Alat dan bahan

Alat:

Pinset

Cortex

Autoklaf

Incubator

Pipet eppendrof

Cawan petri

Jarum ose

Tabun reaksi

Labu Erlenmeyer

Pipet volum

Bahan:

Mikroba : staphylococcus aureus dan

Escherichia coli

Medium nutrient agar dan nacl

Antibiotic

Ampisilin na

Tetrasiklin

Kloramfenikol

Bahan lain: cakram kertas

Kapas berlemak

Alumunium foil

Benang kasur

Teori dasar

Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi minimum dari suatu zat

yang mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme. Penetapan KHM

dapat dilakukan dengan dua cara yaitu :

1. Cara cair

Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat

menghambat pertumbuhan bakteri dengan pengenceran-pengenceran tertentu.

Kemudian ditanamkah biakan bakteri dalam jumlah yang sama. Respon zat uji

ditandai dengan kejernihan atau kekeruhan pada tabung setelah inkubasi.

2. Cara padat

Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan uji dengan

berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri bisa ditanami beberapa jenis

mikroba sehingga nilai KHM zat tersebut terhadap mikroba-mikroba yang digunakan

dapat diketahui.

KHM dapan ditentukan dengan prosedur tabung dilusi. Prosedur ini digunakan untuk

menentukan konsentrasi antibiotika yang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan bakteri

patogen dan mengindikasukan dosis antibiotika yang efektif dalam mengontrol infeksi pada

pasien. KHM dapat juga ditentukan dengan menggunakan konsentrasi tunggal dari suatu

antibiotika dengan membandingkan kecepatan pertumbuhan mikroorganisme pada tabung

kontrol dan tabung yang diberikan antibiotika.

Pada suatu konsentrasi tertentu, antibiotika mempunyai efek menghambat pertumbuhan

mikroorganisme. Pertumbuhan mikroorganisme tersebut ditandai dengan adanya kekeruhan pada

media yang digunakan. Pada kadar tertentu, dimana pertumbuhan mikroorganisme terhambat

oleh jumlah antibiotik yang sesuai, tidak terjadi kekeruhan pada media.

Dengan menggunakan metode penegceran, dapat di lihat pada konsentrasi berapa

antibiotik tersebut mempunyai efek menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pengamatan

dilakukan berdasarkan intensitas kekeruhan yang terjadi pada setiap tabung berisi media dan

suspensi kuman dengan konsentrasi antibiotik yang berbeda konsentrasinya setelah diinkubasi

selama 24 jam.

Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau disebut dengan KHM adalah konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai KHM adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan mikroba. KHM dari sebuah antibiotika terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitivitas dari mikroba terhadap antibiotika. Nilai KHM berlawanan dengan sensitivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai KHM dari sebuah antibiotika, sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. KHM dari sebuah antibiotika terhadap spesies mikroba adalah rata-rata KHM terhadap seluruh strain dari spesies tersebut. Strain dari beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda dalam hal sensitivitasnya. Metode uji antimikrobial yang sering digunakan adalah metode Difusi Lempeng Agar. Uji ini dilakukan pada permukaan medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas saring yang berbentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah inkubasi diameter zona penghambatan diukur. Diameter zona pengambatan merupakan pengukuran KHM secara tidak langsung dari antibiotika terhadap mikroba. Sensitivitas klinik dari mikroba kemudian ditentukan dari tabel klasifikasi (Jawetz et al.,1996).

Pertumbuhan mikroorganisme dapat dikendalikan melalui proses fisik dan kimia. Pengendalian dapat berupa pembasmian dan penghambatan populasi mikroorganisme. Zat antimikrobial adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan dan metabolisme melalui mekanisme penghambatan pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikrobial terdiri dari antijamur dan antibakterial. Zat antibakterial adalah zat yang mengganggu pertumbuhan dan metabolisme melalui penghambatan pertumbuhan bakteri. Beberapa hal yang perlu dipertimbangkan dalam memilih zat antimikrobial kimiawi adalah :

1. Jenis zat dan mikroorganisme

Zat antimikrobial yang akan digunakan harus sesuai dengan jenis mikroorganismenya karena memiliki kerentanan yang berbeda-beda.

