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Tècniques ràpidespel diagnòstic de la
pneumònia
Andrea Vergara Gómez Dto. Microbiología
Hospital Clínic de Barcelona
20 octubre 2018
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¿Por qué tanta urgencia?
Técnicas rápidas disponibles
Perspectivas de futuro
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¿Por qué tanta urgencia?
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4º
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1º
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6º
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Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)
Neumonía Intrahospitalaria (NIH)
Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)
Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios
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Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)
Neumonía Intrahospitalaria (NIH)
Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)
Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios
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Neumonía intrahospitalaria: 20 casos/1000 ingresos
1/3 en UCI
>90% NAV
Pico entre los días 5-9 de ventilación
Hospital-acquired pneumonia and ventilator-associated pneumonia: recent advances in epidemiology and managementBarbier et al. Curr Opin Pulm Med. 2013 May;19(3):216-28.
Incidencia de la NAV
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Of 87 337 patients staying in an ICU for more than twodays, 8% acquired pneumonia, which in 97.5% of the
cases was associated with intubation.
Source: ECDC, HAI-Net patient-based and unit-based data, 2014
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2,6 / 1000 mil días de estancia en UCI
2 / 100 pacientes UCI
5 / 100 pacientes ventilados
6,3 / 1000 días de ventilación mecánica
Incidencia de la NAV
Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017
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Distribución de las infecciones adquiridas en UCI
Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017
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Impacto de la NAV
> duración ventilación mecánica
> estancia UCI
> estancia hospitalaria
> morbi-mortalidad asociada
> $
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Dificultades para diagnosticar NAV
Signos clínicos inespecíficos
Radiografía difícil de interpretar
Confirmar con cultivo microbiológico:
Colonización/Infección
Distribución heterogénea en pulmón
Tratamiento empírico
5% NAVM sin diagnóstico etiológico (Informe ENVIN 2017)
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Técnicas rápidas disponibles
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1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días
CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE
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1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días
CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE
CULTIVO
ID +/- INFORMACIÓN SOBRE RESISTENCIAS
1-varias semanas1-2 días 1-2 días
ID + ANTIBIOGRAMA TIPAJE
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Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46
€280–300
€40
€100-120
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Laboratory diagnosis of pneumonia in the molecular age.Torres A. Eur Respir J 2016; 48: 1764–1778
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LAMPLoop-mediated isothermal amplification
Método de amplificación de ácidos nucleicos simple, rápido y económico
Temperatura constante mediante reacción de “desplazamiento de cadena”
Amplificación y detección en un único paso
Alta eficiencia: 109 copias a partir de <10 en aprox. 1 h
Alta sensibilidad y especificidad
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Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP): A New Diagnostic Tool Lights the World of Diagnosis of Animal and Human Pathogens: A Review. Dhama et al. Pak J Biol Sci. 2014; 17:151-166
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4 primers basados en 6 regiones del gen diana: F3c, F2c y F1c en el extremo 3’ B1, B2 y B3 en el extremo 5‘
2 primers opcionales que aceleran la reacción: LF, LB
ForwardInner
Primer
ForwardOuterPrimer
BackwardOuterPrimer
Backward Inner Primer
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Enzima
“the hearth of the LAMP”
DNA polimerasa + capacidad de desplazamiento de cadena
Bst polymerase (Bacillus stearothermophilus)(66ºC)Bsm polymerase (Bacillus smithii) (60ºC)
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LAMP vs. PCR
Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid and Sensitive Tool for Quality Assessment of Meat Products. Kumar et al. Comp Rev Food Sci Food Saf. 2017;16:1359-78.
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Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46
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LAMP
Extract Boiling Direct
Sensitivity(%, CI95%)
88.0 (67.7-96.8) 80.0 (58.7-92.4) 80.0 (58.7-92.4)
Specificity(%, CI95%)
95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8)
PPV(%, CI95%)
95.7 (76.0-99.8) 95.2 (74.1-99.8) 95.2 (74.1-99.8)
NPV(%, CI95%)
88.0 (67.7-96.8) 81.5 (61.3-93.0) 81.5 (61.3-93.0)
LAMP may be useful as a rapid screening tool to detect HSV-1 in BALF
Aceptado en EIMC
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Microorganismidentified by
culture
Total nº of samplestested
Concordance Minorerrors
Majorerrors
Comments
S. aureus 19 15 2A,B 2C,D ALAMP: SAUR+SMAL detectedBLAMP: SAUR+PAER detected(GNB in GRAM)C,DCulture: Few cfu SAUR
P. aeruginosa 11 9 - 2E,F ECulture:< 1000cfu PAER, LAMP: SAUR positiveFCulture:<1000cfu PAER, all LAMP negative
S. maltophilia 6 6 - - -
K. pneumoniae 4 2 - 2G GCulture:<1000cfu KPNE (twocases)
E. coli 3 3 - -A. baumannii 2 1 - 1H HCulture:100000ufc ABAU
Negative 7 6 1I - ILAMP:KPNE detected (GNB in GRAM)
Mixed flora 6 3 3J,K,L - JLAMP:PAER detectedKLAMP:SAUR detectedLLAMP:KPNE detected
TOTAL 58 45 6 7Artículo en preparación
LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from BAL samples
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Microorganismidentified by culture
Total nº of samplestested
Concordance Minorerrors
Majorerrors
Comments
K. pneumoniae 13 10 3A,B - ALAMP: KPNE + ECOL (two cases)BLAMP: KPNE+PAER
S. aureus 10 7 2C,D 1E CLAMP: SAUR+KPNE DLAMP: SAUR+ECOL ECulture: <1000cfu SAUR
P. aeruginosa 11 9 2F - FLAMP: PAER + ECOL (two cases)
E. coli 8 3 5G,H,I,J - GLAMP: ECOL + PAER HLAMP: ECOL + PAER + SAUR +SMAL ILAMP: ECOL + KPNE JLAMP: ECOL + PAER + SMAL (twocases)
S. maltophilia 2 2 - - -
Polymicrobial 10 3 4 3 See table in supplementary material.
