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TESIS DE MAESTRÍA

“HIV-1: Obtención de la proteína p24 recombinante en

Escherichia coli y evaluación de su reactividad

inmunológica”

Maestría en Microbiología Molecular

UNSAM – ANLIS

Quinta Cohorte

Maestrando: Bioq. Mariana Andrea Zak

Director: Dr. Alexis Edelstein

Año: 2014

ÍNDICE

Bioq. Mariana Andrea Zak Maestría en Microbiología Molecular

Página 1

ÍNDICE

ABREVIATURAS ........................................................................................................................ 3

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 7

1.1 Reseña Histórica .............................................................................................................. 7

1.2 Situación Epidemiológica Mundial y Nacional ............................................................. 7

1.3 Clasificación Taxonómica y Distribución geográfica .................................................. 9

1.4 Estructura Viral y Ciclo de replicación ........................................................................ 12

1.5 Variabilidad Viral ............................................................................................................ 15

1.6 Historia natural de la Infección Viral ........................................................................... 16

1.7 Diagnóstico de la Infección .......................................................................................... 17

1.8 Materiales de referencia y Control de Calidad .......................................................... 22

1.9 Proteínas recombinantes y sistemas de expresión .................................................. 23

1.10 Desafíos en Salud Pública ......................................................................................... 24

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 26

2.1 Objetivos Generales ...................................................................................................... 26

2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................... 26

3. MATERIALES y MÉTODOS ............................................................................................... 27

3.1 Muestras .......................................................................................................................... 27

3.2 Secuencias de referencia ............................................................................................. 27

3.3 Vector............................................................................................................................... 27

3.4 Cepas Bacterianas ........................................................................................................ 28

3.5 Extracción de ARN viral ................................................................................................ 28

3.6 Obtención del fragmento de interés para clonar ....................................................... 29

3.7 Clonado del fragmento de interés ............................................................................... 32

3.8 Expresión de la p24 recombinante .............................................................................. 36

3.9 Purificación de la proteína recombinante ................................................................... 38

3.10 Cuantificación de la proteína recombinante ............................................................ 38

ÍNDICE


Página 2

3.11 Caracterización de la proteína recombinante ......................................................... 39

3.12 Evaluación de la reactividad inmunológica .............................................................. 42

3.13 Materiales de referencia ............................................................................................. 44

4. RESULTADOS ..................................................................................................................... 47

4.1 Obtención del gen gag y del fragmento codificante de p24 .................................... 47

4.2 Selección del fragmento de p24 a clonar ................................................................... 57

4.3 Clonado ........................................................................................................................... 61

4.4 Expresión de la p24 recombinante .............................................................................. 68

4.5 Purificación de la proteína recombinante ................................................................... 71

4.6 Cuantificación de la proteína purificada ..................................................................... 71

4.7 Caracterización de la proteína purificada .................................................................. 72

4.8 Evaluación de la reactividad inmunológica ................................................................ 75

4.9 Materiales de referencia ............................................................................................... 78

5. DISCUSIÓN .......................................................................................................................... 82

6. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 84

7. ANEXOS ................................................................................................................................ 85

Anexo 1: Vector de expresión ............................................................................................ 85

Anexo 2: Escherichia coli BL 21 (DE3) pLys S ................................................................ 86

Anexo 3: Reactivos y Medios de Cultivo .......................................................................... 87

Anexo 4: Alineamientos ....................................................................................................... 91

Anexo 5: Electroferogramas de secuenciación capilar ................................................. 105

Anexo 6: Resultados de búsqueda de alineamientos locales (BLAST) ..................... 111

Anexo 7: Código genético estándar ................................................................................ 132

8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 133

9. AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... 139

ABREVIATURAS


Página 3

ABREVIATURAS

4 CN: 4 cloro naftol

ºC: grados centígrados

µg: microgramos

µl: microlitros

µm: micrómetros

µM: concentración micromolar

A.N.L.I.S.: Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud

Ac: anticuerpo

ADN: ácido desoxiribonucleico

ADNc: ácido desoxiribonucleico copia

Ag: antígeno

AP: aglutinación de partículas

ARN: ácido ribonucleico

ARNasas: enzimas que degradan el ácido ribonucleico

BLAST: “basic local alignment search tool”, herramienta básica de búsqueda de

alineamientos locales

BSA: seroalbúmina bovina

CA: cápside

CC: concentración

CDC/ASTPHLD: Centros para el control y prevención de enfermedades (Centers for

Disease Control and Prevention) / Asociación de Directores de Laboratorios de Salud

Pública Estatales y Territoriales (Association of State and Territorial Public Health

Laboratory Directors), Atlanta - Estados Unidos de Norteamérica.

cm: centímetros

CRFs: Formas Circulantes Recombinantes

Csp: cantidad suficiente para

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato

DO: densidad óptica

DSyETS: Dirección de Sida y ETS, Ministerio de Salud de la Nación – Argentina.

ABREVIATURAS


Página 4

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

EEUU: Estados Unidos de Norteamérica

ELISA: Inmunoensayo ligado a enzima en fase sólida

fmol: femtomoles

FT: “flow through”, escurrido

Fw: “foward”, sentido

g: gramos

gp: glicoproteína

HIV: Virus de la Inmunodeficiencia Humana

HRP: peroxidasa de rábano picante

hs: horas

I.N.E.I.: Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas

IMAC: cromatografía de afinidad de metales inmovilizados

IN: integrasa

IPTG: isopropil tiogalactósido

Kb: kilobases

Kpb: kilopares de bases

KDa: kiloDalton

KV: kilovoltios

L: litro

LB: ágar o caldo Luria-Bertani

LIA: inmunoensayo en línea

LT CD4+: linfocitos T que presentan el marcador de diferenciación número 4 en su

superficie (CD: “cluster of differentiation”)

LTRs: repeticiones terminales largas

M: concentración molar

MA: matriz

mg: miligramos

ABREVIATURAS


Página 5

mM: milimolar

M-MuLV: Virus de la Leucemia Murina de Moloney (Moloney Murine Leukemia Virus)

ml: mililitros

min: minutos

mseg: milisegundos

N: concentración normal

NC: nucleocápside

Ng: nanogramos

NIH: Instituto Nacional de Salud, Maryland – Estados Unidos de Norteamérica

nm: nanometros

Ni-NTA: matriz de níquel - ácido nitriloacético

Ohm: ohmios

ON: “over night”, incubación durante toda la noche

p: proteína

pb: pares de bases

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

pH: menos el logaritmo en base diez de la concentración de protones

PM: peso molecular

PN: plasma negativo

PNL: plasma negativo liofilizado

PP: plasma positivo

PR: proteasa

P/V: peso en volumen

rpm: revoluciones por minuto

RT: transcriptasa reversa / transcripción reversa

Rv: “reverse”, antisentido

SDS- PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

por agregado de ácido dodecil-sulfónico

ABREVIATURAS


Página 6

SIDA: Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida

SOC: “super optimal broth with catabolic repressor”, caldo súper óptimo con

represores del catabolismo

SN: sobrenadante

T: tiempo

TA: temperatura ambiente

TAE: tampón tris-acético-EDTA

TBS: tampón tris salino

UFC: unidades formadoras de colonia

u: unidades

URFs: formas recombinantes únicas

UV: ultra violeta

V: voltios

V/V: volumen en volumen

WB: “western blot”, electrotransferencia de proteínas a una matriz de soporte para

llevar a cabo reacciones de detección inmunológica

x g: veces la fuerza de gravedad.

INTRODUCCIÓN


Página 7

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Reseña Histórica (1)

Las primeras evidencias del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) causado

por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (HIV-1) surgieron hacia fines de

la década del ´70 en Estados Unidos, Europa y África Central si bien fue en 1983

cuando se aisló el virus por primera vez y se lo clasificó como un retrovirus (2). El

síndrome se caracterizó por la presencia de linfoadenopatía generalizada, infecciones

oportunistas y una variedad de cánceres inusuales, acompañado por la disminución de

la subpoblación de linfocitos T CD4+ como hallazgo de laboratorio. Los primeros casos

involucraron a hombres que tenían sexo con hombres y a usuarios de drogas

endovenosas pero rápidamente se identificaron otros grupos afectados: hemofílicos,

otros pacientes transfundidos, y parejas sexuales e hijos de las personas

pertenecientes a los distintos grupos de riesgo.

Desde su descubrimiento hasta la actualidad, la infección dejó de ser una enfermedad

fatal para convertirse en una enfermedad crónica manejable gracias a la instauración

del tratamiento antirretroviral, aunque muchas sociedades pobres y marginadas aún

hoy no poseen acceso al mismo.

En 1986 se recuperó otro retrovirus humano a partir de individuos de distintos países

de África Occidental al que se denominó HIV-2 (3). Este virus estaba genéticamente

relacionado con el HIV-1 pero resultó ser estructural e inmunológicamente diferente y

menos patogénico.

El HIV-1 tuvo distribución mundial siendo responsable de la pandemia de HIV/SIDA

mientras que el HIV-2 permaneció endémico en África.

1.2 Situación Epidemiológica Mundial y Nacional

Los últimos datos recolectados por el Programa Conjunto de las Naciones Unidas

sobre HIV/SIDA (ONUSIDA) indican que al año 2012 se encontraban conviviendo con

el HIV/SIDA 35,3 millones de personas y que en dicho año se registraron 2,3 millones

de nuevas infecciones por HIV y 1,6 millones de muertes relacionadas al SIDA (4)

(Figura 1).

INTRODUCCIÓN


Página 8

Figura 1. Resumen global de la epidemia de SIDA

Adaptado de diapositivas epidemiológicas UNAIDS, 2013 (4)

Estos datos reflejan que en la última década se han logrado avances significativos

hacia el control de la epidemia. Entre los logros obtenidos a nivel mundial se

encuentran la disminución del 33% en nuevas infecciones y del 52% en nuevas

infecciones en niños desde el 2001, la disminución del 29% en muertes relacionadas

con el SIDA desde el 2005, y un acceso a la terapia antirretroviral 40 veces mayor

entre 2002 y 2012 (5). En América Latina, la disminución de nuevas infecciones por HIV

en 2012 fue de un 11% con respecto al año 2001 y las muertes relacionadas con el

SIDA disminuyeron en un 37% (5).

Aún así, y sobre todo teniendo en cuenta que las diversas realidades locales no se

ponen de manifiesto en los datos globales, es preciso continuar con los esfuerzos que

permitan superar los desafíos que restan para cumplir con el objetivo de terminar la

epidemia a través de la eliminación de la transmisión del HIV y las muertes

relacionadas con el SIDA (6, 7).

En Argentina (8) al año 2012, para una población total de 41.281.631 habitantes, se

encuentran registrados en la Dirección de SIDA y ETS (DSyETS) del Ministerio de

Salud 66.657 diagnósticos de la infección, pero se estima que más del 50% de la

población infectada desconoce su condición. La tasa general de nuevos diagnósticos

(no de nuevas infecciones) para dicho año fue de 13/100.000 habitantes, siendo

aproximadamente el doble para varones que para mujeres. Este valor permaneció

INTRODUCCIÓN


Página 9

estable durante la última década y corresponde a alrededor de 5.500 nuevos

diagnósticos por año.

La epidemia de HIV en el país, como en casi todos los países latinoamericanos,

continúa siendo de tipo “concentrada”, es decir que la proporción de personas

infectadas en la población joven y adulta es menor al 1%, pero mayor al 5% en

algunos subgrupos vulnerables. En el período 2010-2012, el 90% de las personas se

infectaron por transmisión sexual, en el caso de los hombres la mitad por relaciones

heterosexuales y la otra mitad homosexuales. El porcentaje de infecciones por

transmisión vertical fue de 1,5% para varones y 3,1% para mujeres, y por uso

compartido de material para consumo de drogas fue de 1,2% y 0,5%, para varones y

mujeres respectivamente, verificándose así una disminución de las infecciones por

ambas vías respecto a las registradas en el período 2001-2003. La disminución de la

transmisión vertical también se puede evidenciar por comparación de las tasas de

transmisión observadas para los períodos 2000-2005 y 2006-2011 que fueron del

9,6% y 4,8%, respectivamente.

