Tcnicas en Bioqumica

Tcnicas enBioqumicaUniv. Ismar Romero.Univ. Jos Rojas.Univ. Kelvin Rojas.Univ. Victor Rojas.Grupo #03

Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la SaludEscuela de Medicina Dr. Witremundo TorrealbaCampus La MoritaProfa. Fabiola Sarco Lira.

Abril, 2013

ElectroforesisEs una tcnica para la separacin de molculas que se basa en la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo, en dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.Afecta la estructura de las protenas por lo tanto, tambin afecta a la funcin de la misma.Separacin, visualizacin y cuantificacin del numero de protenas de una solucin.VentajasDesventajasMovimiento inico en un campo elctricoDurante el proceso de migracin de una partcula cargada en un campo elctrico, dependiendo de la carga neta ocurrir lo siguiente:Si la partcula posee carga + se mover hacia el ctodo.Si la partcula posee carga se mover hacia el nodo.Si la partcula no posee carga no se mover

Electroqumica moderna, Volumen 1. John O'Mara Bockris

En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolcula es el potencial elctrico, E, expresada en voltios/cm.Principios de Bioqumica LehningerLa movilidad electrofortica de la molcula, , es el cociente entre la velocidad de la partcula, V, expresada en cm/seg, y el potencial elctrico.La movilidad electrofortica esta expresada en cm2 /(V)(s)La movilidad depende de la carga de la partcula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre.Proceso ElectroforticoElectroforesis libre:

ElectrodosProtenas disueltas en el bufferBuffer Una disolucin tamponada de la mezcla de protenas se coloca en una clula de observacin en forma de U.http://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpgElectroforesis de zona :

La disolucin a tratar se aplica como una mancha , o como una banda, y las partculas migran a travs del disolvente, utilizando adems un medio de soporte inerte y homogneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles.Bioqumica Christopher K. MathewsCmaras ElectroforticasCmaras horizontales

En la electroforesis de tipo horizontal generalmente, se trabaja con ADN o ARN.Cmaras verticalesEn la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas.

Medios de SoportePapelMtodo sencillo y rpido

Separacin de: ProtenasOligonucletidosCarbohidratosLpidosDesventajasSe desgarra fcilmenteDistorsiona las bandasSe produce interaccin entre las protenas y los grupos hidroxilo de la celulosa, por lo tanto la migracin se frena

Acetato de CelulosaSe usa en el anlisis de fluidos biolgicos

Tiempo de anlisis corto

Sencillez de la tcnica

Desventaja: Su dbil resolucinGran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilacin, por lo que no hay interaccin con las protenas.GelAlmidn Tcnica barata, fcil y rpida

Poliacrilamida

AgarosaSoporte mas usado en electroforesisDe alta resolucinSus componentes son txicosBuena resolucinSeparacin de molculas grandes con radio mayor a 5-10nm (virus, cidos nucleicos)Factores que afectan la ElectroforesisCarga netaTamaoIntensidad del campo elctricaTemperaturaMedio de soporteBuffer

Electroforesis en gel de poliacrilamidaQu es la poliacrilamida?

Polmero generado a partir de acrilamida y bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa para realizar electroforesis de macromolculas, en especial protenas y fragmentos de cidos nucleicos.

http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.htmlComo se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida? Primeramente se necesita el gel de poliacrilamida, quien funciona como filtro gracias a su estructura porosa.

http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/943905

http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspxComo se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida? Colocar las muestras en los pocillos.

Se aplican cargas elctricas

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html

http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electroforesis-monografia.htmlComo se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida?Aplicar un colorante tal como el azul de Coomassie.

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm

Electroforesis en gel de poliacrilamida en SDSEs otra tcnica electrofortica tambin aplicada en protenas en la que las mismas sufren desnaturalizacin.

SDS?De que habla?

El SDS (Dodecilsulfato sdico) es un compuesto desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.

Como se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS? Primero deben desnaturalizarse las protenas.

En presencia de SDS la protena:

http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mito-realidad.html

http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012/11/proteinas.html

http://cvclavoz.com/blog/paralelo/page/6/

http://bioquimica6ce.wikispaces.com/ProteinasComo se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS? Se colocan las muestras en los pocillos y se aplican las cargas elctricas.

Se visualizan aadiendo un colorante como el azul de Coomassie

http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/electroforesis-en-gel.html

http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biologia/tecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html

Electroforesis bidimensionalQu es?Es una tcnica para la separacin de mezclas complejas de protenas, ya que la misma permite la separacin y visualizacin de hasta 1.000 protenas diferentes en un solo gel.

