tehnici de biologie moleculara oct 2009 ii
TRANSCRIPT
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
1/43
TEHNICI DE BIOLOGIEMOLECULAR II
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
2/43
RECOMBINAREA ADN-ului
Recombinare lat. re nou, combina - formare
Informaia genetic a lumii vii estelocalizat la nivelul dublului lan de ADN Materialul genetic poate fi izolat, iar cele 2
lanuri se separ i apoi se pot recombina
cu un alt lan strin complementar Aceste fenomene dau posibilitatea crerii
de noi organisme n condiii naturale sau delaborator
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
3/43
CROSSING-OVERTheimage cannotbe displayed.Your computer may nothaveenough memory toopen theimage,or theimagemay havebeen corrupted.Restartyour computer,and then open thefile again.If thered x stillappears,you may haveto deletetheimage and then insertit again.
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
4/43
RECOMBINAREA ADN-ului
PRICIPIUL METODEI Recombinarea natural (recombinarea
genetic) CROSSING-OVER schimbul
reciproc de fragmente de cromatide (gene)ntre cromozomii omologi alturai npachytenul meiozei 1
Recombinarea artificial (tehnologia ADN-ului recombinat) Genetic Engeneering Ingineria genetic
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
5/43
RECOMBINAREA ADN-ului
1953 J.D. Watson i Fr. Crick - Structuraspaial a ADN-ului
1970 SUA prima recombinare reuit
Pe cale artificial combinarea informaieigenetice de la 2 specii diferite: organism nourecombinat = modificat genetic = transgenic
Baza ingineriei genetice i a biotehnologiilor Implicaii majore n biologie molecular,
biochimie, genetic, farmacologie, medicin,agricultur
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
6/43
RECOMBINAREA ADN-ului
Unelte de lucru n tehnologia ADN-ului recombinat:
Enzimele de restricie ADN-ligazele
Vectorii
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
7/43
ENZIMELE DE RESTRICIE
Endonucleaze de origine bacterian care cliveazADN-ul strin (viral)
Metilarea reprezint un mecanism de aprare al
bacteriei (de protecie) fa de propriileendonucleaze Exonucleaze se fixeaz la captul lanului de
ADN Endonucleaze n interiorul moleculei de ADN
(endonucleaze de restricie) Enzime de restricie I, II, III Eco K si B
(Escherichia coli )
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
8/43
ADN-LIGAZELE
1967 descrierea primelor ADN-ligaze Nu pot lega 2 molecule ADN monocatenare Leag doar 2 lauri ADN din aceeai molecul
ADN dublu helix Formeaz o legtur fosfodiesteric ntre 3-OH
al unei extremiti i 5-P a celeilalte extremiti Consum de energie NAD+ sau ATP
Procesul de legare (linker) esenial n: sintezanormal a ADN-ului, repararea ADN-ului irecombinare genetic
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
9/43
VECTORII I. Vectorii de expresie:
1. Pentru sinteza unor cantiti maride proteine: plasmide, bacteriofagi,
cosmide, fagemide, secvene de inserie 2. De transcriere pentru sinteza
ARN-ului
Vectorii speciali 1. Retrovirusurile - ARN virusuri
conin reverstranscriptaz: HIV
2. Retrovirusurile i plasmid Ti
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
10/43
PLASMIDELE
Clasa major de elemente genice mobile Prezente la procariote (bacterii) i eucariote (plante
i animale) La procariote molecule de ADN dublu catenar
helix circular Dimensiuni: de la 2kpb cteva sute kpb ADN extarcromozomial (cromozomi accesorii),
neobligatoriu pentru supravieuire Componenete:
Una sau mai multe gene pentru o anumitproprietate (rezistena la antibiotice)
Un segment de replicare (factor de replicare) Un segment de transfer (factor de transfer)
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
11/43
BACTERIOFAGII
Virusuri care infecteaz bacteriile
Sunt obligatoriu parazii
mprumut aparatul metaboliccelular al gazdei pentru propriareplicare
Material genetic ADN sau ARN
(retrovirusuri), n form linear saucircular
Fagul , 80,
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
12/43
RECOMBINAREA ADN-ului
Etape Tierea lanurilor ADn dublu catenare cuenzimele de restricie
Rezult ADN monocatenar
Tierea ADN-ului vectorului Cele 2 fragmente se leag covalent cu ajutorul
ADN-ligazelor Introducerea n celula gazd a ADN-ului de
cercetat legat de vector Multiplicarea sincron, odat cu celula gazd a
ADN-ului de cercetat i al vectorului Obinerea unui nr. f mare de copii identice de
ADN recombinat = CLONARE DE ADN
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
13/43
RECOMBINAREA ADN-uluii INGINERIA GENETIC
Termenul de Genetic Engineering (Inginerie genetic) -adesea folosit ca similar cu recombinarea ADN-ului
n realitate Ingeneria genetic este doar ultima etap arecombinrii
Rezult un genom nou, celula avnd caractere aparte Ingineria genetic st la baza proceselor de biotehnologie Terapia genic (Gene Targeting): boli ereditare, infecia cu
HIV, boli neoplazice, boli cardio-vasculare, boli metabolice,vaccinuri recombinate
Aplicaii n agricultur i zootehnie (industria alimentar) Conservani alimnetari Ecologie poluare cu hidrocaburi
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
14/43
INGINERIA GENETICEtape
Se pornete de la matricea ADN-ului monocatenar Copie a ADN-ului monocatenar n prezena
reverstranscriptazei Se obine un lan de ADN dublu catenar
Clonarea acestuia Fragmentul clonat este nglobat ntrt-un vector de exprimare Vectorul este introdus n celula gazd receptoare n celula receptoare se produce transcrierea i translaia
fragmentului de ADN strin n final se obine protine dorit exemplu insulina sau
anumite enzime
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
15/43
RECOMBINAREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
16/43
RECOMBINAREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
17/43
SONDELE GENETICE Probe de acid nucleic (ADN sau ARN) marcate
radioactiv sau non-radioactiv pe o singur baznucleotidic
Conin o secven cunoscut de baze
Reprzint pricipalele unelte pentru metodelede hibridizare pentru analiza secvenei ADN-ului int
Se formeaz prin aceleai metode dehibridizare Blot (S i W) sau in situ
Se obin cu ajutorul enzimelor de restricie Etichetarea, reperarea, cartografierea tutror
genelor i a ntreg genomului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
18/43
SONDELE GENETICE
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
19/43
SONDELE GENETICEMARCAREA
A. Marcarea radioactiv: Cu izotopi radioactivi: H3 (HIS) , S35, I125 i
P32 (Blotting)
B. Marcarea non-radioactiv: Marker: BIOTINA se va lega de uracil
Evidenierea biotinei prin legarea de AVIDINsau STREPTOVIDIN, care se leag la rndullor de un fluorocrom pentru o reacie de culoare
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
20/43
CLONAREA Clonarea bacterian- un grup de celule
bacteriene identice dpv genetic, care provindintr-o singur celul bacterian de origine
Clonarea ADN-ului se realizeaz printr-otehnic de recombinare a ADN-ului, urmat de
ncorporarea acestuia ntr-un vector ntroducerea ntr-o celul gazd i multiplicarea
sincron n biologia molecular, clonarea semnific
obinerea unei culturi de celule identice, de la ocelul unic, care conine un fragmentmultiplicat de acid nucleic de cercetat
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
21/43
CLONAREA ADN-ului
ETAPE Extragerea unui fragment de ADN, prin
tierea ADN-ului genomic cu enzime derestricie
Introducerea ADN-ului ntr-un vector
Introducerea vectorului recombinant ncelula gazd (plasmid cu ADN-ul destudiat) E. coli de obicei
Selectarea celulelor bacteriene care coninvectorul recombinant
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
22/43
CLONAREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
23/43
CLONAREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
24/43
CLONAREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
25/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTIONREACIA N LAN A POLIMERAZEI
PCR este folosit pentru cercetarea unorcantiti foarte mici de ADN dintr-un produsbiologic
Ofer posibilitatea ca dintr-o mixtur de ADN sse extrag o singur molecul de ADN, care sfie ulterior amplificat enzimatic
Spectru de aplicabilitate al PCR foarte larg:
medicin, oncologie, genetic, medicin legal,identificarea i crearea de noi virusuri saubacterii, arheologie, ecologie
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
26/43
PCR PRINCIPIUL REACIEI
ADN monocatenar se folosete dreptmatri
In vitro de la acest lan se formeaz princomplementaritate un nou lan, cuajutorul ADN-polimerazei i n prezenaunui oligonucleotid (15-20 nucleotide)
denumit primer sau amors Oligonucleotidul are un capt 3 OH
liber
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
27/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTIONREACIA N LAN A POLIMERAZEI
Avantajele PCR :
Foarte sensibil: poate evidenia chiarprezena unei singure molecule de ADN
Permite multiplicarea (clonarea) uneisingure secvene de ADN, chiar i n afaracelulei vii
Maini automate Thermal Cycler sauTermocycler
25-30 de cicluri de amplificare n 4 ore
Relativ uor de efectuat
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
28/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
REACIA N LAN A POLIMERAZEI
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
29/43
PCR ETAPELE REACIEI
PCR pornete fie de la un ADN dublucatenar careva fi secionat i transformat n monocatenar, fiedirect de la un lan monocatenar
Denaturarea ADN-ului de cercetat (95C) conine secvena int
Scderea temperaturii i adugarea primeruluisau amorsei hibridizare la temperatur redus(36-65C)
Primerul trebuie s fie n exces pentru a
mpiedica renaturarea Sinteza unui nou lan cu ajutorul ADN-
polimerazei n prezena celor 4 tipuri denucleotide ADN (A, C, G, T)
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
