PARTE 2 CultivoPARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISNORMAS Y GUA TCNICAMANUAL MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISMANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISNORMAS Y GUA TCNICAPARTE II CULTIVO2008 NDI NALUTSOROPSAHONDI NPEOVI MUPNDI NALUTSOROPSAHONDI NPEOVI MUPNDI NALUTSOROPSAHONDI NPEOVI MUPNDI NALUTSOROPSAHONDI NPEOVI MUPRedaccin Lucia Barrera INEI, ANLIS Dr. Carlos G. Malbran, ArgentinaRevisin tcnicaMara Delfna Sequeira de LatiniINER, ANLIS Dr. Carlos G. Malbran, ArgentinaSusana BalandranoInDRE, MxicoMaritza VelazcoINS, ChileErnesto Montoro IPK, CubaRevisin especial de expertosIsabel Narvaiz de KantorAdalberto LaszloAgradecimientosA Mara Alice Telles y Mara Consuelo Garzn TorresPor las publicaciones que documentan la experiencia de Brasil y Colombia con el medio de cultivo Ogawa y el mtodo de Kudoh.A David Avendao y Beatriz Lpez por las fotografas3PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAPREFACIO 7UTILIDAD DEL CULTIVO 9ORGANIZACIN DE LOS SERVICIOS CULTIVO EN LA RED DE LABORATORIOS11EL BACILO DE LA TUBERCULOSIS Y OTRAS MICOBACTERIAS PRESENTES EN MUESTRAS CLNICAS DEL HOMBRE 13FUNDAMENTOS DE LOS PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA EL CULTIVODE Mycobacterium tuberculosis 17Persistencia del bacilo en muestras de la lesin 17 Resistencia del bacilo a agentes decontaminantes17Concentracin de los bacilos 18Exigencias para el desarrollo del bacilo in vitro 18Nutrientes en los medios de cultivo 18Condiciones y tiempo de incubacin19Contaminacin cruzada 20Cuantifcacin del desarrollo de M Tuberculosis20ELECCIN DEL MTODO DE CULTIVO SEGN LOS RECURSOS DISPONIBLES 21Mtodo de Kudoh Ogawa21Mtodo de Petroff22Mtodos ms costosos23Empleo de medios sintticos23Sistemas para la lectura automatizada de cultivos 23UBICACIN DE LAS TAREAS Y DE LOS EqUIPOS FLUjO DEL MATERIAL 25Tareas de muy bajo riesgo 25Tareas de riesgo mediano 26Tareas de mayor riesgo26El laboratorio de procesamiento de muestras y aislamientos26rea de esterilizacin de material contaminado 28Escalamiento de la bioseguridad en las instalaciones de laboratorios de referenciacon alto riesgo biolgico28TOMA, RECEPCIN, CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS 31INDICE4MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISTCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EL CULTIVO DE MUESTRAS33PROCESAMIENTO DE MUESTRAS33Entrenamiento del personal33Organizacin del material33Preparacin de las muestras 35Recuperacin de material tomado por hisopado 36Concentracin de muestras lquidas o semifudas 37Maceracin de muestras de tejido tomadas por biopsia37Eliminacin de desinfectantes de muestras de esputo38Digestin, decontaminacin, y concentracin por el Mtodo de Petroff modifcado 38Inoculacin de los medios de cultivos y preparacin del frotis 40Organizacin del procesamiento simultneo de distintos tipos de muestras40Acondicionamiento del material para el autoclavado41Incubacin de los tubos inoculados41Fijacin y tincin de los frotis41Decontaminacin de reas de trabajo y equipos 41Lectura e informe de resultados de las baciloscopias 42Otros mtodos de decontaminacin/homogenizacin42N-acetil-cisteina-hidroxido de sodio (NALC-NaOH)42Mtodo de Kudoh Ogawa42Decontaminacin con soluciones cidas43Agregado de suplementos a los medios de cultivo 43Incubacin en condiciones especiales 43LECTURA E INFORME DE RESULTADOS50Control visual peridico 50Registro de resultados51Procedimientos especiales de lectura51Agar en placa delgada51Lectura manual de medios con sensores del desarrollo 51Lectura automatizada de caldos52Procedimientos a seguir cuando se detecta desarrollo 52Seleccin de cultivos positivos para identifcacin y prueba de sensibilidad 53Informe de resultados 54Descarte de tubos inoculados54IDENTIFICACIN DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS55Morfologa de las colonias 55Precauciones para procesar cultivos positivos56Caractersticas microscpicas57Pruebas bioqumicas57Prueba de niacina57Inhibicin de catalasa a 68 C59Reduccin de nitrato60Pruebas moleculares615PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICACONTROL DE CALIDAD 65CONTROL DE CALIDAD INTERNO65Medios de cultivo, en particular a base de huevos 65Aspecto 65Sensibilidad66Esterilidad 66Registro de elaboracin o recepcin, control y consumo de medios de cultivo66Organizacin del trabajo, calidad de los registros 66Seguimiento de los resultados67Diario 67Peridico68Relacin entre resultados de baciloscopias y cultivos68Contaminacin 69Anlisis de la demora en la entrega de informes70CONTROL DE CALIDAD EXTERNO70BIBLIOGRAFA SELECCIONADA71ANEXOSANEXO I MEDIDAS MNIMAS DE BIOSEGURIDAD73Entrenamiento del personal 73El laboratorio de cultivo de muestras 74Indumentaria y equipo de proteccin del personal 74Operaciones dentro de una cabina de seguridad biolgica74Precauciones generales para el procesamiento de las muestras 76Centrifugacin 76Procesamiento y desecho de material contaminado76Utilizacin de tubos que emiten luz UV77Mantenimiento de refrigeradores 77Plan de contingencia para accidentes de trabajo78Precauciones para la derivacin de cultivos positivos a otro laboratorio 78ANEXO II EQUIPAMIENTO81Autoclave/estufa de esterilizacin81Homogeneizador o licuadora 82Bomba peristltica 82Coagulador82Centrifuga 82Cabina de seguridad biolgica 83Incinerador de asas 85Agitador de tubos tipo Vortex85Estufa de incubacin85Bao Mara o bloque de calentamiento85Termmetros85ANEXO III MATERIAL DE VIDRIO, PLSTICO Y OTROS87Pipetas 876MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISDispositivos para pipetear 87Morteros88Asas 88Tubos o frascos para envasar los medios de cultivo a base de huevos88Tubos para centrifugar88Gradillas, cestos y bandejas88Recipientes para autoclavar material88ANEXO IV PREPARACIN DE MATERIAL, MEDIOS Y REACTIVOS89Reciclado del material de vidrio o polipropileno89Solucin de limpieza sulfocrmica90Precauciones generales para preparar soluciones 90Conservacin de medios y soluciones 90Medios a base de huevos91Medios sintticos de la serie Middlebrook94Caldo Middlebrook 7H994Agar Middlebrook 7H11 94Mezcla de antibiticos95Buffer fosfato pH 6,8 M/15 95Soluciones decontaminantes 95Hidrxido de sodio 4% para el Mtodo de Petroff modifcado 96Solucin decontaminante para el mtodo NALC NaOH 96Solucin de cloruro de cetilpiridinio en cloruro de sodio, para el transporte de muestras durante un tiempo prolongado 96Reactivos para la prueba de niacina 96Bromuro de ciangeno 10 % 96Cianuro de potasio al 4%97Agua de bromo 97Anilina al 4% 97Reactivos para la prueba de catalasa97Tubos con buffer pH 6,8 97Tween 80 al 10%97Sustrato y reactivos para la prueba de nitrato reductasa98Sustrato 98Reactivos98ANEXO V MODELOS DE FORMULARIOS Y REGISTROS99Solicitud de baciloscopia, cultivo y prueba de sensibilidad99Resultado de baciloscopia, cultivo y resultado de identifcacin del aislamiento 100Registro de resultados de identifcacin de aislamientos 102Formulario para la derivacin de un aislamiento o muestra al laboratorio (nacional) de referencia para identifcacin y/o prueba de sensibilidad 103Registro de temperaturas105Registro de elaboracin o recepcin106Evaluacin de resultados de cultivo 1077Como fue presentado en la primera parte de este Manual, la baciloscopia es la tc-nica que soporta a las acciones de control de la tuberculosis. Con la baciloscopia el laboratorio inicia la investigacin de una muestra de lesin del paciente en bsqueda del bacilo de la tuberculosis, detecta y evala la evolucin de los casos infecciosos, pronostica y avala la curacin de los que completan el esquema exitosamente e identifca a los que fracasan con su tratamiento El cultivo complementa a la baciloscopia ya que permite poner en evidencia bacilos viables pre-sentes en escasa cantidad en una muestra de lesin, caracterizarlos para certifcar que sea el bacilo de la tuberculosis y conocer si es sensible o resistente a las drogas antituberculosasEntonces, el rol del cultivo es ms importante en escenarios con mediana o baja incidencia de tuberculosis,conaltacoinfeccindelbacilodelatuberculosiseHIVyconcargamedianao alta de tuberculosis multirresistente Se han desarrollado tcnicas moleculares para lograr los mismos resultados del cultivo con mayor celeridad. Estos mtodos an no han logrado sustituir a la deteccin, identifcacin y prueba de sensibilidad dependientes del cultivo. El cultivo puede ser aplicado en laboratorios con medianos recursos y mantiene su posicin como mtodo de referenciaporsuprecisin.Porotrolado,ningnmtodoinmunolgicohalogradoequiparar la especifcidad del cultivo para detectar y confrmar el diagnstico de la enfermedad causada por el bacilo de la tuberculosis De manera que, sobre la base de la evidencia producida hasta el momento, no es razonable introducir en los laboratorios de la red de diagnstico de tuberculosis innovaciones, sin tener antes asegurada la cobertura y calidad con baciloscopia y cultivo.Considerando la situacin epidemiolgica prevalente Latinoamrica, la experiencia desarrollada en la Regin y los recursos existentes, es oportuno promover la valoracin del cultivo como la herramienta del Programa de Control de Tuberculosis. El cultivo permite mejorar la evaluacin de la efciencia del Programa en la administracin de tratamientos, optimizar el manejo de la tuberculosismultirresistenteylaasociadaaHIV,yprogresarenelcontroldelaenfermedad donde se han alcanzado los objetivos establecidos para los casos infecciosos. El anlisis de la situacin tambin conduce a impulsar la garanta de calidad del cultivo y asegu-rar el acceso a esta tcnica de los pacientes que pueden benefciarse con ella. Con esta visin se ha encarado la actualizacin de la normas para la identifcacin Mycobacterium tuberculosis mediante cultivo. Esta segunda parte del Manual de Bacteriologa de la Tuberculosis estdedicadaalaboratoriosquepreviamentedebenhaberaseguradocompetencia,calidady bioseguridad para realizar baciloscopia De manera que los procedimientos aqu presentados son adicionales a los descriptos para la realizacin de la baciloscopia en la primera parte del Manual. PREFACIO8MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISEstas normas han tomado en cuenta las que las ante-cedieron en Latinoamrica (Notas Tcnicas CEPANZO N26,27,28y29/1988)ylaselaboradasporla Organizacin Mundial de la Salud (WHO/TB/98.258) y la experiencia de los laboratorios de la Regin. Proponen mejorar la tcnica puesta en vigencia por la norma an-terior, y ofrecen un men de mtodos para distintos es-cenarios, seleccionados entre los que han demostrado aportar al diagnstico de tuberculosis en Latinoamrica, segn la evidencia publicada. Detallan adems los pro-cedimientos para incrementar la calidad y bioseguridad en el trabajo9El cultivo produce resultados tardamente pero es ms sensible que la baciloscopia. Puede evidenciar un mnimo de 10 a 100 bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) presentes en una muestra, si es realizado en forma adecuada. Permite detectar los casos antes de que lleguen a ser infecciososMediante el cultivo es posible incrementar la confrmacin del diagnstico de tuberculosis en aproximadamente 15-20% del total de casos y en 20-30% de los casos de tuberculosis pul-monar. Si se considera el total de casos con diagnstico de tuberculosis pulmonar confrmado