TUGASBIOLOGI SEL DAN MOLEKULManfaat siRNA dan miRNA

Ayu RiandiniFirda Maretha IvarianiRevi PribadiRicha NurselvianaWinda Putri14065450241406544923140663980614066400001406557680

Oleh Kelompok 3

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS INDONESIATAHUN 2015Manfaat siRNA dan miRNATerobosan siRNASiRNA adalah RNA pendek yang terdiri atas 21-23 pasangan basa (base pair). RNA ini bisa mengakibatkan penguraian mRNA yang dinamakan interferensi RNA (RNA interference) yang biasanya disingkat dengan RNAi. siRNA adalah untai ganda yang relatif lebih stabil sehingga dalam aplikasinya siRNA bisa diintroduksikan baik dengan injeksi langsung maupun dengan mengkloningnya ke vektor pembawa seperti plasmid.Fenomena RNAi ini pertama kali ditemukan pada cacingCaenorhabditis eleganslimatahun lalu. Tahun 1998, Andrew Fire dari Carnegie Institution of Washington bekerja sama dengan peneliti dari Johns Hopkins University dan University of Massachusetts Cancer Center, Amerika Serikat (AS), menemukan adanya respons terhadap RNA pasangan ganda (double-stranded RNA, dsRNA) yang mengakibatkan tidak berfungsinya gen yang spesifik terhadap sekuen barisan RNA tersebut (Fire dkk, 1998). Mereka membuktikan bahwa dsRNA dapat menghambat ekspresi gen unc-22, gen yang mengodekan protein pembentuk serat otot (myofilament) yang banyak ditemui dalam tubuh cacingC elegans.Dari hasil penelitian selama ini dibuktikan bahwa siRNA lebih efektif dan spesifik dibandingkan dengan antisense RNA. Lebih dari itu, efek yang ditimbulkan oleh siRNA ini tidak hanya memberikan efek pada gen makhluk tersebut, tetapi bisa terjaga sampai pada keturunan berikutnya (F1). Fenomena RNAi ini kemudian ditemukan di berbagai makhluk hidup dan diperkirakan ada pada semua makhluk hidup.Adapun fungsi alami dari siRNA ini adalah untuk regulator ekspresi gen, baik gen yang ada dalam tubuhnya sendiri maupun gen yang datang dari luar. Ini merupakan sistem pertahanan alami yang dimiliki setiap makhluk hidup. Penemuan ini menarik perhatian banyak ahli untuk mengaplikasikannya sebagai salah satu terapi untuk berbagai penyakit menular, terutama yang disebabkan oleh virus yang sudah diketahui keseluruhan gennya. Artinya, penggunaan siRNA yang spesifik dengan RNA suatu virus akan menghambat ekspresi RNA virus tersebut. Secara tidak langsung akan menghambat pula perkembangbiakan virus sehingga pasien akhirnya bebas dari infeksi virus.Penemuan microRNAMicroRNAs (miRNA) adalah RNA untai tunggal dengan panjang sekitar 21-23 nukleotida, yang mengatur ekspresi gen. miRNAs dikodekan oleh gen yang ditranskripsikan dari DNA, tetapi tidak ditranslasikan menjadi protein (non-coding RNA). Seperti pada Gambar 3, miRNA diproses dari transkrip primer yang dinamakanpri-miRNAmenjadi strukturstem-looppendek yang dinamakanpre-miRNAdan akhirnya menjadi miRNA yang fungsional. miRNA yang matang sebagian komplementari dengan satu atau lebih mRNA, dan fungsi utamanya adalah menekan ekspresi gen. Fenomena miRNA ini pertama kali ditemukan pada tahun 1993 oleh Lee dkk, tetapi istilahmicroRNAbaru diperkenalkan tahun 2001.Gen yang mengkodekan miRNAs jauh lebih panjang daripada miRNA yang matang (Gambar 3). Transkrip primer atau pri-miRNA memiliki kepala dan ekor poly-A yang diproses menjadi lebih pendek di dalam nukleus, yaitu menjadi strukturstem-loopdengan panjang 70 nukleotida yang dikenal dengan pre-miRNA. Pre-miRNA ini selanjutnya diproses menjadi miRNA yang matang di sitoplasma melalui interaksi dengan Dicer. miRNA kemudian membentuk kompleks denganRNA-induced silencing complex(RISC). Kompleks ini yang akhirnya menghambat ekspresi gen.Kebanyakan pre-miRNAs tidak memiliki untai ganda yang sempurna yang ditutupi oleh struktur bundar.Adabeberapa penjelasan mengenai hal ini. Pertama adalah RNA untai ganda yang lebih panjang dari 21 pasang basa mengaktivasi respon interferon dan mesin antivirus di dalam sel. Penjelasan lain adalah profil termodinamik dari pre-miRNA menentukan untai mana yang dilibatkan ke dalam komplek Dicer. Kenyataannya, Han dkk memperlihatkan kemiripan yang jelas antara pri-miRNA yang dikodekan di masing-masing demonstrated very clear similarities between pri-miRNAs yang dikodekan di masing-masing ujung-5 atau ujung-3.

Ketika Dicer melepaskan strukturstem-loopdari pre-miRNA, molekul RNA untai ganda pendek yang komplementari terbentuk, tetapi hanya satu diantaranya yang terintegrasi dengan komplek RISC. Untai ini dikenal dengan untai pemandu (guide strand). Sementara itu, untai lain yang dikenal dengananti-guideataupassenger strand, diuraikan sebagai substrat komplek RISC. Setelah terintegrasi ke dalam komplek RISC yang aktif, miRNA berpasangan dengan dengan mRNA yang komplementari dengannya, dan akhirnya menyebabkan degradasi mRNA.FUNGSI MIRNA DI DALAM SELFungsi miRNA adalah pada regulasi ekspresi gen.Untuk menjalankan fungsinya, sekuen miRNA harus komplementari dengan sekuen sebagian mRNA. Pada hewan, miRNA biasanya komplementari dengan bagian3-untranslated region(3-UTR), sedangkan pada tanaman biasanya komplementari dengancoding-regiondari mRNA. Ikatan (annealing) miRNA dengan mRNA ini akhirnya menghambar translasi protein, tetapi terkadang menfasilitasi degradasi mRNA. Proses ini diperkirakan model aksi yang utama pada miRNA tanaman. Pembentukan untai ganda RNA melalui ikatan miRNA ini memicu degradasi mRNA, seperti yang terjadi pada proses RNAi. Namun pada kasus lain diperkirakan bahwa kompleks miRNA memblokir mesin translasi protein atau mencegah translasi tanpa degradasi mRNA.HUBUNGAN MIRNA DENGAN PENYAKITmiRNA ditemukan berhubungan dengan beberapa penyakit. Salah satu contohnya adalah kanker. Studi pada mencit menunjukan bahwa miRNA memiliki efek terhadap pekembangan kanker. Mencit yang direkayasa untuk memproduksi miRNA dalam jumlah yang banyak di dalam sel limfoma menjadi kanker dalam waktu 50 hari dan mati 2 minggu berikutnya. Sementara mencit yang tidak menghasilkan miRNA bisa hidup lebih dari 100 hari. Studi lain menemukan bahwa dua miRNA menghambat translasi protein E2F1, yang mengatur proliferasi sel. miRNA sepertinya berikatan dengan mRNA sebelum terjadinya translasi.Dengan mengukur aktivitas 217 gen yang mengkodekan miRNA, pola aktivitas gen dapat membedakan tipe kanker yang ada. Artinya miRNA dapat digunakan untuk klasifikasi kanker, yang memungkinkan dokter untuk menentukan tipe jaringan asli yang menyebabkan kanker dan memberikan terapi yang tepat berdasarkan tipe jaringan asli tersebut. Saat ini, profil miRNA telah bisa menentukan apakah pasien leukemia limfositik kronik memiliki kanker tipe agresif atau tidak (Calin dkk, 2007).miRNA juga telah dibuktikan memiliki hubungan dengan penyakit jantung. Mencit yang direkayasa sehingga miRNA yang spesifik untuk otot jauh berkurang, memperlihatkan penyakit jantung umum dengan frekuensi yang tinggi. Mencit ini juga memperlihatkan gejala hiperplasia (peningkatan sel otot jantung yang mengakibatkan pembesaran jantung) dan aliran panas jantung yang tidak normal.

Terapi RNABaik anti-sense RNA, siRNA maupun miRNA memiki fungsi yang sama, yaitu menghambat translasi protein, yang diperlukan dalam berbagai proses pada berbagai organisme. Artinya, jika anti-sense RNA, siRNA, dan miRNA dirancang terhadap target tertentu seperti organisme patogen atau sel kanker, target tersebut bisa dibuat menjadi tidak berfungsi.Untuk siRNA, telah diuji kemampuannya untuk menghambat perkembangbiakan beberapa virus. Glen A Lobun dan Bryan R Cullen dariDuke University Medical Center,AS, membuktikan bahwa siRNA yang dirancang untuk protein Tat dan Rev dari virus HIV berhasil memblokir ekspresi kedua gen tersebut secara spesifik (Lobun and Cullen, 2002). Sementara itu, grup penelitian yang dipimpin oleh Charles M Rice dari Rockefeller University, AS, berhasil menekan replikasi virus hepatitis C (HCV) dengan menggunakan siRNA yang ditargetkan terhadap enzim polimerase dari virus tersebut (Hsu et al, 2003). Karena enzim ini penting untuk replikasi virus, penghambatan ekspresi enzim secara otomatis akan menghambat replikasi virus HCV. Begitu juga gabungan grup penelitian dari Tokyo Medical and Dental University dan National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Jepang, juga berhasil menekan replikasi HCV dengan menggunakan siRNA yang spesifik untuk Internal Ribosome Entry Site (IRES), sekuen yang penting untuk inisiasi translasi mRNA menjadi protein (Yokota et al, 2003). Beberapa peneliti juga telah membuktikan bahwa siRNA dapat menghambat replikasi dan perkembangbiakan virus-virus lain seperti virus influenza (Ge et al, 2003) dan virus polio (Gitlin et al, 2002).Sama halnya dengan siRNA, peluang miRNA untuk digunakan sebagai terapi berbagai penyakit juga tengah dipelajari. Pengontrolan aktivitas miRNA diharapkan bisa meringankan gejala penyakit. Saat ini dimungkinkan untuk mengembangkan produk terapetik berbasis miRNA, sehingga dapat meningkatkan atau menurunkan tingkat protein yang berperan dalam berbagai penyakit seperti kanker, penyakit jantung, penyakit infeksi, gangguan metabolisme dan apoptosis.siRNA dan miRNA ini adalah hal yang relatif baru, sehingga banyak yang perlu dianalisa untuk bisa digunakan menjadi sesuatu yang bisa membantu pasien berbagai penyakit. Tentunya kita berharap agar terapi RNA ini bisa segera terealisasi.

Kendala dalam Penggunaan Terapi RNA secara klinikProspek dari penggunaan molekul RNA dalam aplikasi pengobatan diharapkan dapat segera direalisasikan. Namun demikian, para ahli menyadari masih adanya kendala-kendala yang harus diantisipasi agar molekul RNA tersebut dapat digunakan dengan hasil yang optimal.Faktor-faktor yang menjadi penyulit, yaitu karena antisense RNA maupun siRNA harus dimasukan ke dalam sistem biologis sel hidup, bukan pada media sel bebas (Agrawal, et al,2003); sehingga1. Molekul antisense RNA harus menghindari pemecahan oleh enzim nuklease yang akan memotong asam nukleat menjadi basanya. Enzim ini ada di mana-mana, baik di dalam sirkulasi darah maupun di dalam sel. Untuk membuat asam nukleat lebih resisten terhadap enzim ini telah dibuat beberapa strategi, salah satunya adalah dengan cara mengganti oksigenpada jembatan basa dengan sulfur, sehingga menghasilkan jembatan fosforotioat yang lebih resiten.2. Terapi harus masuk ke dalam sel. Kendala ini merupakan masalah klasik dalam penggunaan materi genetik dalam pengobatan. Para peneliti telah berusaha untuk merekayasa sistem penghantaran untuk kultur sel. Sebagaimana sistem penghantaran materi genetik yang lain, secara teori penghantaran siRNA dapat dilakukan dengan cara, yaitu (1) introduksi langsungsiRNA sinetik ; (2) introduksi suatu plasmid atau virus yang menyandi sekuens gen yang akan memproduksi siRNA yang sesuai. Cara kedua dianggap sebagai cara yang lebih baik karena memberikan efek yang lebih lama. Asam nukleat bebas mempunyai muatan negatif yang kuat yang berasal dari gugus fosfat dari tulang punggung struktur asam nukleat. Hal ini membuat molekul tersebut mudah larut dalam air, tetapi tidak dapat larut dalam lemak ganda strukturmembrane sel. Dengan menggabungkan asam nukleat dengan suatu pembawa yang berfungsi meningkatkan transpor ke dalam sel; atau juga dikemas dalam suatu kapsul lemak, misalnya liposom, yang telah digunakan secara luas untuk transport amfoterisin dan beberapa obat kanker, diharapkan dapat memenuhi keperluan penghantarannya (Ananthaswamy, 2003). Dilaporkan pula suatu sistem penghantar yang sangat menjanjikan, yaitu berupa ligan peptida dari suatu reseptor kompleks enzim serpin yang dibuat membentuk kompleks dengan materigenetic ini, yang mana dapat menghantar ke berbagai sel target (Roberts,2004). Walaupun sampai saat ini belum ditemukan sistem penghantaran yang sesuai, para ahli tetap optimis. Sebagian dari mereka yakin, bahwa penghantaran antisense RNA dan siRNA mungkin tidak memerlukan vektor berupa virus, ataupun sistem penghantaran yang eksotik seperti pada terapi gen. Mereka berpendapat bahwa siRNA dapat secara langsung diintoduksikan ke jaringan seperti telah disebutkan di atas. Namun demikian, hal inipun bukan berarti tanpa masalah, karena tubuh manusia akan dengan cepat mendegradasi siRNA yang masuk. Untuk mengatasi hal tersebut perlu dilakukan upaya untuk meningkatakan stabilitas siRNA, salah satunya dengan modifikasi kimia (Downward, 2004;Lucentini, 2004).3. Di dalam sel, antisense dan siRNA harus ditransportasikan dengan benar. Mula-mula RNA ditangkap dalam endosom, kemudian bertemu dengan lisosom untuk degradasi intraseluler. Hanya sebagian kecil yang bisa lolos melewati Pemecahan endosomal. Setelah bebas didalam sitoplasma, molekul ini masuk ke dalam nukleus, kemudian berdifusi lewat pori-pori membran, dan di dalam nukleus ini akan bertemu dengan target. Jika seluruh gen atau messenger di dalam nucleus dalam keadaan tidak terlindungi atau berbentuk linier, pelaksanaan terapi akan lebih mudah. Pada kenyataannya, baik DNA maupun RNA terlipat secara rapi dan juga diselubungi oleh protein biasa. Pada RNA masalah menjadi sangat berat, karena pengetahuan tentang struktur RNA yang terlipat di dalam sel hidup masih sangat sedikit. Untuk mencapai sasaran terapi, masih digunakan cara trial and error: satu seri percobaan dengan RNA dimulai pada target lokasi awal untuk transkripsi atau translasi, dengan harapan bahwa lokasi tersebut relatif terbuka (Agrawal, et al., 2003).4. Masalah selanjutnya adalah bagaimana dapat terjadi interaksi antara terapi dan target, sehinga dapat menghasilkan hibrida yang stabil. Antara basa guanin (G) dengan sitosin (C) terdapat tiga ikatan hidrogen, sehingga merupakan ikatan yang lebih stabil dibandingkan dengan dua ikatan hydrogen antara adenin (A) dengan timin (T). Panjang minimum untuk rancangan suatu untai RNA ditentukan oleh besarnya genom. Di dalam genom manusia, bagi molekul RNA yang terdiri dari basa berjumlah kurang dari 12-15, tampaknya akan mengalami proses penggandaan, dan mungkin akan merusak gen atau messenger yang tidak sesuai. Oleh karena itu, agar terapi stabil dan dikenali, maka panjang basa nukleotidanya adalah antara 13-20 basa.5. Setelah terbentuk hibrida, tugas selanjutnya adalah merusak target. Antisense yang dirancang untuk mRNA akan berhasil jika didukung oleh enzim RNase H, yaitu enzim yang bekerja memotong messenger. Jika antisense adalah untai tunggal DNA, maka akan langsung berpartisipasi dalam destruksi messenger selanjutnya. Destruksi messenger ini memang diinginkan. Akan tetapi hybrid ini lambat laun akan menimbulkan instruksi genetik yang dapatmenerjemahkannya ke dalam protein yang berhubungan dengan penyakit, dan ini dilakukan oleh ribosom yang mempunyai aktivitas instrinsik untuk menguraikan dan memfasilitasi pembacaan pesan genetik tersebut. Untuk menghindari hal ini, harus dibuat antisense yang ikatannya kuat. Dupleks DNA / RNA lebih lemah daripada dupleks RNA /DNA, maka sedang pula dikembangkan usaha untuk membuat DNA yang miripRNA (Agrawal, et al., 2003).6. Dari sisi efikasi, RNAi telah diketahui menunjukkan spesifisitas yang cukup tinggi. Akan tetapi, sebagaimana molekul-molekul kecil yang lain, kemungkinan terjadinya masalah dalam aplikasi klinik tetaplah ada. Efek samping yang mungkin saja terjadi berupa terhambatnya ekspresi gen-gen lain yang bukan target, baik akibat degradasi mRNA, penghambatan translasi,Ataupun melalui induksi penekanan gen secara global dengan jalan mengaktifkan respons interferon, terlebih jika siRNA diekspresikan oleh vektor virus.

Malik, Amarila. 2005. RNA Therapeutik, Pnedekatan Baru dalam Terapi Gen. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.2, Agustus 2005, 51 - 61Utama, Andi. 2015. Terapi RNA, Akankah Menjadi Penyelamat?. Tersedia di (http://www.unisosdem.org/article_detail.php?aid=3025&coid=1&caid=56&gid=5). Di akses tanggal 11 Mei 2015