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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE?
• El término ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural.
• La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus.
¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES?
• Aplicaciones en investigación y medicina - Producción a gran escala de proteínas de utilidad médica - Animales transgénicos - Terapia génica
• Aplicaciones industriales• Aplicaciones en agricultura - Mejora genética de los cultivos - Nuevos insecticidas naturales
2 FUNCIONES BÁSICAS
• CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN• EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR
EL GEN DE INTERÉS)
¿Y CÓMO SE HACE?
2 ELEMENTOS ESENCIALES
• SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS • VECTOR
VECTORES
1. Plásmidos
• Inserción de hasta 10kb• Sistema más común
2. Fagos
• Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb)• Tipo I (T1, capacidad 23kb)• Lamba (capacidad 25kb)•P1 (capacidad 100 kb)
3. Cósmidos
• Capacidad de 44kb• Plásmidos con sitios cos
Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA
4. BAC • Capacidad de 300kb• Cromosoma artificial de bacterias
Células Huésped
GRAM NEGATIVASGRAM NEGATIVAS (E. coli,
P.aeruginosa)
GRAM POSITIVASGRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis,
S.aureus, Streptommyces)
Levaduras
Células mamíferas
Bacterias
Saccharomyces cereviseae,Pichia pastoris, etc.
Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster)
1. PlásmidosLos plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas.
¿Porqué son empleados como vectores?Porque son:-Pequeños.-Producen múltiples copias.
LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO
ORIGEN DE REPLICACION
GEN DE RESISTENCIA
AL ANTIBIÓTICO (MARCADOR
DE SELECCION)
GEN LACZ (MARCADOR
DE SELECCIÓN)
SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
lacZ AmpR
ADN foráneo
PLÁSMIDO DE CLONADO
ORIGEN DE REPLICACIÓN
GEN LACZ
SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
AMPR
DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y DEL FRAGMENTO DE ADN CON
LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION
PRODUCTO DE PCR
PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION
EcoRI EcoRIEcoRI
PRODUCTO DE PCR
PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION
PRODUCTO DE PCR DIGERIDO CON EcoRI
PLÁSMIDO DE CLONADO DIGERIDO CON EcoRI
LIGACIÓN
¿CON QUÉ?
ADN LIGASA
TUBO CON MEZCLA DE FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON EcoRI
ADN LIGASA
DOS RESULTADOS POSIBLES ….
PLÁSMIDO RECOMBINANTE
PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
¿CÓMO?
MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO
TUBO CON MEZCLA DE PLÁSMIDOS
RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES
TUBO CON CULTIVO LÍQUIDO DE BACTERIAS
DOS RESULTADOS POSIBLES ….
BACTERIA NO TRANSFORMADA
BACTERIA TRANSFORMADA
SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal
INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
BACTERIA NO TRANSFORMADA
A.
EN UN MEDIO CON AMPICILINA
LA BACTERIA SIN PLÁSMIDO NO CRECE
BACTERIA TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
B.
EN UN MEDIO CON AMPICILINA
EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ INTEGRO) ES AZUL
BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO RECOMBINANTE
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
C.
EN UN MEDIO CON AMPICILINA
EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
COMPONENTES:
1.ORIGEN DE REPLICACIÓN2.GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina)3.SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE 4.PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)5.SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)
PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN EN BACTERIAS
6. GEN REPORTERO7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej. neomicina)
PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN
BACTERIAS
PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS
PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN
¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS?
• Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos, immunológicamente activas.
• La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas siguientes:
1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-tranduccionales.
2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas.3. los genes eucariotas contienen intrones.4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos.
5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles 6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las proteasas de la bacteria y ser degradadas.
EL CASO DE LA INSULINA HUMANA
SELECCIÓN DEL PROMOTOR
• Según la célula huésped: - Bacteria - Célula eucariotas• Según el tipo de ARN deseado en células
eucariotas: - ARNm: ARN POLIMERASA tipo II -ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA• Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el
plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos.
• Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a uno ó más cromosomas eucariotas.
CO-TRANSFECCIONLa co-transfección es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se co-transfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha sido bien transfectado.
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
2. FAGOS
¿ Qué son los virus ?
ESTRUCTURA DE LOS FAGOS
FAGOS HELICOIDALES
FAGOS ICOSAEDRICOS
CICLO LITICO
VS. CICLO
LISOGÉNICO
CLASIFICACION DE LOS FAGOS• El genoma de los fagos puede ser:
- RNA simple cadena (MS2, Qß), - RNA doble cadena (phi 6), - DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o - DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4).
• Los fagos pueden ser:
-líticos,-temperados o lisogénicos
PARA PENSAR …..
LOS FAGOS UTILIZADOS COMO VECTORES
¿SON LÍTICOS O LISOGÉNICOS?
PLÁSMIDO
FAGOS
3.Cósmidos
4. BACBACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME