Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia

Taller 1. RAPDs, gel de poliacrilamida y tinción con nitrato de plata.

Leopoldo Arrieta VIolet

2014 (1)

Consulta éstas técnicas de Biología Molecular, para responder el siguiente taller.

1. Defina con sus propias palabras la técnica RAPD:

La técnica de RAPD es una variación de la técnica de PCR, en la cual se usan cebadores cortos y aleatorios éstos, con la tarea de hibridar múltiples loci en el genoma para generar productos del espectro de amplificación, que son característicos de la cadena molde, y usados como potenciales marcadores moleculares.

2. Método (RAPD)

Reactivos: MgCl2, dNTPs, buffer de PCR (pH), H2O, tampón,

Materiales: DNA objeto, primer, DNA Taq polimerasa, micropipetas para RAPDs.

Equipos: Nevera y congelador, campana de flujo laminar, centrífuga, termociclador, fuentes de alimentación, placa calefactora o microondas, medidor de pH, las unidades de electroforesis en gel, transiluminador UV.

3. Método (gel de poliacrilamida)

Reactivos: Agua desionizada, amortiguador superior,SDS, TEMED, persulfato de amonio, Amortiguador de la cámara (solución concentrada 10x 12 g Tris; 57,6 g glicina; 4 g SDS; disolver en ~300 ml de agua),

Materiales: Solución de monómeros de acrilamida, vidrios separados por reglitas de teflón que determinan el grosor del gel; peine para formar los hoyos para muestras; bloque de plástico para ensamblar los vidrios; base para realizar el chorreo del gel; núcleo de la cámara de electroforesis con los electrodos

Equipos: Transiluminador, Cámara fotográfica, Fuente de Poder.

4. Método (TInción de Nitrato de Plata y visualización)

Reactivos: Solución Fijadora (Metanol 50%, Acido acético glacial 12%, Formaldehido 37% 25 µL/50 mL): Para un gel de 1-1.5 mm preparar un volumen final de 25 mL (lo necesario para que cubra por completo el gel); agregando 10 mL de etanol, 2.5 mL de Ac. Acético y aforar hasta 25 mL con agua MiliQ, al momento de utilizarla agregar 12.5 µL de formaldehído, Solución Sensibilizadora (Etanol abs. 30%, Acetato de sodio an. 6.8%, Tiosulfato de sodio 0.2%, Glutaraldehido 25%, 500 µL/100 mL): Para 25 mL agregar 7.5 mL de etanol, 1.7 gr de acetato de sodio anhidro, 0.05 gr de tiosulfato de sodio y 125 µL de glutaraldehído, Solución Plata (Nitrato de plata 0.25%, Formaldehido 37%, 40 µL/100 mL): Pesar 0.0625 gr de nitrato de plata y disolver en 25 mL de agua MiliQ, añadir 15 µL de formaldehído al momento de usarse. Cubrirse de la luz, Solución Reveladora (Carbonato de sodio anhidro 2.5%, Formaldehido 37%, 20 µL/100 mL): Pesar 0.625 gr de carbonato de sodio y disolver en 25 mL de agua MiliQ. Añadir 5 µL de formaldehído al momento de revelar. Esta solución tiene una estabilidad de 10 min, aprox. Agregar 1 cristal de tiosulfato de sodio para aumentar la sensibilidad, Solución Stop (NaEDTA 1.5%): Pesar 0.375 gr de NaEDTA y disolver en 25 mL de agua MiliQ. Solución Preservadora (Etanol Absoluto 30%, Glicerol 4%): Agregar 7.5 mL de etanol, 1 mL de glicerol y aforar hasta 25 mL con agua MiliQ, Solución de Lavados: Se recomienda utilizar Etanol 20 - 50% (para evitar que se hinche el gel).

Materiales: Muestra de DNA.

Equipos: Cámara fotográfica y Transiluminador.

5. ¿Cuáles son los pasos básicos de la tinción con plata?, defínalos brevemente.

Una vez finalizada la electroforesis, retirar el gel de los vidrios y colocarlo en un recipiente que le permita permanecer extendido, se pueden realizar 2-3 enjuagues con la solución de lavado y posteriormente adicionar cada una de la soluciones como se indica a continuación:

Solución fijadora: Agregar el formaldehído a la solución fijadora, homogenizar y cubrir completamente gel. Incubar en agitación constante al menos 30 min. Es recomendable dejarlo toda la noche.

