe
der Versuche 1a und 2a aus Tabelle 36 der Reaktionen mit Hilfe eines pH-Meters detektiert. Die
graphische Auftragung ist in Abbildung 108 und die Daten sind in Tabelle 37 dargestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
119
Abbildung 108: pH-Verlauf der enzymatischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)
Der pH-Wert wurde durch die Zugabe des Enzyms erwartungsgemäß niedriger. Der Abfall des pH-
Werts von 9.49 auf 8.74 war aufgrund der größeren Verdünnung der Reaktionslösung für eine
Proteinkonzentration von 2.5 g/l Protein größer als der Abfall des pH-Werts von 9.41 auf 9.06 für
eine Konzentration von 1.0 g/l. Durch Zugabe von NADP+ sank der pH-Wert nochmal. Anschließend
stieg der pH-Wert kontinuierlich auf im Mittel 10.16 an. Die pH-Verläufe der Versuche 1a und 2a aus
Tabelle 36 sind in Tabelle 37 dargestellt. Bei beiden Messungen wurde das Produkt 4‘-Iod-
phenylethan-1-ol (rac-107) mit einem Umsatz von über 95% und einem ee-Wert von über 99%
erhalten.
Tabelle 37: pH-Verläufe der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei
unterschiedlichen Mengen von LK-ADH
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
120
Eintraga Zeit pH-Wert bei 1.0 g/l
Proteinkonzentration pH-Wert bei 2.5 g/l
Proteinkonzentration
1 IPA + NaHCO3 + 106 9.41 9.49
2 mit Enzym 9.06 8.74
3 mit NADP+ 8.66 8.40
4 2.0 h 9.11 8.80
5 4.0 h 9.44 9.19
6 4.75 h 9.52 9.35
7 21.0 h 10.05 9.77
8 24.0 h 10.07 9.81
9 26.0 h 10.09 9.86
10 45.0 h 10.18 10.13
11 48.0 h 10.17 10.14
asiehe AAV 22
5.4.4 Enzymatische Reduktion von 4´-Phenylacetophenon unter Verwendung einer
Alkoholdehydrogenase
Bei der biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (108) wurde die Abhängigkeit von der
eingesetzten Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l bzw. 2.5 g/l festgesetzt wurde, untersucht. Hierbei
wurde ein Umsatz von durchschnittlich 53% bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l und von
durchschnittlich 66% bei einer Konzentration von 2.5 g/l in 48 Stunden erzielt. Es war klar erkennbar,
dass das Keton 108 das schlechtere Edukt in der biokatalytischen Reduktion war, als das bereits
getestete Keton 106, mit dem bei gleicher Reaktionszeit Umsätze über 95% für 1.0 g/l und 2.5 g/l
Proteinkonzentration erzielt wurden. Die Erhöhung der Proteinkonzentration von 1.0 g/l auf 2.5 g/l
hatte einen positiven Einfluss auf die Reaktion, so dass im Durchschnitt 13% mehr Umsatz bei
höherer Proteinmenge erreicht wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 38 dargestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
121
Tabelle 38: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von
4‘-Phenylacetophenon (108)
Eintraga Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]
1a 1.0 >99 50
1bb 1.0 >99 56
2a 2.5 >99 64
2bc 2.5 >99 67
asiehe AAV 22,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
cWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung
Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v),
0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen
4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ist in der folgenden Abbildung 109
dargestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
122
Abbildung 109: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm von racemischen 4‘-Biphenylethan-1-ol
(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule
5.4.5 Tandemreaktionen der Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen
Reduktion
Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen
Reduktion in Form einer Tandem-Reaktion können chirale Alkohole hergestellt werden
(Abbildung 110). Chirale Alkohole sind wichtige Bausteine für die Pharmaindustrie und daher von
großer Bedeutung.[26] Das Edukt 4'-Iodacetophenon (106) wurde sowohl bei der Suzuki-Kupplung als
bei der Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) am schnellsten
umgesetzt. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v),
0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen
4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109) mit der Chiralpak® IB-Säule ist in Abbildung 111 dargestellt.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
123
Abbildung 110: Tandem-Reaktion durch Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer
Reduktion
Abbildung 111: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm von racemischen 4‘-Biphenylethan-1-ol
(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
124
5.4.5.1 Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration
In der Tandem-Reaktion mit dem Rohextrakt der LK-ADH wurde der gewünschte Biphenylalkohol
(R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) sowohl bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l als auch für
eine Konzentration von 2.5 g/l mit einem Umsatz von 24% erhalten. Der Gesamtumsatz lag bei
beiden Reaktionen über 95%. Bei Einsatz der geringeren Proteinmenge fiel auf, dass das bei der
Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) entstehende 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem
Umsatz von 64% gebildet wurde und das bei der biokatalytischen Reduktion des Ketons 106
entstehende (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) nur zu 12% erhalten wurde. Die Suzuki-Kupplung
war bei geringeren Proteinkonzentrationen die klar schnellere Reaktion. Bei Einsatz einer Protein-
konzentration von 2.5 g/l wurde das bei der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) Keton 108
mit 6% Umsatz erhalten, während bei der biokatalytischen Reduktion des Ketons 106 ein Umsatz von
52% zu verzeichnen war. Die biokatalytische Reduktion war bei höheren Proteinkonzentrationen die
klar schnellere Reaktion, allerdings bildeten sich bei der höheren Proteinkonzentration auch verstärkt
Nebenprodukte (18%). Die Strukturen der Nebenprodukte sind nicht bekannt und der Einfluss dieser
Verbindungen muss noch besser untersucht werden, was aber nicht Gegenstand dieser Promotion
war. Alle Ergebnisse sind in Tabelle 39 dargestellt.
Tabelle 39: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
125
Eintraga Protein-
konzentration [g/l]
Umsatz zu 108
[%]
Umsatz zu (R)-107
[%]
Umsatz zu (R)-109
[%] ee [%]
Gesamtumsatz [%]
1 1.0 42 23 35 >99 >95
2 2.5 6 52 24 >99 >95
asiehe AAV 23.
5.4.5.2 pH-Verlauf der Reaktionen
Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Proteinmenge wurden parallel die pH-Verläufe der
Versuche 1 und 2 aus Tabelle 39 mit Hilfe eines pH-Meters detektiert. Die graphische Auftragung ist
in Abbildung 112 dargestellt.
Abbildung 112: pH-Verläufe der Tandem-Reaktion bei unterschiedlichen Mengen an LK-ADH
Der pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Konzentration von 1.0 g/l mit einer Erniedrigung des
pH-Werts von 8.68 auf 8.46 mit anschließendem kontinuierlichen Anstieg auf 9.38 nach 48 Stunden
glich dem Verlauf für die Suzuki-Kupplung. Bei einer Konzentration von 2.5 g/l verhielt sich der pH-
Verlauf erst durch einen Anstieg von pH 8.23 auf 8.84 wie bei der biokatalytischen Reduktion, aber
anschließend war auch hier eine Erniedrigung des pH-Werts von 8.84 auf 8.64 zu verzeichnen, was
charakteristisch für die Suzuki-Kupplung war. Durch die höhere Menge von Enzym wurde die
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
126
biokatalytische Reduktion favorisiert. Das Ergebnis für den pH-Verlauf der Tandem-Reaktionen bei
einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l (vgl. Eintrag 1, Tabelle 39) ist in Tabelle 40 dargestellt. Es
wurde hierbei ein Umsatz von 42% zu 4‘-Phenylacetophenon (108), ein Umsatz von 23% mit einem
ee-Wert von über 99% zum Alkohol (R)-107) und ein Umsatz von 35% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-
ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von über 95% erhalten.
Tabelle 40: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l
Eintraga Zeitablauf pH-Wert
1 nach Zugabe von IPA + NaHCO3 + 106 9.34
2 nach Zugabe des Katalysators 9.00
3 nach Zugabe des Enzyms 8.80
4 nach Zugabe von NADP+ 8.68
5 2.0 h 8.46
6 3.5 h 8.69
7 5.0 h 8.74
8 24.0 h 8.39
9 25.75 h 8.83
10 28.0 h 9.04
11 30.0 h 9.15
12 48.0 h 9.38 asiehe AAV 23
Das Ergebnis für den pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l (vgl.
Eintrag 2, Tabelle 39) ist in Tabelle 41 dargestellt. Es wurde hierbei ein Umsatz von 6% zu
4‘-Phenylacetophenon (108), ein Umsatz von 52% mit einem ee-Wert von über 99% zum Alkohol
(R)-107 und ein Umsatz von 24% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von
über 95% erhalten.
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
127
Tabelle 41: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l
Eintraga Zeitablauf pH-Wert
1 nach Zugabe von IPA + NaHCO3 + 106 9.42
2 nach Zugabe des Katalysators 8.50
3 nach Zugabe des Enzyms 8.39
4 nach Zugabe von NADP+ 8.23
5 2.0 h 8.84
6 4.0 h 8.64
7 6.0 h 8.61
8 22.0 h 8.57
9 24.0 h 8.82
10 28.0 h 8.98
11 46.0 h 9.15
12 48.0 h 9.16 asiehe AAV 23.
5.4.5.3 Einfluss des einsetzten Cofaktors
Die Abhängigkeit von der Menge des eingesetzten Cofaktors auf die Tandem-Reaktion wurde
untersucht. Bei einer Proteinkonzentration 1.0 g/l fand keine biokatalytische Reduktion in
Abwesenheit des Cofaktors statt: es wurde mit über 95% Umsatz nur das Kupplungsprodukt 4‘-
Phenylacetophenon (108) erhalten. Bei Zusatz von 0.06 Äquivalenten NADP+ fand stattdessen die
biokatalytische Reduktion mit einem Umsatz von 23% zu (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) und
von 35% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von über 95% statt. Die
vorhandene Menge Cofaktor bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l reichte nicht aus, um die
enzymatische Reduktion zu katalysieren, so dass der Cofaktor auf jeden Fall eingesetzt werden
musste. Anders verhielt es sich bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l. Hier fand die
enzymatische Reduktion in Abwesenheit eines zugesetzten Cofaktors mit einem Umsatz von 12% zu
dem Alkohol (R)-107 und von 24% zu dem Biphenylalkohol (R)-109 bei einem Gesamtumsatz von 77%
statt. Die Menge an Cofaktor bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l reichte aus, um eine
enzymatische Reduktion zu katalysieren, doch mussten Einbußen im Gesamtumsatz in Kauf
genommen werden. In Anwesenheit von 0.06 Äquivalenten NADP+ bei einer Proteinkonzentration
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
128
von 2.5 g/l lag der Gesamtumsatz bei über 95% mit 52% Umsatz zum Alkohol (R)-107 und mit 24%
zum Biphenylalkohol (R)-109 (Tabelle 42).
Tabelle 42: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion
Eintraga NADP+
[Äq.]
Protein-konzentration
[g/l]
Umsatz zu 108
[%]
Umsatz zu (R)-107
[%]
Umsatz zu (R)-109 [%]
Gesamtumsatz [%]
1 0 1.0 >95 n.d. n.d. >95
2 0.06 1.0 42 23 35 >95
3 0 2.5 64 12 24 77
4 0.06 2.5 6 52 24 >95
asiehe AAV 23
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
129
5.6 Zusammenfassung
5.6.1. Suzuki-Kupplung
5.6.1.1 Benchmark-Versuch
Es wurde ein vollständiger Umsatz der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-
boronsäure (101b) zu 4‘-Phenylacetophenon (108) in einer Reaktionszeit von 24 Stunden zu erzielt
(Abbildung 113). Diese Ergebnisse deckten sich mit den von BORCHERT erzielten Ergebnissen.[11,131] Die
Reaktion lief sehr schnell ab und nach einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden wurden bereits 89%
Umsatz erhalten.
Abbildung 113: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)
unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von über 95%
Bei der Suzuki-Kupplung des racemischen Alkohols rac-107 mit Boronsäure 101b zu dem racemischen
Biphenylalkohol rac-109 wurde ein Maximalumsatz von 80% bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden
erzielt. Dies bestätigte die Ergebnisse von BORCHERT [131] und bewies, dass das Keton 106 ein besseres
Edukt für die Suzuki-Kupplung als rac-4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-109) war.
5.6.1.2 Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung
Desweiteren wurde auf diese Reaktion ein negativer Einfluss durch die Erhöhung der zugesetzten
Proteinkonzentration in Form von HSA beobachtet. Bei Einsatz des Ketons 106 als Substrat nahm der
vollständig erzielte Umsatz ohne Protein bei steigender Proteinmenge bis auf 50% bei einer
Proteinkonzentration von 10.0 g/l ab. Hierbei wurde bei einer Konzentration von 1.0 g/l Protein noch
vollständiger Umsatz erzielt. Auch bei Verwendung des racemischen Alkohols rac-107 als Edukt
wurde auf diese Reaktion ein negativer Einfluss durch die Erhöhung der Proteinkonzentration in
Form von HSA beobachtet. Bei steigender Konzentration des Proteins nahm der Umsatz ohne Protein
von 80% bis auf 11% bei einer Produktkonzentration von 10.0 g/l ab (Abbildung 114).
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
130
Abbildung 114: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-
Iodacetophenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)
5.6.2 Enzymatische Reduktion
Bei der enzymatischen Reduktion des Ketons 106 mit einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus
kefir und Substrat-gekoppelter in situ-Cofaktorregenerierung durch Verwendung von Isopropanol
(30) im Reaktionsmedium wurde ein Umsatz von 97% zum enantiomerenreinen Alkohol (R)-107 in
einer Reaktionszeit von 48 Stunden bei Raumtemperatur erhalten. Hierbei wurde eine Protein-
konzentration von 1.0 g/l in Form der LK-ADH und 0.06 Äquivalente des Cofaktors NADP+ eingesetzt.
Bei der enzymatischen Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einer Alkoholdehydrogenase
aus Lactobacillus kefir wurde mit 67% der beste Umsatz zum enantiomerenreinen Biphenylalkohol
(R)-109 erzielt. Die Reaktionszeit betrug 48 Stunden und die Reduktion wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Es wurde hierbei eine Proteinkonzentration von 2.5 g/l in Form der LK-ADH und
0.06 Äquivalente des Cofaktors NADP+ eingesetzt.
5.6.3. Tandem-Reaktion
Das beste Ergebnis in Bezug auf den Erhalt des (R)-Biarylalkohols (R)-109 wurde mit dem Keton 106
als Substrat und einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l in Form der LK-ADH über einen Reaktions-
zeitraum von 48 Stunden mit einer Substratkonzentration von 40 mM erreicht. Die biokatalytische
Reduktion fand mit einem Umsatz von 23% zu dem (R)-Alkohol (R)-107 und von 35% zu dem
(R)-Biphenylalkohol (R)-109 bei einem Gesamtumsatz von über 95% statt. Bei beiden Reduktionen
wurde ein ee-Wert von über 99% erreicht. Die Suzuki-Kreuzkupplung lieferte mit einem Umsatz von
5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen
131
42% das Keton 108 und mit 35% das gewünschte (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem
Gesamtumsatz von über 95% (Abbildung 115).
Abbildung 115: Tandem-Reaktion mit 4‘-Iodacetophenon (106) als Substrat zur Herstellung des
gewünschten (R)-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109)
6. Zusammenfassung
132
6. Zusammenfassung
In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, eine Reihe von „Proof of Concepts“ für Eintopfsynthesen unter
Einsatz von Biokatalysatoren in wässrigem Medium zu erbringen. Die untersuchten Syntheseprozesse
umfassten neuartige biokatalytische Verfahren zur Hydroxylierung von kurzkettigen n-Alkanen
insbesondere vom Flüssiggas n-Butan (65), zur Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen
sowie von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton (53) und zur Kombination einer metallkatalysierten
Reaktion am Beispiel der Suzuki-Kreuzkupplung mit einer biokatalytischen Reduktion. Die Ergebnisse
dieser Arbeit sind in diesem Kapitel zusammengefasst.
6.1 Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen zur Synthese von Alkoholen durch
Einsatz einer P450-Monooxygenase
Hierbei stand die Etablierung eines Verfahrens im wässrigen Medium zur biokatalytischen
Hydroxylierung von n-Alkanen wie n-Oktan (64) und n-Butan (65) mit einer P450-Monooxygenase im
Vordergrund (Abbildung 116). Von besonderer Bedeutung war die biokatalytische Hydroxylierung
des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35), einer Bulkchemikalie.