30/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
REACIA N LAN A POLIMERAZEI
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
31/43
PCR ETAPELE REACIEI
Fiecare ciclu se ncheie cu sinteza unui lan dublucatenar i ncepe cu denaturarea acestui lan n al doilea ciclu se folosete drept matri att
ADN-ul de origine, ct i ADN-ul nou sintetizat(datorit ADN-polimerazei)
Cu fiecare ciclu de denaturare-sintez se dubleazcantitatea de ADN rezultat din ciclul anterior(cretere exponenial)
Se repet 30-50 de cicluri, pn se obine
cantitatea necesar de ADN pentru celelaltereacii dorite (hibridizri, sonde, etc) Pentru evitarea erorilor se recomand repetarea
de mai multe ori a aceleai reacii pentru probadat i folosirea de controale negative
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
32/43
POLIMERAZELE FOLOISTE N PCR
n anii 1980 polimeraza Klenow (fragment de
ADN-polimeraz I de la E. coli) Dezavantaje termolabil Apoi Taq-polimeraza, termostabil, izolat de la o
bacterie termofil Thermus aquaticus
n acest fel s-a ajuns n prezent la automatizareacomplet a reaciei n mainile numite ThermalCycler
Dup 4 ore i aproximativ 25-30 de cicluri deamplificare se poate ajunge la o amplificare de 106109 ori
Produsele ADn obinute prin PCR se separ prinelectorforez n gel, benzile sunt citite cu UV
Apoi se realizeaz hibridizri prin metodele blotting
(Southern sau Dot)
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
33/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
REACIA N LAN A POLIMERAZEI
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
34/43
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
REACIA N LAN A POLIMERAZEI
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
35/43
APLICAIILE PRACTICE ALE PCR
Medicin:
Boli ereditare: fibroz chistic, distrofia muscularDuchenne, fenilcetonuria Boli infecioase: HIV (din stadiile precoce ale infeciei,
prin identificarea ARN-ului viral), hepatite virale,herpes virus, papiloma virus, EBV, bacterii Mycobacterium tuberculosis, Clostridium difficile,Neisseria meningitidis, parazii malaria,toxoplasmoz
Boale Whipple, malakoplakia, boala Crohn Medicin legal (fire de pr, celule, snge sau sperm) Biologie strudii de evoluie a speciilor, migraie uman,
fosile Ecologie evidenierea unor microorganisme din pmnt sau
ap care nu au putut fi cultivate n laborator pn n prezent Arheologie mumii egiptene
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
36/43
SECVENIEREA ADN-ului
Analiza structruii ADN-ului a nceput n anii 70 cumetodele de secveniere i de analiz a secvenelor denucleotide din aceste structuri
Se folosesc enzimele de restricie (endonucleaze) carepot tia fragmentele de ADn pn la cteva sute sau
mii de perechi de baze Aceste fragmente sunt apoi separate electroforetic i
analizate n Germania i SUA exist bnci de date n cre sunt
stnse toate secvenele de ADN cunoscute pn nprezent
1995 secvenierea complet a primului genombacterian Haemophilus influenzae, urmat la foartescut timp de cel al Mycoplasma genitalium
n prezent - genomul uman complet
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
37/43
SECVENIEREA ADN-ului
Pricipiu: tierea lanului de ADN n segmente i analizaulterioar a secvenelor de baze nucleotidice
Prin descifrarea acestor secvene se pot delimita genele iimplicit, secvena de aminoacizi codificat de acea gen, nproteina final
Nu se pot obine, ns, informaii despre proceseleposttranslaionale pe care le sufer o protein, respectivstructura teriar i cuaternar a acesteia
Este o variant a tehnicii de recombinare a ADN-ului
Condiia necesar este existena unui nr. suficient de marede copii de ADN, obinut prin clonare sau PCR
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
38/43
SECVENIEREA ADN-ului i FINGERPRINTINGGENOMIC
Se folosesc 2 metode n prezent:
metoda enzimatic Sanger (chain TerminationTechnique) Metoda chimic Maxam-Gilbert )de obicei combinat cu
metoda Sanger) Amprente de ADN sau FINGERPRINTING genomic: pe baza
analozelor secvenelor de ADN, s-a demonstrat c fiecareindivid este unic i c este caracterizat printr-unfingerprinting genomic (o amprent unic de ADN)
Patternul individual unic este dat de regiunile hipervaraibiledin ADN-ul genomic, i anume de zona ADN-urilormicrosatelite
Genomul uman cuprinde 70% de secvene unice identice latoi indiviii i 30% secvene repetitive, specifice fiecruiindivid
Figerprintigul genomic (amprenta genetic) este caracteristicfiecrui individ, se suprapune parial la rude i poate fi identic
la gemenii univitelini
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
39/43
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
40/43
SECVENIEREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
41/43
SECVENIEREA ADN-ului
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
42/43
-
8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II
43/43
TEHNICI DE BIOLOGIE
MOLECULAR II