teórica 2. metodología para la caracterización de las...
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•Metodología para la caracterización de las transiciones. •Procesos de congelación.
Teórica 2.
Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado
Propiedades térmicas DTA
DSC
TGA
Propiedades espectroscópicas RMN
IR
Raman
RSE
Propiedades eléctricas DETA
DEA
Conductividad
Propiedades mecánicas MS
DMA
DMTA
Técnicas microscópicas y análisis de imágenes
DSC Differential Scanning Calorimetry
Horno
Sensores
Referencia
Muestra
Determinación de las temperaturas de transición
DSC Differential Scanning Calorimetry
Tm = Temperatura de la muestra TR = Temperatura de la referencia TC = Temperatura de la celda
Tm - TR = dT
Flujo de calor hacia la referencia Tm TR
TC
Flujo de calor hacia la muestra
Sensor-vista superior
Tanque de N2 (l)
Tanque de N2 (g)
DSC
caudalímetro
Calorimetría diferencial de barrido: Termograma típico de un azúcar liofilizado (adaptado de Roos, 1992).
TRANSICIÓN VíTREA
Región vítrea
Región sobreenfriada
Formación de cristales
Fusión de cristales
Temperatura/tiempo
Transiciones de fase de un sólido amorfo
Determinación de la temperatura de transición
vítrea por DSC
Temperatura
∆cp
Τg onset
Τg endsset
Τg midpoint
Fluj
o ex
otér
mic
o de
cal
or
Efecto del agua:
Variación de Tg en función del contenido de agua para glucosa y maltosa.
Transición vítrea de mezclas
Además del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tg de un dado componente
Transición vítrea de mezclas
Ecuación de Gordon y Taylor: Relaciona Tg de mezclas binarias con la fracción en masa y la Tg de los componentes individuales.
21
2211
wkwTwkTw
g m e z c l aggT ⋅+
⋅⋅+⋅=Tg mezcla = Tg observado para una mezcla binaria w1 y w2 = fracción en masa de los componentes puros Tg1 y Tg2 = Tg de los componentes puros k = constante (representa la fuerza de interacción entre los componentes del sistema).
Transiciones entálpicas
Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización
polioles,
Almidón gelatinización retrogradación
Proteínas desnaturalización agregación
DSC Differential Scanning Calorimetry
mW
-6
-4
-2
0
min
C 130 132 134 136 138 140 142 144
0 1 2 3 4 5 6 7
1
2 Exot.
Endot.
Deflección inicial
Area = calor involucrado
Flujo de calor (dh/dt) = TS - TR
dU/S
Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas
Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1
Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1
Soybean
Lupines
Spelt
WheatmW2
°C50 60 70 80 90 100
exo Vegetable Proteins (1) 13.03.1998 10:14:32
DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S
2. Gelatinización de almidón
Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C
Wheat
Corn
Potato
Rice
mW2
°C40 50 60 70 80
exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38
DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S
3. Fusión/crist. de lípidos
Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)
Sacandé y col., 2002
Técnicas complementarias: Microscopía
Microestructura de sistemas amorfos
Clausse, 2006
Platina térmica
Platina térmica Sistema de control de temperatura
Tanque de N2 L
-300
-200
-100
0
100
200
300
-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)
Hea
t flo
w (m
W)
Exot
herm
icEn
doth
erm
ic
+20°C
Free
zing
Icemelting
-17°C-20°C
-1°C +4°C
Unfrozenwater
Ice
Clausse, 2006
masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g
Termogramas de agua (DSC)
Micrografías de soluciones de NaCl (180x)
Clausse, 2006
Rayos X
Para analizar cristalinidad o amorficidad
Técnicas complementarias:
Todos los solutos forman vidrios?
Dulcitol
(galacti-tol)
Sorbitol
Iditol
Maltitol
Manitol
solución cristal
Conformaciones moleculares de polioles
c
v
v
v
c
No deben modificar su conformación al cristalizar
Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores temperaturas de fusión y mayores ∆Hf
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 0.2 0.4 60 80 100
Solid mass fraction (%)
Tem
pera
ture
(°
C) Tm
Tg
Ts
cg'
solution
ice+glass
glass
Tg'
Maximum
100
120
V
G
Maximum ice crystallization rate ice + freeze-concentrated solution
C
B E
ce
A
D
F
Vitrificación por congelación rápida o secado
Cuando el agua se encuentra formando parte de una mezcla binaria con un soluto es importante determinar cuáles son las fases presentes en función de la composición, temperatura o de la presión. Además de las condiciones de equilibrio que proveen los diagramas de fase, los diagramas de estado suplementados incorporan la curva de temperatura de transición vítrea. Proveen información acerca de condiciones de no equilibrio y estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, incluyen la noción de tiempo completando así la información de los diagramas de fase.