Abbildung 116: Biokatalytische Hydroxylierung der n-Alkane 64 und 65 zu den korrespondierenden
Alkoholen
Bei der Hydroxylierung von n-Alkanen wird unter Verbrauch von NADPH und Einsatz einer
P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium der korrespondierende Alkohol gebildet. Eine in situ-
Cofaktorregenerierung durch Einsatz von D-Glucose und Glucosedehydrogenase (GDH) reduziert das
bei der Hydroxylierung entstehende NADP+ wieder zum benötigten NADPH. Einleitende Versuche zur
Hydroxylierung von n-Alkanen wurden mit dem Substrat 64 durchgeführt, für das durch den Einsatz
6. Zusammenfassung
133
F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3, einer Substratkonzentration von 20 mM und oben
beschriebener in situ-Cofaktorregenerierung in Phosphatpuffer pH 7.0 eine Produktbildung von
0.47 g/l erreicht wurde (Abbildung 117).
Abbildung 117: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Die biokatalytische Hydroxylierung des bei Raumtemperatur gasförmigen n-Butans (65) zu
2-Butanol (35) mit einer P450-Monooxygenase und dem in situ-Cofaktorregenerierungssystem mit
einer GDH wurde im Hinblick auf den Einfluss der Reaktionstemperatur und der eingesetzten
Mutante der P450-Monooxygenase untersucht. Aufbauend auf diesem Ergebnis für das Substrat 64
wurde für das Substrat 65 mit dem gleichen System der Cofaktorregenerierung unter Einsatz der
19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 und einer Reaktionstemperatur von 0°C für die
ersten 8 Stunden sowie anschließendem langsamen Erwärmen auf Raumtemperatur eine Umsetzung
zu dem Alkohol 35 mit einer Produktbildung von 0.16 g/l erreicht (Abbildung 118).
Abbildung 118: Biokatalytische Hydroxylierung des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35)
6. Zusammenfassung
134
6.2 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon
durch die Kombination einer P450-Monooxygenase mit einer
Alkoholdehydrogenase
Das Ziel war die biokatalytische Direktoxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen mit
Luftsauerstoff im wässrigen Medium in Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Im ersten Schritt
wurde das Modellsubstrat Cyclooktan (73) unter Oxidation des Cofaktors NADPH zu NADP+ durch
eine P450-Monooxygenase zum Cyclooktanol (74) hydroxyliert. In der zweiten Stufe der Reaktion
wurde der cyclische Alkohol 74 mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase zum Cyclooktanon (75) unter
Reduktion des zuvor bei der Hydroxylierung gebildeten NADP+ zu NADPH oxidiert. Als
umweltfreundliches Oxidationsmittel fungierte molekularer Sauerstoff in Form von Luft. Zudem
ermöglichte dieses Konzept den Verzicht auf den Zusatz eines Cosubstrats (Abbildung 119).
Abbildung 119: Biokatalytische Doppeloxidation des Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75
Gerade im Hinblick auf die festgestellte Flüchtigkeit der Cycloalkane war die Entwicklung einer
aussagekräftigen Bestimmungsmethode zur Erfassung des Umsatzes von hoher Priorität. In dieser
Arbeit konnte eine valide Analytik zur Lösung dieser Herausforderung erfolgreich etabliert werden.
Die biokatalytische Doppeloxidation des Modellsubstrats Cyclooktan (73) zur Synthese von
Cyclooktanon (75) wurde auf die Abhängigkeit von einem zusätzlichen Additiv, von der
Reaktionstemperatur, von der Reaktionszeit, von der Substratkonzentration und von der
eingesetzten P450-Monooxygenase untersucht. Die Einführung von Isopropanol (30) als Additiv und
die damit verbundene Umstellung auf NADP+ als Cofaktor führte zu einer deutlichen Steigerung der
Produktbildung von 0.090 bis 0.140 g/l auf 0.323 bis 0.353 g/l. Durch das Herabsetzen der Reaktions-
temperatur auf 8°C für 8 Stunden und anschließende Erwärmung auf Raumtemperatur während der
verbleibenden Stunden konnte kein Vorteil beobachtet werden, ebenso wenig wie bei der Erhöhung
der Reaktionszeit von 24 Stunden auf 48 Stunden. Als geeignete Mutante erwies sich die 19A12-
Mutante der P450-Monooxygenase BM-3, mit der eine Steigerung der Produktbildung auf 0.633 bis
0.685 g/l erzielt wurde. Eine nochmalige deutliche Erhöhung der Produktbildung wurde durch
Erhöhung der Substratkonzentration von 25 mM auf 100 mM durch eine Verringerung des
6. Zusammenfassung
135
Reaktionsvolumens erreicht. Mit dem Einsatz des Alkohols 30 als Additiv, Raumtemperatur als
Reaktionstemperatur, 24 Stunden als Reaktionszeit, Einsatz der 19A12-Mutante der P450-
Monooxygenase BM-3 und eine Substratkonzentration von 100 mM in pH 7.0 Phosphatpuffer wurde
mit einer Produktbildung von 0.80 g/l das beste Ergebnis erzielt (Abbildung 120).
Abbildung 120: Optimierte biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon
(75) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung von 0.80 g/l
6.3 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von
εεεε-Caprolacton durch Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einer Baeyer-
Villiger-Monooxygenase
Das Ziel der Arbeit war die direkte biokatalytische Oxidation von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton
(53) mit Luftsauerstoff im Reaktionsmedium Wasser in Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Das
Konzept dieser biokatalytischen Doppeloxidation beruht auf der Kombination einer
Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase. Im ersten Schritt wurde das
Cycloalkanol 16 von einer Alkoholdehydrogenase durch Reduktion des Cofaktors NADP+ zu NADPH
zum Cyclohexanon (41) oxidiert. Der zweite Schritt war eine Baeyer-Villiger-Oxidation, bei der das
Cycloalkanon 41 zu ε-Caprolacton (53) unter Oxidation des vorher entstandenen NADPH zu NADP+
oxidiert wird. Außer molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel wurde durch dieses Konzept kein
Zusatz eines Cosubstrats erforderlich (Abbildung 121).
6. Zusammenfassung
136
Abbildung 121: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) unter Synthese von
ε-Caprolacton (53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium
Im Rahmen dieser Doktorarbeit gelang es, eine biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 zur
Synthese des Lactons 53 in einer Eintopfreaktion in wässrigem Medium durchzuführen. Es wurde
hierbei die Abhängigkeit der Reaktion von der eingesetzten Konzentration an Cyclohexanol (16)
untersucht, wobei der Bereich von 20 mM bis 100 mM Substratkonzentration im Fokus lag. Hierbei
wurde bei einer Konzentration von 40 mM Cyclohexanol (16) mit einem Umsatz von 97% das beste
Ergebnis erzielt (Abbildung 122).
Abbildung 122: „Proof of Concept“ der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu
ε-Caprolacton (53) (optimiertes Verfahren)
Es konnte im Rahmen der Prozessentwicklung ein Zusammenhang zwischen der eingesetzten
Konzentration an Cyclohexanol (16) und dem Umsatz festgestellt werden. Bis zu einer Konzentration
von 60 mM des Alkohols 16 wurde mit 94% ein sehr guter Umsatz verzeichnet, der dann sukzessive
bei einer Konzentration von 100 mM auf 24% abnahm. Diese Abhängigkeit wurde in Abbildung 123
graphisch dargestellt.
6. Zusammenfassung
137
Abbildung 123: Einfluss der Konzentration des eingesetzten Cyclohexanols (16) auf den Umsatz
Die Gründe für den Rückgang des Umsatzes bei erhöhter Konzentration des Alkohols 16 lagen
insbesondere in der deutlichen Inhibierung und dem deutlichen Stabilitätsverlust der Baeyer-Villiger-
Monooxygenase durch höhere Mengen des Zielprodukts ε-Caprolacton (53). Für die zukünftigen
Arbeiten zur Prozessoptimierung ist die Identifizierung von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen, die
weniger oder gar nicht vom Zielprodukt inhibiert oder deaktiviert werden, von großer Bedeutung.
Desweiteren muss nach geeigneten Methoden zur Entfernung des Zielprodukts aus dem
Reaktionsgemisch während der Reaktion (in situ-product removal) geforscht werden, damit die
effektive Konzentration gering gehalten wird.
6.4 Kombination einer metallkatalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer
enzymatischen Reduktion zur Synthese eines Biarylalkohols aus 4‘-Iodacetophenon
Bei der Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer biokatalytischen
Reduktion durch Einsatz einer Alkoholdehydrogenase war das Ziel, den Ablauf dieser Tandem-
reaktion zu verstehen, bei der 4‘-Iodacetophenon (106) als Edukt verwendet wurde (Abbildung 124).
Hierbei wurden beide Reaktionen separat voneinander untersucht, wobei der Fokus vor allem auf
der Abhängigkeit der Suzuki-Reaktion von der eingebrachten Proteinmenge im Laufe der
Tandemreaktion lag.
6. Zusammenfassung
138
Abbildung 124: Konzept der Tandem-Reaktionen durch Kombination der Suzuki-Kreuzkupplung mit
einer biokatalytischen Reduktion
Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen
Reduktion kann z.B. der Biarylalkohol (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) hergestellt werden. Das
Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) konnte sowohl die Suzuki-Kreuzkupplung als auch die biokatalytische
Reduktion eingehen. Mit Hilfe der Suzuki-Kreuzkupplung wurde aus dem Keton 106 das dem-
entsprechende 4‘-Phenylacetophenon (108) erhalten oder das Keton 106 wurde biokatalytisch mit
Hilfe der Alkoholdehydrogenase zum korrespondierenden rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-ol (rac-107)
reduziert. Das gewünschte Produkt, der Biarylalkohol (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109), konnte
durch die Suzuki-Kupplung aus dem enantiomerenreinen Alkohol (R)-107 oder durch die
biokatalytische Reduktion des Ketons 108 erhalten werden. Im Hinblick auf die Tandemreaktion
wurde der Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung für die beiden potentielle
Substrate 4‘-Iodacetophenon (106) und rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-ol (rac-107) untersucht. Hierbei
konnte mit Hilfe des humanen Serumalbumins (HSA) als Modellprotein der Einfluss der
Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung wie z.B. die Inhibierung der Reaktion beobachtet
werden. Es ergaben sich für beide Verbindungen sehr ähnliche Kurven. Die Umsätze nahmen
sukzessive bei höheren Proteinkonzentrationen ab, was zeigte, dass das Protein der LK-ADH bei
ansonsten konstant gehaltenen Reaktionsbedingungen die Suzuki-Kreuzkupplung inhibieren kann
(Abbildung 125).
6. Zusammenfassung
139
Abbildung 125: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-
Iodacetophenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)
Das beste Ergebnis bei der Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der
enzymatischen Reduktion in Form einer Tandemreaktion im Bezug auf den Erhalt des Biarylalkohols
(R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) wurde mit einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l, die aus dem
Rohextrakt der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir stammte, über eine Reaktionszeit von
48 Stunden und einer Substratkonzentration von 40 mM erreicht. Das wässrige Medium bestand aus
einer 1:1 (v/v) - Mischung aus Isopropanol und wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung. Der
Biarylalkohol (R)-109 wurde mit 99% ee und einem Umsatz von 35% erhalten. Desweiteren wurde
der Alkohol (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol (R)-107 mit einem Umsatz von 23% und 99% ee und das Keton
4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von 42% synthetisiert. Der Gesamtumsatz der
Tandem-Reaktion belief sich auf über 95% (Abbildung 126).
Abbildung 126: Ergebnisse der Tandemreaktion
6. Zusammenfassung
140
Die Ergebnisse stellen eine Reihe von „Proof of Concepts“ dar, die Perspektiven für weitere
Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet eröffnen. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der
Enzymklasse der Oxidoreduktasen mit einem Schwerpunkt auf Monooxygenasen und deren
Reaktionen. Die mit Hilfe der vorgestellten biokatalytischen Methoden synthetisierten Produkte
stellten vor allem Bulkchemikalien wie z.B. ε-Caprolacton (53) dar. In dieser Arbeit wurden einige
Mehrstufen-Eintopf-Synthesen in einem wässrigen Medium wie die biokatalytische Oxidation von
linearen Alkanen zu Alkoholen, die biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu den
korrespondierenden Cycloalkanonen oder die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16)
zu ε-Caprolacton (53) realisiert. Es wurden neuartige Synthesen mit Oxidoreduktasen erfolgreich
entwickelt und eine Kombination von metallkatalytischer Reaktion mit einer biokatalytischen
Reaktion ausführlich auf deren Ablauf untersucht. Eine offene Herausforderung für die Forschung
stellt die Verbesserung von biokatalytischen Konzepten dar, mit dem Ziel, effiziente und technisch
geeignete Verfahren zu entwickeln, die sich als konkurrenzfähig zu den lange etablierten Prozessen
der chemischen Industrie erweisen.
7. Summary
141
7. Summary
In this work a number of „proof of concepts“ for one-pot syntheses by using biocatalysts in aqueous
media were successfully performed. The examined processes contain new biocatalytic proceedings
for the hydroxylation of short-chain n-alkanes, especially of the liquid gas n-butane 65, the double
oxidation of cycloalkanes to synthesize cycloalkanones and also of cyclohexanol 16 to synthesize
ε-caprolactone 53. Furthermore the combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling
reaction followed by a biocatalytic reduction was examined. The summarized results are shown in
this chapter.
7.1 Biocatalytic hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase
The establishment of a process in aqueous media in order to hydroxylate n-alkanes like n-octane (64)
and n-butane (65) by applying a P450-monooxygenase was of capital importance as well as the
hydroxylation of the liquid gas n-butane (65) for the purpose to synthesize the bulk chemical
2-butanol 35 (figure 1).
Figure 1: Biocatalytic hydroxylation of the n-alkanes 64 und 65 in order to obtain the corresponding
alcohols
The alcohol was synthesized during the hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase
from Bacillus megaterium and consumption of the cofactor NADPH. The application of additional
D-glucose and glucose dehydrogenase (GDH) enabled an in situ-cofactor regeneration in order to
reduce the cofactor NADP+ which was formed during the hydroxylation. The reduced cofactor NADPH
was then used in order to synthesize the alcohol during the biocatalytic oxidation reaction. The
substrate n-octane (64) was used for the first experiments. The hydroxylation of n-alkane 64 in
7. Summary
142
aqueous media was obtained by using the F87V-mutant of P450-monooxygenase BM-3, a substrate
concentration of 20 mM and the in situ-cofactor regeneration described above with a product
formation of 0.47 g/L (figure 2).
Figure 2: Biocatalytic hydroxylation of n-octane (64)
The biocatalytic hydroxylation of the gaseous n-butane (65) by applying a P450-monooxygenase and
the in situ-cofactor regeneration system was examined for the dependency of the reaction
temperature and of the applied mutant of the P450-monooxygenase. Based on the obtained result
for n-octane (64) the same cofactor regeneration system was used for the biocatalytic hydroxylation
of the n-alkane 65. The best result was achieved by using the 19A12-mutant of P450-monooxygenase
BM-3 and a reaction temperature of 0°C for the first 8 hours, followed by a slow warm-up to room
temperatur during the remaining 16 hours. The desired 2-butanol (35) was synthesized with a
product formation of 0.16 g/L (figure 3).
Figure 3: Biocatalytic hydroxylation of the liquid gas n-butane (65) to obtain 2-butanol (35)
7. Summary
143
7.2 Biocatalytic double oxidation of cyclooctane to synthesize cyclooctanone by
using a combination of a P450-monooxygenase and an alcohol dehydrogenase
The aim was the direct biocatalytic double oxidation of cycloalkanes in order to synthesize cyclo-
alkanones by using only atmospheric oxygen as reagent in an aqueous media in the fashion of a one-
pot-two-step-reaction. The first step contained the hydroxylation of cyclooctane (73) by using a
P450-monooxygenase and by consumption of the initial cofactor NADPH in order to obtain
cyclooctanol (74). An alcohol dehydrogenase (ADH) oxidized the alcohol 74 to cyclooctanone (75)
during the second step. During the hydroxylation reaction NADP+ was achieved which could be used
as cofactor during the oxidation reaction and was meanwhile reduced to NADPH. The catalytic cycle
restarted and there was no need for co-substrates (figure 4).
Figure 4: Biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize cyclooctanone (75)
With regard to the noticed volatility of the cycloalkanes the development of a convincing method for
the determination of conversion and product formation was of particular importance. During this
work a valid analytic system was established and in consequence this challenge was met successfully.
The biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) was studied for the dependency of an additive,
the reaction temperature, the reaction time, the substrate concentration and the applied mutant of
the P450-monooxygenase. The introduction of the additive isopropyl alcohol (30) led to the
application of NADP+ as cofactor at the beginning of the reaction and to an increase of the product
formation from 0.090 - 0.140 g/L to 0.323 - 0.353 g/L. The reduction of the reaction temperature,
which was first room temperature, to a reaction temperature of 0°C for the first 8 hours, followed by
a slow warm-up to room temperatur during the remaining 16 hours did not enhance the product
formation. Also the increase of the reaction time from 24 hours to 48 hours did not lead to more
synthesized product. The product formation increased to 0.633 - 0.685 g/L by using the 19A12-
mutant of P450-monooxygenase BM-3 which was the most suitable of the examined variants. A
further improvement of the product formation was obtained by using a substrate concentration of
100 mM instead of 25 mM. The best result was achieved by using the alcohol 30 as additive, room
temperature, 24 hours reaction time, the 19A12-variant of P450-monooxygenase BM-3, the alcohol
7. Summary
144
dehydro-genase from Lactobacillus kefir and a substrate concentration of 100 mM. The biocatalytic
double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize cyclooctanone (75) in aqueous media was
performed with a product formation of 0.80 g/L (figure 5).
Figure 5: Optimized biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize
cyclooctanone (75) by using the additive isopropyl alcohol (30) (“proof of concept”)
7.3 Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol in order to synthesize
εεεε-caprolactone by using a combination of an alcohol dehydrogenase and a Baeyer-
Villiger-monooxygenase
The development of a direct biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize
the bulk chemical ε-caprolactone (53) in a one-pot-two-step fashion was of capital importance. This
was achieved by combining an alcohol dehydrogenase und a Baeyer-Villiger-monooxygenase with
only atmospheric oxygen as reagent in aqueous media (figure 6).
Figure 6: Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize ε-caprolactone (53)
in a one-pot-two-step fashion
7. Summary
145
The first step was the oxidation of cyclohexanol (16) to cyclohexanone (41) by using an alcohol
dehydrogenase. The initial cofactor NADP+ was reduced during this reaction to NADPH. The second
step contained the Baeyer-Villiger-oxidation of cycloalkanone 41 in order to synthesize lactone 53 by
using a Baeyer-Villiger-monooxygenase. The cofactor NADPH was meanwhile oxidized to NADP+ and
the catalytic cycle could restart. Except for molecular oxygen as oxidant no additional co-substrate
was required. In this work the biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to
synthesize ε-caprolactone (53) with only atmospheric oxygen as reagent in a one-pot-two-step
fashion in aqueous media was successfully performed. The dependency of the substrate
concentration, which ranged from 20 mM to 100 mM, on the double oxidation was analyzed. The
best result was obtained by using a substrate concentration of 40 mM cyclohexanol (16). The
conversion was 97% (figure 7).
Figure 7: Optimized biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize
ε-caprolactone (53) (“proof of concept”)
The increase of the substrate concentration showed very good conversions of 94% at a concentration
of 60 mM cyclohexanol (16), but further increase of the substrate concentration led to a significant
drop of conversion which was only 24% at a concentration of 100 mM cyclohexanol (16) (figure 8).
7. Summary
146
Figure 8: Dependency of the concentration of cyclohexanol (16) on the conversion
In order to find an explanation for this dependency the impact of cyclohexanol (16), cyclohexanone
(41) and ε-caprolactone (53) on the reaction was studied with respect on inhibition and stability of
the Baeyer-Villiger-monooxygenase. A significant inhibition and loss of stability of the Baeyer-Villiger-
monooxygenase was observed by increasing the concentration of the lactone 53. The future work
should address on solving the problem of inhibition and deactivation of the Baeyer-Villiger-
monooxygenase by the product ε-caprolactone (53). Baeyer-Villiger-monooxygenases have to be
identified which will not be inhibited and deactivated by the lactone 53. Furthermore processes for
the in situ-product removal during the reaction should be of capital importance.
7.4 Combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling and an enzymatic
reduction in order to synthesize a biarylalcohol
The goal of the combination of the palladium-catalyzed Suzuki cross-coupling reaction and the
biocatalytic reduction by using an alcohol dehydrogenase was to understand the course of the
tandem reaction with 4‘-iodoacetophenone (106) as initial substrate. Both, the Suzuki cross-coupling
reaction and the biocatalytic reduction were examined separately. The dependency of the amount of
protein on the reactions especially on the Suzuki cross-coupling was studied in detail. The desired
product of this tandem reaction was the biarylalcohol (R)-109 (figure 9).
7. Summary
147
Figure 9: Concept of the tandem reaction by combining Suzuki cross-coupling reaction and
biocatalytic reduction
During the tandem-reaction the compound 4‘-iodoacetophenone (106) was able serve as initial
substrate for both the Suzuki cross-coupling reaction and the biocatalytic reduction. The initial
substrate 106 was converted to 4‘-phenylacetophenone (108) during the Suzuki cross-coupling
reaction respectively to (R)-4‘-iodophenylethan-1-ol (R)-107 during the biocatalytic reduction by
using an alcohol dehydrogenase. The ketone 108 could be biocatalytically reduced to the desired
biarylalcohol (R)-109. The alcohol (R)-107 could serve as substrate for the Suzuki cross-coupling
reaction in order to synthesize the (R)-4'-biphenylethan-1-ol ((R)-109). Furthermore the impact of the
concentration of protein on the Suzuki cross-coupling reaction was studied for the both possible
substrates 106 and rac-107 using human serum albumin (HSA) as model protein with respect of
inhibition. Very similar results were obtained for both substrates: the increase of the concentration
of HSA led to lower conversions. This approved the Suzuki cross-coupling was inhibited by higher
concentrations of protein (figure 10).
7. Summary
148
Figure 10: Dependency of the concentration of protein on the conversion of the Suzuki cross-
coupling with ketone 106 respectively with racemic alcohol rac-107 as initial substrate
The best result with regard to the synthesized product (R)-4'-biphenylethan-1-ol ((R)-109) was
obtained by using a concentration of 1.0 g/L protein, which originated from the alcohol dehydro-
genase from Lactobacillus kefir, 48 hours reaction time and a substrate concentration of 40 mM
4‘-iodoacetophenone (106). The reaction media was a mixture of isopropyl alcohol (30) and an
aqueous solution of sodium carbonate in a ratio of 1:1. The overall conversion of the tandem
reaction was more than 95%. The desired product of the tandem reaction, (R)-4'-biphenylethan-1-ol
((R)-109), was obtained with 99% ee and a conversion of 35%. Furthermore (R)-4‘-iodophenylethan-
1-ol ((R)-107) was synthesized with 99% ee and a conversion of 23% and 4‘-phenylacetophenone 108
was obtained with a conversion of 42% (figure 11).
Figure 11: Results of tandem reaction
7. Summary
149
7.5. Outlook
These results constitute a number of „proof of concepts“ and offer several perspectives for further
investigations on this research topic. The enzyme class of oxidoreductases with focus on
monooxygenases and their reactions was of particular importance for this work. Furthermore the
combination of a biocatalytic reaction and a metal-catalyzed reaction was studied more detailed.
Some new synthesis routes to obtain bulk chemicals like 2-butanol (35) and ε-caprolactone (53) were
developed successfully by using oxidoreductases in enzymatic reactions in aqueous media and in a
one-pot fashion with only atmospheric oxygen as reagent. This work contains the biocatalytic
oxidation of n-alkanes to alcohols, the biocatalytic double oxidation of cycloalkanes to the
corresponding cycloalkanones and the biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to
synthesize lactone 53. It is very important to improve the enzymatic concepts in order to develop
technically applicable and efficient processes which would be able to be in competition with the
long-established chemical industry processes.
8. Experimenteller Teil
150
8. Experimenteller Teil
8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte
Chemikalien:
• Die für diese Doktorarbeit verwendeten käuflichen Chemikalien wurden von Acros Organics®,
Sigma-Aldrich®, ABCR®, Fisher Scientific® oder Fluka® bezogen und ohne weitere Reinigung
eingesetzt.
• Das gasförmige n-Butan wurde als Hochschulspende von der Evonik Degussa GmbH zur
Verfügung gestellt.
• Alle verwendeten Lösungsmittel wurden vor Gebrauch am Rotationsverdampfer destilliert.
Enzyme:
Die verwendeten Enzyme wurden im Rahmen folgender Zusammenarbeiten erhalten:
• Die P450 BM-3 Monooxygenasen wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. U. Schwaneberg
(RWTH Aachen) entwickelt und dankenswerterweise für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.
• Die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH)und Rhodococcus sp. (Rsp-ADH) [132,133]
wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W. Hummel (Universität Düsseldorf, Institut für
molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum Jülich) entwickelt und dankenswerterweise
für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese ADHs sind bei evocatal GmbH ebenfalls käuflich
erwerbbar.
• Die Baeyer-Villiger-Monooxygenase ESC-BVMO 01 aus Acinetobacter calcoaceticus wurde von
der Firma Enzymicals AG aus Greifswald, Deutschland entwickelt und dankenswerterweise für
diese Arbeit zur Verfügung gestellt.
• Die Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (GDH) wurde von Amano Enzyme Inc. aus Nagoya,
Japan erhalten.
• Die Cofaktoren NAD(P)H und NAD(P)+ wurden von Oriental Yeast Co. Ltd. bezogen.
Dünnschichtchromatographie:
Es wurden DC-Platten mit Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumträgerfolie von Merck® verwendet.
Zum Nachweis der Substanzzonen diente die Fluoreszenzlöschung bei einer Wellenlänge von 254 nm.
8. Experimenteller Teil
151
HPLC:
Die Spektren wurden mit einem LC-Net II / ADC Gerät und Pumpen (PU-1587 Intelligent Prep. Pump
und PU 987 Intelligent Prep. Pump) der Firma JASCO oder mit einem Gerät CBM-10A und Pumpe (LC-
10AT Liquid Chromatograph) der Firma Shimadzu aufgenommen. Die Trennungen erfolgten an den
Säulen Daicel Chiralcel® OJ-H bzw. Daicel Chiralpak® AD-H und IB.
NMR-Spektroskopie:
Die Spektren wurden auf einem Bruker Avance 300 oder 400 NMR-Spektrometer aufgenommen. Alle
Spektren wurden bei Raumtemperatur gemessen. Die chemischen Verschiebungen der 1H-NMR-
Spektren sind in ppm angegeben. Spinmultiplizitäten werden als s (Singulett), d (Dublett), dd
(dupliziertes Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) angegeben. Die erhaltenen Daten
wurden mit der Software MestRec (3.6.9.0) bearbeitet.
Thermomixer:
Für die Durchführung der Versuche wurde ein Eppendorf Thermomixer Comfort des Typs 5355
verwendet.
Säulenchromatographie:
Die säulenchromatographische Reinigung wurde mit SiO2 als stationärer Phase durchgeführt. Es
wurde dafür Merck® Silikagel 60 (0.04-0.063 nm) der Firma ICN Biomedicals GmbH verwendet.
UV/Vis-Spektroskopie:
Diese Messungen wurden an einem SPEKOL® 1300 UV/Vis-Spektrophotometer der Firma analytikjena
durchgeführt und mit dem Programm WinASPECT 2.2.6.0 unter Zuhilfenahme des Moduls „Kinetik
Programms“ bearbeitet.
Zentrifuge:
Zur Trennung der organischen Phase von der wässrigen Phase wurde eine Hochgeschwindigkeits-
Mikroliter-Zentrifuge des Modells CT15RE von VWR verwendet.
8. Experimenteller Teil
152
8.2 Synthesen und spektroskopische Daten
8.2.1 Hydroxylierung von n-Alkanen zur Darstellung von Alkoholen
8.2.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 für die Herstellung des LB-Mediums (AAV 1)
Es wurden 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl in einer Glasflasche in 1000 ml destilliertem
Wasser gelöst. Anschließend wurde die Flasche bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert.
8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 für die Herstellung des TB-Mediums (AAV 2)
Das TB-Medium bestand aus zwei verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben
wurden. Lösung A bestand aus 12 g - 102 g Trypton, 24 g - 204 g Hefeextrakt und 4 g - 34 g Glycerin,
die in 800 ml - 7400 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die Lösung wurde bei 121°C für
20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 200 ml - 1100 ml destilliertem Wasser gelösten
KH2PO4 (2.31 g -19.64 g) und K2HPO4 (12.54 g - 106.59 g). Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten
autoklaviert. Beim Fermenter - Versuch wurden zusätzlich 8 ml, steril filtrierte (0.2 μm Filter), SEL
(Spurenelemente-Lösung) und 8 ml, steril filtriertes (0.2 μm Filter), Kanamycin (100 µl/ml bzw.
100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zugegeben. Die beiden Lösungen wurden unter sterilen
Bedingungen miteinander vermischt.
8.2.1.2.1 Herstellung des TB-Mediums
Die Herstellung des TB-Mediums erfolgte gemäß AAV 2. Das TB-Medium bestand aus zwei
verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben wurden. Lösung A bestand aus 12 g
Trypton, 24 g Hefeextrakt und 4 g Glycerin, die in 800 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die
Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 200 ml destilliertem
Wasser gelösten KH2PO4 (2.31 g) und K2HPO4 (12.54 g). Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten
autoklaviert. Die beiden Lösungen wurden unter sterilen Bedingungen miteinander vermischt.
8.2.1.2.2 Herstellung des TB-Mediums für einen Fermenter-Versuch
Die Herstellung des TB-Mediums erfolgte gemäß AAV 2. Das TB-Medium bestand aus zwei
verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben wurden. Lösung A besteht aus 102 g
Trypton, 204 g Hefeextrakt und 34 g Glycerin, die in 7400 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die
Lösung wurde im Fermenter bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 1100 ml
destilliertem Wasser gelösten KH2PO4 (19.64 g) und K2HPO4 (106.59 g). Die Lösung wurde bei 121°C
8. Experimenteller Teil
153
für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B wurde mit 8 ml, steril filtrierter (0.2 μm Filter), SEL (Spuren-
elemente-Lösung) und 8 ml, steril filtrierten (0.2 μm Filter), Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml,
1000fach konzentriert) versetzt und mit Hilfe einer Impfflasche in den Autoklaven zur Lösung A
gegeben.
8.2.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 für die Herstellung des M9-Minimal-Mediums
(AAV 3)
Es wurden 64.0 g Na2HPO4 x 7 H2O, 15.0 g KH2PO4, 2.5 g NaCl und 5.0 g NH4Cl in 970 ml destilliertem
Wasser gelöst. Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen
wurden 25 ml einer steril filtrierten (0.2 μm Filter) 20%igen Glucose-Lösung, 5 ml einer separat
autoklavierten 1 M MgSO4-Lösung und 0.2 ml einer separat autoklavierten 1 M CaCl2-Lösung
dazugegeben. Das M9-Minimal-Medium wird bei der Ganzzellkatalyse eingesetzt.
8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 für die Herstellung der Mutanten für die
P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 4)
Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte Antibiotikum, SEL
(Spurenelemente-Lösung), ALA (Aminolävulinsäure), Thiamin und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacto-
pyranosid) waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Die eingesetzten Antibiotika waren Kanamycin für die
19A12-Mutante und den Wildtyp und Ampicillin für die F87V-Mutante. Zu 4 ml LB-Medium wurden
4 μl Antibiotikum (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen eines Glycerol-
Stocks des Wildtyps bzw. der jeweiligen Mutante der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur
wuchs über Nacht (ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend
wurden zu 600 ml TB-Medium, 600 μl Antibiotikum (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzen-
triert), 600 μl SEL (1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-
Mediums) gegeben. Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers
wachsen, bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden
600 μl ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 600 µl Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl
IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben.
Die Enzyme wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die
anschließende Aufarbeitung erfolgte nicht unter sterilen Bedingungen, aber bei 4°C. Es wurden
zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml-Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm
und 4°C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml-Tube gelöst und
8. Experimenteller Teil
154
für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die entstehenden Pellets wurden zu 18 ml je
500 ml - Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers wurde eine homogene Lösung hergestellt.
Anschließend erfolgte in drei Zyklen der Zellaufschluss mit Hilfe eines Homogenisators. Die Zellreste
wurden von den Enzymen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 4°C und 13000 rpm voneinander
getrennt. Es wurden je 10 ml des Überstandes der zentrifugierten Probe in Falcon Tubes (50 ml)
überführt. Diese Falcon Tubes wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren und ca. 5 Tage lyophilisiert.
8.2.1.4.1 Herstellung des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3
Die Anzucht der Enzyme erfolgte gemäß AAV 4 unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte
Antibiotikum Kanamycin, SEL, ALA, Thiamin und IPTG waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-
Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen
eines Glycerol-Stocks des Wildtyps der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur wuchs über Nacht
(ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend wurden zu 600 ml
TB-Medium, 600 μl Kanamycin (100 µL/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert), 600 μl SEL
(1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-Mediums) gegeben.
Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen, bis eine
OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden 600 μl ALA (0.5 M,
1000fach konzentriert), 600 µl Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl IPTG (0.1 M,
1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben. Die Enzyme
wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die
anschließende Aufarbeitung erfolgte nicht unter sterilen Bedingungen, aber bei 4°C. Es wurden
zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml - Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm
und 4°C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml - Tube gelöst und
für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die entstehenden Pellets wurden zu 18 ml je
500 ml-Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers eine homogene Lösung hergestellt.
Anschließend erfolgte in drei Zyklen der Zellaufschluss mit Hilfe eines Homogenisators. Die Zellreste
wurden von den Enzymen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 4°C und 13000 rpm voneinander
getrennt. Es wurden je 10 ml des Überstandes der zentrifugierten Probe in Falcon Tubes (50 ml)
überführt. Diese Falcon Tubes wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren und ca. 5 Tage lyophilisiert.
Ausbeute: 693 mg
8. Experimenteller Teil
155
8.2.1.4.2 Herstellung der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3
Die Anzucht der Enzyme erfolgte gemäß AAV 4 unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte
Antibiotikum Kanamycin, SEL, ALA, Thiamin und IPTG waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-
Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen
eines Glycerol-Stocks der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur wuchs über
Nacht (ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend wurden zu
600 ml TB-Medium, 600 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert), 600 μl SEL
(1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-Mediums) gegeben.
Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen, bis eine
OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden 600 μl ALA (0.5 M,
1000fach konzentriert), 600 µL Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl IPTG (0.1 M,
1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben. Die Enzyme
wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die
anschließende Aufarbeitung erfolgte nicht unter sterilen Bedingungen, aber bei 4°C. Es wurden
zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml-Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm
und 4 °C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml-Tube gelöst und
für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die entstehenden Pellets wurden zu 18 ml je
500 ml-Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers eine homogene Lösung hergestellt.
Anschließend erfolgte in drei Zyklen der Zellaufschluss mit Hilfe eines Homogenisators. Die Zellreste
wurden von den Enzymen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 4°C und 13000 rpm voneinander
getrennt. Es wurden je 10 ml des Überstandes der zentrifugierten Probe in Falcon Tubes (50 ml)
überführt. Diese Falcon Tubes wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren und ca. 5 Tage lyophilisiert.
Ausbeute: 584 mg
8.2.1.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 für die Fermentation der 19A12-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 5)
Die Fermentation der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 wurde in Anlehnung an eine
literaturbekannte Arbeitsvorschrift [47] durchgeführt. Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen
Bedingungen. Das eingesetzte Antibiotikum, SEL, ALA, Thiamin und IPTG wurden steril filtriert
(0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach
konzentriert) und ein Tropfen eines Glycerol-Stocks der jeweiligen Mutante der P450-
Monooxygenase gegeben. Anschließend wurden zu 160 ml LB-Medium 1.6 ml einer Übernachtkultur
8. Experimenteller Teil
156
der 19A12-Mutante und 160 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)
gegeben. Die Vorkultur ließ man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers
bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht
Vorkultur und 160 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5
Medium in den Fermenter gegeben. Die Kulturen l
Sauerstoffeintrag von 3 l/min wachsen, bis eine OD
wurden 8.16 ml ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 8.16 ml Thiamin (100
und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme w
23 Stunden exprimiert, bis eine OD
4000 rpm und 4°C für 10 Minuten
dazugegeben. Anschließend wurden
wurde verworfen und die zurückbleibenden Pellets w
in AAV 3 beschrieben, aufgearbeitet.
8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift
bestimmung der P450-Monooxygenase BM
Die Enzymaktivität wurde in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift
photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch
Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt.
wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH
herangezogen. Der molare Extinktionskoeffizient ε
zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680
Lösung des Alkans (100 mM) und 100
P450-Monooxygenase BM-3 aus
50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion w
200 μl einer NADPH-Lösung (0.8
Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten w
photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure
bzw. n-Heptan (67) erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität
von 100%) bestimmt.
Abbildung 127: Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung
μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)
man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers
von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 2 bis 3 Stunden). Anschließend
μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5
Medium in den Fermenter gegeben. Die Kulturen ließ man bei 37°C, 300 rpm und einem
Sauerstoffeintrag von 3 l/min wachsen, bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde
den 8.16 ml ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 8.16 ml Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert)
und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme w
ine OD600 von 15.72 erreicht wurde. Die Enzymlösung w
Minuten zentrifugiert. Es wurden pro 500 ml-Tube 45
urden bei 4000 rpm und 4°C für 30 Minuten exprimiert. Der Überstand
worfen und die zurückbleibenden Pellets wurden bei -20°C eingefroren und bei Bedarf, wie
3 beschrieben, aufgearbeitet.
8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 zur spektrophotometrischen Aktivitäts
Monooxygenase BM-3 (AAV 6)
in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift
photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch
in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt.
wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH
Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM
zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer DMSO
Lösung des Alkans (100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes des jeweiligen Mutanten der
3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH
mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten
Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der
Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektro
photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure
erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität
Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung
μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)
man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen,
(ca. 2 bis 3 Stunden). Anschließend wurden 160 ml der
μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5 l TB-
man bei 37°C, 300 rpm und einem
wurde. Anschließend
g/l, 1000fach konzentriert)
und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme wurden ca.
. Die Enzymlösung wurde bei
Tube 45 ml PBS-Puffer
exprimiert. Der Überstand
20°C eingefroren und bei Bedarf, wie
6 zur spektrophotometrischen Aktivitäts-
in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift [10] spektro-
photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch
in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt. Zur Berechnung
wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH-Verbrauch
hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden
μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer DMSO-
des Rohextraktes des jeweiligen Mutanten der
Phosphatpuffer (pH 7.0,
Minuten durch Zugabe von
mM)) gestartet und der
rden durch den Vergleich der spektro-
photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure (66)
erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität
Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung
8. Experimenteller Teil
157
8.2.1.6.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung des Wildtyps der P450-
Monooxygenase BM-3
Die Enzymaktivität wurde gemäß AAV 6 spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm
durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen
Alkans als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es
wurden zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer
DMSO-Lösung von Dodekansäure (66, 100 mM), n-Oktan (64, 100 mM) oder n-Heptan (67, 100 mM)
und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus
megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion
wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen
Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten
(U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment
mit der relativen Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 43 dargestellt.
Tabelle 43: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3
Eintrag Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]a
1 Dodekansäure 0.1748 100
2 n-Oktan 0.0912 52
3 n-Heptan 0.0215 12 abezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.1.6.2 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der 19A12-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3
Die Enzymaktivität wurde gemäß AAV 6 spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm
durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen
Alkans als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es
wurden zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer
DMSO-Lösung von (66, 100 mM), n-Oktan (64, 100 mM) oder n-Heptan (67, 100 mM) und 100 μl
Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus
megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion
wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in
8. Experimenteller Teil
158
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen
Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten
(U/mg) mit der für das Substrat n-Heptan erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit
der relativen Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 44 dargestellt.
Tabelle 44: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3
Eintrag Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]a
1 n-Heptan 0.1439 100
2 n-Oktan 0.0632 44
3 Dodekansäure 0.0000 <2 abezogen auf n-Heptan. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.1.6.3 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der F87V-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3
Die Enzymaktivität wurde gemäß AAV 6 spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm
durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen
Alkans als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es
wurden zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer
DMSO-Lösung von (66, 100 mM) oder n-Oktan (64, 100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Roh-
extraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf
10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach
5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,
50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch
den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das
Substrat Dodekansäure erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen
Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 45 dargestellt.
Tabelle 45: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3
Eintrag Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]a
1 Dodekansäure 0.1160 100
2 n-Oktan 0.0251 22 bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
159
8.2.1.7 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 zur spektrophotometrischen Bestimmung der
Stabilität von P450-Monooxygenasen BM-3 (AAV 7)
Die Enzymaktivität wurde in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift [10] spektro-
photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH an
durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart von n-Heptan oder Dodekansäure als Substrat bestimmt.
Der molare Extinktionskoeffizient ε340 beträgt hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden zunächst in eine 1 ml
fassende Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan
(100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase
BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 8 Stunden
bei 8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wird bzw. 24 Stunden bei RT gerührt wurde,
zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer
NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH
gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten
wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der
für die Substrate n-Heptan erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt.
8.2.1.7.1 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei
Raumtemperatur über 24 Stunden
Der Photometertest wurde gemäß AAV 7 durchgeführt. Es wurden zunächst in eine 1 ml fassende
Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan (67,
100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase
BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 24 Stunden
bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch
Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und
der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen
durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch
erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat n-Heptan (67) erhaltenen Enzym-
aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 46 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
160
Tabelle 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1 99
3 2 87
4 8 50
5 24 0
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.1.7.2 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über
8 Stunden und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Der Photometertest wurde gemäß AAV 7 durchgeführt. Es wurden zunächst in eine 1 ml fassende
Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan (67,
100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase
BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 8 Stunden
bei 8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion
wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung
wurde in verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den
Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat
n-Heptan (67) erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 47 dargestellt.
Tabelle 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden
und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 2 97
3 4 76
4 8 74
5 24 73
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
161
8.2.1.7.3 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei
Raumtemperatur über 24 Stunden
Der Photometertest wurde gemäß AAV 7 durchgeführt. Es wurden zunächst in eine 1 ml fassende
Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von Dodekansäure (66,
100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-
3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 24 Stunden bei
RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch
Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und
der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen
durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch
erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure (66) erhaltenen Enzym-
aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 48 dargestellt.
Tabelle 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über
24 Stunden
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 2 100
3 4 93
4 8 60
5 24 27
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.1.7.4 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über
8 Stunden und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Der Photometertest wurde gemäß AAV 7 durchgeführt. Es wurden zunächst in eine 1 ml fassende
Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von Dodekansäure (66,
100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-
3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 8 Stunden bei
8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde
anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphat-
puffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in
8. Experimenteller Teil
162
verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der
spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure
(66) erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 49 dargestellt.
Tabelle 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und
anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 2 92
3 4 93
4 8 80
5 24 73
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.1.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 zur Überprüfung des Verlusts der Substrate
durch verschiedene Aufarbeitungsmethoden (AAV 8)
In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je
einer der Alkohole 1-Oktanol (68), 2-Oktanol (69), 3-Oktanol (70) oder 4-Oktanol (71) miteinander
vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligen Öffnen des Reaktionsgefäßes bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) als Standard zugegeben. Die
Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Gemisch dreimal mit je
5 ml Dichlormethan unter Zuhilfenahme eines Schütteltrichters extrahiert bzw. auf mehrere 2 ml
Eppendorf-Gefäße verteilt und dreimal mit je 1 ml Dichlormethan je Eppendorf-Gefäß bei 25°C mit
Hilfe des Thermomixers extrahiert. Anschließend wurden bei der Schütteltrichter-Aufarbeitung die
vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und bei der Eppendorf-Aufarbeitung erfolgte
30 Minuten lang die Phasentrennung durch eine Zentrifuge bei 13000 Umdrehungen pro Minute.
Nach Entfernen der wässrigen Phase wurde das Lösungsmittel der vereinigten organischen Phasen
am Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des externen Standards und des jeweiligen
Substrats wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8. Experimenteller Teil
163
8.2.1.8.1 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die
Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters
Die Überprüfung wurde gemäß AAV 8 durchgeführt In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben
wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je ein Substrat (68, 69, 70, 71, 0.1 mmol, 13.0 µl)
miteinander vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligen Öffnen des Reaktionsgefäßes bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard
zugegeben. Die Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das
Gemisch dreimal mit je 5 ml Dichlormethan unter Zuhilfenahme eines Schütteltrichters extrahiert.
Anschließend wurden die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel
der vereinigten organischen Phasen wurde am Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des
externen Standards und des jeweiligen Substrats wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 50 dargestellt.
Tabelle 50: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Hilfe eines
Schütteltrichters
Eintraga Alkohol Dauera [h] Ausbeute des Pyridins [%]
Ausbeute des Alkohols [%]
Faktor
1 1-Oktanol 24 97 82 1.18
2 1-Oktanol 0 86 74 1.16
3 2-Oktanol 24 92 82 1.12
4 2-Oktanol 0 94 85 1.11
5 3-Oktanol 24 85 76 1.12
6 3-Oktanol 0 96 95 1.01
7 4-Oktanol 24 95 75 1.27
8 4-Oktanol 0 90 79 1.14 aReaktionszeit
8. Experimenteller Teil
164
8.2.1.8.2 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die
Aufarbeitung mit Eppendorf-Gefäßen
Die Überprüfung wurde gemäß AAV 8 durchgeführt. In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben
wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je ein Substrat (68, 69, 70, 71, 0.1 mmol, 13.0 µl)
miteinander vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligem Öffnen des Reaktionsgefäßes bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden Pyridin (72, 0.3 mmol 24.2 µl) als Standard
zugegeben. Die Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das
Gemisch auf mehrere 2 ml Eppendorf-Gefäße verteilt und dreimal mit je 1 ml Dichlormethan je
Eppendorf-Gefäß bei 25°C mit Hilfe des Thermomixers extrahiert. Anschließend erfolgte 30 Minuten
lang die Phasentrennung durch eine Zentrifuge bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen
der wässrigen Phase wurde das Lösungsmittel der vereinigten organischen Phasen am
Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des externen Standards und des jeweiligen Substrats
wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 51 dargestellt.
Tabelle 51: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Eppendorf-
Gefäßen
Eintrag Alkohol Dauera [h] Ausbeute des Pyridins [%]
Ausbeute des Alkohols [%]
Faktor
1 1-Oktanol 24 97 82 1.18
2 1-Oktanol 0 97 94 1.03
3 2-Oktanol 24 91 81 1.12
4 2-Oktanol 0 94 91 1.03
5 3-Oktanol 24 97 85 1.14
6 3-Oktanol 0 96 93 1.03
7 4-Oktanol 24 91 81 1.12
8 4-Oktanol 0 94 83 1.13 aReaktionszeit
8. Experimenteller Teil
165
8.2.1.9 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 zur biokatalytischen Hydroxylierung von
n-Oktan (AAV 9)
In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH
7.0, 50 mM) bzw. in einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß wurden 1 ml
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt
des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt.
Anschließend werden n-Oktan (64, 0.1 mmol), D-Glucose
(0.5 mmol) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.
(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH
7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten
bei -5°C, 0°C, 8°C oder Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion
wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ bzw. NADPH
gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei 8°C
oder Raumtemperatur und anschließend 16 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C 24 Stunden im Thermomixer geschüttelt. Danach wurden
Pyridin (72, 0.3 mmol) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße
verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das
Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei
550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-
Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene
Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die
Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden Oktanolen 69 - 71
und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8. Experimenteller Teil
166
8.2.1.9.1 Einfluss der Substratkonzentration
Die Untersuchung zum Einfluss der Substratkonzentration wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In
einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) bzw. in einem 2 ml-
Eppendorf-Gefäß werden 1 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt der
F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf
Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl),
D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1
verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für
20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C im Thermomixer geschüttelt. Die Reaktion
wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und das
Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C im Thermomixer
geschüttelt. Danach wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form
hinzugegeben und für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml
auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je
1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-
Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal
wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben
überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von
den entstehenden Oktanolen 69 - 71 und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-
NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 52 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
167
Tabelle 52: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-
Oktan (64)
Eintrag c (64) Umsatza Produktbildunga
[mM] [%] [mol/l] [g/l]
1a 20 11 0.0029 0.38
1bb 20 14 0.0033 0.42
2 100 n.d. n.d. n.d. anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
8.2.1.9.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung
Bei der Cofaktorregenerierung durch den Einsatz einer Glucosedehydrogenase und D-Glucose wurde
als Cofaktor NADP+ benötigt (Abbildung 128).
Abbildung 128: Hydroxylierung von n-Oktan (64) unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur in
situ-Cofaktorregenerierung
8. Experimenteller Teil
168
Bei dem System ohne Cofaktorregenerierung wurde als Cofaktor das kostenintensivere NADPH
eingesetzt (Abbildung 129).
Abbildung 129: Hydroxylierung von n-Oktan (64) ohne Cofaktorregenerierung
Die Untersuchung zum Einfluss des eingesetzten Cofaktor wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In
einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64,
0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.
(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) bzw. nur n-Oktan (64, 0.1 mmol,
11.4 µl), im Falle von NADPH als Cofaktor dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für
20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+
bzw. NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard
in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden
die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf
neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde
noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten
Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe
einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden
Oktanolen 69 - 71 und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 53 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
169
Tabelle 53: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die
biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintrag GDH Cofaktor Umsatza Produktbildunga
[U/mmol] [mmol] [%] [mol/l] [g/l]
1a 36 0.010
NADP+ 11 0.0029 0.38
1bb 36 0.010 NADP+
14 0.0033 0.42
2 0 0.010
NADPH n.d. n.d. n.d.
anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
8.2.1.9.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+
Die Untersuchung zum Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ wurde gemäß AAV
9 durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und
lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol,
Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden
n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus
Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde
anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg bzw. 0.01 mmol, 7.44 mg)
gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach
wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für
5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-
Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-
Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal
wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden Oktanolen 69 - 71
und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 54 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
170
Tabelle 54: Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ auf die biokatalytische
Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintrag NADP+ Umsatza Produktbildunga
[mmol] [%] [mol/l] [g/l]
1a 0.010 11 0.0029 0.38
1bb 0.010 14 0.0033 0.42
2a 0.002 14 0.0031 0.41
2bc 0.002 13 0.0030 0.39 anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
cWiederholungsversuch zu 2a zur
Validierung
8.2.1.9.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3
Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 wurde gemäß AAV 9
durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und
lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der P450-
Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander
vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und
Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer
pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das
Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden Pyridin (72,
0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße
verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das
Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei
550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-
8. Experimenteller Teil
171
Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene
Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die
Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden Oktanolen 69 - 71
und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 55 dargestellt.
Tabelle 55: Einfluss eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung von
n-Oktan (64)
Eintrag P450 BM-3 Umsatza Produktbildunga
[%] [mol/l] [g/l]
1 F87V 11 0.0029 0.38
2 19A12 5 0.0009 0.11
3 Wildtyp 16 0.0031 0.40 anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
8.2.1.9.5 Einfluss der Reaktionstemperatur
Die Untersuchung zum Einfluss der der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In
einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64,
0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.
(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktions-
8. Experimenteller Teil
172
gemisch wurde für 20 Minuten bei -5°C, 0°C, 8°C oder Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde
anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch
wurde 8 Stunden bei 8°C oder Raumtemperatur und anschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Danach wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form
hinzugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt bzw. geschüttelt. Anschließend
wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf
neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden Oktanolen 69 - 71
und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 56 dargestellt.
Tabelle 56: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)
Eintrag Temperatur Umsatza Produktbildunga
[%] [mol/l] [g/l]
1a RT 14 0.0031 0.41
1bb RT 13 0.0030 0.39
2 8°C-RT 16 0.0036 0.47 anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
8. Experimenteller Teil
173
Charakterisierung der entstehenden Oktanole anhand des Eintrags 2 in Tabelle 56:
2-Oktanol (69): 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.83-0.88 (m, 6H, H-C1), 1.21-1.28 (m, 10H,
H-C2), 3.67-3.73 (m, 1H, H-C3)
3-Oktanol (70): 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.83-0.88 (m, 6H, H-C4), 1.21-1.28 (m, 10H,
H-C5), 3.39-3.45 (m, 1H, H-C6)
4-Oktanol (71): 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.83-0.88 (m, 6H, H-C7), 1.21-1.28 (m, 10H,
H-C8), 3.49-3.53 (m, 1H, H-C9)
8.2.1.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 zur biokatalytischen Hydroxylierung von
n-Butan (AAV 10)
In einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0,
50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder
der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66) bzw. n-Heptan (67)) miteinander vermischt.
Anschließend wurden NADPH (0.002 mmol) bzw. D-Glucose (0.5 mmol),
Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0)
und NADP+ (0.002 mmol) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65) zugegeben, indem man die
Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens hielt und das Ventil für ca.
1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und das Reaktionsgemisch
wurde 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C, 8°C oder RT gerührt. Anschließend wurde sofort
aufgearbeitet oder das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden in
den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml zu je 1 ml auf
zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 50 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
8. Experimenteller Teil
174
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden 2-Butanols (35) wurde aus
der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8.2.1.10.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3
Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 wurde gemäß AAV 10
durchgeführt. In einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)
und lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der P450-
Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66) bzw. n-Heptan (67))
miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg), Glucosedehydrogenase
aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol,
1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65) zugegeben, indem man die Öffnung der
Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde
öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und das Reaktionsgemisch wurde
8 Stunden bei 8°C gerührt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von
24 Stunden in den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml
zu je 1 ml auf zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-
Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten
Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde
die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 50 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden 2-Butanols (35) wurde aus
der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 57
dargestellt.
8. Experimenteller Teil
175
Tabelle 57: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung
von n-Butan (65)
Eintrag P450 BM-3 Produktbildunga
[mol/l] [g/l]
1 19A12 0.0013 0.10
2 F87V n.d. n.d.
3 Wildtyp n.d. n.d. aProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
8.2.1.10.2 Einfluss der Reaktionstemperatur
Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 10 durchgeführt. In
einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und
lyophilisierter Rohextrakt der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzym-
aktivität bezogen auf n-Heptan (67)) miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose
(0.5 mmol, 90.1 mg), Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und
Phosphatpuffer pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-
Butan (65) zugegeben, indem man die Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des
Rundkolbens hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest
verschlossen und das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C, 8°C oder
Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von
24 Stunden in den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml
zu je 1 ml auf zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-
Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten
Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde
die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-
8. Experimenteller Teil
176
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließende erfolgt die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 50 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden 2-Butanols (35) wurde aus
der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 58
dargestellt.
Tabelle 58: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
Eintrag Temperatur Produktbildunga
[mol/l] [g/l]
1 RT 0.0008 0.06
2 8°C-RT 0.0013 0.10
3 0°C-RT 0.0021 0.16
4 -1/-2°C-RT 0.0017 0.13
5 -5°C-RT 0.0006 0.04 aProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
Charakterisierung des entstehenden 2-Butanols anhand des Eintrags 3 in Tabelle 58:
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.99 (t, 3J = 7.35 Hz, 3H, H-C1), 2.10 (s, 3H, H-C2), 2.47
(q, 2H, H-C3)
8. Experimenteller Teil
177
8.2.1.10.3 Einfluss der Reaktionszeit
Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 10 durchgeführt. In
einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyo-
philisierter Rohextrakt der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität
bezogen auf n-Heptan (67)) miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose (0.5 mmol,
90.1 mg), Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer
pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65)
zugegeben, indem man die Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens
hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und
das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei 0°C gerührt. Entweder wurde danach sofort
aufgearbeitet oder das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden in
den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml zu je 1 ml auf
zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 50 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden 2-Butanols (35) wurde aus
der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 59
dargestellt.
Tabelle 59: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)
8. Experimenteller Teil
178
Eintrag Temperatur Dauera Produktbildungb
[h] [mol/l] [g/l]
1 0°C-RT 24 0.0021 0.16
2 0°C 8 0.0019 0.14 aReaktionszeit,
bProduktbildung nach
1H-NMR und Auswaage bestimmt
8.2.2 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Darstellung von Cycloalkanonen
8.2.2.1 Spektrophotometrische Bestimmung der Aktivitäten verschiedener P450-
Monooxygenasen BM-3
Die Enzymaktivität wurde gemäß AAV 6 spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm
durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen
Alkans als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es
wurden zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer
DMSO-Lösung von Cyclooktan (73, 100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-
oder der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach
5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,
50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 60
dargestellt.
Tabelle 60: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten verschiedener P450-Monooxygenasen
bezogen auf Cyclooktan (73)
Eintrag P450 BM-3 U/mg
[µmol/min*mg]
1 19A12 0.1749
2 F87V 0.0074
8. Experimenteller Teil
179
8.2.2.2. Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 zur Untersuchung der Analytik mit Hilfe
eines Standards (AAV 11)
In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß, in einem 25 ml- oder in einem 10 ml-Rundkolben wurden 1 ml bis
5 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol) miteinander vermischt
und für 5 Minuten im Thermomixer bei 25°C geschüttelt bzw. für 5 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) hinzugegeben. Anschließend wurde das
2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 4 ml oder die 5 ml wurden
zu je 1 ml auf vier bzw. fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier bzw. fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene
Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die
Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei
900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der
Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8.2.2.2.1 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem
Reaktionsvolumen von 1 ml
Die Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards erfolgte gemäß AAV 11. In einem 2 ml-
Eppendorf-Gefäß wurden 1 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75,
0.1 mmol, 12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten im Thermomixer bei 25°C geschüttelt.
Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurde das
2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde
durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C
extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro
Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde
die organische Phase in einen 10 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72)
wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8. Experimenteller Teil
180
Durchschnittliche Wiederfindung an Cyclooktanon (75): 95%
Durchschnittliche Wiederfindung an Pyridin (72): 94%
8.2.2.2.2 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem
Reaktionsvolumen von 4 ml
Die Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards erfolgte gemäß AAV 11. In einem 25 ml-
Rundkolben wurden 4 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol,
12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu
je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen
mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72)
wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
Durchschnittliche Wiederfindung an Cyclooktanon (75): 98%
Durchschnittliche Wiederfindung an Pyridin (72): 90%
8.2.2.2.3 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem
Reaktionsvolumen von 5 ml
Die Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards erfolgte gemäß AAV 11. In einem 10 ml-
Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol,
12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurden die 5 ml zu
je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen
mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
8. Experimenteller Teil
181
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72)
wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
Durchschnittliche Wiederfindung an Cyclooktanon (75): 95%
Durchschnittliche Wiederfindung an Pyridin (72): 97%
8.2.2.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 zur Hydroxylierung von Cyclooktan mit
Cofaktorregenerierung zum Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der
Monooxygenase (AAV 12)
In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß, in einem 25 ml- oder in einem 10 ml-
Rundkolben wurden zu 1 ml bis 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)
nacheinander 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73))
bzw. 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) der
F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (als lyophilisierter
Rohextrakt), Cyclooktan (73, 0.1 mmol), D-Glucose (0.5 mmol) und
36 U/mmol Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH
7.0) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol)
gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurden Pyridin (72,
0.3 mmol), als Standard zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit
1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 4 ml oder die 5 ml wurden zu je 1 ml auf vier bzw. fünf 2 ml-
Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurden durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
8. Experimenteller Teil
182
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden
Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt.
8.2.2.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 1 ml
Reaktionsvolumen und 38.2 U/mmol Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß wurden
zu 1 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante
der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)),
Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus
Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die
Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet
und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,
24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der
wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml-Kolben
überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 61 dargestellt.
8.2.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung in 4 ml
Reaktionsvolumen und 7.64 U/mmol Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan
(73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.
(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die Reaktion
wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für
8. Experimenteller Teil
183
24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl)
als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml oder die 5 ml zu je 1 ml auf vier bzw. fünf
2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wird durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer
Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung
10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende
wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße
gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt.
Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen
pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die
organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanols 74 und des
Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis
ist in Tabelle 61 dargestellt.
8.2.2.3.3 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 5 ml
Reaktionsvolumen und 38.2 U/mmol Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 10 ml-Rundkolben wurden zu
5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der
P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)),
Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus
Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die
Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet
und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,
24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml oder die 5 ml zu je 1 ml auf vier bzw.
fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
8. Experimenteller Teil
184
Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden
Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 61 dargestellt.
Tabelle 61: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der
Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase
anach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
Eintraga c (73) P450 BM-3 74a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mM] [U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 20 38.20 6.6 0.86 7 7 27 0.0017 0.172
1bd 20 38.20 6.6 0.69 6 6 10 0.0013 0.138
2 100 38.20 33.0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3 25 7.64 10.8 1.31 10 10 27 0.0026 0.328
8. Experimenteller Teil
185
8.2.2.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 zur Doppeloxidation von Cyclooktan
(AAV 13)
In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß bzw. in einem 10 ml- oder 25 ml-
Rundkolben wurden zu 1 ml bis 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM,
1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der
F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 bis 22.92 U/mmol,
Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73) bzw. 38.2 U/mmol, Enzym-
aktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol) und
LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch
Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) als Standard zugegeben. Anschließend
wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 5 ml werden zu
je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen
mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in neue 2 ml-Eppendorf-
Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal
wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden
Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt.
8.2.2.4.1 Einfluss des Substratkonzentration
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß bzw.
10 ml-Rundkolben werden zu 1 ml bzw. 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesium-
chlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3
(38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl)
und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend
durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard
8. Experimenteller Teil
186
zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan
versetzt bzw. die 5 ml wurden zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen
Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System
wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C
extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro
Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde
die organische Phase in einen 10 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotations-
verdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins
(72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 62 dargestellt.
Tabelle 62: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclooktan (73)
anach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH
Eintrag
c (73) 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 20 0.13 1 1 2 0.0002 0.026
2 100 0.13 1 1 1 0.0010 0.130
8. Experimenteller Teil
187
8.2.2.4.2 Doppeloxidation von Cyclooktan mit 4 ml Reaktionsvolumen und
7.64 U/mmol P450-Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1
verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors
NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden
die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 63 dargestellt.
8.2.2.4.3 Doppeloxidation von Cyclooctan mit 5 ml Reaktionsvolumen und
38.2 U/mmol P450-Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 10 ml-Rundkolben wurden zu
5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1
verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors
NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden
die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
8. Experimenteller Teil
188
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 63 dargestellt.
Tabelle 63: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-
Monooxygenase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
anach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
Eintrag
c (73) P450 BM-3 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mM] [U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 20 38.20 6.6 0.47 4 3 8 0.0007 0.094
2a 25 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
2bd 25 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
2cd 25 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
8. Experimenteller Teil
189
8.2.2.4.4 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 25 ml-Rundkolben werden zu
4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) lyophilisierter Rohextrakt der F87V-
Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 bis 22.92 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf
Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit
Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH
(0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden
die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 64 dargestellt.
Tabelle 64: Einfluss der eingesetzten Menge der P450-Monooxygenase auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
8. Experimenteller Teil
190
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung
8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 zur Doppeloxidation von Cyclooktan mit
Isopropanol als Additiv (AAV 14)
In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu 997.5 µl bis 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM
Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64
U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol), IPA (30, 2.5 bis
10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde
anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol) gestartet und für 24 bis 48 Stunden bei
Raumtemperatur bzw. 8 Stunden bei 8°C und anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur
innerhalb der verbleibenden 16 Stunden gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol)
als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße
verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das
Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei
550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei
13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in
den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben
beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte
die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar
entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der
Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt (Tabelle 65).
Eintrag
P450 BM-3 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
1be 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
1ce 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
2 15.28 21.5 0.41 3 3 13 0.0008 0.103
3 22.92 32.3 0.37 3 3 10 0.0007 0.093
8. Experimenteller Teil
191
Tabelle 65: Unterschied von der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ohne Einsatz
des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
Charakterisierung des entstehenden Cyclooktanons anhand des Eintrags 2a in Tabelle 65:
1H-NMR (400 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 1.38 (m, 2 H, H-C1), 1.57 (m, 4 H, H-C2), 1.89 (m, 4 H,
H-C3), 2.43 (m, 4 H, H-C3)
Eintrag
IPA 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[µl] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 0 0.56 4 4 11 0.0011 0.140
1b 0 0.36 3 3 5 0.0007 0.090
1c 0 0.40 3 3 7 0.0008 0.100
2a 10 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
2bd 10 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
2cd 10 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
8. Experimenteller Teil
192
Abbildung 130: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit der 19A12-
Mutante und Isopropanol (30) als Additiv
8.2.2.5.1 Einfluss der Reaktionstemperatur
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH
(200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe
des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei
Raumtemperatur bzw. 8 Stunden bei 8°C und anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur
innerhalb der verbleibenden 16 Stunden gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,
24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-
Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan
versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des
8. Experimenteller Teil
193
Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei
13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in
den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben
beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte
die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar
entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der
Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 66
dargestellt.
