tecniche cromatografiche
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TECNICHE CROMATOGRAFICHE
Le tecniche cromatografiche permettono di separare gli analiti presenti in una miscela complessa.
Tutti i sistemi cromatografici sono costituiti da una fase stazionaria, che
puo’ essere un solido, un gel, un liquido o una miscela solido/liquido ed e’
immobilizzata, ed una fase mobile, che puo’ essere liquida o gassosa e fluisce
sopra od attraverso la fase stazionaria.
IL CROMATOGRAMMA
Rappresentazione illustrata della risposta del rilevatore in funzione del tempo o del
volume di eluizione. Consiste in una serie di picchi, che rappresentano l’eluizione dei
singoli analiti.
IL CROMATOGRAMMA
Tempo di ritenzione (tR)
Tempo impiegato da ciascun analita per uscire dalla colonna.
Il tR ha due componenti: il tempo morto (tM), cioe’ il tempo necessario per passare attraverso gli
spazi liberi nella matrice della fase stazionaria, ed il t’R, cioe’ il tempo in cui l’analita e’
trattenuto dalla fase stazionaria. Quindi, il tempo di ritenzione adattato e’:
t’R = tR-tM
Volume di eluizione o di ritenzione (Vr)
Volume richiesto per eluire l’analita
Fattore di capacita’ (k’)
Indica il tempo relativo che occorre all’analita per eluire dalla colonna, in relazione ad un analita non trattenuto (o escluso), che non
interagisce con la fase stazionaria e che, per definizione, ha un k’ pari a 0. Per cui si ha:
k’ = (tR – tM )/ tM = t’R/ tM
Il fattore di capacita’ (k’) e’ correlato al coefficiente di distribuzione (Kd) dell’analita. Poiche’ la quantita’ e la
concentrazione sono in relazione con il volume, si puo’ scrivere:
k’= Kd x VS/VM
dove
VS e’ il volume della fase stazionaria
VM e’ il volume vuoto o spazio morto
Fattore di separazione (a)
E’ una misura della capacita’ intrinseca del sistema di discirminare tra due analiti. Tale
fattore puo’ essere espresso come :
a = k’A/k’B = t’RA/t'RB
Efficienza della colonna e risoluzione
Si ritiene che le colonne cromatografiche consistano in un numero (N) di zone
adiacenti, in ciascuna delle quali c’e’ lo spazio sufficiente per equilibrare
completamente l’analita tra le due fasi. Ogni zona e’ detta piatto teorico. La
lunghezza della colonnna contenente un piatto teorico e’ detta altezza del piatto
(H), generalmente misurata in micrometri.
Il numero dei piatti teorici e’ :
N=L/H [1]
dove L e’ la lunghezza della colonna
Vale anche la relazione: N = 5.54[(tR – tM)/w1/2]2
Se si considera la posizione di un picco, la [1] puo’ essere espressa come:
N=16L2 /w2 [2]
dove w e’ la larghezza della base del picco in oggetto
Inoltre, si definisce l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP) come
HETP = L/N
La risoluzione e’ definita come il rapporto della differenza nel tempo di ritenzione tra
i due picchi ed il valore medio delle loro larghezze di base (wav):
RS = 2(tRA – tRB)/(wA – wB) = tR/ wav [3]
La risoluzione e’ influenzata da: - efficienza del sistema - fattore di selettivita’ - fattore di capacita’
di conseguenza, la [3] puo’ essere scritta come:
RS = (N-2/4) x (a-1/a) x (k’2/1-k’av) [4]
dove k’2 è il fattore di capacita’ per il picco trattenuto piu’ a lungo k’av è il fattore di capacita’ medio per i due analiti
– Equazione di van Deemter per la risoluzione
Rs = ½ x (a-1/a+1) x k’2/1+k’2x (L/h)1/2 [5]
Dove: a – fattore di selettività (separazione)
a = tR1/tR2
k’ – termine di migrazione, fattore di capacità;
L – lunghezza della colonna
h – altezza piatto
LA MATRICE
La matrice e’ il materiale che viene utilizzato per fornire un supporto
alla fase stazionaria
CARATTERISTICHE
- Elevata stabilita’ meccanica
- Presenza di gruppi funzionali
- Elevata capacita’
- Pori di dimensioni e forma controllata
- Superficie inerte per ridurre l’assorbimento non selettivo degli analiti
TIPI DI MATRICE
AGAROSIO
CELLULOSA
DESTRANO
POLIACRILAMMIDE
POLISTIRENE
SILICE
SISTEMI CROMATOGRAFICI
SCELTA DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO
CROMATOGRAFIA SU COLONNA
La fase stazionaria e’ attaccata ad una matrice adatta ed impaccata all’interno di
una colonna di vetro o metallo. La fase mobile viene fatta passare nella colonna
per gravita’.
La cromatografia liquida su colonna
si divide in:
- Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC, low pressure liquid chromatography)
- Cromatografia liquida a media pressione (MPLC, medium pressure liquid chromatography)
- Cromatografia liquida ad alta pressione [o meglio prestazione] (HPLC, high pressure [performance] liquid chromatography)
Schema di un sistema per HPLC
APPLICAZIONI
Separazione di ormoni, droghe, farmaci, amminoacidi, zuccheri, oligopeptidi e proteine.
CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO
Questo processo coinvolge forze di interazione deboli, come le forze di Van
der Waals ed i legami idrogeno. Il fenomeno si verifica solo in corrispondenza
di specifici siti di adsorbimento.
