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TAXONOMIA MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE Fusarium
OBTENIDOS A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS
YESID FABIÁN ACEVEDO GRANADOS
Tesis de Grado presentada para optar al Título de
Magíster en Ciencias - Biotecnología
DIRECTORA
Adelaida María Gaviria Rivera, I.A, Ph. D.
Grupo de Investigación en Sistemática Molecular
Universidad Nacional de Colombia
CO-DIRECTORA
Luz Elena Cano Restrepo, Ph. D.
Grupo de Micología Médica y Experimental
Corporación para Investigaciones Biológicas
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD DE CIENCIAS
2013
CONTENIDO
RESUMEN……………………………………………………………………………...1
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...3
2. MARCO TEÓRICO….……………………………………………………………...7
2.1 Patogenicidad e importancia Clinica…………………………………………….......8
2.2 Taxonomia de Fusarium……………………………………………………………12
2.3 Técnicas Moleculares de Valor Taxonómico………………………………………14
2.3.1. Genes Utilizados en Taxonomía Molecular de Fusarium…….…………………16
2.3.2. Importancia del Factor de Elongación de la Traducción 1α (EF-1α) en
Fusarium………………………………………………………………………………..19
2.3.3 Importancia de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB-2) en
Fusarium………………………………………………………………………………..21
3. OBJETIVOS………………………………………………………………………..26
3.1. Objetivo general………………………………………………………………...…26
3.2. Objetivos específicos…………………………………………………………........26
4. METODOLOGÍA…………………………………………………………………..27
4.1 Poblacion y muestra………………………………………………………………...27
4.2 Cepas…………………………………………………………………………….…27
4.3 Extracción y purificación de ADN…………………………………………………28
4.4 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2………………………………..28
4.5 Electroforesis, procesamiento y análisis de imágenes…………………………...…30
i
4.6 Secuenciación de los fragmentos de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de
Fusarium sp…………………………………………………………………………….30
4.7 Edición y análisis de las secuencias………………………………………………..31
4.8 Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del género
Fusarium procedentes de muestras clínicas…………………………………………….31
4.9 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias……………………………………31
4.10 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium a partir de los genes EF-1α y
RPB2……………………………………………………………………………………32
4.11 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas…………....32
5. RESULTADOS……………………………………………………………………..33
5.1 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2………………………............33
5.2. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos clínicos de
Fusarium sp. por consulta en la base datos Fusarium-ID……………………………...34
5.3 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias……………………………………..42
5.3.1 Caracterización de las secuencias………………………………………………...42
5.3.2 Estimación de patrones de sustitución……………………………………………43
5.3.3 Distancias genéticas………………………………………………………………44
5.3.4 Análisis de entropía de secuencias……………………………………………….46
5.4 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium……………………………….48
5.5 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas……………..62
6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………...64
6.1 Identificación molecular a nivel de género y especie de aislamientos clínicos de
Fusarium..........................................................................................................................64
6.2 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias…………………………………....68
ii
6.3 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium…………………………….…71
6.4 Correlación de la especie identificada de Fusarium sp con las variables
epidemiológicas de los pacientes analizados…………………………………………...75
7. CONCLUSIONES………………………………………………………………….78
AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………….79
BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………...81
ANEXOS…………………………………………………………………………….....99
Anexo 1. Arboles obtenidos mediante los métodos de Máxima Verosimilitud, Máxima
Parsimonia e Inferencia Bayesiana……………………………………………………..99
iii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Descripción de los cebadores utilizados para la identificación y taxonomía.......29
Tabla 2. Composición de las mezclas de PCR para la identificación y taxonomía
molecular de género y especie de aislamientos de Fusarium sp .procedentes de muestras
clínicas.............................................................................................................................30
Tabla 3. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del
género Fusarium, obtenidos de muestras clínicas………………………………………36
Tabla 4. Características de los alineamientos de las secuencias de EF-1α y RPB2……...43
Tabla 5. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de
nucleótidos de EF-1α.......................................................................................................44
Tabla 6. Máxima estimación de Probabilidad compuesta de patrón de sustitución de
nucleótidos de RPB2.......................................................................................................44
Tabla 7. Matriz de Distancias Genéticas de EF-1α...........................................................45
Tabla 8. Matriz de Distancias Genéticas de RPB2............................................................45
Tabla 9. Localización de la lesión y número de especies de Fusarium aisladas entre la
población femenina y masculina incluida en este estudio……………………………….62
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de la región de EF-1α…………………………………………………...21
Figura 2. Mapa de la región de RPB2...............................................................................25
Figura 3. Electroforesis de fragmentos amplificados por PCR de los genes EF-1α, RPB2
5-7 y RPB2 7-11 de aislamientos clínicos del género Fusarium.......................................34
Figura 4. Análisis de Entropía y comparación con las zonas amplificadas por los
cebadores del gen EF-1α………………………………………………………………..46
Figura 5. Distribución de nucleótidos informativos a través de los intrones y exones del
gen EF-1α……………………………………………………………………………….47
Figura 6. Análisis de Entropía y comparación con las zonas amplificadas por los
cebadores del gen RPB2………………………………………………………………...47
Figura 7. Dendrograma del gen EF-1α. de 59 aislamientos clínicos de Fusarium
construido usando el método de Neighbor-Joining……………………………………..50
Figura 8. Dendrograma del gen RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium construido
usando el método de Neighbor-Joining…………………………………………………53
Figura 9. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos
clínicos del complejo de especies Fusarium oxysporum construido usando el método de
Neighbor-Joining……………………………………………………………………….55
Figura 10. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos
clínicos del complejo de especies Fusarium solani construido usando el método de
Neighbor-Joining……………………………………………………………………….57
Figura 11.Comparación de los dendrogramas construidos bajo el método de Neighbor-
Joining………………………………………………………………………………….59
Figura 12. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos
clínicos de Fusarium usando el método de Neighbor-Joining…………………………..61
v
RESUMEN
Fusarium es un género fúngico amplio y diverso de diferentes complejos de especies,
causante de una gran variedad de enfermedades en plantas, productor de diversas toxinas
y representa un importante patógeno oportunista en humanos. La taxonomía de las
especies de Fusarium ha sido por mucho tiempo una tarea compleja y controversial. Esto
es debido principalmente a la aplicación de diferentes sistemas taxonómicos y la inherente
variabilidad morfológica de algunas de estas especies. Estas características requieren de
la revisión por parte de un experto en taxonomía, con el fin de lograr un acertado y
confiable diagnóstico, el cual es crucial en el manejo de enfermedades o infecciones y
estudios de diversidad genética. En Colombia, el laboratorio de Micología Médica de la
Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia ha reportado un incremento anual
del 211 % de casos de infecciones causadas por Fusarium, entre 1990 y 2000 y la Unidad
de Micología Médica y Experimental de la Corporación para Investigaciones Biológicas
(CIB) del 317 % entre 1995 (29 aislamientos) y 2003 (92 aislamientos), sin embargo en
estos centros especializados a nivel nacional en micología médica, no se lleva a cabo un
diagnóstico a nivel de especie.
El principal objetivo de este estudio fue el de estudiar la diversidad y establecer la
taxonomía de aislamientos clínicos de Fusarium, mediante el uso de dos marcadores
moleculares. En primera instancia se llevó a cabo la identificación de los 59 aislamientos
mediante consulta en la base de datos Fusarium-ID con base en secuencias codificantes
del factor de elongación de la traducción EF-1α. Y en segunda se llevaron a cabo análisis
de secuencias y variabilidad evolutiva que permitieron evaluar los niveles de información
contenido en las secuencias de EF-1α y RPB2 usadas en el presente estudio. Variables
como la localización de la lesión y el género del paciente permitieron correlacionar los
aislamientos de Fusarium con la población afectada.
Los resultados obtenidos permitieron observar la agrupación de los 59 aislamientos en
tres complejos de especies: Fusarium oxysporum (FOSC), Fusarium solani (FSSC) y
Fusarium incarnanatum-equiseti (FIESC). Alineamientos de las secuencias permitieron
evidenciar la alta variabilidad de las secuencias mostrando zonas variables que contrastan
1
con zonas conservadas, además se identificó la variabilidad haplotípica, patrones de
sustitución de cada grupo de secuencias, al igual, se determinaron las distancias genéticas
entre los complejos de especies identificados, así como análisis de entropía; todo lo
anterior permitió observar niveles de informativos y de variabilidad más adecuados en las
secuencias de EF-1α, en comparación a lo observado en las secuencias de RPB2. La
taxonomía resultante basada en las secuencias de EF-1α permitió la agrupación de los
distintos aislamientos en los tres complejos de especies identificados mediante los
métodos de Neighbor-Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia
Bayesiana; en el caso de la taxonomía basada en las secuencias de RBP2 se observó por
el contrario la agrupación de dichos aislamientos en mezclas de los diferentes complejos
de especies obtenidos. Basado en la mayoría de resultados, se observa que el uso de las
secuencias codificantes para el factor de elongación de traducción 1α, EF-1 α permiten
una confiable clasificación de los aislamientos de origen clínico y permite ratificar la
utilidad que posee este marcador molecular en los distintos complejos de Fusarium en
comparación a lo observado al usar la secuencias de la segunda subunidad mayor de la
ARN polimerasa II, RPB2.
2
1. INTRODUCCIÓN
Fusarium es uno de los géneros fúngicos más importantes a nivel mundial por su
patogenicidad a plantas, humanos y animales y la producción de toxinas. Las especies de
este género durante años recientes han aumentado su implicación en enfermedades en
humanos y hoy en día representan la segunda causa de infecciones fúngicas invasivas en
humanos con altas tasas de morbilidad y mortalidad (Alastruey-Izquierdo et al., 2008).
El espectro de infecciones pueden ser desde tipo superficial (onicomicosis y queratitis),
invasivas locales, hasta diseminadas; estas últimas se presentan exclusivamente en
pacientes severamente inmunocomprometidos (Guilhermetti et al., 2007). De igual
manera especies de Fusarium también pueden causar enfermedades alérgicas como es la
sinusitis en individuos inmunocompetentes (Nucci y Anaissie, 2007).
Estudios recientes han demostrado que el género Fusarium incluye diversos clados
filogenéticos, contenidos en complejos de especies (Summerbell y Schroers, 2002). La
taxonomía de Fusarium es muy compleja y ha sufrido varios cambios (Llorens et al.,
2006). En la década anterior se reportó la marcada y preocupante incidencia de
infecciones causadas por Fusarium en humanos y animales, en donde además de la
acostumbrada presencia de F. solani y F. oxysporum, se logró identificar otras 13 especies
de este género entre las cuales se encuentran F. verticilloides, F. chlamydosporum, F.
dimerum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum y F. sacchari (Alastruey-Izquierdo
et al., 2008).
Desde su definición en 1809 por Link, el género Fusarium ha recibido mucha atención
en la literatura científica. Una parte importante de estos estudios trata de aspectos
taxonómicos, en donde la gran mayoría se centran en el uso de caracteres morfológicos
para diferenciar secciones y especies. La caracterización convencional de especies de
Fusarium se ha basado principalmente en criterios morfológicos, aunque también se ha
tenido en cuenta características fisiológicas al igual que la fertilidad (Sampietro et al.,
2010). La identificación de especies de Fusarium siempre ha sido difícil, aun para
expertos micólogos por que la evaluación morfológica y sexual requiere tiempo, de gran
conocimiento y experiencia en la taxonomía y fisiología de Fusarium, y aun así, el
3
porcentaje de incertidumbre en la correcta identificación de la especie es del 30 %.
(Mishra et al., 2003; Alastruey-Izquierdo et al., 2008; Sampietro et al., 2010). La
experiencia requerida solo es disponible en laboratorios de referencia y aun en ellos, al
menos cinco días de trabajo son requeridos para identificar un aislamiento a nivel de
especie mediante observación de caracteres morfológicos (Alastruey-Izquierdo et al.,
2008).
En los años noventa, con el incremento del uso y aceptación de los métodos basados en
el ADN, comenzó a ser claro que las clasificaciones basadas exclusivamente en
morfología desestimaban la verdadera diversidad de este género (Gräfenhan et al., 2011).
Las secuencias de ADN de varios loci como el factor de elongación de la traducción 1α
(EF-1α), segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), β-tubulina,
calmodulina y regiones ribosomales, han permitido establecer varios complejos de
especies de interés clínico, como: F. solani complejo de especies (FSSC), F. oxysporum
complejo de especies (FOSC), F. incarnatum-equiseti complejo de especies (FIESC), F.
chlamydosporum complejo de especies (FCSC), F. tricinctum complejo de especies
(FTSC), F. dimerum complejo de especies (FDSC) y Gibberella fujikuroi complejo de
especies (GFSC) (O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2011). Actualmente es aceptado que
los taxones que anteriormente se pensaba que representaban especies, actualmente son
complejos de especies. (Kvas et al., 2009).
El gen EF-1α ha mostrado una alta señal taxonómica, ya que permite la correcta
identificación y correspondencia gracias al adecuado nivel de resolución intraespecies y
el alto grado de concordancia en sus resultados al ser usados de forma individual y
conjunta, para todos los complejos de especies del género, seguido por el gen RPB2 que
no es aparentemente efectivo para el complejo de especies Fusarium oxysporum (FOSC),
pero si para los demás complejos de especies reportados en humanos (Jiménez-Gasco y
Jiménez-Díaz 2003; Balajee et al., 2009; O’Donnell et al., 2009). Estos genes son
marcadores moleculares adecuados para estudios de taxonomía y filogenia porque
cumplen con algunas de siguientes características: i, se presentan como una única copia
dentro del genoma o múltiples copias idénticas, ii son de fácil alineamiento y análisis
entre especies estrechamente relacionadas, con alto grado de sustitución en su secuencias,
4
lo suficiente para asegurar que las mutaciones se hayan acumulado de forma
proporcionada durante el breve tiempo durante el cual los taxa hayan ido evolucionando,
iii. tasas de sustitución suficientemente altas para generar un número suficiente de sitios
informativos, pero lo suficientemente bajas para evitar el número excesivo de
sustituciones múltiples (fenómeno de saturación); para los genes codificantes de proteínas
puede ser que la tasa de sustituciones sinónimas sea demasiado alta a pesar de que las
sustituciones no sinónimas sean muy pocas, iv. disponibilidad universal de cebadores
para PCR. Conllevando posteriormente al conocimiento de su ortología entre
especímenes y parologia definiendo relaciones entre organismos (Guarro et al., 1999;
Cruickshank R, 2002; Gomes et al., 2002).
La carencia de variación informativa en la subunidad 28S del ADN ribosomal, al igual
que del ARN de la subunidad menor de la mitocondria, poligalactouronasa y de las IGS,
como también la presencia de autapomorfias en las secuencias del gen Calmodulina, y
el descubrimiento de tipos no ortólogos del ITS2 en algunos complejos de especies de
Fusarium, ha generado grandes controversias sobre el uso de estos genes a nivel
individual, especialmente de los genes del ARN ribosomal nuclear, para la reconstrucción
filogenética y la inferencia de los límites de especies dentro del reino Fungi (Alastruey-
Izquierdo et al., 2008; O’Donnell et al., 2009; Kvas et al., 2009; Landlinger et al., 2009;
Harrow et al., 2010).
La identificación precisa y rápida de la especies de Fusarium es crítica para predecir el
potencial patógeno de dichos aislamientos y administrar el mejor tratamiento (Alastruey-
Izquierdo et al., 2008; Landlinger, et al., 2009; Sampietro et al., 2010). Los métodos
moleculares que se fundamentan en la comparación de secuencias de ADN son
actualmente los más utilizados para el estudio de genética de poblaciones, taxonomía,
filogenia y sistemática de Fusarium. Estos métodos incluyen entre otros: el polimorfismo
en el tamaño de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length
Polimorphisms: RFLP), el polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados
(Amplified Fragment Length Polymorphisms: AFLP), la amplificación aleatoria de ADN
polimórfico (Random Amplified Polymorphic DNA: RAPD), patrones de diferenciación
de elementos repetitivos y secuenciación de genes codificantes o no de proteínas
5
(Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003). La secuenciación de múltiples loci, como el
factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α, TEF), una región de la subunidad mayor
de la ARN polimerasa II (RPB2), la topoisomerasa II y las regiones ITS del ADN
ribosomal se han utilizado para sistemática molecular (Balajee et al., 2009).
La secuenciación de loci es esencial para determinar los límites de la especie y
correlacionarlos con sus hospederos y distribución biogeográfica de hongos de
importancia clínica, como Fusarium (Wang et al., 2011). Genes codificantes de proteínas,
con numerosas porciones intrónicas, se consideran potenciales marcadores en estudios
taxonómicos a nivel de especie en hongos, dado que estos tienden a variar a altas tasas en
comparación con los marcadores utilizados comúnmente como el ITS y las regiones del
ARN ribosomal nuclear (Harrow et al., 2010). Del relativo pequeño número de genes que
han sido evaluados a la fecha dentro los diversos complejos de especies del genero
Fusarium (FSSC, FOSC, FIESC, FCSC, FTSC, FDSC y GFSC), como regiones
espaciadoras intergénicas del ADN ribosomal (Intergenic Spacer Region: IGS), ADN
ribosomal, factor de elongación de la traducción (Elongation Factor 1α: EF-1α),
poligalacturonasa (PG), ARN de la subunidad menor del ribosoma mitocondrial, segunda
subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), fosfato permeasa, β-tubulina (TUB),
nitrato reductasa, genes de apareamiento MAT 1 and MAT2 (Matying type 1 y 2) y RPB2.
Aunque la mayoría de estos genes son útiles para la detección e identificación del género,
normalmente no contienen suficiente polimorfismo para distinguir entre especies dentro
de complejos de especies de Fusarium; solo los genes EF-1α y RPB2, han demostrado un
alto grado de concordancia en sus resultados al ser usados de forma individual y conjunta
(Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003; Balajee et al., 2009). Partiendo de la poca utilidad
de estas secuencias, estas deberían ser excluidas de futuros análisis, principalmente de los
que implican el uso de tres locus (Sharma et al., 2004; O’Donnell et al., 2008). Por todo
lo anterior los genes EF-1α y RPB2 fueron utilizados para estudiar la taxonomía de
aislamientos clínicos de Fusarium provenientes de diferentes pacientes de la población
del Valle de Aburra (Antioquia).
6
2. MARCO TEORICO
Fusarium actualmente está constituido por aproximadamente 70 especies (Leslie y
Summerell, 2006), comúnmente aisladas de diversos climas y nichos ecológicos (Nelson
et al., 1994). Las especies del género pueden ser organismos saprofitos que suelen
colonizar sustratos vegetales y constituirse como verdaderos patógenos en cultivos como
plátano, avena, arroz, entre otros, y causar graves repercusiones económicas para el sector
agrícola, pues de 101 cultivos de importancia económica a nivel mundial, más de 80
pueden ser atacados por Fusarium (Leslie y Summerell, 2006).
El género Fusarium se encuentra dentro de la división Ascomycota, clase Euascomyctes,
orden Hypocreales y familia Hypocreaceae. La fase sexual o perfecta (también llamada
teleomórfo) se encuentra en los géneros Albonectria, Gibberella y Haematonectria
(Leslie y Summerell, 2006).
En los años 70 se determinó que ciertas cepas de Fusarium son capaces de producir cierto
tipo de micotoxinas, las cuales son metabolitos secundarios que pueden ocasionar serias
intoxicaciones en animales y humanos (Kim et al., 1995). Actualmente, algunas especies
de Fusarium son reconocidas como importantes patógenos oportunistas, que causan
diversos tipos de patologías tanto en el hombre como en otros animales (Guarro y Gené,
1995; Boutati y Anaissie, 1997; Ortoneda et al., 2004). Su ocurrencia como agentes
causales de infección en humanos se ha venido incrementado en los últimos años (Marr
et al., 2002; Husain et al., 2003), las especies aisladas con mayor frecuencia son F. solani,
F. oxysporum y F. verticillioides, pero más recientemente se ha observado un aumento
del número de casos clínicos producidos por especies nunca antes registradas en humanos
como F. chlamydosporum, F. dimerum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum, F.
sacchari, F. incarnatum, F. thapsinum y F. polyphialidicum, entre otras (Nucci y
Anaissie, 2007).
7
2.1 Patogenicidad e Importancia Clínica.
Múltiples estudios han demostrado que los mecanismos de infección de Fusarium entre
los hospederos vegetales y animales son diferentes. En el hombre y otros animales pueden
ocasionar diversas patologías a través de diferentes mecanismos de acción, como:
- Micetismo: intoxicación alimentaria por sustancias químicas constituyentes del hongo
ingerido.
- Micotoxicosis: intoxicación por ingestión de toxinas elaboradas por el metabolismo del
hongo al crecer en algunos alimentos.
- Alergias: reacciones de hipersensibilidad debidas a mecanismos inmunológicos.
- Micosis: infecciones por invasión de los tejidos superficiales o profundos.
Fusarium ha llegado a causar una amplia gama de enfermedades en el hombre que
incluyen, micotoxicosis y micosis que pueden ser de tipo superficial, localizada o
diseminada (Guarro y Gené, 1995). Las infecciones por Fusarium se incluyen dentro de
la categoría de las hialohifomicosis, las cuales se definen como micosis causadas por
hongos oportunistas que presentan hifas hialinas y septadas; también se utiliza el término
fusariosis para referirse específicamente a las infecciones causadas por este género.
La ingestión accidental de toxinas producidas por Fusarium (micotoxicosis) es rara en el
hombre, pero es más frecuente en animales a consecuencia del consumo de piensos y
forrajes contaminados por estos hongos durante el periodo de almacenaje. Sin embargo
durante la Segunda Guerra Mundial, la escasez de alimentos produjo varios brotes
importantes de micotoxicosis en la antigua Unión Soviética, que ocasionó la muerte de
cientos de personas que debieron alimentarse con cereales colonizados por Fusarium
(Nelson et al., 1994). En la actualidad desde el punto de vista clínico son mucho más
importantes las micosis.
8
El origen de la infección, puede generarse por la acción de enzimas como proteasas,
colagenasas y queratinasas propias de Fusarium o por consecuencia de traumatismos
físicos, los cuales se convierten en la puerta de entrada (Nelson et al., 1994);
posteriormente se puede desarrollar fácilmente diferentes tipos de infección. Entre las
infecciones superficiales y micosis superficiales, se han reportado casos de: onicomicosis,
queratitis, infecciones cutáneas, colonización de ulceras e infecciones de heridas y
quemaduras (Guarro y Gené, 1995). Las onicomicosis son, probablemente, el tipo más
común de infección superficial causado por Fusarium. El hongo invade las uñas, asociado
con el uso masivo de duchas, baños turcos, tratamientos de pedicura y el uso de calzado
cerrado en zonas tropicales, en los cuales se generan ambientes de humedad propicios
para la proliferación y desarrollo de Fusarium (Tosti et al., 2000). La queratitis por
Fusarium, a diferencia de otros géneros, cursa con un peor pronóstico y su tratamiento es
de difícil manejo (Tosti et al., 2000).
Los casos de infecciones localizadas en tejidos profundos, aunque presentan una menor
incidencia, son igual de importantes, diversas e incluyen: endoftalmitis exógena (debida
a traumatismos), que puede llevar a ceguera completa y ataque al sistema nervioso
central; infecciones profundas de piel y tejidos subcutáneos; osteomielitis; artritis séptica;
peritonitis relacionada con el uso de catéteres; abscesos cerebrales; endocarditis;
infección pulmonar y cistitis (Guarro y Gené, 1995).
En la actualidad, el incremento de terapias clínicas agresivas, aumenta considerablemente
el número de pacientes inmunodeprimidos, esto ha favorecido que las infecciones
ocasionadas por Fusarium sean cada vez más frecuentes. En estos pacientes las
infecciones presentan un tratamiento comprometido y con altos porcentajes de mortalidad
(aproximadamente 70 %) (Leslie y Summerell, 2006). Los síntomas clínicos típicos de
una fusariosis diseminada incluyen fiebre refractaria y la presentación de nódulos
cutáneos de color purpura con un área necrótica central (Nucci et al., 2003). En un gran
porcentaje, la biopsia de estos nódulos denota la presencia de hifas hialinas, septadas y
con ramificaciones que irrumpen vasos sanguíneos. Los cultivos del material de biopsia
y los hemocultivos resultan de gran beneficio en el diagnóstico, ya que posibilitan de
alguna manera discriminar la infección de aquellas provocadas por miembros del género
9
Aspergillus, que de forma contraria presentan hemocultivos negativos (Nucci y Anaissie,
2007). En el caso de las infecciones localizadas, estas pueden responder a una
combinación de tratamientos con antimicóticos sistémicos y escisión quirúrgica, pero las
infecciones sistémicas pueden llegar a ser crónicas o fatales, sobretodo en pacientes en
estado inmunocomprometido (Dignani y Anaissie, 2004; Nucci y Anaissie, 2007).
Las especies del genero Fusarium que se han reseñado como patógenos para el hombre,
teniendo en cuenta su orden de importancia, son: F. solani, F. oxysporum, F.
verticillioides, F. dimerum, F. proliferatum, F. chlamydosporum, F. sacchari, F.
nygamai, F. napiforme y más recientemente, F. incarnatum, F. polyphialidicum y F.
thapsinum (Nucci y Anaissie, 2007).
F. solani, la especie del género más aislada en todo el mundo se ha descrito en numerosas
ocasiones como agente de infecciones superficiales, localizadas y diseminadas en
pacientes inmunocomprometidos, especialmente en pacientes neutropénicos
(disminución aguda o crítica de granulocitos en la sangre). F. solani se ha relacionado
con pacientes que presentan queratitis (Godoy et al., 2004; Naiker y Odhav, 2004; Zhang
et al., 2006), incluso ha estado vinculada con el uso de lentes de contacto (Donnio et al.,
2007; O’Donnell et al., 2007; Jureen et al., 2008), considerado como el principal agente
causal de ceguera en áreas tropicales. También se ha reportado en casos de infecciones
cutáneas (Bodey et al., 2002; Pérez-Pérez et al., 2007), de micetoma (infección crónica
de la piel y tejidos subyacentes) (Tomimori-Yamashita et al., 2001; Yera et al., 2003),
infecciones diseminadas en trasplantes de órganos (Arney et al., 1997; Sampathkumar y
Paya, 2001), cáncer (Bushelman et al., 1995; Hennequin et al., 1997) o leucemia (Nucci
y Anaissie, 2007). En un estudio realizado con 84 pacientes con leucemia se encontró 30
de ellos con fusariosis invasiva, F. solani fue la especie más aislada, presente en 17
pacientes (Nucci et al., 2003).
En segunda instancia, con menor número de casos registrados, pero con igual nivel de
importancia clínica se encuentra la especie F. oxysporum; a la cual se le ha atribuido casos
de onicomicosis (Guilhermetti et al., 2007), queratitis (Chang et al., 2006), infecciones
diseminadas (Guarro y Gené, 1995; Rothe et al., 2004; Olivares et al., 2005) y localizadas
10
(Bodey et al., 2002; Gorman et al., 2006). Esta especie se ha aislado reiteradamente en
los sistemas de distribución de agua de un hospital de Houston (Texas), evidenciando que
se trataba del agente causal de múltiples infecciones en pacientes de dicho hospital
(Anaissie et al., 2001). Incluso se ha descrito como responsable de infecciones adquiridas
por uso de catéter (Ammari et al., 1993), e infecciones en pacientes con SIDA (Paugam
et al., 1999) o que han sido sometidos a trasplante de órganos (Banerji y Singh, 2011).
En tercer lugar se encuentra F. verticillioides, que a diferencia de las especies F. solani y
F. oxysporum, sobresale por su capacidad de producir varios tipos de micotoxinas como
moniliformina, fusarinas y fumonosinas, las cuales se relacionan con diversas
enfermedades en animales y humanos al ingerir cereales u otros alimentos contaminados
por este microorganismo (Nelson et al., 1994). Además de su relevancia como agente
causal de micotoxicosis, también se le ha acusado casos de queratitis (Pereiro et al., 1998;
Naiker y Odhav, 2004), micetoma (Ajello et al., 1985) e infecciones cutáneas (Bodey et
al., 2002). Asimismo, se ha vinculado con infecciones diseminadas en pacientes con
SIDA (Guarro et al., 2000) y con cáncer (Hennequin et al., 1997; Tezcan et al., 2009).
Otras especies, igualmente implicadas en patologías humanas, pero con menos frecuencia
son, F. proliferatum capaz de producir fumonisina, de forma similar que F. verticillioides
y se le ha señalado como agente causal de onicomicosis (Ninet et al., 2005), lesiones
cutáneas (Bodey et al., 2002), endoftalmitis (Ferrer et al., 2005), así como de infecciones
sistémicas (Summerbell et al., 1988). De igual manera F. sacchari se ha implicado en
casos de queratitis (Chander et al., 2011) y de al menos un caso de fungemia (Guarro et
al., 2000). F. dimerum se ha asociado a casos de queratitis (Schroers et al., 2009),
infecciones cutáneas (Bodey et al., 2002), endocarditis (Camin et al., 1999) y numerosos
casos de infección diseminada en pacientes inmunocomprometidos (Austen et al., 2001;
Letscher-Bru et al., 2002; Bigley et al., 2004). Por su parte F. incarnatum se ha aislado
de la epidermis de pacientes víctimas de quemaduras (Lortholary et al., 2010) y de
lesiones cutáneas (Bodey et al., 2002). F. chlamydosporum se ha identificado como
agente causal de dos casos de fusariosis profunda, uno de ellos asociado a infección por
catéter en un paciente con linfoma (Kiehn et al., 1985) y el otro de una persona con cuadro
clínico de neutropenia (Segal et al., 1998). A F. nygamai se le ha atribuido varios casos
11
de micotoxicosis en Malasia (Sapumohotti, 2004), aunque solo años más tarde sé
demostró que es productor de moniliformina (Leslie et al., 2005); también se ha
informado como agente responsable de infección sistémica en un paciente con leucemia
(Azor et al., 2009). F. thapsinum, una especie descrita recientemente (Klittich et al.,
1997), ha sido el agente causal de fusariosis sistémica en un paciente con leucemia (Nucci
y Anaissie, 2007), así como de diversos casos de queratitis (O’Donnell et al., 2007). Y
por último, se han encontrado dos especies de Fusarium de las que solo se ha descrito un
único caso como son: F. napiforme, agente de hialohifomicosis diseminada en un paciente
con leucemia aguda (Melcher et al., 1993) y F. acutatum aislado de una herida en el pie
de un paciente diabético (Taj-Aldeen et al., 2006).
2.2 Taxonomía de Fusarium
Fusarium es un género muy heterogéneo, difícil de identificar y clasificar (Nelson et al.,
1983; Guadet et al., 1989; Nelson et al., 1994). Además uno de los problemas en
taxonomía de hongos se debe a la doble nomenclatura, una para el estado sexual y otra
para el estado asexual (Summerbell y Schroers, 2002). En el género Fusarium se incluyen
formas asexuales de diferentes géneros de ascomicetos de la familia Nectriaceae, orden
Hypocreales; los géneros que representan a Fusarium como teleomorfo son Albonectria,
Gibberella y Haematonectria (Leslie y Summerell, 2006).
La taxonomía clásica de Fusarium se ha basado en la definición de los caracteres
morfológicos presentes en el hongo y características de crecimiento en cultivo. Las
características macroscópicas propias de las colonias del hongo incluyen, textura
algodonosa, rara vez levaduriforme, con pigmentos salmón, morado, rosado, café claro,
amarillo o gris; vistos al microscopio, los hongos presentan hifas hialinas, septadas y
filamentosas, pueden producir tres tipos de conidias y mesoconidias, microconidias,
macroconidias y clamidosporas. Los caracteres primarios para identificar especies son la
morfología de la macroconidia; presencia o ausencia, morfología o disposición de
microconidias; morfología de los microconidióforos (simples o ramificados) portadores
de células conidiógenas con un desarrollo fialídico; y presencia o ausencia de
clamidosporas (Leslie y Summerell, 2006).
12
Siguiendo las pautas de la taxonomía clásica, la identificación de especies del género
Fusarium es una tarea ardua y no siempre se obtienen resultados convincentes debido a
que son organismos que exhiben una gran variación en sus caracteres morfológicos y
fisiológicos; por lo que en muy pocas ocasiones se logra la identificación de la especie,
aún en los laboratorios especializados de microbiología. A nivel de especie muchos
caracteres fenotípicos presentan gran variación y son afectados por condiciones de
cultivo, además los aislamientos pueden tener demandas nutricionales diferentes lo cual
perjudica su crecimiento, por ejemplo la observación de macroconidias es difícil cuando
son obtenidas en cultivo (Hennequin et al., 1997; Hue et al., 1999). Por otro lado, el
procedimiento es dispendioso y de alto costo por los insumos necesarios y el tiempo de
dedicación (Dignani y Anaissie. 2004). La capacidad de variación explica en cierta
medida el hecho de que las especies del género puedan colonizar nichos ecológicos muy
dispares, sin embargo, también es la razón por la que actualmente todavía no se dispone
de un sistema de clasificación estable y de acogimiento general (Leslie y Summerell,
2006).
A principios del siglo XX, se llegaron a contabilizar cientos de especies de Fusarium ya
que se describían en función del huésped donde se encontraban; sin embargo,
Wollenweber y Reinking (1935) llevaron a cabo una importante exploración del género,
limitando el número de especies a 65, las cuales se agruparon en 16 secciones teniendo
en cuenta características macroscópicas y microscópicas como la morfología de la colonia
y los conidios, respectivamente. Así una sección agrupa especies con características
morfológicas similares. A su vez, estas especies contenían 55 variedades y 22 formas,
cepas morfológicamente similares caracterizadas por su adaptación a diferentes
hospederos y éstas, a su vez, en razas (Guadet et al., 1989; Nelson et al., 1994). Esta
primera clasificación no resultó muy conveniente ya que los caracteres morfológicos en
los que se basaba la división de especies eran poco estables y variaban en función de las
condiciones ambientales y del medio de cultivo utilizados. Años más tarde, en 1940 y
1954, Snyder y Hansen redujeron a nueve el número de especies (Snyder y Hansen, 1941;
Snyder y Hansen, 1945), de forma que, en general, cada una de ellas se correlacionaba
con las secciones establecidas en el sistema anterior, pero este sistema resultó
exageradamente simple.
13
Un claro reflejo de la controvertida taxonomía del genero Fusarium es la publicación
hasta la fecha de cerca de 10 propuestas de clasificación diferentes (Leslie y Summerell,
2006). El trabajo de revisión del género más reciente, publicado por Leslie y Summerell
en 2006 “The Fusarium Laboratory Manual”, incluye 70 especies, y no tiene en cuenta
las secciones consideradas anteriormente. Esta publicación incorpora los conceptos de
especie morfológica, biológica y filogenética. Además incluye de forma detallada
técnicas y métodos para el aislamiento, crecimiento e identificación de cepas de Fusarium
sp, seguido por una detallada descripción de cada una de las 70 especies.
Aunque el sistema de clasificación de Fusarium por secciones todavía sigue citándose en
la literatura científica, diversos trabajos basados en técnicas moleculares ha puesto de
manifiesto que se trata de un sistema de clasificación artificial (Cai et al., 2003).
2.3 Técnicas Moleculares de Valor Taxonómico.
La taxonomía del genero Fusarium, hasta hace quizás menos de una década, se basaba
solamente en el estudio de caracteres morfológicos. Sin embargo, este enfoque presenta
algunas limitaciones tales como la dificultad de diferenciar hongos estrechamente
relacionados, delimitar eficientemente algunos taxa y la laboriosidad de los métodos
(Guarro et al., 1999). Es por ello que actualmente, se han incorporado las técnicas de
biología molecular como apoyo a la taxonomía clásica para resolver estas limitaciones.
El uso de secuencias moleculares con un relativo grado de conservación permite la
definición y diagnóstico de unidades moleculares taxonómicas operacionales (MOTU’s:
Molecular Operational Taxonomic Units). El uso de MOTU’s permite la rápida y efectiva
identificación de muchos taxa, incluso aquellos que no han sido descritos anteriormente.
Esta metodología tuvo sus inicios en un contexto no molecular, OTU (Operational
Taxonomic Units; Unidades Taxonómicas Operacionales) propuesta por Sokal R. y
Sneath P. en 1963, en donde se utilizaba tantos caracteres como fuese posible, sin conocer
el verdadero valor taxonómico de cada carácter. En este mismo contexto las secuencias
de ADN pueden ser usadas para definir OTU’s debido a que cada secuencia puede ser
considerada como un grupo de caracteres sin un valor a priori. Basado en lo anterior
14
Floyd y colaboradores en 2002 introdujeron el concepto MOTU el cual define aquellas
entidades identificadas en un contexto molecular; esta metodología revela el grado de
variación de secuencias entre taxa estrechamente relacionadas con base en cortas regiones
genómicas específicas (Floyd et al., 2002).
Este método ha demostrado una gran utilidad en diversos estudios realizados tanto con
procariotas como con organismos eucariotas. Por ejemplo, en animales ha sido utilizado
en el establecimiento de la diversidad de tardígrados en distintas zonas de Escocia
(Blaxter et al., 2013); en plantas se ha usado por ejemplo en el inventario y estimación de
diversidad de árboles presentes en la zona tropical Amazónica (González et al., 2009).
En el caso de los hongos, esta metodología ha permitido establecer la diversidad de
muestras ambientales y su posterior clasificación formal dentro de los modelos actuales
de clasificación (Hibbett et al., 2011). Incluso ha permitido la revisión y establecimiento
de la tipificación, taxonomía y filogenia de géneros anamorfos de hongos ascomicetos
como son Acremonium, Cosmospora, Fusarium, Stilbella y Volutella (Gräfenhan et al.,
2011). En el caso específico de su aplicación a la taxonomía en Fusarium, éste ha sido
aplicado de manera individual tanto a grupos de especies con interés agrícola, como es el
caso de F. dimerum (Schroers et al., 2009), y reconocimiento de F. chlamydosporium
como endófito de orquídeas en Malasia. A nivel clínico ha permitido el refinamiento de
la taxonomía de las especies más representativas de este género (Nelson et al., 1994) y al
igual que en la taxonomía a nivel intra e inter complejos de especie y filogenia del genero
Fusarium (Watanabe et al., 2011). Estos estudios demuestran que este método puede ser
aplicado tanto a hongos meiospóricos como mitospóricos y que se pueden diferenciar
especies aparentemente indistinguibles por criterios de especie biológica y morfológica
(Kasson et al., 2013).
El establecimiento de estas unidades taxonómicas puede representarse gráficamente
mediante dendrogramas que actúan como modelos de la identidad y descripción de la
jerarquía obtenida para un grupo determinado de organismos. Para la taxonomía a partir
de datos moleculares se utilizan diferentes métodos. Entre estos métodos se encuentran
aquellos basados en distancias genéticas y métodos basados en caracteres conservados.
Entre los métodos basados en distancias genéticas se encuentran: Neighbor-Joining
15
(Agrupamiento de Vecinos Cercanos) y UPGMA (Unweighted Pair Group Method
with Arithmetic Mean; Método de Pares Agrupados usando Promedio Aritmético sin
Ponderación), los cuales se basan en el establecimiento de que tan diferente es un taxa
con relación a otro, basado en la estimación de la similitud total entre los diferentes
caracteres, establecido esto por un análisis estadístico que permite la construcción de
dichas distancias entre cada par de taxones. Los métodos basados en caracteres
conservados, los cuales son de gran aplicación en estudios taxonómicos y filogenéticos,
métodos Bayesianos y métodos estadísticos de inferencia como Verosimilitud y
Parsimonia, se basan inicialmente en la definición de un criterio de optimalidad o función
objetiva, con el fin de evaluar un árbol dado, es decir la asignación de un puntaje y usado
en la comparación de los arboles obtenidos posteriormente; seguido del uso de un
algoritmo con el fin de medir el criterio de optimalidad asignado y en la búsqueda de los
árboles que alcanzan los mejores valores de acuerdo a este criterio (Hillis et al., 1996).
Existen diversos paquetes informáticos que manejan estos métodos, dentro de los más
importantes se encuentran MEGA 5 (Molecular Evolutionary Genetics Analisys)
(Tamura et al., 2011) y BEAST (Bayesian Evolutionary Analysis by Sampling Trees)
(Drummond et al., 2012).