2.Konsentrasi dan intensitas zat antimikrobial

Semakin tinggi konsentrasi zat antimikrobial yang digunakan, maka semakin tinggi pula daya kemampuannya dalam mengendalikan mikroorganisme.

3.Jumlah organisme

Semakin banyak mikroorganisme yang dihambat atau dibunuh, maka semakin lama waktu yang diperlukan untuk mengendalikannya.

4. Suhu

Suhu yang optimal dapat menaikkan efektivitas zat antimikrobial

5. Bahan organik

Bahan organik asing dapat menurunkan efektivitas zat antimikrobial dengan cara menginaktifkan bahan tersebut atau melindungi mikroorganisme. Hal tersebut karena penggabungan zat dan bahan organik asing membentuk zat antimikrobial yang berupa endapan sehingga zat antimikrobial tidak lagi mengikat mikroorganisme.

Akumulasi bahan organik terjadi pada permukaan sel mikroorganisme sehingga menjadi pelindung yang mengganggu kontak antara zat antimikrobial dengan mikroorganisme (Boyd, 1980).

· Faktor lain yang mempengaruhi adalah dosis antibiotika yang diberikan. Beberapa masalah adalah konsentrasi dari zat kemoterapi dalam jaringan, dimana menghasilkan konsentrasi obat lain lebih besar atau lebih rendah daripada yang digunakan dalam laboratarium. Hal itu penting, sehingga level obat itu dapat dicapai dalam bermacam bagian tubuh dapat

diketahui seperti halnya sensitivitas relative dari bakteri pathogen. Sensitifitas relatif disebut dengan Minimum Inhibitory Concentration atau MIC (Pelczar,1988).

Mekanisme Kerja Antibiotika

Pemusnahan mikroba dengan antibiotika yang bersifat bakteriostatik masih tergantung dari keanggupan reaksi daya tahan tubuh hospes. Peranan lamanya kontak antara mikroba dengan antimikroba dalam kadar efektif juga sangat menentukan untuk mendapatkan efek, khususnya pada tuberkolostatik.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotika dibagi dalam lima kelompok :

1.Yang mengganggu metabolism sel mikroba.

2.Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba.

3.Yang mengganggu permeabilitas membrane sel mikroba.

4.Yang menghambat sintesis protein sel mikroba.

5.Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba.

Penentuan kepekaan mikroba terhadap suatu antibiotika atau khemoterapeutik dipakai untuk menentukan pengobatan terbaik terhadap penyakit yang disebabkan oleh suatu mikroba tersebut pada manusia atau hewan. Ada dua metode untuk menentukan kadar hambat minimal suatu antibiotika yaitu:

Metode Difusi

Pada metode ini zat antibiotika berdifusi pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan bakteri. Dasar pengamatannya adalah terbentuk zona hambat disekeliling cakram atau silinder yang berisi antibiotika. Metode ini dipengaruhi oleh faktor fisik dan kimia, selain antara obat dan organisme.

Cara parit

Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan baktei dibuat parit kemudian diisi dengan zat antibiotika dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan disekeliling parit.

Cara silinder

Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat lubang diletakan silinder kemudian diisi dengan zat antibakteri, setelah itu diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang

sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas dasra ada atau tidaknya hambatan disekeliling silinder.