bacteriolgicamente, la baciloscopia detecta el 70-80% y el cultivo 20-30% el restante. Estas cifras estn condicionadas por la situacin epidemiolgica. Entre los casos con tuberculosis extrapulmonar el aporte del cultivo al diagnstico es muy va-riable segn la localizacin de la patologa. Aun con un resultado negativo del cultivo es posible que se establezca o se mantenga el diag-nstico de tuberculosis sobre la base de las evidencias clnicas y epidemiolgicas Cuando es necesario priorizar el uso de recursos, el cultivo es reservado para los sintomticos que no han podido ser diagnosticados por baciloscopia. Con este criterio, se siembran princi-palmente las muestras de sintomticos adultos con enfermedad pulmonar poco avanzada, las de los nios y todas las muestras extrapulmonares. En ciertas circunstancias, el cultivo permite dar seguridad al resultado de la baciloscopia positiva. Es el caso de materiales tomados con hisopos cuyas fbras de algodn pueden ser confundidas UTILIDAD DEL CULTIVOAporterelativo del cultivo al diagnstico de tuberculosisTodos los casosTuberculosispulmonarTuberculosispulmonarcon cultivo+TuberculosisinfecciosaBaciloscopia - / Cultivo+Baciloscopia +Cultivo - / diagnstico porradiologia/clnica/epidemiologa100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%010MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISconBAAR.Oelcasodelavadosbroncoalveolaresque pueden contener bacilos muertos que estaban en el ins-trumento utilizado para tomarlos. Mediante el cultivo es posible aislar los BAAR presentes en una muestra en cantidad sufciente como para identi-fcarlos por mtodos bioqumicos, toda vez que sea nece-sario. Es preciso hacerlo cuando se procesan muestras provenientes de pacientes infectados por HIV que pue-den estar afectados por tuberculosis pero tambin, con mayorfrecuenciaquelospacientesinmunocompeten-tes, por una micobacteriosis. Tambin es necesario en el caso de muestras en las que puede haber micobacterias ambientales colonizantes (lavado gstrico, orina).Por su sensibilidad y porque detecta nicamente bacilos vivos, el cultivo es el mejor mtodo para demostrar la cu-racin de un paciente al fnalizar el esquema teraputico. Sin embargo, es difcil asegurar el acceso al cultivo a to-dos los pacientes a los que se les da el alta, por lo que generalmente las normas requieren el simple control con una baciloscopia en favor de que puedan ser cumplidas, toda vez que la evolucin clnica del paciente sea buena.El cultivo permite realizar la prueba de sensibilidad a los an-tibiticos, identifcar a los casos que necesitan una reformu-lacin de la quimioterapia y orientar la conformacin de un nuevoesquemadetratamiento.Paraestefn,esnecesa-rio cultivar las muestras de pacientes que tienen riesgo de estar afectados por tuberculosis resistente al esquema es-tandarizado de primera lnea. Son los pacientes que tienen antecedentes de tratamiento antituberculoso, sospecha de falla de tratamiento o de contagio con un bacilo resistente a las drogas.. El cultivo es el mejor mtodo disponible para cerciorar falla de tratamiento. Para detectarlos, evitando de-moras, se cultivan las muestras de casos bajo tratamiento con baciloscopia positiva al fnalizar el segundo mes de qui-mioterapia, y se realiza la prueba de sensibilidad inmediata-mente despus de desarrollado el cultivo en el caso en que la baciloscopia persista positiva en el siguiente control. Cuandoseestrealizandounestudioparaevaluarla resistencia a drogas antituberculosas es necesario cul-tivar las muestras de los pacientes incluidos en la inves-tigacin segn el protocolo de trabajo, aun cuando esto nosearequeridoparaelmanejoclnicodeloscasos. Estos estudios son parte de la evaluacin de las accio-nes del Programa de Control de TuberculosisPorultimo,elcultivoeselmtododereferenciaconel que se tiene que evaluar todo nuevo mtodo diagnosticoUso sElEctivo dEl cUltivoEn el momento de diagnstico Cultivar todas las muestras de pacientes sintomticos, con signos clnicos y/o radiografa u otras imgenes compatibles con tuberculosis y alguna de las siguientes caractersticas: baciloscopianegativade3muestrasrespiratorias localizacinextrapulmonardelaenfermedad nios inmunosuprimidos,particularmenteHIVpositivos baciloscopiapositivaenlavadogstrico,lavado bronquial o hisopados antecedentesdetratamientoantituberculoso,especialmente si se registr abandono o fracaso exposicinainfeccinporbacilosresistentesa las drogas (contactos de casos con tuberculosis resistente, internados o trabajadores de instituciones de salud o de prisiones donde se registran casos con tuberculosis multirresistente)dURAntE El contRol dE tRAtAmiEnto cultivar muestras de casosdetuberculosiscrnicosoconbaciloscopia positiva en el control del segundo mes de quimioterapia o en un control posterior casosdiagnosticadosconbaciloscopianegativa y que convierten a positiva su baciloscopia durante el tratamiento PARA lA vigilAnciA dE lA REsistEnciA A dRogAs AntitUBERcUlosAs Cultivar las muestras de casos bajo estudio o vigilancia segn lo establecido en el protocolo de trabajo 11ORGANIZACIN DE LOS SERVICIOS DE CULTIVO EN LA RED DE LABORATORIOSRequerimientos que limitan la implementacin del cultivo a algunos laboratorios de la red Mayordedicacindelpersonalporcadamuestraexaminada Entrenamientoenprcticasdemayorriesgobiolgico Equiposdemedianoyaltocostoconmantenimientoasegurado Laboratorioespacioso/conunsistemadedireccionamientoypurifcacindeaireElprocesamientodemuestrasparaelcultivoinvolucraagitacin,yenocasionesla necesidad de manipular alto numero de bacilos multiplicados en el medio. Estas ope-raciones incrementan el riesgo y por lo tanto el laboratorio debe introducir medidas adicionales de proteccin de su personal.Los mayores recursos necesarios para el cultivo determinan que en algunos pases est cen-tralizado en uno o unos pocos laboratorios de referencia. Es conveniente impulsar un proceso de descentralizacin hacia laboratorios intermedios cuando el territorio es extenso, o la pobla-cinesmuygrandeenciertasreas,ocuandoexistanbarrerasquedifcultanoretardanla derivacin de muestras. Segn la Organizacin Mundial de la Salud es necesario al menos un laboratorio que realice cultivo por cada rea con poblacin de 500.000 habitantes. Para que todos los pacientes que se puedan benefciar con el cultivo tengan acceso a l, y para garantizar su calidad, es necesaria la participacin de toda la red. Los laboratorios de las unida-des de salud que realizan baciloscopia deben estar conectados con el laboratorio de la red ms accesible que realice cultivo, si hay ms de uno, y derivar a ese laboratorio las muestras que requieren ser cultivadas. A la vez, cuando el laboratorio que hace cultivo no tiene condiciones de seguridad sufciente para abrir y procesar cultivos positivos o no tiene implementada la prueba de sensibilidad, debe establecer la conexin con el laboratorio de referencia ms accesible para derivar los aislamientos que requieran ser identifcados o la prueba de sensibilidad. La calidad del medio de cultivo es un punto crtico. Para elaborar los medios a base de huevo se requiere cierta infraestructura y personal dedicado a la preparacin y control de calidad del medio. Por esta razn muchas veces es necesario y/o conveniente que los laboratorios de re-ferencia de una jurisdiccin y/o el nacional produzcan y provean esos medios a la red de labo-ratorios. En tal caso es necesario asegurar el transporte adecuado, y abastecimiento oportuno con medios de cultivo a los laboratorios Si existen varios laboratorios intermedios en la red realizando cultivo, los laboratorios de refe-rencia deben garantizar la calidad del cultivo en la jurisdiccin a su cargo mediante controles de 12MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIScalidad, entrenamiento y la implementacin de medidas correctivas necesarias. El nivel que asegura para el pas la organizacin de red delaboratoriosylareferenciatcnicadebeasegurar la calidad del cultivo y evaluar si la oferta, la utilizacin yelrendimientodelcultivosonadecuadosentodoel pas, en acuerdo con el plan de trabajo y objetivos del Programa de Control de Tuberculosis. Con este enfoque son varias las actividades que debe asumir este nivel: elaborar y difundir normas tcnicas y operativaspara la implementacin del cultivo diseareimplementarunprogramadeformacinderecursoshumanosquecontemplealcultivocomo herramienta de manejo de casos de tuberculosis implementar un programa de garanta de calidaddel cultivo proveeraloslaboratoriosdereferenciadelasjuris-diccionesherramientasparaelentrenamientoyel control de calidad en cada rea de trabajo promoverlabioseguridad orientareimpulsarlainsercindeadelantostcni-cos con precisin demostrada donde sea posible y conveniente, asegurando para esto el entrenamien-to necesario. LaboratoriosResponsabi l i dadde referencia nacionalde referencia para una jurisdiccinintermedios perifricosOrganizacin de los servicios, evaluacin de la oferta, utilizacin y rendimiento del cultivo + Provisin de normas de trabajo + Gestin de equipamiento y bioseguridad adecuada para cultivar muestras y derivar cultivos positivos+ + + Entrenamiento y transferencia de de mtodos + + Garanta de calidad de cultivo + /+ Provisin de medios+ /+ Preparacin de medios+ + /+ Cultivo de muestras +/ + + Seleccinyderivacindemuestrasquerequierenser cultivadas +Seleccin y derivacin de aislamientos que requieren identifcacin/prueba de sensibilidad /+ /+ 13EL BACILO DE LA TUBERCULOSIS Y OTRAS MICOBACTERIAS PRESENTES EN MUESTRAS CLNICAS DEL HOMBREEl gnero Mycobacterium est integrado por cerca de 100 especies. Como fuera ex-plicado en la primera parte de este Manual, tienen alto contenido de cidos miclicos en su pared que retienen anilinas utilizadas como colorantes (fucsina, auramina) aun despusdesertratadasconalcohol-cido.Demaneraquetodaslasespeciesse presentan como bacilos acido-alcohol resistentes (BAAR), y por lo tanto no es posible distinguir con certeza el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias por la baciloscopia. la tuberculosis es la enfermedad ms importante desde el punto de vista de salud pblica entre las causadas por las micobacteriasMycobacterium tuberculosis es el causante de la mayora de los casos de tuberculosis en el hombre en el mundo entero El llamado complejo M. tuberculosis es un taxn continuo que comprende a varios agentes etio-lgicos de tuberculosis. M. tuberculosis, M. africanum que se presenta con variantes o subtipos regionales, y M. canetti (nombre propuesto para algunos aislamientos raros por sus colonias lisas y por algunos marcadores genticos) son primariamente patgenos en el hombre. M bovis yMmicroticausantuberculosisprimariamenteenanimales.Algunosaislamientospeculiares hallados en cabras y focas o lobos marinos han sido llamados M. caprae y M. pinnipedii Desde el punto de vista de la salud pblica, M. tuberculosis y M. africanum son las especies de micobacterias ms importantes porque son altamente patgenas para el hombre y muy trans-misibles de individuo a individuo por medio de aerosoles expulsados por la tos de los pacientes con lesin pulmonar. Tal como su nombre lo indica, M. africanum es patgeno frecuente en el continente africano, aunque, obviamente su dispersin en otras reas geogrfcas es posible de la mano de las corrientes migratorias.M. bovis causa tuberculosis