La fiabilidad de las agrupaciones taxonómicas obtenidas, una vez se han alcanzado los
dendrogramas y/o arboles; por uno u otro método, es reflejada por un método estadístico
que estima los niveles de confianza de los agrupamientos obtenidos, de éstos el más
utilizado es el análisis de bootstrap que determina la frecuencia en que un determinado
grupo fue hallado a partir de un número de réplicas (generalmente 1000) en el análisis
(Felsenstein, 1985; Hillis y Bull, 1993). Se considera que un valor superior al 75% indica
un buen soporte estadístico para las ramas constituyentes de dendrograma, al igual que el
de las distancias genéticas entre MOTU’s (Felsenstein J. 1985).
2.3.1 Genes Utilizados en Taxonomía Molecular de Fusarium
Entre las secuencias utilizadas comúnmente para el estudio taxonómico de hongos se
encuentran los genes que codifican para los ARN ribosómicos (ARNr) y sus regiones
espaciadoras internas (ITS). Sin embargo, en la mayoría de análisis se ha observado una
16
marcada tendencia a secuenciar más de un gen con el fin de realizar análisis multigénicos
para incrementar la fiabilidad de los resultados obtenidos. Para el género Fusarium, los
genes utilizados, además de los anteriores, suelen ser genes estructurales que codifican
proteínas como β-tubulina (BT2, TUB), el factor de elongación 1α de la traducción (EF-
1α) y la calmodulina (CAL) (Taylor y Fisher, 2003). Al utilizar la metodología de
MOTU's se obtiene mayor consistencia de los diferentes taxa y grupos taxonómicos, ya
que éstos pueden corroborarse de manera individual, ya sea por uno o varios genes
diferentes y también en análisis concadenados de las secuencias (Floyd et al., 2002).
Algunos ejemplos relevantes de genes utilizados para análisis de sistemática molecular
de Fusarium se describen a continuación. La región 28S del ADN ribosómico nuclear -
también llamada LSU - ha sido útil en el análisis de la historia evolutiva del complejo
Gibberella fujikuroi, que incluye las especies F. verticillioides, F. proliferatum, F.
subglutinans y otras especies relacionadas; también ha permitido detectar múltiples
orígenes evolutivos dentro del complejo de especies Fusarium oxysporum, relacionado
con la enfermedad de Panamá en banano causada por una forma especial de este
complejo, igualmente ha sido útil en la resolución de especies del complejo de especies
de F. solani (FSCS) que causan enfermedades tanto en humanos y plantas; y además en
la genotipificaciòn y diversidad filogenética de brotes de queratitis en Estados Unidos
(O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998; O'Donnell et al., 2000; Zhang et
al., 2006; O’Donnell et al., 2007). El gen que codifica para la subunidad menor
mitocondrial (mtSSU) ha permitido por ejemplo la confirmación de aislamientos de F.
verticillioides a partir de muestras de banano en Japón; incluso ha sido útil en la
identificación de una nueva especie de Fusarium denominada F. commune la cual fue
aislada de Pisum sativum (arveja) en la región norte de Europa, y en complemento a ello
se identificó filogenéticamente la estrecha cercanía de F. commune con el complejo de
especies F. oxysporum. La región mtSSU además ha sido usada en el análisis de la
distribución geográfica del complejo de especies de F. oxysporum en enfermedades de
origen nosocomial en los Estados Unidos (O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al.,
1998; O'Donnell et al., 2000; Hirata et al., 2001; Skovgaard et al., 2003; O’Donnell et
al., 2004). La región ITS del ADN ribosómico nuclear se usó en un estudio que implicó
la detección de nuevas especies que componen el complejo de especies Gibberella
17
fujikuroi (O'Donnell et al., 2000; Zhang et al., 2006). Ninguna de las secuencias
ribosomales antes señaladas ha reflejado un adecuado poder de resolución a nivel de
especie, incluso han llegado a ser problemáticos en el momento de ser usados en conjunto
con otros genes; actualmente su uso se limita a la identificación de especímenes a nivel
de género (Balajee et al., 2009). Otro genes estructurales como el que codifica para la
Calmodulina (CAM), la β-tubulina (O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998;
O'Donnell et al., 2000), el gen erg-3, que codifica para la enzima esterol C-14 reductasa
(Zhang et al., 2006) y el gen que codifica para el factor de elongación de la traducción 1α
(EF-1α) (O’Donnell et al., 1998; O'Donnell et al., 2000; Hirata et al., 2001; Skovgaard et
al., 2003; O’Donnell et al., 2004; Zhang et al., 2006; O’Donnell et al., 2007), se han
utilizado para la reconstrucción filogenética de miembros que componen el complejo de
especies de Gibberella fujikuroi y otros complejos de especies de Fusarium muy
cercanos, para el esclarecimiento del origen de enfermedades causadas por miembros del
complejo de especies Fusarium oxysporum, incluso en la filogenia del complejo de
Gibberella fujikuroi y de F. verticillioides en bananos exportados por diversas zonas
productoras de México y llevadas al oriente de Asia (Zhang et al., 2006). El gen erg-3,
se ha usado también para estudiar la relación de miembros del complejo de especies de
Fusarium solani con el origen de enfermedades en cultivos agrícolas y a su vez en el
personal que tiene contacto con este tipo de cultivos. El gen RPB2, que codifica para la
segunda subunidad mayor de la enzima ARN polimerasa II se ha usado para la
identificación de miembros del género Fusarium implicados en infecciones oculares
durante los años 2005 y 2006 (O’Donnell et al., 2007).
De los genes estructurales mencionados solo el EF-1α y el RPB2 han demostrado tener
un alto nivel de resolución para el género Fusarium, es decir discriminan especies aun
dentro de complejos de especies, aunque RPB2 no es muy adecuado para el complejo F.
oxysporum, que es quizá el grupo de mayor dificultad taxonómica del género y uno de
los más importantes en plantas y humanos. Actualmente se dispone de una base de datos
denominada FUSARIUM-ID (Fusarium identification), que alberga un número
considerable de secuencias de estos dos genes y además secuencias de β-tubulina, IGS,
ITS 1 y ITS2, rDNA y RPB1; que pueden ser usados como referencia para una
18
identificación, tipificación y taxonomía y filogenia más precisa de aislamientos de
Fusarium (Geiser et al., 2004; Balajee et al., 2009).
2.3.2. Importancia del Factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) en
Fusarium.
La síntesis proteica puede ser divida en tres etapas fundamentales: iniciación, elongación
y terminación, la elongación de la traducción requiere de varios y diferentes proteínas
solubles denominadas factores de elongación (eEF’s). El paso final de la expresión génica
tiene lugar en los ribosomas en donde el ARNm se traduce en proteína. En eucariotas, el
alargamiento de la cadena polipeptídica requiere la acción orquestada de tres factores. El
complejo eucariota factor de elongación 1 (eEF1= aa-ARNt, aminoacil-ARNt; mant-
GDP, 2’-(ó-3’)-O-(N-metilantraniloil) guanosina 5’-difosfato, hace entrega de la
molécula de aminoacil-ARNt (aa-ARNt) al sitio-A libre del ribosoma en pleno proceso
de elongación (Carvalho et al., 1984). El EF-1α es una proteína G clásica que actúa como
un “activador molecular” para los estados activos e inactivos basados en la presencia y
unión de GTP o GDP (Bourne et al., 1991). En el momento en que se da la unión del
codón y el anticodón, el ribosoma actúa como un activador de la actividad GTP-asa en el
estímulo de la hidrolisis de GTP, dando como resultado la liberación del GDP unido a
EF-1α del ribosoma. En organismos eucariotas este factor también actúa en la unión de
actina y en la construcción de proteínas, siendo su homólogo en procariotas la proteína
bacteriana EF-Tu (Pittman et al., 2006). La interacción EF-1α-actina está plenamente
conservada desde las levaduras a mamíferos, sugiriendo la importancia del EF-1α en la
integridad del citoesqueleto (Kinzy et al., 1994, Pittman et al., 2009).
Actualmente el EF-1α es considerado como el gen esencial en análisis multigénicos por
las siguientes razones: 1) La presencia de una única copia en el genoma de Fusarium, 2)
la no detección de copias ortólogas, 3) su riqueza de regiones intrónicas y alto nivel de
polimorfismo entre especies estrechamente cercanas y 4) la posibilidad de generar
cebadores universales; que permiten estudios a través de los limites filogenéticos del
género (Geiser et al., 2004; O’Donnell et al., 2004). Además, la gran utilidad de la
secuencia del EF-1α es debida principalmente a que de los 656 nucleótidos que lo
19
componen en promedio 39 de ellos son considerados cladísticamente significativos, los
que a su vez se encuentran en un 95 % en regiones exónicas, con algunas pequeñas
excepciones donde se han observado fenómenos de transición de bases, lo que conlleva a
un 50 % más de información que el gen que codifica para la pequeña subunidad ribosomal
de la mitocondria del ARNr (mtSSU) (Figura 1). Al parecer el gen EF-1α ha estado bajo
pocas restricciones evolutivas como se deduce de los patrones de mutación que incluyen
delecciones de bases (O’Donnell et al., 1998). El EF-1α ha mostrado mejores resultados
que el uso de secuencias que codifican para proteínas como la β-tubulina, Calmodulina e
Histona H3 que también tienen porciones ricas en intrones, y siguen siendo útiles como
marcadores genéticos en estudios de filogenia y taxonomía específicamente de Fusarium
(Nitschke et al., 2009; Sampietro et al., 2010), como el complejo G. fujikuroi y el
complejo de especies de F. oxysporum entre otros (O’Donnell et al., 1998). Por todo lo
anterior el gen codificante para el factor de elongación de la traducción ha comenzado a
ser el marcador de elección no solo como único gen utilizado para la identificación de
Fusarium (Ferrer et al., 2005; Kvas et al., 2009; Nitschke et al., 2009; Park et al., 2010;
Sampietro et al., 2011), sino también para análisis en conjunto con varios marcadores
moleculares (multi-locus) (O’Donnell et al., 2008; Park et al., 2010; Sampietro et al.,
2010). El EF-1α ha demostrado ser altamente informativo, al punto que la base de datos
denominada FUSARIM-ID se fundamenta principalmente en este gen, aunque contiene
también secuencias para la β-tubulina, RPB1, RPB2 57, RPB2 711, IGS, ITS 1 y 2,
(Geiser et al., 2004). FUSARIM-ID se ha puesto a disposición del público en
combinación con otra serie de recursos, como la plataforma de Genómica Comparativa
de Fusarium (FCGP) y la plataforma de la Comunidad de Fusarium (FCP) (Harrow et
al., 2010), las tres se integran en Ciberinfraestrutura para Fusarium (CiF) (Park et al.,
2010).
20
Figura 1. Mapa de la región de EF-1α, con la localización de los cebadores. Tomado y
adaptado de Geiser y colaboradores (2004).
2.3.3. Importancia de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2)
en Fusarium
Los genes nucleares codificantes de proteínas implicadas en la replicación, transcripción
y traducción de la información genética se han considerado apropiados para estudios
taxonómicos y filogenéticos debido en gran medida a que no sufren procesos de
transferencia horizontal de genes en eucariotas (Liu y Hall, 2004). El gen de la segunda
subunidad mayor de la ARN polimerasa II, se encuentra en una sola copia dentro del
genoma de hongos haploides (James et al., 1991; Liu et al., 1999).
Las ARN polimerasas nucleares eucariotas I, II y III son las responsables de la síntesis de
los ARN ribosomales mayores, pre-ARN mensajero (no maduro o transcripto primario)
y de pequeños ARN ribosomales (SSU) y del ARN de transferencia, respectivamente
(ARNt). La similitud en la estructura de la segunda subunidad mayor de estas ARN
polimerasas entre los organismos eucariotas indica que son muy conservadas, cada una
de las tres polimerasas contiene de 9 a 14 péptidos con actividad transcripcional; algunas
de las subunidades son compartidas entre las ARN polimerasas, mientras que otras son
exclusivas de la enzima de cada grupo de organismos (Sweetser et al., 1987). Los genes
que codifican para las subunidades de las ARN polimerasas I, II y III coexisten desde su
ancestro eucariota inicial el cual ha sido predicho por análisis de homología en secuencias
intrónicas de Arabidopsis sp (Liu y Hall, 2004). Uno de estos genes, el RPB2, codifica
para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II, tiene como función transcribir
el ARN mensajero. Su importancia radica en que se encuentra en una sola copia dentro
21
del genoma de los ascomicetes y posee una tasa evolutiva relativamente baja, quizás
debido a que desempeña una función básica para la célula, aunque suficiente para ser
usada en taxonomía (Liu y Hall, 2004). El papel que posee esta ARN polimerasa en las
características estructurales y evolutivas de la célula es tan general que es poco afectada
por las principales fuerzas de adaptación evolutiva (Liu y Hall, 2004).
La ARN polimerasa II, que transcribe el pre-ARNm; está formada de complejos
agregados cuyas subunidades estructurales están bien definidas (Sweetser et al., 1987;
Liu et al., 1999). El gen que codifica para la segunda subunidad mayor de la ARN
polimerasa II tiene una longitud aproximada de 1.8 kb (O’Donnell et al., 2007), que
codifica para una proteína de 138750 Dalton, que contiene aminoácidos implicados en la
unión de nucleótidos de purinas e iones de zinc, como es el caso del sitio catalítico para
la síntesis de ARN de la ARN polimerasa de Escherichia coli (Sweetser et al., 1987;
O’Donnell et al., 2007; Ruprich-Robert G y Thuriaux P. 2010). El uso de la RPB2 como
marcador molecular se inició como alternativa a la región de la pequeña subunidad del
ribosoma nuclear (SSU ADNr) comúnmente usada en la sistemática molecular de
ascomicetes (Liu et al., 1999; Hansen et al., 2005) (Figura 12).
Las diversas regiones del gen tienen diferentes tasas de evolución, y por tanto
dependiendo del segmento usado, pueden ser útiles para análisis de taxonomía y filogenia
a nivel de especies (Hansen et al., 2005). Las secuencias de la RPB2 por lo general tienden
a generar alineamientos poco conflictivos y con más sitios informativos que las
secuencias ribosomales (Wang et al., 2004). La región de la RPB2, de mayor tasa
evolutiva y por lo tanto de mayor importancia de análisis de taxonomía, es aquella que se
encuentra entre los dominios 6-7 (Liu et al., 1999; Hansen et al., 2005). A nivel de
especie, esta región posee mayor resolución y soporte de clados que la LSU y β-tubulina
(Hansen et al., 2005; Matheny, 2005).
Análisis estadísticos no ponderados de Máxima Parsimonia, revelaron que el gen RPB2
contiene aproximadamente 608 caracteres informativos en el género Fusarium
(O’Donnell et al., 2007). La región de la RPB2 cuenta con el mayor número de caracteres
informativos potencialmente parsimoniosos (58.95%), en comparación con el segmento
22
5’ del LSU ADNr (22.56 %) y de la β-tubulina (18.49 %), es decir es 1.48 veces mayor
señal filogenética (Hansen et al., 2005). Conjuntamente los exones de la RPB2 exhiben
un alto porcentaje como potenciales caracteres informativos para análisis de parsimonia,
en relación con los exones de LSU y β-tubulina los cuales poseen porcentajes similares
entre sí (Hansen et al., 2005). Doce regiones altamente conservadas, con un 85 % de
identidad en sus secuencias de aminoácidos fueron, identificadas por comparación de las
secuencias RPB2 de hongos, plantas y animales (Liu et al., 1999); cuatro intrones están
presentes en la secuencia de la RPB2, pero la presencia o ausencia de estos intrones parece
haberse dado al azar dentro del orden Pezizales. Esto confirma los resultados de Liu y
colaboradores (1999), que sugieren que los intrones en el gen pudieron haber sido
ganados o perdidos frecuentemente durante la evolución de los hongos (Liu et al., 1999;
Hansen et al., 2005).
Con el uso del gen RPB2 se han encontrado excelentes resultados como marcador
taxonómico y filogenético en diferentes grupos fúngicos a diferentes niveles de la escala
taxonómica como lo son clases y subclases del reino Fungí, principalmente de los
Pezizales (Liu y Hall, 2004; Frøslev et al., 2005). En el caso específico del genero
Fusarium y sus complejos de especies se ha observado bajos niveles de resolución de
clados basales como el complejo de especies de F. solani y el complejo de F. dimerum, y
sobre todo del complejo de especies de F. oxysporum. Por esto es necesario la búsqueda
de otros loci filogenéticamente más informativos para contribuir a resolver la taxonomía
de todo el género Fusarium (O’Donnell et al., 2007).
Partiendo de lo anterior y teniendo en cuenta que la identificación morfológica es
compleja y requiere de especialistas y su criterio aun genera preguntas taxonómicas no
ofrece una garantía en la identificación de especies de Fusarium y dada la importancia
económica de este género, se hace necesaria el uso de metodologías complementarias
pero nunca suplementarias como la aplicación de técnicas moleculares para su
identificación. Es indispensable el uso de múltiples loci para aumentar la precisión en las
técnicas de identificación molecular de especies, sobre todo en especies de Fusarium
implicadas o relacionadas a humanos con enfermedades como son: F. solani y F.
oxysporum.
23
Casos como el del complejo de especies Gibberella fujikuroi en donde se sabe que es un
grupo monofilético que contiene una mezcla de especies de Fusarium sp con rasgos
morfológicos similares que complica su identificación en cualquiera de sus dos estados,
sexual o asexual, la aplicación de este tipo de estrategias ha permitido revelar que este
complejo está compuesto por al menos 50 especies, de las cuales 34 se han logrado
diferenciar mediantes caracteres morfológicos y 10 por criterios de fertilidad sexual; 20
de ellas producen uno o más micotoxinas, demostrando nuevamente la alta variabilidad
de este género (Kvas et al., 2009).
El complejo de especies de F. oxysporum alberga especies de alto grado de ubicuidad y
especialmente de patogenicidad a cultivos de importancia agrícola, en este caso la
aplicación de herramientas moleculares corrobora la heterogeneidad de dicho complejo,
de tal manera que las topologías obtenidas mediante el uso de diferentes marcadores como
ADNr 18S y 28S, EF-1α, MAT-1 (1-2), no son totalmente coincidentes en un grupo de
muestras evaluadas por Lievens y colaboradores en el año 2009, las cuales abarcaron
puntos clave de la geografía mundial especialmente por su importancia agrícola y la
repetida presentación de casos de infección de plantas con este complejo de especies
(Lievens et al., 2009).
Otro caso de gran relevancia es el presentado en el complejo de especies de F. solani ya
que sus miembros son responsables de aproximadamente dos tercios de los casos de
fusariosis en humanos, animales y además algunos son fitopatógenos de importancia
económica. La aplicación de estudios filogenéticos moleculares ha permitido diferenciar
alrededor de 45 especies dentro de este complejo, distribuidas en tres clados (O’Donnell
et al., 2008).
En el caso específico del complejo de especies de F. graminearum hasta hace pocos años
se creía que se trataba de una sola especie cosmopolita teniendo en cuenta solo
caracterización morfológica, pero la aplicación de técnicas moleculares ha permitido
distinguir al menos 11 especies filogenéticamente distintas con una marcada y clara
distribución biogeográfica. Esto es importante ya que dentro de este complejo se incluye
24
importantes patógenos de cereales fuente primaria de alimentación en algunos países en
desarrollo (O’Donnell et al., 2008).
Otro caso de gran importancia debido a la similitud de los patrones de reportes médicos
se presenta entre Cylindrocarpon lichenicola y Acremonium falciforme con miembros del
complejo de especies F. solani, los cuales generaron un alto grado de preocupación y por
ende la revisión de su cercanía y afinidades filogenéticas a pesar de que sus caracteres
morfológicos conidiales son diferentes; fue resuelto gracias a métodos de secuenciación
y uso de secuencias para análisis de filogenia multilocus, permitiendo el esclarecimiento
de estas dudas y devolviendo el nombre original de Fusarium lichenicola C. B.
Massalongo 1951 y proponiendo la nueva especie denominada Fusarium falciforme
(Taylor et al., 2000; Summerbell y Schroers, 2002).
