tecnologia do dna recombinante i: análise de dna e rna bibliografia: recombinant dna – james...
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Tecnologia do DNA recombinante I:
Análise de DNA e RNA
Bibliografia:Recombinant DNA – James Watson & Michael GilmanGuia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph RapleyBiologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha
Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da SilvaInstituto de Química- USP
Análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA)
Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR
Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos
Mutagênese in vitro
Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos
Endonucleases de restriçãoHaemophilus aegytius HaeIII 5’...G G C C...3’
3’...C C G G...5’
Haemophilus haemolyticus HhaI 5’...G C G C...3’ 3’...C G C G...5’
Escherichia coli EcoRV 5’..G A T A T C...3’ 3’..C T A T A G...5’
EcoRI 5’.G A A T T C...3’ 3’.C T T A A G...5’
Nocardia otitidis- NotI 5’..G C G G C C G C..3’caviarum 3’..C G C C G G C G..5’
DNA-Ligases
Clonagem de um segmento de DNA (gene) em vetores
Fragmento de DNA
Vetor ou veículo de clonagem:-plasmídeo-bacteriófago-cosmídeo-cromossomo artificial de bactéria (BAC)-cromossomo artificial de levedura (YAC)
Ligação enzimática: Ligase de DNA
insertofragmento de DNA ligado ao vetor
bactéria transformada
introduzir nas células: transformação e seleção
construção
Clonagem de DNA em bactérias
Detecção e análise de ácidos nucleicos
Eletroforese em gel de agarose
Brometo de Etídio
Fotografando um gel de agarose corado com Brometo de Etídio
Transiluminador com luz UV
Gel
Camera Polaroid
Dig
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Marcador de tamanho (pb)
Marcador de tamanho (pb)
Mapa de restrição
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Marcador de tamanho (pb)
Marcador de tamanho (pb)
Transferência de ácidos nucleicos do gel para membrana de náilon (Blot)
Gel
Membrana Papel toalhaPapel Filtro
Peso de 0,3-0,5 Kg
Reservatório com tampão de transferência
Ponte de papel
Hibridização de DNA (ou RNA) detecta se a solução contem sequencias complementares as fitas
imobilizadas no filtro
Southern Blot: DNA x DNA
Transferência para membrana
Eletroforese do DNA em gel de agarose
Hibridização da membrana com sonda radioativa
Exposição a filme de Raios-X
Marcar fragmento radioativamente para geração
de uma sonda para hidridização
Produção de sondas gênicas para hibridização
Marcação da sonda através da síntese in vitro com nucleotídeos radioativos (32P-
dATP)
Produção de sondas
gênicas para hibridização a
partir da sequência
conhecida de um peptídeo
Marcação da sonda com 32P na extremidade 5´(32P ATP)
Detecção de genes expressos Northern Blot RT-PCR (PCR precedido de
transcrição reversa) Análise do nível de expressão
de um único gene de cada vez Macroarrays de DNA Microarrays de DNA
Análise do nível de expressão de milhares de genes simultâneamente
Northern Blot: RNA x DNA
Transferência para membrana
Eletroforese de RNA em gel de agarose
Hibridização da membrana com sonda radioativa
Exposição a filme de Raios-X
28S
18S
Sonda Gene A
Northern BlotGel de Agarose
0h 24h
28S
18S
Sonda Gene B
Northern BlotGel de Agarose
0h 24h
Macro e microarrays de DNA
Arranjo ordenado de fragmentos de DNA imobilizados em uma superfície sólida porosa (membrana de náilon) ou não porosa (lâmina de vidro, plástico).
Os “pontos” neste arranjo correspondem a um gene específico. É possível fabricar microarranjos com MILHARES de “pontos” em alta densidade
Tipos de microarrays de DNA
GeneChip®: Oligonucleotídeos (20~25-mer) sintetizados in situ (on-chip). Estes são conhecidos como “DNA chips” e foram desenvolvidos pela Affymetrix em 1994.
DNA microarrays em vidro: Fragmentos de DNA obtidos por PCR (500~5.000 pb) ou oligonucleotídeos imobilizados em lâmina de vidro (lâmina de microscópio) com um “spotter” robotizado [~1995, grupo de Pat Brown, Stanford]
DNA purificado (plasmídeo/ produtos de PCR/ oligonucleotídeos) imobilizados em membrana de nylon ou plástico em alta densidade (ex: sequências de 8000 genes em membrana de 8 x 12cm, Clontech)
Principal aplicação da tecnologia de microarrays de DNA
Determinação do nível de expressão de milhares de genes
simultaneamente (abundância dos respectivos mRNAs)
Avaliação global da expressão gênica em células, tecidos e organismos em diferentes situações fisiológicas e patológicas
Classificação molecular de tumores – diagnóstico e prognóstico
Farmacogenômica/Toxicogenômica
GeneChip (oligoarray)
“Wafer”
12,7cm
250.000 probes (“features”) representando 5.000 genes humanos
Oligos (106- 107 cópias) / featureSíntese fotoquímica in situ
feature
Amostras de DNA (produtos de PCR purificados)
Deposição na lâmina de vidro com um robô (spotter)Imobilização covalente
Arranjo ordenado e preciso das amostras de DNA em alta densidade
“microarray de DNA em lâmina de vidro”
Microarrays de DNA
ID
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000000
DNA clones/PCR mRNA/cDNA Labelling Data Analysiscontrol sample
Cye 3 Cye 5
O genoma completo da levedura S.cerevisiae em um chip ~6.000 genes
http://cmgm.stanford.edu/pbrown/yeastchip.html
Bloco 11 inferior, sala 1100 – IQ/USPhttp://bioinfo.iq.usp.br/cagelab
Tecnologia do DNA recombinante II: Clonagem de genes
Bibliotecas de DNA
Bibliografia:Recombinant DNA – James Watson & Michael GilmanGuia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph RapleyBiologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha
Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da SilvaInstituto de Química- USP
Purificação e análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA)
Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR
Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos
Mutagênese in vitro
Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos
Construção de Bibliotecas de Genes
Bibliotecas Genômicas representam todo o genoma
Bibliotecas de cDNA representam os genes
expressos em um tecido ou situação fisiológica ou patológica
Clones genômicos Clones de cDNA
Biblioteca Genômica construída em bacteriófago
Biblioteca Genômica construída em bacteriófago
Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas
Varredura de Bibliotecas construídas em plasmídeo
Hibridização de colônias de bactérias
Estratégia de sequenciamento do genoma
Nature 15 Feb 2001 409(6822)
Who
le g
enom
e sh
otgu
n
Construção de Biblioteca de
cDNA
Clonar cDNAs em bacteriófagos ou plasmídeo
Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas
Vetor de expressão
Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos
Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos
