tecnicas basicas de biologia molecular(2)
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Técnicas Básicas de BiologiaMolecular
Diamar Costa-PintoFIOCRUZ
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Visão da Apresentação
PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento Southern, Northern e Western blotting
By Diamar
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Diagnóstico do século 21- Podemos fazer análises genômicas,pois a maioria dos cromossomo já estãomapeados.
- O projeto genoma tem sido umagrande ferramenta para unir genomas elaboratório clínico.
Mapas Genéticos, Citológicos eFísicos
EST – Sequências expressas marcadas.cDNA curtos que ligam mapas físicos agenéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição
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Procurar um gene dentro de um genoma
humano é comparável a procurar uma pessoasem sobrenome em uma casa sem endereçoem uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.
Solange Farah
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Enzimas de Restrição
1953 – a eficiência de replicação de umbacteriófago dependia da célula hospedeira
Verificou-se, então, a presença de nucleases Bactéria restringe o crescimento do fago eprotege o seu DNA metilando-o (modificando) Fenômeno chamado restrição/modificação
Advento das endonucleases de restrição Sítio é normalmente uma palíndrome
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Enzimas de Restrição(continuação)
Palíndrome:ARARAARARA
OMO
OMO
ANAANA By Diamar
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Enzimas de Restrição(continuação)
Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares debases
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas Primeira letra maiúscula é gênero e as duasoutras minúsculas são espécies 1073 – foram usadas para clonagem molecular
Pode-se recombinar DNA humano com qualqueroutra espécie Fragmentos separados por eletroforese
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Enzimas de Restrição(continuação)
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Vídeo de Enzima de
Restrição
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Eletroforese
Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960 Movimentação de moléculas submetidas a
campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose,
poliacrilamida
Separa proteínas por cargas e peso molecular Separa ácido nucléicos por peso molecular
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Eletroforese
+-
Horizontal
Vertical
Fonte de eletroforese
Visualização do gel de agarose
-
+ By Diamar
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Eletroforese
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Vídeo de Eletroforese
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Clonagem Molecular
Consiste no isolamento e propagação demoléculas de DNA idênticas
Primeiro: inserto + vetor = rDNA
Segundo: rDNA + célula hospedeira =
transformação
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E h é ( ) l
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Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar umgene específico, com uma característica desejada, e transfere este
gene para outro organismo vivo
Célula humana Bactéria
Plasmídeo
DNA
Enzima de restrição
Tesoura genética
Transformação
DigestãoDNA da bactéria
DNA da célula humana
rDNAClonagem
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O DNA recombinante
Não se limita a organismos de uma mesma espécie
A compatibilidade sexual torna-se irrelevante
Permite modificações em uma única geração, o queantes levaria dezenas ou centenas de gerações
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Vídeo de Clonagem
Molecular
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Vetor
São moléculas de transporte Moléculas de DNA
Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,vírus, YACs, etc. Diferenças de tamanho de inserto
Podem ter comportar linear e/ou circular
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Vetor(continuação)
Vetores de expressão procarióticos
Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem
Vetores de expressão eucarióticos
Origem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução,
poliadenilação de mRNA, capping Sinais especiais para processamento e secreção
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Vetor(continuação)
Características gerais
Região promotora Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker Gene de resistência a antibióticos Origem de replicação Gene repórter
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Vetor(continuação)
PLASMÍDEOS:
Penetra naturalmente nas bactérias
Fita dupla Circular Extracromossômico
Resistência a antibióticos Vetores shuttle
Insertos até 4000 pb
pUC 18, pUC 19 By Diamar
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Vetor(continuação)
