FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICASESCUELA DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

CURSO: Helmintologa Parasitaria TEMA: TCNICAS SEROLGICAS PARA HELMINTOSALUMNAS: MORILLOS SILVA, Teresa Lucila AZCO RAMIREZ, Ana Lucia RAMIREZ ALAYO, Belen SALINAS ARANDA, Maria de Jesus

DOCENTE:Dr. JARA CAMPOS, CESAR AUGUSTO

TRUJILLO PER2015

TCNICAS SEROLGICAS PARA HELMINTOS

Laserologaes el estudio que permite comprobar la presencia deanticuerposensangreLas serologas de helmintos ms comunes o ms tiles son las de hidatidosis, cisticercosis, fascioliasis, esquistosomiasis, toxocariasis, anisakiasis, filariasis y estrongiloidiasis.La cantidad de parsitos protozoarios y helmintos que afectan la vida del humano y la de los animales es considerable. El estudio de sus antgenos es complejo, ya que existen formas antignicas variadas, dependiendo de las diferentes etapas de su ciclo de vida. Las tcnicas para el estudio de antgenos parasitarios evolucionaron a medida que aparecieron nuevos mtodos para aislar, purificar y determinar su estructura qumica (por ejemplo, la secuencia de aminocidos de antgenos proteicos).Con la mejora de las tcnicas inmunolgicas se ha logrado la automatizacin y la robotizacin, pero sobre todo el incremento de la sensibilidad diagnostica, lo cual hace posible un estudio ms detallado y amplio de los antgenos parasitarios. El fundamento de las tcnicas para el estudio de los antgenos parasitarios, desde sus orgenes hasta el momento actual, se basa en dos estrategias: a) identificacin o cuantificacin de anticuerpos contra componentes de los parsitos, y b) identificacin directa o indirecta de los parsitos o alguno de sus componentes.

A. Clasificacin de los antgenos parasitariosLos antgenos de los parsitos se pueden clasificar segn la fuente de donde se obtienen para su estudio o aplicacin clnica y su naturaleza qumica. Los parsitos tienen ciclos de vida complejos con capacidad de reproducirse dentro del hospedero (protozoarios), o aquellos que maduran pero no se reproducen dentro del hospedero (helmintos). Esta diversidad de etapas o estadios que el parsito debe completar en su ciclo vital implica un cambio estructural, bioqumico y celular que se refleja en la diversidad de antgenos que se pueden presentar de acuerdo con las diferentes etapas de desarrollo, las cuales pueden ser concurrentes en un mismo hospedero, por lo cual un parsito puede expresar diferentes antgenos de diferentes estadios en un mismo hospedero.En consecuencia, la inmunidad despertada por estos antgenos por lo general es especfica de estadio. Debido a todo lo anterior, es importante, tanto para fines diagnsticos como de investigacin de la respuesta contra los parsitos, identificar su fuente u origen. Una clasificacin prctica de los antgenos parasitarios de acuerdo con su origen es la siguiente:a. Antgenos solubles extrados del parasito (somticos)b. Antgenos solubles excretados o secretadosc. Antgeno sintticod. Antgenos recombinantesLos antgenos somticos o estructurales son extrados del parasito; no son secretados por los parsitos, sino que forman parte estructural de ellos y se necesitan procedimientos de extraccin qumica para obtenerlos. Estos antgenos, a excepcin de aquellos presentes en la cutcula o membranas de superfino cie, pueden estar ocultos al hospedero y ser reconocidos solo por el sistema inmune despus de la muerte del parasito.Los antgenos solubles excretados o secretados al medio de cultivo son derivados de procesos metablicos del parasito, y fueron la fuente de antgenos de protozoarios, nematodos, cestodos, artrpodos y otros. Sin embargo, la concentracin de estos antgenos en el medio de cultivo de protozoarios o donde se mantienen helmintos regularmente es muy baja, por lo que se requiere cultivar o mantener grandes cantidades de ellos para obtener volmenes tiles de material antignico.Los antgenos sintticos se obtienen por sntesis qumica en un laboratorio cuando ya se conoce la secuencia de aminocidos del pptido o protena antignica contra la cual se dirige la mayora de los anticuerpos producidos por el husped. La fuente de antgenos sintticos es prcticamente inagotable, es reproducible y de costo relativamente bajo; sin embargo, su produccin est condicionada al conocimiento preciso de la secuencia de aminocidos de los antgenos.Los antgenos recombinantes son en general de naturaleza peptdica o proteica y se originan con tcnicas de DNA recombinante; para ello, el gen que codifica para un antgeno de un parasito se expresa en bacterias como E. coli o levaduras metilo trficas como Pichia pastoris. A partir de cultivos masivos en fermentadores se obtienen las bacterias recombinantes que producen o secretan el antgeno parasitario cuyo gen fue introducido artificialmente, y luego se realiza la purificacin, que puede incluir columnas de afinidad con anticuerpos. Tambin es posible clasificar a los antgenos, segn su composicin qumica, en protenas, glucoprotenas, glucolipidos y polisacridos y cidos nucleicos.B. Fundamento de las tcnicas inmunolgicas para estudiar antgenos parasitarios