en el ganado bovino y en una gran variedad de animales salvajes y do-msticos, eventualmente tambin en los que viven en zoolgicos. Desde el animal, normalmente del bovino, puede ser transmitido al hombre. A pesar de que todava existe una cantidad no desdeable de rebaos infectados por este microorganismo en Latinoamrica, las medidas de sanidad animal y las aplicadas a los alimentos han llevado al descenso la incidencia de la zoonosis. En reas ganade-ras se puede esperar que M bovis cause a lo sumo el 1-2% del total de casos de tuberculosis con cultivo positivo. Afecta muy distintivamente a quienes estn en contacto con el ganado (trabajadores rurales, de establecimientos que procesan carne para consumo, habitantes de reas ganaderas). M microti fue identifcado como el causante de tuberculosis en roedores y en un numero muy limitado de mamferos. Muy excepcionalmente se han descrito casos de enfermedad causada 14MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISpor esta micobacteria en humanos que se sospecha ad-quirida desde los animalesLa distincin de las especies del complejo M tuberculo-sis aporta informacin muy interesante desde el punto devistaepidemiolgico,peronoesesencialparalas actividades de control ni el manejo clnico de los casos, ya que responden a los esquemas de tratamiento de la tuberculosisestandarizadosdeprimeralnea,siempre que no hayan adquirido resistencia a estos frmacos.ElbacilodeCalmetteyGurin(BCG)utilizadocomo vacuna contra la tuberculosis, comparte la mayor parte delascaractersticasdeMbovisdelcualsesupone quederiva,perotienevirulenciaatenuada.Puedeser aislado de muestras de lesiones originadas por alguna complicacindelavacuna,particularmenteennios. Tambin a partir de muestras de pacientes con alguna complicacin del tratamiento de cncer de vejiga reali-zado con BCG. M. leprae, causante de la lepra, no desarrolla en los me-dios de cultivo y no ser considerado en este Manual.El resto de las micobacterias, que tambin pueden ser detectadasenmuestrastomadasdelhombre,sonca-pacesdevivirlibrementeyporesosonllamadasam-bientales. Tambin se las conoce como oportunistas o atpicas. Este ltimo trmino fue inicialmente utilizado paraagruparlasmicobacteriasquenoseparecanal bacilodelatuberculosis.Peroenrealidadnosonat-picasporquecompartentodaslascaractersticasque defnen al gnero y la capacidad de vivir libremente no es excepcional entre las micobacterias.Comoelbacilodelatuberculosis,lasmicobacterias ambientales pueden integrarse fcilmente en los aero-soles,peroenestecasosonlosquesegeneranpor movimientos de agua y aire en la naturaleza. Los aero-soles son aspirados por el hombre y sa es la va por la quemsfrecuentementeloinfectan,aunquetambin lo pueden hacer por va digestiva o penetrar por alguna lastimadura de la piel o heridas. Normalmente colonizan el rbol respiratorio o el tracto digestivo o urogenital sin causardaoalguno.Msan,elencuentropuedeser inmunolgicamenteefectivoyconferirproteccincon-tra las especies de micobacterias altamente patgenas. Muy excepcionalmente un individuo inmunocompetente esvulneradoporestasmicobacteriasambientales,el riesgoaumentacuandohasufridoenfermedadespul-monarescrnicas(tuberculosis,enfermedadobstructi-va crnica, asbestosis, silicosis, etc.). Las micobacterias ambientales tienen capacidad para subsistir en solucio-nes o instrumentos de uso hospitalario y prtesis, ele-mentos que pueden ser vehculo de serias infecciones posquirrgicas.Noexisteevidenciadequelasmico-bacterias ambientales sean transmisibles de hombre a hombre.Seaslanmicobacteriasambientalesen3-5%delas muestras de pacientes inmunocompetentes con cultivo positivo de BAAR, son ms frecuentes en cultivos rea-lizados en caldos enriquecidos, pero en su mayora son insignifcantes. las micobacterias ambientales son consideradas colonizantes banales o contaminantes agregados durante la toma o procesamiento de la muestra a menos que se rena slida evidencia que demuestre que estn causando enfermedad. En pases con alta o mediana incidencia de tuberculosis, entre los enfermos inmunocompetentes con cultivo po-sitivo de BAAR ms del 99% son casos de tuberculosis. La enfermedad causada por micobacterias ambientales esmsfrecuenteentreindividuosinmunosuprimidos, comosonlosquepadecenSIDAytienenbajosnive-les de linfocitos T. Cuando se administran esquemas de tratamiento anti-HIV de alta efcacia, los individuos que viven con este virus pueden recomponer su sistema in-mune y la frecuencia de las micobacteriosis disminuye notoriamente.El complejo de micobacterias oportunistas de mayor in-cidenciacomopatgenoeselintegradoporM.avium y M.intracellulare (complejo MAI) y su localizacin ms frecuente es la pulmonar. Siguen, en orden de frecuen-cia, algunas micobacterias de rpido desarrollo: comple-15PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAjo M fortuitum (del que con mtodos complementarios a los bioqumicos se puede distinguir M fortuitum y M. pe-regrinum), M abscessus y M chelonae. En algunas reas geogrfcas se destaca la frecuencia de M. kansasii que eslamsvirulentaentrelasmicobacteriasambienta-les y la nica que normalmente es sensible al esquema antituberculosodeprimeralnea.Otrasmicobacterias aparecen con mucha menor frecuencia Enloscasosexcepcionalesenlosqueexistamotivo para dudar si lo que se ha visto, por examen microscpi-co o en el medio de cultivo, pueda ser una micobacteria diferente al bacilo de la tuberculosis, es importante dis-tinguirentretuberculosis,micobacteriosisopresencia de una micobacteria banal. La distincin, debe ser rea-lizada con la mayor celeridad posible, en especial si se est frente a un paciente comprometido (inmunosupri-mido por efecto del HIV o corticoides, sometido a pro-cedimientosquirrgicosincluyendotransplantes,etc.). En estas situaciones se abren tres posibilidades frente al paciente: tratarloportuberculosis administrar tratamiento o quimioproflaxis contrauna micobacteriosis (con esquemas diferentes a los antituberculosos) notratarloSi el paciente ya tiene quimioterapia instaurada, el resul-tado preciso del laboratorio orientar a mantener el es-quema o modifcar la conducta inicialmente adoptadaPorotraparte,si sediagnosticatuberculosisesnece-sariodesencadenarelcontroldecontactosymedidas para la contencin de la transmisin de la enfermedad, actividadesinnecesariasenelcasodeidentifcaruna micobacteria ambiental.17FUNDAMENTOS DE LOS PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA EL CULTIVO DE Mycobacterium tuberculosis Mediante el cultivo es posible hacer que los bacilos presentes en las muestras de los pacientes se multipliquen in vitro, hasta que se muestren formando colonias en un medio slido, turbidez en un caldo o hasta que algn sensor incorporado en el medio cambie de color o emita fuorescencia cuando el bacilo consume O2 o libera CO2. PERSISTENCIA DEL BACILO EN MUESTRAS DE LA LESIN Las micobacterias ambientales pueden sobrevivir fuera del hospedador, si las condiciones no son extremas, pero los integrantes del complejo M.tuberculosis resisten menos fuera de l. De manera que la probabilidad de hacerlos reproducir en el cultivo aumenta con la rapidez con la que se siembre la muestra de la lesin del paciente. La demora es muy crtica cuando el nmero de bacilos es escaso o cuando el pH de la muestra es desfavorable para la sobrevivencia del bacilo, como en el caso de lavados gstricos y orinas. Aunque es desventajosa porque permite lareproduccindelaforacontaminante,noestangravelapostergacindelasiembrade muestras de esputo que contienen alto nmero bacilos (baciloscopia positiva); con ellas se han obtenido cultivos positivos hasta 15 das despus de la recoleccinLa luz solar, desecacin y el calor son condiciones micobactericidas. En cambio, el bacilo resiste a temperaturas muy bajas y su viabilidad puede ser preservada durante plazos crecientes entre los 2-4 C y -70 C. RESISTENCIA DEL BACILO A AGENTES DECONTAMINANTESComparadoconotrasbacteriasquesereproducenenpocosminutos,todoslosintegrantes delcomplejoM.tuberculosis,yvariasmicobacteriasambientalesproliferanmuylentamente. En condiciones favorables de laboratorio, el bacilo de la tuberculosis se divide cada 18 a 24 horas. Las secreciones del aparato respiratorio que han atravesado las vas altas, la orina que pas por la uretra, las muestras del tracto digestivo y las lesiones superfciales de piel contie-nen fora habitual o contaminante que se multiplica cada 15-60 minutos. Por esta razn no es posibleaislaralbacilodelatuberculosisinoculandoestasmuestrasdirectamenteenplacas con medios de cultivo y seleccionando colonias por su morfologa. Con este procedimiento, los grmenes comunes acompaantes ocupan el medio de cultivo en pocas horas impidiendo que aparezca el bacilo de la tuberculosis.Las micobacterias pueden resistir a ciertos desinfectantes como el cloruro o bromuro de cetil-piridinio y el trifosfato de sodio que pueden ser utilizados para el trasporte de muestras durante 18MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISun tiempo prolongado. Por el contrario, son letales para el bacilo algunos conservantes como fenol, formol o de formaldehdo,algunossonutilizadosparainvestigacio-nes histolgicas. Si las muestras contienen grmenes comunes y no han sido decontaminadas durante su transporte, se requiere un tratamiento especial para aislar el bacilo de la tuber-culosis u otras micobacterias. Es necesario homogenei-zar las muestras densas, como los esputos, y eliminar la fora acompaante mediante un proceso de decontami-nacin.Estoesrealizadogeneralmenteconunabase fuerte como el hidrxido de sodio (NaOH). El bacilo de la tuberculosis es ms resistente que los gr-menescomunesaltratamientocondecontaminantes, perounaproporcinnodespreciabledeBAARmuere durante el procedimiento, entre 30 y 60 % dependiendo del mtodo. El efecto letal es mayor cuanto mayor es la concentracin de la base y cuanto ms prolongado es el tratamiento. De manera que es necesario ser preciso al preparar la solucin decontaminante y al controlar el tiempo de contacto con ella para preservar la viabilidad del bacilo de la tuberculosis, tanto como sea posible. Se puede agregar un agente mucoltico como la n-acetil-L-cisteina(NALC)paradisminuirlaviscosidaddelespu-toyfavorecerlapenetracindeldecontaminanteque puede entonces ser utilizado a menor concentracin y durante menos tiempo. A la vez facilita la precipitacin de los bacilos por centrifugacin. El agregado de citrato desodioenlamezcladecontaminantesirveparaunir iones de metales pesados que pueden estar presentes en la muestra e inactivar al NALC. Es posible aumen-tarlarecuperacindeBAARdisminuyendoenprimer lugareltiempodecontactoconeldecontaminantey luegolaconcentracindeNaOH,siempreycuando estonoresulteenunaumentodelporcentajedecul-tivos contaminados muy por encima del 4% que es el nivel considerado aceptable. Se puede considerar esta alternativa en laboratorios que procesan muy cuidado-samenteysindemoraslasmuestraselmismodaen que son tomadas. Es preferible no decontaminar muestras de tejidos o l-quidos normalmente estriles, para evitar el efecto dele-treo del procedimiento. Pero es necesario asegurar la esterilidad durante todos los procedimientos de toma y procesamiento de la muestra, de otra forma se perder material muy valioso y de difcil obtencin por contami-nacin del cultivo. Elbacilodelatuberculosissobreviveysemultiplica