Tabelle 66: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung
Eintrag T
75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a RT 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bd RT 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cd RT 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 8°C 1.31 11 12 27 0.0026 0.328
8. Experimenteller Teil
194
8.2.2.5.2 Einfluss der Reaktionszeit
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter
Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität
bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH
(200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe
des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bzw. 48 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard
zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die
wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-
System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und
25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro
Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 67 dargestellt.
Tabelle 67: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)
von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
8. Experimenteller Teil
195
aReaktionszeit,
bUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
cUmsatz nach IS,
dUmsatz nach ISH,
eWiederholungsversuche zu 1a
zur Validierung
8.2.2.5.3 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einem
Reaktionsvolumen von 4 ml
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter
Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol,
Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und
LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch
Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard
zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die
wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-
System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und
25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro
Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-
NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 68 dargestellt.
Eintrag
Dauera 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb
[h] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 24 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1be 24 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1ce 24 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 48 1.38 11 11 40 0.0027 0.345
8. Experimenteller Teil
196
Tabelle 68: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenasen bei einer Substratkonzentration von
25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von
Isopropanol (30) als Additiv
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,
eWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
8.2.2.5.4 Einfluss der Substratkonzentration
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden
997.5 bis 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander
lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3
(7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA
(30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde
Eintrag Mutante
75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bd F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cd F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
2be 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
2ce 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
8. Experimenteller Teil
197
anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als
Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße bzw.
der 1 ml auf ein neues 2 ml-Eppendorf-Gefäß verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-
Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten
Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend
wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach
wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier bzw.
ein neues 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan
wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten
Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe
einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden
Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind für die 19A12-Mutante in Tabelle 69 und für die F87V-
Mutante in Tabelle 70 dargestellt.
Einsatz der 19A12-Mutante
Tabelle 69: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung
Eintrag
c (73) 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 25 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
1bd 25 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
1cd 25 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
2 100 0.80 6 6 14 0.0063 0.800
8. Experimenteller Teil
198
Einsatz der F87V-Mutante
Tabelle 70: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische
Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
anach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung
8.2.2.5.5 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer
Substratkonzentration von 100 mM
Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu
997.5 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander 7 lyophilisierter
Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol,
Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 2.5 μl) und
LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch
Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard
zugegeben. Anschließend wurde die wässrige Phase in ein 2 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und mit 1
ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wird die
überstehende wässrige Phase in dem Eppendorf-Gefäß abgenommen und in ein neues 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und
Eintrag
c (73) 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a 4 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bd 4 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cd 4 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 1 0.49 4 4 10 0.0039 0.490
8. Experimenteller Teil
199
des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 71 dargestellt.
Tabelle 71: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von
100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH
8.2.2.5.6 Einfluss von der Präsens der P450-Monooxygenase
Die Untersuchung über die Notwendigkeit der P450-Monooxygenase erfolgte gemäß AAV 14. In
einem 25 ml-Rundkolben werden zu 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesium-
chlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante bzw. des
Leervektors der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan
(73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit
Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol,
7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde
Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf
Eintrag Mutante
75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1 19A12 0.80 6 6 14 0.0063 0.80
2 F87V 0.49 4 4 10 0.0039 0.49
8. Experimenteller Teil
200
vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml
Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im
Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur
Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die
überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-
Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch
zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei
13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit
Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und
des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 72 dargestellt.
Tabelle 72: Einfluss der P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter
Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
Eintrag Enzym
75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bd F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cd F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
8. Experimenteller Teil
201
aUmsatz nach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,
eWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
8.2.2.5.7 Einfluss von der Präsens der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir
Die Untersuchung über die Notwendigkeit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir erfolgte
gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM,
1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-
Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan
(73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit
Glycerin) bzw. keine LK-ADH gegeben. Die Reaktion wurde anschließend Zugabe des Cofaktors NADP+
(0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der
Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden
die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den
Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch
30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.
Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen
abgenommen und in vier neue 2 ml- Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion
mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung
durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen
Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des
entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 73 dargestellt.
Eintrag Enzym
75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]
2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
2be 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
2ce 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
3 Leer-
vektor n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
8. Experimenteller Teil
202
Tabelle 73: Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von
Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv
anach
1H-NMR und Auswaage,
bUmsatz nach IS,
cUmsatz nach ISH,
dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,
eWiederholungsversuche zu 3a zur Validierung
Eintrag Mutante
LK-ADH 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga
[U/mmol] [mg] [%] [%] [%] [mmol/ml] [mg/ml]
1a F87V 200 1.41 11 11 26 0.0028 0.353
1bd F87V 200 1.29 10 11 34 0.0026 0.323
1cd F87V 200 1.36 11 12 26 0.0027 0.340
2 F87V 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
3a 19A12 200 2.54 20 20 37 0.0050 0.635
3be 19A12 200 2.74 22 25 35 0.0054 0.685
3ce 19A12 200 2.53 20 20 40 0.0050 0.633
4 19A12 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
8. Experimenteller Teil
203
8.2.3 Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase
als Katalysator zur Herstellung von εεεε-Caprolacton
8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 für die spektrophotometrische Bestimmung
der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (AAV 15)
Zur Bestimmung der Enzymaktivität wurden Stammlösungen des Cyclohexanols (16, 10 mM) und des
als Referenzsubstanz verwendeten 1-Phenylethanols und eine 12.5 mM NADP+-Lösung in
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) hergestellt. Es wurden 960 μl der entsprechenden Substratlösung
und 20 μl NADP+-Lösung in eine Küvette pipettiert und durch Schütteln gut vermischt. Anschließend
wurden 20 μl der entsprechend verdünnten LK-ADH-Lösung (Rohextrakt) zugegeben und die Lösung
wurde noch ein weiteres Mal gut durchmischt. Die Messung wurde anschließend so schnell wie
möglich gestartet. Es wurde die Zunahme von NADPH beobachtet (Tabelle 74).
Tabelle 74: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH
Eintrag Substrat U/ml [μmol/min*ml] relative Aktivitäta [%]
1 1-Phenylethanol 79.4 100
2 Cyclohexanol 55.2 70
abezogen auf 1-Phenylethanol. Vg = 1 ml, f = 101, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 für die biokatalytische Doppeloxidation von
Cyclohexanol zur Synthese von εεεε-Caprolacton (AAV 16)
In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)
und Rohextrakt der BVMO ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf
Cyclohexanon (41)) vermischt und gut geschüttelt. Anschließend wurden
Cyclohexanol (16, 0.1 mmol bis 0.5 mmol), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U,
Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit Glycerin) dazu
gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer
bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+
8. Experimenteller Teil
204
(0.002 mmol bis 0.01 mmol) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße
verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das
Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei
550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-
Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene
Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die
Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach
Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in
einen 25 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar
entfernt. Die Masse des entstehenden Anteils an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der
Auswaage des Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8.2.3.2.1. Einfluss der Cofaktormenge
Die Untersuchung zum Einfluss des eingesetzten Cofaktors wurde gemäß AAV 16 durchgeführt. In
einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und Rohextrakt der BVMO
ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Cyclohexanon (41)) vermischt und gut geschüttelt.
Anschließend wurden Cyclohexanol (16, 0.1 mmol, 10.5 μl), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U,
Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit Glycerin) dazu gegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion
wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.002 mmol bis 0.01 mmol, 1.48 mg bis
7.44 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen
Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System
wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C
extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen
und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan
wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten
Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe
einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden Anteils
an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der Auswaage des Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-
Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 75 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
205
Tabelle 75: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors
Eintrag
ADH BVMO NADP+ Umsatza Produktbildunga
[U] [U] [Äq.] [%] [mol/l] [g/l]
1 40 3.82 0.02 97 0.0192 2.20
2 40 3.82 0.10 99 0.0197 2.25
anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt.
Charakterisierung des entstehenden ε-Caprolactons (53) anhand des Eintrags 1 in Tabelle 75:
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 1.68-1.80 (m, 6H, H-C1), 2.62 (m, 2H, H-C2), 4.24 (m, 2H,
H-C3)
8. Experimenteller Teil
206
Abbildung 131: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclohexanol (16)
8.2.3.2.2 Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration
Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten Substratkonzentration wurde gemäß AAV 16
durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und
Rohextrakt der BVMO ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Cyclohexanon (41)) vermischt
und gut geschüttelt. Anschließend wurden Cyclohexanol (16, 0.1 mmol bis 0.5 mmol, 10.5 μl bis
52.5 µl), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U, Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit
Glycerin) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer bei
Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+
(0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei Raum-
temperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt
und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das
Zweiphasen-System wurde durch 30 MinutenSchütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei
550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-
Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene
8. Experimenteller Teil
207
Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasen-
trennung durch 30 min. Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der
wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-
Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die
Masse des entstehenden Anteils an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der Auswaage des
Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt (Tabelle 76).
Tabelle 76: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der
Stoffmenge des eingesetzten Substrats
Eintrag
ADH BVMO c (Cyclohexanol) Umsatza Produktbildunga
[U] [U] [mM] [%] [mg/ml]
1a 40 3.82 20 mM 97 2.20
1bb 40 3.82 20 mM 99 2.25
2 40 3.82 40 mM 97 4.41
3 40 3.82 60 mM 94 6.45
4 40 3.82 80 mM 36 3.21
5 40 3.82 100 mM 24 2.72
anach
1H-NMR und Auswaage bestimmt,
bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung
8. Experimenteller Teil
208
8.2.3.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 zur Inhibierung der BVMO ECS-MO1 durch
Cyclohexanon und das Produkt εεεε-Caprolacton (AAV 17)
Die Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung
des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des Cyclohexanons (41) als
Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden
zunächst in eine 1 ml fassende Küvette Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), in Phosphatpuffer gelöstes
Cyclohexanon (41, 300 mM) und eine Enzym-Lösung der BVMO ECS-MO1 (in Phosphatpuffer (pH 7.0,
50 mM)) zusammengegeben. Es wurde so viel Volumen der Cyclohexanon-Stammlösung (300 mM)
zugegeben, bis eine Konzentration von 10 mM bis 100 mM im Photometertest erreicht wurde. Bei
der Untersuchung der Inhibierung von ε-Caprolacton (53) wurde die Cyclohexanon-Konzentration auf
25 mM gehalten und so viel Volumen einer ε-Caprolacton-Stammlösung zugegeben, bis eine
ε-Caprolacton-Konzentration von 0.025 M bis 0.400 M erreicht wurde. Die Reaktion wurde
anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die Ergebnisse
sind für die Inhibierung durch Cyclohexanon (41) in Tabelle 77 und für die Inhibierung durch
ε-Caprolacton (53) in Tabelle 78 dargestellt.
Tabelle 77: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41)
Eintrag c (Cyclohexanon) [mM] relative Aktivität [%]
1 0 0
2 10 100
3 20 72
4 35 63
5 50 57
6 100 57
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
209
Tabelle 78: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53)
Eintrag c (εεεε-Caprolacton) [M] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 0.025 91
3 0.050 79
4 0.100 67
5 0.200 38
6 0.400 14
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8.2.3.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 zur Stabilität der BVMO ECS-MO1 (AAV 18)
Die Enzymaktivität der BVMO wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch
Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart von Cyclohexanon (41)
als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden
zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 725 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 125 μl einer Lösung
von Cyclohexanon (41) in Puffer (200 mM) und 100 μl einer Lösung der BVMO ECS-MO1 (3.82 U in
Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) bzw. einer mit Cyclohexanol (16) bzw. mit Cyclohexanon (41,
25 mM bis 100 mM) bzw. mit ε-Caprolacton (53, 0.1 M bis 1.0 M) versetzten Lösung der BVMO ECS-
MO1 (3.82 U in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird,
zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 μl einer
NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH
gemessen. Diese Messung wurde in mehreren definierten Zeitabständen innerhalb von 24 Stunden
durchgeführt. Die Ergebnisse sind für die Stabilität der BVMO ohne Zusatz in Tabelle 79, mit Zusatz
von verschiedenen Konzentrationen durch Cyclohexanol (16) in den Tabellen 80-82 mit Zusatz von
verschiedenen Konzentrationen durch Cyclohexanon (41) in den Tabellen 83-85 und mit Zusatz von
verschiedenen Konzentrationen ε-Caprolacton (53) in den Tabellen 86 und 87 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
210
Stabilität der BVMO ohne Zusatz
Tabelle 79: Stabilität der BVMO ohne Zusatz
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0.5 100
2 1.0 100
3 2.0 99
4 4.0 96
5 7.0 79
6 24.0 60
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an Cyclohexanol (16)
Tabelle 80: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanol (16)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 0.5 96
3 1.5 94
4 3.5 93
5 6.5 87
6 24.0 58
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Tabelle 81: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanol (16)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 102
3 3.0 101
4 7.0 87
5 24.0 72
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
211
Tabelle 82: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanol (16)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 96
3 2.5 93
4 4.0 89
5 7.0 76
6 24.0 39
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an Cyclohexanon (41)
Tabelle 83: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanon (41)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 102
3 2.0 89
4 7.0 83
5 24.0 48
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Tabelle 84: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanon (41)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 92
3 2.0 82
4 4.0 77
5 7.0 66
6 24.0 36
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
212
Tabelle 85: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanon (41)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 94
3 2.0 86
4 4.0 82
5 7.0 58
6 24.0 21
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an ε-Caprolacton (53)
Tabelle 86: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 99
3 3.0 97
4 5.0 88
5 7.0 82
6 24.0 67
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
Tabelle 87: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.25 M ε-Caprolacton (53)
Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]
1 0 100
2 1.0 84
3 2.0 74
4 4.0 57
5 8.0 32
6 24.0 8
Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.
8. Experimenteller Teil
213
8.2.4 Palladium-katalysierte Kreuzkupplung in Kombination mit einer
enzymatischen Reduktionsreaktion
8.2.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 zur Suzuki-Kreuzkupplung von
4‘-Iodacetophenon zur Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (AAV 19)
Es wurde eine Suspension aus 4 mol% Palladium(II)chlorid und
5 mol% TPPTS (105), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in
0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wurde
diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus
Natriumhydrogen-carbonat (1.0 mmol), 4'-Iodacetophenon (106,
0.4 mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0 bis 0.4 mmol) und in 5 ml
entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben.
Anschließend wurden nur in Kapitel 8.2.4.1.1 bis zu 100 mg HSA (human serum albumin) zugegeben.
Nach 5.5 bis 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm mit zuweilen punktueller
Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M
Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
8.2.4.1.1 Einfluss der Proteinkonzentration
Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinkonzentration wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es
wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol,
11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.
Nach 30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-
carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und Phenylboronsäure
(101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser
gegeben. Anschließend wurden kein bzw. 10 mg bis 100 mg HSA zugegeben. Nach 24 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure
angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind Tabelle 88 dargestellt.
8. Experimenteller Teil
214
Tabelle 88: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon
(106)
Eintrag HSA [g/l] Umsatz [%]
1 0 >95
2 1 >95
3 5 82
4 10 50
Abbildung 132: 1H-NMR-Spektrum der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit
Phenylboronsäure (101b) (Benchmark-Versuch)
8. Experimenteller Teil
215
Charakterisierung des entstehenden 4'-Phenylacetophenons (108) anhand des Eintrags 1 in
Tabelle 88:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 2.63 (s, 3H, H-C1), 7.39 (t, 3J = 7.20 Hz, 1H, H-C10), 7.46 (t,
3J = 7.40 Hz, 2H, H-C9, H-C9'), 7.61 (d, 3J = 6.80 Hz, 2H, H-C8, H-C8'), 7.67 (d, 3J = 8.80 Hz, 2H, H-C5, H-
C5'), 8.02 (d, 3J = 8.40 Hz, 2H, H-C4, H-C4')
8.2.4.1.2 Einfluss der Reaktionszeit
Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionszeit wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es wurde eine
Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg),
beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach
30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-
carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und Phenylboronsäure
(101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser
gegeben. Nach 5.5 bis 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde das Reaktions-
gemisch mit 2.5 M Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und
das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektros-
kopie bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 89 dargestellt.
Tabelle 89: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)
8. Experimenteller Teil
216
Eintrag Reaktionszeit [h] Umsatz [%]
1 5.5 89
2 24.0 >95
8.2.4.1.3 pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon
Die Beobachtung des pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es wurde
eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol,
11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.
