tcc aula 3
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Técnicas de preservação de microrganismosTRANSCRIPT
Questões de revisão da aula anterior
1. Descreva sucintamente a evolução da classificação dos seres
vivos.
2. Refira as principais diferenças na parede e membrana celulares
entre o Domínio Bacteria e Domínio Archea.
3. Escolha 3 características para distinguir células que pertençam ao
reino Fungi e ao reino Protista.
4. No filo Ascomicota encontram-se fungos com reprodução
assexuada por esporulação e por gemulação. Explique as
diferenças e dê exemplos.
5. Os fungos têm um papel muito importante no desenvolvimento
sustentável de processos biotecnológicos. Comente, justifique e dê
exemplos.
6. Selecione uma espécie de fungo e descreva-o: filogenia,
morfologia, reprodução, nutrição, interesse, etc.
Condições de cultura
Requisitos nutricionais
Meios de Cultura
Temperatura
Necessidades gasosas
pH
Pressão osmótica
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Requisitos nutricionais
Os microrganismos necessitam de assegurar
as suas funções vitais: Produção de energia
Síntese de biomassa
NUTRIENTES
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Principais requisitos nutricionais
Água: 80-90% peso
Macronutrientes:
C, O, H, N, P, S,…
Micronutrientes:
Elementos mínimos
Mg, Co, Cu, Zn,…
Cofactores - enzimas
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Exigências suplementares
Factores de crescimento
Nutrientes acessórios, não podem ser
sintetizados na célula Aminoácidos, purinas, vitaminas
Necessários a microrganismos auxotróficos
(ex. Mutantes)
Microrganismos prototróficos - não requerem
factores de crescimento (maioria dos fungos)
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Fontes de Carbono
Heterotróficos
Carbono orgânico, principal fonte
Compostos utilizáveis depende do tipo de microrganismo
Autotróficos
CO2 – principal e exclusiva fonte de C
Conversão de CO2 em compostos orgânicos, processo reductor que requer energia.
Autotróficos facultativos
Ex. bactérias
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Classificação dos microrganismos de acordo com as
fontes de carbono e energia
Fonte de Carbono
CO2 Carbono orgânico
Fonte de Energia
LUZ
Composto inorgânico
Composto orgânico
FotoautotróficoAlgas, bactérias fotossintéticas
QuimiolitoautotróficoBactérias nitrificantes e
oxidantes de enxofre
QuimioorganoautotróficoBactérias metilotróficas autotróficas
FotoheterotróficoBactérias fotossintéticas,
Archea halófilas
QuimiolitoheterotróficoArchea metanotróficas
QuimiorganoheterotróficoFungos, protozoários,
Maioria das bactérias
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Meios de cultura
Permitem promover o crescimento das células,
in vitro
Incluem nutrientes indispensáveis sob forma
assimilável
Nutrientes presentes em quantidades não
tóxicas e não limitantes
O meio de cultura deve simular o mais possível
o meio de onde o microrganismo foi isolado
satisfazendo todos os requisitos nutricionais
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Meios de cultura Constituídos por uma base mineral suplementados por uma fonte de:
Carbono
Energia
Azoto
Factores de crescimento
Autotróficos
Heterotróficos Heterotróficos
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Tipos de Meios
Estado Físico
Líquido
Sólido
Semi-sólido
Composição química
Quimicamente definidos
Quimicamente complexos
Funcionalidade
Simples
Selectivos
Diferenciais
Enriquecidos
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Meios sólidos
Adição de agar – agente solidificante.
Polissacárido complexo, extraído de algas.
Soluções a 1-1.5 % fundem a 100 ºC e solidificam quando T<42 ºC.
Não é biodegradável, não perde poder solidificante.
Permitem um meio firme ao crescimento de colónias.
Relativa clareza permite visualização das colónias.
Muito útil para isolamento de microrganismos.
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Técnicas de isolamento em agar
12
Técnicas de isolamento em agar
Para microrganismos
anaeróbios
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Meios semi-sólidos
Consistência pouco firme
Agente solificante 0.3 a 0.5 % (agar)
Permite motilidade
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Composição química
Quimicamente definido
Composição química rigorosamente conhecida
Utiliza-se para microrganismos cujas exigências
nutricionais são claramente conhecidas
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Meios complexos
Não se conhece a composição exacta
Nutrientes complexos Extracto de carne
Extracto de levedura
Peptona
Leite
Extracto de solo
Substâncias complexas contendo:
Açucares, aminoácidos, vitaminas, sais,...
Aplica-se a uma gama alargada de microrganismos Factores de crescimento não conhecidos
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Tipos de Meios Exemplo: O meio LB (Luria-Bertani
broth) é utilizado para crescimento e
manutenção de bactérias.
Composição:
Triptona 10 g/L;
Extracto de levedura 5 g/L;
Cloreto de sódio 10 g/L.
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Constituintes dos meios complexos
Extractos: Tecidos eucariotas (levedura, bife, fígado, coração, plantas,
etc) são extraídos por fervura e depois concentrados e secos até à consistência de pasta ou pó. São fonte de amino ácidos, vitaminas, coenzimas...
Peptonas: Misturas complexas de componentes orgânicos e inorgânicos
obtidos por digestão de tecidos que contêm proteínas de animais, tais como musculo de bife, gelatina, caseína, cerais, etc... São productos comercializados em pó. As peptonas contêm principalmente peptidos e amino ácidos.
Ex: Triptona: resulta da digestão da caseína
Ex: Fitona: resulta da digestão de soja
Ex: Peptona: Resulta da digestão de musculo de bife. Peptona numa concentração de 0.1% é também usado como
diluente.
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Meios selectivos
Suprimem o crescimento de microrganismos
indesejáveis
Permitem isolamento de culturas puras ou
axénicas a partir de culturas mistas
Ex: sais biliares inibem crescimento de bactérias
Gram+
Outros agentes:
Antibióticos, ácidos, oxigénio, pH,...
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Exemplo: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) inibe o crescimento de muitas
bactérias, é selectivo para leveduras e fungos
Meios selectivos
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Meios diferenciais
Meios que não inibem o crescimento mas
permitem distinguir tipos de microrganismos
Diferenciação:
Cor e tamanho das colónias, cor do meio, etc
Ex: agar MacConkey usa-se para isolar
enterobactérias patogénicas; permite também
distinguir entre microrganismos que fermentam a
lactose.
Meio selectivo-diferencial
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Meios diferenciais
Staphylococcus (growth, yellow colonies) vs.
Streptococcus (growth, white colonies)
Exemplo: CNA (agar com sangue) permite diferenciar
Estafilococos de Estreptococos
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Meios diferenciais e selectivos
MSA: crescimento/fermentação
Exemplo: MSA permite
seleccionar o género
Estafilococos e diferenciar
entre fermentativos e não
fermentativos
Exemplo: MAC selectivo
para gram negativas e
diferencia entre
fermentativos e não
fermentativos
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Meios enriquecidos
Permitem o crescimento de uma espécie em
detrimento de outras
São muito nutritivos
Favorecem crescimento de microrganismos de
crescimento fastidioso
Ex: Strepcoccus pyogenes; Haemophillus influenza
Ex: meios de agar/sangue; agar/chocolate,...
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Exemplo: Agar Sangue Exemplo Agar chocolate
Meios enriquecidos
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Temperatura
O microrganismo apresenta a sua temperatura
óptima, mas também sobrevive a temperaturas
mais altas ou mais baixas. De acordo com a
temperatura, os microrganismos podem ser
classificadas em:
- psicrófilos: cresce abaixo de 15 ° C (latente);
- mesófilos: entre 20 - 40 ° C;
- termófilos: entre 45 - 55 ° C;
- estenotermófilos: entre 65 - 80 ° C.
Fungos: mesófilos (filamentosos (20 a 25oC) < leveduras (25 a 30 0C)
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Necessidades gasosas
De acordo com o a necessidade de oxigénio:
- aeróbios: crescem na presença de O2; Aeróbios estritos – dependem totalmente da respiração aeróbia
- anaeróbios: crescem na ausência de O2; Anaeróbios estritos- O2 é letal
Anaeróbios aerotolerantes- metabolismo exclusivamente anaeróbio, mas O2 não é letal
- anaeróbios facultativos: crescem tanto com ou sem O2;
- microaerófilos: crescem em concentração de O2 menor do que a do ar atmosférico (5% O2).
Fungos são em geral aeróbios e alguns são anaeróbios facultativos
Podem suportar altas concentrações de CO2 e baixas de O2
Exemplo: Penicillium roqueforti suporta dentro de queijo 80 % CO2 e 4% O2
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Necessidades gasosa
Anaerobiose ou microaerofilia
Jarro de anaerobiose
Catalisador: paládio
Indicator de anaerobiose
Pacote
gerador de
gás
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pH Microrganismos acidófilos – pH entre 1.0 e 5.5
Microrganismos alcalófilos – pH entre 8.5 e 11.5
Microrganismos neutrófilos – pH entre 5.5 e 8.0 Fungos preferem meios ácidos, pH 5-6 mas toleram uma ampla
gama de pH: 2,5 a 9,5
Bactérias preferem meios neutros
Substâncias tampão Adicionadas ao meio para manter o pH dentro da gama óptima de pH de
crescimento do microrganismo. Ex: fosfatos de potássio e sódio, e carbonato de cálcio. Impedem variações bruscas de pH resultantes da produção metabólica de ácidos e bases. Nota: Peptona – poder tamponante.
Indicadores de pH São adicionados ao meio para detectar alterações na concentração de H+
durante o crescimento de um microrganismo, como por exemplo para avaliar a fermentação de hidratos de carbono. Muito utilizados em meios diferenciais. Ex: Púrpura bromo-cresol, azul de bromo-tiomol e vermelho de fenol
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Pressão osmótica
Usam-se substâncias para manter o equilíbrio do meio, impedem que a célula se rompa (NaCl 0.5 % ou sacarose 0.1 %) .
Atividade da água, 0<aw<1 Em geral >0.98
Fungos são em geral xerófilos (amigo do seco); Conseguem
crescer em condições de aw< 0,84
Fungos filamentosos<leveduras<bactérias
Microrganismos halófilos Adaptados a concentrações de sal elevadas >0.2 M
5.5 M NaCl → aw = 0.75 → Archaebacteria
Microrganismos osmofílicos Adaptados a concentrações de açúcar elevadas ou elevado
índice de desidratação
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Meios de culturaFungos filamentosos
Meios de cultura ricos e complexos
Meio de agar com batata e dextrose – PDA (rico em açucar)
Meios ricos em açúcar favorecem crescimento vegetativo
Meios menos ricos em açúcar favorecem esporulação
Exemplo PCA- batata, cenoura e agar.
Agar de Extrato de Malte (MEA)
Agar de Czapek (CZ)
Meio CZ apenas permite crescimento de espécies
capazes de utilizar o nitrato como fonte de azoto
Cultura de Fungos filamentosos
Crescimento em meio liquido
Inoculação
Suspensão de espóros
Suspensão de micélio
Agitação
Quebra das hifas
Micélio mais disperso e homogéneo
Fungos filamentosos- Prática (MB)
Crescimento em meio sólido – PDA
Inoculação do agar em caixa
Solução de espóros em Tween 80 (0.05%)
Porção de micélio
Incubação
Medir crescimento (diâmetro)
Meios de culturaLeveduras
Meios de cultura ricos e complexos
Meio YPD – Extrato de levedura, peptona, dextrose
Meio de Sabourough – Meio rico em carbohidratos, favorece o
crescimento de fungos e leveduras em detrimento das bactérias
Adicionando cloranfenicol e cicloheximida permite isolar dermatófitos
Meio YNB- Yeast Nitrogen Base
sem/com aminoácidos; sem/com sulfato de amónio
Utiliza-se para estudar a utilização de fontes de carbono
Peptona – 20 g/L
Extracto de levedura – 10 g/L
Glucose – 20 g/L
YPDA- adiciona-se 20 g/L de agar
Cultura de leveduras
Colónias bem definidas em meio sólido
Turvação do meio líquido indicando
crescimento celular – suspensão
homógenea
Técnicas de Preservação de microrganismos
Técnicas de esterilização e desinfecção
Tecnologia de cultura de
células microbianas
Módulo II
Engenharia Clínica
Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica
Introdução à Bioengenharia I
Mestrado em Biotecnologia
2014-2015Isabel Belo/DEB
Preservação
Objectivo
Conservar material biológico garantindo:
ausência de contaminação
perdas de viabilidade
ausência de alterações genéticas
Culturas stock Industria:
manter as estirpes de produção
Laboratórios académicos:
manter estirpes que desempenham determinadas reações
Laboratórios médicos:
estirpes referência para testes de patologia
Taxonomistas:
grande nº de culturas para fins comparativos
Investigação:
Culturas puras com características inalteráveis
Métodos de preservação
Aspectos a ter em conta Manutenção da viabilidade
Alteração da população
Alteração genética
Pureza
Custo
Nº de culturas
Valor da culturas
Fornecimento e transporte
Frequência de uso das culturas
Armazenamento no frio (Sub-cultura)
Inoculação de meio fresco em tubo ou frasco
Incubação a T adequado
Armazenamento (ex. 5 ºC) Reduzir entrada de ar – parafina liquida
Baixo custo de equipamento
Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)
Tempo de armazenagem < 1 semana
Métodos de preservação
Armazenamento no frio (Sub-cultura)
Inoculação de meio fresco sólido Caixa de agar ou agar em tubo inclinado
Armazenamento (ex. 5 ºC)
Baixo custo de equipamento
Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)
Risco de desidratação e contanimação
Risco de alteração da população aumenta com o nº de sub-culturas
Tempo de armazenagem 1 a 3 meses
Métodos de preservação
Secagem
Desidratação
Remoção de água e prevenção da rehidratação
Aplicável a fungos e algumas bactérias
Ex. secagem em sílica gel (5 anos)
Secagem em papel, armazenamento em caixas
herméticas
Em suportes pré-secos de amido, dextrano, …,
Em discos de gelatina
Liofilização (Freeze drying)
A água é removida por sublimação de uma
amostra congelada
Liofilização
A água é removida por sublimação de uma
amostra congelada Os organismos são suspensos num meio adequado,
congelados e expostos a vácuo.
