teoría y practica en cinética enzimatica
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conceptos y resolución de problemas de cinética enzimaticaTRANSCRIPT
30-07-2015
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Seminario-Taller Principios Básicos de la
Cinética Enzimática para el
Diseño y Operación de
Reactores
Dr. Roberto J. Vega Paulino [email protected]
1
2
Tema 1
Catálisis y Biocatálisis
Enzimas como catalizadores
Actividad enzimática
Propiedades y significado tecnológico
Sustancia que reduce la barrera energética de una reacción química, aumentando la velocidad de conversión del sustrato a producto.
Catálisis y Biocatálisis
CATÁLISIS
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(Enzimas)
Catálisis fisiológica
¿Qué es Biocatálisis?
Catálisis de proceso (artificial) bajo
condiciones de reacción de un proceso
industrial 4
Catálisis y Biocatálisis
alta especificidad
alta actividad en condiciones moderadas
alto número de rotación
biodegradabilidad
producto “natural” complejidad molecular
alto costo de producción
labilidad
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Catálisis y Biocatálisis
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Enzimas son Proteínas
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ENZIMA
(proteína)
“Catalizadores de la vida”
Catalizan las reacciones Bioquímicas
en condiciones suaves
Catalasa H2O2 H2 O2 +
Ea= 76 KJ M-1
Ea’= 30 KJ M-1
v
v * 108 t: años t: segundos 7
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Primaria
Secundaria
Terciaria
sitio activa
Cuaternaria 8
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Enzimas son Proteínas Conjugadas
9
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
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E
E
ES
S
P
Modelo de la llave - cerradura (Emil Fischer 1894)
10
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
E: cerradura
S. llave
Explica la especificidad de la Enzima
Falla al explicar la estabilización del estado de transición
Modelo del ajuste inducido (Koshland 1958)
11
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
E CoE
P E-CoE S
S P
E E
S P
E··CoE E E
CoE’
CoE
1
2
3
Enzimas de acuerdo a sus requerimientos de cofactor y coenzima
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E
E
ES
S
P
Actividad (pequeña porción de la enzima)
Estabilidad (Capacidad de la enzima de retener su actividad)
Especificidad
E*
E k dt
dE - D
13
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Desnaturalización Pérdida reversible de la actividad biológica por desplegamiento de la estructura terciaria, donde no ocurre cambios químicos en la proteína.
14
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Inactivación Pérdida irreversible de la actividad biológica porque existen cambios químicos en la proteína
15
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
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Estabilidad termodinámica o conformacional
Estabilidad cinética o de largo plazo
Proceso Global para la Inactivación
N U I K k
Const. Equilibrio de desplegamiento Const. velocidad inactivación
16
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
Estabilidad y Actividad tienen Tendencias Opuestas
Estabilidad: Rigidez molecular Actividad: Flexibilidad conformacional
17
Enzimas como Catalizadores. Relaciones
de Estructura funcionalidad
dt
dp
dt
ds- v a
Concepto y determinación de la
actividad enzimática
S E P
Definición termodinámica
Definición cinética
p
t
Disminución del sustrato Inactivación enzimática Inhibición enzimática Desplazamiento del equilibrio
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p
t
0t0t
0tdt
dp
dt
ds- v a
Concepto y determinación de la
actividad enzimática
Representa el máximo potencial catalítico en un
set dado de condiciones experimentales 19
Concepto y determinación de la
actividad enzimática
Definición de una Unidad de Actividad
La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de
Bioquímica: UI.
Una UI se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato por min en
condiciones estandarizadas de T, pH y [S] óptimo.
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El katal (kat): número de moles de sustrato convertido por segundo
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Métodos de Análisis de la Actividad
Enzimática
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Bioprocesos
- células viables
Celulares
- células inviables
Acelulares (enzimáticos) • Libres
• Soportados
• Con CoE disociables
• Sin CoE disociables
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Fuente de Enzimas
Naturales
• plantas
• animales
• microorganismos mesófilos
extremófilos
Modificados • mutantes
• recombinantes
• Ingenerados
Sintéticos • mimos (molécula orgánica para recrear el
sitio activo de una enzima)
24
1960
%
1985
2000
Planta, Animal
70
25
< 20
Microbiana 30 75 > 80
Producción de Enzimas
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25
Manipulaciones ambientales
medio de cultivo
condiciones de operación
modalidad de cultivo
Manipulaciones genéticas
mutación
recombinación
mutagénesis dirigida
Producción de Enzimas
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Clases de enzimas. Significado
Tecnológico
Procesos con E con CoE disociables
oxidoreductasas
transferasas Intracelulares
Procesos con E sin CoE disociables
liasas
hidrolasas
nitrilo hidratasa
aspartasa
fumarasa
Isomerasas Intracelulares
ligasas ATP
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Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
Aplicación industrial
Otras aplicaciones
Aditivos
Analíticas
Médicas
Investigación
80 %
20 %
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Hidrolasas extracelulares