Entre los años 1990 y 2012 se registraron en nuestro país 44.979 casos de SIDA. La

tasa de casos de SIDA tiene una tendencia descendente desde la introducción del

tratamiento antirretroviral pero se ha evidenciado un descenso menos marcado en los

últimos años a pesar de haberse alcanzado un nivel de cobertura casi universal (70-

79%) para el tratamiento antirretroviral. Esta situación se asocia a que se está

verificando un acceso tardío de los convivientes con la enfermedad al sistema de

salud: en los últimos diez años el 26% de los varones y el 15% de las mujeres se

diagnosticaron en etapas avanzadas de la infección. En el caso particular de los niños

nacidos de madres positivas también se observa este fenómeno ya que un 30% se

diagnostica luego del año de vida y un 10% luego de los dos años. La tasa de muertes

asociadas al SIDA en 2011 fue de 3,2/100.000 habitantes.

En nuestro país, al igual que en el resto del mundo, se requiere continuar con la

intensificación de las medidas de prevención, control y tratamiento de la infección para

contribuir a la concreción del objetivo de transmisión y muertes “cero” planteado para

el año 2015 (6, 7).

1.3 Clasificación Taxonómica y Distribución geográfica (1, 9, 10)

Los virus HIV de los tipos 1 y 2 pertenecen a la familia Retroviridae, subfamilia

Lentivirinae y al género: Lentivirus.

INTRODUCCIÓN


Página 10

El tipo HIV-1 se clasifica en cuatro grupos: M (“Main”), O (“Outlier”), N (“New”/nonM-

nonO) y P. En base a estudios filogenéticos se propuso que estos grupos

corresponderían a distintas introducciones del HIV-1 en la población humana a partir

de los retrovirus de inmunodeficiencia simiana. En el caso de los grupos M y N la

transmisión habría sido a partir de virus que infectan chimpancés (Pan troglodytes

troglodytes) (SIVcpz). Para el grupo O aún no se ha identificado el reservorio simiano y

el grupo P se habría originado en virus simianos que infectan gorilas (SIVgor) (11,12).

El HIV-2 se clasifica en grupos de la A a la H, siendo los más frecuentes los grupos A

y B. Estos grupos habrían tenido origen en distintas introducciones de HIV-2 en la

población humana a partir de los virus de inmunodeficiencia simiana que afectan a los

sooty mangabeys (Cercocebus atys) (SIVsm).

El 95% de los aislamientos mundiales pertenecen al grupo M del HIV-1. Este grupo

incluye nueve subtipos o clados de HIV-1 (A, B, C, D, F, G, H, J y K), algunos con sub-

subtipos, y formas circulantes recombinantes (CRFs) que se originan por eventos de

recombinación entre cepas de distinto clado. Se han descripto cincuenta y ocho CRFs

que se encuentran distribuidas en diferentes regiones del mundo (13). También existen

formas recombinantes únicas (URFs) que no se han tornado epidémicas.

Los aislamientos pertenecientes a un clado pueden presentar distancias nucleotídicas

de hasta un 15% en las secuencias codificantes del gag y de hasta un 30% en las

secuencias codificantes del env, y las distancias genéticas inter-clados podrían variar

entre el 30 y el 40% según los genes analizados.

Los distintos subtipos del grupo M se encuentran distribuidos de manera heterogénea

en los distintos continentes del mundo. En África se encuentran prácticamente todos

los subtipos. En la región central del continente se encuentra una gran diversidad de

subtipos, CRFs y URFs.; en el oeste predominan los subtipos A y G y la CRF02 A/G;

en el este predominan los subtipos C y A; y en el sur predomina el subtipo C y se

encuentra un bajo porcentaje del subtipo B. En Asia predominan los subtipos B y C y

las CRFs de estos subtipos, encontrándose también el subtipo A en India. En Europa

el subtipo predominante es el B pero por inmigraciones se introdujeron otros subtipos

como el G y también surgieron formas recombinantes. En Australia y Oceanía

predomina el subtipo B, aunque se registraron casos de subtipos C, A y G, y CRF01

A/E. En América del Norte el subtipo predominante es el B, si bien se están

introduciendo otros subtipos. En América del Sur, predominan los subtipos B y F y sus

formas recombinantes.

INTRODUCCIÓN


Página 11

En Argentina (14, 15, 16) circulan principalmente los subtipos B, F y una serie de

recombinantes únicas B/F que actualmente son las variantes virales predominantes. A

su vez, se detectó la circulación de la CRF12 B/F que posee un patrón de

recombinación en el que la mayor parte del genoma corresponde al subtipo F con

pequeñas porciones del subtipo B en las regiones de gag, pol y env.

A través de estudios moleculares fue posible comprobar una asociación de los

subtipos circulantes con diferentes grupos de riesgo en nuestro país (17, 18, 19): el subtipo

B predomina en los hombres que tienen sexo con hombres, y los recombinantes B/F

en heterosexuales, en usuarios de drogas endovenosas y en los casos asociados a

transmisión vertical.

Además, en Buenos Aires se caracterizó el primer recombinante triple B, C y F del

país (20) en el cual gag y pol son predominantemente del subtipo F y env del subtipo B,

mientras que los fragmentos del subtipo C están intercalados en distintas regiones a lo

largo de todo el genoma. El subtipo C sería proveniente de Brasil.

Los virus del grupo O se clasifican en cinco clados y se encuentran distribuidos en el

centro-oeste de África, principalmente en Camerún, Gabón, Congo y Guinea

Ecuatorial. Poseen menos de un 50% de identidad nucleotídica con los virus del grupo

M.

Los virus de los grupos N y P se encuentran en África y se aislaron de individuos de

Camerún.

Se ha demostrado que la diversidad genética que presentan los tipos 1 y 2 del HIV

tiene consecuencias biológicas tales como diferencias en el tropismo celular, en la

capacidad de replicación, en la patogenicidad y en la transmisibilidad, que modifican la

evolución de la enfermedad. Sin embargo, ha resultado más difícil establecer estas

asociaciones para los distintos subtipos del HIV-1 ya que existen numerosos factores

relacionados al hospedador y al ambiente que también inciden en el curso de la

enfermedad dificultando el análisis de las relaciones causales.

Por otro lado, la diversidad también afecta al diseño de ensayos para diagnóstico y

monitoreo de la infección, a ensayos para monitoreo de resistencia a antirretrovirales y

al desarrollo de vacunas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que no se ha

demostrado una asociación entre subtipos genéticos y subtipos antigénicos virales (21).

INTRODUCCIÓN


Página 12

1.4 Estructura Viral y Ciclo de replicación (1, 22)

a) Partícula Viral

El HIV es un virus envuelto, esférico, de diámetro variable entre 100 y 120 nm. La

partícula viral posee una cápside proteica conoide o “core” (p24) que contiene al

genoma viral (dos moléculas de ARN simple cadena de polaridad positiva) y a las

nucleoproteínas acompañantes. La cápside se encuentra rodeada por una matriz

proteica (p17) de estructura icosahédrica. La envoltura es una bicapa lipídica derivada

de la célula huésped y en ella se encuentran insertas numerosas espículas

constituidas por oligómeros de glicoproteínas virales (gp41 y gp120). Ver Figura 2.

gp120 (SU)gp41 (TM)

p7, NCp17, MA

p24, CA

Proteasa

Transcriptasa

Reversa

Integrasa

Envoltura

ARN

genómico

Figura 2. Estructura de la partícula viral HIV-1

Adaptado de Fields Virology 5th Edition, 2007 (1)

b) Genoma Viral

Como se muestra en la Figura 3, cada cadena de ARN viral (9,7 Kb) posee tres genes

principales: gen antígeno específico de grupo (gag), gen polimerasa (pol) y gen

envoltura (env). El gen gag codifica para las proteínas estructurales de la matriz (MA),

de la cápside (CA – p24), de la nucleocápside (NC – p7) y p6, que se sintetizan como

un precursor proteico de 55 KDa (Pr55). El gen pol codifica para las enzimas virales

proteasa (PR), transcriptasa reversa (RT) e integrasa (IN), que se originan por ruptura

de una poliproteína precursora de 160 KDa (Pr160). Esta ruptura está mediada por la

proteasa viral que posee actividad autocatalítica. El gen env codifica para las

glicoproteínas de envoltura gp120 (superficie) y gp41 (transmembrana) que se originan

INTRODUCCIÓN


Página 13

a través de la digestión proteolítica por enzimas celulares de una glicoproteína

precursora de 160 KDa (gp160).

El genoma viral también posee varios marcos abiertos de lectura adicionales que

codifican para las proteínas accesorias Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu y Nef. Estas proteínas

se generan a partir de cortes y reempalmes (“splicing”) diferenciales de ARN

mensajeros.

Por otro lado, como consecuencia de la transcripción reversa del genoma viral que

tiene lugar durante la replicación, se introducen repeticiones terminales largas en los

extremos del ADN copia (LTRs) que cumplen diversas funciones en distintas etapas

del ciclo de replicación viral.

HIV-1Fuente: Costin JM, Virology Journal 2007, 4:100

Figura 3. Organización Genómica HIV-1

b) Ciclo de Replicación

El HIV es un parásito intracelular obligado. El rango de células hospedadoras

susceptibles se encuentra determinado por la presencia en la superficie de la

membrana de los receptores y co-receptores necesarios para la interacción con la

partícula viral. Los principales linajes de células afectadas son los linfocitos T

colaboradores (LT CD4+), macrófagos y algunas poblaciones de células dendríticas.

El ciclo de replicación (Figura 4) comienza con la unión y entrada del virus a la célula.

La primera interacción ocurre a través de la unión de la gp120 viral al receptor principal

que es el CD4 y a un co-receptor CCR5 (variantes R5) o CXCR4 (variantes X4). Esto

provoca un cambio conformacional de la gp41 que permite la inserción del péptido de

INTRODUCCIÓN


Página 14

fusión en la membrana celular. Así, se produce la fusión de la envoltura viral con la

membrana celular permitiendo la llegada de la partícula al citoplasma. Luego tiene

lugar el desnudamiento, seguido de la transcripción reversa del genoma por acción de

la transcriptasa reversa viral. El ADN copia doble cadena forma un complejo con

proteínas celulares y virales que permite su traslado al núcleo de la célula infectada.

Una vez allí, el genoma viral doble cadena puede integrarse al genoma celular a través

de los LTRs por acción de la integrasa (ADN proviral) o puede permanecer de manera

episomal. El ADN proviral se replica junto con el genoma celular y se generan

transcriptos de ARN viral que pueden ser exportados del núcleo para ser

empaquetados como genoma viral de nuevas partículas o pueden dar origen a los

ARN mensajeros que serán traducidos a proteínas. Las proteínas virales se sintetizan

como poliproteínas inmaduras que serán empaquetadas junto al genoma para dar

origen a partículas virales nacientes en los lugares cercanos a la superficie celular

donde se insertan las glicoproteínas de envoltura (gp120 y gp41). Luego, por acción

de la proteasa viral las proteínas inmaduras se tornan funcionales provocando el

rearreglo madurativo de las partículas virales durante su liberación de la célula

hospedadora por brotación.

Figura 4. Ciclo de Replicación HIV-1

INTRODUCCIÓN


Página 15

1.5 Variabilidad Viral

La población viral de HIV presenta una gran variabilidad tanto inter como intra

individuos. A las variantes virales que circulan en un individuo infectado se las

denomina cuasiespecies (23). Esta variabilidad se debe a que la transcripción reversa,

que tiene lugar durante la replicación viral, es un proceso de baja fidelidad en el que

potencialmente se podrían acumular errores con una tasa de 10-5 a 10-4 por sitio

nucleotídico por generación. Este hecho sumado a la gran producción viral que ocurre

en cada individuo infectado y asociado al rápido recambio de las células infectadas,

permite la rápida acumulación de mutaciones. Además, la transcriptasa reversa tiene

la particularidad de cambiar de molde durante su actividad polimerasa lo que genera

inserciones, deleciones y la ocurrencia de una alta frecuencia de recombinación entre

diferentes cadenas de ARN viral (24, 25, 26). Todos estos factores también contribuyen a

la diversidad viral ya descripta en el punto 1.3.

La capacidad del HIV para acumular mutaciones sin perder su actividad replicativa

permite la evasión viral a la respuesta inmunológica y la generación de resistencia a

los antivirales.