FAGOS Vírus de bactérias Fago λ é o mais utilizado Fita dupla linear Recirculariza durante a infecção na bactéria Aceita até 20 mil pb
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Vetor(continuação)
COSMÍDEOS Pequeno tamanho 4 a 6 Kb Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria Possuem seqüências cos
Aceitam insertos de até 50 mil pb
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COSMÍDEOS
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COSMÍDEOS
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Vetor(continuação)
YACs (Yeast Artificial Chromosome)
Células hospedeiras as leveduras Comportam-se como cromossomos Aceitam 400 mil pb Possuem seqüências de DNA específicas de
levedura: telômero, centrômero e origem dereplicação
ARS: Seqüência de replicação autônoma
CEN: Seqüências centroméricas
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E h i G éti P d ã é i
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Engenharia Genética – Produção em série
- Hormônio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormônio sexuais
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Sequenciamento
Frederick Sanger (1977), Inglaterra
Segundo Prêmio Nobel Síntese de DNA in vitro por término
didesoxi Mapa físico dos genes e dos
cromossomos
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Sequenciamento(continuação)
Hood: Semi-automatizado (1986)
Venter: Genoma de bactéria usandoddNTPs fluorescentes automatizados,robóticas e PCR (1995)
Perkins-Elmer Corp: Comercializado oSequenciamento totalmente automatizado
(1999) By Diamar
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ConsideraçõesP
P
BN
A
C
G
T
U
OH
P
OHOH
RiboseC1
C2C3
C4
C5
P
P
BN
A
C
G
T
OH
P
OHOH
dNTP
PentoseC1
C2C3
C4
C5
Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico
O - Necessáriopara ligaçãofosfodiéster
5’ 3’
Polimerização
ddNTP (Didesoxinucleotídeo)NTP
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Estuda a integridade da sequência de um DNAld A li dif t t h d
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molde. Analisa diferentes tamanhos defragmentos formados a partir de um primer e dainserção randômica de dNTPs (polimeriza) e
ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.Sequenciamento
ddNTP
ddNTP
ddNTP
Fragmento 1
Fragmento 2
Fragmento 3
Primer
DNA molde
dNTPdNTPdNTP
dNTP
dNTPdNTP
DNA polimerase
ACGT
AC
ACG
TGCA
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S i t t ti d
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Sequenciamento automatizado
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Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)
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Southern Blotting
E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de
agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
Detecta polimorfismo de DNA ou mutação By Diamar
Southern blot
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Southern blot
Descrição:
- Digestão do DNA em teste com enzimasde restrição;
- Resolução dos fragmentos comeletroforese em gel de agarose;
- Transferência do DNA para membrana denylon;
- Hibridação com uma sonda de DNA ouRNA marcada com radioatividade ouquimioluminescentes
Aplicação: Alterações em um úniconucleotídeos; detecção de inserções, deleçõese rearranjos; ordenamento de fragmentos doDNA em um mapa físico; fragmentos de
cromossomo.
Com o advento da PCR seu uso tornou-selimitado.
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Southern blot
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Southern blot
46, XY.Síndrome da insensibilidade
androgênica. Vagina em fundo desaco, sem útero ou tubas uterinas.1:20.000. Testículos no abdome oucanal inguinal (confundidos comhérnias, na infância). Defeitomolecular: varia de deleçãocompleta do gene a mutações de
ponto nos domínios de ligação deandrógenos ou ligação ao DNA daproteína receptora de andrógeno.
Sonda de cDNA para ogene humano ligado ao Xde receptor de andrógeno
hibridando no genomadigerido do paciente.
Exemplo da especificidade dassondas.
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Vídeo de Southern blot
(DNA _DetectivePC)
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Northern blotting
Corrida de RNA totais ou mRNA em gel deagarose
RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) Sensibilidade a RNAses Transferência para membrana por ação capilar Sondas de RNA ou DNA para hibridar
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Northern blotting (Continuação)
Úteis em estudo de expressão gênica
Estudo de diferentes tecidos Estuda o padrão temporal de expressão
de genes durante o crescimento do
indivíduo
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Northern blotting
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o t e b ott g
MarcadoresrRNA
RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).