LAVADOS: Realizar 3 lavados rápidos con etanol al 50%. Solución Sensibilizadora: Se agrega el glutaraldehido a la solución sensibilizadora y

se cubre el gel durante 30 minutos. LAVADOS: Se realizan 3 lavados con etanol al 20%, 10 minutos cada uno. IMPREGNADO CON AgNO3: Se agrega el formaldehido a la solución de nitrato de

plata y se cubre el gel durante 20-30 minutos (dependiendo del grosor del gel), protegiendo en todo momento de la luz.

LAVADOS: Realizar dos lavados rápidos con etanol al 20%, de 20 seg c/u para quitar exceso de la solución anterior.

Solución Reveladora: Se agrega el formaldehído a la solución de revelado y se cubre el gel. Se debe dejar el tiempo suficiente para que aparezcan bandas de 3-10 min

una vez que aparecen con la intensidad deseada retirar de inmediato para evitar fondo.

LAVADOS: Realizar un lavado rápido (20 seg) con etanol al 20% para quitar el exceso de la solución anterior.

Solución STOP: Se cubre el gel con esta solución durante 10 min con agitación constante (se puede usar la solución fijadora 1).

LAVADOS: Se hacen 3 lavados con etanol 50% de 1 min c/u. Solución de Almacenamiento: Para secar el gel se cubre con esta solución al menos

30 min. Se puede dejar largos periodos.6. Procedimiento: Diagrama de Flujo del proceso completo.

6. Al realizar un gel de poliacrilamida, ¿qué sucede si no se le agrega Temed, ni Persulfato de amonio), ¿Cuál es la función de estos reactivos?

La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice, sin los reactivos el gel no tendría las propiedades de tamiz molecular esperadas y las muestras ni siquiera podrían correr.

7. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica RAPDs?

Ventajas Desventajas

No requiere información preliminar sobre la secuencia de DNA a estudiar, por lo tanto no requiere un diseño específico de los primers.

Casi todos los marcadores RAPD son dominantes. Es decir que los fragmentos de DNA amplificados fueron de locus heterocigotos (1 copia) u homocigotos (2 copias)

En comparación con técnicas previas, es efectivo en la obtención de marcadores moleculares, en un corto periodo

La PCR es una reacción enzimática, por lo tanto, la calidad y la concentración del DNA molde, la concentración de los componentes de la PCR y las condiciones de ciclado pueden influenciar el resultado. Así, la técnica de RAPD es muy dependiente del ajuste de los protocolos que la hace reproducible.

El costo unitario por ensayo es bajo comparado con otras tecnologías de marcadores moleculares.

Puede que los desajustes entre el primer y la cadena de DNA den como resultado la ausencia de productos en la PCR, o disminuir la cantidad de los mismos, haciendo los resultados difíciles de interpretar.

.Requiere pocas cantidades de DNA, algo cercano a 10ng por reacción.

Escasez de información previa de los productos de la amplificación.

Puede ser automatizada. La técnica tiene problemas de reproducibilidad, es sensible a los cambio en la calidad del DNA y los componentes y condiciones de la PCR,

Produce un alto número de fragmentos que pueden ser amplificados.

para asegurar su efectividad se deben definir bien algunas variables en particular las concentraciones de ADN.

Los primers aleatorios pueden ser adquiridos fácilmente.

8. Nombre 4 diferencias y 4 similitudes que la técnica RAPDs comparta con la técnica de PCR.

RAPDs PCR

La secuencia que va a ser amplificada es desconocida.

Los cebadores se hibridarán en un loci particular, previamente conocidos.

El primer es diseñado con una secuencia arbitraria.

Se requiere que los primer sean diseñados con una secuencia específica, según el estudio.

Se necesita conocimiento previo de la secuencia a estudiar.

facilita el estudio de poblaciones ya que permiten estimar variabilidad genotípica entre muestras muy parecidas

por la unión del primer específico a lugares estocásticos a la cadena de DNA, cualquier pequeña variación en los parámetros de reacción pueden modificar los resultados

Los primers previamente diseñados permiten asegurar la poca variabilidad en los parámetros de reacción.

10. Enumere 5 aplicaciones de los RAPDs

1.Taxonomía (por marcadores Genéticos) 2. Hallar la diversidad genética de especies/polimorfismos. 3. Parasitología (tipificación molecular de los agentes etiológicos) 4. Estudios forenses. 5. Genética evolutiva y de poblaciones.