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Tecniche di estrazione-preconcentrazione

• Spazio di testa statico (HS)

• Spazio di testa dinamico (purge & trap)(PAT)

• Estrazione in fase solida (SPE)

• Micro-estrazione in fase solida (SPME)

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Processo di estrazione che coinvolge un liquido ed una fase solida

L’obbiettivo è:ritenere l’analita sulla fase solida

o eluirlo rapidamente

ESTRAZIONE SU FASE SOLIDA (SPE)

SPE

Approccio più utilizzatoA) Il campione passa attraverso un

piccolo volume di fase stazionariasolida impaccata in una cartuccia.

B) Il soluto è trattenuto, le interferenze passano attraverso la fase o sono successivamente lavate via.

C) Il soluto viene eluito dalla fase utilizzando un piccolo volume di solvente.

B C

A) Il campione passa attraverso un piccolo volume di fase stazionariasolida impaccata in una cartuccia.

B) Il soluto passa non trattenuto attraverso la fase.

AB

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Questa procedura si basa sugli stessi principidella ritenzione in cromatografia liquida, cioè:� l’adsorbimento� l’affinità� l’esclusione molecolare� lo scambio ionico

La tecnica si adatta quindi al recupero dimicrocomponenti di polarità bassa, media edelevata in funzione del tipo di adsorbenteutilizzato.

Principi

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Rappresentazione del meccanismo di “Adsorbimento"

Fase mobile(liquido o gas)

Siti attivi Fase stazionaria

* * * * ****

La fase stazionaria deve contenere dei siti attivi capaci di dar luogo adinterazioni con il soluto che portano ad un suo adsorbimento .

Tali interazioni sono del tipo:- Legami idrogeno- Interazioni dipolo-dipolo- Forze di Van der Waals

Rappresentazione del meccanismo di “Scambio ionico” Rappresentazione del meccanismo di “Scambio ionico” (esempio di resina a scambio anionico).(esempio di resina a scambio anionico).

La fase stazionaria La fase stazionaria èè costituita da:costituita da:

c) matrice polimerica (es copolimero stirenec) matrice polimerica (es copolimero stirene--divi nilbenzene) su cui sono divinilbenzene) su cui sono legati dei gruppilegati dei gruppi--funzionalifunzionalib)b)dotati di carica elettricadotati di carica elettricaa) a) portanti il controioneportanti il controione. .

�� LL ’’anione (campione) presente nella fase mobile anione (campione) presente nella fase mobile sostit uiscesostituisce uno dei uno dei controioni della resina. controioni della resina.

�� Facendo passare il controione originario in elevat a concentrazione o Facendo passare il controione originario in elevat a concentrazione o un diverso anione piun diverso anione pi ùù affine al gruppo funzionale si ottiene lo affine al gruppo funzionale si ottiene lo spostamento dello ione campione.spostamento dello ione campione.

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Fase stazionaria (granuli di gel)

Molecole del campione

Fase mobile

Rappresentazione del meccanismo diRappresentazione del meccanismo di ““Esclusione molecolareEsclusione molecolare ””

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel (idrofilo) car atterizzato da pori didimensioni variabili, scelte a seconda del tipo di molecole da separare.

� Nella cromatografia di esclusione, i componenti di un campi one vengonoseparati in base alle dimensioni delle molecole .

� Le molecole di piccole dimensioni sono rallentate perché penetrano all’internodei pori della fase stazionaria e ne restano intrappolate pe r la maggior parte deltempo.

� Le molecole che hanno dimensioni significativamente maggi ori delladimensione media dei pori dell’impaccamento ne restano esc luse e nonsubiscono alcuna ritenzione; ossia esse viaggiano attrave rso la colonna allavelocità della fase mobile.

1) La fase stazionaria è costituita da una matrice insolubil e a cui ècovalentemente legato un adatto ligando.

2) Nel passaggio della miscela, si legano all’adsorbente so lo lemolecole con un sito di legame specifico per il ligando; le al trefluiscono via.