Após liofilização as células são guardadas em vácuo ou num
gás inerte em ampolas individuais.
Liofilização Armazenagem do produto liofilizado à
temperatura ambiente ou 4ºC – 8ºC
Humidade residual 1 a 3%
Facilidade de transporte e
armazenamento
Durabilidade alta
Vários anos
Pode ocorrer perda de
viabilidade celular
(mantem até ~30 %)
Desvantagens: equipamento caro
Reativação das células
Abrir as ampolas em
ambiente asséptico
Usar uma pequena
quantidade de meio para
hidratar as células
Inocular meios sólidos
e líquidos
Avaliar a viabilidade
celular
Criopreservação
A água torna-se inacessível por congelação
Pode ocorrer danos celulares no processo de
congelamento/descongelamento
Adição de crioprotectores
Ex: glicerol (10% v/v) e DMSO (5% v/v)
Congelação
De -20 ºC a -196ºC
-80 ºC (arcas) vials com esferas e glicerol
-140 ºC (Nitrogénio em fase vapor)
-196ºC (Nitrogénio em fase líquida)
Criopreservação
Em tubos específicos
Com esferas para adesão celular
Com crioprotetores
Equipamento caro
Elevada manutenção da viabilidade celular
Grande durabilidade da estabilidade das
culturas
Tubos criogénicos
Colecções
Coleções de culturas de microrganismos
instruções específicas para aquisição, manutenção e distribuição
técnicas de preservação utilizadas devem garantir a manutenção do potencial do microrganismo
material biológico microbiano certificado – garantia de qualidade e autenticidade
Colecções de culturas de microrganismos
Funções
Coleccionar e catalogar
Manter
Fornecer
Desenvolvimento de bases de dados
Regulamentação dos depositários e clientes
Regulamentação do transporte
Requisitos
Definição da natureza do material biológico e do
grupo de risco
Equipa qualificada e treinada
competência para trabalhar com os microrganismos da coleção
conhecimento dos procedimentos de higiene e biossegurança -
evitar contaminação de amostras e riscos de infecção
Dependências físicas adequadas ao manuseio de
microrganismos do grupo de risco definido pela
coleção
ECCO European Culture Collections Organization
Colecções CélulasDSM – Deutsche sammlung
vom mikroornismen
Alemanha
Bactérias, plasmídeos, fungos, leveduras, células de
plantas e animais
CBS- centraalbureau voor
schimmelcultures
Holanda
Fungos e leveduras
http://www.cbs.knaw.nl/
MUM- Micoteca da
Universidade do Minho
Fungos
http://www.micoteca.deb.uminho.pt/
Colecções de culturas de microrganismos
Exemplos das maiores do mundo
ATCC – American Type Culture Collection, EUA https://www.atcc.org
JCM – Japan Collection of Microorganisms, Japão http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/catalogue.shtml
WFCC – World Federation for Culture Collectionshttp://wdcm.nig.ac.jp/wfcc/index.html
Técnicas de esterilização e
desinfecção
Esterilização e desinfecção
Métodos Físicos
Calor
Filtração
Métodos químicos
Agentes antimicrobianos
Esterilização e desinfecção
Permitem o controlo do desenvolvimento dos
microrganismos
Métodos essenciais
Tratamento e prevenção de infecções
Prevenção de contaminações de culturas puras
Controlo de microrganismos
Esterilização
Completa destruição ou remoção de todas as
formas de vida, patogénicas ou não.
Desinfecção
Eliminação ou remoção de microrganismos
causadores de doenças
Sanitização
Redução da carga bacteriana a níveis seguros
para a saúde pública.
Métodos físicos-CalorMétodo Temperatura Eficiência
Incineração >500 ºC Vaporiza o material orgânico em superficies não
inflamáveis.
Água à ebulição 100 ºC 30 min de fervura mata formas vegetativas.
