Técnicas Analíticas en Estabilidad de Medicamentos:

Estabilidad Química.

Vicente Merino Bohórquez

UGC Farmacia. HU Virgen Macarena (Sevilla)

20 de Octubre de 2017

• Mijaíl Tsvet (1903):

• Botánico ruso

• El primero en usar la cromatografía en columna

• Fase estacionaria sólida INULINA en columna cilíndrica de vidrio

• Fase móvil líquida ETER DE PETRÓLEO

• Fenómenos de ADSORCIÓN Separación de clorofilas a y b

• Logró separar carotenoides y xantofilas

Ostrowski W. Michael S. Tswett--inventor of column chromatography. (On the occasion of 65th anniversary of his lecture on the column chromatography technique). Folia Biol (Krakow). 1968;16(4):429-48.

Un poco de Historia…

Método específico Fase estacionaria Tipo de Equilibrio

Líquido-sólido (adsorción) Sólido Adsorción

Líquido-líquido (Reparto) Líquido adsorbido sobre un

sólido Distribución entre líquidos

inmiscibles

Líquido-fase unida químicamente (Reparto)

Especies orgánicas enlazadas a superficie sólida

Distribución entre el líquido y la superficie enlazada

Intercambio iónico (HPLC-IEC)

Resina de intercambio iónico

Intercambio iónico

Exclusión por tamaño (HPLC-SEC)

Liquido en el intersticio de un líquido polimérico

Penetrabilidad en poros (Filtración en gel y Penetrabilidad en

gel)

Tipos de Cromatografía Líquida (I)

Tipos de Cromatografía Líquida (II)

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ReversedPhase/

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/IonExchange/

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/

Fase directa o normal:

• FM Apolar (apolar>>polar) n-hexano,etileter,CHCl3

• F Estacionaria Polar (ciano,amino,diol,…)

• Retención de sustancias Polares

Fase inversa o reversa (ampliamente utilizada >90%)

• FM Polar (Polar>>apolar)H2O,ACN, MeOH, THF

• F Estacionaria Apolar (C18, C8, Fenilo,…)

• Retención de sustancias Apolares

Según la naturaleza de las fases líquidas implicadas:

Cromatografía de Reparto (I)

Partes de un Sistema HPLC

Mantiene la composición FM y la alta presión

Reservorio contenedor de vidrio

Mantiene la Tª en la columna (fase estacionaria)

Inyecta un volumen de muestra en el sistema sin perdidas de presión

Identificación y cuantificación Diodos en serie (DAD) Indice de Refracción

Fluorescencia

Composición de un Sistema HPLC

• Es el “corazón” del equipo HPLC

• Material químicamente INERTE (acero inox).

• Resistentes desde punto vista físico

• Compuestas de partículas muy porosas de sílice

• Existen de diferentes optimización de la EFICACIA • Diámetros (2-5 mm) • Longitudes (50-250 mm) • Tamaño poro interno (1.8-10 µm)

• Estables a pH=2-8 (algunas específicas pH extremos ZIRCONIO)

Columna HPLC-RP

Fases Estacionarias HPLC

• Distintas FE en función de lo que nos convenga:

C18-OCTADECILSILANO CIANO

AMIDA

C18-OCTADECILSILANO

Fases estacionarias de columnas HPLC-RP

• Dependerá del tipo de cromatografía (Normal vs. Reversa)

• Disolventes muy puros (grado HPLC)

• Parámetros: viscosidad, tensión de vapor, compresibilidad, absorción UV,…

• Polaridad: es el parámetro más importante DEFINE EL TIPO DE CROMATOGRAFÍA

• Los DISOLVENTES más utilizados en fase REVERSA: • Agua (tamponada o no) • Acetonitrilo • Metanol • Tetrahidrofurano (THF)

Selección Fase Móvil (I)

• Según la composición FM:

1. Condiciones ISOCRÁTICAS: composición constante de FM

durante todo análisis. Problema general de la elución.

2. Condiciones GRADIENTE: varía la composición, se va aumentando la fuerza eluotrópica del disolvente con el tiempo de análisis.