Sin CoE disociables
Biocatalizadores solubes
Medio de reacción acuoso
Reacciones irreversibles
S + H2O P1 + P2
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
29
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
30
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
Novozymes
Fuente: Biocatalysts and Enzyme Technology. Buchholz et al. (2012)
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Año Rubro
Detergentes Textiles Alimentos Otros
1992 42 15 37 6
1995 35 13 34 18
2000 32 5 30 33
2010 29 4 27 40
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
32
Fuente: Basic Biotechnology. Ratledge y Kristiansen (2006)
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
33
Amano Enzyme: https://www.amano-enzyme.co.jp/
Novozymes:
http://www.novozymes.com/en/Pages/default.aspx
Biocatalysts: http://www.biocatalysts.com/
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de
Procesos
Empresas líderes en la comercialización de
Enzimas industriales
DSM:
http://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/produ
cts/enzymes.html
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Enzimas usadas tradicionalmente como
catalizadores industriales
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35
Enzimas usadas tradicionalmente como
catalizadores industriales
Enzyme Source Applications
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Enzimas usadas tradicionalmente como
catalizadores industriales
Enzyme Source Applications
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Biocatálisis en Reacciones de Síntesis
Reacciones degradativas
(escaso valor agregado)
Enzimas en solución en reacciones hidrolíticas
Enzimas inmovilizadas en reacciones de hidrólisis e
isomerización
Reacciones de síntesis
(elevado valor agregado)
Enzimas con requerimientos de CoE
Enzimas sin requerimientos de CoE
( hidrolasas en medios no convencionales)
38
Biocatálisis en Reacciones de Síntesis
39
Biocatálisis en Reacciones de Síntesis
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40
Biocatálisis en Reacciones de Síntesis
41
Proyección del Uso Industrial de
Enzimas
Industria Alimentaria
Biocombustibles
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Alimentación animal
Fitasas, β-glucanasas
Alimentos funcionales y nutracéuticos
Lipasas, proteasas, glicosidasas
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43
Proyección del Uso Industrial de
Enzimas
44
Proyección del Uso Industrial de
Enzimas
45
Proyección del Uso Industrial de
Enzimas
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46
Prebióticos
(Fructooligosacáridos)
Proyección del Uso Industrial de
Enzimas
Fructosiltransferasa
Enzima clave
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Prebióticos Oligosacáridos
48
Estructura de los Fructooligosacáridos
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Agua
Sacarosa
Al-Na Micelio
Sol. CaCl2
Neosugar G
Neosugar
Flujo de Proceso de la Producción de
Neosugar
(1) Reactor de lecho empacado (2) Columna de carbon activo (3) Columna de Intercambio iónico (4) Columna de carbón vegetal (5) Concentrador
(1) (2) (3)
(4)
(5)
(5)
50
51
Fructosiltransferasa
Fructosiltransferasa Fructosiltransferasa
FOS-3 sacarosa sacarosa
E-Fru
fructosa
Fructosiltransferasa
FOS-3
FOS-4
glucosa
Mecanismo de Transfructosilación
Vega 2014. Biochemical Engineering Journal 82: 158-165
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Screening de fructosiltransferasas para
producir FOS
Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51
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Picos Cromatográficos de FOS
1) FOS-5 4) Sacarosa 2) FOS-4 5) Glucosa 3) FOS-3 6) Fructosa
Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51
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Producción de Biodiesel
Transesterificación de un triglicérido y esterificación de un
ácido graso libre para producir ésteres metílicos de ácidos
grásos , glicerol y agua.
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Tema 2
Cinética enzimática en sistema homogéneo
Hipótesis de la cinética enzimática
Determinación de los parámetros cinéticos
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S, P
Cinética Enzimática Es el estudio de la velocidad de las reacciones enzimáticas, variando
las condiciones químicas y físicas. Las ecuaciones de velocidad son
importantes en el diseño de un bioreactor enzimático.
S P E
[ ] [ ]d S d Pv
dt dt
Mecanismo de la reacción enzima-sustrato
1
1
2
k
k
k
S E ES
ES E P
63
Hipótesis del equilibrio rápido (Michaelis-Menten)
2
1
1
[ ]
[ ] [ ] [ ]
[ ][ ]
[ ]
t
v k ES
E E ES
k E SK
k ES
/[E]t 2 2
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] 1 [ ] [ ]t
v ES ES Ek k
E E ES ES E
[ ] [ ]
[ ]
ES S
E K
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Hipótesis del equilibrio rápido (Michaelis-Menten)
max[ ]
[ ]
V Sv
K S
[S]
Vmax
maxVmaxV
max 2
1
1
[ ]V k E
kK
k
donde:
65
Hipótesis del Estado Estacionario (Briggs-Haldane)
2
1 1
1 1 2
0
[ ]
[ ][ ] [ ]
[ ][ ] [ ] [ ] 0
[ ] [ ] [ ]
P
s
ES
v k ES
v k S E k ES
v k E S k ES k ES
E E ES
66
max[ ]
[ ]M
V Sv
K S
2 2
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] 1 [ ] [ ]
P
t
v ES ES Ek k
E E ES ES E
1 2 1[ ][ ] ( )[ ]
[ ] [ ]
[ ] M
k E S k k ES
ES S
E K
1)
2)
3)
Hipótesis del Estado Estacionario (Briggs-Haldane)
max 2
2 1
1
max
[ ]
M
M
V k E
k kK
k
V
K
donde:
Eficiencia catalítica
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Unidades de Vmax
Si v está en mol/L. min, entonces [E]t= mol/L, k+2= min-1 . Se
tiene que conocer el peso molecular de la enzima, la actividad
específica y número de sitios activos.
Si v está en µmol/L.min, entonces [E]t = UI/L, k+2 es 1
UI: Unidades internacionales µmol/min.