La mayor variabilidad ocurre en la gp120 del gen env. Esta glicoproteína presenta

cinco regiones hipervariables (V1 a V5) flanqueadas por regiones relativamente más

conservadas (C1 a C5). En cambio gp41, a pesar de presentar variabilidad, posee un

dominio inmunodominante altamente conservado (1).

Por otro lado, la cápside viral (p24) es una proteína conservada ya que, si bien posee

altos niveles de expresión y se encuentra bajo presión de selección por parte de la

respuesta inmunológica del hospedador, predomina la presión evolutiva de

conservación de su estructura para poder cumplir sus funciones (27, 28).

La molecula de la cápside posee dos dominios: el N-terminal (dominio central o “core”)

y el C-terminal (dominio de dimerización) unidos a través de una serie de residuos. El

dominio N-terminal posee una horquilla beta seguida de siete alfa hélices, mientras

que el dominio C-terminal posee 4 alfa hélices seguidas de unos residuos sin

estructura secundaria. En este último dominio se encuentra una región de 20

aminoácidos altamente conservados denominada región principal de homología (MHR)

que está presente en todos los retrovirus del género (27).

Se ha observado que en la región C-terminal se encuentran epitopes

inmunodominantes que dan origen a gran parte de los anticuerpos anti-p24 presentes

en circulación durante la etapa inicial de la infección. Estos anticuerpos presentan

reactividad cruzada con diferentes subtipos virales, permitiendo el reconocimiento de

la p24 de distintos orígenes (29).

INTRODUCCIÓN


Página 16

1.6 Historia natural de la Infección Viral (1, 22, 30, 31)

Las vías de transmisión del HIV son tres: i) sexual: a través del sémen o secreciones

vaginales; ii) parenteral: a través de sangre o derivados contaminados, transplante de

órganos o tejidos infectados y uso compartido de elementos para drogadicción

endovenosa, y iii) vertical: intra-útero, perinatal y lactancia.

Durante la infección primaria con HIV, un porcentaje de las personas infectadas

presenta un síndrome retroviral agudo de severidad variable. Los síntomas asociados

al síndrome son inespecíficos y pueden incluir fiebre, dolor de garganta, erupción

cutánea, linfoadenopatía, esplenomegalia, mialgia, artritis y, con menor frecuencia,

meningitis. Dada la inespecificidad del cuadro y al grado de variabilidad de la

intensidad de los síntomas, muchas personas infectadas no realizan la consulta

médica.

Como se muestra en la siguiente figura,

Figura 5. Curso clínico de la infección por HIV

Adaptado de Fauci AS y col, 1996 (30)

una vez que el HIV ingresa al organismo se disemina rápidamente de forma sistémica

y ya no puede ser erradicado. En la etapa aguda de la infección, se observan altos

niveles de viremia asociados a una abrupta disminución de los linfocitos T

colaboradores (LT CD4+). Cuando surge la respuesta inmunológica específica tanto

humoral como celular, se produce un control parcial de la replicación viral junto con la

recuperación del recuento de LT CD4+. Sin embargo, el virus no puede ser

INTRODUCCIÓN


Página 17

completamente eliminado y se establece un estado de latencia clínica en el que se

verifica una replicación viral crónica persistente, siendo el tejido linfoide uno de los

principales reservorios virales. En general, en esta etapa la viremia es de bajo nivel y

se produce un descenso lento del recuento de LT CD4+. La replicación viral

ininterrumpida provoca una activación crónica del sistema inmunológico lo que

paradójicamente conduce a una mayor replicación viral y a la depleción de las células

susceptibles. De esta manera se produce un progresivo deterioro del sistema

inmunológico llevando a una profunda inmunosupresión, a la adquisición de

enfermedades oportunistas y a la aparición de las manifestaciones clínicas severas de

la enfermedad (SIDA). En esta etapa tardía, nuevamente se detectan altos niveles de

viremia y un muy marcado descenso del recuento de LT CD4+. Finalmente, el paciente

fallece.

1.7 Diagnóstico de la Infección (32, 33, 34, 35)

El desarrollo y la optimización de la metodología para el diagnóstico y el seguimiento

de la infección por el HIV como así también los algoritmos recomendados para su

implementación se fundamentan en la cinética que presentan los marcadores virales e

inmunológicos durante el curso de la enfermedad (Figura 6).

Luego del contagio, la secuencia de aparición de los marcadores en circlulación es la

siguiente: ARN viral (viremia) aproximadamente a los 9 días post infección, ADN

proviral - antígeno p24 (antigenemia) aproximadamente 1 semana después y

respuesta inmunológica humoral específica (seroconversión) de 2 a 6 semanas más

tarde. El momento exacto en el que cada uno de estos marcadores se comienza a

detectar depende de varios factores: las características del método utilizado, las

características individuales del hospedador y las características virales.

En la etapa aguda de la infección hay una gran replicación viral y en la mayoría de los

casos es detectable la p24 viral en conjunto con una elevada carga viral y una

marcada disminución de los LT CD4+. Una vez que se establece la respuesta

inmunológica inicial (seroconversión), se controla la replicación y la carga viral

disminuye a un valor denominado carga viral de inicio o “set point”. Este valor

constituye un marcador pronóstico de la progresión de la enfermedad. A su vez, la

antigenemia se torna no detectable y los LT CD4+ se recuperan aunque no llegan a los

niveles previos a la infección.

Durante la etapa de latencia clínica, que puede durar varios años, se establece un

estado estacionario y es posible detectar el genoma viral en concentraciones variables

INTRODUCCIÓN


Página 18

dependientes del balance entre la producción y la eliminación viral. También se

detectan los anticuerpos dirigidos contra las proteínas estructurales codificadas por los

genes gag y env. Además, se verifica una lenta disminución del recuento de los LT

CD4+ como signo de deterioro inmunológico.

En las etapas tardías, los recuentos de LT CD4+ se encuentran muy disminuidos y se

produce un gran aumento de la replicación viral. Se vuelve a detectar la proteína p24

en circulación, no se detectan los anticuerpos dirigidos contra las proteínas del gag

pero se mantienen los anticuerpos dirigidos contra las glicoproteínas de envoltura y la

carga viral es muy elevada.

Infección

agudaSíntomasLatencia

clínica

TIEMPO

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

R

ELA

TIV

A

p24

IgM

LT CD4+

ADN proviral

ARN

env - Ac

gag - Ac

Figura 6. Cinética de los marcadores de la infección por HIV

En base a los tiempos de positivización de los marcadores se estableció el algoritmo

para el diagnóstico de la infección. Desde 1989, dicho algoritmo (36) para el estudio de

adultos y niños mayores de 18 meses, incluye dos reacciones serológicas de tamizaje

utilizando técnicas de distinta configuración - inmunoensayo ligado a enzima en fase

sólida (ELISA) y aglutinación de partículas (AP) -, y una reacción serológica

confirmatoria por medio de un inmunoensayo en fase sólida con diseño de tira que

permite la detección diferencial de los anticuerpos dirigidos contra las distintas

proteínas virales (“Western Blot”, WB). Ver Figura 7.

INTRODUCCIÓN


Página 19

TAMIZAJE

CONFIRMACIÓN

ELISA AP

Ambas NO REACTIVO DISCORDANTES Ambas REACTIVO

WB

Resultado NEGATIVO

Ausencia de bandas

Resultado NEGATIVO

*2 de las bandas:

p24, gp41, gp 120/160

Cualquier patrón de

bandas que no cumpla

criterio de positividad

Resultado POSITIVO Resultado INDETERMINADO

ELISA: Inmunoensayo ligado a enzima en fase sólida; AP: aglutinación de partículas; WB: “western blot”

* Criterio de positividad WB: CDC/ASTPHL (37, 38)

Figura 7. Algoritmo de diagnóstico adultos y niños mayores de 18 meses

Con el paso del tiempo y el avance de la tecnología, la metodología de diagnóstico se

fue modificando para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección (Figura

8).

Figura 8. Tiempo de positivización de los métodos de diagnóstico

Adaptado de Patel P y col, 2010 (34)

INTRODUCCIÓN


Página 20

En este aspecto tuvo una incidencia preponderante la incorporación de proteínas

recombinantes y péptidos sintéticos en reemplazo de los lisados virales en el diseño

de los ensayos. En el caso de los ELISAs, además, se sumó la detección de

anticuerpos de tipo IgM a los de tipo IgG (tercera generación) y, posteriormente, la

detección simultánea de antígeno p24 y anticuerpos (cuarta generación), estrategias

que contribuyeron a la disminución del período de ventana. En el caso del Western

Blot, el uso de proteínas recombinantes y péptidos sintéticos permitió aumentar la

especificidad del método por disminución de la reactividad cruzada con proteínas

contaminantes provenientes de los cultivos.

Por otro lado, si bien los métodos de amplificación de ácidos nucleicos permiten la

detección viral con anterioridad a todos los métodos descriptos, los requisitos para la

realización de los ensayos impiden su aplicación masiva para el diagnóstico de la

infección.

El diagnóstico de la infección en los niños menores de 18 meses y a cualquier edad

durante el período de ventana, puede realizarse por métodos de detección de antígeno

p24 o por detección de ácidos nucleicos (ARN viral o ADN proviral), siendo estos

últimos más sensibles. En la Figura 9 se muestra el algoritmo recomendado

actualmente en nuestro país (39).

Figura 9. Algoritmo de diagnóstico en niños menores de 18 meses (39)

INTRODUCCIÓN


Página 21

A pesar de la gran sensibilidad y especificidad que posee el diagnóstico a través de la

aplicación del algoritmo convencional, los estudios epidemiológicos demuestran que

no se ha logrado un adecuado control de la enfermedad.

Por este motivo, recientemente se ha propuesto la implementación de nuevos

algoritmos de diagnóstico (40, 41) (Figura 10) que incluyen la utilización de pruebas

rápidas (“test” rápidos) en los Centros de Atención Primaria de la Salud con el objeto

de mejorar la accesibilidad de la población al diagnóstico, mejorar la proporción de

personas que reciben los resultados de las determinaciones realizadas y acelerar su

incorporación al sistema de salud para su seguimiento y tratamiento, y de esta manera

contribuir a la mejor calidad de vida de las personas que conviven con el HIV/SIDA y al

control de la diseminación de la enfermedad.

A

BA1: Test Rápido de igual o mayor sensibilidad que A2

Figura 10. Algoritmos de diagnóstico en Centros de Atención Primaria (40, 41)

A su vez, la implementación de las pruebas rápidas resultan de gran utilidad en

situaciones en las que se requiere la toma rápida de decisiones con respecto al

INTRODUCCIÓN


Página 22

tratamiento como por ejemplo la prevención de la transmisión vertical en los casos de

mujeres embarazadas en trabajo de parto que desconocen su estado serológico

respecto de la infección por HIV o el inicio de la profilaxis post-exposición ocupacional

de trabajadores de la salud en caso de que el paciente relacionado al

incidente/accidente se encuentre infectado.

1.8 Materiales de referencia y Control de Calidad

Se entiende por material de referencia a todo material suficientemente homogéneo y

estable en aquellas características que lo tornan adecuado para cumplir su propósito

en un proceso de medición (cuali o cuantitativo) (42). La demanda de estos materiales

se ha incrementado en los últimos años como consecuencia de la necesidad de

obtener datos más confiables en diversas disciplinas científicas y tecnológicas (43).

Entre sus aplicaciones (42, 43) se encuentran la calibración de equipos de medición, la

evaluación y validación de metodologías y el diseño de paneles de control de calidad.

La implementación de programas de calidad que incluyan la utilización de paneles de

control de calidad interno y externo para los ensayos que se llevan acabo en los

laboratorios de diagnóstico y monitoreo de la infección por el HIV, garantizan la

confiabilidad de sus resultados ya que asegura el adecuado desempeño de los

mismos de manera sostenida en el tiempo.

El control de calidad interno (44, 45) es una herramienta que permite el monitoreo crítico

de los procedimientos y de la rutina de trabajo. Se basa en la inclusión de materiales

de control junto a las muestras de rutina en los ensayos, para luego realizar un análisis

estadístico de los resultados que permita la detección de errores tanto aleatorios como

sistemáticos para así poder implementar las medidas correctivas necesarias. Su

principal objetivo es asegurar la validez de los resultados que se obtienen en cada

ensayo.

El control de calidad externo (46, 47, 48) es una herramienta que permite la evaluación de

la exactitud analítica de un laboratorio, mediante la comparación de los resultados

obtenidos por éste con los obtenidos por otros laboratorios de características

semejantes al analizar las muestras que conforman paneles para evaluación externa

de la calidad. El objetivo principal es poner en evidencia desvíos sistemáticos en los

resultados generados por un laboratorio en particular con respecto a los resultados

obtenidos por el conjunto de los laboratorios que realizan los mismos estudios. Este

tipo de controles promueve la mejora contínua de los laboratorios participantes

INTRODUCCIÓN


Página 23

contribuyendo a la disminución de la variabilidad inter-laboratorio y por ende al acceso

equitativo de la población a un diagnóstico y monitoreo de calidad.

De esta manera, el fortalecimiento de la calidad de las determinaciones conlleva

beneficios directos sobre la salud de la población y optimiza el uso de los recursos que

invierte el Estado.

Como valor añadido, la implementación de las herramientas del sistema de calidad

garantiza, en Salud Pública, la calidad de la información generada para la toma de

decisiones (49). Esto permite una intervención más adecuada y eficiente, mejorando el

bienestar de la comunidad y reduciendo los indicadores de morbi-mortalidad.

1.9 Proteínas recombinantes y sistemas de expresión (50, 51, 52, 53, 54, 55, 56)

La demanda de proteínas recombinantes se ha ido incrementando a medida que se

diversificaron los campos de aplicación. Muchas áreas sufrieron importantes avances

tecnológicos gracias a su utilización: producción de medicamentos en la industria

farmacéutica, diseño de equipos de diagnóstico, producción de enzimas para diversos

fines, producción de bioinsecticidas y la industria de los alimentos, entre otras.

La producción de proteínas recombinantes a través del uso de técnicas moleculares

permite asegurar la disponibilidad de las mismas en forma continua, homogénea y de

alta calidad. La elección del sistema apropiado para su obtención depende de diversos

factores entre los cuales se encuentran los niveles de expresión requeridos, el

requerimiento de modificaciones post-traduccionales en la proteína de interés y el

propósito con el que se que se la va a utilizar.

Los sistemas de expresión procariotas que utilizan como hospedador a la bacteria

Escherichia coli constituyen una plataforma ampliamente difundida ya que presenta las

siguientes ventajas: i) su genoma es conocido desde hace varios años, lo que amplía

considerablemente las posibilidades de su manipulación genética, ii) existe una gran

cantidad de conocimiento acumulado sobre su fisiología y metabolismo, iii) existen

varios vectores y cepas hospedadoras bien establecidos para la producción de

proteínas recombinantes, iv) puede crecer rápido en medios muy simples, con altos

niveles de producción de proteica y v) bajo costo.

Las principales limitaciones que presentan estos sistemas es la incapacidad de llevar a

cabo modificaciones post-traduccionales complejas que son necesarias en el caso de

expresión de proteínas de origen eucariota, y la baja capacidad para formar uniones

disulfuro. Otra limitación es que, en ciertas ocasiones, la proteína heteróloga se

produce en forma insoluble por dificultades en el plegado o agregación, dando lugar a

INTRODUCCIÓN


Página 24

la formación de cuerpos de inclusión. Por estos motivos, generalmente constituye el

sistema de elección para la expresión de proteínas que no requieran su recuperación

en forma nativa conformacional y/o funcional.

1.10 Desafíos en Salud Pública

La lucha contra la pandemia causada por el Virus de Inmunodeficiencia Humana es

uno de los objetivos prioritarios de la agenda sanitaria internacional y, más aún, es uno

de los Objetivos del Milenio planteados por Naciones Unidas (7, 57, 58). Las estrategias

para hacerlo cubren los tres aspectos fundamentales del abordaje de los agentes

infecciosos: profilaxis, diagnóstico y tratamiento.

En este contexto, la metodología experimental para la obtención de reactivos de

detección tanto de la respuesta inmune del huésped como de la presencia de virus,

hace que sea necesario contar con material viral en grandes cantidades. Esto último

trae aparejado que la manipulación del HIV con esos fines deba hacerse en recintos

con elevado nivel de bioseguridad (59, 60). Sin embargo, la biología molecular y más

específicamente las técnicas de ADN recombinante, permiten contar con materiales

bioquímicamente equivalentes a los obtenibles por cultivo pero con una reducción

considerable del riesgo biológico asociado, ya que de esta forma disminuye la

probabilidad de exposición (61). Además, la disponibilidad continua de estos materiales

en estado puro y homogéneo constituye una fuente adecuada para la elaboración de

materiales de referencia de utilidad para la implementación de programas de calidad.

El diagnóstico mediante técnicas de fácil acceso, rápidas, sensibles y específicas, y

con control de calidad, sin duda permitirá fortalecer las estrategias de vigilancia y

control de la diseminación de la enfermedad. Con esta finalidad, el desarrollo de

conocimiento y experiencia local en la obtención de candidatos moleculares para la

detección de la infección viral y para el aseguramiento de la calidad de los métodos

que se utilizan para ello, permitiría optimizar la disponibilidad de recursos a través de

la utilización de metodologías y controles que surgen de las propias variantes virales

circulantes en nuestro medio. A su vez, esto redundaría en el ejercicio de nuestra

soberanía en cuanto a la disponibilidad de material local para el trabajo prospectivo en

Salud Pública.

Como ya se describió en los distintos puntos de la introducción, la proteína p24 del

HIV-1 es la principal proteína de la cápside viral y, además de cumplir su función

estructural, está involucrada en diversos pasos del ciclo replicativo del virus,

incluyendo el denudamiento, la importación del ADN copia al núcleo y el

INTRODUCCIÓN


Página 25

empaquetamiento del genoma para la formación de las nuevas partículas virales.

Además, esta proteína es un excelente marcador de la actividad y expresión viral. Su

detección permite diagnosticar la infección, predecir el descenso de los LT CD4+ y la

progresión clínica de la infección en etapas tempranas o tardías de la enfermedad, y

monitorear el tratamiento antirretroviral. A pesar de ser muy antigénica, es una

proteína conservada, y la respuesta policlonal de anticuerpos anti p24 que se genera

en los individuos infectados presenta reactividad cruzada con la p24 de diversos

subtipos virales. A su vez, la presencia de anticuerpos anti-p24, junto a los anticuerpos

dirigidos contra alguna de las glicoproteínas de envoltura, constituye un criterio de

positividad para la confirmación serológica de la infección por HIV-1, y la disminución

de estos anticuerpos en las etapas tardías de la enfermedad constituye un marcador

de progresión a SIDA.

Por otro lado, es una proteína pequeña y sencilla, sin modificaciones post-

traduccionales que puede ser utilizada como blanco molecular para el diseño de

nuevos métodos de diagnóstico y para la elaboración de materiales de referencia sin

necesidad de encontrarse en su forma nativa, consituyendo así el blanco ideal para

ser obtenido en un sistema procariota.

En este marco y, dada la relevancia que posee la detección de esta proteína y de la

respuesta inmunológica que ella provoca para el estudio del curso de la infección por

HIV-1, se la ha tomado como eje central para el desarrollo de este proyecto.

OBJETIVOS


Página 26

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Generales

- Contribuir al conocimiento científico en uno de los campos prioritarios de la

política sanitaria mundial.

- Contribuir al control de la epidemia causada por el HIV dentro del Territorio

Nacional Argentino.

- Contribuir al mejoramiento de la accesibilidad de la población al diagnóstico de

la infección.

- Contribuir al aseguramiento de la calidad del diagnóstico de la infección.

2.2 Objetivos Específicos

- Obtener la proteína viral p24 del HIV-1 en forma recombinante en un sistema

procariota.

- Diseñar un ensayo que permita evaluar su reactividad inmunológica.

- Realizar un estudio comparativo de la capacidad de detección de anticuerpos

anti p24 del HIV-1 entre el ensayo diseñado y un método confirmatorio

comercial.

- Evaluar la aptitud de la proteína recombinante para ser utilizada en la

elaboración de materiales de referencia y la conformación de paneles de

control de calidad.

MATERIALES y MÉTODOS


Página 27

3. MATERIALES y MÉTODOS

3.1 Muestras

Se utilizaron plasmas de pacientes HIV positivos pertenecientes a la colección de

muestras del Laboratorio de HIV del Departamento de Virología del INEI – ANLIS “Dr.

Carlos G. Malbrán” y plasmas HIV negativos de trabajadores de la ANLIS “Dr. Carlos

G. Malbrán”. Todas las muestras fueron irreversiblemente disociadas de su

identificación.

3.2 Secuencias de referencia

Se utilizaron como secuencias de referencia de HIV-1 secuencias de genoma viral

completo correspondientes a aislamientos virales de Argentina (AF332867-1, AF385936-1,

AF408626-1, AF408627-1, AF408628-1, AF408629-1, AF408630-1, AF408631-1, AF408632-1,

AY536237-1 AY536238-1, AY968312-1, DQ383754-1, DQ1890088-1), Brasil (U52953-1, AF005494-1,

AF005495-1, AF286228-1, AY173956-1, AY173957-1, AY173958-1, AY455778-1, AY455779-1,

AY455780-1, AY771588-1, AY771591-1, DQ085867-1, DQ085871-1) publicadas en la base de

datos Genbank del Instituto Nacional de Salud (NIH), Maryland – EEUU (62), y un

alineamiento de referencia para subtipos publicado en la base de datos del Laboratorio

Nacional Los Álamos, Nueva Méjico – EEUU que incluye 170 secuencias

correspondientes a genomas completos de HIV-1 (63).

3.3 Vector

Para el clonado y la expresión de la p24 recombinante en un sistema procariota, se

utilizó como vector el plásmido pRSET A correspondiente al equipo de clonado

“pRSET A, B, y C” (Invitrogen). Ver mapa del vector en el Anexo 1.

Se trata de un vector diseñado para lograr altos niveles de expresión proteica en

Escherichia coli gracias al clonado de la secuencia de ADN de interés bajo un

promotor fuerte, T7, que es reconocido de manera específica por la ARN polimerasa

del fago T7. Además, en este vector el inserto queda posicionado río abajo y en marco

de lectura con la secuencia de un péptido de fusión amino terminal que incluye un

codón ATG para el inicio de la traducción y una cola de seis histidinas que constituye

un dominio de unión a metales para facilitar la purificación de la proteína recombinante

por cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Por otro lado, el

plásmido posee un gen de resistencia a ampicilina que permite la selección de las

bacterias que lo contienen.



Página 28

3.4 Cepas Bacterianas

3.4.1 Escherichia coli JM 109 (utilizada para el mantenimiento del plásmido

pRSET A recombinado con el fragmento de ADN copia correspondiente a la

p24):

Genotipo: F’ (traD36, proAB+ lacIq, D(lacZ)M15) endA1 recA1 hsdR17(rk-, mk+) mcrA

supE44 l- gyrA96 relA1 D(lacproAB) thi-1.

Esta cepa bacteriana es ideal para el mantenimiento de ADN plasmídico de buena

calidad ya que, por su genotipo, el ADN heterólogo no es degradado por

endonucleasas de restricción y se minimiza la recombinación con el genoma

bacteriano.

3.4.2 Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (utilizada para la expresión de la p24

recombinante):

Genotipo: F-, ompT hsdSB (rB- mB

-) gal dcm (DE3) pLys S (CamR).

Esta cepa bacteriana carece de las proteasas lon y omp T lo que impide la

degradación de las proteínas heterólogas. También carece de endonucleasas de

restricción, motivo por el cual no se degradan los plásmidos que se incorporan por

transformación. Por otro lado, contiene la forma lisógena del fago lambda (DE3) que

lleva el gen de la T7 ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5. La

expresión de esta enzima está inhibida por el represor lac y puede inducirse por

agregado de isopropil tiogalactósido (IPTG). Por último, la cepa también contiene el

plásmido pLys S que le confiere resistencia a cloranfenicol y le otorga un mecanismo

de control de la expresión basal de la proteína exógena por si resultara tóxica para la

bacteria. Este mecanismo consiste en la expresión de la lisozima de T7 que se une a

la T7 ARN polimerasa que pudiera generarse por escape al mecanismo de represión.

La lisozima de T7 también favorece la lisis bacteriana que es necesaria para la

purificación de la proteína recombinante.

Ver esquema de regulación de la expresión en el Anexo 2.

La conservación de ambas cepas bacterianas se realizó en caldo LB (Luria - Bertani)

con glicerol al 10% V/V a -70ºC.

3.5 Extracción de ARN viral

Se purificó el ARN viral a partir de muestras de plasma de pacientes HIV positivos

utilizando un método comercial con columnas de sílica-gel siguiendo las instrucciones

del fabricante (QIAamp Viral RNA mini kit - QIAGEN).



Página 29

3.6 Obtención del fragmento de interés para clonar

3.6.1 Diseño de cebadores (“primers”):

El diseño de los cebadores “sentido” (Fw) y “antisentido” (Rv) se basó en secuencias

consenso obtenidas a partir de los alineamientos de las secuencias nucleotídicas

correspondientes al gen gag completo y a los fragmentos codificantes de la p24 de

HIV-1 de los aislamientos virales de Argentina y Brasil citados en el punto 3.2.

La optimización del diseño se llevó a cabo mediante la utilización del programa OLIGO

MFC Application, versión 6.7.1.0 (Molecular Biology Insights, Inc.).

Para el alineamiento y el análisis de las secuencias se utilizaron los programas

MegAlign (Lasergene - DNASTAR) y BioEdit (Ibis Biosciences).

3.6.2 Amplificación de fragmentos del genoma viral

a) Transcripción Reversa - Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR): gen

gag

Se diseñó una reacción de RT-PCR en dos pasos para la amplificación del fragmento

correspondiente al gen gag del virus HIV-1 utilizando las enzimas RevertAid Reverse

Transcriptase™ (M-MuLV) y Taq DNA Polimerasa recombinante (Fermentas). Como

molde para la transcripción reversa se utilizó el ARN viral extraído de las muestras y

para la PCR se utilizó el producto de la RT.

b) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): p24

Se diseñó una reacción de PCR para la amplificación del fragmento correspondiente a

la p24 del virus HIV-1 usando como molde el ADN copia del gen gag obtenido por RT-

PCR. Se utilizó la enzima Taq DNA Polimerasa recombinante (Fermentas).

La puesta a punto de las reacciones incluyó la evaluación de la cantidad adecuada de

molde, la determinación de la concentración adecuada de Mg2+ y de cebadores, la

selección de la temperatura óptima de hibridación de los cebadores y el número de

ciclos de amplificación.

3.6.3 Detección de los productos de amplificación

La detección de los productos de las reacciones de amplificación (RT-PCR y PCR) se

llevó a cabo por observación al UV de corridas electroforéticas en geles de agarosa al

0,8 – 1% en solución tampón TAE (Tris – Acetato – EDTA) teñidos con bromuro de

etidio (0,5 µg/ml). Se sembraron 10 µl de producto con 1 µl de una solución tampón

que contiene los colorantes azul de bromofenol y xilencianol para indicar el frente de



Página 30

corrida. En todos los casos se utilizó un marcador con bandas de ADN de tamaño

conocido.

3.6.4 Purificación de productos amplificados

a) Geles de agarosa preparativos:

La purificación de los productos de interés amplificados se realizó por electroforesis en

geles preparativos de agarosa al 0,8 – 1% en solución tampón TAE (Tris – Acetato –

EDTA) teñidos con bromuro de etidio (0,5 µg/ml). Se sembraron 60 µl de muestra con

6 µl de una solución tampón que contiene los colorantes azul de bromofenol y

xilencianol para indicar el frente de corrida. En todos los casos se sembró un marcador

con bandas de ADN de tamaño conocido. Luego se escindieron del gel las bandas de

tamaño compatible con los productos de interés utilizando el transiluminador UV para

visualizarlas.

b) Extracción del ADN de la banda de gel de agarosa:

La purificación selectiva del ADN de interés se realizó a través de un método comercial

con columnas. El equipo provee soluciones tampón que permiten la solubilización de

la agarosa, la unión selectiva del ADN a una matriz de sílica (QIAquick gel extraction

kit– QIAGEN) y su posterior elución.

Los productos puros se conservaron a -20ºC.

3.6.5 Cuantificación de los productos purificados

La cuantificación de los productos purificados se realizó en una corrida electroforética

en gel de agarosa al 0,8 – 1% en solución tampón TAE (Tris – Acetato – EDTA) teñido

con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) mediante la comparación visual al UV de la

intensidad de la banda del ADN de interés con las intensidades correspondientes a las

bandas cuantificadas de un marcador de ADN que presenta bandas de 100 a 1000

pares de bases (Gene Ruler 100 bp DNA ladder – Fermentas).

3.6.6 Identificación de los productos purificados

La identificación de los fragmentos obtenidos luego de la amplificación y la purificación

se llevó a cabo a través de los siguientes pasos:

a) Reacción de secuenciación basada en el método de Sanger (64): se

secuenciaron las cadenas “sentido” y “antisentido” de cada producto utilizando el

reactivo Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems), según el protocolo

recomendado por el fabricante:



Página 31

Mezcla Cantidad por tubo

Molde (700 pb) 20 ng

Cebador Fw o Rv 2,0 pmol

Tampón 5X 1,0 µl

Big Dye Terminator 2,0 µl

Agua Csp 10 µl

Ciclado:

- 96ºC 1 min

- 30 ciclos 96ºC 10 seg; 50ºC 5 seg; 60ºC 4 min

- Mantenimiento final 4ºC

A continuación de la reacción se procedió a la purificación de la muestra por

precipitación con etanol 95% y 70% y, por último, se realizó la separación

electroforética en el secuenciador capilar ABI PRISM 3100 - Avant (Applied

Biosystems).

El análisis de las secuencias obtenidas se realizó con el programa BioEdit (Ibis

Biosciences).

b) Evaluación de homología con secuencias conocidas:

Se llevó a cabo la comparación de homología de las secuencias obtenidas con las

disponibles en la base de datos Genbank del Instituto Nacional de Salud (NIH),

Maryland – EEUU utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineamientos

locales (BLAST) (65).

3.6.7 Selección del fragmento codificante de la p24 a clonar

La selección del fragmento a utilizar para el clonado y expresión de la p24

recombinante se basó en un análisis de la relación filogenética de las secuencias

nucleotídicas codificantes de p24 obtenidas con las correspondientes a las secuencias

circulantes en la región incluidas en un alineamiento de referencia para subtipos

publicado en la base de datos del Laboratorio Nacional Los Álamos, Nueva Méjico –

EEU, y también en la evaluación del porcentaje de homología que presentaron las

secuencias de aminoácidos de los fragmentos codificantes de p24 en estudio con las

correspondientes a las secuencias de referencia con las que mostraron mayor

relación.



Página 32

La inferencia filogenética (66) se llevó a cabo por el método de máxima verosimilitud

con soporte estadístico (bootstrap).

Para la estimación el modelo que mejor se ajusta a los datos para el análisis

filogenético se utilizó el programa jModelTest versión 2.1.3 y para la filogenia

propiamente dicha el programa MEGA versión 5.2.

Para evaluar el porcentaje de homología entre las secuencias aminoacídicas de los

fragmentos en estudio y las secuencias de referencia con las que se agruparon se

utilizó el programa BioEdit (Ibis Biosciences).

3.7 Clonado del fragmento de interés

3.7.1 Obtención del plásmido recombinante

a) Incorporación de sitios de restricción al fragmento codificante para p24

La incorporación de los sitios de restricción al fragmento de interés se llevó a cabo a

través de una reacción de amplificación (PCR) utilizando cebadores diseñados con

sitios de restricción compatibles con los presentes en el vector. Los cebadores

modificados incluyeron también las bases necesarias para la estabilización de las

enzimas durante su interacción con el fragmento a restringir y las bases para

incorporar el codón de terminación (codón “stop”) al final de la secuencia. La PCR se

realizó en las condiciones optimizadas para la reacción original de amplificación de

p24.

b) Digestión con enzimas de restricción

Se llevó a cabo la restricción asimétrica del fragmento de interés y del vector de

expresión utilizando las enzimas XhoI y NcoI según el siguiente esquema:

Mezcla Restricción Vector Fragmento

ADN 600 ng 600 ng

Tampón Tango 2X 12 µl 12 µl

XhoI (10 u/ µl) 3 µl 3 µl

NcoI (10 u/ µl) 3 µl 3 µl

Agua Csp 60 µl Csp 60 µl

Se incubó la reacción durante 1 hora a 37ºC y luego se inactivaron las enzimas por

calentamiento a 80ºC durante 20 minutos.



Página 33

c) Purificación de la reacción de restricción y cuantificación de productos puros

Los productos de la digestión enzimática se purificaron y cuantificaron según las

técnicas ya descriptas: electroforesis en gel preparativo de agarosa, extracción de

ADN a partir de las bandas del gel, comparación de intensidad de banda del ADN

extraído con las de un marcador con bandas de ADN cuantificadas en electroforesis

en gel de agarosa.

d) Ligación

La reacción de ligación se llevó a cabo utilizando la enzima T4 ADN Ligasa

(Fermentas) y una relación molar inserto:vector restringidos de 3:1.

Detalle de la reacción:

Reacción de Ligación Tubo Prueba Control 1 Control 2

ADN vector restringido 30 fmol* (57 ng) ---- ----

ADN inserto restringido 90 fmol* (42 ng) ---- ----

ADN vector original (10 ng/µl) ---- 1 µl (5,2 fmol*) ----

Tampón T4 ADN Ligasa 10X 2 µl ---- 2 µl

T4 ADN ligasa (1u/µl) 1 µl ---- 1 µl

Agua Csp 20 µl ---- Csp 20 µl

*equivalencia para ADN: 1 fmol = Nº pb x 6,6 10-4

ng

En primer lugar se incubó el ADN con el agua a 45ºC durante 5 minutos; luego se

enfrío en hielo y se agregaron los demás componentes de la mezcla; por último, se

incubó la reacción durante toda la noche (“over night”, ON) a 16ºC y se inactivó la

enzima por calentamiento a 70ºC durante 10 minutos.

3.7.2 Transformación de cepas bacterianas por electroporación

a) Generación de bacterias competentes

Para la obtención de las bacterias de mantenimiento y de expresión en estado

competente se adaptó el protocolo descripto en Molecular Cloning: A laboratory

Manual (3ª Edición).

Brevemente, se cultivaron las bacterias en caldo LB hasta crecimiento en fase

logarítmica (DO660nm: 0,6) y se enfriaron rápidamente en hielo. Luego, se disminuyó la

fuerza iónica del medio por sucesivos lavados con cantidades decrecientes de agua

desionizada estéril (centrifugación a 4.000 x g, 15 min, 4ºC), y por último, se generaron



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fracciones de 80 µl que se conservaron a -70ºC en glicerol 10% V/V hasta su

utilización.

b) Electroporación

Para la transformación por electroporación se utilizó el equipo Gene Pulser II- BioRad.

i) Transformación de E. coli JM 109:

Se agregó 1 µl de cada una de las reacciones de ligación a respectivos viales

conteniendo 80 µl de bacterias competentes y se mantuvieron en hielo durante 60

segundos. Luego, se colocó cada mezcla en una cubeta de 0,2 cm de separación

entre sus electrodos pre-enfriada en hielo y se aplicó un pulso eléctrico de 2,5 KV con

una resistencia de 200 Ohm. Inmediatamente, se agregó 1 ml de caldo súper óptimo

con represores del catabolismo (“super optimal broth with catabolic repressor”, SOC) a

temperatura ambiente y se transfirió cada mezcla a un tubo de 1,5 ml para su

incubación a 37ºC durante 1 hora en agitación.

ii) Transformación de E. coli BL 21 (DE3) pLys S:

Se agregó 1 µl de agua desionizada estéril, 1 µl (10 ng) del vector original o 1 µl (11,5

ng) de una dilución 1/10 del vector recombinante (purificado a partir de E. coli JM 109

que habían sido previamente transformadas con la mezcla de ligación) a respectivos

viales conteniendo 80 µl de bacterias competentes y se mantuvieron en hielo durante

60 segundos. Luego, se colocó cada mezcla en una cubeta de 0,2 cm de separación

entre sus electrodos pre-enfriada en hielo y se aplicó un pulso eléctrico de 2,5 KV con

una resistencia de 200 Ohm. Inmediatamente, se agregó 1 ml de medio SOC a

temperatura ambiente y se transfirió cada mezcla a un tubo de 1,5 ml para su

incubación a 37ºC durante 1 hora en agitación.

c) Selección de bacterias transformantes/recombinantes

La selección de las bacterias transformantes/recombinantes se realizó en placas de

ágar LB con antibiótico: 50 µg/ml de ampicilina para E. coli JM 109 y, 50 µg/ml de

ampicilina y 35 µg/ml de cloranfenicol para E. coli BL 21 (DE3) pLys S.