Nach 30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-
carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und Phenylboronsäure
(101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser
gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm mit punktueller Proto-
kollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit, wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M
Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen werden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind Tabelle 90 dargestellt.
Umsatz: >95%
Tabelle 90: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)
Eintrag Zeit pH-Wert bei 24 h
Reaktionszeit pH-Wert bei 5.5 h
Reaktionszeit
1 IPA + NaHCO3 + 106 9.48 9.39
2 + 101b 9.30 9.25
3 mit Katalysator 0 h 8.54 8.56
4 2.0 h 8.18 8.24
5 4.0 h 8.31 8.48
6 5.5 h 8.79 8.74
7 7.0 h 8.80
8 24.0 h 9.94
8. Experimenteller Teil
217
8.2.4.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 für die Synthese des rac-Iodphenylethan-1-
ols durch Reduktion mit Natriumborhydrid (AAV 20)
Zur Synthese des racemischen Alkohols wurde 4’-Iodacetophenon (106,
3.0 mmol, 738.2 mg) in 20 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von
Natriumborhydrid (4.2 mmol, 158.9 mg) wurde 24 Stunden bei Raum-
temperatur gerührt. Die Lösung wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 7
eingestellt. Die Zugabe von 20 ml dest. Wasser führte zur Bildung von
weißem Niederschlag. Es wurde dreimal mit je 20 ml Dichlormethan
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt des rac-4‘-
Iodphenylethan-1-ols (rac-107) im Ölpumpenvakuum getrocknet.
Ausbeute: 93%
Abbildung 133: 1H-NMR-Spektrum der Natriumborhydrid-Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)
8. Experimenteller Teil
218
Charakterisierung des entstehenden racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ols (rac-107):
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.45 (d, 3J = 6.40 Hz, 3H, H-C1), 1.76 (br s, 1H, OH), 4.84 (q,
3J = 6.27 Hz, 1H, H-C2), 7.11 (d, 3J = 8.00 Hz, 2H, C4, H-C4'), 7.66 (d, 3J = 8.40 Hz, 2H, C5, H-C5')
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR-Spektroskopie) stimmen mit denen aus der Literatur
überein.[11,13]
8.2.4.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 für die Suzuki-Kupplung von
rac-4‘-Iodphenylethanol zur Synthese von rac-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV 21)
Es wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol) und
TPPTS (105, 0.020 mmol), beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-
ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach
30 Minuten wird diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension
aus Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol), rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-
ol (rac-107, 0.4 mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol) und
in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser
gegeben. Anschließend wurden nur in Kapitel 8.2.4.3.2 bis zu 100 mg HSA zugegeben. Nach 24 bis
48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5
angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.53 (d, 3J = 6.40 Hz, 3H, H-C1), 4.95 (q, 3J = 6.40 Hz, 1H, H-
C2), 7.33 (t, 3J = 7.40 Hz, 1H, H-C10), 7.43 (m, 4H, H-C4, H-C4', H-C9, H-C9'), 7.57 (m, 4H, H-C5, H-C5',
H-C8, H-C8')
8. Experimenteller Teil
219
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR-Spektroskopie) stimmen mit denen aus der Literatur
überein.[11,13]
8.2.4.3.1 Einfluss der Reaktionszeit
Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionszeit wurde gemäß AAV 21 durchgeführt. Es wurde eine
Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg),
beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.
Nach 30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-
carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107, 0.4 mmol, 99.2 mg) und Phenyl-
boronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem
dest. Wasser gegeben. Nach 24 bis 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das
Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde
abfiltriert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-
Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-
NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 91 dargestellt.
Tabelle 91: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol
(rac-107)
aWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
bWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung
Eintrag Reaktionszeit [h] Umsatz [%]
1a 24 75
1ba 24 69
2a 48 80
2bb 48 71
2cb 48 78
8. Experimenteller Teil
220
8.2.4.3.2 Einfluss der Proteinmenge
Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinmenge wurde gemäß AAV 21 durchgeführt. Es wurde eine
Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg),
beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.
Nach 30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-
carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107, 0.4 mmol, 99.2 mg) und Phenyl-
boronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem
dest. Wasser gegeben. Anschließend wurden kein bzw. 10 bis 100 mg HSA zugegeben. Nach
48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5
angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die
Ergebnisse sind Tabelle 92 dargestellt.
Tabelle 92: Einfluss der eingesetzten Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-
Iodphenylethanol (rac-107)
aWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,
bWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung,
cWiederholungsversuch zu 3a
zur Validierung
Eintrag HSA [g/l] Umsatz [%]
1a 0 80
1ba 0 71
1ca 0 78
2a 1 75
2bb 1 71
3a 5 51
3bc 5 51
4 10 11
8.2.4.4 Allgemeine Arbeitsvorschrif
Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat
gelöst. Anschließend wurden Keton
wurde so viel Rohextrakt der LK
2.5 g/l erreicht wurde. Die Reaktion w
48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH
während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt
wurde mittels chiraler HPLC bestimmt.
8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von
4‘-Iodacetophenon
Die Synthese von
22. Zunächst w
5 ml dest. Wasser und 5
Iodacetophenon (
zugegeben. Danach w
konzentration
Enzymkonzentration) bzw. 581 µl (entsprechen
der LK-ADH dazu pipettiert. Die Reaktion w
18.6 mg) gestartet. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller
Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum
getrocknet. Der ee-Wert wurde
0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 9
HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):
tR(S) = 17.3 Minuten
tR(R) = 18.5 Minuten
ee-Wert: >99%
8. Experimenteller Teil
Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 für die biokatalytische Reduktion (AAV
Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol) in 5 ml dest. Wasser und 5
rden Keton (0.4 mmol) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach
so viel Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert, dass eine Proteinkonzentration von 1.0 g/l bis
. Die Reaktion wurde durch Zugabe von NADP+ (0.025 mmol
Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH
ährend der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet
wurde mittels chiraler HPLC bestimmt.
8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von
Die Synthese von (R)-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107)
. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol
ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst. Anschließend w
Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und 1 mM
zugegeben. Danach wurden 233 µl (entsprechen
konzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK
581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l
ADH dazu pipettiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors
Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller
Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
ngsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum
mittels chiraler HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v),
Die Ergebnisse sind Tabelle 93 dargestellt.
H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):
8. Experimenteller Teil
221
für die biokatalytische Reduktion (AAV 22)
ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol
Magnesiumchlorid zugegeben. Danach
konzentration von 1.0 g/l bis
mmol) gestartet. Nach
Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der ee-Wert
8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von
) erfolgte gemäß AAV
Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg) in
ml Isopropanol gelöst. Anschließend wurden 4'-
1 mM Magnesiumchlorid
µl (entsprechen einer Protein-
) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml
einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt
des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol,
Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller
Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
ngsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum
H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v),
8. Experimenteller Teil
222
Tabelle 93: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-
Iodacetophenon (106)
Eintrag Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]
1a 1.0 >99 97
1ba 1.0 >99 97
2a 2.5 >99 97
2bb 2.5 >99 95
aWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
bWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung
8.2.4.4.2 pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon
Die Beobachtung des pH-Verlaufs der biokatalytischen Reduktion von 4'-Iodacetophenon (106)
wurde gemäß AAV 22 durchgeführt. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg)
in 5 ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst. Anschließend wurden 4'-Iodacetophenon (106,
0.4 mmol, 98.4 mg) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach wurden 233 µl (entsprechen
einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.
581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert.
Die Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol, 18.6 mg) gestartet. Nach
48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts
während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
8. Experimenteller Teil
223
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Die pH-
Verläufe der Versuche 1a und 2a aus Tabelle 93 sind in Tabelle 94 dargestellt.
Tabelle 94: pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei
unterschiedlichen Mengen von LK-ADH
Eintrag Zeit pH-Wert bei 1.0 g/l
Proteinkonzentration pH-Wert bei 2.5 g/l
Proteinkonzentration
1 IPA + NaHCO3 + 106 9.41 9.49
2 mit Enzym 9.06 8.74
3 mit NADP+ 8.66 8.40
4 2.0 h 9.11 8.80
5 4.0 h 9.44 9.19
6 4.75 h 9.52 9.35
7 21.0 h 10.05 9.77
8 24.0 h 10.07 9.81
9 26.0 h 10.09 9.86
10 45.0 h 10.18 10.13
11 48.0 h 10.17 10.14
8.2.4.4.3 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-
Phenylacetophenon
Die Synthese von (R)-4‘-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) erfolgte gemäß
AAV 22. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol,
84.0 mg) in 5 ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst.
Anschließend wurden 4'-Phenylacetophenon (108, 0.4 mmol,
78.5 mg) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach wurden
233 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l)
Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw. 581 µl
8. Experimenteller Teil
224
(entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol, 18.6 mg) gestartet. Nach
48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts
während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der ee-Wert
wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
bestimmt. Nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel mit Cyclohexan und Ethylacetat
als Lösungsmittel im Verhältnis 4:1 (v/v) wurde das Produkt als weißer Feststoff erhalten. Die
Ergebnisse sind Tabelle 95 dargestellt.
Umsatz: 67%
Isolierte Ausbeute (sauberes Produkt): 51% (40 mg, 0.202 mmol)
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):
tR(S) = 15.0 Minuten
tR(R) = 16.3 Minuten
ee-Wert: >99%
Tabelle 95: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von
4‘-Phenylacetophenon (108)
Eintrag Protein
1a
1ba
2a
2bb
aWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,
8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift
(R)-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV
Es
TPPTS (
(
w
bzw
NADP
bestehend aus Natriumhydrogencarbonat
acetophenon (106, 0.4 mmol) und Phenylboronsäure (
in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5
Rühren bei Raumtemperatur, 400
Reaktionszeit wurde mit 2.5 M Essigsäure auf pH
10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen w
getrocknet. Das Lösungsmittel w
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz w
Wert wird mittels chiraler HPLC (Chiralpak®
bestimmt.
8.2.4.5.1 Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem
Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinmenge auf die Tandem
durchgeführt. Zuerst wurde eine Suspension aus
TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg)
8. Experimenteller Tei
Proteinkonzentration [g/l] ee [%]
1.0 >99
1.0 >99
2.5 >99
2.5 >99
Wiederholungsversuch zu 1a zur Validierung, bWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung
8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 für die Tandem-Reaktion zur Synthese von
ol (AAV 23)
Es wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol
TPPTS (105, 0.020 mmol), beides bezogen auf 4‘
(106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.
wurde diese, ebenso wie für eine Proteinkonzentration von
bzw. 2.5 g/l) benötigte Menge an Rohextrakt der LK
NADP+ (0.025 mmol) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension
bestehend aus Natriumhydrogencarbonat
mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol) und 1 mM
ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH
M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Anschließend w
ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie
Wert wird mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/
Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion
chung zum Einfluss der Proteinmenge auf die Tandem-Reaktion wurde
eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8
mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106)
8. Experimenteller Teil
225
Umsatz [%]
50
56
64
67
Reaktion zur Synthese von
Palladium(II)chlorid (0.016 mmol) und
, beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon
ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten
für eine Proteinkonzentration von 1.0 g/l
) benötigte Menge an Rohextrakt der LK-ADH und bis
zu einer parallel dazu angesetzten Suspension
(1.0 mmol), 4'-Iod-
mM Magnesiumchlorid
ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden
rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts während der
. Anschließend wurde dreimal mit je
rden über Magnesiumsulfat
am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Spektroskopie bestimmt. Der ee-
IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
Reaktion
Reaktion wurde gemäß AAV 23
(0.016 mmol, 2.8 mg) und
), in 0.5 ml entgasten
8. Experimenteller Teil
226
dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen einer
Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.
581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und NADP+
(0.025 mmol, 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus
Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und
Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde
mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum
getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie und der ee-Wert mittels chiraler HPLC
(Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt (Tabelle 96).
HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):
tR(S) = 13.0 Minuten
tR(R) = 13.8 Minuten
ee-Wert für (R)-107: >99%
ee-Wert für (R)-109: >99%
Tabelle 96: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion
8. Experimenteller Teil
227
Eintraga Protein-
konzentration [g/l]
Umsatz zu 108
[%]
Umsatz zu (R)-107
[%]
Umsatz zu (R)-109
[%] ee [%]
Gesamtumsatz [%]
1 1.0 42 23 35 >99 >95
2 2.5 6 52 24 >99 >95
8.2.4.5.2 pH-Verlauf der Tandem-Reaktion
Die Beobachtung des pH-Verlaufs der Tandem-Reaktion von 4'-Iodacetophenon (106) wurde gemäß
AAV 23 durchgeführt. Zuerst wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg)
und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml
entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen
einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.
581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und NADP+
(0.025 mmol, 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus
Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und
Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und
punktueller Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde mit 2.5 M Essigsäure auf
pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz
wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt und der ee-Wert mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB,
Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm). Die pH-Verläufe des Versuchs 1 aus Tabelle 96
ist in Tabelle 97 und des Versuchs 2 aus Tabelle 96 ist in Tabelle 98 dargestellt.
ee-Wert für (R)-107: >99%
ee-Wert für (R)-109: >99%
8. Experimenteller Teil
228
Tabelle 97: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l
Eintrag Zeitablauf pH-Wert
1 nach Zugabe von IPA + NaHCO3 + 106 9.34
2 nach Zugabe des Katalysators 9.00
3 nach Zugabe des Enzyms 8.80
4 nach Zugabe von NADP+ 8.68
5 2.0 h 8.46
6 3.5 h 8.69
7 5.0 h 8.74
8 24.0 h 8.39
9 25.75 h 8.83
10 28.0 h 9.04
11 30.0 h 9.15
12 48.0 h 9.38
Tabelle 98: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l
Eintraga Zeitablauf pH-Wert
1 nach Zugabe von IPA + NaHCO3 + 106 9.42
2 nach Zugabe des Katalysators 8.50
3 nach Zugabe des Enzyms 8.39
4 nach Zugabe von NADP+ 8.23
5 2.0 h 8.84
6 4.0 h 8.64
7 6.0 h 8.61
8 22.0 h 8.57
9 24.0 h 8.82
10 28.0 h 8.98
11 46.0 h 9.15
12 48.0 h 9.16
8. Experimenteller Teil
229
8.2.4.5.3 Einfluss des Cofaktors
Die Untersuchung zum Einfluss des Cofaktors auf die Tandem-Reaktion erfolgte gemäß AAV 23.
Zuerst wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105,
0.020 mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest.
Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen einer
Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.
581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und. NADP+ (0 bis
0.025 mmol bzw. 0 bis 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus
Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und
Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde
mit 2.5 M Essigsäure auf etwa pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR bestimmt. Der Umsatz wurde durch
1H-NMR-Spektroskopie bestimmt und der ee-Wert mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB,
Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm). Die Ergebnisse sind Tabelle 99 dargestellt.
Tabelle 99: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion
8. Experimenteller Teil
230
Eintrag NADP+
[Äq.]
Protein-konzentration
[g/l]
Umsatz zu 108
[%]
Umsatz zu (R)-107
[%]
Umsatz zu (R)-109 [%]
Gesamtumsatz [%]
1 0 1.0 >95 n.d. n.d. >95
2 0.06 1.0 42 23 35 >95
3 0 2.5 64 12 24 77
4 0.06 2.5 6 52 24 >95
HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):
tR(S) = 13.0 Minuten
tR(R) = 13.8 Minuten
ee-Wert für (R)-107: >99%
ee-Wert für (R)-109: >99%
9. Literaturverzeichnis
231
9. Literaturverzeichnis
[1] K. Buchholz, V. Kasche, U. T. Bornscheuer, Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCH,
Weinheim, 2005.
[2] Umweltbundesamt: Weiße Biotechnologie – Ökonomische und ökologische Chancen,
Dubbert/Heine, Berlin 2006.
http://www.umweltbundesamt.de/uba-info-medien/dateien/3260.htm, Stand 17.07.2013.
[3] T. Becker, D. Breithaupt, H. W. Doelle, A. Fiechter, M. Griensven, C. Kasper, S. Lütz, R.
Pörtner, H.-G. Schlegel, D. Sell, S. Shimizu, F. Stahl, K. Suck, R. Ulber, J. Wegener, K. Würges,
H. Yamada, H. Zorn, Ullmann´s Biotechnology and Biochemical Engineering, Band 1, Wiley-
VCH, Weinheim, 2007.
[4] a) K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 6. Auflage, Springer, Berlin Heidelberg,
2011; b) K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 5. Auflage, Springer, Berlin, 2004.