aunpHcercanoalneutro.Paraneutralizarlamues-tradecontaminadaconhidrxidodesodiosepuede agregar una solucin cida gota a gota hasta que vire un indicador de pH. Este proceso debe ser controlado muycuidadosamenteCualquierdefectooexcesode lasolucincidaoriginaunpHcidonoaptoparael desarrollo del bacilo. Para evitar este riesgo se prefere enlasnormasactualesaplicarprocesosdelavados con un buffer de pH neutro para eliminar la base utili-zada para decontaminar. CONCENTRACIN DE LOS BACILOS El volumen que puede ser inoculado en cada tubo, pla-caobotellaconmediodecultivoesde0,1a0,5ml. Para concentrar en ese inculo la mayor parte de BAAR presentes en una muestra es necesario sedimentarlos por centrifugacin u otro proceso efectivo e inocuo de precipitacin. Cuando la fuerza que se aplica para pre-cipitar es insufciente se pierden muchos bacilos en el sobrenadante, que es descartado, y por lo tanto dismi-nuye en forma crtica la potencia del cultivo para detec-tar bacilos escasos.EXIGENCIAS PARA EL DESARROLLO DEL BACILO IN VITRONutrientes en los medios de cultivoEl bacilo de la tuberculosis puede crecer utilizando gli-cerol como fuente de carbono, y asparagina e iones de amoniocomofuentedenitrgenoymicronutrientes. Metabolizaelglicerolapiruvato.M.bovisraramente crece a partir de una muestra clnica en un medio con glicerol porque no puede procesar este compuesto o lo hace con mucha difcultad, prefere un medio con piru-19PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAvato o glutamato de sodio. Otro componente clave para eldesarrollodelbaciloeslaalbmina,habitualmente incorporadaenlosmediosdecultivoconelagregado dehuevosdegallinaoseroalbminabovina.Algunos medios sintticos contienen biotina y catalasa para es-timular el desarrollo de bacilos daados Es posible distinguir las colonias caractersticas de M. tuberculosisdesarrolladasenunmedioslidoabase dehuevoscoaguladosoconteniendoagar.Elmedio conagartransparentefacilitalavisualizacindeco-loniaspequeasypuedeserinspeccionadoconuna lupaomicroscopio,loqueadelantaladeteccinde loscultivospositivos.Encambio,cuandosedetecta desarrolloenunmediolquidoesnecesarioverifcar medianteunabaciloscopiasisetratadeBAAR,por-quevisualmenteesmuydifcildistinguireldesarrollo del bacilo de la contaminacinElcaldoyagarenriquecidofavoreceneldesarrollode lasmicobacterias,particularmentedelasambientales, pero tambin de la fora contaminante. Cuando se uti-lizan esto medios para inocular muestras, normalmente se agrega una mezcla con antibiticos inocuos para las micobacterias pero que contribuyen a impedir el desa-rrollo de la contaminacin. Se ha demostrado que la combinacin de distintos me-dios incrementa la posibilidad de obtener cultivos posi-tivos.Variosfactorespuedenexplicaresto.Enprimer lugarseofrecenmsnutrientesparaquedesarrollen algunascepasdelbacilodelatuberculosisydeotras micobacteriasconexigenciasparticulares.Ensegun-dolugarseamortigualasconsecuenciasquetieneel trabajar con un nico lote de medio que fortuitamente pudohaberresultadoconmalacalidad.Porltimo,es msprobablequesepuedanrecuperaraislamientos cuandohaycontaminantesquedesarrollanenalguno de los medios, generalmente en los ms ricos, pero que resultaninhibidosenotro.Cuandosloesposibleuti-lizarmediosabasedehuevos,convienesembrarlas muestras en Lwenstein Jensen y Stonebrink u Ogawa simultneamente. En la medida en que sea posible, es conveniente agregar adems algn caldo o medio con agarespecialmenteparalasmuestrasquecontienen bajo nmero de bacilos, como son la mayora de las ex-trapulmonares. Condiciones y tiempo de incubacinElbacilodelatuberculosissehaadaptadoavivirala temperatura corporal del hombre y en la oscuridad. Se multiplica mejor cerca de los 37 C, la velocidad de de-sarrollo disminuye al alejarse de esa temperatura, muy difcilmente crece por debajo de los 34 C y puede morir por encima de los 40 C. La luz solar (UV) es perjudicial para su sobrevivenciaAlgunas micobacterias ambientales preferen tempera-turas ms bajas para desarrollar especialmente las que suelen afectar a la piel y tejidos superfciales El tiempo en el que detecta un cultivo positivo depende de lo enrgico del mtodo de decontaminacin aplica-do,delpHalquehayaquedadoelinculoluegodel tratamiento,delariquezadelmediodecultivoyde que ste contenga o no algn sensor que evidencie el desarrolloantesdequesehagavisible.Perotambin dependedelascaractersticaspeculiaresdealgunas cepas del bacilo, de la cantidad de bacilos que haya en la muestra de la lesin y del tiempo durante el cual se ha administrado tratamiento antituberculoso al paciente. Existen cepas de bacilos y clones multirresistentes que son ms fastidiosos para multiplicarse. La mayor parte de las muestras con baciloscopia 3+ evidencian desa-rrollo dentro de las primeras 3 semanas de incubacin en medios a base de huevos, y dentro de los 10 das en medios ms ricos. A partir de muestras con muy esca-sosbacilos,nodetectablesporbaciloscopia,lascolo-niasaparecentardamente,aproximadamentehasta8 semanas despus de la siembra en medios a base de huevos y hasta 6 semanas de ser sembradas en agar o caldos enriquecidos.Tan prolongada incubacin a 37 C debe ser hecha en tubos, viales o botellas que adems de ofrecer biosegu-ridad, eviten la desecacin. A la vez el bacilo es aerobio estricto y por eso debe quedar atrapada una atmsfera de oxigeno dentro del tubo, vial, botella o placa. En gene-20MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISral es mejor el desarrollo en tubos grandes. Las placas con agar son colocadas dentro de bolsas de polietileno para evitar la desecacin pero deben ser permeables al pasaje de aire. Una atmsfera de CO2 al 10% durante la primera semana de incubacin favorece el desarrollo de las micobacterias en caldos o medios con agar, aun-que no es indispensable.la agilidad en el procesamiento de las muestras, el empleo de mtodos de decontaminacin menos agresivos, la utilizacin de una buena centrfuga, la combinacin de medios,la incubacin en una estufa precisa permiten incrementar la confrmacin bacteriolgica del diagnstico de tuberculosis por cultivo.RIESGO BIOLGICO INHERENTE A LOS PROCEDIMIENTOS Laagitacinycentrifugacindetubosconteniendo suspensionesconbacilosdurantelahomogeneiza-cin/decontaminacin/concentracingeneranaero-solesinfecciososqueincrementanelriesgobiolgico en un laboratorio que realiza cultivo, en relacin con el que realiza slo baciloscopia. El riesgo es mayor cuanto mayor es la carga de bacilos que contenga la muestra ycuandomayorlacantidaddemuestrasconteniendo bacilos procesadas.CONTAMINACIN CRUZADAEslatransferenciaaccidentaldemicroorganismos,en este caso del bacilo de la tuberculosis, de una muestra a otra al ser procesadas en serie en el laboratorio. Las fuentes de este tipo de contaminacin son generalmen-temuestrasquecontienenabundantesbacilosEste error que puede originar falsos resultados positivos del cultivo, ha sido detectado con mayor frecuencia que la esperada,yseencuentraprcticamenteentodoslos laboratorios que lo investigan. La sobrecarga de trabajo, laaltafrecuenciademuestrasconbaciloscopiaposi-tivaenlarutina,eldesorden,losprocedimientospoco rigurosos, la utilizacin de reactivos no alicuotados, son condiciones propicias para este tipo de contaminacin delaboratorio.Sepuedetransferirmaterialporsalpi-caduras, con las manos o la ropa, mediante soluciones, pipetas o dispensadores contaminados.CUANTIFICACIN DEL DESARROLLO DE M. tuberculosis Eldesarrolloenmediosslidosescuantifcadoutili-zando una escala semicuantitativa que es reproducible, expresa la cantidad de bacilos detectados y permite evi-denciarvariacionessignifcativasdeesacantidad.Por lotantoesindicativadelgradodeavanceyevolucin de la enfermedad. En el caso de los medios lquidos, el tiempo que demanda la deteccin del resultado positivo es, generalmente, indicativo del nmero de bacilos pre-sentes en la muestra21ELECCIN DEL MTODO DE CULTIVO SEGN LOS RECURSOS DISPONIBLESla seleccin del mtodo a emplear entre los incluidos en las normas debe resultar de un anlisis riguroso y realista de elpresupuestoregularycontinuoqueestaseguradoparacubrirtodaslasprioridades para las que debe aplicar el cultivo laefcienciaconlaquesecomercializanycompranlosinsumosnecesarios elentrenamientodelpersonalyequipamientodellaboratorio laceleridadconlaqueseprocesanlasmuestrasluegoderecolectadas laasistenciatcnicaquetienenlosequiposnecesariosenellugardondeseaplicael mtodoElsiguientecuadromuestralosmtodosmsutilizadosinternacionalmente,particu-larmenteenLatinoamrica,paraelcultivodelbacilodelatuberculosisyquehan demostrado ser tiles para el manejo clnico y epidemiolgico de la tuberculosis. Se presentan en orden creciente de costo complejidad riesgobiolgico sensibilidad (probabilidaddeobtenercultivospositivosapartirdemuestrasconteniendobacilos) rapidezparadetectaruncultivopositivoMTODO DE KUDOH OGAwASe han desarrollado y evaluado varias modifcaciones del Metodo de Petroff que, aunque puedan resultar menos efcientes en laboratorios muy bien equipados y con alto presupuesto, son muy tiles para situaciones en las que es necesario establecer el cultivo en laboratorios con estufa de incubacin pero sin centrfuga adecuada, muchas veces sin rea de contencin de las actividades de mayor riesgo, y con difcil acceso a un laboratorio de referencia. La variante ms utilizada en Latinoamrica es una modifcacin de la tcnica de Ogawa Kudoh, econmica, muy sencilla y su-fcientemente sensible como para asegurar que el cultivo contribuya a confrmar el diagnstico de tuberculosis pulmonar, en casos con baciloscopia negativa. Utiliza hisopos para tomar y procesar la muestra a sembrar, y medios a base de huevo con pH acido. Es til para recuperar los bacilos de esputos de pacientes bacilferos que requieren prueba de sensibilidad. Genera riesgo biolgico similar al de la baciloscopia pues no requiere centrifugacin de suspensiones con bacilos.22MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISMTODO DE PETROFFEl el mtodo ms difundido en el mundo entero, y en es-pecial en pases en desarrollo donde la tuberculosis es prevalente, es el de homogenizacin/ decontaminacin con la tcnica de Petroff modifcada, y la inoculacin en medios a bases de huevos con pH cercano al neutro. Es el ms conveniente teniendo en cuenta la situacin de lamayorpartedeloslaboratoriosquerealizancultivo. Los medios a base de huevos son los ms econmicos y siempre es benefcioso utilizarlos, aun cuando sea po-sible agregar otros medios para cultivar las muestras.Mtodo de decontaminacinMedio(s) de cultivonecesariosRequerimientosEquipamiento centrifuga ycabina de seguridad biolgicaPresupuestoKudoh Ogawa A base de huevos, acidifcados (Ogawa)Pueden serpreparados en ellaboratorio apartir de unafrmula simpleNo dependientesde insumosoequiposde una marcadeterminada--------------BajoPetroff modifcadoNALC- NaOHA base de huevos, neutros (Lwenstein-Jensen, Stonebrink, Ogawa)Adecuadoy con buen funcionamiento verifcado Bajo-intermedioA base de huevos,y agar o caldos enriquecidos Middlebrook 7H11,7H9)*Los medios deMiddlebrookpueden serpreparados en el laboratoriopartiendo de sufrmula compleja,o con basesdeshidratadas, y enriquecimientosy mezclas deantibiticos listospara agregarAdecuadoycon buen funcionamiento verifcadoIntermedio Los enriquecimientos de los medios yel NALCson los insumos de mayor costo Caldos con sensoresdel desarrollobacteriano(MGIT, MB/BacT).Pueden ser ledos visualmente o con equipos automatizadosProducidos por la industriaLos equiposgeneran dependencia de insumos de una marcadeterminada Adecuadoy con buen funcionamiento verifcadoAlto* El medio de Kirchner es un caldo con frmula mas simple y econmica pero es enriquecido con suero bovino estril que, en general, no est fcilmente disponible.23PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAMTODOS MS COSTOSOS Ciertas variaciones del mtodo de Petroff permiten re-cuperar ms bacilos y acelerar los resultados con un in-cremento de costos. Al considerar el estas alternativas es necesario analizar si se tienen asegurados: elprocesamientodiariodelasmuestrasalaspocashoras de recolectadas larevisin,almenossemanal,deloscultivosenme-dios slidos, y con mayor frecuencia de los caldos y medios con agar en incubacin elinformeinmediatoderesultadosdecultivospositivos latransmisininmediatadelosresultadosalcentrode salud/mdico que atiende el paciente la utilizacin oportuna del resultadodel cultivo porparte del mdicono es razonable encarecer los servicios de laboratorio si antes no estn aseguradas las condiciones para que el mayor costoresulte en una optimizacin del manejo de los casos de tuberculosisAseguradas estas condiciones, conviene priorizar la in-troduccindetcnicasmscarasenlaboratorioscon demostradacalidadenelcultivoconvencionalyque concentreneldiagnsticodecasoscrticosdetuber-culosis (infantil, extrapulmonar, asociada a infeccin por HIV, multirresistente). En estos laboratorios, a la vez, es posible seleccionar para procesar por las tcnicas ms costosas slo las muestras de pacientes que requieren prioritariamenterapidezenlaobtencindelresultado del cultivo, y mantener los procedimientos convenciona-les para el resto de las muestras Empleo de medios sintticosCuandoesposiblecontarconrecursosadicionalesa los necesarios para la implementacin de la tcnica de Petroff,peroansoninsufcientesparamanteneren funcionamientoalgnequipodelecturaautomatizada de cultivos, se puede considerar la posibilidad de adop-tar el procedimiento de homogenizacin/decontamina-cindelasmuestrasconNALC-NAOHyelagregado demediossemisintticosenriquecidos,ademsdelos mediosabasedehuevos,parasembrarlasmuestras. Estos medios favorecen el desarrollo de contaminantes, porlotantonosonrecomendablessinoseprocesan lasmuestrassindemorasdespusderecolectadas. Los medios lquidos son benefciosos para el desarrollo delbacilosperoesnecesariotenerencuentaque,si sonutilizados,sernecesariocontrolarmedianteexa-men microscpico todo tubo o botella donde se detecte desarrollo, y eventualmente subcultivarlos para obtener aislamientos puros. Esto implica mayor carga de trabajo y, por ende, necesidad de recursos humanos adiciona-les. Por otra parte, la manipulacin de cultivos positivos obtenidosencaldosincrementaelriesgodegenerar aerosolesinfecciososenellaboratorioydetransferir bacilos de un cultivo a otro, generando falso resultados positivos, de manera que deben ser utilizados por per-sonal muy entrenado.Para reducir el costo de cultivo utilizando medios sint-ticosesposibleutilizarmedioMiddlebrook7H11 enuna capa delgada, dentro de placas de Petri pequeas. Estas placaspuedenserexaminadasdosvecesporsemana con aumento de 100x o 400x bajo la lente de un micros-copio. As es posible reducir al menos a la mitad el tiem-poparaidentifcaruncultivopositivo,conrelacinalo que se demora con medios a base de huevos Se alcanza entonces la celeridad de la lectura automatizada de cul-tivos. Pero el examen de placas demanda mucho tiempo, sobre todo si se aplica para investigar un alto nmero de muestras. Es una alternativa que merece ser considerada parainvestigarenformaselectivaciertasmuestras,en especial extrapulmonares, y de pacientes crticosSistemas para la lectura automatizada de cultivosPermiten cuantifcar la disminucin de O2 o el aumento deCO2queocurreenunabotellaotuboconmedio liquido cuando se est reproduciendo una bacteria. Son estufas de cultivo con sensores (colorimtricos, fuoro-24MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISmtricos, o baromtricos) capaces de detectar y eviden-ciar cambios de presin de estos gases, conectados a unacomputadoraparaidentifcarlasealdelcultivo positivo y el registro y anlisis de los resultados. Los de usomsdifundidoenLatinoamricasonelBACTEC yelMBBact.ElequipoBACTEC460queutilizame-dios de cultivo con una fuente de carbono marcada ra-diactivamentehasidodemuchautilidadpero,porlos inconvenientes que origina el empleo de material radio-activo,laindustrialohareemplazadoporelBACTEC MGIT 960. Este ltimo utiliza el medio de cultivo MGIT (MycobacterialGrowthIndicadortube)quetambin puedeserinspeccionadosinequipos,utilizandouna lmpara UV para ver la fuorescencia que indica el de-sarrollo de un germen.Estossistemasaplicanunmtododeprocesamiento y siembra de muestras muy similar al convencional, de manera que no disminuyen el trabajo previo a la siem-bra. Pero s simplifcan el control de los cultivos en incu-bacin y acelerar la deteccin de los cultivos positivos. Son especialmente recomendables cuando se procesa un alto nmero de muestras. En el momento de seleccionar un equipo es importante conocer cules han sido aceptados por las normas de OMS para evaluar la resistencia a drogas antituberculo-sas para que, adems, puedan ser utilizados para acele-rar signifcativamente las pruebas de sensibilidad.El incremento de costo por muestra analizada que ori-ginan estos sistemas, en relacin con el de los mtodos convencionales, es variable pero siempre signifcativo. Esmayorparaloslaboratorioshabituadosapreparar suspropiosmediosdecultivoabasedehuevos,los que procesan un bajo nmero de muestras y que por lotantodebencomprarpocasbotellasotuboscon medio,losqueestnalejadosdelascapitalesdelos pasesylosqueestnenpasesconaltosaranceles deimportacin.Lasempresasqueproveenlosequi-pos de lectura automatizada normalmente los ofrecen sinqueseanecesarioadquirirlos,siellaboratoriose obligaacomprarunacantidaddebotellasotubos. Estaopcinespocoviableenlaboratoriosconbajo nmero de muestras para procesar. Se han registrado problemas de comercializacin de los viales con medio de cultivo y en la asistencia tcnica de los equipos en plazas que no son atractivas porque slo tienen uno o unos pocos equipos funcionando.La decisin de incorporar estos sistemas automatizados delecturadecultivosdebesertomadaenelcontexto de un plan de refuerzo de la capacidad de los laborato-rios de la red, en especial para mejorar el manejo de ca-sos de tuberculosis entre pacientes infectados por HiV ydetuberculosismultirresistente.Paraqueelesfuer-zo y gasto inicial que implica la incorporacin de estos equipos no sea infructuosa, debe mediar el compromiso de las autoridades del Ministerio de Salud de asegurar el presupuesto necesario en forma sostenida y regular. Debera adems mediar un compromiso frmado por el proveedor para mantenerelpreciodereactivosymediosaunnivelaceptable para el pas garantizar adecuadas condiciones de transportedelosreactivosymediosdecultivoylaentrega de estos insumos con vencimiento posterior a los 6 meses proveer manuales detallados en castellano, entre-namiento inicial y soporte tcnico permanente para la operacin del sistema garantizar servicio tcnico y repuestos inmediatoscuando sean necesarias las reparaciones asegurarasistenciacomercialgileininterrumpidaLosequiposdebenserincorporadospreferentemen-teenlaboratoriosqueconcentreneldiagnosticode casoscomplicados,quetengancalidadybioseguri-dadgarantizadas,personalsufcienteymuyentrena-do, fuente de electricidad ininterrumpida, temperatura ambiental controlada no superior a los 28 C, espacio sufcienteparaalbergarlosequipos,yagilidadenlos mecanismos de compras. 25UBICACIN DE LAS TAREAS Y DE LOS EqUIPOS FLUjO DEL MATERIALComo fue explicado en la primera parte de este Manual, la exposicin a las pequeas gotas emitidas con la tos de los pacientes bacilferos es lo primero que se debe evi-tar. Los pacientes deben ser atendidos, en forma gil y rpida, fuera del laboratorio, en un rea o local particularmente dedicado a esta tarea, con renovacin permanen-te del aire. Si los sistemas de renovacin del aire que se instalen en el laboratorio toman aire de la sala de espera, se estar incrementando el riesgo del personal del laboratorio en vez de disminuirlo En lo que se refere a las tareas internas del laboratorio, por sobre todas las cosas es necesario agrupar tareas segn el nivel de riesgo encontrar la mejor ubicacin posible para cada categora de tareas en el espacio disponible establecer una organizacin que asegure una ruta lgica, sin obstrucciones y segura del material ms peligrosoLas tareas de muy bajo riesgo biolgico deben ser apartadas para no exponer innecesariamen-te al personal que las realiza y cuidar el ambiente. Las tareas con distinto nivel de riesgo deben ser ubicadas convenientemente para que se direc-cione el material (potencialmente) infeccioso desde un rea de riesgo mediano a otra de mayor riesgo. Esta ltima rea debe estar muy bien separada, y all se intensifcar la extraccin de aire, los cuidados en el trabajo cotidiano, las medidas de contencin del riesgo y de contingen-cia para accidentes. TAREAS DE MUY BAjO RIESGO administracin del laboratorio, preparacin y almacenamiento de materiales, reactivos, medios de cultivo lavado y reciclado de material de vidrio previamente autoclavadoPueden ser situadas y organizadas con fexibilidad, segn sea ms conveniente en el espacio que se disponga. Deben ser ubicadas en reas limpias donde no ingresan pacientes, ni mues-tras, ni cultivos positivos, ni elementos utilizados en el rea de procesamiento de muestras sin queanteshayansidoesterilizados.Puedenestarcentralizadasporunidadesqueasistanno slo al diagnstico de tuberculosis sino a varios servicios del laboratorio26MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISEn el rea de lavado y reciclado de material de vidrio se requiere una pileta/lavabo amplio, una mesada tambin amplia, un autoclave y una estufa (preferentemente de esterilizacin)En el rea de preparacin de medios de cultivo y reacti-vos se requiere una mesada, una balanza, un pHmetro, unaestufaocoaguladoryunrefrigeradorconcapaci-dadsufcienteparaalmacenarlosmediosyreactivos quenecesitansermantenidosatemperaturacercana a los 4 CEl lavado y reciclado de material y la preparacin de me-diosyreactivospuedenserubicadosenunmismola-boratorio si es necesario y el espacio es sufciente para albergar ambas actividadesTAREAS DE RIESGO MEDIANO ingresodemuestras examenmicroscpicodelosextendidosSedebeseleccionarparaestasreasmesas,sillas,ar-marios,estantesymobiliarioquepuedanserdeconta-minados con solucin de hipoclorito de sodio. Si solo se disponedemobiliariodemadera,esnecesariopintarlo con pintura impermeable que resista la accin de decon-taminantes.Parapermitirlalimpiezaydesinfeccin,se debe dejar espacio alrededor de muebles y equipos y no se debe almacenar material directamente sobre el pisoEsnecesariaunamesapararecibirlasmuestrasyun armario con buena capacidad para guardar libros y car-petas. En este cuarto se controlan los envases, se veri-fca la consistencia de la identifcacin de los envases con la de las solicitudes, se ingresa la informacin en el registrodellaboratorioysearchivansolicitudesyfor-mularios recibidos