3) Durante l’eluizione (con una fase mobile diversa) invece , gli analitisi staccano dalla colonna e si raccolgono le molecole che era norimaste legate.

Rappresentazione del meccanismo di “Affinità”

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Riassumendo

Si sfrutta la distribuzione dell’analita tra una fase liquid a

S(liq.), ed una fase solida (S) insolubile nella soluzione

con la quale è posta a contatto.

S(liq.) S

Il campione in soluzione è fatto fluire attraverso una

colonna impaccata con un adsorbente solido. Dopo il

contatto per un tempo opportuno , il soluto, che è

rimasto ancorato alla fase solida, può essere recuperato

utilizzando piccoli volumi di un’opportuna soluzione

estraente.

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L'estrazione in fase solida (SPE) è una tecnica di preparazione del campione usata

per isolare (purificazione) e/o per concentrare (arricchimento) gli analiti di

interesse.L'ampia scelta di fasi adsorbenti e delle

dimensioni delle colonnine rende possibile ottimizzare tale tecnica in funzione del

problema specifico dell'utilizzatore.

� Risulta essere un efficiente metodo di pre-concentrazione necessario per i metodi analitici in tracce;

� adatto a tutti i tipi di campione;

� riduce il consumo di solventi (minore nocività per l’operatore, minori costi per lo smaltimento);

� migliora l’efficienza, produce un campione;

relativamente pulito in quanto praticamente scevro da

interferenti, adatto per l’analisi in TLC, GC e in HPLC;

� possibilità di rigenerazione e quindi di riutilizzo de lla

fase solida;

� possibilità di automazione.

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Contenitori in polipropilene o in teflon (tetrafluoroetilene -se è richiesto un rilascio di composti organici pari a zero) a forma di siringa (tipo usato in ambito sanitario) con setti porosi per trattenere il materiale adsorbente.

Serbatoio del campione

Estraente in fase solida

Setto vetro poroso

Colonnine preconfezionate per estrazioni SPE

Setto vetro poroso

Materiale adsorbente di varia natura di solito:

Quantità: 50 - 100 - 200 - 500 mg o 1 g

Dimensioni particelle: 40-50 µm

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La colonna viene lavata, cioècondizionata, con lo stessosolvente che verrà utilizzato pereluire l’analita impiegando unvolume corrispondente a 5-10 volteil volume della fase stazionaria.

Solvente di condizionamento es:

Sequenza delle operazioni per l’SPE

(a)

L'analita + matrice viene caricatoin colonna con un solventeappropriato (a basso potereeluente) incapace, cioè, di fareluire dalla colonna gran partedei componenti il campione.

(b)

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La colonna viene “lavata” con uno o più solventi che faranno eluire le

impurezze lasciando l'analita in colonna(o VICEVERSA).

Questo passaggio richiede una buona conoscenza delle proprietà chimico-

fisiche dell'analita, della matrice e dell'adsorbente.

(d) �(c) (e)

L'analita viene eluito con una piccola quantità di un appropriato solvente.

Riassumendo

�

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Composizione della fase

mobile

Fattori principali che influenzano la selettività dell’isolamento dell’analita

Tipo di materiale (FASE) che costituisce l’impaccamento della

cartuccia

Questo parametro è quello che

maggiormente influenza la

selettività e l’efficienza della

separazione.

Miglioramento di selettività limitato : - dal potere eluente del solvente- dalla solubilità della sostanza da determinare.

Capacità di carico degli adsorbenti pari generalmente all' 1- 5 % della loro massa (per una cartuccia di 100 mg la capacità è pari a 1- 5 mg).

Velocità di flusso

Una velocità di flusso TROPPO ELEVATA non lascia tempo sufficiente al raggiungimento dell'equilibrio tra la fase estraente e il solvente che scorre attraverso essa. Il solvente, quindi potrebbe passare attraverso la matrice senza entrare in contatto con l'intera sua superficie.