1. REACCION DE PRECIPITINAS2. DOBLE DIFUSION3. INMUNOELECTROFORESIS

4. ELECTROSINRESIS: En el soporte empleado (gel) se disponen en forma encontrada la mezcla antignica y el suero en estudio, en el cual se espera encontrar los anticuerpos especficos. Se aplica corriente elctrica para acelerar el proceso. En la zona de interaccin se forma una banda de precipitacin. Es utilizada en el diagnstico de cisticercosis, fasciolosis e hidatosis.La desventaja de este mtodo radica en su baja sensibilidad y requiere para hacerse positiva entre 10 y 20 ug de anticuerpos por ml. Esta tcnica, adems, ha sido utilizada para la caracterizacin de fracciones antignicas parasitarias.5. REACCIN DE FLOCULACIN CON LATEXFue utilizada durante mucho tiempo como prueba de tamiz por su buena sensibilidad, rapidez y facilidad de ejecucin, especialmente en el diagnstico de enfermedad de Chagas, toxoplasmosis e hidatidosis. Pero sus problemas de especificad derivados de la mala estandarizacin en el tamao y la concentracin de las molculas de ltex (soporte del antgeno), han hecho que se discontine su empleo. 6. REACCIN DE FLOCULACIN CON BENTONITAUtiliza como soporte partculas de bentonita sensibilizadas con el antgeno, el cual al ponerlo en contacto con el suero del paciente reacciona evidencindose la reaccin como floculacin.Su mayor utilidad prctica se ha obtenido en el diagnstico de triquinosis. Debido a su buena especificidad y tarda sensibilidad (tres semanas pos infeccin) ha motivado su remplazo por mtodos de mayor precocidad en el diagnstico de la infeccin aguda por Trichinella spiralis 7. REACCIN DE FIJACIN DE COMPLEMENTOEsta antigua reaccin ha sido ampliamente utilizada en el diagnstico de las parasitosis. Consta de dos sistemas, uno de deteccin de los anticuerpos presentes en el suero del paciente (antgeno-complemento de cuy) y otro indicador de la reaccin antgeno-anticuerpo (hemolisina-glbulos rojos de cordero). La reaccin detecta fundamentalmente anticuerpos especficos fijadores del complemento, los cuales se unirn al antgeno y al complemento presente en el primer sistema; de esta forma, la reaccin indicadora no presentar hemolisis. La ausencia de anticuerpos en el suero del paciente, dejar en libertad el complemento que ser fijado por la reaccin indicadora apareciendo hemolisis.Debido a la gran cantidad de reactantes utilizados, se requiere de una gran estandarizacin del mtodo como tambin una serie de condiciones en el suero en estudio, ya que la anticomplementariedad de algunas muestras (sueros envejecidos, infectados, hemolizados o lipmicos), hace que las inmunoglobulinas desnaturalizadas y agregadas del suero, fijen inespecficamente el complemento, alterndose la discriminacin entre una reaccin positiva o negativa. Todo ello ha hecho que esta reaccin no sea utilizada en el diagnstico de rutina parasitolgica.8. REACCIN DE INMUNOFLUORESCENCIADebido a que anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes como el isotiocianato de fluoresceina, la aureamina-rodamina u otras no pierden sus capacidades inmunolgicas, pueden ser utilizadas para la deteccin del complejo antgeno-anticuerpo. La visualizacin de la reaccin se efecta a travs de un microscopio de luz ultravioleta, el cual mediante una longitud de onda especfica para cada fluorocromo lo excita y emite una luz fluorescente visible pticamente.El mtodo puede ser directo o indirecto, de acuerdo al nmero de anticuerpos marcados empleados. El ms frecuentemente utilizado es el mtodo indirecto, pues permite detectar anticuerpos de diversas clases (IgG, IgM, IgA, IgE) adheridos a antgenos de superficie.9. MTODOS INMUNOENZIMTICOS:La marcacin de protenas (antgeno o anticuerpo) con enzimas, tiene la ventaja de aumentar la sensibilidad de los mtodos que emplean este tipo de conjugados, pues la reaccin enzima-sustrato amplifica la visualizacin de la reaccin inmunolgica a travs del producto final cromognico. De acuerdo al tipo de producto obtenido, los mtodos se pueden clasificar en reaccin de ELISA cuando el producto es soluble y visible a simple vista o mediante lectura espectrofotomtrica, o inmunoenzimtico cuando el producto es precipitante y se visualiza en el sitio de reaccin. Reaccin de ELISA clsica. Como soporte del antgeno o de los anticuerpos se utiliza microplacas, tubos, esferas, discos de poliestireno o de polivinilo, las cuales son bloqueados con protenas no reaccionantes para evitar reacciones inespecficas. Posteriormente, se agrega la muestra en estudio, facilitando la produccin de la reaccin antgeno-anticuerpo. A continuacin de una serie de lavados, se utiliza un segundo anticuerpo marcado con la enzima, el cual se unir a la reaccin previamente formada. La visualizacin de la reaccin se observara a simple vista o mediante lectura espectrofotomtrica del producto coloreado formado por la accin de la enzima sobre el sustrato especfico. Desde su descripcin, este mtodo ha sido utilizado ampliamente en el diagnstico de parsitos debido a su alta sensibilidad. En la actualidad, debido a la utilizacin de antgenos insuficientemente purificados se han descrito reacciones cruzadas.