Não destroi endósporos nem toxinas.
Fervura intermitente 100 ºC 3 ciclos de 30min
Destrói endósporos bacterianos.
Autoclave
(vapor sobre pressão)
121 ºC
15 min.
Mata todas as formas de vida, incluindo endósporos
bacterianos.
Material cirúrgico, roupas, meios de cultura, materiais
carbonizáveis, etc.
Calor seco
(ar seco em estufa)
160 ºC
2 h
Oxidação dos constituintes da célula
Material que deve ser mantido seco.
Ex: Vidro e metal
Calor seco
(ar seco em estufa)
170 ºC
1 h
idem. Notar que o aumento de temperatura de 10 ºC
diminui 50 % o tempo de esterilização.
Pasteurização
(metódo batch)
63-66 ºC
30 min
Mata a maioria da células vegetativas de
microrganismos patogénicos.
Industria alimentar. Evita alterações pela temperatura.
Pasteurização
(metódo flash)
72 ºC
15 s
Idêntico ao batch. Para o leite, os efeitos indesejáveis
na qualidade e sabor são menores.
Métodos físicos-Calor
autoclave Bico de bunsen
Esterilização T> 100ºC Incineração (anças, agulhas)
Ambiente assético
Susceptibilidade microbiana a temperaturas
elevadas
Ponto térmico letal
Temperatura mínima que mata todos os
microrganismos ao fim de 10 min
Tempo térmico letal
Tempo mínimo necessário para matar todos os
microrganismos, a uma dada temperatura
Tempo de redução decimal, D
Tempo necessário para reduzir 90% a população
microbiana, a uma dada temperatura
Susceptibilidade microbiana a temperaturas
elevadas
N/No = e (-K t)
Sabendo que o
tempo de redução
decimal de
tratamento térmico
a 110 oC é 20 min
determine a
constante cinética
de inativação
térmica.99.9% de inativação
Redução 3 log
Métodos Físicos - Filtração
Remoção de microrganismos de fluidos
Gases e líquidos termo-lábeis
Soro, plasma, vitaminas, antibióticos, etc
Discos ou membranas de celulose ou policarbonato com
poros de 0,05 μm a 0,8 μm
Métodos Físicos - Filtração
Atmosferas isentas de microrganismos
Câmaras de fluxo laminar
Filtros de elevada eficiência
Remoção de partículas e microrganismos do ar
Métodos Físicos
Radiações
Acção directa sobre os constituintes da célula, ex DNA
Radiações ionizantes Raios g, raios X
Termo-lábeis, ex. Injectáveis
Radiações não ionizantes
Ultravioleta (240 a 280 nm)
Impede ou altera a replicação de DNA
Agente microbiocida ou mutante
Existe em câmaras de fluxo, laboratórios, blocos
operatórios
Agentes químicos
Diversos agentes químicos matam ou inibem o crescimento de microrganismos
Agentes antimicrobianos
Eficácia depende de: Dimensão da população microbiana
Composição da população microbiana
Concentração do agente antimicrobiano
Duração da exposição
Temperatura
Envolvente local (biofilme, matéria orgânica).
Agentes antimicrobianos
Agentes antimicrobianos
Resistência a agentes químicos
Escala crescente
Formas vegetativas de bactérias
Formas vegetativas de fungos e esporos fúngicos
Vírus
Micobactérias
Esporos bacterianos
Priões
Testes de sensibilidade
Avalia a capacidade de um microrganismo de
se multiplicar in vitro na presença do agente
antimicrobiano.
Métodos de diluição:
Meios de cultura líquidos ou sólidos com crescentes
concentrações do agente, com a mesma concentração
de inóculo.
Permite determinar concentração mínima inibitória
a mais fraca concentração de antibiótico capaz de inibir
completamente “in vitro” o crescimento visível de um
microrganismo.
Determinação da CMI e da CMB de um antibiótico
em meio liquido
Concentração Mínima Bactericida (CMB)
A mais fraca concentração de antibiótico que, após 18 horas de contacto,
elimina 99,9% de uma população bacteriana.
Normas NCCLS - Clinical and Laboratory Standards Institute
Outros métodos de controlo anti-microbiano
Homogeneização por alta pressão
Utiliza sistemas de compressão de fluidos a
pressões superiores a 100 MPa (1000 bar)
Leva à rutura celular, aplica-se a produtos
alimentares
Fototerapia dinâmica
Agente fotossensibilizador (FS)
Irradiação: comprimento de onda de luz específico
Ativação do FS na presença de oxigénio gera
espécies reativas de oxigénio
Morte celular