Cara cakram

Kertas cakram yang mengandung zat antibakteri diletakan diatas lempeng, setelah diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan bakteri uji. Pengamatan dilakukan berdasarkan ada tidaknya hambatan disekeliling cakram

Metode dilusi

Metode ini menggunakan antibakteri yang turun secar bertahap, baik dengan media cair atau padat kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan. Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh atau tidaknya bakteri

Cara pengenceran tabung (Metode Kirby-Bauer)

Pada metode ini zat yang akan diuji kepekaan antibakterinya diencerkan secar serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium cair, kemudian diinokulasikan dengan bakteri uji, inkubasi pada suhu 37°C selama 18-21 jm ( untuk bakteri) dan 1-2 minggu (untuk jamur). Aktivitas antibakteri ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

Cara penapisan lempeng

Pada metode ini zat yang akan diuji antibakterinya diencerkan secara serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium agar pada suhu 40-50°C, kemudian dituang dalam cawan petri. Setelah lempeng agar membeku ditanam inokulum bakteri dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri uji. Kadar hambat minimum zat antibakteri yang diuji, ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

Turbiditas

Pada metode ini pengamatann aktivitas didasarkan atas kekeruhan yang terjadi pada medium pembenihan. Pertumbuhan bakteri juga dapat ditentukan dari perubahan yang terjadi sebelum dan sesudah inkubasi, yang dilakukan dengan mengukur serapannya secara spektrofotometer. Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan peningkatan jumlah sel bakteri, yang mengakibatkan meningkatnya kekeruhan. Kekeruhan yang terjadi umumnya berbanding lurus dengan serapan.

I.1.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus tampak hidup bergerombol seperti seikat anggur berwarna

kuning. Warna tersebut dihasilkan oleh pigmen yang melapisi dinding sel. Memiliki sifat

aerob fakultatif, artinya membutuhkan oksigen pada saat tertentu, namun dalam kondisi lain

mampu bertahan hidup tanpa oksigen sama sekali. (Anneahira, tanpa tahun).

Gambar II.4 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus tidak menghasilkan spora dan tidak motil, tidak bergerak tetapi

mampu membentuk kapsul untuk melindungi diri. Ukuran selnya berkisar 0,8-1,0 μm, dan

tumbuh optimal pada suhu normal tubuh manusia, kisaran 36-37°C. Bakteri ini mampu

berkembang dalam lingkungan dengan konsentrasi NaCl sekitar 3 Molar. (Anneahira, tanpa

tahun).

Staphylococcus aureus memiliki kemampuan mendeteksi jumlah sel menggunakan sinyal

oligopeptida, dan memastikan jumlah tersebut cukup untuk memproduksi toksin dan enzim

koagulase. Enzim inilah yang berfungsi menggumpalkan firinogen di dalam plasma darah

sehingga Staphylococcus aureus selamat dari fagositosis dan respon sistem antibodi pada

tubuh kita. (Anneahira, Tanpa tahun).

Staphylococcus aureus dapat mengganggu sistem imun pada tubuh manusia karena

mengikat antibodi, menyerang membran sel dan menyebabkan hemolisis, serta leukolisis

yang mematikan sel tubuh manusia. (Anneahira, Tanpa tahun).

Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk coccus

(bulat), hidup berkoloni (seperti buah anggur) dan memiliki karakteristik hemolytic pada

darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai

45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15% dan menghasilkan enzim

koagulase. Selain itu biasanya, S.aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan

furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang urat darah, saluran kencing,

osteomyelitis serta menyebabkan keracunanan makanan yaitu dengan melepaskan

enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens ke

dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

2.7 Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif, ditemukan oleh Theodor Escherich (tahun 1885). Hidup pada tinja dan menyebabkan masalah kesehatan pada manusia, seperti diare, muntaber serta masalah pencernaan lainnya. Bakteri Escherichia coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm, dapat bertahan hidup di medium sederhana dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam dan gas, kandungan G+C DNA ialah 50 sampai 51 mol % (Pelczar dan Chan, 1986:949).