Reaccin de ELISA reversa o invertida. El mtodo trata de capturar inmunoglobulinas especficas presentes en baja concentracin en el suero en estudio. Para ello se inmoviliza la antiinmunoglobulina al soporte slido, haciendo posteriormente reaccionar la muestra problema, capturndose de esta forma la inmunoglobulina presente. Se revela la reaccin con un conjugado compuesto por el antgeno especfico unido a una enzima. Posteriormente, al agregar el sustrato se producir su degradacin y la formacin de un producto coloreado proporcional a la Ig especfica presente en la muestra con problema. Reaccin ELISA doble sndwich.Se puede aplicar para la deteccin de anticuerpos y de antgenos. Para los primeros, se sensibilizan las placas con una inmunoglobulina especifica anti-Ig, marcadora de infeccin aguda que detectar los anticuerpos especficos presentes en la muestra en estudio. Con posterioridad se agregara el antgeno especfico u la reaccin se detectara al utilizar un anticuerpo anti-antgeno especfico marcado con la enzima. Producida la reaccin antgeno-anticuerpo, se detectar por el producto coloreado producido al emplear el sustrato enzimtico especifico.Para la determinacin de antgenos se sensibilizarn las placas con anticuerpos mono o polivalentes anti-antgenos especficos, los cuales sern atrapados desde la muestra problema. Posteriormente, al agregar el anticuerpo especfico marcado con la enzima especfica, se producir la reaccin antgeno-anticuerpo, la cual ser detectada por el producto coloreado obtenido al agregar el sustrato enzimtico especifico.A pesar de que el empleo de anticuerpos monoclonales es estas tcnicas aumenta la especificidad del diagnstico, no son utilizadas rutinariamente, ya que la tecnologa de preparacin de los diversos reactantes, es muy sofisticada.

Dot inmunoensayo (Dot ELISA).Una serie de membranas (nitrocelulosa, inmuln, etc.) tienen la capacidad de fijar en forma no covalente a molculas proteicas, lipopolisacaridos, cidos nucleicos, etc., constituyentes de los antgenos parasitarios. De esta forma, al incubar estos soportes sensibilizados con el suero en estudio, se unirn los anticuerpos al antgeno, los cuales posteriormente son revelados por un mtodo inmunoenzimtico cuyo producto final es inmunoprecipitante.Este mtodo tiene la ventaja de utilizar pequeas cantidades de inmunorreactivos, de fcil almacenamiento y no necesita espectrofotmetro. Sin embargo, debido a que las mezclas antignicas que emplea son muy complejas y poco purificadas, sus resultados son inespecficos. Ha sido una tcnica altamente empleada en unin a otros mtodos, en el diagnstico de la hidatidosis, fasciolosis, cisticercosis y otras parasitosis.

Inmunoblot o inmunnoelectrotransferenciaDe gran utilidad para el estudio de mezclas inmugnicas complejas. Primeramente las separa mediante una electroforesis en geles de policrilamida en los constituyentes polipeptidicos que la conforman segn su peso molecular. Posteriormente, los polipeptidos son transferidos, mediante una electroforesis horizontal, a un soporte sensibilizado con la muestra problema. La reaccin antgeno-anticuerpo se visualizara mediante una reaccin enzimtica cuyo producto es precipitante. Este mtodo, de excelente especificidad, se utiliza rutinariamente como prueba confirmatoria.