Análisis de filogenia hechos por Knutsen y colaboradores, (2004) basándose en la
secuencia del gen EF-1α, permitieron revalidar la clasificación de F. langsethiae como
un taxa separado en la sección Sporotrichiella de F. sporotrichioides, mientras que F.
kyushuense es taxón hermano de F. poae (Knutsen et al., 2004).
Figura 2. Mapa de la región RPB2, las cajas negras y los números anteriores representan
los 12 motivos de aminoácidos que se conservan en todos los eucariotas. Las posiciones
de los cebadores se representan mediante flechas.
25
3. OBJETIVOS.
3.1 Objetivo General.
Estudiar la taxonomía y diversidad de aislamientos de Fusarium obtenidos a partir de
muestras clínicas mediante el uso de dos marcadores moleculares de referencia.
3.2 Objetivos específicos.
3.2.1 Estimar la variabilidad molecular de los aislamientos de Fusarium con base en
secuencias de los genes: factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda
subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2).
3.2.2 Analizar la relación evolutiva entre los genotipos de Fusarium con base en la
secuenciación de los genes factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda
subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2).
26
4. METODOLOGÌA
4.1 Población y muestra.
Las cepas de Fusarium fueron obtenidas de 59 individuos que acudieron de manera
particular o remitidos por alguna institución prestadora de salud (IPS), al laboratorio de
Micología Médica y Experimental (MME) de la Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB) en el periodo comprendido entre los años 2004 y 2006; con el fin de
realizarse un exámen directo y cultivo de la lesión. Cada paciente se sometió a una
encuesta donde se incluían datos sociodemográficos (edad, residencia, ocupación),
antecedentes y consumo de antimicóticos entre otros. Posteriormente se procedió a la
toma de la muestra. Las muestras fueron obtenidas a partir de uñas de manos y pies,
córnea, piel, abdomen y fueron sembradas en agar Saboraud, PDA y Mycosel, e incubadas
a temperatura ambiente por un periodo entre 1 y 3 semanas. Una vez se obtuvo
crecimiento macroscópico, las colonias identificadas como Fusarium sp. se almacenaron
en viales con agua estéril hasta su posterior uso. Este procedimiento fue llevado a cabo
en el laboratorio de Micología Médica y Experimental (MME) de la CIB (Giraldo, 2010).
4.2 Cepas.
Las cepas de Fusarium spp obtenidas a partir de aislamientos clínicos, fueron cultivadas
en los medios Agar PDA, Mycosel y/o Saboraud a temperatura ambiente (25ºC) y
mantenidas en agua estéril antes de realizar el procedimiento de extracción de ADN, en
las instalaciones del Laboratorio de Biología Molecular Bloque 19 de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medellín (Giraldo, 2010). La confirmación de la identidad de
cada aislamiento como perteneciente al género Fusarium por descripción de las
características morfológicas y por detección molecular fue llevada a cabo durante la tesis
de maestría en Biotecnología de Giraldo D. en 2010, con la ayuda de cepas de referencia
donadas por el laboratorio de Microbiología y Fitopatología de la Universidad de los
Andes, LAMFU al laboratorio de Micología de la CIB (Giraldo, 2010).
27
4.3 Extracción y purificación de ADN
Después de diez días de incubación, en una cámara de flujo laminar, una porción del
cultivo de cada aislamiento se maceró con Nitrógeno líquido para proceder a realizar la
extracción de ADN por el método de Fenol-Cloroformo Alcohol-Isoamílico descrito
previamente por Sambrook y Russell (2001). Posterior a la extracción, el ADN se
resuspendió en 40 μL de agua estéril, se cuantificó a 260 nm en un espectrofotómetro
(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific) y se cualificó mediante electroforesis en gel
de Agarosa al 2 % teñido con 5 µl de Bromuro de Etidio 0,5 µg/ml en Buffer TBE 1.0 X
a 70 V por una hora. Después de conocer la concentración de ADN se hizo la
correspondiente dilución con el fin de obtener una concentración de 25 ng/µl de ADN
para todas las cepas.
4.4 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2.
La amplificación del fragmento de 716 pb del gen que codifica para el factor de
elongación de la traducción EF-1α se hizo con el par de oligonucleótidos ef1H y ef2T,
dichos cebadores fueron diseñados mediante la comparación de las secuencias de
miembros de los complejos más representativos de Fusarium como son sus teleomorfos
Gibberella fujikuroi, G. zeae, F. solani, y F. oxysporum, (Figura 3A). (Tabla 1)
(O’Donnell et al., 2008), bajo las siguientes condiciones: una etapa de desnaturalización
inicial a 94 ºC por 5 min, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 30 seg,
alineamiento a 57 ºC por 1 min y extensión a 72 ºC por 1min, por último una etapa de
extensión a 72 ºC por 10 min (O’Donnell et al., 2008). Los dos fragmentos del gen que
codifican para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II, RPB2-57 y RPB2-
711, se amplificaron con los pares de oligonucleótidos; RPB2-57 5f2/7cR y RPB2-711
7cF/11aR, respectivamente; estos cebadores fueron diseñados por Liu y colaboradores en
1999 durante un estudio que comparó 27 secuencias de especies de organismos
ascomicetes y su amplio uso en el género Fusarium se inició por O’Donnell y colaborados
en el año 2008 (Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008) (Tabla1), que en conjunto
amplifican un fragmento de aproximadamente 1738 pb (O’Donnell et al., 2008). Las
condiciones de amplificación por PCR para RPB2-57 y RPB2-711 fueron: una etapa de
28
desnaturalización inicial a 94 ºC por 90 seg, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a
94 ºC por 30 seg., alineamiento a 55 ºC y 57 ºC (para RPB2-57 y RPB2-711,
respectivamente) por 90 seg. y extensión a 68 ºC por 2 min, por último una etapa de
extensión a 68 ºC por 5 min (O’Donnell et al., 2008). Las condiciones de las mezclas de
PCR para cada fragmento se detallan en la Tabla 2.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en diferentes termocicladores
(T3000® BIOMETRA, PTC-100 MJ ResearchTM y MultiGene Labnet Gradient). Como
control negativo se utilizó la misma mezcla para la PCR pero sin ADN.
Las cepas de F. solani (código 030790), F. oxysporum (código 041898) y F.
verticillioides (código 032989) se utilizaron como control positivo y fueron donadas por
el laboratorio de Microbiología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, LAMFU
(Bogotá, Colombia) al laboratorio de Micología de la CIB. Los productos finales de la
amplificación fueron purificados con el kit de Qiagen, siguiendo las indicaciones del
fabricante y mantenidos a - 20 ºC hasta el momento de su secuenciación.
Tabla 1. Descripción de los cebadores utilizados para la amplificación por PCR y
secuenciación parcial de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de Fusarium spp.
procedentes de muestras clínicas.
Región de
amplificación Cebador Uso Secuencia ( 5’- 3’)a
Tamaño
del
fragmento
Temperatura
de
alineamiento
(°C)
EF-1α ef-1H
ef-2T Amplificación
5’-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3
5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’ ~716 pb 57
EF-1α ef3
ef22T Secuenciación
5’-GTAAGGAGGASAAGACTCACC-3’
5’-AGGAACCCTTACCGAGCTC -3’ N/A N/A
RPB2-57 5F2
7cR
Secuenciación
Amplificación
5’-GGGGWGAYCAGAAGAAGGC-3’
5’-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3’ ~977 pb 55
RPB2-711 7cF
11aR
Secuenciación
Amplificación
5’-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3’
5’-GCRTGGATCTTRTCRTCSACC-5’ ~1135 pb 57
(N/A: No aplica). a S = C ó G, W = A ó T, R = A ó G, Y = C ó T.
29
Tabla 2. Composición de las mezclas de PCR para la amplificación de los fragmentos de
los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de Fusarium sp .procedentes de muestras
clínicas.
Reactivo EF-1α RPB2-57 RPB2-711
Agua Mili-Q 16.49 µl 16.62 µl 16.62 µl
Buffer de Taq polimerasa 2,5 µl (10X) 2,5 µl (10X) 2,5 µl (10X)
MgCl2 1, 5 µl (25 mM) 1,25 µl (mM) 1,25 µl (mM)
dNTP 2 µl (20 mM) 1 µl (mM) 1 µl (mM)
Cebadores 0,63 µl (20 µM) 1 µl (mM) 1 µl (mM)
BSA - 0,5 µl 0,5 µl
Taq polimerasa 0,25 µL (5U/µl) 0,13 µL 5 U/ µl 0,13 µL 5 U/ µl
ADN molde 1 µl (25µg) 1 µl (25µg) 1 µl (25µg)
Volumen final (µl) 25µl 25 µl 25 µl
4.5 Electroforesis, procesamiento y análisis de imágenes
Todos los productos de PCR amplificados fueron confirmados mediante electroforesis.
De cada producto se corrió 4 µl en un gel de agarosa al 1 % teñido con 5 µl de Bromuro
de Etidio 0,5 µg/ml y 1 % GelStar® 0,01 µg/ml para EF-1α y RPB2 respectivamente, en
Buffer TBE 1.0 X a 70 V por una hora. Posteriormente se observaron a través de un
transiluminador de luz ultravioleta y/o un transiluminador de luz visible, respectivamente
para ser fotografiados y grabados en un computador. El tamaño de cada fragmento se
determinó por comparación con el marcador de peso molecular de 100pb Plus DNA
Ladder (Fermentas®) (Sambrook y Russell, 2001) (Figura 3).
4.6 Secuenciación de fragmentos de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de
Fusarium sp.
Los productos de la amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2 (RPB2-57 y
RPB2-711), fueron secados en una Eppendorf Vacufuge Concentrator Basic, a
temperatura ambiente, resuspendidos en 10 µl de agua Mili-Q y se enviaron a Macrogen®
Korea para su secuenciación. Los fragmentos del gen EF-1α fueron secuenciados con los
cebadores ef3 y ef22T (Tabla 1); los fragmentos de RPB2-57 con los cebadores 5f2 y 7cR
(Tabla 2) y los fragmentos de RPB2-711 con los cebadores 7cF y 11aR (Tabla 2)
30
(O’Donnell et al., 2008). Cada fragmento se secuenció en ambas direcciones en un
secuenciador automático capilar ABI3730XL, en Macrogen Korea.
4.7 Edición y análisis de secuencias
La edición de secuencias que codifican para el factor de elongación de la traducción EF-
1α y la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II RPB2, se hizo con el programa
BioEdit (Hall T, 1999); a continuación se determinó la secuencia consenso de cada
aislamiento mediante la edición manual y alineamiento de las secuencias en ambos
sentidos. Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple con todas las secuencias de
cada gen con el programa Clustal W (Larkin et al., 2007).
4.8 Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del
género Fusarium procedentes de muestras clínicas
El alineamiento permitió agrupar las secuencias con base en su similitud para determinar
las regiones variables y conservadas dentro de éstas. Seguidamente se realizó un análisis
BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool), de cada secuencia, en la base de datos
Fusarium-ID disponible en la página web: (http://isolate.Fusariumdb.org/blast.php) de la
base de datos Cyber-infrastructure for Fusarium (CiF) con el objetivo de determinar la
especie a que pertenece cada aislamiento.
4.9 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias
El análisis de entropía de las secuencias se realizó con base en la diversidad haplotípica
y divergencia genética, además se identificaron los sitios monomórficos, polimórficos,
parsimoniosamente informativos, singletones, InDels (Inserciones-Delecciones),
patrones de sustitución de nucleótidos y matrices de distancia con los paquetes
informáticos BioEdit (Hall T., 1999), DAMBE (Xia, X., 2013), DnaSP (Librado, P. y
Rozas J., 2009) y MEGA (Tamura et al., 2011), los cuales permitieron observar la
separación de los aislamientos en grupos que corresponden o no a especies o complejos
de especies. En este análisis se incluyó secuencias de genotipos de cepas de referencia de
31
Fusarium y como grupo externo, Fusarium dimerum ET-grFD_01824 para EF-1α y
Fusarium dimerum ET-grFD_01824 para RPB2 para los análisis de la totalidad de los
aislamientos; para los análisis que involucraron las aislamientos identificados como
miembros del complejo de especies de Fusarium solani y de Fusarium oxypsorum por
separado, se usaron como grupos externos, las secuencias de los genes EF-1α y RPB2 de
Fusarium chlamydosporum FD_01697, Fusarium dimerum ET-grFD_01824 y Fusarium
napiforme FD_01181 como miembro del complejo de especies de Gibberella fujikuroi,
estas secuencias fueron obtenidas de la base de datos Fusarium-ID (O’Donnell et al.,
2010).
4.10 Taxonomía de aislamientos de Fusarium a partir de los genes EF-1α y RPB2.
Las secuencias consenso de los genes EF-1α y RPB2 de cada aislamiento fueron alineadas
mediante el uso de MUSCLE (Edgar, 2004). Posterior a ello se llevó a cabo un cálculo
de distancias genéticas de acuerdo al modelo de sustitución Kimura-2-parámetros y se
construyeron los dendrogramas de cada gen, mediante los algoritmos de Neighbor-
Joining¸ Máxima Verosimilitud y Máxima Parsimonia (bootstrap = 5000), al igual que la
concatenación de las secuencias de dichos genes para todos los aislamientos identificados
y de manera separada para los aislamientos pertenecientes a los complejos de especies de
F. oxysporum y F. solani. Al consenso de bootstrap se le colapsaron las ramas con valores
superiores al 50%, dispuesto en el paquete informático MEGA (Tamura et al., 2011).
Posteriormente se procedió a la elaboración de árboles para cada conjunto de secuencias
mediante métodos bayesianos, permitiendo observar los nodos que tuvieran una
probabilidad posterior de clado ≥ 70%, mediante el uso del paquete informático BEAST
(Drummond et al., 2012).
4.11 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas.
Posteriormente, la identificación molecular de la especie de cada aislamiento clínico de
Fusarium, se correlacionó con los siguientes datos epidemiológicos: edad, género,
patología y ubicación de la lesión, con el fin de intentar establecer alguna correspondencia
entre dichas variables y los aislamientos analizados.
32
5. RESULTADOS
5.1 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2.
La amplificación por PCR, con el juego de cebadores ef-1H y ef-2T, del fragmento de
EF-1α de los 59 aislamientos de Fusarium dio como resultado amplificados de
aproximadamente 716 pares de bases que corresponde a la región comprendida entre el
primer y cuarto (ultimo) exón del gen, el cual a su vez contiene tres intrones (Figura 1).
En el presente estudio se amplifico esta región génica a partir del ADN de todos los 59
aislamientos estudiados.
La amplificación por PCR de la sección 5-7 del gen codificante para RPB2 con los
cebadores 5F2 y 7cR, abarca los dominios de mayor grado de conservación del gen RPB2,
dando como resultado un amplicon de aproximadamente 977 pares de bases (Figura 2 y
Figura 3B). (Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008).
La amplificación de la región 7-11 del gen codificante para RPB2 con los cebadores 7cF
y 11aR dio como resultado un amplificado de aproximadamente 1135 pares de bases,
(Figura 3C). De igual manera estos cebadores fueron diseñados por Liu y colaboradores
(1999) y adoptados años más tarde al análisis de aislamientos de Fusarium por O’Donnell
(Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008).
Las regiones 5-7 y 7-11 del gen RPB2 fueron amplificadas a partir del ADN del total de
los 59 aislamientos analizados (Figura 3C).
33
Figura 3. Electroforesis de fragmentos amplificados por PCR de los genes EF-1α, RPB2
5-7 y RPB2 7-11 de aislamientos clínicos del género Fusarium. A. Fragmentos
amplificados con el juego de cebadores ef-1H/ef-2T. Carril 1: 55444; 2: 55496; 3: 55498;
4: 56665; 5: 56868; 6: 57081; 7: 58025; 8: 63414; 9: 63901; 10: 64927; 11: 65068; C+
Control positivo 030790; C- Control negativo. B. Fragmentos amplificados con el juego
de cebadores 5F2 y 7cR. Carril 1: 55588; 2: 56301; 3: 57228; 4: 63550; C+ Control
positivo 041898; C- Control negativo. C. Fragmentos amplificados con el juego de
cebadores 7cF y 11aR. Carril 1: 55399; 2: 56094; 3: 57239; 4: 63316; C- Control
negativo; C+ Control positivo 032989, MP Marcador de Peso Molecular 100 pb plus.
5.2 Identificación molecular a nivel de complejo de especie de aislamientos clínicos
de Fusarium spp.
En este estudio el análisis BLAST de las secuencias del gen EF-1α en la base de datos
Fusarium-ID permitió identificar cada uno de los 59 aislamientos, 33 pertenecen al
complejo F. oxysporum, 25 al complejo F. solani y un único aislamiento (56665) al
complejo F. incarnatum-equiseti (Tabla 3). Los resultados estadísticos referentes a
34
valores de coincidencia exacta o de similitud absoluta (100%), con las secuencias de
aislamientos encontradas en la base de datos fue solo observada en 33 aislamientos (19
aislamientos del complejo de Fusarium oxysporum y 14 aislamientos del complejo de
Fusarium solani y los 26 aislamientos restantes presentaron porcentajes de similitud por
encima del 98.25 %.
El análisis BLAST de las secuencias codificantes para el gen RPB2 en la base datos
Fusarium-ID arrojó incongruencias, en la identidad de los 59 aislamientos, definidas estas
como diferencias en la identidad obtenida a nivel de complejos de especies y/o
aislamientos, siendo marcadamente distintas a las registrados por EF-1α y sin el mismo
soporte estadístico, correspondiendo a 42 aislamientos identificados como miembros del
complejo F. solani y 17 como F. staphylae. Los valores estadísticos que soportan estas
identidades demostraron que solo 22 aislamientos presentaron porcentajes de
coincidencia exacta o similitud absoluta (100 %), mientras que los 37 aislamientos
restantes mostraron dichos valores tan bajos como del 84.82 % (aislamiento 55498),
sumado a ello los valores (Score) de similitud máxima de 999.99 se presentaron en 53
aislamientos, mientras los restantes seis aislamientos presentaron valores de 575;
resultados en los valores E (Expect) de 0 fueron observados en 54 aislamientos, pero en
cinco del total de los aislamientos se observaron valores lejanos de 0, siendo el más lejano
de 1E-165 correspondiendo a una posibilidad significativa de encontrar más de un registro
de referencia con la misma secuencia.
El análisis BLAST de las secuencias codificantes para el gen RPB2 en la base datos
Fusarium-ID arrojó incongruencias en la identidad de varios de los 59 aislamientos,
respecto a la determinada por EF-1α, 42 aislamientos se identificaron como miembros del
complejo F. solani y 17 como F. staphylae. Los valores estadísticos que soportan estas
identidades mostraron que solo 22 aislamientos presentaron porcentajes de coincidencia
exacta o similitud absoluta (100 %), mientras que los 37 restantes mostraron valores entre
99.88 % y el 84.82 % (aislamiento 55498), sumado a ello los valores (Score) de similitud
máxima de 999.99 se presentaron en 53 aislamientos, mientras los restantes seis
aislamientos presentaron valores de 575. El valor E (Expect) de 0 fue observado en 54
aislamientos, los cinco restantes el valor fue lejano de 0, como 1E-165, que indica una
posibilidad significativa de encontrar más de un registro de referencia con la misma
35
secuencia. Partiendo de lo anterior y para fines prácticos la identidad de los 59
aislamientos se basó en los resultados obtenidos por las secuencias de EF-1α, de acuerdo
a sus altos valores estadísticos obtenidos y altos niveles de confianza demostrada.
Tabla 3. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del
género Fusarium obtenidos de muestras clínicas.