A – sonda de α-tubulina – hibrida todos
B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores
C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos By Diamar
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Western blotting
Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para
desnaturação Transferência para membrana por força elétrica
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Western blotting (continuação)
Proteína alvo é identificada por anticorpo monoou policlonal
Revelação do sistema com anticorpo secundáriofluorescente ou radioativo
Informa o tamanho e a quantidade das proteínas
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Western blotting
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Western blotting Análise de proteínas por anticorpos específicos após
eletroforese e transferência para membrana.
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Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)
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RFLPsPolimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
Uso de enzimas de restrição
Produção de fragmentos de DNA de tamanhoadequados para serem utilizados
As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos deDNA
Aplicação: compara alelos normais e afetados para
cada mutação estudada.
Mapa de Restrição
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PCR - RFLP
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RFLPs
P li fi d i t d
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Polimorfismo dos comprimentos dosfragmentos de restrição
Um caso de erro inato do metabolismo:
G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
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RFLP de Planta
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DNAs genômico de Arabidopis é digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul everde.
F1 é heterogêniopossui fragmentos deambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipodiferentes: C-Colombia, N-
Niederzenzes e H –Heterozigoto.
Oligonucleotídeo alelo-específico (ASO)
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p ( )
Descrição:
- Hibridação preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composiçãode bases complenmentar única.
Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.
Mutação é conhecida. Revela uma únicaalteração de base. Distingue hetero ouhomozigotos para a sequência. A análise é
restrita a mutação familiar conhecida ou paradistúrbios genéticos com nº finito demutações diferentes. Ex: beta-talassemia.
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FISH
Hibridação in situ com fluorescência Detecta DNA localizados dentro de cromossomos
Usa lâminas de microscopia Cromossomos estão em metáfase, anáfase e
interfase
Usa sondas de DNA específicas
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FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
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(Hibridação in situ com fluorescência)
Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no
cromossomo 15 paterno.
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By Diamar FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
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Relação evolutivaentre cromossomos.
DNA de gibãoHylobates lar
sondado com DNAHumano.
Setas indicamcromossomo 8 do
gibão.
Cromossomohumano 4 hibridacom cromossomo
(laranja) do macacoverde africano.
Evolução cromossômica em mamíferos
SSCPSingle strand conformational polymorphism
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Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
Método baseado na
mobilidade eletroforética.
Gel não desnaturante.
Protocolo Básico PCR do gene alvo.
DNA desnaturado.(eletroforese)
Mobilidade diferente
da normal indicamutação.
Sensível paratamanho e forma da fita
simples.
Detecta a mudançade uma base.
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SSCPSingle-strand conformational polymorphism
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Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
Fragmentos até200 pb – 90% desensibilidade.
Fragmentosmaiores que 400 pb- 80% desensibilidade.
(digestão )
Heterozigoto
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina Chips de genes Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Microdisposição de oligo ou de sondas
- Microssíntese de oligos in situ (no chip )
- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
fabricadas
- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
Leitura por scanners By Diamar
MicroarrayMicroarranjos de DNA – Chips de DNA
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j p
É uma técnica que emprega arranjos (arrays),que contêm um grande número de genesroboticamente distribuídos de forma ordenada emuma placa de vidro.
Pode comparar a expressão de um grandenúmero de gene, simultaneamente.
Existem lâminas de 400.000 pontos.São feitas com ponteiras de titâneo.
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidossob condições normais e anormais
Sequenciamento do DNA e genotipagem
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Contras Utilização
Técnica cara - Mapear mutações
Sensibilidade é reduzida - Oncogenes
Lâminas não são reutilizadas - Expressão das viasmetabólicas
Repetir várias vezes - Regiões regulatórias
de genes de levedura
Grande quantidade de - Expressão de genesmRNA (2 a 5 µg) anônimos
- Analisar 10.000 amostrasem 12 horas
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Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
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Descrição:
- Hibridação do DNA emteste com disposições
ordenadas de nucleotídeosem chip de silicone.
Aplicação:
- Detecção de DNA emteste com composiçãoconhecida.
By Diamar
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Referências Bibliográficas:
MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: arrayof possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER , F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequencesamong DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.Mol. Biol. 98:503-517.
By Diamar