Matrici del campione sporche potrebbero comportare una riduzione della capacità di carico per il campione nei gel non selettivi. Ad esempio se per estrarre un campione da una matrice contenente grandi quantità di materiali lipofili utilizziamo una quantità di gel ottadecile piccola, la capacità del gel potrebbe essere superata.

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ADSORBENTI NATURALI (Carbone ed Allumina)

NERI di CARBONE GRAFITATO (Graphitized Carbon Black) (GCB)

RESINE POLIMERICHE

GEL DI SILICE e GEL DI SILICE MODIFICATI

GEL di IMMUNOAFFINITA’

POLIMERI A STAMPO MOLECOLARE (Molecularly Imprinted Polym ers -

MIPs)

PRINCIPALI ADSORBENTI UTILIZZATI IN SPE

Nei gel di silice modificati (derivatizzati) si distinguono le seguenti fasi:

- A SUPERFICIE POLARE (SPE a FASE DIRETTA O NORMALE )

- A SUPERFICIE APOLARE (SPE a FASE INVERSA)

- CON SITI CARICHI (SPE a SCAMBIO IONICO)

I materiali attualmente in uso sono a fase chimicamente legata al

supporto di gel di silice.

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GEL DI SILICE MODIFICATI A SUPERFICIE POLARE (SPE A FASE DIRE TTA ONORMALE )

Questi gel di silice trattengono gli analiti attraverso interazioni tra gruppi polari.

Fasi polari con gruppi NH 2,adsorbono composti organici con gruppi funzionali acidi e basici.

Il lavaggio della colonna viene spesso effettuato con un solvente organico di modesta polarità, come il cloruro di metilene privo di alcol.

I composti polari sono quindi eluiti con metanolo o miscele di metanolo e tampone acido(per i composti basici) o metanolo e tampone basico(per i composti acidi).

5-Fluorouracile

Fenilefrina

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La fase desiderata viene legata ai gruppi reattivi silanolici (Si-OH) della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro).

L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile.

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

SiH3C

Cl CH3

SUPPORTO SILICEO

GEL DI SILICE MODIFICATI A SUPERFICIE APOLARE (SPE A FASE INVERSA)

Molti dei silanoli superficialinon reagiscono a causadell’ingombro sterico. I silanoliche non reagiscono sonospesso chiamati “silanoliliberi”. Questo fenomeno ètanto più rilevante quantomaggiore è l’ingombro dellegante(es. C18).

SiH3C

CH3Si

H3C

CH3

SiH3C

CH3

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

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I silanoli liberi sono disponibili peraltre interazioni con le molecole disoluto, spesso indesiderate (sonocausa dei picchi scodati). Vienequindi spesso effettuato unprocesso di end-cappingutilizzando un silano di piccoledimensioni che si lega ai silanoliliberi. Piccoli silani come iltrimetilclorosilano sono ingrado di accedere a molti deisilanoli liberi rimasti dopo illegame della fase stazionaria. Ilprocesso di end-capping rende isilanoli inaccessibili allemolecole di soluto.

DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (ENDEND--CAPPINGCAPPING))

SiH3C

CH3Si

H3C

CH3

SiH3C

CH3

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

Si

CH3 CH3

CH3Cl

I gel di silice lipofili trattengono i composti apolari o poc o polaripurché essi siano nella forma non ionizzata, attraverso int erazioni divan der Waals

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FASI NON COMPLETAMENTE RIVESTITE:È possibile comprare dei gel di silice a fase inversa con un al to grado diderivatizzazione in cui la maggior parte dei residui silano lici è stata bloccata.Potrebbe, a volte, anche essere preferibile sfruttare l'in sieme delle proprietàlipofile ed adsorbenti di fasi inverse che non siano stati de rivatizzati in modospinto (endcapped).In queste ultime ci sono in superficie, dei gruppi silanolic i polari ancora liberi.Nel caso delle ammine potrebbe verificarsi un tipo di intera zione polare con igruppi silanolici non derivatizzati sulla superficie dei g el di silice lipofili

Quanto più è ridotta la lunghezza della catena alchilica sul lasuperficie del gel di silice tanto più è probabile che anchel'adsorbimento rivesta un ruolo nell'estrazione.