Aislamiento
Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
55347 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-e
NRRL43458
(92.93%)
999.99/0
55349 F Uña pie
F. solani species
complex 2-a
NRRL43433
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-j
NRRL43649
(99.88%)
999.99/0
55444 M Uña pie
F. oxysporum
species complex 5
NRRL22533
(99.7%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(100%)
999.99/0
55466 M Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(98.15%)
999.99/0
55496 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 52
NRRL38540
(99.54%)
999.99/0
F. solani species
complex 25-a
NRRL31169
(100%)
999.99/0
55498 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 22
NRRL38608
(99.7%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(84.82%)
575.00/1
E-165
55529 M Uña pie
F. oxysporum
species complex 147
NRRL36251
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(85.3%)
674.00/
1,00 E-60
36
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
55583 M Desconocido
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (98.34%) 999.99/0
55585 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(99.7%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (85.29%)
700.00/
8,00 E-70
55588 F Piel
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.31%) 999.99/0
55762 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(99.85%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (97.96%) 999.99/0
55787 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 195
NRRL38322
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.65) 999.99/0
55827 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 16
NRRL38597
(99.68%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(85.2%)
706.00/
1,00 E-66
55861 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.88%) 999.99/0
55945 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(99.88%)
999.99/0
55979 M Córnea
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.88%) 999.99/0
56054 M Piel
F. solani species
complex 3+4-ss
NRRL32729
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 3+4-b
NRRL43537
(100%)
999.99/0
37
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
56094 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (100%) 999.99/0
56212 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(100%)
999.99/0
56240 F Uña pie
F. solani species
complex 1-a
NRRL28546
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(99.54%)
999.99/0
56301 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-j
NRRL43649
(100%)
999.99/0
56320 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 17-a
NRRL22157
(84.86%)
682.00/
7,00 E-59
56321 F Uña mano
F. solani species
complex 29-a
NRRL28008
(99.12%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-g
NRRL43490
(97.79%)
999.99/0
56323 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 232
NRRL39464
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(100%)
999.99/0
56337 F Uña pie
Fusarium solani
FD_01371
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 5-l
NRRL32791
(100%)
999.99/0
56340 F Uña pie
F. solani species
complex 34-a
NRRL46703
(99.4%)
999.99/0
F. solani species
complex 5-l
NRRL32791
(98.63%)
999.99/0
56363 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (97.67%) 999.99/0
38
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
56604 F Uña pie
F. solani species
complex 2-v
NRRL32838
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-g
NRRL43490
(95.69%)
999.99/0
56665 F Piel
F. incarnatum-
equiseti species
complex 1-a
(98.25%)
999.99/0
F. solani species
complex 12-d
NRRL32309
(99.88%)
999.99/0
56780 F Uña pie
F. solani species
complex 2-k
NRRL31165
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 2- j
NRRL43649
(100%)
999.99/0
56868 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(99.7%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-j
NRRL43649
(99.88%)
999.99/0
56891 M Uña pie
Fusarium solani
FD_01371
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 5-d
NRRL43681
(100%)
999.99/0
56894 M Uña pie
F. solani species
complex 1-a
NRRL28546
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(99.84%)
999.99/0
56988 M Córnea
F. solani species
complex 25-a
NRRL31169
(99.11%)
999.99/0
F. solani species
complex 25-a
NRRL31169
(100%)
999.99/0
57221 F Uña pie
F. solani species
complex 1-a
NRRL28546
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(100%)
999.99/0
57228 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 47
NRRL26225
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(100%)
999.99/0
57335 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-j
NRRL43649
(98.97%)
999.99/0
39
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
57560 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 195
NRRL38322
(99.56%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (98.45%) 999.99/0
57721 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL3851
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(98.8%)
999.99/0
57885 M Uña pie
F. oxysporum
species complex
33 NRRL38515
(99.85%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (100%) 999.99/0
57949 F Uña pie
F. solani species
complex 3+4-c
NRRL43536
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 3+4-c
NRRL43536
(100%)
999.99/0
58023 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 232
NRRL39464
(99.12%)
999.99/0
F. solani species
complex 3+4-c
NRRL43536
(99.88%)
999.99/0
58025 M Uña pie
F. solani species
complex 7-b
NRRL32323
(99.7%)
999.99/0
F. solani species
complex 7-c
NRRL32794
(98.58%)
999.99/0
62698 M Abdomen
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (100%) 999.99/0
62802 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(99.56%)
999.99/0
F. solani species
complex 19-b
NRRL22346
(96.32%)
999.99/0
63145 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 195
NRRL38322
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.2%) 999.99/0
63200 F Uña pie
F. solani species
complex 2-v
NRRL32838
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-v
NRRL32838
(100%)
999.99/0
40
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
63316 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(99.85%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (100%) 999.99/0
63414 M Uña pie
F. oxysporum
species complex 5
NRRL22533
(99.7%)
999.99/0
F. solani species
complex 27-a
NRRL37625
(100%)
999.99/0
63447 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-e
NRRL43458
(100%)
999.99/0
63613 F Uña mano
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(99.41%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (85.29%) 694.00/0
63635 F Uña pie
F. solani species
complex 2-k
NRRL31165
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-g
NRRL43490
(96.71%)
999.99/0
63649 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (95.72%) 999.99/0
63666 F Uña mano
F. oxysporum
species complex 195
NRRL38322
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 12-d
NRRL32309
(99.65%)
999.99/0
63749 M Uña mano
F. solani species
complex 20-d
NRRL32858
(99.1%)
999.99/0
F. solani species
complex 5-d
NRRL43681
(100%)
999.99/0
63768 F Uña pie
F. oxysporum
species complex 33
NRRL38515
(100%)
999.99/0 Fusarium
staphyleae (99.88%) 999.99/0
63917 F Uña pie
F. solani species
complex 2-b
NRRL43373
(99.85%)
999.99/0
F. solani species
complex 2-e
NRRL43458
(99.71%)
999.99/0
41
Aislamiento Genero
del
Hospedero
Localización
de la lesión
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID EF-1α
Puntaje
/Valor E
de EF-1α
Identidad molecular
asignada (%) BLAST
Fusarium-ID RPB2
Puntaje
/Valor E
de RPB2
64765 F Uña pie
F. solani species
complex 1-a
NRRL28546
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(99.54%)
999.99/0
65068 F Uña pie
F. solani species
complex 1-a
NRRL28546
(100%)
999.99/0
F. solani species
complex 1-c
NRRL43812
(100%)
999.99/0
5.3 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias
5.3.1 Caracterización de las secuencias.
La cantidad de sitios monomórficos de las regiones secuenciadas representan cerca del
48 % de la longitud total del gen EF-1α (858 pb) y del 39 % de RPB2 (1870 pb) (Tabla
4). El análisis de abundancia de sitios polimórficos fue de 23,5 % para el gen EF-1α y de
33 % para RPB2; por otro lado el número de sitios parsimoniosamente informativos
representó el 68 % para EF-1α y 71 % para RPB2, del polimorfismo observado en estas
secuencias; los cuales demuestran el grado de variabilidad suficiente para llevar a cabo la
diferenciación de aislamientos en complejos de especies del genero Fusarium. El número
de singletons, fue relativamente bajo, correspondió a 7,5 % y 9,5 % para EF-1α y RPB2.
El número de fenómenos de inserciones/delecciones detectados en los dos conjuntos de
secuencias fue muy similar, ya que representó el 11,6 % para EF-1α y el 11,8 % de RPB2
Además de los conjunto de secuencias se determinaron 55 haplotipos con EF-1α y 58 con
RPB2, lo que corresponde con un alto grado de variabilidad haplotípica, de 0,9977 para
EF-1α y de 0,9994 para RPB2 (Tabla 4).
42
Tabla 4. Características e información de los alineamientos de las secuencias de EF-1α y
RPB2.
Marcador
(longitud)
Sitios
Monomórficos
Sitios
Polimórficos
Sitios
Parsimoniosamente
informativos
Singletones InDels
(I)
N° de
Haplotipos
(h)
Diversidad
Haplotípica
(Hd)
EF-1α
(858 pb) 412 202 138 64 100 55 0,9977
RPB2
(1870pb) 744 618 439 179 221 58 0,9994
5.3.2 Estimación de patrones de sustitución.
El análisis de patrones de sustitución corroboró que la probabilidad presentarse
fenómenos de transición es mayor que la probabilidad de fenómenos de transversion, el
cambio de bases entre pirimidinas fue del 19,7 % en promedio y del 17,7 % para los
cambios Citosina (C) a Timina (T) y 21,69 % para los cambio de Timina (T) a Citosina
(C), específicamente, para el conjunto de secuencias de EF-1α, lo que justifica en gran
medida la presencia de zonas de marcada entropía, sitios parsimoniosamente informativos
y variabilidad monomórfica y polimórfica a nivel de nucleótidos (Tabla 5).
Igualmente el análisis de probabilidad compuesta de patrones de sustitución para el
conjunto de datos correspondientes a las secuencias de RPB2, demostró que las
probabilidades de los fenómenos de transición son mayores que las probabilidades de
transversión, la probabilidad de cambios entre pirimidinas (Citosina (C) y Timina (T))
fue del 20,9 % y 23,77 % respectivamente (Tabla 6).
43
Tabla 5. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de
nucleótidos de EF-1α.
A T C G
A - 5.11 6.26 9.76
T 4.59 - 21.69 4.51
C 4.59 17.7 - 4.51
G 9.94 5.11 6.26 -
Tabla 6. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de
nucleótidos de RPB2.
A T C G
A - 3.99 4.53 10.51
T 4.33 - 23.77 4.53
C 4.33 20.9 - 4.53
G 10.05 3.99 4.53 -
5.3.3 Distancias genéticas.
Los valores de distancias genéticas entre el conjunto de datos de EF-1α obtenidos en este
análisis mostraron una marcada distancia entre los aislamientos de los complejos de
especies de Fusarium solani, Fusarium oxyporum y Fusarium incarnatum-equiseti,
corroborando la clara asignación de identidades a cada uno de los aislamientos evaluados
y la agrupación de los aislamientos con base en los complejos de especies asignados. Es
de resaltar la marcada distancia observada entre los aislamientos de los complejos de
Fusarium oxysporum y de Fusarium solani (0,222) y entre los aislamientos de los
complejos de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium solani (0,238) y la posible
cercanía existente entre los miembros de los complejos de Fusarium oxysporum y
Fusarium incarnatum-equiseti, con una distancia registrada menor (0,163).
Adicionalmente estas relaciones se ven confirmadas con los bajos valores en la variación
estándar mostrada por las distancias de los diferentes complejos de especies analizados
de Fusarium (Tabla 7).
44
Las distancias genéticas obtenidas entre las secuencias de RPB2 evaluadas mostraron la
marcada distancia entre los aislamientos de los complejos de Fusarium oxysporum y de
Fusarium solani (0,161), y entre los miembros de los complejos de Fusarium incarnatum-
equiseti y de Fusarium oxysporum (0,159); en contraste se observó la poca distancia entre
los individuos de los complejos de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium solani
(0,034), lo que es consistente con los valores de desviación estándar de dichas distancias
genéticas entre los aislamientos de los diferentes complejos de especies (Tabla 8).
Al comparar los análisis de distancias genéticas para las secuencias de los dos genes, se
puede observar la incongruencia existente entre dichos resultados, ya que a diferencia de
la marcada distancia existente entre los tres complejos de especies identificados Fusarium
oxysporum, Fusarium solani y Fusarium incarnatum-equiseti por análisis de EF-1α, los
resultados de RPB2 muestran, además de menores valores de distancia, una marcada
cercanía entre los complejos de especies de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium
solani, debiéndose lo anterior muy posiblemente al bajo poder de resolución de este
marcador en el complejo de especies de Fusarium oxysporum que a su vez afecta las
distancias obtenidas entre los demás complejos de especies.
Tabla 7. Matriz de Distancias Genéticas de EF-1α.
Variación estándar
Distancias F. solani F. oxysporum F. incarnatum-equiseti
F. solani __ 0,021 0,021
F. oxysporum 0,222 __ 0,017
F. incarnatum-equiseti 0,238 0,163 __
Tabla 8. Matriz de Distancias Genéticas de RPB2.
Variación estándar
Distancias F. solani F. oxysporum F. incarnatum-equiseti
F. solani __ 0,011 0,005
F. oxysporum 0,161 __ 0,011
F. incarnatum-equiseti 0,034 0,159 __
45
5.3.4 Análisis de entropía de secuencias.
El alineamiento de las 59 secuencias de EF-1α fue editado manualmente en BioEdit y
reducido al tamaño de la secuencia más corta (673 pb), con el fin de obtener la gráfica de
entropía de las secuencias. Esta gráfica mostró claramente cuatro regiones con alto nivel
de entropía, denominadas Hot Spot (zonas calientes: zonas de alta variabilidad
nucleotídica), separadas por tres regiones de baja entropía. La última Hot Spot (extremo
3’) presentó mayor grado de entropía (Figura 4).
Las 59 secuencias codificantes de RPB2, igualmente fueron editadas manualmente con
BioEdit y posterior a su alineamiento se redujo su tamaño al de la secuencias más corta
(1643 pb), con el fin de obtener la gráfica de entropía. Ésta reveló el alto nivel de entropía
en el conjunto de secuencias analizadas, distribuido a lo largo de todo el alineamiento sin
destacar zonas de separación de bajo grado de entropía (Figura 5).
Figura 4. Grafica de Entropía de EF-1α y comparación con las zonas amplificadas.
46
Figura 5. Distribución de la localización de nucleótidos informativos a través de los
intrones y exones del gen EF-1α, de taxa analizados. Las flechas indican las únicas
sustituciones informativas dentro de los exones. Tomado y adaptado de O’Donnell y
colaboradores (1998).
Figura 6. Grafica de Entropía de RPB2 y comparación con las zonas amplificadas.
47
El análisis de secuencias mostró que el número de sitios monomórficos detectados en las
secuencias de EF-1α es mucho mayor (48 %) que los detectados en las secuencias de
RPB2 (39 %), sin embargo, es necesario considerar que el tamaño del fragmento de EF-
1α es de 716 pb aproximadamente, mientras el de RPB2 es de alrededor de 1879 pb. Esto
contrasta y ratifica la utilidad de estos marcadores. De igual manera, la proporción de los
sitios polimórficos de las secuencias de EF-1α fue más baja (23,5 %) en comparación a
los de RPB2 (33 %), pero esta baja proporción se contrarresta con el buen grado de sitios
parsimoniosamente informativos, del 68 % y 71 % para EF-1α y RPB2 respectivamente.
Además, se encontró que la proporción de singletones es baja y similar para los dos
conjuntos de secuencias, 7,5 % para EF-1α y 9,5 % para RPB2, al igual que el número de
InDel’s, 11,6 % y 11,8 % para EF-1α y RPB2 respectivamente. Las secuencias
permitieron la definición de un alto número de haplotipos, 55 para EF-1α con una
variabilidad haplotípica de 0,9977 y de 58 haplotipos para RPB2 con una variabilidad de
0,9994. Por otra parte las gráficas de entropía de los grupos de secuencias revelaron que
las zonas variables de EF-1α en su gran mayoría corresponden a exones, con algunas
pequeñas regiones de intrones. Caso contrario se observó en la gráfica de entropía de
RPB2, ya que 7 dominios (5-11), de los 12 que constituyen este gen, tuvieron un frecuente
nivel de entropía a lo largo de toda su secuencia.
5.4 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium.
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la evaluación de diversos métodos
estadísticos de inferencia como lo son: Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e
Inferencia Bayesiana, el método de Neighbor-Joining es aquel que mejor representa las
relaciones existentes entre los aislamientos de los distintos complejos de especies
identificados; los resultados de los demás métodos son presentados en la sección de
anexos para su respectiva consulta.
El dendrograma construido por el método de Neighbor-Joining a partir de las secuencias
que codifican para EF-1α, agrupó cada aislamiento en uno de los tres principales
clústeres, I, II, y III, asociados con los complejos de Fusarium solani, Fusarium
oxysporum o Fusarium incarnatum-equiseti, respectivamente (Figura 7). Los miembros
identificados dentro del complejo de Fusarium solani clúster I, con soporte de boostrap
de 100 %, se agruparon en el sub-clúster I o sub-clúster II, con un soporte de boostrap de
48
87 % y de 99 % respectivamente. El sub-clúster I estuvo constituido por ocho
aislamientos, seis obtenidos de uñas de pie, un aislamiento de uña de mano (56321, mujer)
y un aislamiento de córnea (56988, hombre). El sub-clúster II con 17 aislamientos, de los
cuales 15 se obtuvieron de uñas de pie, uno de uña de mano (63749, hombre) y uno de
piel (56054, hombre) (Figura 7).
49
Figura 7. Dendrograma de la región EF-1α de 59 aislamientos clínicos de Fusarium
construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap
(5000 réplicas) son mostrados en cada nodo. El dendrograma fue enraizado usando la
secuencia de EF-1α de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos
Fusarium-ID.
F. incarnatum-equiseti 56665
63145F. oxysporum
57560F. oxysporum
55787F. oxysporum
63666F. oxysporum
55444F. oxysporum
63414F. oxysporum
55529F. oxysporum
55498F. oxysporum
57228F. oxysporum
58023F. oxysporum
56323F. oxysporum
55827F. oxysporum
55861F. oxysporum
62698F. oxysporum
62802F. oxysporum
55979F. oxysporum
63316F. oxysporum
55945F. oxysporum
55466F. oxysporum
63649F. oxysporum
55583F. oxysporum
63768F. oxysporum
55762F. oxysporum
57721F. oxysporum
56363F. oxysporum
56212F. oxysporum
55585F. oxysporum
55496F. oxysporum
56094F. oxysporum
55588F. oxysporum
57885F. oxysporum
63613F. oxysporum
56320F. oxysporum
57335F. solani
63917F. solani
56301F. solani
55347F. solani
63447F. solani
56868F. solani
55349F. solani
56604F. solani
63200F. solani
56054F. solani
63635F. solani
56780F. solani
57949F. solani
56891F. solani
56337F. solani
63749F. solani
56340F. solani
56321F. solani
56988F. solani
58025F. solani
57221F. solani
56894F. solani
65068F. solani
64765F. solani
56240F. solani
F. dimerum
96
6687
89
99
8558
54
54
52
90
100
99
98
8875
7268
57
99
55
85
72
61
87
100
59
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub
-clu
ster
IS
ub-c
l us t
er I I
Su b
- cl u
s te r
III
Su b
- cl u
s te r
IVC
l us t
e r I
Cl u
ster
II
Cluster III
50
Los aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium oxysporum
clúster II, también con un soporte de boostrap del 100 %, se agruparon dentro del sub-
clúster III o IV. El sub-clúster III incluyó 27 aislamientos, 22 obtenidos de uñas de pie,
uno de uña de mano (63613, mujer), uno de piel (55588, mujer), uno de córnea (55979,
hombre), uno de abdomen (62698, mujer) y un aislamiento de origen desconocido (5558,
hombre), con soporte de boostrap de 90 %. El sub-clúster IV estuvo compuesto por seis
aislamientos, cinco obtenidos de uñas de pie y uno de uña de mano (63666, mujer), con
valor de boostrap de 99 %. Finalmente, el clúster III estuvo definido por un único
aislamiento (56665) identificado en el complejo de especies de Fusarium incarnatum-
equiseti y procedente de la piel de una mujer, con un soporte estadístico de boostrap de
59 % (Figura 7). Es de considerar que en ninguno de los clústeres o sub-clústeres
formados se observa la agrupación de los aislamientos basados en el tejido afectado ni
por el género del paciente (Figura 7).
En el caso del dendrograma que describe la relación de las secuencias codificantes para
RPB2 de los 59 aislamientos, obtenido por el método de Neighbor-Joining se encontró la
formación de dos clústeres. El clúster I, conformado por los sub-clústeres I, II, II, contiene
la mayoría de los aislamientos de Fusarium solani, tal como el clúster I de la Figura 7,
además de 12 de los aislamientos del complejo de Fusarium oxysporum, en el sub-clúster
I se encuentran 17 aislamientos de Fusarium oxysporum y un aislamiento de Fusarium
oxysporum; en el sub-clúster II se encuentra conformado en su mayoría por 10
aislamientos de Fusarium oxysporum, junto con siete aislamientos de Fusarium solani y
el único aislamiento del complejo Fusarium incarnatum-equiseti y el sub-clúster III se
encuentra conformado por un único aislamiento del complejo Fusarium oxysporum. El
clúster II en su mayoría incluyó aislamientos de Fusarium oxysporum, los cuales se
encuentra distribuidos en dos sub-clúster, el sub-clúster IV contiene seis aislamientos de
Fusarium oxysporum y un único aislamiento de Fusarium oxysporum, por su parte el sub-
clúster V está compuesto en su totalidad por 15 aislamientos de Fusarium oxysporum. El
sub-clúster I constituido por 18 aislamientos, 15 de ellos obtenidos de uñas de pies, dos
obtenidos de piel (56321 y 56054 mujeres) y uno de uña de mano (63749 hombre), con
un soporte de estadístico alto de boostrap de 95 %, mostró de manera clara la agrupación
de 17 (68 %) de los aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium
51
solani en comparación a los 25 aislamientos del clúster I de la Figura 7, además de uno
de los 33 aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium
oxysporum. El sub-clúster II constituido por 18 aislamientos, de los cuales 15
aislamientos se obtuvieron de uñas de pies, uno de uña de mano (63666, mujer), uno de
córnea (56988, hombre) y el único aislamiento del complejo de Fusarium incarnatum-
equiseti aislado de la piel de una mujer, estuvo soportado por un valor de boostrap de 75
%, y constituido por la presencia de diferentes miembros de los tres complejos de especies
identificados en este trabajo; 11 (33 %) del complejo de Fusarium oxysporum, siete (28
%) de los aislamientos del complejo de Fusarium solani y el único aislamiento
identificado como miembro del complejo de especies de Fusarium incarnatum-equiseti.
El sub-clúster III constituido por un aislamiento del complejo de especies de Fusarium
oxysporum y obtenido de uña de pie (62802, mujer) posee una valor de soporte de
boostrap de 88 %. El sub-clúster IV se encuentra constituido por cinco aislamientos del
complejo de especies de Fusarium oxysporum, junto con un aislamiento del complejo de
especies de Fusarium solani, obtenido de uña de pie (56604, mujer), este sub-clúster
además presenta un soporte de boostrap de 51 %. El sub-clúster V se encuentra
constituido en su totalidad por 15 aislamientos del complejo de especies de Fusarium
oxysporum, en donde siete de dichos aislamientos fueron obtenidos de uñas de pie, un
aislamiento de uña de mano (61613, mujer) un aislamiento de piel (55588, mujer) un
aislamiento de córnea (55979, hombre), un aislamiento de abdomen (62698, hombre) y
un aislamiento de origen desconocido (55582, hombre), este clúster presenta soporte de
boostrap de 100 %. Es importante resaltar que al igual como se observó en el árbol
obtenido por las secuencias de EF-1α, no se evidenció una relación de las agrupaciones
resultantes con base en el tejido infectado y/o el género del paciente (Figura 8).
52
Figura 8. Dendrograma de la región RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium
construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap
(5000 réplicas) son mostrados en cada nodo. El dendrograma fue enraizado usando la
secuencia de EF-1α de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos
Fusarium-ID.
F. 63635solani
F. 55349solani
F. 56301solani
F. 56868solani
F. 63200solani
F. 56780solani
F. 56321solani
F. 56891solani
F. 57335solani
F. 63917solani
F. 55347solani
F. 63447solani
F. 57949solani
F. 56054solani
F. 58023oxysporum
F. 56337solani
F. 56340solani
F. 63749solani
F. 58025solani
F. 63414oxysporum
F. 55444oxysporum
F. 55945oxysporum
F. 57228oxysporum
F. 56323oxysporum
F. 55466oxysporum
F. 63666oxysporum
F. 56665incarnatum-equiseti
F. 56988solani
F. 55496oxysporum
F. 57221solani
F. 57721oxysporum
F. 64765solani
F. 56894solani
F. 56212oxysporum
F. 56240solani
F. 65068solani
F. 62802oxysporum
F. 56604solani
F. 55585oxysporum
F. 56320oxysporum
F. 55827oxysporum
F. 55529oxysporum
F. 55498oxysporum
F. 63613oxysporum
F. 56363oxysporum
F. 55861oxysporum
F. 55762oxysporum
F. 63768oxysporum
F. 55583oxysporum
F. 63145oxysporum
F. 55979oxysporum
F. 57560oxysporum
F. 63649oxysporum
F. 55588oxysporum
F. 56094oxysporum
F. 62698oxysporum
F. 63316oxysporum
F. 57885oxysporum
F. 55787oxysporum
F. dimerum
100
60
100
5458
60
52
100
71100
100
9196
100
100
100
8299
98
63
53
72
7063
5056
95
92
90
81
75
94
88
71
51
F.
Sub
-clu
ster
V
Sub
-clu
ster
II
Sub
-clu
ster
I
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub-cluster III
Sub
-clu
ster
IV
Cl u
ster
II
Clu
ster
I
53
Al momento de obtener el dendrograma por el método de Neighbor-Joining basado en la
concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, para los 33 aislamientos identificados
como miembros de complejo de especies de F. oxysporum y definidos como Cluster II
(Figura 7), se logra apreciar claramente la fragmentación de los diferentes sub-cluster; de
esta manera se ve alternada la agrupación de los miembros de Sub-cluster III sub Sub-
cluster IV, incluso con secuencias usadas como grupo externo al complejo de especies de
F. oxysporum, como F. chlamydosporum y Gibberella fujikuroi. Además es importante
resaltar los altos valores de boostrap que soportan dichas agrupaciones, siendo para todas
ellas de 99 % (Figura 9).
54
Figura 9. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones
EF-1α y RPB2 de 33 aislamientos clínicos del complejo de especies Fusarium oxysporum
construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes de bootstrap (5000
réplicas) son mostrados en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de
EF-1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, junto con la presencia de
secuencias de referencia obtenidas de la base de datos Fusarium-ID.
F. oxysporum 55945
F. oxysporum 55466
F. oxysporum 56323
F. oxysporum 57228
F. oxysporum 63414
F. oxysporum 55444
56665F. incarnatum-equiseti
F. oxysporum 63666
F. oxysporum 58023
55496F. oxysporum
F. oxysporum 56212
F. oxysporum 57721
62802F. oxysporum
Fusarium chlamydosporum
F. oxysporum 55498
F. oxysporum 63613
F. oxysporum 55529
55585F. oxysporum
F. oxysporum 56320
F. oxysporum 55827
Gibberella fujikuroi
F. oxysporum 55583
F. oxysporum 55762
F. oxysporum 63768
F. oxysporum 55861
F. oxysporum 56363
F. oxysporum 62698
F. oxysporum 63316
F. oxysporum 63145
F. oxysporum 55787
F. oxysporum 57560
F. oxysporum 55979
F. oxysporum 56094
F. oxysporum 57885
F. oxysporum 55588
F. oxysporum 63649
Fusarium dimerum
100
9467
99
100
100
100
99
76
45
47
65
97
47
62
99
99
93
99
5597
3531
42
42
42
40
99
54
0.05
Sub-cluster I
Sub-cluster IV
Sub
-clu
ster
VS
ub-c
lust
er V
Sub
-clu
ster
IV
Sub
-clu
ster
IIS
ub- c
lust
er II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
EF-1α + RPB22420 pb
Sub-cluster III
Sub-cluster II
55
En el caso del dendrograma obtenido para los 25 aislamientos identificados como
miembros del complejo de especies de Fusarium solani, usando el método de Neighbor-
Joining y con base en la concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, se logra
convalidar las agrupaciones obtenidas para todos los aislamientos del Cluster I definido
por el análisis de Neighbor-Joining de las secuencias de EF-1α a la totalidad de
aislamientos identificados en el presente trabajo (Figura 7); tanto las relaciones de los
miembros del Sub-cluster I como el Sub-cluster II se ven soportadas por altos valores de
boostrap, siendo de 75 % para el Sub-Cluster II y del 95 % para el Sub-Cluster I, al estar
en presencia de secuencias de referencia de miembros de los diferentes complejos de
especie de Fusarium sp de importancia clínica (Figura 10).
56
Figura 10. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones
EF-1α y RPB2 de 25 aislamientos clínicos del complejo de especies Fusarium solani
construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes de bootstrap (5000
réplicas) son mostrados en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de
EF-1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, junto con la presencia de
secuencias de referencia obtenidas de la base de datos Fusarium-ID.
F. solani 63447
55347F. solani
F. solani 63917
57335F. solani
56301F. solani
F. solani 56868
F. solani 63200
55349F. solani
56780F. solani
F. solani 63635
56054F. solani
F. solani 57949
F. solani 56340
F. solani 63749
F. solani 56337
F. solani 56891
F. solani 56604
58025F. solani
F. solani 56988
F. solani 57221
F. solani 56894
F. solani 65068
F. solani 56240
F. solani 64765
56321F. solani
56665F. incarnatum-equiseti
Fusarium chlamydosporum
Gibberella fujikuori
Fusarium dimerum
34
57
100
100
100
99
8999
94
95
82
67
89
4549
30
28
73
72
59
75
70
47
49
0.05
Sub
-clu
ster
I
Sub
-clu
ster
II
Clu
ster
I
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
EF-1α + RPB22420 pb
57
Al establecer una comparación de los diferentes dendrogramas obtenidos por el método
de Neighbor-Joining, se puede observar que el dendrograma basado en las secuencias de
EF-1α genera claramente la formación de los tres clústeres, basados en los tres complejos
de especies identificados mediante análisis de BLAST para secuencias de EF-1α,
viéndose un alto soporte estadístico de las réplicas de boostrap (100 %) para los
aislamientos reconocidos como miembros de los complejos de Fusarium solani (Clúster
I) y de Fusarium oxysporum (Clúster II) y un moderado valor estadístico (59 %) para el
miembro del complejo de especies de Fusarium incarnatum-equiseti (Clúster III) en el
dendrograma de EF-1α; en el caso de las representaciones de las relaciones obtenidas por
el método de Neighbor-Joining, con base en las secuencias de RPB2 para la totalidad de
los aislamientos objeto del presente trabajo, se observa que a pesar de que no existe un
grado de correspondencia aceptable, se genera la agrupación de los aislamiento con base
a su identidad en clúster y sus respectivos sub-clústeres con altos valores de boostrap para
las secuencias analizadas de este gen (Figura 11).
58
Figura 11. Comparación de los dendrogramas construidos bajo el método de Neighbor-
Joining. A. Dendrograma de EF-1α y B. Dendrograma de RPB2.
Al momento de concatenar y alinear las secuencias de los genes EF-1α y RPB2 se obtuvo
un grupo de datos con una longitud de 2420 pb para cada uno de los 59 aislamientos
clínicos. Este grupo de secuencias fue objeto de un análisis de Neighbor-Joining con el
fin de estimar las relaciones de dichos aislamientos con base a la previa identificación y
asignación de complejos de especies en la base datos Fusarium-ID. A diferencia de la
F. incarnatum-equiseti 56665
63145F. oxysporum
57560F. oxysporum
55787F. oxysporum
63666F. oxysporum
55444F. oxysporum
63414F. oxysporum
55529F. oxysporum
55498F. oxysporum
57228F. oxysporum
58023F. oxysporum
56323F. oxysporum
55827F. oxysporum
55861F. oxysporum
62698F. oxysporum
62802F. oxysporum
55979F. oxysporum
63316F. oxysporum
55945F. oxysporum
55466F. oxysporum
63649F. oxysporum
55583F. oxysporum
63768F. oxysporum
55762F. oxysporum
57721F. oxysporum
56363F. oxysporum
56212F. oxysporum
55585F. oxysporum
55496F. oxysporum
56094F. oxysporum
55588F. oxysporum
57885F. oxysporum
63613F. oxysporum
56320F. oxysporum
57335F. solani
63917F. solani
56301F. solani
55347F. solani
63447F. solani
56868F. solani
55349F. solani
56604F. solani
63200F. solani
56054F. solani
63635F. solani
56780F. solani
57949F. solani
56891F. solani
56337F. solani
63749F. solani
56340F. solani
56321F. solani
56988F. solani
58025F. solani
57221F. solani
56894F. solani
65068F. solani
64765F. solani
56240F. solani
F. dimerum
96
6687
89
99
8558
54
54
52
90
100
99
98
8875
7268
57
99
55
85
72
61
87
100
59
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub
-clu
ster
IS
ub-c
lust
er II
Sub
-clu
ster
III
Sub
-clu
ster
IVC
lust
er I
Clu
ster
II
Cluster IIIAB
63635F. solani
55349F. solani
56301F. solani
56868F. solani
63200F. solani
56780F. solani
56321F. solani
56891F. solani
57335F. solani
63917F. solani
55347F. solani
63447F. solani
57949F. solani
56054F. solani
58023F. oxysporum
56337F. solani
56340F. solani
63749F. solani
58025F. solani
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
55945F. oxysporum
57228F. oxysporum
56323F. oxysporum
55466F. oxysporum
63666F. oxysporum
56665F. incarnatum-equiseti
56988F. solani
55496F. oxysporum
57221F. solani
57721F. oxysporum
64765F. solani
56894F. solani
56212F. oxysporum
56240F. solani
65068F. solani
62802F. oxysporum
56604F. solani
55585F. oxysporum
56320F. oxysporum
55827F. oxysporum
55529F. oxysporum
55498F. oxysporum
63613F. oxysporum
56363F. oxysporum
55861F. oxysporum
55762F. oxysporum
63768F. oxysporum
55583F. oxysporum
63145F. oxysporum
55979F. oxysporum
57560F. oxysporum
63649F. oxysporum
55588F. oxysporum
56094F. oxysporum
62698F. oxysporum
63316F. oxysporum
57885F. oxysporum
55787F. oxysporum
F. dimerum
100
60
100
5458
60
52
100
71100
100
9196
100
100
100
8299
98
63
53
72
7063
5056
95
92
90
81
75
94
88
71
51
Sub-cluster V
Sub-cluster II
Sub-cluster I
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub-cluster IIIS
ub-cluster IV
Cluster II
Cluster I
59
clara agrupación de los distintos aislamientos con base a la pertenencia de los distintos
complejos de especies obtenidos en la gráfica 7, este análisis no permite soportar de
manera eficiente el Sub-cluster I que agrupa los aislamientos identificados en el complejo
de especies de F. solani, debido específicamente al incorrecto soporte estadístico del
aislamiento 56321 (Uña de mano; Mujer); en cuanto al Sub-cluster II y el correspondiente
Cluster I se observan altos valores de soporte de nodo, siendo estos de 77 % y 100 %
respectivamente. En el caso del Cluster II y los Sub-cluster III y Sub-cluster IV que lo
componen no se observa un adecuado soporte estadístico de dichos sub-cluster, pero de
manera contraria se registra un alto valor de soporte para el Cluster I siendo este de 92 %
que contiene a los miembros del complejo de especies de F. oxyporum. En el caso de
Cluster III compuesto por el único aislamiento miembro del complejo de especies de F.
incarnatum-equiseti este se encuentra soportado con un valor de estadístico de nodo de
60 %, pero con la particularidad de que también soporta al aislamiento F. dimerum, usado
como grupo externo (Figura 12).
60
Figura 12. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones
EF-1α y RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium construido usando el método de
Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap (5000 réplicas) son mostrados
en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de EF-1α y RPB2 de Fusarium
dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos Fusarium-ID.
56094F. oxysporum
63649F. oxysporum
57885F. oxysporum
55979F. oxysporum
62698F. oxysporum
63316F. oxysporum
55861F. oxysporum
55762F. oxysporum
55583F. oxysporum
63768F. oxysporum
55588F. oxysporum
56363F. oxysporum
63145F. oxysporum
57560F. oxysporum
55787F. oxysporum
55498F. oxysporum
63613F. oxysporum
55529F. oxysporum
55827F. oxysporum
55585F. oxysporum
56320F. oxysporum
62802F. oxysporum
55496F. oxysporum
56212F. oxysporum
57721F. oxysporum
63666F. oxysporum
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
57228F. oxysporum
56323F. oxysporum
55945F. oxysporum
55466F. oxysporum
58023F. oxysporum
56240F. solani
64765F. solani
65068F. solani
56894F. solani
57221F. solani
56988F. solani
58025F. solani
56321F. solani
56340F. solani
63749F. solani
56337F. solani
56891F. solani
56054F. solani
57949F. solani
56604F. solani
63200F. solani
55349F. solani
56780F. solani
63635F. solani
63447F. solani
55347F. solani
63917F. solani
56868F. solani
56301F. solani
57335F. solani
F. incarnatum-equiseti 56665
F. dimerum
100
100
100
53
62
100
99
99
97
95
84
76
93
73
69
77
63
100
6399
72
57
95
100
100
9994
100
100
100
9175
98
97
93
72
72
59
92
92
60
Cluster III
Sub
-clu
ster
IS
ub-c
lust
er II
Clu
ster
IS
ub-c
lust
er IV
Sub
-clu
ster
IVS
ub-c
lust
er II
IS
ub-c
lust
er II
IS
ub-c
lust
er II
I Clu
ster
II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
EF-1α + RPB22420 pb
61
5.5 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas
En el periodo comprendido entre el 2004 y el 2006 se obtuvieron, en la Unidad de
Micología Médica y Experimental (MME) de la Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB), 59 aislamientos de hongos compatibles con el género Fusarium,
procedentes de lesiones de 59 pacientes. En la tabla 3 se relaciona el género del paciente
con la especie de Fusarium identificada a partir de la secuencia parcial del gen EF-1α en
la base de datos Fusarium-ID, (Tabla 3) y la localización de la lesión. Las especies del
genero Fusarium son reconocidas principalmente como agentes causales de onicomicosis
en humanos, razón que explica que el 88.13 % de los aislamientos provengan de lesiones
de uñas y, se presenten en mayor proporción en mujeres (76,27 %), que manifestaron
realizarse frecuentemente el arreglo de uñas en centros de belleza.
Tabla 9: Especies de Fusarium de aislamientos clínicos y localización de la lesión entre
la población femenina y masculina incluida en este estudio.
Género Localización de la lesión Complejo de especies Número de aislamientos
Femenino
Piel F. oxysporum 1
F. incarnatum-equiseti 1
Uña mano F. oxysporum 2
F. solani 1
Uña pie F. oxysporum 22
F. solani 18
Total mujeres 45
Masculino
Abdomen F. oxysporum 1
Córnea F. oxysporum 1
F. solani 1
Desconocido F. oxysporum 1
Piel F. solani 1
Uña pie F. oxysporum 5
F. solani 3
Uña mano F. solani 1
Total hombres 14
Total muestras 59
62
El complejo de especies F. oxysporum se destacó como el complejo más frecuentemente
detectado tanto en hombres como en mujeres, seguida por el complejo de especies F.
solani. La proporción de estos dos complejos se mantuvo aproximadamente constante en
mujeres y hombres. Así, de un total de 45 aislamientos en mujeres, 25 pertenecen al
complejo F. oxysporum y 19 al complejo F. solani; y de un total de 14 aislamientos en
hombres, 8 al complejo F. oxysporum y 6 corresponden al complejo F. solani. El
complejo de especies F. solani se destaca porque en hombres fue causante de tres tipos
de lesiones en localizaciones diferentes (córnea, piel y uñas), mientras en mujeres solo de
una (Figura 7).
63
6. DISCUSIÓN
6.1 Identificación molecular a nivel de género y especie de aislamientos clínicos de
Fusarium
El principal objetivo de este trabajo fue estudiar la taxonomía y variabilidad de 59
aislamientos clínicos de Fusarium sp. por secuenciación de las regiones que codifican
para el factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda subunidad de la
ARN polimerasa II (RPB2). Estos loci fueron elegidos debido a que poseen una mayor
diversidad nucleotídica comparado con otros loci como Calmodulina, IGS, ITS 1 y 2
(O’Donnell et al., 2009).
Las regiones codificantes de proteínas, a partir de ADN nuclear, implicadas en procesos
celulares vitales y altamente conservados han sido ampliamente usadas en la
identificación de diferentes microorganismos; particularmente, en la identificación de
especies de Fusarium se han usado las regiones ITS, β-tubulina, Calmodulina y las
regiones 28S y 5.8S del ADN ribosomal (Hennequin et al., 1999; Balajee et al., 2007;
Dyavaiah et al., 2007).