con las muestrasEn otra mesa pueden ser ubicados el/los microscopio/s paraqueelpersonalnoestexpuestoenelreade mayor riesgo mientras lee los frotis.Por este sector tambin ingresa el material de vidrio re-ciclado, medios de cultivo y reactivos necesarios para el procesamiento de muestras. Alavez,estareapuedefuncionarcomoantecmara dellaboratoriodeprocesamientodemuestrasyaisla-mientos, si no es posible contar con un pequeo cuarto con doble puerta, ubicado antes del laboratorio de ma-yor riesgo. La antecmara contribuye a mantener la pre-sinnegativadentrodellaboratoriodeprocesamiento de muestras y aislamientos, y modera los movimientos de aire en el momento de ingreso/egreso del personal TAREAS DE MAYOR RIESGO procesamientodemuestrasydeaislamientosde M tuberculosis esterilizacindelmaterial(potencialmente)in-feccioso Para las reas dedicadas a estas tareas tambin se re-quiere mobiliario e instalaciones que puedan ser decon-taminados con solucin de hipoclorito de sodio.EL LABORATORIO DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y AISLAMIENTOSContiguo al rea de ingreso de material, y preferentemente antecedido por una antecmara, debe estar el laboratorio dondesernprocesadaslasmuestras.Esunlaboratorio de acceso restringido al personal tcnico y profesional del laboratorio. Los requerimientos mnimos son: murosntegrosdesdeelpisohastaeltecho,dema-nera que el aire no salga de este laboratorio cuando su puerta est cerrada. puerta(s)yventanasconcierrehermticoparaevi-tarfltracionesdeaireybrindarseguridadcontra actos de vandalismo. es conveniente un panel de vidrio en puerta quepermita visin desde afuera del laboratorio. superfciesdepisos,paredes,techoymesadasdematerialnoporoso,lisasyselladas,cubiertoscon materialesypinturasqueresistaneltratamiento con solucin de hipoclorito de sodio y eventualmen-te con fenol al 5%. fcilaccesoalreadedecontaminacindemateriales. muybuenailuminacin.27PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICA aguacorriente,gasyelectricidad una pileta/lavabo para hacer coloraciones y otrapara el lavado de manos (preferentemente ubicada cerca de la salida del laboratorio). dos mesas/ mesadas (una para la preparacin defrotis y otra para la lectura de cultivos). espacio sufciente para ubicar una centrifuga, unaestufa de incubacin un refrigerador amplio (prefe-rentemente dos, uno para material limpio y otro para muestras y aislamientos) y una cabina de seguridad biolgica. unsistemadeextraccindeaire acondicionadordelatemperaturasielclimaesmuycalido o muy fro y genera incomodidad en el perso-nal, que no genere movimiento de aire Se debe impedir que funcionen en este laboratorio sis-temas de recirculacin/calefaccin/refrigeracin de aire que intercambien aire entre distintas reas de la unidad de salud, y que generen movimientos de aire sobre la mesa de trabajo. Si existen bocas de estos sistemas dentro del laboratorio, deben ser anuladas y selladas. Tampoco los extractores deben generar movimientos de aire directa-mente sobre la mesada de trabajo. Al elegir el sistema de extraccin de aire se debe considerar que debe renovar el aire al menos 6 veces por hora. Cada extractor debe ser ubicado lo ms alto posible, en la pared opuesta a la puerta de ingreso, y deben expulsar el aire hacia un rea abierta,notransitada,lejosdeedifciosocupadosyto-mas de aire. De esta manera se logra barrer el aire, desde las reas de menor riesgo hacia las de mayor riesgo, para luegoexpulsarlohaciaelexteriordondelosaerosoles quedandiluidosenelespacioabiertoysometidosala actividad esterilizante de los rayos solares. Las cuidado-sasprcticasdetrabajoquedebenserimplementadas en esta rea minimizan la posibilidad de crear aerosoles y expulsar bacilos con el aire del laboratorio. En conse-cuencia, el aire no queda estancado dentro del laborato-rio, no se acumulan aerosoles en varios das de trabajo y, no regresa el aire del laboratorio a reas de la unidad de salud donde circula el resto del personal. Se crea presin negativa dentro del laboratorio. Existen sistemas para ve-rifcarvisualmentelapresinnegativa.Unmtodomuy simple consiste en suspender en la puerta de ingreso un pauelo de papel, pequeo y muy liviano, y verifcar que muevahaciaelinteriordellaboratorioimpulsadoporel movimiento del aire. La cabina de seguridad biolgica fltra y retiene a los ba-cilos que pueden quedar suspendidos en las operacio-nes de mayor riesgo. Es necesario impulsar un proceso paraqueloslaboratoriosdelaredquehacencultivo estnequipadosconestetipodecabinasduranteel cual,lgicamente,sedebepriorizaraloslaboratorios con mayor nivel de riesgo que son los que tienen alguna de las siguientes tres caractersticas: procesanconfrecuenciamuestrasconbaciloscopiapositiva utilizando centrifugacin obtienen en promedio ms de 5 cultivos positivospor mes abren cultivos positivos para su identifcacin oprueba de sensibilidadLa integridad del fujo de aire en la cabina de biosegu-ridadpuedeserperturbadaporcualquiercorrientede airequegenerenlosmovimientosdepersonas,venta-nas abiertas, apertura y cierre de puertas. Por esta ra-zn debe estar ubicada en un lugar donde la circulacin depersonalsealaindispensableylejosdepuertasy ventanasqueseabran.Convienedejarunespaciode unos 30 cm libres alrededor del equipo para poder ac-ceder durante las tareas de control y mantenimiento.Cuandoseutilizancabinasdeseguridadbiolgica,no es indispensable tener un sistema de extraccin de aire, aunque lgicamente es conveniente. La extraccin pue-de ser realizada por la misma cabina mientras est en funcionamiento,expulsandoelaireatravsdelducto hacia el exterior. El tcnico que la instale debe asegu-rarquenohayarecirculacindeairehaciaelinterior dellaboratorioporesteducto.Lapresinnegativase interrumpe al apagar la cabina, por lo que es necesario dejarlaenfuncionamientodurantetodaslashorasde trabajo si es el nico sistema de extraccin de aire.Las centrfugas de mesa deben ser estar a una altura cmodaparaquepuedaverseelrotoryparaoperar sin difcultad.28MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISSi hay espacio sufciente y es posible contar con labora-torios separados o compartimentos creados con divisio-nes que no permitan la circulacin de aire entre distintas zonas de trabajo, es conveniente ubicar la coloracin de frotis en uno, la cabina de seguridad biolgica dentro de otrocompartimiento,ylacentrifugaenuntercero.De esta forma, si se produce algn accidente en la cabina o en la centrifuga, es posible cerrar el laboratorio o com-partimientoycontenerallelriesgohastasolucionar elproblema.Elaislamientodelacabinadeseguridad biolgica tambin es conveniente cuando es necesario decontaminarla con vapores txicos, por ejemplo previo a un cambio de fltros Lostubosconluzultravioletasoneconmicosytiles para completar la desinfeccin de superfcies cercanas. Lascabinasdeseguridadbiolgicatienenuntubode UV.Tambinpuedensercolocadossobreotrasmesa-das de trabajo, sobre el rea donde se deja la ropa de trabajo, sobre la centrifuga. El personal debe protegerse con batas de uso exclusi-voparaestarea,quesepondralingresarydeber sacarse al terminar sus tareas y salir. Es necesario en-tonces organizar un rea con percheros y estantes para ordenar la ropa de trabajo en la antecmara, separando la ropa limpia de la utilizada.REA DE ESTERILIZACIN DE MATERIAL CONTAMINADOAquseubicanel/losautoclavesutilizadosparade-contaminarmuestrasy,sobrenadantesquedebenser desechados, y el material de vidrio utilizado con mate-rial (potencialmente) infeccioso que debe ser reciclado (tubos, pipetas). Debe ser fcilmente accesible desde el laboratorio de procesamientodemuestras,demaneraquenosea necesariotransportarelmaterialcontaminadogran-des distancias o a travs de escaleras/ascensores Lo ideal es que est en un cuarto contiguo al laboratorio deprocesamientodemuestras,comunicadoporuna puerta distinta a la de ingreso de muestras y material. As las muestras y el material que debe ser reciclado siguenelsiguienterecorridoenunanicadireccin: readeingreso,readeprocesamiento,readede-contaminacin. Luegodeesterilizado,seprocedealdescartedelma-terialdesechable,siguiendolasnormasoperativasdel servicio de salud. Como el material fue autoclavado ya no genera riesgo biolgico El material de vidrio reciclable puede ser trasladado, luegodeesterilizadoyyasinriesgo,alreadela-vado-preparacin-esterilizacinlaque,idealmente, estar ubicada en forma contigua a la de decontami-nacin de materialEnelAnexoIIsepresentaelequipamientoymaterial mnimonecesarioenunlaboratorioquerealizacultivo para tuberculosisESCALAMIENTO DE LA BIOSEGURIDAD EN LAS INSTALACIONES DE LABORATORIOS DE REFERENCIA CON ALTO RIESGO BIOLGICOPara laboratorios de referencia que concentran la identi-fcacinypruebasdesensibilidadparatodalared,que investigan un alto nmero de aislamientos de M. tubercu-losis, en particular los que son resistentes a las drogas an-tituberculosas, es pertinente considerar mayores medidas de bioseguridad, ciertamente ms costosas y dependien-tes de un servicio de mantenimiento especializado. Una medida de proteccin mayor del medio ambiente y de las personas ajenas al servicio consiste en que el aire sea esterilizado antes de ser expulsado hacia el exterior. Selogramediantelainstalacindefltrosdepartculas de gran efciencia HEPA (del ingles High effciency par-ticulate air) en la abertura por donde sale el aire. Estos fltros deben ser peridicamente controlados y reempla-zados.Estamedidaesrecomendable,aunconunnivel de riesgo mediano, cuando no es posible expulsar el aire del laboratorio a un espacio abierto. De esta forma el aire ser doblemente fltrado, primero por la cabina de seguri-dad biolgica y segundo por el fltro de salida al exterior.29PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAEjemplo de organizacin de reas de trabajo e instalaciones del laboratorio para el cultivo de Mycobacterium tuberculosisCerramientos que pueden, eventualmente, ser desmontados para el ingreso de equipos de gran tamao30MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISEl acceso a la antecmara y luego al laboratorio de mayor riesgo mediante puertas que cierran solas y hermticamente facilita la contencin del riesgo cuando circula el personalOtra medida para extremar la contencin del riesgo ex-clusivamenteenellaboratoriodeprocesamientodelos aislamientos,consisteenlainstalacindeunautoclave en el mismo laboratorio, de doble puerta, en posicin ho-rizontalatravesandounmurodellaboratorio.Unapuer-ta de esta autoclave se abre desde el laboratorio donde se procesan muestras y por all se introduce el material contaminado. Una vez esterilizado, el material es extrado abriendo la segunda puerta en el otro extremo de la auto-clave, por fuera del laboratorio, idealmente en el rea de lavado y reciclado de material de vidrio. Si no es posible, puedeestarenunpasilloexteriorallaboratoriodesde donde se trasladar el material al rea de lavado y reci-clado. As es posible asegurar que no salga ningn mate-rial del rea de mayor riesgo sin previa esterilizacin.Esrecomendableconsiderarestasposibilidades cadavezquesepienseenlasinstalacionesdeunla-boratorionuevooenmejorarlasinstalacionesdeun laboratorio existente. AlgunoslaboratoriosdeLatinoamricaconmuy alto riesgo biolgico han encarado la instalacin de la-boratoriosypracticasdelnivelBL2+oBSL3queno son consideradas en especial en este