Para la reacción de transformación de la cepa E. coli JM 109 con la reacción de

ligación se realizaron las siguientes siembras:

- 3 placas “Tubo prueba”: 100 µl puro y 100 µl diluciones 10-1,10-2 y 10-3.

- 3 placas “Control 1”: 50 µl puro y 100 µl diluciones 10-1,10-2 y 10-3.



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- 1 placa “Control 2”: 100 µl correspondientes a todo el volumen de muestra (1

ml) luego de su centrifugación y posterior resuspensión del sedimento en 100

µl de sobrenadante.

Para la reacción de transformación de la cepa E. coli BL 21 (DE3) pLys S con el vector

recombinante se realizaron las siguientes siembras:

- 3 placas “Vector recombinante”: 50 µl puro y 100 µl diluciones 10-1, 10-2 y 10-3.

- 3 placas “Vector original”: 50 µl puro y 100 µl diluciones 10-1, 10-2 y 10-3.

- 1 placa “Agua desionizada”: 100 µl correspondientes a todo el volumen de

muestra (1 ml) luego de su centrifugación y posterior resuspensión del

sedimento en 100 µl de sobrenadante.

d) Verificación de la presencia del inserto en las colonias seleccionadas

La confirmación de la presencia del fragmento codificante para p24 en el vector

portado por las bacterias que desarrollaron en los medios de selección se llevó a cabo

a través de una reacción de amplificación a partir de las colonias (“PCR-colony”): se

realizó la PCR para la amplificación del fragmento correspondiente a la p24 utilizando

los cebadores modificados con los sitios de restricción y las condiciones optimizadas

previamente. Se utilizó como templado media colonia tomada del cultivo de selección y

se agregó a la reacción un paso de calentamiento a 94ºC durante 10 minutos previo al

comienzo del ciclado para permitir la lisis de las bacterias.

e) Conservación de colonias recombinantes

Las colonias recombinantes (PCR-colony positivas) se amplificaron individualmente en

caldo LB con antibiótico de selección y se conservaron con glicerol 10% V/V a -70ºC.

d) Purificación del vector recombinante

La purificación del vector recombinante se llevó a cabo a partir del cultivo de una

colonia recombinante en medio líquido (caldo LB con ampicilina 50 µg/ml). Se utilizó

un método comercial para mini preparaciones en columnas de sílica siguiendo las

indicaciones del fabricante (Gene Jet plasmid Miniprep Kit – Thermo Scientific).

El vector purificado se cuantificó por comparación de la intensidad de banda con las

intensidades de bandas de ADN cuantificadas de un marcador en una electroforesis

en gel de agarosa con bromuro de etidio y luego se conservó a -20ºC.



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e) Confirmación de la secuencia del inserto presente en el vector purificado

La confirmación de la secuencia del inserto presente en el vector purificado se llevó a

cabo a través del método de secuenciación capilar automatizada, siguiendo los pasos

ya descriptos en el punto 3.6.6. Para cada reacción (“sentido” y “antisentido”) se

utilizaron 60 ng de vector recombinante purificado como molde.

3.8 Expresión de la p24 recombinante

3.8.1 Piloto de expresión

Se llevó a cabo una prueba piloto para optimizar los parámetros de la expresión de la

proteína de interés.

a) Generación de una reserva de expresión

Se generó una reserva (“stock”) de E. coli BL 21 (DE3) pLys S recombinantes en fase

de crecimiento logarítmico a través del cultivo over night de una colonia en 30 ml de

caldo LB con antibióticos (50 µg/ml de ampicilina y 35 µg/ml de cloranfenicol) a 30ºC y

en agitación. Luego, se diluyó el cultivo al medio en caldo LB con glicerol 20% V/V y

antibióticos y, finalmente, se generaron fracciones de 1 ml que se congelaron a -70 º C

para su conservación.

b) Inducción de la expresión proteica

Se realizó un cultivo en agitación a 37ºC de 0,5 ml del stock de bacterias de expresión

en 50 ml de caldo LB conteniendo los antibióticos de selección (50 µg/ml de ampicilina

y 35 µg/ml de cloranfenicol) hasta alcanzar una densidad óptica aproximada de 0,5 a

550 nm (DO550). En ese punto se tomó una muestra de 1 ml del cultivo como

referencia de expresión proteica basal (Tiempo 0 = T0). Luego, se agregó al medio un

inductor de la expresión, isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), en una

concentración final de 1mM y se tomaron muestras de 1 ml de cultivo a intervalos de

tiempo fijos de una hora durante 6 hs y luego over night (T1 a T6 y TON = T11),

determinándose en todos los casos la DO550 (espectrofotómetro Metrolab M1700).

Las muestras tomadas en los diferentes tiempos de cultivo se centrifugaron a 14.000

rpm durante 1 minuto y se conservaron los sedimentos bacterianos a -20ºC para su

posterior utilización en la evaluación de la expresión.

c) Evaluación de la expresión y localización celular de la proteína expresada

La evaluación de la expresión se llevó a cabo a través de una electroforesis en gel de

poliacrilamida en tampón tris-glicina con dodecil- sulfato de sodio (SDS-PAGE; gel de



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estaqueo al 5% y gel de corrida al 12%). Se analizaron las muestras tomadas a los

tiempos T0, T2, T4, T6 y ON. Se utilizó un marcador de peso molecular de proteínas

pre-coloreado (2 KDa – 220 KDa; GenBiotech).

Previo a su siembra en el gel, los sedimentos bacterianos correspondientes a los

tiempos T2, T4, T6 y ON se sonicaron (3 ciclos de 10 segundos – amplitud del 40%) en

tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7 (100 µl); se centrifugaron por 10 minutos a

14.000 rpm a 4ºC y se separaron los sobrenadantes. Luego se agregaron 100 µl de

tampón de siembra 2X (ver composición en Anexo 3) a 100 µl de cada uno de los

sobrenadante y también a todos los sedimentos. Por último, se calentaron todas las

fracciones a 100ºC durante 5 minutos.

Se utilizó como referencia de expresión proteica basal el sonicado sin centrifugar del

sedimento bacteriano correspondiente al momento previo al agregado del inductor (T0)

diluido al medio en tampón de siembra 2X y calentado a 100ºC durante 5 minutos.

En todos los casos se sembraron 30 µl de muestra.

Las condiciones de corrida fueron: 10 minutos a 60 V y luego 2 horas a 100 V.

El revelado se realizó por tinción con azul de Coomassie (ver composición de

reactivos en Anexo 3): se incubó el gel de corrida con el colorante durante 2 horas a

temperatura ambiente en agitación y luego se lo incubó con la solución decolorante

durante toda la noche a temperatura ambiente en agitación. Por último, se realizaron

enjuagues con agua destilada.

3.8.2 Expresión de la p24 recombinante propiamente dicha

Se realizó la expresión de la p24 a mayor escala según las condiciones definidas en la

la evaluación de los resultados de la prueba piloto: inoculación de 250 ml de caldo LB

conteniendo los antibióticos con 2,5 viales del stock de expresión, inducción a las 3 hs

de iniciado el cultivo y cosecha a las 11 hs post inducción.

El desarrollo del cultivo se monitoreó por medio de lecturas de DO550.

La cosecha de las bacterias del cultivo de expresión se llevó a cabo por centrifugación

a 4.000 x g a 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el sobrenadante y se conservó el

sedimento bacteriano a -20ºC.

En el momento previo al agregado del inductor (T0) se cosechó de la misma manera

una alícuota de 40 ml que se utilizó en estudios posteriores para evaluar la expresión

basal de la proteína.



Página 38

3.9 Purificación de la proteína recombinante

Cromatografía de afinidad de metales

La proteína recombinante fusionada a una cola de 6 residuos consecutivos de histidina

se purificó por cromatografía de afinidad de metales en condiciones desnaturalizantes

utilizando un método comercial de columnas (QIAexpress® Ni-NTA Fast Start Kit -

QIAGEN) con una matriz de níquel - ácido nitriloacético (Ni-NTA) que posee alta

selectividad y afinidad por estos residuos aminoacídicos.

Brevemente, se resuspendió el sedimento bacteriano del cultivo de expresión en

tampón de lisis desnaturalizante pH8 (ver composición en Anexo 3) y se incubó a

temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se centrifugó a alta velocidad (14.000 x

g) durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares. Se

pasó el sobrenadante conteniendo la proteína recombinante por la columna de

afinidad de metales, se realizaron dos lavados con tampón desnaturalizante pH 6,3 y

luego tres pasos de elución con tampón desnaturalizante pH 4,5.

En todos los pasos se recolectaron en tubos separados las fracciones que pasaron a

través del lecho de la columna:

- Primera fracción: Escurrido (“Flow Through”, FT)

- Segunda fracción: Lavado 1 (W1)

- Tercera fracción: Lavado 2 (W2)

- Cuarta, quinta y sexta fracción: Eluatos 1, 2 y 3 (E1, E2 y E3)

3.10 Cuantificación de la proteína recombinante

Se llevó a cabo la cuantificación de proteínas totales en los tres eluatos que se

recolectaron en la purificación por cromatografía de afinidad de metales (E1, E2, y E3).

Se utilizó el método de cuantificación de proteínas totales de Bradford (67) modificado

para volúmenes pequeños siguiendo las instrucciones del fabricante del reactivo

(Reactivo de Bradford, SIGMA).

Brevemente, en una microplaca de pocillos de fondo plano se mezclaron 5 µl de

muestra con 250 µl de reactivo de Bradford, se incubó a temperatura ambiente durante

10 minutos y se realizó la lectura de densidad óptica a una longitud de onda de 595

nm con el lector de microplacas BioTek modelo Epoch.

Se utilizó un blanco de reacción y una curva de calibración de cinco puntos preparada

con una solución de seroalbúmina bovina (BSA) en un rango de concentración de 0,09

a 1,4 mg/ml.

Todas las determinaciones se realizaron por duplicado.



Página 39

Con los datos obtenidos para la curva de calibración se construyó un gráfico de

densidad óptica en función de la concentración proteica y se interpolaron los valores

de las muestras ensayadas.

3.11 Caracterización de la proteína recombinante

3.11.1 Estimación del tamaño y detección de la proteína de fusión

Se realizó una corrida de SDS-PAGE (gel de estaqueo al 5% y gel de corrida al 12%)

en tampón Tris-glicina-SDS con todas las fracciones recolectadas en la purificación,

con una alícuota de sobrenadante de lisis bacteriana desnaturalizante y una alícuota

de sobrenadante correspondiente a una fracción de cultivo de expresión tomada a T0

que se cosechó y lisó de igual manera que el resto del cultivo.

Se sembraron 10 µl de cada fracción, 10 µl de sobrenadante de lisis de expresión y 40

µl de sobrenadante de lisis bacteriana T0, todos diluidos al medio en tampón de

siembra 2X y calentados a 100ºC durante 5 minutos. Se utilizó un marcador de peso

molecular de proteínas pre-coloreado (2 KDa – 220 KDa; GenBiotech). Las

condiciones de corrida fueron: 10 minutos a 60 V y luego 2 horas a 100 V.

Una vez finalizada la corrida, se realizó la electrotransferencia de las bandas proteicas

presentes en el gel a una membrana de soporte seguida de una detección

inmunológica (“Western Blot”). Para la transferencia se utilizó una membrana de

nitrocelulosa de 0,2 µm de poro y la solución tampón Tris-glicina 20% metanol pH 8,3.