Colonne SPE non-polari

Le colonnine SPE con meccanismo di ritenzione non polare sono usate soprattutto per estrazioni di composti organici da matrici acquose.

I prodotti non-endcapped presentano interazioni secondarie che li rendono particolarmente indicati per estrazioni di composti basici o altri analiti polari da matrici acquose.

I prodotti endcapped sono indicati per applicazioni dove le interazioni secondarie con i gruppi silanolici non sono richieste

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Con questi gel di silice si hanno Interazioni di scambio ionico tra analiti con gruppi carchi (-) o (+) e gruppi funzionali di segno opposto dell’adsorbente.

Dimetilaminopropil

Aminopropil

Solfonilfenilpropil

Carbossipropil

GEL DI SILICE MODIFICATI - CON SITI CARICHI (SPE a SCAMBIOIONICO)

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Adsorbenti di AFFINITA’ sono costituiti da LIGANDI immobilizzati solitamente su polisaccaridi quali ad es. cellulosa, agarosio o agarosio-acrilammide, che hanno un'elevata affinità per un particolare analita.

GEL di IMMUNOAFFINITA’

Le braccia a forma di Y si legano in modo altamente specifico all’analita

In tale ambito, si sfrutta ad esempio il legame selettivo tra:� un enzima e il suo substrato

� ormoni e recettori

� antigeni e anticorpi (in

questo caso si usa il termine

immunoaffinità).

Nel caso di gel di immunoaffinità è stata indotta la produzione di anticorpi per un particolare analita; tali immunoglobuline sono poi legate alla superficie di una matrice SPE.

Vari tipi di manipolazione chimica permettono questo tipo di immobilizzazione e la SPE, nonché la cromatografia di affinità, si è ben affermata in ambito biochimico.

GEL di IMMUNOAFFINITA’

Le braccia a forma di Y si legano in modo altamente specifico all’analita

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I polimeri a stampo molecolare (MIPs) sono resine sintetiche altamente ramificate che presentano al loro interno siti selettivi per il riconoscimento molecolare.

Vengono sintetizzati in modo abbastanza semplice lasciando polimerizzare i monomeri funzionali in presenza di una molecola modelloper la quale i componenti del polimero hanno una certa affinità e che agisce da stampo.

Quando il modello viene rimosso, sul polimero rimane “impressa” la forma della molecola modello e di eventuali gruppi funzionali ad essi legati che sono in grado di legare le molecole bersaglio, composti con struttura uguale o molto simile a quella usata come stampo.

Il comportamento di questi polimeri è simile a quello degli anticorpi, per questo sono anche definiti “anticorpi sintetici ”.

POLIMERI A STAMPO MOLECOLARE (Molecularly Imprinted Polymers - MIPs)

il polimero lega di preferenza la molecola modello originale.

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VANTAGGI

� possono essere rigenerati e riutilizzati senza diminuire le proprie capacità anche dopo un uso prolungato;

� possibilità di analizzare un carico maggiore di campione grazie all’elevata densità dei siti di legame, di alcuni ordini di grandezza superiore a quella degli anticorpi usati come immuno-adsorbenti;

� i siti di legame incorporati nella matrice solida sono in grado di resisterein condizioni ambientali anche molto difficili (temperature e pressionielevate, soluzioni non acquose e pH estremi).

� possibilità di ottenere un maggior recupero di analiti, di abbassare i limiti di rilevamento, l’elevata stabilità, la maggiore selettività, la possibilità di lavorare con solventi organici e il basso costo di produzione, rendono questo approccio molto promettente rispetto agli attuali protocolli per SPE.