Manual.31TOMA, RECEPCIN, CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRASLasnormasconcernientesabioseguridad,envases,momentoyformadere-coleccinynmerodemuestrasarecolectarsegnlalocalizacindela lesin, han sido descritas en la primera parte de este Manual dedicado a la baciloscopia. Son vlidas todas las recomendaciones all detalladas para facilitar y agilizar la recepcin de muestras, para preservarlas, asegurar su correcta identifcacin, registro en el libro del labora-torio y la bioseguridad durante su manipulacin y transporte. En particular, es preciso tener presente que para el cultivo es fundamental observar las siguien-tes recomendaciones Procesar las muestras con la menor demora posible. Lo ideal es procesar las mues-tras de contenido gstrico y las extrapulmonares dentro de las cuatro horas siguientes a larecoleccin.Paralograrloesnecesarioestablecerunaorganizacinconjuntaentreel personal del laboratorio y el equipo mdico que toma las muestras.Preservar las muestras de la luz solar, desecacin y el calor. Mantenerlas refrigeradas a 4 C hasta el momento de su procesamiento si inevitablemente debe transcurrir ms de 24 horas desde la recoleccin hasta la siembra. Cuando la muestra de esputo debe ser transportada y queda inevitablemente expuestaa temperatura ambiente durante ms de 48 horas despus de recolectada, agregar igual volumen de cloruro o bromuro de cetilpiridinio 1% disuelto en una solucin de cloruro de sodio al 2%. Estos reactivos homogeneizan el mucus y restos orgnicos ydecontaminanlamuestraduranteeltransporte.Enestecaso,lamuestranodebeser refrigerada porque estos decontaminantes cristalizan a baja temperatura y, una vez cristali-zados, no protegen e inhiben el desarrollo del bacilo de la tuberculosis. Se ha descrito que estas soluciones pueden inhibir el desarrollo del bacilo en medios lquidos y por eso se ha recomendado no utilizarlos cuando se emplean estos caldos. Nuncaagregaralasmuestrasfenol, formol o solucin de formaldehido. Algunos anes-tsicostienenactividadantimicrobianayporlotantotambindebenserevitados.Esto puedeserdesconocidoporelequipomdicoquetomabiopsiasysigueprocedimientos indicadosparaestudioshistopatolgicos,inadecuadosparaelcultivodemicobacteriasy tambin de otros microorganismos. 33TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EL CULTIVO DE MUESTRASPROCESAMIENTO DE MUESTRASENTRENAMIENTO DEL PERSONALEl personal que procese muestras debe estar entrenado en riesgos,formadetransmisindelatuberculosis higiene usoderopadeproteccin manejodematerial(potencialmente)infeccioso operacionesparaevitarlaformacindeaerosoles organizacindellaboratorio,fujodematerialydelaire operacionesarealizarenelcasodeaccidentes operacinymantenimientodelosequiposdelaboratorio buenaspracticasdelaboratorio operacionesenesterilidad importanciadelosresultadosparaelmanejodecasos importanciadelosresultadosparaelProgramadeControldeTuberculosisORGANIZACIN DEL MATERIAL Es necesario sistematizar el trabajo para minimizarelriesgobiolgicoydetransferenciadebacilosentredistintosmateriales evitarconfusiones poderrastrearlosprocedimientosenelcasoenquesepresentedudassobrelosresultados Repetir los procedimientos siempre el mismo orden en cada da de trabajo. Ordenar losenvasesdelasmuestras,tubosyportaobjetossegnsunumeracin.Mantenertodoel material ordenado durante todo el proceso. Separarlasmuestrasdelospacientesqueseconocetienenbaciloscopiapositivalos laboratorios que no tienen cabina de seguridad biolgica no deben procesar con centrifugacin muestras con baciloscopia positiva, para minimizar el riesgo bio-lgico.Estasmuestrassongeneralmenteinvestigadasparaidentifcarelbaciloobserva-do en el examen microscpico y/o conocer su sensibilidad a drogas antituberculosas. En 34MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIStal caso es conveniente derivar directamente la muestra al laboratorio de referencia para que allserealicenestosestudios.Estoposibilita,ala vez, que la muestra sea sembrada directamente en medios con antibiticos para acelerar la prueba de sensibilidad.Sinoesposiblerealizarestaderiva-cin,cuandoserecibelamuestrasepuedeoptar por procesarla por un mtodo que no utilice centri-fugacin como el de Ogawa Kudoh, y derivar el tubo de medio de cultivo inoculado tan pronto como sea posible al laboratorio de referencia.Loslaboratoriosconcabinadeseguridadtambin debensepararyprocesaralfnallasmuestrasde lospacientesqueseconocensonbacilferospara disminuir el riesgo de contaminacin cruzada.La siguiente es una gua para ordenar las muestras y el material a utilizara)Ordenartodaslasmuestrasqueserncultivadas segn su nmero.b)Identifcar y separar para derivar o para procesar al fnal las muestras de pacientes bacilferos.c)Numerar para cada muestra un tubo de centrfuga de15ml,deplstico,graduado,confondocnico, preferentementeestril.Puedesernecesarioms de un tubo en el caso de orinas y contenidos gstri-cos. Si la centrfuga lo permite, es conveniente cen-trifugarlasmuestrasdemuchovolumenentubos de 50 ml, tambin plsticos, graduados, con fondo cnico. No es necesario un tubo de centrfuga para muestrasdetejidonormalmenteestrilesytoma-das con asepsia.d)Por cada muestra, numerar un tubo con cada medio de cultivo a utilizar. Incluir al menos dos tubos con medios a base de huevo, preferentemente uno con medio Lwenstein Jensen y otro con Stonebrink u Ogawa.Aestosmediosbsicospuedenagregar-semediosconagarycaldos,especialmentepara muestras extrapulmonares y de nios, si los recur-sos disponibles lo permiten. En el caso de utilizar el mtodo de Ogawa, preparar dos tubos con el medio acidifcado por cada muestra e)Organizar una gradilla con los tubos de cada serie de muestras que pueda ser procesada de una vez, considerandolacapacidaddelacentrfuga,yotra con las muestras de pacientes bacilferos, si es que van a ser procesadas en el laboratorio.f)Ubicarencadacolumnadelagradillaelmaterial correspondiente a una muestra, delante el tubos de centrifuga y detrs los tubos con medio de cultivo. Ordenar el material correspondiente a cada mues-tra, de izquierda a derecha, segn la numeracin g)Prepararynumerarunportaobjetosparacada muestra segn fuera detallado en la primera parte deesteManual.Ordenarlosportaobjetosenuna bandejasegnsunumeracin.Mantenerlospor-taobjetosseparadosunodelotroalmenospor1 cm.dedistanciadurantetodoelproceso,incluso durante la tincinh)Lavarse las manos. Colocarse guantes desechables i)Ubicar dentro de la cabina de seguridad todo el ma-terial necesario. Conviene tener una lista escrita de este material para no olvidar ningn elementolos envases con las muestras ordenados segn su numeracinla(s)gradilla(s)conteniendolostubosdecen-trfuga y los medios de cultivo ordenados labandejaconteniendolosportaobjetosorde-nadosuna gradilla vaca para trasladar los tubos hasta la centrfugaalgunostubosdecentrifugaadicionalespara eventualidadesunmorteroestril,untubocontapaarosca conteniendo arena estril por cada muestra de tejido recibidaunapinzaestrilporcadamuestradetejidoe hisopado recibidoun agitador tipo vortex un frasco o tubo conteniendo 50 ml de solucin decontaminante (NaOH 4%) por cada serie de muestras a procesar, y uno adicional por si fue-ran insufcientes una botella conteniendo 200 ml de buffer fos-fato pH 6,8 estril por cada serie de muestras aprocesar,yunoadicionalparanecesidades eventuales35PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICAuna propipeta o pipetas desechables con bulbo pipetas estriles (una de 1 2 ml, una de 5 ml y una de 10 ml por cada muestra recibida) En elcasodeutilizarfrascosdispensadorespara distribuirlasolucindecontaminanteybuffer las pipetas de 10 ml no son necesariasunoodosrecipientesdepolipropileno,vidrio oaceroinoxidable,autoclavables,conteniendo hipoclorito1%,concapacidadsufcientepara contenerlossobrenadantesquesedescartan en un da de trabajo. Elegir recipientes que mi-nimicen el riesgo de salpicaduras, que puedan ser tapados cada vez que sean utilizados, y ce-rrados hermticamente para ser trasladados al autoclave al fnalizar el da de trabajo un recipiente de polipropileno o acero inoxidable concapacidadadecuadaparacontenerlaspi-petas que se utilizan, conteniendo hipoclorito de sodio1%.Elrecipientedebepodersercerrado hermticamente para ser trasladado al autoclavealgodn o pauelos de papel, un frasco cerrado con hipoclorito 1% para limpiar bocas o paredes delostubosencasonecesarioyotrofrasco cerradoconfenol5%paralimpiareventuales derrames o salpicaduras de mayor magnitudunabolsadesechableyautoclavable,conca-pacidad sufciente para descartar los tubos de centrfuga de plstico que se utilizan en un da de trabajo j)Ubicar cerca de la cabina un recipiente de polipropi-leno o acero inoxidable con tapa, para el autoclavado del material que ser desechado. Debe tener capaci-dad sufciente para contener los tubos de centrifuga quesedescartendentrodelabolsa,lospapelesy algodn que eventualmente fueran utilizados k)Ubicarcercadelacabinaodelamesadadetra-bajounsegundorecipientedepolipropilenoo aceroinoxidablecontapa,paraelautoclavadodel material que ser reciclado. Debe tener capacidad sufciente para contener el recipiente con sobrena-dantes hermticamente cerrado, pinzas, morteros, y elementos accidentalmente salpicados con material potencialmente patgeno (algn tubo de ensayo de vidrio, recipientes con decontaminante o buffer). l)Manteneralladodelacentrifugatubosdecentri-fuga del mismo tipo de los utilizados para procesar las muestras, en un numero igual a la mitad de los portatubosquetieneelrotorenuso,yunfrasco dispensadorconaguadestiladaoetanol70para equilibrar los tubos impares m)Ubicar en la mesada de trabajo la(s) bandeja(s), de aceroinoxidableodeotromaterialquepuedaser desinfectadoconhipocloritodesodioy,eventual-mente autoclavado, con una varilla de vidrio u otro elemento similar que permita inclinar los tubos sem-brados, elevndolos unos 15 en su parte superior.n)Ubicar cerca del mechero y de la pileta dedicada a lacoloracintodosloselementosnecesariospara la fjacin y tincin de los frotis, segn lo detallado enlaprimerapartedeesteManualdedicadoala baciloscopia. Todos los procedimientos que siguen, hasta fnalizar la siembradelasmuestras,debenserrealizadosdentro de la cabina de seguridad biolgica con las siguientes precauciones ObservartodaslasnormasdetalladasenlosAnexosIsobrebioseguridaddelaprimerapartedeeste Manual dedicada a la baciloscopia y en esta parte dedicada al cultivo. Encenderlacabinadeseguridadbiolgica,permitirqueseestablezcaelfujolaminardeaireyevitar alterarlo.PREPARACIN DE LAS MUESTRASSerecomiendaprocesarlatotalidaddecadamuestra paranoperdermaterialquepuedecontenerbacilos. Esconvenienteadems,procesarporseparadocada muestra del mismo paciente, sin mezclarlas. Esto incre-mentalaposibilidadderecuperarbacilos,enespecial en el caso en que alguna de las muestras se contamine. Alavezpermiteverifcarsisereiteraelaislamientoa partirdedistintasmuestrasdelpacienteyasresolver dudasqueocasionalmentesepuedenpresentarenel diagnstico de tuberculosis o discernir si se est frente a un caso de micobacteriosis36MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISSe aplican distintos procedimientos antes de la siembra se-gn la consistencia, volumen y contaminacin de la mues-tra. El tipo de muestra predominante ser seguramente el esputo producido por expectoracin espontnea. Recuperacin de material tomado por hisopado Abrir el tubo de centrfuga identifcado con el n-merocorrespondientealamuestra,colocarenl, conunapipetaestril,aguadestiladaencantidad sufciente para sumergir todo el algodn del hisopo (normalmente 2 o 3 ml) Transferir el hisopo a este tubo de centrfuga.Moverlo suavemente tratando de que se desprenda el material en el agua. Quebrar el palillo de hisopo ensupartesuperiorparapodercerrareltubode centrifuga con su tapa. Tapar el tubo que original-mente tena el hisopo Agitarenvortex. Dejar el hisopo sumergido al me-nos15minutosparapermitirquesedesprendala mayor cantidad posible de material Destapareltuboyconunapinzaestril,tomarelpali-llo del hisopo, presionar el algodn sobre la pared del tubo para escurrirlo, retornar el hisopo dentro del tubo donde fue recibido y apartarlo para descartarlo al f-nalizar del procesamiento de las muestras Descartar la pinza en el recipiente destinado a descartar pipetas de vidrio, o dentro de una bolsa autoclavableProcedimientos previos a la siembraMuestras que contienen fora normalesputoDecontaminacin/ homogeneizacinhisopados Desprendimiento del material en agua destilada Decontaminacin.