Se aplicó una corriente de 0,8 mA/cm2 (38,4 mA) durante una hora. Para la detección

inmunológica se lavó la membrana dos veces durante 10 minutos con solución tampón

Tris-salina (TBS); se bloqueó la membrana 1 hora a temperatura ambiente con 3% P/V

BSA en TBS-Tween; se realizaron 2 lavados de 10 minutos con TBS-Tween/Tritón

seguidos de un lavado de 10 minutos con TBS; se incubó durante toda la noche a 4ºC

con un anticuerpo monoclonal de ratón anti – cola de histidinas (penta His Antibody,

QIAGEN) dilución: 1/1000 en solución de bloqueo); se realizaron 2 lavados de 10

minutos con TBS-Tween/Tritón seguidos de un lavado de 10 minutos con TBS; se

incubó durante 1 hora con un conjugado policlonal de cabra anti – ratón marcado con

peroxidasa de rábano picante (HRP) (Goat anti Mouse IgG H+L horseradish

peroxidase conjugate, BIO-RAD) diluido 1/3000 en solución de bloqueo y, por último,

se realizaron 3 lavados con TBS-Tween/Tritón seguidos de un lavado de 10 minutos

con TBS. Para visualizar las bandas se sumergió la membrana en el sustrato

cromogénico 4-Cloro-1-Naftol (4CN) durante 20 minutos. La reacción de color se

detuvo con 2 enjuagues con agua destilada y se dejó secar.



Página 40

Todos los pasos se realizaron en agitación excepto la reacción de color.

Ver composición y preparación de reactivos en Anexo 3.

3.11.2 Identificación inmunológica

a) Detección de la cola de histidinas:

La proteína recombinante purificada se utilizó para sensibilizar una membrana de

nitrocelulosa soportada de 0,2 µm de poro por filtración por gravedad utilizando el

dispositivo comercial Bio-Dot® Microfiltration Apparatus (BIO-RAD). Se generaron

puntos (“dots”) de concentraciones proteicas 100 y 200 ng/dot y, como controles, un

dot blanco generado por sensibilización con solución tampón diluyente de anticuerpos

(primario y conjugado), dos dots positivos para control de reactividad entre el

anticuerpo primario y el conjugado generados por sensibilización con el monoclonal de

ratón anti-cola de histidinas y un dot positivo para control de actividad enzimática

generado por sensibilización con el conjugado policlonal de cabra anti - IgG de ratón

marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP).

Finalizada la sensibilización, se retiró la membrana del aparato, se realizaron dos

lavados con TBS por 10 minutos en agitación y se bloquearon los sitios inespecíficos

con una solución tampón de 3% P/V BSA en TBS-Tween durante una hora en

agitación a temperatura ambiente. A continuación, se realizaron lavados con TBS-

Tween/Tritón y con TBS, todos en agitación. Se dejó secar la membrana bloqueada

durante 1 hora a temperatura ambiente y se la recortó en tiras individuales de reacción

conteniendo todas las concentraciones proteicas y los dots de control. Cada tira se

incubó durante 3 hs a temperatura ambiente y en agitación con 1 ml de anticuerpo

monoclonal de ratón anti - cola de histidinas (Anti-6X His tag antibody [3H2201],

Abcam) diluido 1/100 en solución de bloqueo. Luego, se realizaron lavados con TBS-

Tween/Tritón y con TBS (1ml x tira), todos en agitación y, acontinuación, se incubó

durante una hora a temperatura ambiente y en agitación con un conjugado policlonal

de cabra anti - IgG de ratón marcado con HRP (Goat anti Mouse IgG (H+L) HRP

conjugate, BioRad) diluido 1/250 y 1/500 en solución de bloqueo (1ml x tira). Por

último, se realizaron lavados con TBS-Tween/Tritón (1 ml x tira) y con TBS (1 ml x

tira), todos en agitación.

Para visualizar la formación de inmunocomplejos se agregó 1 ml de una solución del

sustrato cromogénico 4-Cloro-1-Naftol (4CN) a cada tira y se lo dejó actuar durante 5

minutos sin agitar. La reacción de color se detuvo con 2 enjuagues con agua destilada.



Página 41

En todos los pasos de lavado se optimizó la cantidad de lavados, su duración y la

utilización de detergentes (Tween o Tween más Tritón) para reducir la señal de fondo.

Ver composición del diluyente de anticuerpos y de las soluciones de lavado y de

bloqueo en Anexo 3.

Esquema de sensibilización y detección:

Tira Sensibilización Detección

1 B 100 200 anti His 1/100

anti His 1/10

anti IgG M-HRP 1/250

anti His 1/100 anti IgG M-HRP

1/250

2 B 100 200 anti His 1/100

anti His 1/10


anti His 1/100 anti IgG M-HRP

1/500

B: dot blanco.

b) Detección específica de la proteína p24:

Se realizó un ensayo inmunológico de puntos de la misma manera que para la

detección de la cola de histidinas pero utilizando como anticuerpo primario un

anticuerpo monoclonal de ratón anti-p24 (Mouse anti Human HIV p24 [MAB880-A],

Millipore) y un esquema de sensibilización de la membrana que incluyó tres

concentraciones de proteína recombinante (50, 100 y 200 ng/dot) y un dot positivo

para control de reactividad entre el anticuerpo primario y el conjugado generados por

sensibilización con el monoclonal de ratón anti-p24.

Esquema de sensibilización y detección:

Tira Sensibilización Detección

1 B 50 100 200 anti p24 anti IgG M-HRP

1/250 anti p24 1/100


2 B 50 100 200 anti p24 anti IgG M-HRP

1/500 anti p24 1/100


B: blanco



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3.12 Evaluación de la reactividad inmunológica

3.12.1 Diseño y optimización de un ensayo inmunológico de puntos

Se diseñó un ensayo inmunológico de puntos sobre nitrocelulosa (“Dot Blot”) que

permitió evaluar la capacidad de la p24 recombinante para detectar la presencia de

anticuerpos anti p24 en plasmas de pacientes HIV-1 positivos.

El ensayo consistió en sensibilizar una membrana de nitrocelulosa en forma de puntos

(“dots”) con la proteína recombinante, recortarla en tiras, enfrentar dichas tiras a

plasmas de pacientes HIV-1 positivos y negativos, y revelar la presencia de

anticuerpos anti p24 (formación de inmunocomplejos) con un conjugado anti

inmunoglobulinas humanas marcado con peroxidasa de rábano picante (anti H-HRP)

que por acción sobre un sustrato cromogénico origina un precipitado azul. La tira de

reacción contó con un dot de prueba (p24), un dot blanco (B) y un dot control de

actividad enzimática (anti H-HRP).

Esquema de tira de ensayo:

Tira Sensibilización Muestra Detección

1 B p24 X ng/dot anti H-HRP plasma 1/100 anti H-HRP

Para la optimización del ensayo se procedió de la siguiente manera:

Se sensibilizó una membrana de nitrocelulosa soportada (0,2 µm de poro) en forma de

puntos con el dispositivo comercial Bio-Dot® Microfiltration Apparatus (BIO-RAD)

utilizando concentraciones crecientes de la proteína recombinante purificada (50, 100

y 200 ng/dot), solución diluyente de muestras como dot blanco y conjugado anti-

humano marcado con HRP como dot positivo para control de actividad enzimática.

Luego de la sensibilización, se retiró la membrana del aparato, se realizaron lavados

con TBS y se bloquearon los sitios inespecíficos con una solución de 3% P/V BSA en

TBS-Tween durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. A continuación, se

realizaron lavados con TBS-Tween/Tritón y con TBS, todos en agitación. Se dejó secar

la membrana bloqueada durante 1 hora a temperatura ambiente y se la recortó en tiras

individuales de reacción conteniendo todas las concentraciones proteicas y los

controles.

Las tiras de reacción se incubaron over night (18 hs) a temperatura ambiente y en

agitación con una dilución 1/100 de plasma en diluyente de muestra (1 ml x tira). Se

utilizaron plasmas cuyo patrón de anticuerpos anti HIV-1 se encontraba previamente

caracterizado por un inmunoensayo comercial en línea (LIA): plasmas positivos para la



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banda correspondiente a p24 con intensidad de 4+, 3+ y 2+, y dos plasmas negativos

para dicha banda.

Al finalizar la incubación, se realizaron lavados con TBS-Tween/Tritón (1ml x tira) y

con TBS (1 ml x tira), todos en agitación. A continuación, se incubó durante 1 hora con

diluciones 1/500, 1/1000,1/1500 y 1/2000 de anticuerpo policlonal de cabra anti – Igs

humanas conjugado con HRP (Goat anti Human IgA, IgG, IgM antibody HRP

conjúgate, Millipore) (1 ml x tira) en agitación y, por último, se realizaron lavados con

TBS-Tween/Tritón (1 ml x tira) y con TBS (1 ml x tira), todos en agitación.

Para visualizar la formación de inmunocomplejos se agregó 1 ml de una solución del

sustrato cromogénico 4-Cloro-1-Naftol (4CN) a cada tira y se lo dejó actuar durante 5

minutos sin agitar. La reacción de color se detuvo con 2 enjuagues con agua destilada.

En todos los pasos de lavado se optimizó la cantidad de lavados, su duración y la

utilización de detergentes para reducir la señal de fondo.

Ver composición del diluyente de muestras y de conjugado y de las soluciones de

lavado y de bloqueo en Anexo 3.

Esquema de sensibilización y detección para cada dilución de conjugado:


1 B 50 100 200 anti H-HRP

1/X P4+ 1/100

anti H-HRP 1/X

2 B 50 100 200 anti H-HRP

1/X P2+ 1/100

anti H-HRP 1/X

3 B 50 100 200 anti H-HRP

1/X P3+ 1/100

anti H-HRP 1/X


1 B 50 100 200 anti H-HRP

1/X P- A 1/100

anti H-HRP 1/X

2 B 50 100 200 anti H-HRP

1/X P- B 1/100

anti H-HRP 1/X

B: dot blanco

1/X: dilución de conjugado en evaluación

Pn+: plasma positivo para anticuerpos anti p24 con intensidad de n cruces en el LIA

P-: plasma negativo para anticuerpos anti p24 por LIA



Página 44

3.12.2 Evaluación del desempeño del ensayo inmunológico

Se comparó la capacidad de detección de anticuerpos anti p24 de HIV-1 del

inmunoensayo diseñado con la del método comercial INNO-LIA™ HIV I/II Score

(Innogenetics N. V. - Bélgica) a través del análisis de 34 plasmas de pacientes que

conviven con el HIV y 10 plasmas HIV negativos por ambos métodos.

El método comercial se llevó a cabo siguiendo las indicaciones del fabricante, y el dot

blot diseñado se realizó en las condiciones establecidas en el ensayo de optimización.

Criterios para determinar reactividad:

En el método comercial en línea, se estableció el grado de reactividad (en cruces) para

cada banda antigénica por comparación de la intensidad de cada una de ellas con la

intensidad de reacción de los controles presentes en la tira.

En el dot blot diseñado, se estableció la reactividad del dot prueba de cada muestra

por comparación con la reactividad del dot prueba para un plasma HIV negativo

utilizado como control negativo.

3.13 Materiales de referencia

Se evaluó la utilidad de la proteína recombinante para la elaboración de un estándar

de referencia y paneles de control de calidad a través de las pruebas piloto que se

describen en los siguientes puntos.

3.13.1 Detección por un método de diagnóstico comercial

Se evaluó si la p24 recombinante purificada podía ser detectada por medio de un

ELISA comercial de cuarta generación (Greenscreen ULTRA HIV Ag-Ab Assay, BIO -

RAD).

El ensayo comercial se llevó a cabo siguiendo las indicaciones del fabricante con las

siguientes muestras:

- Plasma HIV negativo (PN)

- Plasma HIV positivo (PP)

- Plasma HIV negativo con agregado de proteína p24 recombinante (300 pg/ml)

(PN 300)


(PN 100)


(PN 50)



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liofilizado y reconstituido a su volumen inicial con agua miliQ estéril. (PNL 100)

Todos los plasmas se mantuvieron congelados a -70ºC hasta su utilización en el

ensayo excepto el liofilizado que se mantuvo a temperatura ambiente (20ºC) desde su

elaboración (una semana).