Diagramas de estado suplementados
Estos diagramas son especialmente útiles para analizar la estabilidad en sistemas congelados, deshidratados o parcialmente deshidratados que no corresponden a estados de equilibrio termodinámico.
Concentración de soluto, %
• Temperatura de transisición vítrea (Tg) • Fusión de hielo (Tm) • Solubilidad (Tm
s)
Dichas curvas definen regiones de estabilidad variable.
(adaptado de Fennema, 1996).
Diagrama de estado suplementado para un sistema binario.
Líquido sobreenfriado
Solución
Hielo + solución
Hielo + líq. sobreenfriado Vidrio
Tem
pera
tura
, °C
Región comprendida entre Tm (equilibrio) y Tg: El sistema se encuentra, con raras excepciones, en un estado de no equlilibrio. La curva Tm define las condiciones donde el solvente (agua) puede cristalizar. Si la concentración de soluto supera la concentración definida por el punto eutéctico en el diagrama de fases, puede formarse un sólido eutéctico (soluto y solvente) o bien el solvente continúa cristalizando en una solución sobresaturada. La primera situación ocurre con las sales mientras que la segunda ocurre comúnmente con azúcares, polímeros y comp. polioxhidrílicos.
Zona metaestable donde puede ocurrir cristalización de solutos. En condiciones de temperatura y concentración cercanas a la curva de solubilidad, la velocidad de cristalización aumenta con la sobresaturación. Sin embargo, cuando el sistema se acerca a la curva de Tg, ya sea por concentración o congelación, la viscosidad aumenta drásticamente y la velocidad de cristalización disminuye debido a limitaciones difusionales. A Tg, las restricciones en la movilidad molecular del sistema son tales que impiden la cristalización en escalas de tiempo razonables. Cabe remarcar que éste es un estado dinámico (restringido cinéticamente) y no un estado de equilibrio.
Región comprendida entre las curvas Tms y Tg:
Región comprendida debajo de la curva de Tg: Si el material adquirió el estado vítreo, en general, las reacciones o procesos que dependen de la transferencia de masa o de la difusión están restringidos y son muy lentos. La cristalización, por ej., no ocurre en una escala de tiempo práctica. No es una condición de equilibrio sino un estado metaestable.
Congelación
Efecto de la velocidad de enfriamiento
Control de la cristalización. Variables extrínsecas 1. Velocidad de cristalización 2. Temperatura mínima alcanzada
Control de la cristalización:
Variables intrínsecas (Composición)
a) Presencia de agentes nucleantes:
Ejs. IAg; bacterias.
b) Modificación del crecimiento de los cristales de hielo:
Péptidos anticongelantes (en realidad inhiben el crecimiento de los cristales): peces antárticos.
Presencia de biopolímeros: gomas
Presencia de sales
La fuerza impulsora para los procesos de cristalización es la diferencia en potencial químico entre la fase solución y el sólido cristalino.
Puede expresarse como la diferencia de concentración respecto a la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el sistema que cristaliza y su punto de fusión.
Formación de hielo: La línea que se extiende desde el punto eutéctico (TE) a Tg’, representa condiciones de no equilibrio. Si el sistema se almacena a:
T > TE ⇒ fusión del hielo
T < Tg’ ⇒ sistema altamente viscoso, movilidad molecular muy reducida, limitaciones difusionales que impiden la cristalización de agua.
Máxima formación de hielo ⇒ congelación lenta a temperaturas entre TE y Tg’.
Congelación Formas de congelación y cantidad de
hielo formado
Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.
(A)Enfriamiento previo a -100°C a 30°C/min. Se observa formación de hielo al calentar (5°C/min) por encima de Tg.
(B) Enfriamiento a -100°C, mantenimiento 15 min a -48°C, re-enfriamiento a -100°C, para máxima formación de hielo.
Cambios inducidos en las biomoléculas por la congelación
Estrés Respuesta celular
Reducción de T Cambios de fase de lípidos de membrana
Aumento de la conc. de soluto Encogimiento osmótico
Aumento de fza iónica. Efectos directos en membranas, solubilización de proteínas de membrana
Deshidratación Desestabilización de bicapas lipídicas Precipitación de sales y formación de eutécticos variable
Formation de burbujas de gas Daño mecánico a membranas/citoesqueleto
Aumento de viscosidad Los procesos difusivos (ósmosis) se limitan Cambios de pH Desnaturalización de proteínas etc. Las células se comprimen Daños en membranas
Efecto de distintos crioprotectores en la estabilidad de LDH en congelado/descongelado
Comparación daño por cong./descong (tramado) con liofilizado (sólido). PFK con aditivos 0,5M
Velocidades de congelación:
Lenta: ≤ 1 °C/min
Rápida ≥ 100°C/min
La temperatura crítica que usualmente tiene efacto sobre la supervivencia de organismos vivientes es -40°C.
Los procedimientos desarrollados para la preservación de organismos por congelación o secado son aún altamente empíricos.
La presencia de cierto contenido de agua y el mantenimiento de un rango de temperaturas es un requerimiento para organismos vivientes.
Cuando a dos tipos de células distintas se aplica la misma velocidad de congelación, se obtienen diferentes niveles de congelación intracelular.
En células de levadura permanece una significativa cantidad de agua a velocidades > 10°C/min.
En glóbulos rojos, un aumento similar de agau remanente en las células se observa cuando la velocidad es > 1000°C/min.
Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.
Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.
La supervivencia de células de Saccharomyces cerevisiae luego de congelar y descongelar es máxima para una velocidad de congelación de 1 a 10°C/min.
La existencia de este óptimo se debe a dos fenómenos:
Efectos mecánicos
Efectos de los solutos
Efectos mecánicos
Congelación extracelular
•Cuando una suspensión de células se somete a enfriamiento lento, la cristalización de hielo comienza en el medio externo y su interior se mantiene en estado sobre-enfriado hasta ~ -10°C.
•En ese rango de T el agua sobre-enfriada tiene mayor presión de vapor que el hielo, y el agua intracelular se expele, causando deshidratación progresiva de las células.
Efectos mecánicos
•El agua que sale de las células congela en el exterior al encontrarse con cristales ya formados.
•Si el enfriamiento es lento, el sistema se equilibra con la expulsión de agua y las células se encogen por pérdida de agua intracelular, cuya concentración de solutos aumenta.
•
agua hielo
hielo hielo
Causa de daño por congelación intracelular
Cell
water Extracell.
ice
ice ice ice ice Supercooled cytoplasm
Sistemas congelados
Mecánicos
Dependientes de la velocidad
Químicos
Cambios de pH
Aumento de fuerza iónmica.
Daño por congelación intracelular
Efectos mecánicos
Congelación intracelular
•De un enfriamiento rápido, resulta cristalización intracelular, como resultado de la nucleación con hielo que proviene del exterior a través de ductos en las membranas.
•A su vez, si el enfriamiento es muy rápido, los cristales son pequeños y si es ultra-rápido ocurre vitrificación.
•Si se debe evitar el crecimiento de cristales, el descongelado debe ser muy rápido también.
Efectos mecánicos
•El enfriamiento muy rápido lleva a alta supervivencia, si está seguido de un descongelado rápido.
•Pero si el descongelado no puede ser lo suficientemente rápido, es mejor congelar más lentamente ya que la deshidratación de las células limita el desarrollo de cristales intracelulares.
•La velocidad de congelación que causa congelación intra y extracelular depende de la velocidad de movimiento del agua de adentro hacia afuera.
•Las condiciones de congelación que provocan cristalización intracelular causan disminución de viabilidad.
Tanto plantas como animales tienen mecanismos para evitar la cristalización de hielo. Los tres principales mecanismos son: •Formación de vidrios. •Cristalización extracelular. •Proteínas anticongelantes.
Sistemas congelados
Congelación rápida (ej. con nitrógeno líquido): Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se obtiene un sistema amorfo con un valor de Tg (menor que Tg’) que será dependiente de la cantidad de agua asociada a la fase amorfa. Congelación lenta: Favorece la formación de hielo, que será máxima a Tg’ < T< TE,
Tiempo
Congelación lenta
Congelación rápida
Can
tidad
de
hiel
o fo
rmad
o, %
Cg’, Tg’: Punto en el diagrama de estado definido por la intersección de las curvas de fusión y de Tg. Corresponde a una concentración de soluto/temperatura a la cual la cristalización de agua está inhibida cinéticamente. Cg’ es la concentración correspondiente a la matriz máximamente concentrada por formación de hielo: a Cg’ se alcanza la mínima cantidad de agua asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar por crioconcentración. Tg’ es la temperatura de transición vítrea correspondiente a esa matriz.
Crioconcentración
Caraterísticas de Tg’ : • El valor es independiente de la concentración inicial, sólo depende de la composición o tipo de soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su diagrama de estado característico que diferirá cuantitativamente pero no cualitativamente del diagrama mostrado en la Figura anterior. • Se determina generalmente por DSC a partir de soluciones que fueron almacenadas en condiciones de máxima formación de hielo. • Conocer el valor de Tg’ es importante para evaluar la estabilidad de productos congelados (los cuales a Tg’ son estables a la cristalización de agua por largos períodos de tiempo).