La caffeina viene eluita insieme al solvente CHCl3

L’aggiunta di un piccolo volume di CH3OH al solvente causa la rottura dei ponti idrogeno tra teofillina e il polimero e fa eluire la teofillina.

Separazione di Teofillina e Caffeina mediante una colonna SPE contenente un polimero con l’impronta della teofillina.

Anche gli isomeri ottici possono essere separati facendoli passare attraverso un polimero a stampo molecolare per il quale si è impiegato come molecola modello uno degli isomeri ottici.

1,3,7-trimetilxantina 1,3-dimetilxantina

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Adsorbente in fase solida

Soluzione del campione

Aspirazione

COLLETTORE DA VUOTO

CONDIZIONI SPERIMENTALI: SPE DI IPA

� SOLVENTE DI CONDIZIONAMENTO E DI ESTRAZIONE:

Cicloesano per HPLC

� CARTUCCIA ADSORBENTE: Florisil (MgO SiO 2·H20)

ADATTAMENTO DELLA SPE ALLA AUTOMATIZZAZIONE

per l’esecuzione di estrazioni in parallelo

Gli elementi essenziali del sistema sono i seguenti:(i) Un solvente di bassa forza trasporta il campione (linea 1 ) e fa in modo

che esso sia trattenuto alla testa di una colonna estrattiva di

Questa colonna potrebbe essere� non polare, laddove sia richiesta la rimozione di impurezze polari prima della cromatografia o � polare, se invece è necessaria la rimozione di sostanze lipofile .

Le sostanze indesiderate fuoriuscitie dalla colonna vanno allo scarico (linea 1)

Adattamento della SPE alle tecniche di estrazione a utomatizzata on-line

a monte dell'analisi HPLC

preconcentrazione.

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(ii) Il campione viene recuperato dalla colonna di estrazion eutilizzando per il flusso di ritorno lo stesso solvente che e rastato usato per caricarlo, in tal modo finisce intrappolato allatesta della colonna cromatografica (linea 2)

(iii) Il campione viene eluito con la fase mobile HPLC (linea 3)

Membrane SPE , per campioni di acqua di grandidimensioni (superiori a 10 L) si possono usare membrane lacui fase adsorbente è costituita da politetrafluoroetilene(PTFE) legato con silice e altre resine in un filtro di 0,5 mmdi spessore.

Membrane SPE

La membrana a forma di disco sottile è montata all’interno di una struttura di plastica fissata sulla punta di una siringa.

Per eseguire l’estrazione si costringe la soluzione che si trova all’interno della siringa a passare attraverso la membrana.

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� Rapida preparazione del campione.

� Elevato recupero di analiti senza formazione diemulsioni. Sebbene i recuperi siano generalmentebuoni, in questo tipo di analisi probabilmente èpreferibile utilizzare uno standard interno per valutare (equindi compensare il dato analitico) le eventuali perditeper assorbimento irreversibile nel mezzo di estrazione.

� La fase solida è immiscibile con i solventi e perciò,dopo aver caricato il campione, può essere utilizzatatutta una serie di condizioni di lavaggio per rimuovere icomponenti interferenti, avendo a disposizioneun'ampia gamma di solventi di lavaggio.

Vantaggi Estrazione in fase solida (SPE) rispetto all'estrazione liquido/liquido

� La natura chimica dell'adsorbente può essere variatain modo tale che esso sia selettivo per un particolaregruppo funzionale dell'analita.

� Un campione diluito in un grande volume disoluzione può essere intrappolato nella colonna(inchiodato) e così concentrato.

� Sono necessari soltanto piccoli volumi di solventesia per il lavaggio sia per l'eluizione (risparmio disolventi tossici e di materiale).

� Il costo delle colonne può essere ammortizzatorisparmiando nell'acquisto e nello smaltimento delsolvente.

� Possibilità di automazione dell’intero processo

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ESEMPI APPLICAZIONI SPE

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Fenoli analizzabili

FENOLI

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SOLFANILUREE

ERBICIDI AZOTATI