Lehninger 5ta edicinSe incorpora una mezcla de anfolitos.

Cul es el procedimiento para la electroforesis bidimensional? Punto Isoelectrico Se establece un gradiente de pH.

Cul es el procedimiento para la electroforesis bidimensional?

Primera dimensin. pI decrecienteEl gel se coloca sobre un gel de poliacrilamida SDSSegunda dimensin

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDSPeso molecular decrecientepI decrecienteLehninger 5ta edicin Electroforesis en gel de agarosaEs una tcnica utilizada para fragmentos grandesde ADN.

Agarosa?La agarosa es un polmero de galactosa

http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196Cmo se lleva a cabo la electroforesis en gel de agarosa? Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con un buffer.

http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.htmlCmo se lleva a cabo la electroforesis en gel de agarosa?

http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-nucleicos.htmlCmo se lleva a cabo la electroforesis en gel de agarosa?

http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis/

La Espectrofotometra Es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoleculas, etc) y estado de agregacin (slido, lquido, gas)Principios de la EspectrofotometraTodas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.

29La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. En el proceso de absorcin de la radiacin, un fotn incidente cede su energa a una molcula, lo que da lugar a la excitacin de la misma que pasa a un nivel de energa superior.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. La frecuencia de la radiacin absorbida es proporcional a la diferencia de energa entre ambos niveles. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La espectrofotometra se basa en dos leyes que relacionan la absorcin de luz a una determinada longitud de onda con la concentracin del material absorbente y la longitud del camino que debe atravesar. Estas dos leyes, que combinadas resultan en la ley de Lambert-Beer

Espectro de absorcinRepresentacin grfica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud equivalente) en funcin de la longitud de onda de la radiacin, l, (o de otro parmetro relacionado con la energa de la radiacin utilizada).

Ley de Lambert BeerASPECTOS TERICOS La fotometraLa colorimetraLa espectrofotometraMedicin de luzLeyes de Lambert y BeerLuz monocromtica Lambert y Beer

relacionan

observandoLa medida de la absorcinEl espesor de la sustancia absorbenteLa cantidad de sustancia que absorbecrecimiento exponencial de la absorcin de radiacinespesor de la regin absorbenteEn Funcin dela cantidad de esa especieLey de Lambert:Medio absorbenteIntensidad transm.Ley de Lambert Beerla cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin

Agua con azcar disuelta.Agua con mayor cantidad de azcar.Ley de Beer: Sustancia absorbenteIntensidad trans.Ley de Lambert BeerLa cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luzAgua con azcar disuelta.Agua con azcar disuelta en un vaso con mayor dimetro.

Ley de Lambert BeerEstas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer: Relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado, relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin

http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-radiacion_11.htmlLey de Lambert BeerTransmitancia (T)Es la fraccin de radiacin incidente transmitida por la solucin

Si T se expresa en %,T % = 100 I/I0

T: I/I0Absorbancia (A)Es la fraccin de radiacin incidente absorbida por la solucin, expresada como

A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T

Si T se expresa en % A = log100/T% = 2 -logT%

La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia est directamente relacionada con las propiedades intrnsecas del analito, con su concentracin y con la longitud de la trayectoria del haz de radiacin al atravesar la muestraLey de Lambert BeerA = C . . L : Absortividad molarEs una propiedad de la materia relacionada nicamente con la naturaleza de la misma.

a cuando la concentracin est en mg/L cuando la concentracin est en mol/L

L: Trayectoria de la radiacin a travs de la muestra (cm)

C: Concentracin (mg/L mol/L)

expbasquimica-g1-zb-09-10.wikispaces.com

Skoog, D. A.; West, D. M.;Holler, F. J.; Crouch,S. R. FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA. Absorcin dela luz.MacGraw Hill: Mxico.

Skoog, D. A.; West, D. M.;Holler, F. J.; Crouch,S. R. FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA. Absorcin dela luz.MacGraw Hill: Mxico.Ley de Lambert BeerUna disolucin 100 M de un determinado cromforo tuvo una transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midi en una celda 1.5 cm de longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolucin; b) la absorptividad molar del cromforo.

A = -log T = - log 0.5 = 0.301

b) A = C . . L Reordenando la ecuacin obtendremos: = A/(C . L) = 0.301 /(10-4M x 1.5 cm) = 2 x 103M-1cm-10,50,01% Concentracin % Transmitancia

Nadie puede volver atrs y comenzar de nuevo. Pero cualquiera puede comenzar hoy mismo y hacer un nuevo final, no te rindas.

Annimo