Selección Fase Móvil (II)

FM: 40%ACN:60% buffer 0.01M KH2PO4 pH=4.1

Isocrático: TMD-DKTP-DROP

FM:10% ACN60% ACN (min 06) 90% buffer40% buffer 0.01M KH2PO4 pH=4.1

Tramadol

Droperidol

Dexketoprofeno

Gradiente: TMD-DKTP-DROP

Detector Características Sensibilidad

UV/Vis Específico de compuestos cromóforos

UV ng

UV/Vis Diodos en serie Idem UV/Vis + espectros completos

3D ng

Fluorescencia Específico para compuestos

fluorescentes fg-pg

Índice de Refracción Universal: polímeros, azucares, triglicéridos, ácidos orgánicos,

excipientes 0,1-10 µg

Detector de dispersión de luz (DLS) Universal: no volátiles, semivolátiles,

compatible con gradiente ng

Electroquímica Específico: compuestos

electroactivos pg

Conductividad Específico: aniones y cationes, ácidos

orgánicos y surfactantes ng

Espectrometría de masas Universal y específico. Identificación

definitiva. fg-pg-ng

Detectores HPLC: posibilidades

• Útil para sustancias absorción UV (cromóforos)

• Permite barrido de λ 200-400 nm (espectro UV)

• Permite análisis espectral en 2D-3D

• Detección de un gran número de fármacos

Detector UV Diodos en Serie (UV- Diode Array Detector)

Cromatograma

Espectro UV 2D

Análisis espectral: Idebenona

Técnica de supresión ionización

Técnica de formación

pares iónicos

Técnicas de derivatización precolumna

Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (I)

• Objetivo conseguir moléculas en forma lipófila (no ionizada).

• Aumento de la interacción con la F Estacionaria Mejora la separación de las moléculas.

• Control de pH de la fase móvil (pH±2 pKa)

• Dependerá de si son ácidos débiles o base débiles.

• Tener en cuenta el pH de estabilidad de la columna (2-8)

Supresión de la ionización

• AINE (Derivado arilpropiónico)

• Aplicación HPLC Determinación contenido pa

• Supresión ionización: • Columna C18 (4.6 mm x100 mm, 3.5 µm)

• Control por buffer KH2PO4/H2PO4 pH=2.5

Forma NO IÓNICA MEJOR RETENCIÓN en FASE REVERSA

Ejemplo: ibuprofeno

FM: 45% Buffer KH2PO4 (pH=2.5) 55% Acetonitrilo Columna C18 (4.6x100 mm, 3,5 µm) Tª 25ºC. UV=230 nm

Cromatograma Ibuprofeno

Técnica de supresión ionización

Técnica de formación

pares iónicos

Tecnica de derivatización precolumna

Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (II)

• Objetivo conseguir pH todas las moléculas estén ionizadas

• A la FM se añade un contraión complejo neutro y liposoluble

• Mejora la retención en fase apolar permite separar iones

• Para ácidos (pH>pKa) Contraión + (tetrabutilamonio)

• Para bases (pH<pKa) Contraión - (octanosulfónico)

Formación de pares iónicos

• Agonista α2-adrenérgico HTA,Crisis HTA,Sdme. Abstinencia opiáceos, hiperactividad, …

• Uso pediátrico en forma de jarabe (clorhidrato de clonidina)

• Base débil (pKa=8,16) pH=10,16 desmoronamiento FE

• Análisis HPLC según USP formación pares iónicos:

+ Complejo neutro

Clonidina-Octanosulfonato (forma no ionizada)

Formas ionizadas

The United States pharmacopeia, 34nd rev., and The national formulary, 29th ed. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention; 2011:2574-75.

Ejemplo: clonidina

Proyecto GT Farmacotecnia: Estabilidad fisicoquímica y microbiológica de tres formulaciones orales pediátricas

Clonidina 2,6-Dicloroanilina

Clonidina 2,6-Dicloroanilina

Sorbato potásico

Jarabe SIN conservante

Jarabe CON conservante

Cromatograma de clonidina

Técnica de supresión ionización

Técnica de formación

pres iónicos

Técnica de derivatización precolumna

Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (III)

Fuentes en estabilidad

• Técnica útil en análisis de compuestos que no son detectables.

• Mediante una transformación química se hacen “visible” al detector y se pueden cuantificar.

• Uso de reactivos derivatizantes.

