Medicina Psicología Odontología Enfermería

Lic. ORLANDO GRANADOS MEJÍA

ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN CELULAR

ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN CELULAR

La técnica del ADN recombinante se utiliza en:

estudios sobre la regulación de la expresión génica

En la regulación de la producción comercial de síntesis deproteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento

En el desarrollo de organismos transgénicos

en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran númerode copias de un gen determinado. En este último caso, existe unatécnica mejor, denominada con las siglas PCR (REACCIÓN ENCADENA DE LA POLIMERASA )

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LAPOLIMERASA ). TECNICA

• consiste en introducir el gen seleccionado en elinterior de un vector y éste, a su vez, dentro deuna célula, denominada célula anfitriona.

• Aprovechando la maquinaria celular, el gen seexpresa, sintetizándose así la proteínacodificada en el gen. Además, al dividirse lacélula, las nuevas células formadas contienenese gen que también sintetizan esa proteína.

• Se genera un grupo celular que contiene ungenoma distinto

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.

•Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).

•Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN.

•El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción.

•Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida o por centrifugación.

Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores

de la expresión génica.

1.PREPARACIÓN DE LA SECUENCIA DEL ADN PARA SU CLONACIÓN

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar.Un vector debe presentar las siguientes características:

•Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.

•Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.

•Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.

•Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.

Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y

seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador

puede ser la resistencia a un antibiótico.

2.Preparación de un vector de clonación

1.Cortar el vector con enzimas de restricción, las

mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN

que se quiere insertar.

2.Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante

los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o

escalonados.Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector sedenomina ADN inserto, o simplemente, inserto.

Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser

plásmidos, virus como el fago l, cromosomas creados

de forma artificial.

Las etapas del proceso

En esta etapa se produce la unión covalente

del vector y el ADN inserto mediante una

ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada

Mella, Muesca o Nick.

3. Formación del ADN recombinante

Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.Los tipos de células anfitrionas son:

•Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo costo de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.

•Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:

•Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.

Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.

4. Introducción del ADN recombinante en la célula

anfitriona

Se induce la división de células anfitrionas, de formaque se producen también copias de ADNrecombinante y, por ello, la clonación.

Primero se efectúa una siembra en placas Petri conagar como medio de cultivo.

Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas seráseleccionada y transferida a distintos medioslíquidos, donde seguirá aumentando el número deindividuos de la colonia.

5.Propagacióndel cultivo

En los procesos de clonación se utiliza un gran número decélulas. Al final del proceso se hace necesario separar las célulasque contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.

La detección y la selección de colonias se realiza en los medios decultivo.

En los procesos de clonación se obtienen:

células anfitrionas que no han incluido el vector,

células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar,

y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto.

6. Detección y selección de los clones recombinantes

Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada quehibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que setranscribe a partir de él.

Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en elADN recombinante mediante anticuerpos específicos.

Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser:

Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen dela célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si lacolonia no produce enzima lactasa, es que el ADNrecombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en esegen.

métodos para detectar y seleccionar