Tipologie di cromatografia di adsorbimento
- Cromatografia su idrossiapatite
- Cromatografia per interazione idrofobica
I solventi vengono scelti in base alle caratteristiche degli analiti
- Alcoli, se gli analiti contengono gruppi idrossilici
- Acetone o Esteri, se gli analiti presentano gruppi carbonilici
- Idrocarburi, per analiti non polari.
CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE
Questa tecnica dipende dai coefficienti di
distribuzione (Kd) ed utilizza fasi
stazionarie e fasi mobili liquide.
Tipologie di cromatografia di partizione
- Cromatografia liquida in fase normale - Cromatografia liquida in fase inversa - Cromatografia liquida in fase inversa per
accoppiamento ionico - Cromatografia chirale - Cromatografia controcorrente
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Si basa sull’attrazione tra particelle di carica opposta. Le separazioni a scambio ionico vengono effettuate su colonne impaccate
con uno scambiatore ionico.
SCAMBIATORI IONICI (1)
- Scambiatori anionici o basici:
molecole con gruppi carichi positivamente che legano molecole anioniche (cariche negativamente)
- Scambiatori cationici o acidi:
molecole con gruppi carichi negativamente che legano molecole cationiche (cariche positivamente)
SCAMBIATORI IONICI (2)
- Scambiatori forti:
sono completamente ionizzati a tutti i valori di pH; sono i gruppi solfonato e le ammine quaternarie
- Scambiatori deboli:
sono ionizzati solo in un ristretto intervallo di pH; sono i gruppi carbossilici e dietilammonio
Il meccanismo di scambio ionico si basa su cinque passaggi:
1. Diffusione dello ione sulla superficie di scambio
2. Diffusione dello ione attraverso la matrice fino al sito di scambio
3. Scambio di ioni al sito d’interazione 4. Diffusione dello ione scambiato fino alla
superficie 5. Distacco selettivo dello ione scambiato ad
opera dell’eluente e diffusione della molecola nell’eluente esterno.
Schema di una cromatografia a scambio ionico
Nella resina scambiatrice di cationi(o anioni) il catione (o anione)
presente nella msicela viene legato al posto degli ioni del tampone
con cui era stata equilibrata la colonna.
CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE (o gel filtrazione)
La separazione delle molecole, sulla base della loro dimensione molecolare e della forma, utilizza le
proprieta’ del setaccio molecolare di una varieta’ di materiali porosi.
Vt = V0 + Vi [5]
dove Vi e’ la somma del volume interno dei
granuli di resina V0 e’ il volume morto Vt e’ il volume totale occupato dalla resina
rigonfiata dal solvente
La distribuzione dell’analita nella colonna dipende dal volume totale di fase mobile disponibile. Per un dato gel, il fattore di distribuzione Kd di un particolare analita dipende dalle sue dimensioni molecolari.
Kd = Ve-V0/Vt-V0 [6]
Kd = 0 molecola grande
Kd = 1 molecola piccola
APPLICAZIONI
Purificazione delle macromolecole biologiche Determinazione della massa molecolare
relativa Dissalazione Studi proteina-ligando Concentrazione delle soluzioni
CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
Questa tecnica si avvale dell’estrema specificita’
delle interazioni di riconoscimento
molecolare, per ottenere la separazione e la purificazione delle
molecole.
Tipologie di cromatografia di affinita’
- Cromatografia di affinita’ con lectine
- Cromatografia di immunoaffinita’
- Cromatografia con chelanti di metalli
- Cromatografia con ligandi colorati
- Cromatografia covalente
Schema di purificazione di un enzima
CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE
Tecnica che permette di migliorare la risoluzione delle separazioni per partizione
ed adsorbimento.
Il materiale che deve essere separato viene posizionato
sotto forma di macchia in un angolo della lastrina, che viene sviluppata e, quindi, rimossa dal contenitore e fatta seccare. In seguito viene sviluppata con un
secondo sistema di solventi, per i quali i composti da
separare hanno diversi valori di Kd.
CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO (GLC o GC)
Si basa sulla ripartizione tra una fase liquida ed una gassosa. Le colonne utilizzate sono capillari di vetro o metallo con diametro interno tra 0.03 e 0.1 mm e lunghe fino a
100 metri.
Schema dell’apparato per GC
Fase Stazionaria
E’ un liquido ad alto punto di ebollizione
Puo’ essere :
- fase stazionaria selettiva, che sfrutta le caratteristiche chimiche dei componenti
- fase stazionaria non selettiva, che sfrutta i diversi punti di ebollizione
E’ costituita da un gas inerte come azoto, elio oppure argon
Fase Mobile
Sistemi di rilevazione
- Rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID)
- Rivelatore a cattura di elettroni (ECD)
CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE
La fase stazionaria, legata ad una matrice adatta, si trova stratificata su una superficie di vetro,
plastica o metallo. La fase mobile liquida passa per capillarita’ sul sottile strato di materiale, in
posizione orizzontale o verticale.
Il movimento dell’analita e’ caratterizzato dal suo fattore di ritardo, Rf.
Rf = distanza percorsa dall’analita
distanza percorsa dal solvente
Sistemi di rilevazione
- Esame della lastrina sotto luce ultravioletta, per composti che assorbono nella zona dell’ultravioletto o fluorescenti
- Esame della lastrina sootoposta ad autoradiografia
- Esame della lastrina mediante l’uso di agenti specifici.