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TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS
Claudia EtchebehereCátedra de Microbiología
Facultad de Química y Facultad de Ciencias2008
• Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a
ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria)
• Prescott, Harley and Klein, Microbiología, cuarta edición. Capítulo 19).
BIBLIOGRAFÍA
TEMARIO
Taxonomía y concepto de especie en procariotas
Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica
Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos
Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting)
Filogenética: clasificación y relación evolutiva
gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos
Relación entre taxonomía clásica y filogenética.
Diversidad bacteriana. Ejemplos.
Identificación de una cepa
Taxos=estructuración u orden, nomos=ley
Comprende:
•Clasificación
estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud
•Nomenclatura
asigna nombres a los taxones
•Identificación
determina a que taxones pertenece un organismo que se aisló
TAXONOMÍA
¿Para que sirve clasificar los microorganismos?
Ordenar los conocimientos
Lenguaje común
Descubrir organismos no descriptos
Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos)
Estudios evolutivos
TaxonomíaCaracterización exhaustivaAplicación de teoría y método de clasificaciónFormación de grupos taxonómicos (taxones)Nomenclatura
IdentificaciónCaracterización por número limitado de tests
adecuados al problemaComparación con spp conocidasAsignación a una spNo identificado: estudio taxonómico
Identificación de un aislamiento
Cultivo puroEstudios morfológicos (macro y micro, Gram)Estudios bioquímicos, enzimas vías de degradación, metabolismo, relación con el oxígeno.Comparación con cepas ya caracterizadasAsignación de especie
Definición de especie
Unidad taxonómica básica
Grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas
Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo o de una sola célula
Definición en revisión continua
• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas)
• En el futuro definición genómica de especie.
• Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70%
- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
Definición de especie en Bacterias
Longitud de onda (nm)
ADN simple hebra
ADN doble hebra
Abs
orba
ncia
220 260 300
Abs
. rel
ativ
a 26
0 nm
80 90 100temperatura (ºC)
Tm = 86ºC
ADN doble hebra
ADN simple hebra
desnaturalización
Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN-ADN o de ADN-ARN
Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion
Determinación del % de hibridación ADN-ADN
Taxones: Dominio
Phylum
Clase
Orden
Familia
Género
Especie
Sub-especie
importancia en estudios clínicos y ecológicos
RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA
Dominio Phylum
Clase Orden
Familia Genero
Especie
BacteriaProteobacteria
Gamma ProteobacteriaZymobacteria
ChromatialesChromatiaceae
AllochromatiumAllochromatiumAllochromatium warmingiiwarmingii
Bacterias Gram negativasBacterias fotótrofas púrpuras
Bacterias púrpuras del azufre
Secuencia del gen 16S rRNA
Jerarquía taxonómica de la bacteria AllochromatiumAllochromatium warmingiiwarmingii
•serovariedad o serotipo (antígenos distintos)
•fagovariedad (tipificación por fagos)
•biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)
•patovariedad (patogenicidad)
•morfovariedad (diferencias morfológicas)
•genomovariedad (grupos con ADN similares)
Categorías de clasificación a nivel de sub-especie (tipificación)
Variedades o tipos
Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology
1923 (1ed)-1994 (9ed)
Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4)
Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5)
The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)
Manuales de microorganismos
International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología
Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validación del nombre)
PUBLICACIONES
COLECCIONES DE MICROORGANISMOS
(cepas tipo y otras)
ATCC (American Type Culture Collection)
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZelkulturen, Colección alemana)
CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)
www.straininfo.net
Taxonomía bacteriana
CLÁSICAcaracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.)
% G+C
ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)
Morfología: forma, tamaño y tinción
Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S
Movilidad: tipo y disposición de flagelos
Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos,patogenicidad
Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico
Contenido G+C
% G+C = G + C x 100G + C + A + T
Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía (HPLC)
Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%)Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada
Características genotípicas clásicas
• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos
• Se basa en un gran número de caracteres
• Cada carácter tiene igual peso
• La similitud es función de la proporción de caracteres comunes
TAXONOMÍA NUMÉRICA
- caracteres fenotípicos (no menos de 60)
- coeficiente de semejanza = a + d .
a + b + c + d
a: número de caracteres positivos en ambas cepasb: número de caracteres positivos sólo en cepa 1c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2d: número de caracteres negativos en ambas cepas
Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas
TAXONOMÍA NUMÉRICA
Taxonomía molecular
Basada en el estudio de moléculas
Caracteres GenotípicosCaracteres GenotípicosHibridación ADN-ADN
Molecular fingerprinting (huella molecular)
Caracteres FenotípicosCaracteres FenotípicosQuimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos (FAME), otros
- depende de la secuencia completa del genoma- útil en organismos estrechamente relacionados
- determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2Δ Tm del híbrido
- es el criterio actual de definición de especie
Hibridación ADN-ADN
• secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción •resolución a nivel de sub-especie.
Molecular fingerprinting
Marcadores quimiotaxonómicos
Características
- análisis químico con equipamiento especializado
- no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos
- alto grado de discriminación
- presentes en distintas estructuras celulares
CARACTERES FENOTIPICOS
- Pared: peptidoglicanos en Gram +
- Membrana externa Gram negativos:
-lipopolisacáridos
- Membrana citoplasmática:
-ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester),
-lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas.
- Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.
- Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.
- Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas
Marcadores quimiotaxonómicos
Desventajas de una clasificación artificial
No permite inferir propiedades
No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio
No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)
Clasificación natural
Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica.
Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas
POLIFÁSICA
Fenotípicos:Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc)- moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas
Filogenéticos:Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S
Genotípicos:Genotípicos: -clásicos: % G+C
- moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting(ej. Perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN)
Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres:
Bases de la filogenética molecular
El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.
Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies)
Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas
Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución
CARACTERES FILOGENETICOS
PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO
distribución universal (presente en todos los organismos)función homóloga en todos los organismoscapacidad de alinear secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variablesausencia de transferencia horizontalcantidad de información suficiente
•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)
•Subunidad beta de ATPasa
•RecA
• Factor de Elongación Tu
•Genes funcionales
Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos
Nombre Tamaño Ubicación(nucleótidos)
5S 120 Subunidad mayor del ribosoma
16S 1500 Subunidad menor
23S 2900 Subunidad mayor
ARNrProcariotas
Estructura primaria:Dominios de conservación universal Regiones altamente variablesDominios de nivel intermedio de conservación, con
cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria
Estructura secundaria:Similar en todos los organismosAcotada por su función en la síntesis de proteínas:
función ancestral
Secuencia del ARNr 16S
Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coliLíneas gruesas: dominios de conservación universal
Líneas normales: dominios de conservación intermedia
Líneas punteadas: regiones hipervariables
Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente
Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.
Árbol filogenético
2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas
Organismos secuencias ARN
A CGU AGA CCU GAC
B C CUU CCU AGA GCU GGC CAA
C C CAA GAC GUG GCA
D C CAU GCU AGA UGU GCC
Secuencia del organismo problema
secuencias obtenidas de la base de datos
Posicion mas conservada
Posiciones mas variables
Posiciones que van a ser comparadas
Árboles filogenéticos
Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos (MEGA)
Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva
Similitud de secuencias implica similitud en los genes
Definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S
En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3%con el resto de las secuencias conocidas de bacteriasentonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%
especies diferentes
Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%
Relación entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridización genómica de ADN entre pares de organismos.
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA
> 3% < 3%
Diferencia de secuencia con la cepa mas similar
Alineamiento y corrección de la secuencia
Comparación con bases de secuencias(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE
< 70%
Hibridación ADN-ADN
pruebas fenotípicas
similaresdiferentes
> 70%
Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes
NUEVA ESPECIE
Secuencias signaturas o firma en ARNr
•Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos•Ejemplos:
•AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria
•CACACACCG (posición 1400) en Archaea
•C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos
COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS
Secuencia del gen ARNr 16S
Se emplea frecuentemente para:
ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO
DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: “Candidatus”
METODOS RÁPIDOS DE CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACION.
ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS
Amplificación y clonado del gen del ARNr de 16S para su posterior secuencia
DNA ambiental
PCR gen especifica
Gen amplificado de los microorganismos A y B
A B
Ligación de fragmentos de interés en el vector de clonado
Plásmidos con inserto
Transformación de cepas E. coli
Seleccion y análisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc.
FISH: Fluorescence in situ hybridisation
muestra
Fijacionpermeabilizacion
Fijacion
Celulas hibridadas
Lavado
sonda fluoróforo
blanco (rRNA)
Hibridación Ribosomas
Sondas de oligonucleotido fluorescentes
Deteccion
Microscopio deEpifluorescencia
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Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya
Bacteria Archaea Eucarya
Peptidoglicano Sí No No
Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester
Ribosomas 70S 70S 80S
tRNA iniciador Formilme-tionina
Metionina Metionina
RNA polimerasa Una(4 subun)
Varias(8-12 subun)
Tres(12-14 subun)
Ribosoma sensible a:
Toxina diftérica No Sensible Sensible
Cloranfenicol
Kanamicina
Estreptomicina
Sensible No No
Operones Sí Sí No
Árbol del ARNr 16S
Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria
Muchos de los linajes profundos son anerobioso microaerofílicos
Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria
ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL
Termofilia en todos los miembros de la ramaTermofilia en algunos miembros de la rama
Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S
• Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya
• Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis)
• Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia
• Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicación, transcripción y traducción
Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes
Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) FotótrofosFotótrofos anoxigénicosanoxigénicos
Representantes de ambos géneros poseen clorosomascon similar función y estructura
posibles explicaciones:
transferencia lateral
evolución independiente
el gen del ARNr 16S aportaría información limitada
Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales)
Mas de 400 géneros
Phylum mejores caracterizados:
Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros
Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros
DOMINIO BACTERIA
AquifexAquifexBacterias autótrofas y termófilas
Bacterias verdes no del azufreBacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato
DeinococciDeinococciAltamente resistentes a la radiación (D. radiodurans)
Bacterias verdes del azufre Bacterias verdes del azufre ((Chlorobium))Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico
PlanctomycetesPlanctomycetes
Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única, “Candidatus”
CyanobacteriaCyanobacteriaBacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica
DOMINIO BACTERIA
Gram positivos bajo GCG+C < 50%Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus, StaphylococcusGram positivos alto GC
G+C > 50-55%Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium
DOMINIO BACTERIA
PROTEOBACTERIASAlfa:metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas(Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosínteticasBeta:litótrofas de NH3 (Nitrosomonas)Delta:Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras
DOMINIO BACTERIA
Ejemplos de diversidad:estructura y función
• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)
• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)
• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces)
• Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)
• Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias,comportamiento social (Myxobacterias)
• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)
• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.:decarboxilasas en Oxalobacter formigenes
DOMINIO ARCHAEA
40 géneros3 linajes separados:
Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos)Crenarchaeota (termófilos)Korarchaeota (solo secuencias ambientales)
Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente
Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)
Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores:Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad,morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)
¿Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)?
Son ancestrales
Son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya
Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada
Concepto polifásico de especie:Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes
Concepto ecotipo (Cohan, 2004):Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamentecoherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.
Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.
• Origen de la tierra 4600 millones de años
• Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S
• Temperatura > 100°C
• Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos)
• Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)
• Célula moderna: ADN ARN Proteína
ORIGEN DE LA VIDA