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Técnicas de genética molecular
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- Detección de secuencias de ADN y ARN
- Localización de un gen
- Estructura y función de una región genómica
- Expresión génica
Se requieren métodos para trabajar con una pequeña
parte del ADN o del ARN
Técnicas de genética molecular
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Separación de moléculas por tamaño y carga eléctrica
Permite visualizar fragmentos de ADN:
electroforesis en gel de agarosa
electroforesis en gel de poliacrilamida
electroforesis capilar
Electroforesis
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Preparación:
Electroforesis en gel de agarosa
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Electroforesis horizontal:
Electroforesis en gel de agarosa
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Escaleras de fragmentos de tamaño conocido
100 pb p-GEM PhiX-HaeIII
Marcadores de tamaño molecular
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Preparación:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
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Electroforesis vertical:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
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Secuenciador automático
ABI 3130
Electroforesis capilar
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Agentes intercalantes emisores de fluorescencia en
transiluminador de luz UV
Visualización de los fragmentos de ADN
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Bromuro de etidio (Sharp en 1973):
- molécula plana capaz de unirse al ADN
- agente carcinogénico y mutagénico.
- se une al ADN de dos formas:
- unión fuerte intercalándose entre los pares
de bases,
- unión débil, “no intercalante”, luego de que
los sitios de intercalación están saturados.
Agentes intercalantes
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Intercalación de la molécula de
BrEt- entre dos bases contiguas en
la molécula de ADN.
Luego de la unión, la fluorescencia
del colorante a la luz UV aumenta
casi 20 veces.
Máximo de emisión del BrEt- a
595 nm.
Agentes intercalantes
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Riesgo de exposición al BrEt: cancerígeno
Utilización de colorantes inocuos:
Sybr Green, Sybr Gold, Sybr Safe, GelRed, GelGreen.
Agentes intercalantes
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Marcación radioactiva del ADN con 32P y
detección por autorradiografías
1 2 3 E 4 5 6 7 8 9 10
Visualización de los fragmentos de ADN
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Nitrato de plata, con transiluminador de luz visible
Visualización de los fragmentos de ADN
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Marcación con fluoróforos + lector láser
Visualización de los fragmentos de ADN
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Obtención de moléculas de ADN genómico
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Etapas generales de una extracción de ADN:
-ruptura de membranas
-digestión proteica
-purificación
-precipitación
-resuspensión del ADN
Obtención de moléculas de ADN genómico
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Obtención de moléculas de ADN genómico
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Fuentes de ADN
• Sangre: • leucocitos de mamíferos (camélidos: eritrocitos
nucleados) • Eritrocitos y leucocitos de otros grupos
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Fuentes de ADN
• Otros fluidos corporales: • Líquido amniótico • Semen • Orina
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Fuentes de ADN
• Pelos: • Con folículo: ADN nuclear y mitocondrial • Sin folículo: ADN mitocondrial
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Fuentes de ADN
• Epitelio bucal: • hisopado de mucosa bucal • enjuague bucal • hisopado de objetos
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Fuentes de ADN
• Hueso: • exhumaciones • restos arqueológicos
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Fuentes de ADN
• Materia fecal:
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Fuentes de ADN
• Material vegetal: • Hojas • Semillas • Flores, etc.
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Fuentes de ADN
• Microorganismos: • Cultivos de laboratorio • Material arqueológico (sarro dental antiguo)
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Obtención de ARN
Minimizar la actividad de ARNasas (¡muy estables!) - uso de material descartable libre de ARNasas - tratamiento del material de vidrio y las soluciones con DEPC 0,1% - uso de inhibidores de ARNasas (tiocianato de guanidina y agentes reductores) - trabajar rápido, en baja temperatura, con tapas cerradas - utilización permanente de guantes