[5] A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, 2. komplett überarbeitete
und erweiterte Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2006.
[6] R. A. Sheldon, I. Arends, U. Hanefeld, Green Chemistry and Catalysis, Wiley-VCH, Weinheim,
2007.
[7] ExPASy Bioinformatics Resource Portal: http://enzyme.expasy.org/EC/2.6.1.2, Stand 5.9.13.
[8] ExPASy Bioinformatics Resource Portal: http://enzyme.expasy.org/EC/6.3.3.3, Stand 5.9.13.
[9] K. Baer, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2008.
[10] E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew. Chem. 2008, 120, 9693-9696; Angew. Chem. Int. Ed.
2008, 47, 9551-9554.
[11] S. Borchert, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,
2008.
[12] K. Baer, M. Kraußer, E. Burda, W. Hummel, A. Berkessel, H. Gröger, Angew. Chem. Int. Ed.
2009, 48, 9355–9358; Angew. Chem. 2009, 121, 9519-9522.
[13] E. Burda, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Erlangen, 2010
[14] M. Kraußer, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2011.
[15] K. Baer, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2011.
[16] G. Rulli, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2009.
[17] M. Kraußer, T. Winkler, N. Richter, S. Dommer, A. Fingerhut, W. Hummel, H. Gröger,
ChemCatChem 2011, 3, 293-296.
[18] K. Tenbrink, M. Seßler, J. Schatz, H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 2363-2367.
[19] P. Anastas, J. C. Warner, Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press,
Oxford, 1998.
9. Literaturverzeichnis
232
[20] P. Anastas, L. G. Heine, T. C. Williamson, Green Chemical Syntheses and Processes, American
Chemical Society, Washington DC, 2000.
[21] H.-J. Arpe, Industrielle Organische Chemie, 6. Auflage Wiley-VCH, Weinheim, 2007.
[22] B. Fabry, Chemie in unserer Zeit 1991, 4, 214-222.
[23] I. T. Horváth, P. T. Anastas, Chem. Rev. 2007, 107, 2169-2173.
[24] P. A. Wender, M. P. Croatt, B. Witulski, Tetrahedron 2006, 62, 7505-7511.
[25] T. Schiffer, G. Oenbrink, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th Edition, 2005,
Electronic Release, Wiley-VCH.
[26] Deutsche Apothekerzeitung: Odanacatib zur Therapie der Osteoporose,
http://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/pharmazie/news/2010/12/21/odanacatib-zur-
therapie-der-osteoporose.html, Stand 15.12.10, aufgerufen am 9.7.13.
[27] S. C. Maurer, K. Kühnel, L. A. Kaysser, S. Eiben, R. D. Schmid, V. B. Urlacher, Adv. Synth. Catal.
2005, 347, 1090-1098.
[28] A. W. Munro, J. G. Lindsay, Mol. Microbiol. 1996, 20, 1115-1125.
[29] E. T. Farinas, U. Schwaneberg, A. Glieder, F. H. Arnold, Adv. Synth. Catal. 2001, 343, 601-606.
[30] P. C. Cirino, F. H. Arnold, Adv. Synth. Catal., 2002, 344, 932-937.
[31] L. O. Narhi, A. J. Fulco, J. Biol. Chem. 1987, 262, 6683-6690.
[32] D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167-
171.
[33] S. C. Maurer, H. Schulze, R. D. Schmid, V. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 802-810.
[34] A. Glieder, E. T. Farinas, F. H. Arnold, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 1135-1139.
[35] A. Celik, D. Sperandio, R. E. Speight, N. J. Turner, Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2688-2690.
[36] W. Kaim, B. Schwederski, Bioanorganische Chemie, 3. Auflage, Teubner Verlag, Stuttgart,
2004.
[37] S. J. Lippard, J. M. Berg, Bioanorganische Chemie, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1995.
[38] I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A. M. Stock, S. A. Maves, D. E. Benson, R. M. Sweet, D.
Ringe, G. A. Petsko, S. G. Sligar, Science 2000, 287, 1615-1622.
[39] P. C. Cirino, F. H. Arnold, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 3299-3301.
[40] Dissertation von S. Tatzel, Modellierung von Cytochrom P450-Monooxygenasen, Stuttgart,
2008.
[41] S. S. Boddupalli, R. W. Estabrook, J. A. Petersen, J. Biol. Chem. 1990, 265, 4233-4239.
[42] U. Schwaneberg, C. Schmidt-Dannert, J. Schmitt, R. D. Schmid, Anal. Biochem. 1999, 269, 359-
366.
9. Literaturverzeichnis
233
[43] U. Schwaneberg, C. Otey, P. C. Cirino, E. Farinas, F. H. Arnold, J. Biomol. Screening 2001, 6,
111-117.
[44] W. Adam, Z. Lukacs, C. R. Saha-Möller, B. Weckerle, P. Schreier, Eur. J. Org. Chem. 2000,
2923-2926.
[45] K. Hofstetter, J. Lutz, I. Lang, B. Witholt, A. Schmid, Angew. Chem. 2004, 116, 2215-2218;
Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2163-2166.
[46] E. T. Farinas, M. Alcalde, F. Arnold, Tetrahedron 2004, 60, 535-528.
[47] U. Schwaneberg, A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, R. D. Schmid, J. Chromatogr. A 1999, 848,
149-159.
[48] J. Kuper, T. S. Wong, D. Roccatano, M. Willmanns, U. Schwaneberg, J. Am. Chem. Soc. 2007,
129, 5786-5787.
[49] W. Adam, Z. Lukacs, D. Harmsen, C. R. Saha-Möller, P. Schreier, J. Org. Chem. 2000, 65, 878-
882.
[50] W. Adam, Z. Lukacs, C. Kahle, C. R. Saha-Möller, P. Schreier, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001, 11,
377-385.
[51] M. W. Peters, P. Meinhold, A. Glieder, F. H. Arnold, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13442-
13450.
[52] Y. Watanabe, S. Laschat, M. Budde, O. Affolter, Y. Shimada, V. B. Urlacher, Tetrahedron 2007,
63, 9413-9422.
[53] E. Weber, A. Seifert, M. Antonovici, C. Geinitz, J. Pleiss, V. B. Urlacher, Chem. Commun. 2011,
47, 944-946.
[54] F. E. Zilly, J. P. Acevedo, W. Augustyniak, A. Deege, U. W. Häusig, M. T. Reetz, Angew. Chem.
2011, 123, 2772-2776; Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 2720-2724.
[55] S. Kardinahl, D. Rabelt, M. Reschke, Chem. Ing. Techn. 2006, 78, 209-217.
[56] A. Streitwieser, C. H. Heathcock, E. M. Kosower, Organische Chemie, 2. Auflage, VCH,
Weinheim, 1994.
[57] R. W. Estabrook, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 338, 290-298.
[58] A. Rentmeister, F. H. Arnold, R. Fasan, Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 26-28.
[59] H.-J. Böhm, D. Banner, S. Bendels, M. Kansy, B. Kuhn, K. Müller, U. Obst-Sander, M. Stahl,
ChemBioChem 2004, 5, 637-643.
[60] A. Dennig, N. Lülsdorf, H. Liu, U. Schwaneberg, Angew. Chem. 2013, 125, 8617-8620. Angew.
Chem. Int. Ed. 2013, 52, 8459-8462.
[61] A. Dennig, J. Marienhagen, A. J. Ruff, L. Guddat, U. Schwaneberg, ChemCatChem 2012, 4,
771-773.
9. Literaturverzeichnis
234
[62] O. Shoji, T. Kunimatsu, N. Kawakami, Y. Watanabe, Angew. Chem. 2013, 125, 6738-6742.
[63] C. Filling, K. D. Berndt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E. Nordling, J. Biol. Chem. 2002,
277, 25677-25684.
[64] N. H. Schlieben, K. Niefind, J. Müller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 2005,
349, 801-813.
[65] H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker,
A. May, Angew. Chem. 2006, 118, 5806-5809; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5677-5681.
[66] H. Jörnvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzales-Duarte, J. Jeffery, D. Ghosh,
Biochemistry 1995, 17, 487-492.
[67] W. Blankenfeldt, I. D. Kerr, M. F. Giraud, H. J. McMiken, G. Leonard, C. Whitfield, P. Messner,
M. Graninger, J. H. Naismith, Structure 2002, 10, 773-786.
[68] C. Filling, K. D. Berndt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E. Nordling et al., J. Biol. Chem.
2002, 277, 25677-25684.
[69] A. Weckbecker, Dissertation, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Jülich, 2005.
[70] M. T. Musser, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Elektronische Fassung, Wiley-
VCH, Weinheim, 2012.
[71] T. Schiffer, G. Oenbrink, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. Auflage,
Elektronische Fassung, Wiley-VCH, 2000.
[72] J. Teles, B. Rößler, R. Pinkos, T. Genger, T. Preiss (BASF SE), Eur. Patent EP 1663932, 2008.
[73] J. Teles, B. Rössler, R. Pinkos, G. Tebben, C. Müller (BASF SE), Eur. Patent EP 2041060, 2009.
[74] R. Fasan, M. M. Chen, N. C. Crook, F. H. Arnold, Angew. Chem. 2007, 119, 8566-8570; Angew.
Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8414-8418.
[75] R. Fasan, Y. T. Meharenna, C. D. Snow, T. L. Poulos, F. H. Arnold, J. Mol. Biol. 2008, 383, 1069-
1080.
[76] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Butan
[77] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Oktan
[78] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von 1-Oktanol
[79] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von DL-2-Oktanol
[80] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von DL-3-Oktanol
[81] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von 4-Oktanol
[82] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von Pyridin
[83] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Hexan
[84] Merck Millipore: Sicherheitsdatenblatt Cyclooktan
[85] Merck Millipore: Sicherheitsdatenblatt Cyclohexan
9. Literaturverzeichnis
235
[86] C. A. Müller, B. Akkapurathu, T. Winkler, S. Staudt, W. Hummel, H. Gröger, U. Schwaneberg,
Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 1787-1798.
[87] E. Burda, T. Reß, T. Winkler, C. Giese, X. Kostrov, T. Huber, W. Hummel, H. Gröger, Angew.
Chem. 2013, 125, 9493-9496; Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 9323-9326.
[88] Enzymicals AG, Biocatalyst catalog 2013.
[89] A. Kirschner, U. T. Bornscheuer, Angew. Chem. 2006, 118, 7161-7163; Angew. Chem. Int. Ed.
2006, 45, 7004-7006.
[90] J. Rehdorf, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer, Angew. Chem. 2010, 122, 4609-4611;
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 4506-4508.
[91] T. Schubert, Dissertation, Forschungszentrum Jülich, Jülich, 2002.
[92] J. Zhou, Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, 2010.
[93] M. Labet, W. Thielemans, Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 3484-3504.
[94] T. Laue, A. Plagens, Namen- und Schlagwortreaktionen der Organischen Chemie, 5. Auflage,
Vieweg+Teubner, Wiesbaden, 2006.
[95] Sigma Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von Peressigsäure
[96] D. E. Torres Pazmiño, H. M. Dudek, M. W. Fraaije, Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 138-144.
[97] The European Bioinformatics Institute – Protein Data Bank in Europe, aufgerufen am 10.3.14:
http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/PDBeXplore/ligand/?ligand=FAD#
[98] M. T. Reetz, F. Daligault, B. Brunner, H. Hinrichs, A. Deege, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43,
4078-4081.
[99] G. de Gonzalo, M. D. Mihovilovic, M. W. Fraaije, ChemBioChem 2010, 11, 2208-2231.
[100] http://www.apotheken-umschau.de/Sodbrennen/Sodbrennen--Ursachen-
Speiseroehrenentzuendung-Oesophagitis-55050_4.html, Stand 23.1.14
[101] Infomed Online: E. Gysling, A. de Luca – Esomeprazol in pharma-kritik Nr.11/2001.
http://www.infomed.ch/pk_template.php?pkid=272
[102] Inzwischen wurde auch von der Arbeitsgruppe BORNSCHEUER über ein weiteres
Herstellungsverfahren von ε-Caprolacton auf dem Weg der Doppeloxidation ausgehend von
Cyclohexanol berichtet: H. Wulf, H. Mallin, U.T. Bornscheuer, Enzyme Microb. Technol. 2013,
53, 283-287.
[103] Die im Rahmen dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten zur Herstellung von ε-Caprolacton
(Kapitel 4.4) erfolgten unabhängig von denen in der Literaturstelle [102] beschriebenen
Arbeiten.
[104] ChemieTek® Expertise & Experience, aufgerufen am 24.3.2014:
http://www.chemietek.com/products.aspx?pid=109
9. Literaturverzeichnis
236
[105] N. Miyaura, A. Suzuki, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1979, 19, 866-867.
[106] N. Miyaura, K. Yamada und A. Suzuki, Tetrahedron Lett. 1979, 20, 3437-3440.
[107] A. O. King, N. Okukado, E.-i. Negishi, Chem. Comm. 1977, 19, 683-684.
[108] D. Milstein, J. K. Stille, J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 3636-3638.
[109] K. Sonogashira, Y. Tohda, N. Hagihara, Tetrahedron Lett. 1975, 16, 4467-4470.
[110] R. F. Heck, J. P. Nolley, Jr., J. Org. Chem. 1972, 37, 2320-2322.
[111] H. A. Dieck, F. R. Heck, J. Organomet. Chem. 1975, 93, 259-263.
[112] K. C. Nikolaou, P. G. Bulger, D. Sarlah, Angew. Chem. 2005, 117, 4516-4563; Angew. Chem.
Int. Ed. 2005, 44, 4442-4489.
[113] Nobelprize.org – The Official Website of the Nobel Prize:
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/lists/year/index.html?year=2010&images=yes,
aufgerufen am 22.8.13.
[114] R. Brückner, Reaktionsmechanismen, 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2007.
[115] A. Suzuki, Acc. Chem. Res. 1982, 15, 178-184.
[116] N. K. Garg, D. D. Caspi, B. M. Stoltz, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9552-9553.
[117] P. D. Hobbs, V. Upender, J. Liu, D. J. Pollart, D. W. Thomas, M. I. Dawson, Chem. Commun.
1996, 923-924.
[118] R. R. Knowles, J. Carpenter, S. B. Blakey, A. Kayano, I. K. Mangion, C. J. Sinz, D. W. C.
MacMillan, Chem. Sci. 2011, 2, 308-311.
[119] N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 1995, 95, 2457-2483.
[120] K. Sonogashira, J. Organomet. Chem. 2002, 653, 46-49.
[121] F. M. Bickelhaupt, T. Ziegler, P. von Ragué Schleyer, Organometallics 1995, 14, 2288-2296.
[122] A. Diefenbach, F. M. Bickelhaupt, J. Chem. Phys. 2001, 115, 4030-4040.
[123] K. Albert, P. Gisdakis, N. Rösch, Organometallics 1998, 17, 1608-1616.
[124] M. Jakt, L. Johannissen, H. S. Rzepa, D. A. Widdowson, R. Wilhelm, J. Chem. Soc., Perkin
Trans. 2, 2002, 576-581.
[125] O. Reiser, Chem. unserer Zeit 2001, 2, 94-100.
[126] L. J. Goossen, D. Koley, H. L. Hermann, W. Thiel, Organometallics 2005, 24, 2398-2410.
[127] S. R. Chemler, D. Trauner, S. J. Danishefsky, Angew. Chem. 2001, 113, 4676-4701; Angew.
Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4544-4568.
[128] C. Dupuis, K. Adiey, L. Charruault, V. Michelet, M. Savignac, J.-P. Genêt, Tetrahedron Lett.
2001, 42, 6523-6526.
[129] C. Delhomme, D. Weuster-Botz, F. E. Kühn, Green Chem. 2009, 11, 13-26.
9. Literaturverzeichnis
237
[130] R. W. Armstrong, J.-M. Beau, S. H. Cheon, W. J. Christ, H. Fujioka, W.-H. Ham, L. D. Hawkins,
H. Jin, S. H. Kang, Y. Kishi, M. J. Martinelli, W. W. McWhorter Jr., M. Mizuno, M. Nakata, A. E.
Stutz, F. X. Talamas, M. Taniguchi, J. A. Tino, K. Ueda, J.-i. Uenishi, J. B. White, M. Yonaga,
J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 7525-7530.
[131] S. Borchert, geplante Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
[132] W. Hummel, M.-R. Kula (FZ Jülich GmbH), EP 456107; 1991.
[133] A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotrans. 2006, 24, 380-389.