Compuesto
T’g (°C)
Pentosas
Ribosa -48
Xilosa -47
Hexosas
Fructosa -42
Glucosa -43
Manitol -40
Disacáridos
Sacarosa -32
Trehalosa -30
Lactosa -28
Trisacáridos
Rafinosa -26
Tetrasacáridos
Estaquiosa -24
Maltohexaosa -15
Ciclodextrina -9
Temperaturas de transición vítrea de carbohidratos máximamente concentrados.
• Gráfico ∆H de fusión vs. Cont. de agua.
Extrapolando hasta ∆H =0 se obtiene el cont. de agua de la matriz concentrada.
• A partir de los termogramas, disminuyendo el contenido de agua hasta que no aparezca agua congelable.
• Luego de efectuar una serie de templados, determinando la Tg de la matriz concnetrada y calculando su contenido de agua por Gordon y Taylor.
Determinación de la matriz máximamente concentrada (Tg’/cg’)
Muchas sales forman soluciones sobresaturadas durante el enfriamiento y eventualmente vitrifican. Durante la descongelación muestran una transición vítrea y luego cristalización del eutéctico.
Las soluciones binarias agua-sal tienden a formar eutécticos pero las mezclas ternarias de dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua generalmente vitrifican.
La formación de eutécticos parciales puede estar entonces acompañada de importantes cambios de pH.
Formación de vidrio y separación de fases eutéctica en soluciones de sal
Sal Tg’ Te
NaCl.2H2O <-60 -21.7
NaHCO3 -52 -4
Tris base -55 -4
Glicina -70 -4
β-Ala -65 -14
CaCl2 -95 -52
NaCit -41 --
KCit -62 --
NaAc -64 --
KAc -76 --
Influencia de la velocidad de congelación sobre la morfología de los cristales en la muestra congelada
Lento
Rápido
hielo Sólidos en la matriz no congelada
Posibles estrategias para evitar daños por hielo.
1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados) 2. Aumento de la velocidad de nucleación extracelular INAs 3. Inhibición del crecimiento de cristales AFP
Son lipoproteínas de cerca de 30 kD que reducen el grado de sobreenfriamiento. Proveen estructuras parecidas al hielo que sirven de molde.
Ice nucleating Agents (INAs)
Termogramas de agua pura y agua con agentes nucleantes (AgI o bacterias).
Colorado potato beetle
Ice nucleating bacteria from insects (Pseudomona syringae and Erwinia herbicola)
Muchos sistemas biológicos promueven nucleación heterogénea por medio de agentes nucleantes de hielo (INAs). Estos agentes nuclean hielo entre las células. Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C. INAs adaptativos: son generalmente proteínas con PM hasta 30000. Los aminoácidos se encuentran ordenados de tal forma que forman un molde para el hielo. Se forma una capa de hielo en la superficie de los INAs. Sin embargo, esto no llevará al crecimiento de cristales si no alcanzan un tamaño mayor que r*
Agentes nucleantes de hielo
Proteinas anticongelantes AFP
En condiciones de baja temperatura muchas plantas producen crioprotectores coligativos, como prolina o sacarosa.
En otras, ocurren cambios en proteínas y lípidos de membranas.
Unas pocas plantas son capaces de producir AFP que las protegen de los efectos negativos de la congelación.
AFP
Se identificaron en peces antárticos pero luego se encontraron en microorganismos, insectos, plantas y nematodos.
(2,600 - 33,000 Daltons)
Actúan evitando el crecimiento de los cristales de hielo (bajo efecto sobre propiedades coligativas). Antarctic Notothenoid
Mecanismo
Las AFP inhiben el crecimiento de hielo por adsorción-inhibición. Se adsorben específicamente a los planos de crecimiento de hielo evitando la propagación. Se comportan como “agentes inhibidores de hielo estructurales”
Hexagonal ice grown in aqueous solution
(flat disc)
Ice crystal grown in AFP solution
(bipyramidal)
Type III antifreeze protein (AFP) linked through its N-terminus to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP).
ice-binding site
Pertaya et al., 2007
AFP-GFP on the surface of ice crystals
Pertaya et al., 2007 J Phys: Cond Matter
INAs Sobre-enfriamiento Tn
Costos de energía
Tiempo de congelación
Tamaño de los cristales
Caracterización de los efectos
Caracterización de los efectos
AFPs Sobre-enfriamiento temperatura de congelación
Inhiben crecimiento de los cristales, modifican la morfología del hielo
Tamaño de los cristales,
Rat
e
Temperature
INAS Overall crystallization
Tg Tm
Rat
e
Temperature
AFP Overall crystallization
Tg Tm
Rat
e
Temperature
AFP INAS
Overall crystallization
Tg Tm
Tem
pera
ture
W 0.25 0.5 0.75 1
2
4
150
100
50
0
-50
-100
-150
0
Control cinético de la cristalización de solutos
y agua
Modificación de los diagramas de estado por cambios en la formulación