(es posible procesarlos por el mtodo de Kudoh )contenido gstricoorina sangre menstrual Centrifugacin si el volumen total es mayor a 4 mlDecontaminacin biopsia de intestinoDesintegracin en mortero Decontaminacinesputo tratado con bromuro o cloruro de cetilpiridinio 1%LavadoMuestras normalmente estriles, tomadas aspticamente alquidos tomados por puncin pleural, cefalorraqudeo, mdula sea, pericrdico, sinovial, articular, pus, sangreCentrifugacin si el volumen total es mayor a 1 mlbiopsia de tejidos pleural, ganglionar, genital, seo, etcDesintegracin en mortero a Cuando no se est seguro de la asepsia, se puede dividir la muestra en dos partes iguales. Decontaminar y sembrar una parte el da en que se recibe. Verifcar al da siguiente si se contamin el medio de cultivo. Si no se contamin, sembrar directamente la segunda parte. Si se contamin, decontaminar y sembrar la segunda parte. Alternativamente, se puede sembrar una mitad de la muestra directamente y la otra decontaminada, simultneamente en el da en que se recibeEsta recomendacin tambin es vlida para procesar sangre de pacientes muy inmunosuprimidos, por ejemplo los que estn en estadios avan-zados de SIDA, porque pueden estar afectados por varios grmenes oportunistas que pueden inutilizar el medio de cultivo utilizado para aislar el bacilo de la tuberculosis. 37PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICA Tapareltubodecentrfugayubicarloenlagradillaque contiene los tubos del material que ser decon-taminado, en el orden que le corresponde, para ser procesado por la tcnica de Petroff modifcada Ms adelante se describe el mtodo de Kudoh que tam-bin es adecuado para hisopadosConcentracin de muestras lquidas o semifuidasMuestras normalmente estriles con volumen menor a 1 ml Sembrar directamente y ensutotalidaddistri-buyndolasenlostubosconmediosdecultivo. Sembrar 0,5 ml por tubo con medio slido, para que pueda ser absorbida. Muestras normalmente no estriles de escaso volumen Ubicareltuboenelordenquelecorrespondeenlaserie de muestras que sern decontaminadas para que sea procesado mediante la tcnica de Petroff modifcadaMuestrasnormalmentenoestrilesdevolumenmayor a 4 ml Trasvasar el volumen total de cada muestra a unoo ms tubos de centrfuga volcando suavemente el contenido del envase dentro de los tubos. Centrifugar15minutosa3000g.Siseutilizantu-bos de 50 ml conteniendo ms de 15 ml de muestra, prolongar la centrifugacin hasta los 30 minutos Esperarquesedetengacompletamentelacentrfuga Retirar los tubos cuidando no resuspender el se-dimento, trasladarlos a la cabina. Dejar reposar los tubos 5 minutos antes de abrirlos Abrirelprimertubocentrifugado,descartarsuso-brenandanteenelrecipientededicadoaestefn conunmovimientosuave,sinsalpicar,sintocarla boca del frasco. Limpiar el exterior del tubo con un algodn pauelo de papel embebido en hipoclorito desodio1%,sisemojoeventualmentelapared. Cerrar la tapa del tubo. Procederdeigualformaconlossiguientestubos.Noabrir el siguiente tubo sin haber cerrado el anterior Agregar 1 ml de buffer pH 6.8 a cada sedimentodeorina,contenidogstrico,ysangremenstrual. Abrir los tubos de a uno y cerrarlos inmediatamente despus de agregado el buffer, no abrir el siguiente antesdehabercerradoelanterior.Conagitacin manualdisolverlossedimentos.Reunirenunsolo tubolossedimentoscorrespondientesaunani-ca muestra, trasvasando el contenido de los tubos suavemente,sinsalpicar.Agregarlostubosenla gradilla que contiene la serie de muestras que sern decontaminadas, y proceder a decontaminarlos en el orden que les corresponda segn su nmero Agitar el sedimento de las muestras normalmenteestriles (lquidos pleurales, cefalorraqudeos, sino-viales, articulares, sangre). Si es necesario, agregar unas gotas de buffer pH 6.8 para disolverlo en vo-lumen sufciente para inocular los tubos o botellas conmediosdecultivoutilizadosypararealizarel frotis para el examen microscpico. No dejar rema-nente en el tubo, sembrar todo el precipitado.Maceracin de muestras de tejido tomadas por biopsia Trasvasarlamuestrasuavementeaunmorteroes-trildeporcelanauotromaterialautoclavable,sin salpicar. Puede ser necesario el auxilio de una pin-za estril para realizar esta operacin. Descartar la pinza en el recipiente destinado a descartar pipetas de vidrio, o dentro de una bolsa autoclavable. Agregar1mldebufferpH6.8dentrodelmortero Disgregareltejidopresionandoconlamanodelmor-tero y homogeneizar el tejido. Si es resistente a este proceso,agregararenaestril,volcandolosgranos suavemente desde el tubo, y volver a disgregar. Sieltejidoesnormalmenteestrilyhasidotomadocon asepsia, recoger con una pipeta todo el mate-rialmacerado,distribuirloenlosmediosdecultivo identifcados con el nmero de la muestra, y prepa-rar el frotis en el portaobjetos identifcado con ese mismo nmero38MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIS Sieltejidocontienecontaminantes,recogerconuna pipeta todo el material macerado, transferirlo altubodecentrfugaidentifcadoconelnmero de la muestra que est siendo procesada, ubicar el tubo en el orden que le corresponde en la se-rie de muestras que sern decontaminadas para que sea procesado mediante la tcnica de Petroff modifcada Sisetratadeunmaterialnormalmenteestrilperose ignora si fue tomado y mantenido en esterilidad, utilizar la mitad del macerado para la siembra direc-ta y el resto para decontaminar. Ubicar el mortero dentro del papel o bolsa dondefuepreviamenteesterilizadoydescartarlodentro del recipiente destinado a autoclavar el material que se va a reciclarEliminacin de desinfectantes de muestras de esputoPara eliminar el bromuro o cloruro de cetilpiridinio de las muestras transportadas con estos conservantes Transferirlamuestraaltubodecentrfugaiden-tificado con el nmero correspondiente, volcan-do muy suavemente el contenido del envase, sin salpicar. Medirelvolumencontenidoeneltubodecentrfugaobservando la graduacin que tiene en su pared Agregareldobledevolumendebuffer.Siseope-rasolamentecontubosde15mlynoesposi-bleduplicarelvolumendentrodeuno,dividirla muestraendostubos,yduplicarelvolumenen cada uno de ellos Agitarlostubosenvortex Centrifugar15minutosa3000g Dejarreposar5minutoseltubocentrifugado Descartarelsobrenadante ResuspenderelprecipitadoenbufferpH6.8 Sembrar distribuyendo el precipitado en los tubosde medios de cultivo identifcados con el nmero de la muestra que se est procesando Prepararelfrotisenelportaobjetosidentifcadoconel mismo nmeroDigestin, decontaminacin y concentracin por el Mtodo de Petroff modifcado Verifcar que la primera serie de muestras a decontaminar no supere a la capacidad del rotor de la centrifuga. Tener en cuenta que el tiempo de contacto con el decontaminan-te no puede exceder en total los 30 minutos, de manera que normalmente no es posible procesar series de ms de 12muestrasOperarconserenidadymovimientossua-ves pero ininterrumpidamente para evitar que el tiempo de contacto con el decontaminante se prolongue Abrirelprimerenvaseconteniendounamuestradeesputo. Trasvasar todo su contenido en el tubo de centrifugaquelecorresponde,conunmovimiento muy suave y seguro, o transferirlo con una pipeta. Taparelenvaseyeltubodecentrfuga Proceder de la misma manera con las siguientesmuestras, de a una. No abrir un envase ni un tubo de centrifuga sin haber cerrado antes los anteriores Tomar la primera muestra transferida sin agregadodedecontaminante,verifcarsuvolumen,abrirel tubo,agregarNaOH4%hastaduplicarelvolumen del esputo guindose por la graduacin exterior del tubo. Cerrar el tubo. Proceder del mismo modo con el resto de las muestras de esputo, con los sedimentos de muestras previamente centrifugadas y macerados de tejidos que requieran decontaminacin Enelcasoenquelacapacidaddelacentrfugaseaun factor limitante, tratar de ubicar pares de mues-trasconvolumensimilar.AgregarNaOH2%ala muestradecadaparquetengamenorvolumen, hasta igualar el volumen de ambos tubos. Este pro-ceso permitir luego centrifugar el par de tubos con volumen igualado en posicin opuesta en el rotor y aprovechar mejor la capacidad de la centrfuga. Verifcarquetodoslostubosestncerradosherm-ticamente Agitar el primer tubo en vortexvigorosamente,y luego colocarlo en una gradilla vaca auxiliar Procederdeigualformaconlassiguientesmues-tras, manteniendo el orden de los tubos en la nue-va gradilla39PARTE II CULTIVO NORMAS Y GUA TCNICA Dejaractuareldecontaminante5minutos Enlossiguientes5minutoscompletarlosprocedi-mientos que siguen hasta poner en funcionamiento la centrfuga Trasladarlagradillaconteniendolostuboshastalacentrfuga Ubicar cada tubo dentro de un portatubos delrotor y balancear con un tubo con igual volumen enlaposicinopuesta.Sinoseencuentrados tubosconigualvolumen,ubicarenfrenteun tuboconelvolumennecesariodeaguadesti-ladaoetanol70Taparelrotorconlatapade bioseguridad Centrifugar15minutosa3000ga25-35C Dejarreposarlostubos5minutosluegodedeteni-da la centrfuga Abrir la tapa de la centrifuga. En caso de sos-pecharocomprobaralgnderramedentrodel contenedordetubos,autoclavarloconsutapa deseguridad.Delocontrario,retirarlomuycui-dadosamente, tratando de no resuspender el se-dimento, trasladarlo tapado, junto con la gradilla auxiliaralacabina,yalldestaparlo.Retirarlos tubos y ubicarlos en orden segn su numero en la gradilla auxiliar, con cuidado de no resuspen-der el sedimento Comprobarquelosprocedimientoshayansidorea-lizadosconagilidadsufcientecomoparaqueel tiempo total de contacto con el decontaminante no exceda los 30 minutos Abrirdeaunocadatubo,descartarsuavementeel sobrenadante dentro del recipiente destinado a este fn, sin salpicar ni mojar la parte exterior del tubo. Limpiar el exterior del tubo con un pauelo depapeloalgodnembebidoenhipoclorito1% si, eventualmente, se moja la pared. Descartar el pauelo o algodn dentro de la bolsa destinada a descartartubos.Dispensarbufferfosfatohasta completarlos15mlconunfrascodispensador oconunapipeta,sintocarlabocanipareddel tubo. Cerrar el tubo Procederdeigualformacontodoslostuboscentri-fugados. No abrir el siguiente tubo sin haber cerra-do previamente el anterior Comprobarelcierrehermticodelastapasdeto-dos los tubos manipulados Agitarvigorosamenteenvortex cada tubo y ubicar-los en el contenedor de la centrifu