Bergerak aktif dan tidak berspora. Suhu yang baik untuk pertumbuhan bakteri ini adalah antara 8°C-46°C, tetapi suhu optimumnya adalah 37°C. Morfologi dan ciri-ciri pembeda Escherichia coli yaitu: (1) merupakan batang gram negatif, (2) terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam rantai pendek, (3) biasanya tidak berkapsul, (4) tidak berspora, (5) motil atau tidak motil, peritrikus, (6) aerobik, anaerobik fakultatif, (7) penghuni normal usus, seringkali menyebabkan infeksi (Pelczar dan Chan,1986:809-810).

Gambar II.5 Escherichia coli

Escherichia coli dapat tumbuh di medium nutrien sederhana, dan dapat

memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas. Kecepatan berkembangbiak

bakteri ini adalah pada interval 20 menit jika faktor media, derajat keasaman dan suhu tetap

sesuai. Selain tersebar di banyak tempat dan kondisi, bakteri ini tahan terhadap suhu, bahkan

pada suhu ekstrim sekalipun. Oleh karena itu, bakteri tersebut dapat hidup pada tubuh

manusia dan vertebrata lainnya. (Anonim II, 2010).

MEKANISME AKSI ANTIBIOTIK AMPISILIN / AMPICILLIN

1 Menghambat sintesis dinding sel bakteri dengan mengikat satu atau lebih pada ikatan penisilin-protein (PBPs – Protein binding penisilin’s), sehingga menyebabkan Penghambatan pada tahapan akhir transpeptidase sintesis peptidoglikan dalam dinding sel bakteri, akibatnya biosintesis dinding sel terhambat dan sel bakteri menjadi pecah (lisis)

DEPKES

2 Menghambat sintesis dinding sel bakteri dengan mengikat satu atau lebih protein Pengikat-penisilin (PBP) yang pada gilirannya menghambat langkah transpeptidasi akhir sintesis peptidoglikan di dinding sel bakteri, sehingga menghambat biosintesis dinding sel. Bakteri akhirnya lisis akibat aktivitas yang sedang berlangsung dari dinding sel enzim autolytic (autolysins dan murein hidrolase) sementara perakitan dinding sel ditangkap.

DIH

3Mengikat protein-pengikat-penisilin spesifik (PBP) yang terletak di dalam dinding sel bakteri, Ampisilin menghambat tahap ketiga dan tahap terakhir dari sintesis dinding sel bakteri. Sel lisis ketika dimediasi oleh enzim autolytic dinding sel bakteri seperti autolysins; Kemungkinan bahwa Ampisilin mengganggu inhibitor autolysin.

DRUGBANK

Ampisilin memiliki aktivitas antibakteri yang luas diantaranya terhadap streptococci, pneumococci nonpenicillinase- producting staphilocochi, listeria, meningococci; turunan H.Influenzae, salmonella, Shigella, E.coli, Enterobacter, dan

Klebsiella

Mekanisme kerja tetrasiklin

Tetrasiklin bersifat bakteriostatik dengan jalan menghambat sintesis protein. Hal inidilakukan dengan cara mengikat unit ribosoma sel kuman 30 S hingga mencegahterbentuknya amino asetil RNA. Antibiotik ini dilaporkan juga berperan dalam mengikat ionFe dan Mg. Meskipun tetrasiklin dapat menembus sel mamalia namun pada umumnya tidak menyebabkan keracunan pada individu yang menerimanya.

Mekanisme Kerja Kloramfenikol adalah sebagai berikut.

bekerja menghambat sintesis protein bakteri

obat dengan mudah masuk ke dalam sel melalui proses difusi terfasilitasi

obat mengikat secara reversible unit ribosom 50S, sehingga mencegah ikatan asam amino yang mengandung ujung aminoasil t-RNA dengan salah satu tempat berikatannya di ribosom

pembentukan ikatan peptida dihambat selama obat berikatan dengan ribosom

kloramfenikol juga dapat menghambat sintesis protein mitokondria sel mamalia karena ribosom mitokondria mirip dengan ribosom bakteri

Daftar pustaka

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Pelczar, M.J.Jr, and E. Chan.1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit UI Press. Jakarta

Jawetz., et al. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Rajawali Press