En la actualidad las regiones más utilizadas para la identificación de Fusarium a nivel de
especie son el gen del factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α), y los genes de
la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2 y RPB1). Otras regiones
también estudiadas con fines de identificación a nivel de especie incluyen, genes de
apareamiento (MAT), genes que codifican para la Celobiosa-C y la Topoisomerasa II, el
gen que codifica para la β-tubulina, Calmodulina, entre otros (Atkins y Clark, 2004.,
Hatsch et al., 2004; Hinojo et al., 2004; Wilson et al., 2004; Bogale et al., 2006; Dyavaiah
et al., 2007; Alustrey-Izquierdo et al., 2008). Esto, demostrando la poca utilidad de las
regiones ribosomales para la identificación de Fusarium a nivel de especie, ya que son
demasiado conservadas y por la tanto tienen menor capacidad de resolución y han
generado taxonomías y filogenias erróneas y junto con ello el bajo grado de confiabilidad
64
en procesos de identificación (Sakai et al., 2006; Dyavaiah et al., 2007; Zaccardelli et al.,
2008).
La identificación molecular a nivel de complejo de especies mediante análisis BLAST en
la base de datos de Fusarium-ID, se construyó como respuesta a la imperante necesidad
de determinar la especie de aislamientos de Fusarium de importancia toxigenica y clínica,
antes reconocidas solo por caracteres morfológicos (Geiser et al., 2004). En sus inicios
esta base de datos conto únicamente con secuencias correspondientes al gen EF-1α; que
es a la fecha el mejor marcador molecular para identificar aislamientos de Fusarium, pero
a medida que aumentó la facilidad en los procesos de secuenciación, aumentó el número
de aislamientos y el número de marcadores empleados en la identificación, como son
RPB2, RPB1, IGS, ITS1, ITS2, ADNr (Geiser et al., 2004).
Al momento de comparar las secuencias codificantes para el factor de elongación de la
traducción EF-1α de los 59 aislamientos de Fusarium sp por medio de la herramienta
BLAST en la base de datos Fusarium-ID, se logró determinar que los aislamientos
pertenecen a uno de tres complejos de especies, F. oxysporum, F. solani y F. incarnatum-
equiseti¸ con altos valores estadísticos de soporte (Figura 6, Tabla 3). La mayoría de ellos,
33, se ubicaron en el complejo Fusarium oxysporum, seguido por 22 en el complejo de
especies de Fusarium solani. Estos datos, concuerdan con los reportados por Giraldo, en
2010 que detectó por PCR 52 y 28 aislamientos de los complejos de especies de Fusarium
oxysporum y de Fusarium solani, respectivamente, a partir de un total de 101 aislamientos
de Fusarium.
Las secuencias codificantes para la segunda subunidad de la ARN polimerasa II (RPB2)
al ser analizadas por la herramienta BLAST en la base de datos de referencia Fusarium-
ID, identificaron 42 aislamientos como miembros del complejo de especies F. solani y
17 como F. staphyleae. (Figura 11, Tabla 3).
Sin embargo, las secuencias de EF-1α presentaron mayores valores de identidad absoluta
en comparación a los registrados por las secuencias de RPB2, además la diferencia entre
los valores máximos y mínimos de porcentaje identidad fue menor en la secuencias de
65
EF-1α, de igual manera los registros (score) de coincidencia de identidad de todas las
secuencias de EF-1α fueron el máximo posible obtenido, en comparación con lo
observado con las secuencias de RPB2, cinco del total de la secuencias confrontadas,
mostraron valores demasiado inferiores de coincidencia con las secuencias dispuestas o
de referencia en la base datos Fusarium-ID; al igual que lo observado. Con respecto a los
valores de E todas las secuencias de EF-1α obtuvieron valores de 0, que indica que la
posibilidad de observar cambios o múltiples coincidencias en la búsqueda es nula, de
manera contraria las mismas cinco secuencias de RPB2 mostraron altos valores de cambio
o coincidencia múltiple en los procesos de búsqueda lo que conlleva a bajos niveles de
confiabilidad (Tabla 3); adicionalmente valores de similitud (score), revelan niveles de
coincidencia de la secuencia consulta frente a las secuencias de referencia dispuestas en
dicha base de datos, obteniéndose los máximos valores posibles, siendo de 999.99 y E
(Expect = Esperado), lo cual indica la posibilidad de cambio o coincidencia múltiple de
secuencias, durante la búsqueda en la ya mencionada base datos es nula y cuyo valor
máximo es 0, siendo similar para todos los aislamientos identificados, correspondiendo a
valores de 999.99 y 0 respectivamente (Tabla 3). Todo lo anterior puede ser debido a la
posible presencia de variantes alélicas, existencia de nuevas especies, falta de una
secuencia representativa en la base de datos o a que la secuencia consulta no se encuentra
bien definida o al bajo grado de resolución (Geiser et al., 2004), este último factor ya se
ha reportado a nivel del complejo de especies de Fusarium oxysporum (O’Donnell et al.,
2007).
El gen nuclear del factor de elongación de la traducción 1-α (EF-1 α), codifica una parte
esencial de la maquinaria de traducción proteica, dicho gen codifica una proteína G que
hace entrega del aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma, durante el proceso de
traducción de proteínas. La estructura primaria del EF-1α es altamente conservada entre
todos los eucariotas y procariotas, además se ha identificado como una de las proteínas
de mayor abundancia en eucariotas (más del 5 % del total de proteínas del citosol)
(Mateyak y Kinzy, 2010; Eltschinger et al., 2012).
La utilidad de EF-1α se basa en que cerca del 6 % de los nucleótidos que lo conforman
son considerados cladísticamente significativos (39/656 nucleótidos), el 95 % de estos
66
nucleótidos se encuentran en regiones exónicas, en donde se han detectado procesos de
transición de bases, lo que genera un 50 % más de información que otros genes usados
en Fusarium, tal como mtSSU, β-tubulina, Calmodulina, que le otorga un mayor nivel de
confianza y utilidad (Geiser et al., 2004). Todo lo anterior al parecer indica que el gen
EF-1α ha estado bajo pocas restricciones evolutivas, como se deduce de los patrones de
mutación que incluyen delecciones de bases (O’Donnell et al., 1998; Kristensen et al.,
2005). Otra ventaja del gen EF-1α es que este se presenta en una única copia en el genoma
de Fusarium (Geiser et al., 2004).
Como consecuencia de las características de EF-1α y de los resultados obtenidos en la
identificación de los aislamientos del presente trabajo, se mantuvo las identidades de
dichos aislamientos con base en este gen y no las determinadas por RPB2, justificado lo
anterior en los observaciones hechas por Balajee y colaboradores en 2009, en donde
demuestran la cuestionada y baja utilidad de este marcador en la identificación y uso en
técnicas de tipificación de secuencias multilocus, específicamente en miembros de
complejo de especies de Fusarium oxysporum (Balajee et al., 2009).
Diferentes autores han demostrado la complejidad genética del género Fusarium, que
sustenta el hallazgo de un gran número de especies filogenéticas dentro los complejos de
especies F. solani, F. graminearum y F. oxysporum (O´Donnell et al., 2004; Bogale et
al., 2006; Leslie y Summerell, 2006; O´Donnell et al., 2008; Balajee et al., 2009).
Además, varios de estos complejos son polifiléticos. Este hecho explica que, aislamientos
que pertenecen a un mismo complejo de especies de F. oxysporum o de F. solani pueden
tener grandes diferencias genéticas, producto de orígenes filogenéticos diferentes
(Nelson et al., 1994; González et al., 2009; Bogale et al., 2006, 2007; Leslie et al., 2007;
O´Donnell et al., 2008; Balajee et al., 2009). Es posible que muchos o algunos de los
aislamientos del complejo de especies F. oxysporum y F. solani obtenidos en este estudio
provengan de linajes diferentes, lo que explicaría que los dendrogramas y/o árboles
arrojen politomias difíciles de resolver, excepto por el método de Inferencia Bayesiana y
de Neighbor-Joining. Aunque, este trabajo no buscaba hacer un análisis de la filogenia de
los aislamientos de Fusarium, sí se tuvo en cuenta en el análisis de las secuencias, con el
fin de determinar si podría soportar los taxa determinados. En el caso específico de los
67
análisis de las secuencias de EF-1α se pudo observar una gran congruencia entre el
dendrograma obtenido por Neighbor-Joining y el árbol obtenido por métodos bayesianos,
ya que se observó una total correspondencia entre los clústeres y clados junto con sus
respectivos sub-clústeres y sub-clados soportado por altos valores estadísticos cuando se
comparó estos métodos con el grupo de secuencias de RPB2, no se observó una
correspondencia clara con respecto a los clústeres y clados obtenidos, ni con sus sub-
clústeres y sub-clados respectivamente. El dendrograma obtenido por el método de
Neighbor-Joining mostró la formación de dos clúster y el árbol obtenido por métodos
bayesianos generó cinco clados; sin embargo a pesar de estas incongruencias, las distintas
agrupaciones contienen los miembros de los diferentes complejos de especies
reconocidos en el presente trabajo, con altos soportes estadísticos.
6.2 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias
La proporción de sitios monomórficos y polimórficos observados en los análisis del grupo
de secuencias de los marcadores EF-1α y RPB2, sugirió una mayor variabilidad de las
secuencias de RPB2, quizás más útil en la discriminación de miembros de complejos
especies estrechamente cercanos y difíciles de diferenciar con otras secuencias. Este gen
RPB2 evidenció el alto grado de diversidad de la muestra clínica evaluada en este estudio,
dentro de los complejos de especie de Fusarium, quizás debida a que los pacientes llegan
a este laboratorio de Micología Médica remitidos por diferentes Entidades Promotoras de
Salud (Tabla 4).
La estimación de probabilidad compuesta de patrones de sustitución de nucleótidos en
los dos conjuntos de secuencias de EF-1α y RPB2 permitió observar el alto porcentaje de
probabilidad para los fenómenos de transición, cerca del doble respecto a la transversión,
específicamente entre pirimidinas Citosina (C) y Timina (T), tanto para EF-1α como para
RPB2. Estos datos corroboran los altos niveles de entropía observados para estos grupos
de secuencias nucleotídicas, que no afectan en gran medida la secuencia aminoacídica
final, ni la funcionalidad de estas proteínas, específicamente, reportado al nivel de los
ascomicetos (Liu et al., 1999; Hibbett et al., 2007) y específicamente en Fusarium (Chang
68
et al., 2006; Balajee et al., 2007; O’Donnell et al., 2007; O’Donnell et al., 2008;
O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2010).
Con relación a los valores resultantes de las matrices de distancias genéticas obtenidas a
partir de las secuencias de EF-1α, se encontró una clara separación de los miembros de
los tres complejos de especies Fusarium oxysporum, Fusarium solani y Fusarium
incarnatum-equiseti, especialmente entre los complejos Fusarium oxysporum - Fusarium
solani y Fusarium solani - Fusarium incarnatum-equiseti y la relativa baja distancia entre
los complejos Fusarium oxysporum y Fusarium incarnatum-equiseti (0,163) lo que
sugiere una cercana relación entre estos complejos, datos que se respaldan por los análisis
de O’Donnell y colaboradores en 2009, en donde se usan secuencias de los genes EF-1α,
RPB2, RPB1, β-tubulina, Calmodulina, y diferentes regiones ribosomales, siendo
evaluada la utilidad de cada uno de estos marcadores moleculares en diferentes complejos
de especies de Fusarium de importancia clínica por Balajee y colaboradores 2009
(Balajee et al., 2009).
Al estimar las distancias genéticas de los diferentes complejos de especies mediante las
secuencias codificantes de RPB2, se encontró que la distancia obtenida entre los
complejos Fusarium oxysporum y Fusarium solani son menores a las reportadas por las
secuencias del EF-1α (0,161); igualmente la distancia obtenida entre los complejos
Fusarium solani y Fusarium incarnatum-equiseti (0,034) fue menor a los obtenida con
las secuencias de EF-1α, lo que contrasta con los altos valores de distancias entre los
complejos Fusarium oxysporum y Fusarium incarnatum-equiseti, que indica y reitera la
moderada-baja utilidad que poseen las secuencias del gen RPB2 en la identificación de
individuos pertenecientes al complejo de especies de Fusarium oxysporum (Balajee et al.,
2009).
Los niveles de entropía revelados en los alineamientos realizados al conjunto de
secuencias de EF-1α, demuestran la presencia de cuatro zonas de alto grado de entropía
bien definidas y separadas por tres regiones de alto grado de conservación, lo que coincide
con los análisis realizados por O’Donnell y colaboradores en 1998, (Figura 5) gran parte
de estas zonas con altos niveles de entropía y constituidas en parte por regiones
69
conservadas corresponden a los tres dominios estructurales de esta proteína,
denominados; dominio de unión a GTP o exón 2, responsable de un cambio
conformacional mediado por la hidrolisis de GTP a GDP (Moller et al., 1987); dominio
2 o exón 3, implicado en un cambio estructural a barril-β encargado en la unión de ARNt
(ARN de transferencia) que va a ser cargada (Nissen et al., 1995) y dominio 3 o exón 4,
ubicado en el extremo c-terminal y adopta una estructura de barril-β involucrado en la
unión de la molécula de ARNt y del factor de elongación EF-1β) (Wang et al., 1997). Los
mismos análisis practicados al grupo de secuencias de RPB2 no permiten observar zonas
de altos niveles de entropía bien diferenciadas ni la separación de estas por zonas amplias
de conservación de nucleótidos, indicando ello el alto número de dominios estructurales
de importancia (12) y de múltiples motivos funcionales distribuidos ampliamente en las
secuencias codificantes de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (Cramer
et al., 2001; Ruprich-Robert G, Thuriaux P. 2010), separadas por zonas de conservación
o bajos niveles de entropía, lo que concuerda de igual manera con el trabajo de Frøslev y
colaboradoes (2005) en donde se observa zonas de entropia bien distribuidas a lo largo
de las secuencias de RPB2, aunque a nivel de secuencias aminoacidicas el grado de
conservacion es bastante marcado, que conllevo al uso de este marcador molecular para
estudiar las relaciones del filum Basidiomicota. Posteriormente se implementó al estudio
de la taxonomia y filogenia del genero Fusarium.
Es de resaltar que aunque se muestra altos niveles de entropía en regiones codificantes
para los grupos de secuencias de RPB2, a nivel de las secuencias aminoacídicas y
funcionalidad de las mismas estas demuestran un alto grado de conservación (Sweetser
et al., 1987; Kinzy et al., 1994; O’Donnell et al., 1998; Liu et al., 1999; Pittman et al.,
2009); lo que se traduce en un excelente balance entre el grado de variabilidad
intraespecifica y variabilidad interespecifica, necesaria en los procesos de identificación
y sistemática molecular de Fusarium en la actualidad (Figura 4 y Figura 5).
El análisis de la variabilidad generada por los dos conjuntos de secuencias de los genes
EF-1α y RPB2, como son el número de sitios monomórficos, polimórficos, singletones,
fenómenos de inserción-delección y parsimoniosamente informativos, facilita la
detección de variabilidad y conservación a través de las secuencias, permitiendo analizar
70
la presencia del alto grado de zonas informativas y de zonas variables que separaron los
diferentes aislamientos de origen clínico analizados en el presente trabajo.
6.3 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium.
La evaluación de los distintos métodos estadísticos de inferencia usados en este trabajo
como lo son Neighbor-Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia
Bayesiana, permitieron reconocer la gran utilidad del método de Neighbor-Joining para
estimar las relaciones existentes entre los aislamientos de origen clínicos objeto del
presente trabajo, el cual no requiere de métodos estadísticos complejos para evidenciar
de manera sencilla las relaciones entre la totalidad de las muestras; además estos
resultados fueron respaldados por los resultados de Inferencia Bayesiana llevados a cabo
mediante el programa BEAST (Drummond et al., 2012).
El dendrograma obtenido por el método de Neighbor-Joining a partir de las secuencias
de EF-1α reveló una clara agrupación de los aislamientos previamente identificados como
miembros de los complejos de especies Fusarium oxysporum, Fusarium solani y
Fusarium incarnatum-equiseti (Figura 7). Cabe notar que el único miembro del complejo
de especies Fusarium incarnatum-equiseti tuvo una mayor relación con los miembros de
Fusarium oxysporum. Estos resultados coinciden con la revisión hecha por Balajee y
colaboradores en 2009, en donde proponen, definen, evalúan y aceptan la formación de
siete complejos de especies de interés clínico, que incluyen F. solani, F. oxysporum, F.
incarnatum-equiseti, F. chlamydosporum, F. tricinctum, F. dimerum y Gibberella
fujikuroi (O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2011). La agrupación de estos complejos se
basó en la presencia de dos clúster (MOTU’s) (Clúster I = sub-clúster I - sub-clúster II y
Clúster II = sub-clúster III y sub-clúster IV) (Figura 7).
La construcción del dendrograma que describe la relación de las secuencias codificantes
para RPB2 de los 59 aislamientos, obtenido por el método de Neighbor-Joining, permitió
la identificación de tres clústeres, similar a lo presentado en el dendrograma de EF-1α,
pero se diferenció en la no formación de sub-clústeres claramente definidos. Es de resaltar
que estos clústeres (I, II y III) no incluyeron al total de integrantes de los complejos de
71
especies determinados en este trabajo (Fusarium solani, Fusarium oxysporum y
Fusarium incarnatum-equiseti), de esta manera el clúster I conformado en su mayoría por
aislamientos del complejo Fusarium oxysporum (21 aislamientos) y un aislamiento del
complejo de especies Fusarium solani, el cluster II formado por 19 aislamientos de los
tres complejos de especies identificados, en su mayoría aislamientos del complejo
Fusarium oxysporum (11 aislamientos), y el clúster III constitutivo por 18 aislamientos,
todos del complejo de especies Fusarium solani, excepto un único aislamiento del
complejo de especies Fusarium oxysporum (Figura 8). Las relaciones obtenidas por el
método de Neighbor-Joining a los aislamientos del complejo F. oxysporum evidencio de
manera detallada el baja utilidad que posee este tipo de secuencias en la identificación y
resolución de relaciones taxonómicas de los aislamientos de origen clínico analizados
(Figura 8).
Al momento de analizar las relaciones obtenidas mediante el análisis del método de
Neighbor-Joining, por la concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, para aquellos
aislamientos identificados como miembros del complejo de especies de F. oxysporum,
nuevamente se observa la aceptable agrupación de estos aislamientos de acuerdo a los
sub-cluster definidos previamente, mediante el análisis de las secuencias de RPB2 para
la totalidad de los aislamientos analizados en el presente trabajo, por el método de
Neighbor-Joining (Figura 9). De esta manera se observa la clara irrupción de algunos
miembros del Sub-cluster I y Sub-cluster III en el MOTU que contiene a la totalidad de
los aislamientos del Sub-cluster II, caso similar se observa en el agrupación de los
miembros del Sub-cluster IV ya que se ven ubicadas al extremo de esta agrupación,
miembros de los complejos de especies de F. chlamydosporum y G. fujikuroi quienes
sirven como grupos externos al análisis de las relaciones del complejo de especies F.
oxysporum; en el caso de los aislamientos del Sub-cluster V, su agrupación no se ve
afectada por ningún otro aislamiento o grupo externo (Figura 9).
Estas observaciones encuentran un alto grado de coincidencia por los análisis de
concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2 por el método de Neighbor-Joining,
realizados de manera individual a los aislamientos identificados como miembros del
complejo de especie F. solani, tanto a nivel de los dos sub-cluster que componen el
72
Cluster I, teniendo como base las agrupaciones obtenidas por este mismo método pero
con base solo en las secuencias de EF-1α (Figura 7); así los valores estadísticos de
bootstrap que soportan estas agrupaciones, 75 % para el Sub-cluster II y de 95 % para el
Sub-cluster I, logran sustentar nuevamente dichas agrupaciones establecidas en la
identidad de cada uno de los aislamientos (Figura 10).
Es importante resaltar que no se observó la agrupación de aislamientos en relación con el
tejido afectado ni con el género del paciente (Figura 7, Figura 8, Figura 9 y Figura 10).
Resultados similares ocurrieron en el estudio de Wang y colaboradores (2011), en donde
se probaron los juegos de cebadores e-1H/ef-2T para EF-1α, 5F2/7cR para la región
RPB2-57 y 7cF/11aR para la región RPB-711 específicos para los diversos complejos de
especies de Fusarium sp, los cuales amplificaron el ADN de cepas de referencia de siete
complejos de especies. O’Donnell y colaboradores (2008) probaron y validaron estos tres
pares de cebadores; al usarlos con diferentes aislamientos de interés clínico de los
diferentes complejos de especies Fusarium encontraron un excelente grado de
discriminación en todos los complejos de especies evaluados (O’Donnell et al., 2008).