68
Determinación de los parámetros cinéticos
1) Lineweaver-Burk
69
Determinación de los parámetros cinéticos
2) Headdie-Hofstee v
v/S
Vmax
KM
3) Hanes S / v
S K/V
1/V
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Integración de la Ecuación de Michaelis-Menten
[ ] [ ]
[ ]
dP d S V Sv
dt dt K S
[ ]
[ ] 0
[ ][ ]
[ ]i
S t
S
K Sd S Vdt
S
[ ] [ ] [ ]1 1ln( )
[ ]
i iS S SV
t S K K t
[ ]1 1 [ ]ln( )
[ ] [ ]
P V P
t P P K K t
t [S] [P]
0 [Si] 0
----
-----
-----
-----
too [Poo]
71
Problema 1
β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa y es ampliamente utilizada en la industria láctea. Una preparación de β-galactosidasa comercial de Kluyveromyces marxianus var lactis está siendo utilizada en la producción de leche de baja lactosa. Es conocido que 500 UI de β-galactosidasa por litro de leche se requiere para reducir el contenido de lactosa en la leche en un 80% durante almacenamiento (considerado satisfactorio) y usted debe calcular el requerimiento de enzima dosada (mL de preparación enzimática para ser adicionada por L de leche). Para hacer esto, la actividad de la β-galactosidasa de la preparación enzimática se debe determinar. El ensayo enzimático se basa en determinar la glucosa en un sistema de HPLC con un detector de índice de refracción. El procedimiento analítico consiste en adicionar 0.3 mL de la preparación enzimática, diluida tres veces, a 1.2 mL de 150 g/L de solución de lactosa e incubando la mezcla a 35 °C y pH 6.4. Las muestras se toman en diferentes tiempos de reacción y sujetas a inactivación enzimática por calentamiento en agua hirviendo y luego filtrando antes del ensayo de HPLC. Los siguientes resultados se obtuvieron:
72
T (min) 0 2 4 6 8 12 18 26 36 48
G (mM) 0 150 307 461 597 912 942 976 999 1015
Solución:
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60
Glu
cosa
(m
M)
Tiempo (min)
y = 75.811x R² = 0.9997
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 2 4 6 8 10 12 14
Glu
cosa
(m
M)
Tiempo (min)
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74
Problema 2 Un extracto crudo de glucosa isomerasa se ha obtenido después de la cultivación de Streptomyces flavogriseus y la disrupción celular en un homogenizador. La enzima cataliza la isomerización reversible de glucosa en fructosa. Una muestra de 1 mL de este extracto, diluido como se indica en la siguiente tabla, se puso en contacto con 4 mL de 0. 1 M de glucosa (C6H12O6) solución. La concentración de glucosa se monitoreó durante la reacción y los siguientes resultados se obtuvieron:
Tiempo de Reacción (min)
Concentración de glucosa (g/L)
Dilución 1:50 Dilución 1:100
0 14.40 14.40
2 13.91 14.15
4 13.58 13.91
6 13.27 13.64
8 13.04 13.46
10 13.03 13.34
75
Calcule la actividad de la glucosa isomerasa en el extracto crudo, expresándola en UI/mL.
12.8
13
13.2
13.4
13.6
13.8
14
14.2
14.4
14.6
0 2 4 6 8 10 12
Glu
cosa
(g
/L)
Tiempo (min)
Solución:
y = -0.1254x + 14.4 R² = 0.9994
13.6
13.8
14
14.2
14.4
14.6
0 1 2 3 4 5 6 7
Glu
cosa
(g
/L)
Tiempo (min)
Dilución 1:100
y = -0.1971x + 14.4 R² = 0.9815
13
13.2
13.4
13.6
13.8
14
14.2
14.4
14.6
0 1 2 3 4 5 6 7
Glu
cosa
(g/
L)
Tiempo (min)
Dilución 1:50
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Problema 3
Derive una expresión de velocidad para la formación de P del siguiente mecanismo enzimático reversible:
E S ES P E + + k+1
k-1
k+2
k-2
y cuál sería el diseño experimental para determinar los parámetros cinéticos?
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80
Problema 4: Cinética enzimática de multi-sitio
Suponga que una enzima tiene dos sitios activos de modo que el sustrato se convierte a producto vía la secuencia de reacciones:
E + S ES k+1
k-1
ES S k+2
k-2
ESS +
ESS k+3
ES + P ES k+4
E + P
Derive una expresión de velocidad para la formación de P, asumiendo el estado quasi-estacionario para ES y ESS
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85
Problema 5:
Empleando métodos numéricos, muestre cómo las concentraciones de sustrato, producto y complejo enzima-sustrato cambian con respecto al tiempo en un reactor por lotes para el simple mecanismo de Michaelis-Menten. S [0]= 0.1 mol/L E [0]= 0.01 mol/L Los valores de las constante de reacción son k+1=40 L.mol-1.s-1, k-1=5 s-1 y k+2=0.5 s-1
86
Problema 6:
De una serie de experimentos por lote con una concentración de enzima constante, los siguientes datos de velocidad inicial se obtuvieron en función de las concentraciones de sustrato inicial.
[S], mmol/L Vel. Rx, mmol/L.min
1 0.2
2 0.22
3 0.30
5 0.45
7 0.41
10 0.5
Determine los parámetros cinéticos, por los cuatro métodos estudiados. Discuta los resultados
87
Problema 6:
α-L-fucosidasa cataliza la hidrólisis de α-L-fucosidos en L-fucosa y un alcohol. La actividad enzimática se determinó por medio de las velocidades iniciales de la hidrólisis del sustrato sintético p-nitrofenil α-l-fucopiranosido. Los siguientes resultados se han obtenidos con una preparación purificada de α-L-fucosidasa del molusco marino Pecten maximus a pH 4.5 y 50 °C.
S 1 2 3 4 5 10 15 20
V 51.52 64.15 69.86 73.12 75.22 79.81 81.47 82.34
S: concentración inicial de p-nitrofenil α-l-fucopiranosido (mM) V: velocidad de reacción inicial (µ mol p-nitrofenol.min-1.mg-1)
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89
Una situación diferente se da lugar si más error experimental está involucrado. Asuma que para este propósito los siguientes datos obtenidos con α-L-fucosidasa de hígado de abalone. En la cual las cinéticas enzimáticas se determinan midiendo las velocidades iniciales de hidrólisis del sustrato sintético 2-cloro-4-nitrofenil- α-L-fucopiranosido en α-L-fucósido y 2-cloro-4-nitrofenol, siendo cinéticamente cuantificado mediante la medición de la absorbancia a 405 nm.