Other 10 7 3K,L,M - KLAMP: ECOL + KPNELLAMP: PAERMLAMP: PAER + SAUR + SMAL
Mixed flora 10 10 - - -
Negative 9 9 - - -
TOTAL 83 60 19 4
Artículo en preparación
LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from AT/BAS samples
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The presence/absence of carbapenem-hydrolyzing enzymes was correctly determined
for all isolates in <30 min.
82 Acinetobacter spp: 15 sensibles (OXA-51)19 OXA-40 24 OXA-5820 OXA-233 NDM 1IMP-2
Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Methodology To Detect Carbapenemase Carriage in Acinetobacter Clinical Isolates. Vergara et al. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58:7538–40.
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Strain Concentration (cfu/mL)
Eazyplex SuperBugcomplete A (min:seg)
OXA-23 producing A.baumannii 103 14:00102 16:15
OXA-40 producing A.baumannii103 12:50102 13:15
OXA-58 producing A.baumannii103 16:10102 18:30
OXA-23 producing A.baumannii R308 103 11:45102 -
OXA-40 producing A.baumannii R329 103 16:15102 -
OXA-58 producing A.baumannii R80103 20:00102 -
NDM producing A.pitii 103 20:00102 -
NDM producing A.dijkshoorniae 103 18:30102 -
Datos no publicados
Detección directa de carbapenemasas en BAL
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Strain Concentration (cfu/mL) Xpert Carba-R (Ct) Eazyplex SuperBug CRE
(min:seg)
NDM producing K. pneumoniae 103 27.2 18:45102 29.3 -
OXA-48 producing K. pneumoniae 103 28.3 18:00102 30.4 -
VIM producing K. pneumoniae 103 28.3 27:00102 31.1 -
NDM + CTXM1 producing E. coli103 27.2 NDM 7:45, CTXM1 6:00
102 30.6 NDM 10:30, CTXM1 8:15
OXA-48 producing E. coli 103 28.3 20:00102 31.3 -
VIM producing E. coli 103 29.1 12:20102 33.5 19:50
KPC + CTXM15 producing E. asburiae
103 30.4 KPC 18:45, CTXM1 14:00
102 33.1 KPC 25:30, CTXM1 26:00
NDM+OXA-48+CTXM1 producing K. pneumoniae
103 NDM 31.4 OXA 31.2 CTXM1 12:00102 NDM 33.4 OXA 33.4 -
NDM+CTXM1 producing K. pneumoniae
103 30.5 NDM 17:00 CTXM1 10:15102 35.4 CTXM1 16:30
KPC producing K. pneumoniae 103 31.1 -102 35.3 -
Detección directa de carbapenemasas en BAL
Datos no publicados
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Perspectivas de futuro
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Bacterias
Virus
Resistencias
Hongos
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Bacterias
Virus
Resistencias
Hongos
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Rapid Whole-Genome Sequencing for Detection and Characterization of Microorganisms Directly from Clinical Samples.Hasman et al. J Clin Microb. 2014;52:139-146.
WGS + Metagenómica
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Early insights into the potential of the Oxford Nanopore MinION for the detection of antimicrobial resistance genes. Judge et al. J Antimicrob Chemother 2015;70.2775-78
Rapid Pathogen Identification in Bacterial Pneumonia Using Real-Time Metagenomics. Pendleton, K.M. et al. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2017;196:1610-12
Rapid Diagnosis of Lower Respiratory Infection using Nanopore-based Clinical Metagenomics. Charalampous et al. bioRxiv 2018
This study demonstrates that nanopore metagenomics can rapidly and accurately characterise bacterial lower respiratory infections when combined with efficient human DNA depletion.
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• Se requiere un diagnóstico rápido en los casos de
neumonía.
• El cultivo es necesario, ya que nos permite aislar al
microorganismo causante.
• Las técnicas moleculares son de gran ayuda, aunque
no están exentas de limitaciones.
• La metagenómica (Nanopore) puede suponer un gran
avance en el diagnóstico de la neumonía.