• Isoniazida tiene un producto de degradación identificado como hidrazina (carcinógeno y mutagénico)

• Derivatización con benzaldehido nos permite cuantificarlo

Derivatización precolumna

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

6.510

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

6.511

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

6.494

40ºC

25ºC

5ºC

0

5

10

15

20

25

30

DÍA 0 DIA 6 DÍA 10 DÍA 14 DÍA 21 DÍA 28 DÍA 50 DÍA 70 DIA 90

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

(µ

CG

/ML)

FORMACIÓN DE HIDRAZINA EN LAS DOS FORMULACIONES

F1 40ºC F1 25ºC F1 5ºC F2 40ºC F2 25ºC F2 5ºC

• Estudio caracterización infliximab biosimilar

• Comparan características FQ: • IFX BIOSIMILAR (CT-P13) vs IFX ORIGINAL (RMP)

• Ensayo de pureza: • Cromatografía de exclusión molecular (HPLC-SEC):

• TSK G3000SWXL (Tosoh®)

• FM buffer acuoso en ISOCRÁTICO

• DETECTOR UV 214 nm.

• Cumplen las especificaciones 99.4-99.9% en MONÓMEROS (Acmab)

• Ensayo de cargas de isoformas: • Cromatografía de intercambio catiónico

• Propac WCX 10 (Dionex®)

• FM: NaCl en GRADIENTE

• DETECTOR UV 214 nm.

Jung SK, Lee KH, Jeon JW, Lee JW, Kwon BO, Kim YJ et al. Physicochemical characterization of Remsima. Mabs. 2014; 6(5):1163-77.

Determinación de fármacos de origen biológico

Fuentes en estabilidad

Espectro UV-Visible e IR:

• Puede ser útil para cuantificación de sustancias farmacéuticas.

• Principios activos suelen absorber en el espectro UV-visible.

• Son técnicas poco específicas y selectivas (ojo en estudios de estabilidad)

• Especial interés de la espectroscopia IR cercano (FTIR) para identificación rápida de materia prima y determinación de aguas.

• Cada compuesto tiene un espectro IR único (excepto los isómeros ópticos)

Espectrofotometría UV-Visible-IR

Fuentes en estabilidad

• Consiste en la medición de la emisión de luz de una sustancia química cuando se expone a la radiación UV, visible u otra radiación electromagnetica.

• λexcitación<λemision (20-30 nm)

• Más sensible que la de absorción UV

• Mucho menor ruido de fondo (blanco señal baja) vs Absorción UV-Vis.

• Determinación de impurezas aminobutanol por derivatización con fluorescamina

Fluorimetría

Fuentes en estabilidad

Espectrometría de Masas

• Se generan iones que se separan m/z y registra la abundancia relativa.

• Compuesto por: • Fuente de iones: volatiliza la sustancia a estado gaseoso. • Analizador: clasifica los iones en función de su m/z. • Detector: registra los iones y registra la abundancia relativa

• Útil para cuantificación e identificación definitiva de todo tipo de moléculas ionizables:

• Fármacos y sus metabolitos. • Sustancias endógenas polares. • Macromoléculas (péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y oligosacáridos)

CT-P13 (biosimilar)

Infliximab (comparador)

Forma Farmacéutica Control de Calidad

(contenido pa) Estudios Estabilidad FQ

Cápsulas Dexametasona Etinilestradiol

-----

Inyecciones intravitreas

Vancomicina Ceftazidima

-----

Soluciones orales -----

Clonidina Fenobarbital Hidralazina

Isoniazida (Hidrazina) Etambutol (aminobutanol)

Preparados tópicos -----

Gel Timolol

Mezclas iv TMD-DKTP-DROP N-Acetilcisteína

Experiencia HU Virgen Macarena

• Gran versatilidad a la hora de analizar distintos productos farmacéuticos (fármacos clásicos, Mabs, biológicos, etc.) tan sólo: • Cambio de columnas • Disolventes FM • Variedad de detectores

• Universalidad: técnica de referencia de las principales farmacopeas del mundoUSP,BP, EP,JP, RFE,..

• Herramienta de garantía de calidad en farmacotecnia: • Control de calidad • Estabilidad FQ

Conclusiones HPLC

• www.agilent.com

• www.thermofisher.com

• www.waters.com

• www.shimadzu.com

Para más información