S 0.5 1 1.5 2 4 8 16 20
V 2.2 4.8 5.73 7.19 9.68 12.04 13.66 14
S: concentración inicial de 2-cloro-4-nitrofenil-α-L-fucopiranosido (mM) v: velocidad de reacción inicial (µ moles 2-cloro-4-nitrofenol.min-1.mg-1 )
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Problema 7:
Dibuje el perfil de la concentración de sacarosa sobre el tiempo cuando la invertasa se adiciona en un nivel de 1 g/L a 50 mM de solución de sacarosa. Los parámetros cinéticos de la enzima en condiciones de reacción son: KM=10 mM y Vmax= 1000 μmoles.min-1.g-1
enzima .
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Tema 3
Cinética de Inhibición Enzimática Tipos de inhibición de enzimas Determinación de los parámetros cinéticos
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MECANISMOS DE INHIBICIÓN:
96
1) Inhibición Competitiva
Mecanismos de Inhibición
E S + ES E P + + I
EI
k+1
[ ]
[ ]
[ ](1 )
ap
ap
i
V Sv
K S
IK K
K
k-1
k+2
k+3 k-3
3
3
i
kK
k
IC
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97
Mecanismos de Inhibición
2) Inhibición No Competitiva
[ ]
[ ]
apV Sv
K S
P
E S + ES E P + + I
EI
+ I
ESI S +
k+1
k-1
k+2
k+3 k-3 k+1
k-1
k+3 k-3
EI + k+4 [ ]
1ap
i
VV
I
K
'[ ]
[ ]1
iap
i
V IV
KV
I
K
'
4[ ]TV k E
INCT
INCP
98
Mecanismos de Inhibición
3) Inhibición Tipo Mixta [ ]
[ ]
ap
ap
V Sv
K S
E S + ES E P + + I
EI
+ I
ESI S +
k+1
k-1
k+2
k+3 k-3 k’+1
k’-1
k’+3 k’-3
EI + k+4 P
'
[ ]1
ap
i
VV
I
K
'
1 [ ]
1 [ ]
iap
i
I KK
I K
IMT
' '
'
[ ]
[ ]1
iap
i
V V I KV
I
K
'
1 [ ]
1 [ ]
iap
i
I KK
I K
IMP
99
Mecanismos de Inhibición
4) Inhibición Acompetitiva
E S + ES E P + + I
ESI
k+1
k-1
k+2
k’+3 k’-3
EI + k+4 P
[ ]
[ ]
ap
ap
V Sv
K S
'
[ ]1
ap
i
VV
I
K
'
[ ]1
ap
i
KK
I
K
IACT
' '
'
[ ]
[ ]1
iap
i
V V I KV
I
K
'
[ ]1
ap
i
KK
I
K
IACP
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34
100
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
101
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
102
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
Total
# parámetros
2
3 3 4 4 5
3
Acompetitiva Parcial
‘ ‘
4 ‘
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35
103
Gráficos Lineales Secundarios
IC INCT
[ ]ap
i
KK K I
K
[I] [I]
1 1 1[ ]
ap i
IV V VK
-Ki -Ki
104
'[ ]
[ ]1
iap
i
V IV
KV
I
K
'
'
[ ]
[ ]
1 1
[ ]
iI ap
i
V V
I KLim V V
I K
105
Gráficos Lineales Secundarios
IMT
'
1 1 [ ]
ap i
I
V V VK
1/Vap
[I]
1/V
[ ](1 )
ap
ap
ap i
K K I
V V K
[ ]ap
i
I
K
[I]
∆ap
∆
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36
106
1 1 [ ]
ap i
I
K K KK
IACT
[I] K’i
Gráficos Lineales Secundarios
107
Inhibición Acompetitiva Total por altas concentraciones de sustrato
'
'
[ ]
[ ]
1
1
ap
ap
ap
i
ap
i
V Sv
K S
VV
S K
KK
S K
2
'
[ ]
[ ][ ]
i
V Sv
SK S
K
[S] v
----- -----
----- ------
----- ------
----- ------
108
Inhibición Acompetitiva Total por altas concentraciones de sustrato
'
1 1 1 [ ]
[ ] i
K S
v V S V K V
Si S << K
1 1 1
[ ]
K
v V S V
Si S>> K
'
1 1 [ ]
i
S
v V K V
1/v
1/[S]
1/V
1/v
[S]
1/V
30-07-2015
37
109
Problema 1 La enzima α-D-galactosidasa cataliza la siguiente reacción de hidrólisis:
Rafinosa ----> galactosa + sacarosa + fructosa
Se ha determinado que la enzima es inhibida por los productos de la reacción siendo uno de ellos un inhibidor competitivo y los dos restantes inhibidores no competitivos. Los siguientes valores experimentales se obtuvieron en presencia y ausencia de estos productos
v · 10-1 ( mol/ L min)
G (mM) 0 10 50 100 0 0 0 0 0 0
S (mM) 0 0 0 0 1 10 30 0 0 0
F (mM) 0 0 0 0 0 0 0 1 10 100
R (mM)
0.10 0.98 0.45 0.13 - 0.90 - - 0.90 - -
0.25 2.14 1.03 0.33 0.17 1.80 0.8 - 2.00 1.60 -
0.50 3.10 1.70 0.60 0.33 2.60 1.23 0,54 3.10 2.20 0.80
0.75 4.00 2.40 0.87 0.51 3.30 1.47 0,66 3.80 2.80 0.99
1.25 4.50 3.30 1.40 0.78 4.20 1.80 0,78 4.70 3.50 1.20
1.75 5.40 3.80 1.80 1.10 4.50 2.10 0,90 5.10 4.10 -
3.50 6.20 5.04 3.00 1.80 5.40 2.40 1,10 5.90 4.50 1.50
7.00 6.40 5.90 4.20 - 5.90 2.50 1,10 6.20 5.10 -
10.0 6.60 6.30 - - - 2.60 - 6.50 - 1.70
12.5 6.70 6.40 - - 6.0 - - 6.60 5.20 -
15.0 6.70 6.50 5.30 - - - - - - -
32.5 6.80 - 6.20 5.50 - - - - - 1.80
Determine el tipo de inhibición que ejerce cada uno de los productos y las constantes cinéticas respectivas.
110
Los siguientes resultados se obtuvieron con una glucosa 6 fosfatasa (EC 3.1.3.9) purificada de un extracto de hígado de rata. La enzima cataliza la hidrólisis de glucosa 6 fosfato (G6P) a glucosa (G) y fosfato inorgánico (Pi).
Determine el tipo de inhibición ejercida por glucosa. Proponga una expresión de velocidad plausible para la hidrólisis de G6P con glucosa 6 fosfatasa.
Página 48
Problema 2
111
La enzima tanasa cataliza la reacción :
Digalato -----> Galato + ác. Gálico Lo que es de importancia en la industria alimentaria en la remoción de ciertos sabores amargos. Los siguientes valores se han obtenido experimentando con un preparado de tanasa de Aspergillus sp actuando sobre digalato de sodio.
S mM 0.1 0.2 0.4 0.8 1 2 10 50 100 150 200
V mM/h
0.2 0.38 0.74 1.37 1.65 2.78 5 2.77 1.65 1.17 0.91
Determine la expresión cinética correspondiente y los parámetros cinéticos
Problema 3
30-07-2015
38
112
Fenilalanina amonio liasa (EC 4.3.1.5) de Rhodotorula glutinis cataliza la conversión de fenilalanina (X) en ácido trans-cinámico (Y) y amonio (Z), donde Y es un inhibidor competitivo y Z un inhibidor acompetitivo parcial. Desarrolle una expresión cinética paramétrica y evalué los parámetros cinéticos aparentes en términos de las correspondientes constantes de Michaelis e inhibición.
Problema 4
113
114
30-07-2015
39
115
Problema 5
La enzima lactasa hidroliza lactosa a galactosa y glucosa. Este último se comporta como inhibidor. a) Determine la expresión cinética b) A partir de la tabla anexa, calcular las constantes cinéticas.
V (mmol/mL.min)
Lactosa (mM)
G= 0mM G= 5mM G= 10mM
G= 100mM
G= 1000mM
10 9.09 7.9 7 2.3 0.31
50 33.3 30 27.5 10.8 1.56
100 50 46.2 43.2 19.5 3.08
250 71.4 68.3 65.7 38 7.39
116
Cinética de Reacción con dos Sustratos Mecanismos y Modelos Determinación de los parámetros cinéticos
Tema 4
117
30-07-2015
41
121
Mecanismo Secuencial Ordenado
EA E + A
EA + B EAB
EAB E Y Z + +
[ ][ ] [ ] [ ]
[ ] [ ]A
A
E A EA AK
EA E K
'
'
[ ][ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]B
B
EA B EAB EA BK
EAB E E K
[ ]v k EAB
[ ]
[ ]
[ ] [ ][ ]1
[ ] [ ]t
EAB
v Ek
EA EABE
E E
k
' '
[ ][ ]
[ ] [ ][ ]A B B
V A Bv
K K K A A B
(1)
Hipótesis del Equilibrio Rápido
122
[ ]
[ ]
AP
AP
V Av
K A
'
'
[ ]
[ ]
AP
AP
V Bv
K B
( )
( )
AP
AP
V f b
K f b
'
'
( )
( )
AP
AP
V f a
K f a
Mecanismo Secuencial Ordenado
'
'
'
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
B
A B
B
V BA
K Bv
K KA
K B
' '
[ ]
[ ][ ]
[ ]A B B
V Bv
K K K AB
A
123
Mecanismo Secuencial Aleatorio
KA
K’B
K’A
KB
k
30-07-2015
42
124
Mecanismo Secuencial Aleatorio
EA E + A
EB E + B
EA + B EAB
EB + A EAB
EAB E Y Z + +
[ ][ ] [ ] [ ]
[ ] [ ]A
A
E A EA AK
EA E K
[ ][ ] [ ] [ ]
[ ] [ ]B
B
E B EB BK
EB E K
k
'
'
[ ][ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]B
B
EA B EAB EA BK
EAB E E K
'
'
[ ][ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]A
A
EB A EAB EB AK
EAB E E K
[ ]v k EAB
(2)
(3)
' '
B A A BK K K K
Hipótesis del Equilibrio Rápido
125
[ ]
[ ]
[ ] [ ] [ ][ ]1
[ ] [ ] [ ]t
EAB
v Ek
EA EB EABE
E E E
Mecanismo Secuencial Aleatorio
' ' '
[ ][ ]
[ ] [ ] [ ][ ]A B B A
V A Bv
K K K A K B A B
'
' '
'
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
B
A B A
B
V BA
K Bv
K K K BA
K B
'
' '
'
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
A
A B B
A
V AB
K Av
K K K AB
K A
126
30-07-2015
43
127
Determinación de los Parámetros Cinéticos
A B Y Z + + E
128
Mecanismo Secuencial Ordenado
GRÁFICOS PRIMARIOS
129
Mecanismo Secuencial Aleatorio
GRÁFICOS PRIMARIOS
30-07-2015
44
130
Mecanismo Secuencial Ordenado
GRÁFICOS SECUNDARIOS
131
Mecanismo Secuencial Aleatorio
GRÁFICOS SECUNDARIOS
132
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi
Ecuación de Velocidad en la ausencia de productos Y y Z
[ ][ ]
[ ] [ ] [ ][ ]B A
V A Bv
K A K B A B
30-07-2015
45
133
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
B
A
B
V BA
K Bv
K BA
K B
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
A
B
A
V AB
K Av
K AB
K A
Mecanismo VAP KAP V’AP K’AP
Ping-Pong [ ]
[ ]B
V B
K B[ ]
[ ]
A
B
K B
K B
[ ]
[ ]A
V A
K A
[ ]
[ ]
B
A
K A
K A
134
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi
GRÁFICOS PRIMARIOS
1/v
1/[A]
[B]
-1/KAP
1/VAP
1/v
1/[B]
[A]
-1/K’AP
1/V’AP
135
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi
GRÁFICOS SECUNDARIOS
1/[B] -1/KB
1/VAP
1/V
1/[B] -1/KB
1/KAP
1/KA
30-07-2015
46
136
Problemas Resueltos
v (µmol/min.gcat)
[FGME] [7ACCA]
2 4 6 8 10
2 5.56 10.81 15.79 20.51 25.00
4 8.51 16.33 23.53 30.19 36.36
6 10.35 19.67 28.13 35.82 42.86
8 11.59 21.92 31.17 39.51 47.06
10 12.50 23.53 33.33 42.11 50.00
Problema1: Se ha reportado recientemente la síntesis del antibiótico β-lactámico cefaclor con penicilina acilasa de Bacillus megaterium a partir de ácido 7-aminodesacetoximetil 3-clorocefalosporánico (7ACCA) y D-fenilglicina metil éster (FGME) (Zhang et al. Biocatal. Biotransform. 25(1): 59-64, 2007). Con dicha enzima se ha obtenido los siguientes resultados para la velocidad inicial de síntesis de cefaclor (v) a distintas concentraciones (mM) de 7ACCA y FGME:
Se pide determinar el mecanismo de reacción y evaluar todos los parámetros cinéticos de la reacción
137
Problemas Resueltos
Problema2: La enzima nucleósido difosfato-quinasa cataliza la siguiente reacción:
Concentración GTP (µmol/L) 22 30 50 200
Concentración dGDP (µmol/L)
Velocidad (UI/ml)
20 0,095 0,112 0,141 0,196 25 0,102 0,120 0,155 0,223 40 0,112 0,136 0,180 0,284
100 0,125 0,156 0,218 0,385
GTP + dGDP GDP + dGTP
En un experimento con la enzima aislada desde eritrocitos se obtuvieron los siguientes resultados:
Indique cuál es el probable mecanismo de reacción enzimática y determine los parámetros cinéticos
138
Problemas Resueltos
Problema 3: Los siguientes resultados de velocidad inicial (moles/min g) de síntesis
de Z-aspartame (Z-AM) se han obtenido con un preparado enzimático comercial:
FAME (mM)
ZA (mM)
5 10 20 40
2.5 0.55 1.09 2.13 4.08
5 0.98 1.92 3.70 6.90
10 1.61 3.13 5.88 10.53
20 2.38 4.55 8.33 14.29
La enzima termolisina cataliza la síntesis de Z-AM mediante la unión peptídica de Z-Aspartato (ZA) y fenilalanina metil éster (FAME) - Determinar el mecanismo de reacción enzimática - Determinar el valor de los parámetros del modelo cinético que representan dicho mecanismo
30-07-2015
47
139
Problemas Resueltos
Revisar el Mecanismo de síntesis de Fructooligosacáridos a partir de sacarosa
Biochemical Engineering Journal (2014) 82: 158-165
140
Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática
Tema 5
141
S
En
EnS
+
H+
H+ +
En Pi +
En-1S En+1S H+
En+1 + H+ + En-1
ka
k-a
kb
k-b
k’-a
k’a k’b
k’-b
k-1 k1
k2
+
bb
b
kK
k
aa
a
kK
k
''
'
bb
b
kK
k
''
'
aa
a
kK
k
2[ ]nv k E S
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
1 2
1
k kK
k
30-07-2015
48
142
1[ ][ ] [ ] 0n n
a ak H E k E
1 [ ][ ][ ]
nn
a
E HE
K
1[ ] [ ][ ] 0n n
b bk E k E H
1 [ ][ ]
[ ]
nn bK E
EH
' ' 1[ ] [ ][ ] 0n n
b bk E S k E S H
'1 [ ]
[ ][ ]
nn bK E S
E SH
' ' 1[ ][ ] [ ] 0n n
a ak H E S k E S
1
'
[ ][ ][ ]
nn
a
E S HE S
K
En-1:
En+1:
En-1S:
En+1S:
143
EnS:
' ' ' 1
2 1 1
' 1
( [ ])[ ] [ ][ ] [ ][ ]
[ ] 0
n n n
b a b
n
a
k k k k H E S k E S H k E S
k E S
1 2 1[ ][ ] ( )[ ]
[ ][ ] [ ]
n n
n n
k E S k k E S
E S K E S
1 1 1 1[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]n n n n n n
tE E E E E S E S E S
Balance de la concentración de enzima total
144
'
'
[ ] [ ][ ] [ ][ (1 ) 1 ]
[ ] [ ] [ ]
n b bt
a a
K H K H KE E S
S K H K H
2[ ]nv k E S
2[ ]
[ ] [ ]
n
t t
v k E S
E E
[ ]
[ ]
AP
AP
V Sv
K S
'
'
[ ]1
[ ]
AP
b
a
VV
H K
K H
'
'
[ ][1 ]
[ ]
[ ]1
[ ]
b
aAP
b
a
H KK
K HK
H K
K H
30-07-2015
49
145
'
'
[ ]1
[ ]
AP
b
a
VV
H K
K H
'
' 2 '2
'
1( ) 0
[ ][ ] [ ](1 )
[ ]
AP b
b a
a
dV V K
H Kd H H K
K H
* ' '
' '*
[ ]
2
a b
a b
H K K
pK pKpH
146
Diseño experimental
147
'
'
[ ]1
[ ]
AP
b
a
VV
H K
K H
'
'
[ ]log log log[1 ]
[ ]
bAP
a
H KV V
K H
Zona ácida (I): ' '
a bH K K
'log log log[ ] logAP aV V H K
'log logAP aV pH V pK
' '
a bK K H Zona básica (II):
'log log log[ ] logAP bV V H K
'log logAP bV pH V pK
Determinación de los parámetros cinéticos
