técnicas moleculares ii “tecnología de proteínas”
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Técnicas moleculares II“Tecnología de Proteínas”
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Estructura y características de las proteínas
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Propiedades físico-químicas de los aminoácidos
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Procariotas vs Eucariotas: técnicas de extracción
• Ruptura mecánica directa• Alta presión• Sonicación• Bolitas de vidrio• Soluciones hipotónicas• Detergentes
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Fraccionamiento subcelular
Centrifugación Diferencial vs. Centrifugación en gradiente
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Técnicas electroforéticas: Isoelectroenfoque (relación carga/masa)
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Técnicas electroforéticas: SDS-PAGE (independizarse de la carga)
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SDS-PAGE
¿Por qué vemos las bandas proteicas en el gel?¿Una banda en un gel SDS-PAGE corresponde aun único polipéptido?
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Técnicas electroforéticas: Geles bidimensionales
Los puntos rojos son proteínas comunesLos puntos azules proteínas específicas
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Técnicas que involucran la utilización de anticuerpos
• Western blot• Inmunohistoquímica• Inmunoprecipitación• ELISA
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Western blot
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Inmunohistoquímica
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Técnicas cromatográficas
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Técnicas cromatográficas: tipos de columnas
HPLC(High-performance liquid chromatrography)
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Introducción a los TP 3, 4 y 5
Extracción de proteínas totales
Cuantificación utilizando método de Bradford
Chequeo del extracto mediante electroforesis en SDS-PAGE
Análisis de una proteína pura mediante Western blot
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TP nº 3: Extracción y cuantificación de extractos proteicos
• Extracción de proteínas a partir de distintos tejidos, utilizando métodosmecánicos y solución de lisis con detergentes.• Cuantificación de proteínas por métodos colorimétricos: BRADFORD
Curva de calibración
y = 0,8409x + 0,3545
R2 = 0,986
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
y = 0,8816x
R2 = 0,983
0,000
0,0500,100
0,150
0,2000,250
0,300
0,350
0,4000,450
0,500
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Interpolar la absorbancia de las muestras en la curva
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TP nº 4: SDS-PAGE y tinción con Coomasie blue
Gel de proteínas extraídas de distintos tejidos de rata
Gel de distintas concentraciones de la proteína IgG
Rf = Dc/DtGraficar log(PM) vs Rf para el ladderExtrapolar el Rf de las bandas de las muestras en la curva
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TP nº 5: Western blot