Al comparar los dendrogramas obtenidos por análisis separados de las secuencias de EF-
1α y RPB2 se puede observar la clara inexistencia de relación entre las agrupaciones
obtenidas por cada grupo de secuencias para los 59 aislamientos evaluados; además no se
observa de igual manera ningún grado de correspondencia de acuerdo con los complejos
de especies obtenidas por las secuencias de EF-1α; de esta forma se corrobora el elevado
grado de confianza y correcta identificación de aislamientos de Fusarium de muestras
clínicas por el factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α), siendo mayor que el
registrado por la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), que coincide
con las observación hechas por Balajee y colaboradores en 2009 (Figura 11).
De igual modo, la concatenación de las secuencias codificantes de las proteínas EF-1α y
RPB2 permitió corroborar de manera aceptable las relaciones obtenidas para los distintos
aislamientos de origen clínico con base a los tres complejos de especies identificados en
el presente trabajo mediante el método de Neighbor-Joining, teniendo como antecedente
73
el análisis basado en las secuencias de EF-1α, ya que se observa la conformación de los
mismos cluster (I, II y III), soportado por altos valores estadísticos de boostrap para
dichos nodos, junto con algunas pequeñas diferencias al momento de la definición de los
distintos sub-cluster (I, II, III y IV) de dichos cluster, debido en gran medida la bajo grado
de utilidad y de resolución de relaciones a nivel de complejos de especies por parte de las
secuencias de RPB2 induciendo a errores en los análisis taxonómicos. Al comparar estos
análisis de concatenación con las relaciones obtenidas en las secuencias de RPB2
igualmente por el método de Neighbor-Joining no se observa ningún tipo de similitud en
distribución de los aislamientos con base en los Cluster (I y II) y los distintos Sub-cluster
que los componen, ratificando la confiabilidad de las relaciones establecidas por el
método Neighbor-Joining basado en el grupo de secuencias de EF-1α (Figura 12).
Se ha reportado que las secuencias del factor de elongación son las más apropiadas para
la taxonomía, filogenia e identificación de especies de Fusarium, seguidas por las
regiones de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II y la β-tubulina en la
identificación y en estudios de taxonomía y filogenia (O’Donnell et al., 2008). Estos
resultados son acordes con otros estudios en donde se han usado estas regiones de manera
separada y/o concatenada en la identificación, taxonomía y/o filogenia de especies de
Fusarium (Healy et al., 2005; Monod et al., 2006; Sakai et al., 2006; Alfonso 2008;
Zaccardelli et al., 2008). Esto concuerda con la variabilidad genética marcada de este
complejo (O’Donnell et al., 2000; Godoy et al., 2004; Leslie y Summerell, 2006;
Dyavaiah et al., 2007; O’Donnell et al., 2008; Zaccardelli et al., 2008). Por todo lo
anterior es claro deducir que el método que mejor describe las relaciones taxonómicas
existentes entre los 59 aislamientos clínicos de Fusarium es el de Neighbor-Joining, junto
con la variabilidad expresada por el conjunto de secuencias de EF-1α, justificado en gran
medida por la clara y evidente agrupación de los aislamientos de acuerdo a los complejos
de especies identificados, el soporte estadístico de boostrap de los nodos que soportan
dichos clústeres y sus respectivos sub-clústeres y a la muy alta afinidad y/o
distanciamiento existente entre los miembros de dichos complejos de especies.
Al llevar a cabo una evaluación profunda de las relaciones existentes entre los diferentes
aislamientos, teniendo como base su identificación por comparación de las secuencias en
74
la base de datos Fusarium-ID, se puede establecer el alto grado de grado de utilidad y
resolución de EF-1α con respecto a los resultados de las relaciones obtenidas por las
secuencias codificantes para RPB2, ratificado además por la correcta agrupación de los
diferentes aislamientos con base al complejo de especies perteneciente.
6.4 Correlación de especies identificadas de Fusarium sp con variables
epidemiológicas de pacientes analizados
Diversos estudios llevados a cabo en pacientes inmunocompetentes reportan que las
infecciones por Fusarium spp tienen mayor incidencia en zonas como uñas, ojos y piel
(Castro, 2004; Nardin et al., 2006; Ranawaka et al., 2008; Azor et al., 2009). En este
estudio se observó el mismo esquema reportado para este tipo de hialohifomicosis, ya que
del total de 59 aislamientos el 88,13 % de los aislamientos provenían de lesiones de uñas,
principalmente de los pies, el 5,08 % de piel y el 3,38 % de córnea. Esto concuerda con
que la mayoría de las lesiones de uñas es difícil erradicar el agente causal, especialmente
si se trata de mohos como Fusarium, del cual se conoce su poca respuesta a los
antimicóticos disponibles; lo que conlleva a que estas lesiones sean de duración
prolongada y difícil tratamiento (Castro, 2004; Alustrey-Izquierdo et al., 2008; Azor et
al., 2008; Tortorano et al., 2008; Azor et al., 2009) (Tabla 6).
De los 59 aislamientos, la mayoría derivo de pacientes del género femenino (n = 45),
principalmente de lesiones de uñas. Esta observación es muy común en diferentes
estudios, y se explica por la práctica generalizada del arreglo de uñas entre las mujeres,
por la mayor exposición a traumas y humedad asociados con labores manuales en el hogar
y al uso frecuente de calzado cerrado (De Bedout et al., 2001; Escobar y Carmona, 2003;
Castro, 2004; Zuluaga et al., 2005; Calado et al., 2006; Guilhermetti et al., 2007) (Tabla
6).
Posterior a las lesiones en uñas, los miembros del genero Fusarium son una causa
frecuente de infecciones oculares en zonas tropicales y subtropicales como Brasil, México
y Florida (EE.UU.); además están implicados en la mayoría de los brotes reportados de
queratitis en Asia y es el principal hongo que causa esta patología en Estados Unidos
(Dignani y Anaissie, 2004; Dóczi et al., 2004; Godoy et al., 2004; O’Donnell et al., 2008;
75
Perez et al., 2009). Opuesto a las lesiones en uñas, la queratitis es más frecuente en
hombres que en mujeres, principalmente en agricultores o granjeros. Aunque en este
estudio las muestras de córnea fueron pocas (n = 1), cabe resaltar que esta provenía de un
hombre, lo cual puede asociarse con el hecho de que los hombres están más relacionados
con actividades fuera del hogar, como la agricultura, lo que les crea una mayor exposición
a traumas en el ojo con material vegetal, particulado o metálico, ocasionando lesiones a
nivel de córnea y conllevando al desarrollo de queratitis (Dóczi et al., 2004; Godoy et al.,
2004; Alfonso et al., 2006; Zhang et al., 2006; Alfonso, 2008;). Otra causa que se asocia
al desarrollo de esta patología es el uso de lentes de contacto o sus soluciones de limpieza
contaminados con esporas de Fusarium (Alfonso et al., 2006; Dyavaiah et al., 2007).
Debido a que no se posee la suficiente información del paciente, no podemos concluir
cuál de éstas es la causa de esta micosis en este individuo. Con relación al agente causal
de la queratitis, las tres especies asociadas molecularmente a los complejos de especies
F. solani, F. oxysporum y F. incarnatum-equiseti estuvieron implicadas en estas
infecciones, lo que concuerda con lo reportado en la literatura, donde F. oxysporum y F.
solani son las especies más registradas como agentes causales de esta patología, aunque
F. incarnatum-equiseti con una menor incidencia también ha sido reportado ((Nucci y
Anaissie, 2007) (Tabla 6).
Asimismo F. solani está fuertemente asociado con el desarrollo de micosis invasivas
especialmente en pacientes con el sistema inmunológico comprometido donde las
lesiones superficiales se convierten en el punto de acceso del hongo (Baran et al., 1997;
Girardi et al., 1999; Chade et al., 2003; Mansoory et al., 2003; Ninet et al., 2005; Calado
et al., 2006, Zhang et al., 2006). Este hallazgo es similar a lo reportado en el estudio de
Ranawaka y colaboradores, (2008), donde de un grupo de seis pacientes, uno era diabético
con una lesión en la uña de dos años de duración, causada por F. solani. Igualmente Nir-
Paz y colaboradores en 2004, analizaron un grupo de 68 pacientes inmunocompetentes,
de los cuales 23 eran diabéticos; aunque en este estudio no se determinó la especie de
todos los aislamientos, F. solani fue reportado como una de los principales agentes
causales (Nir-Paz et al., 2004) (Tabla 6).
A nivel local, en dos estudios realizados en la Universidad de los Andes (Bogotá,
Colombia) por Reyes (2001) y Castro (2004), se logró la identificación por métodos
76
morfológicos la especie de varios aislamientos provenientes de onicomicosis;
encontraron que la especie más frecuente identificada fue F. solani, seguida por F.
oxysporum, y en menor proporción F. verticillioides y F. subglutinans.
77
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Este estudio revelo la importancia de regiones nucleares codificantes de genes implicadas
en funciones vitales y altamente conservadas y demostró que EF-1α es un gran marcador
molecular, con un alto grado de fiabilidad en la identificación de aislamientos de
importancia clínica pertenecientes al género Fusarium.
La utilidad mostrada por secuencias codificantes de proteínas como marcadores
moleculares en estudios de sistemática molecular de hongos fue ratificada nuevamente en
este estudio. Es de resaltar el alto grado de resolución y establecimiento de la variabilidad
intra-complejo de especies, además de sus patrones evolutivos; que posee el factor de
elongación de la traducción (EF-1α) debido en gran medida al número, calidad y
proporciones de zonas informativas y regiones conservadas siendo mucho mejor que las
características demostradas por las secuencias de la segunda subunidad mayor de la ARN
polimerasa II (RPB2), que permite la adecuada identificación y establecimiento de la
taxonomía de aislamientos clínicos de Fusarium, ya que este posee un nivel moderado de
utilidad en el complejo de especies de Fusarium oxysporum.
La utilidad que poseen la secuencias moleculares como un sistema acertado en la
identificación de agentes causales de infecciones causadas por hongos se ve ratificada
nuevamente, ya que las relaciones existentes en las diversas variables epidemiológicas
evaluadas en cada uno de los casos, y la posibilidad de obtener la identidad de dicho
patógenos en cuestiones de 72 horas mejoraría la calidad y tiempo de los tratamientos
hacia este tipo de infecciones.
El uso de un tercer marcador molecular permitiría hacer mejor análisis, que soporten la
identificación y relaciones existentes entre aislamientos de interés clínico, solventando
los bajos niveles de utilidad otros marcadores, en especial del genero Fusarium, con el
fin de llevar a cabo análisis multilocus, ya que se ha reportado que el factor de elongación
de la traducción 1α es el único que posee altos niveles de resolución en todos los
complejos de especies de Fusarium.
78
AGRADECIMIENTOS
Ofrezco enorme gratitud a la Dra. Adelaida María Gaviria Rivera directora de mi tesis de
maestría por haberme permitido desarrollar mi investigación a su lado, por sus
sugerencias y apoyo durante la realización del mismo.
Agradezco a la Dra. Sandra Uribe Soto, docente del posgrado en Biotecnología por los
conocimientos transmitidos durante de mi tesis de maestría, por sus importantes
sugerencias, al igual que por el gran apoyo y ayuda brindados durante este periodo.
Manifiesto gran aprecio y agradecimiento a Richard Hoyos M.Sc PhD (c), por la gran
ayuda y conocimientos en el área de la sistemática molecular, que me aportó durante la
investigación, además por sus sugerencias, constante apoyo y motivación.
Doy mi más sincera gratitud al Grupo de Investigación en Sistemática Molecular y al
grupo de trabajo del Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medellín, quienes me apoyaron completamente en el
desarrollo de mi tesis con sus conocimientos y valiosos recursos de investigación, además
de la motivación manifestada por cada uno de sus integrantes.
Manifiesto también mi gran aprecio y agradecimiento a los profesores del posgrado en
Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín: Mauricio
Alejandro Marín, Pablo Andrés Gutiérrez, Mauricio Salazar Yepes, Rafael Arango Isaza,
Edna Judith Márquez y Héctor Alejandro Rodríguez, por los conocimientos y consejos
aportados en el desarrollo de mis estudios y trabajo de investigación en las diversas áreas
aplicadas.
Agradezco a mis amigos de la UNAL y UdeA; Bibiana Betancur, Nevar García, Catalina
Camargo, Diego Carrero, María Angélica Contreras, Yesica Ardila, Liliana Acevedo,
Jibram León, Lorena García, Isabel Cadavid, Federico Álvarez, José Rangel, por su gran
e invalorable ayuda académica y personal en esta importante etapa.
Ofrezco sinceros agradecimientos al personal de la dirección del Posgrado en
Biotecnología de la Universidad Nacional, Dr. Mario Evelio Arias, Dr. Cesar Augusto
79
Velásquez, Leidy Londoño, Gloria Rivas, Neyi Pulgarín y Gloria Elena Gómez por su
buen ánimo y enorme colaboración ofrecida en los trámites administrativos relacionados
con el desarrollo de mi maestría.
Por ultimo este trabajo está dedicado a mis padres, Mercedes y José Domingo por todos
sus sacrificios y constante apoyo; y muy especialmente a Diana Marcela Trujillo Jiménez
por todo tu amor, paciencia y enseñanzas más importantes que esta maestría y mil
doctorados juntos.
80
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EF-1α Máxima Verosimilitud
ANEXOS.
Anexo 1. Arboles obtenidos mediante los métodos de Máxima Verosimilitud, Máxima
Parsimonia e Inferencia Bayesiana. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap (5000 réplicas)
son mostrados en cada nodo. Los árboles fueron enraizados usando las secuencias de EF-
1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos
Fusarium-ID.
56301F. solani
56868F. solani
55347F. solani
57335F. solani
63447F. solani
63917F. solani
55349F. solani
63200F. solani
56604F. solani
56780F. solani
63635F. solani
56337F. solani
56891F. solani
57949F. solani
56340F. solani
63749F. solani
56054F. solani
56988F. solani
56321F. solani
58025F. solani
64765F. solani
56240F. solani
56894F. solani
57221F. solani
65068F. solani
56665F. incarnatum-equiseti
55498F. oxysporum
56323F. oxysporum
55827F. oxysporum
58023F. oxysporum
55728F. oxysporum
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
57560F. oxysporum
63666F. oxysporum
63145F. oxysporum
55787F. oxysporum
55861F. oxysporum
55979F. oxysporum
55945F. oxysporum
63316F. oxysporum
56212F. oxysporum
62802F. oxysporum
56094F. oxysporum
55466F. oxysporum
55583F. oxysporum
62698F. oxysporum
56320F. oxysporum
56363F. oxysporum
63768F. oxysporum
55585F. oxysporum
63613F. oxysporum
55588F. oxysporum
55762F. oxysporum
57721F. oxysporum
57885F. oxysporum
63649F. oxysporum
55496F. oxysporum
55529F. oxysporum
F. dimerum
99
99
93
92
7775
72
50
50
99
8151
64
100
94
70
96
6489
Sub
-cla
do IV
Sub
-cla
do II
IS
ub-c
lado
III
Sub
-cla
do I
Sub
-cla
do II
Cla
do I
Cla
do II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Clado III
99
EF-1α Máxima Parsimonia
F. oxysporum 55583
55466F. oxysporum
57721F. oxysporum
55979F. oxysporum
63649F. oxysporum
55762F. oxysporum
63768F. oxysporum
63613F. oxysporum
55861F. oxysporum
63316F. oxysporum
57885F. oxysporum
55945F. oxysporum
55585F. oxysporum
56094F. oxysporum
56212F. oxysporum
55588F. oxysporum
62698F. oxysporum
56363F. oxysporum
62802F. oxysporum
56320F. oxysporum
55496F. oxysporum
56323F. oxysporum
55827F. oxysporum
58023F. oxysporum
55728F. oxysporum
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
57560F. oxysporum
55787F. oxysporum
63145F. oxysporum
63666F. oxysporum
55498F. oxysporum
55529F. oxysporum
57221F. solani
56894F. solani
64765F. solani
65068F. solani
56240F. solani
58025F. solani
56988F. solani
56321F. solani
56340F. solani
63749F. solani
56337F. solani
56891F. solani
56054F. solani
57949F. solani
56780F. solani
63635F. solani
63200F. solani
56604F. solani
55349F. solani
57335F. solani
55347F. solani
63447F. solani
56301F. solani
63917F. solani
56868F. solani
56665F. incarnatum-equiseti
F. dimerum
99
90
88
7380
70
99
99
7563
74
99
97
76
96
88
84
66
51
57
99
58
Sub
-cla
do II
IS
ub-c
lado
III
Sub
-cla
do IV
Su b
-cla
do II
Sub
-cla
do I
Cla
do I
Cla
do II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Clado III
100
EF-1α Inferencia Bayesiana
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub-
clad
o IV
Su b
-cla
d o II
I Cl a
do I
I
S ub-
clad
o I
S ub-
clad
o I I
Cl a
do I
Clado III
101
RPB2 Máxima Verosimilitud
F. solani 56780
55349F. solani
63635F. solani
56301F. solani
56868F. solani
63200F. solani
56321F. solani
57335F. solani
63917F. solani
55347F. solani
63447F. solani
56054F. solani
57949F. solani
58023F. oxysporum
56891F. solani
56340F. solani
63749F. solani
56337F. solani
62802F. oxysporum
56988F. solani
55496F. oxysporum
56240F. solani
65068F. solani
57721F. oxysporum
57221F. solani
56212F. oxysporum
56894F. solani
64765F. solani
63666F. oxysporum
56665F. incarnatum-equiseti
56323F. oxysporum
57228F. oxysporum
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
55945F. oxysporum
55466F. oxysporum
58025F. solani
56604F. solani
55498F. oxysporum
63613F. oxysporum
55529F. oxysporum
55827F. oxysporum
55585F. oxysporum
56320F. oxysporum
56363F. oxysporum
55861F. oxysporum
55762F. oxysporum
63768F. oxysporum
63145F. oxysporum
55583F. oxysporum
55588F. oxysporum
62698F. oxysporum
63649F. oxysporum
57560F. oxysporum
63316F. oxysporum
55979F. oxysporum
56094F. oxysporum
57885F. oxysporum
55787F. oxysporum
F. dimerum
100
9489
100
100
65
100
70
100
100
85
52
99
99
83
67
87
5999
80
79
6898
66
69
70
57
Sub
- Cla
do I
Sub
-cl a
do I
IC
lado
II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub-clado III
Cla
do I
Sub
-cla
do I
VS
ub-c
lado
V
102
RPB2 Máxima Parsimonia
.
56780F. solani
56301F. solani
56868F. solani
63635F. solani
55349F. solani
57335F. solani
63200F. solani
56321F. solani
63917F. solani
55347F. solani
63447F. solani
58023F. oxysporum
57949F. solani
56054F. solani
56891F. solani
56340F. solani
63749F. solani
56337F. solani
F. oxysporum 62802
56988F. solani
55496F. oxysporum
57721F. oxysporum
57221F. solani
56894F. solani
64765F. solani
56212F. oxysporum
56240F. solani
65068F. solani
58025F. solani
63666F. oxysporum
56665F. incarnatum-equiseti
56323F. oxysporum
55945F. oxysporum
57228F. oxysporum
55466F. oxysporum
63414F. oxysporum
55444F. oxysporum
56604F. solani
55498F. oxysporum
63613F. oxysporum
55529F. oxysporum
55827F. oxysporum
55585F. oxysporum
56320F. oxysporum
56363F. oxysporum
63768F. oxysporum
63145F. oxysporum
55861F. oxysporum
55762F. oxysporum
55583F. oxysporum
55588F. oxysporum
55787F. oxysporum
56094F. oxysporum
57885F. oxysporum
63316F. oxysporum
62698F. oxysporum
63649F. oxysporum
55979F. oxysporum
57560F. oxysporum
F. dimerum
99
9396
99
99
70
99
99
99
99
99
99
97
77
77
74
71
64
71
51
74
57
79
Sub
-cla
do I
Sub
-cl a
do II
Cla
do II
Localización de lesión Convención
Uña pie
Uña mano
Piel
Cornea
Abdomen
Desconocido
Sub
-cla
do II
I
Cla
do I
103