30-07-2015
50
148
Zona del óptimo (III): ' '
a bK H K
log logAPV V
pH VAP logVAP
--- ---- ----
--- ----- -----
---- ---- -----
---- ----- -----
pK’a pK’b
Determinación de los parámetros cinéticos
149
pH KAP ∆AP=KAP/VAP
--- ---- ----
--- ----- -----
---- ---- -----
---- ----- -----
[ ][1 ]
[ ]
[ ][1 ]
[ ]
AP bAP
AP a
bAP
a
K K H K
V V K H
H K
K H
[ ]log log log[1 ]
[ ]
bAP
a
H K
K H
Zona ácida (I): a bH K K
log logAP apH pK
Determinación de los parámetros cinéticos
150
Zona básica (II): a bK K H
log logAP bpH pK
Zona del óptimo (III): a bK H K
log logAP
Determinación de los parámetros cinéticos
30-07-2015
51
151
pH ∆AP log∆AP
--- ---- ----
--- ----- -----
---- ---- -----
---- ----- -----
pKa pKb
Determinación de los parámetros cinéticos
152
Efecto de la temperatura sobre la Afinidad, Reactividad y Estabilidad
0 0 0
0 0
ln
ln
G H T S RT K
H SK
RT R
Donde:
Efecto de T sobre K Rx endotérmica
Lo misma Ec. para las constantes de inhibición
153
Efecto de la temperatura sobre la Afinidad, Reactividad y Estabilidad
Efecto de T sobre kcat Ea: 4-40 kcal/mol
30-07-2015
52
154
Diseño experimental
155
Representación esquemática del efecto de la temperatura en la actividad y estabilidad
156
Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática
Inactivación térmica enzimática
T1
T2
T3 T4
e/e0
1
Tiempo
30-07-2015
53
157
Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática
Cinética de inactivación de primer orden Dr k e
kD: constante de velocidad de inactivación de primer orden tiempo-1
e: Concentración de la enzima activa UI/unidad de volumen
158
Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática
Balance de masa para la enzima en un reactor por lotes
( )D
d eVk eV
dt
D
dek e
dt
0
0
ln
exp( )
D
D
ek t
e
ek t
e
1/2
ln 2
D
tk
159
Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática
Eia: Energía de activación para el proceso de inactivación enzimática Eia: 20-200 Kcal/mol
30-07-2015
54
160
Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática
[ ] [ ]
[ ] [ ]
ap
ap ap
V S ke Sv
K S K S
0 0
0
exp( ) exp{ [ exp( )] }[ ]
exp( ) [ ]
a iaDo
E Ek e k t S
RT RTvH
K SRT
161
Problemas Resueltos
Problema 1
162
Problema 1
30-07-2015
55
163
Problemas Resueltos
Problema 2
164
Los siguientes resultados correspondientes al perfil de pH de una lactasa de Aspergillus oryzae:
pH A ( mmolgluc/min g)
pH A (mmolgluc/min g)
1,75 8,7 5,2 478,5
2,0 15,5 5,5 471,5
2,5 45,4 6,0 430,5
3,0 120 6,5 332,5
3,5 250 7,0 193,0
4,0 379,5 7,5 83,0
4,5 451,5 8,0 29,5
4,8 471,5 8,5 9,5
5,0 477,5 A partir de la hipótesis de Michaelis y Davidsohn, determinar los valores de pK del complejo activo lactosa-lactasa y calcular el pH teórico óptimo de la enzima.
Problemas Resueltos Problema 3
165
Problemas Resueltos
Problema 1
30-07-2015
56
166
Problemas Resueltos Problema 2
167
2430.1828446 exp( ) [ ]
543.9 [ ]0.52 exp( )[1 ] [ ]
233262584 exp( )
ANTv
AAAN
T
T
Problema 2
168
Problema 3 Problemas Resueltos
30-07-2015
57
169
Inmovilización de Enzimas Cinética Heterogénea Restricciones Difusionales Externas e Internas
Tema 6
Eficiencia de uso
Flexibilidad operacional
Control de reacción
Pureza del producto
Enzimas Inmovilizadas
Enzima asociada o contenida en una matriz
Aumento de estabilidad funcional
Facilidad de recuperación
Desarrollo de procesos continuos
Costo fabricación X
- adsorción
Unión
- covalente
- inclusión en geles Contención - retención en membranas - CLEC Agregación - CLEA
Enzimas Inmovilizadas
CLEA LentikatsR
30-07-2015
58
Inmovilización covalente de enzimas a soportes activados
ACTIVACIÓN DEL SOPORTE
NaIO4
NaOH 0.1N NaBH4
Glicidol
Guisan et al. (1997)
Oxidación
Inmovilización covalente de enzimas a soportes activados
O
H C NH2 +
Grupos aldehído (soporte activado)
Grupos amino (lis reactivas)
Derivado enzimático
CH N C N
Intermedio Base de Schiff
pH 10
Reducción
NaBH4
Estabilización de la enzima por unión covalente multipuntual
Rigididización 3D
Reduce los cambios conformacionales inducidos
por codisolventes, temperatura...
A través de: varios residuos de la enzima unidos por brazos cortos al soporte
30-07-2015
59
CLEA
Cross – Linked Enzyme Aggregates
Enzima Precipitada
Glutaraldehyde
CLEA Enzima Soluble
PEG
A
Enzima Precipitada CLEA DP Enzima Soluble+ PEI + DS
B
Glutaraldehyde PEG
PEG: Polietilino glicol DS: Sulfato dextrano PEI: Polietilenamina
CLEA CLEA LentiKatsTM Enzima Soluble
PVA CLEA G
PRECIPITACION ENCAPSULACION
Enzima Precipitada
ENTRECRUZA MIENTO
Fuente: Illanes (2008)
30-07-2015
60
178
Algunas Aplicaciones
179
1969- 1970 Aminoacilasa Inmovilizada
180
Comparación de los costos de producción de L-aminoacidos por procesos de lotes y continuo
Industrial Applicattion of Immobilized Biocatalysta 1993. Pag. 3
30-07-2015
61
Precio del azúcar: 1970: $ 0.07 a $0.08/lb 1974: > $ 0.5/ lb 1976 : < $ 0.1/lb
182
Estimated world HFS consumption in millions of tons dry basis
183
From starch to HFS. (Courtesy of Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark.)
30-07-2015
62
184
Dos razones para inmovilizar la Glucosa Isomerasa
Glucosa es una enzima cara debido a los rendimientos
de fermentación bajos (intracelular) y actividad
catalítica baja (sustrato natural xilosa).
La fructosa y glucosa no son estables en las condiciones
de isomerización industrial (60 °C, pH 7.5)
185
Ejemplos de Glucosa Isomerasa inmovilizada comercializada
Parámetros de Inmovilización
Rendimiento de inmovilización
.100IE
C
EY
E
Capacidad de carga del soporte
.100 .100I c RP
C c
P P PY
P P
Rendimiento de inmovilización de proteína
Rendimiento de inmovilización de enzima
argI
c ada e
EE A
M
argc R
c ada
P PP
M
30-07-2015
63
Cinética Enzimática en Fase heterogénea
Efectos conformacionales (c)
Efectos microambientales: rest. difusionales (rd)
partición
Cinética intrínseca Enzima soluble
Cinética intrínseca Enzima inmovilizada
Cinética efectiva Enzima inmovilizada
Efectos conformacionales Impedimentos estéricos
Restricciones difusionales
Restricciones Difusionales
Restricciones difusionales externas p0
p
s0
s
Restricciones difusionales internas
0 L
s0 s0
S P E p0
p
s0
s
0
3
3
''
'
( )
[ ]; [ ]; [ ]
[ ]
s
s
s
J h s s
V sv
K s
M L MJ h s K
T T L
MV
T
'r J v Estado estacionario
Caso I: control por transporte (Ss=0)
0
r J h s
Caso II: control cinético (Ss =S0)
' 0
0
'V sr v
K s
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Velocidad de conversión de sustrato como una función del sustrato del bulk (Illanes, 2008)
Conc. del seno del líq.
0
'
( ) ss
s
V sh s s
K s
RDE, M-M
00
'
'
'
s
Vh K
SK
S
K
v
V
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'
00'
00
0
(1 )( , )
(1 )
s
s s
s
V S
K Sf
V S
K S
obsobs inh
inh
vv v
v
Factor de Efectividad
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 5 10 15 20
β0
η
1,01
5
10
20
100
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Illanes (2008)
Engasser (1978)
Restricciones Difusionales Internas
' ' ''
' '''' '
. . . . ( )
.: .
x x x
dsJ A J A v A x A x
dt
dJ V S dsv Ley de Fick J D
dx K S dx
2 ''
2
0
.. 0
) 0 ) 2
0
d s V SD
K Sdx
I x II x L
dSS S
dx
' '
3
2
[ ].
[ ]
Mv V
T L
LD
T
22
2
''0
0
. 01
.
d
dz
SS VL
K K K D
xz
L
0
) 0 ) 0.5
0
I z II z
ddz
0
( , , )f z
22
2. 0
d
dz
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Sol. Numérica
Sol. Analítica (Cinética Primer orden)
Restricciones Difusionales Internas
' 2 ' 2 '' 3 3
' 22 ''
4.4 .4 . [( ) ]
3
( . ).
.
r r rJ r J r v r r r
d J rr v
dr
dSJ D
dr
2 ''
2
0
.2 0
) 0 )
0
d S D dS V SD
r dr K Sdr
I r II r R
dSS S
dr
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00
0
(1 )( , , )
(1 )sp f
Perfiles de concentración dentro de una partícula de catalizador esférico
β/ β0
Illanes et al. (2003)
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1/v’’
Grunwald (1989). Determination of effective diffusion coefficient: an important parameter for the efficiency of immobilized biocatalysts. Biochem Educ 17:99–102
Handriková et al. (1996). Enzyme and Microbial technology 18: 581-584
Difusividades de lactosa en varios sistemas
Sistema Difusividad (cm2/seg)
K. fragilis en gelatina (5%, 37°C)
4.21x10-8
Gelatina (5%, 5°C) 1.44x10-6
E. Coli en carragenina y goma de algarrobo (5%, 32°C)
3.53x10-8
Carragenina y goma de algarrobo (5%, 32°C)
1.285x10-8
Agua (25°C) 4.9x10-6
Fuente: Castillo et al. (1991)
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Método de Clark y Bailey (1983). (Gráfico Eadie-Hofstee)
Engasser (1978)
Engasser and Horvath (1973)
Polakovic et al. (2001) (diseño óptimos)
Bruce et al. (1974)
Referencias Bibliográficas Illanes A. (2008). Enzyme biocatalysis: principles and applications. Springer. Guisan et al. (2007) . Immobilization of enzyme on glyoxil Agarose. In: immobilization of enzymes and cells. GF. Bickerstaff (ed.). Humana Press.
Engasser and Horvath (1973). J. Theor. Biol. 42: 137-155.
Engasser (1978). Biochimica et Biophysica Acta, 526: 301-310.
Handriková et al. (1996). Enzyme microbial technology 18: 581-584. Polakovic et al. (2001). Chemical engineering science 56: 459-466.
Castillo E. et al. (1991). Enzyme and Microbial Technology 13: 127-133.
Bruce et al. (1974). Effect of Diffusional limitations on Lineweaver-Burk plots for immobilized enzymes. AICHE 20: 503
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GRACIAS