Las muestras se incluyeron en la placa del ensayo por duplicado. Se utilizó un control

positivo de antígeno, un control positivo de anticuerpos y un control negativo (por

triplicado). La lectura de densidad óptica se realizó a una longitud de onda de 450 nm

(DO450) con el lector de microplacas BioTek modelo Epoch.

Las condiciones de validez del ensayo fueron:

- DO450 de cada pocillo de control negativo < 0,170

- Promedio de DO450 de los tres pocillos de control negativo < 0,150

- DO450 del pocillo de cada control positivo > 0,9

Para poder evaluar los resultados se calculó el punto de corte como lo establece el

fabricante: el promedio de la DO450 de los tres pocillos del control negativo más 0,2 y

luego se estableció la relación de absorbancia/punto de corte para todas las muestras.

Se consideró positiva a toda muestra cuya relación fue ≥ 1 y negativa a toda muestra

cuya relación fue < 0,9.

3.13.2 Ensayo de estabilidad

Para evaluar la estabilidad del plasma HIV negativo adicionado con la proteína

recombinante (75, 100 y 300 pg/ml) y del plasma HIV negativo adicionado con la

proteína recombinante (100 pg/ml) liofilizado se llevó a cabo el ELISA comercial de

cuarta generación descripto en el punto anterior luego de exponer las muestras a las

siguientes condiciones:

a) Plasmas sin liofilizar (PN y PN 75, 100, 300):

- Almacenamiento a -70ºC durante 7 días (-70; 7)

- Almacenamiento a temperatura ambiente (20ºC) durante 3 días (TA; 3)


- Almacenamiento a 37ºC durante 3 días (37; 3)




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b) Plasma liofilizado (PNL y PNL 100):




Para llevar a cabo el ELISA los plasmas liofilizados se reconstituyeron a su

volumen inicial con agua desionizada estéril.

Las muestras se incluyeron en la placa del ensayo por duplicado. Se realizó la lectura

de densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm con el lector de microplacas

BioTek modelo Epoch.

Las condiciones de validez del ensayo fueron las mismas que se describieron en el

punto anterior y el cálculo del puntode corte se llevó a cabo de igual forma.

Se consideró que la muestra se mantuvo estable cuando la reducción de la señal

(DO450) fue inferior al 10% respecto de la obtenida para la condición óptima de

conservación.

RESULTADOS


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4. RESULTADOS

4.1 Obtención del gen gag y del fragmento codificante de p24

4.1.1 Alineamientos y secuencias consenso

Mediante el alineamiento de las secuencias nucleotídicas de HIV-1 correspondientes a

aislamientos de Argentina y Brasil disponibles en la base de datos GenBank del

Instituto Nacional de Salud (NIH), Maryland – EEUU se establecieron las secuencias

consenso para el gen gag de HIV-1 (Figura 11) y para el fragmento del gen gag que

codifica para la proteína p24 de HIV-1 (Figura 12). Ver alineamientos en anexo 4.

Figura 11. Secuencia nucleotídica consenso gen gag HIV-1 Argentina - Brasil

N: desconocido

Figura 12. Secuencia nucleotídica consenso p24 HIV-1 Argentina - Brasil

RESULTADOS


Página 48

4.1.2 Diseño de Cebadores

Los cebadores “sentido” (Fw) y “antisentido” (Rv) que se diseñaron en base a las

secuencias nucleotídicas consenso establecidas para ser utilizados en la amplificación

específica del gen gag y del fragmento codificante para p24 de HIV-1, son los

siguientes:

a) gag:

Fw: 5´ ATg ggT gCg AgA gCg TCA g 3´ (temperatura de disociación 62ºC)

Rv: 5´ CTA ggg gTC gTT gCC AAA gAg Tg 3´ (temperatura de disociación

72ºC)

b) p24:

Fw: 5´ CCT ATA gTA CAg AAT CTT CA 3´ (temperatura de disociación 54ºC)

Rv: 5´ CAA AAC TCT TgC CTT ATg gC 3´ (temperatura de disociación 58ºC)

Para poder contar con los fragmentos de interés completos, no fue posible modificar la

posición de inicio de los cebadores (extremo 5´). Sin embargo, se ajustó la longitud de

los mismos (extremo 3´) para minimizar la formación de horquillas y de

homo/heterodímeros.

Los cebadores para la amplificación de p24 presentaron algunos sitios de unión

inespecífica a la secuencia del gen gag aunque con menor afinidad que para el sitio de

interés y dieron lugar a la co-amplificación de fragmentos de tamaño molecular

diferente al esperado para el fragmento de p24 que no interferieron en el proceso.

4.1.3 Amplificación y caracterización del gen gag

a) RT-PCR

La transcripción reversa y posterior amplificación por reacción en cadena de la

polimerasa (RT-PCR) del gen gag se llevaron a cabo utilizando como molde el ARN

viral extraído de muestras de pacientes HIV positivos. La optimización de la reacción

requirió varias pruebas de amplificación modificando diversos parámetros, entre ellos,

la cantidad inicial de molde (5 y 10 µl), la concentración (0,4 µM y 0,8 µM) y

temperatura de hibridación (67 y 60ºC) de los cebadores y la concentración de Mg2+ (2

y 4 mM). Las modificaciones de la cantidad inicial de molde y de la concentración de

cebadores no produjeron cambios significativos en la reacción. La utilización de una

concentración final de Mg2+ de 4 mM en vez de 2 mM provocó la aparición de bandas

RESULTADOS


Página 49

espúreas. El parámetro más crítico fue la temperatura de hibridación de los cebadores

en la PCR. Inicialmente, se utilizó una temperatura correspondiente al punto medio

entre las temperaturas de disociación de ambos cebadores (67ºC) y no se logró la

amplificación. Luego, la disminución de la astringencia del sistema por disminución de

la temperatura de hibridación de los cebadores a 60ºC permitió la obtención de un

fragmento de movilidad electroforética y tamaño compatibles con lo esperado para el

gen gag del HIV-1 (~1500 pb) (Figura 13). Fue posible amplificar el gen en el 70%

(7/10) de las muestras ensayadas.

En la siguiente tabla se indican las condiciones optimizadas de las reacciones:

Tabla 1. RT-PCR gen gag optimizada

A) Transcripción Reversa

RT Volumen por tubo (µl)

ARN molde 5,0

Cebador Rv (5 µM) 3,0

Agua 4,5

Calentamiento a 65ºC por 5 min

Enfriamiento en hielo

Tampón 5X 4,0

Inhibidor ARNasas (40 u) 0,5

dNTPs (10 mM) 2,0

Transcriptasa Reversa (200 u/µl) 1,0

Total 20

B) Amplificación

PCR Volumen por tubo (µl)

Tampón 10X 5,0

MgCl2 (25 mM) 4,0

dNTPs (10 mM) 4,0

Cebador Fw (5 µM) 4,0


Taq ADN polimerasa (5 u/ µl) 0,3

Agua 26,7

Molde: producto RT gen gag 2,0

Total 50

RESULTADOS


Página 50

Ciclado optimizado:

RT:

- Transcripción reversa: 42ºC 1 h

- Inactivación transcriptasa reversa: 70ºC 10 min

PCR:

- Desnaturalización: 94ºC 2 min

- Amplificación: 35 ciclos 94ºC 30 seg; 60ºC 30 seg; 72ºC 2 min

- Extensión de productos: 72ºC 10 min

- Mantenimiento final: 4ºC

Figura 13. Amplificación del gen gag (RT-PCR).

Agarosa 0,8% en 1xTAE.

Calle 1: amplicón de referencia (AR: 1400 pb); Calle2: Control Negativo,

Calles 3 y 4: Muestras, Calle 5: Marcador ADN 100 pb

b) Purificación y secuenciación

A partir de una electroforesis preparativa en gel de agarosa de uno de los productos

de RT-PCR del gen gag, se obtuvo el fragmento del gen gag puro en una

concentración de 20 ng/µl y con este material se obtuvieron las secuencias parciales

de las cadenas “sentido” y “antisentido” utilizando los mismos cebadores que en la RT-

PCR (Figura 14).Ver electroferogramas en Anexo 5.

RESULTADOS


Página 51

Figura 14.Secuencia nucleotídica parcial del gen gag

c) Identificación

Con la herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales de nucleótidos

(BLASTn), se evaluó la homología de las secuencias nucleotídicas parciales obtenidas

con las disponibles en la base de datos Genbank. Para la cadena parcial “sentido” se

obtuvieron alineamientos con secuencias correspondientes al gen gag de HIV-1 de

Argentina y Brasil (entre otros) con un porcentaje de identidad del 83 - 84% y un valor

esperado mínimo (e-value) de 3e-173 y máximo de 2e-151. Para la cadena parcial

“antisentido” (revertida y complementaria) también se obtuvieron alineamientos con

secuencias del gen gag de HIV-1 con un porcentaje de identidad mayor o igual al 89%

y un valor esperado (e-value) de 0.

De esta manera se pudo verificar que el fragmento amplificado y purificado

correspondió al gen gag de HIV-1. Ver resultados del BLAST en Anexo 6.

4.1.4 Amplificación y caracterización del fragmento codificante para p24

a) PCR

Para la amplificación del fragmento codificante de la proteína p24 por PCR también se

llevó a cabo la optimización de las condiciones de reacción y ciclado. Si bien se ajustó

la concentración y temperatura de hibridación de los cebadores, y la concentración de

RESULTADOS


Página 52

Mg2+, en este caso el factor más crítico fue la cantidad inicial de molde (ADN copia del

gen gag). En un principio se utilizaron 2 µl de molde y se obtuvo un bandeo

inespecífico con muy bajo rendimiento del producto de interés. Lo mismo ocurrió al

disminuir el volumen a 1 µl. Finalmente, este efecto se corrigió al utilizar 0,5 µl.

En la tabla 2 se presenta la mezcla de reacción de PCR optimizada que, luego de ser

sometida a las condiciones optimizadas de ciclado, permitió la obtención de un

fragmento de movilidad electroforética y tamaño compatibles con lo esperado para el

fragmento codificante de la proteína p24 del HIV-1 (693 pb) (Figura 15). Fue posible

amplificar el fragmento en todas las muestras ensayadas (7/7).

Tabla 2. PCR p24 optimizada

Mezcla Volumen por tubo (µl)

Tampón 10X 2,5

MgCl2 (25 mM) 2,0

dNTPs (10 mM) 2,0

Cebador Fw (5 µM) 2,5


Taq ADN polimerasa (5 u/ µl) 0,2

Agua 12,8

Molde: ADNc (gen gag amplificado) 0,5

Total 25

Ciclado optimizado:

- Desnaturalización: 94ºC 2 min

- Amplificación: 35 ciclos 94ºC 30 seg; 56ºC 30 seg; 72ºC 2 min

- Extensión de los productos: 72ºC 10 min

- Mantenimiento final: 4ºC

RESULTADOS


Página 53

Figura 15. Amplificación del fragmento codificante de p24 (PCR)

Agarosa 1% en 1xTAE.

Calle 1: Control negativo; Calles 2-8: Muestras 1-7, Calle 9: Marcador ADN 100 pb.

El fragmento de aproximadamente 950 pb que co-amplificó con el fragmento de interés

no interfirió en el desarrollo del proyecto.

b) Purificación y secuenciación

A partir de una electroforesis preparativa en gel de agarosa de todos los productos de

PCR se obtuvieron los fragmentos codificantes de la p24 puros en una concentración

aproximada de 20 ng/µl, y con este material se obtuvieron las secuencias completas

de las cadenas “sentido” y “antisentido” utilizando los mismos cebadores que se

usaron para la PCR. A continuación se muestran las secuencias nucleotídicas

“sentido” corregidas de los siete fragmentos purificados y las secuencias

aminoacídicas correspondientes. Ver electroferogramas de una secuencia ejemplo en

Anexo 5.

Secuencias nucleotídicas del fragmento codificante de p24:

RESULTADOS


Página 54

RESULTADOS


Página 55

Secuencias aminoacídicas del fragmento codificante de p24:

RESULTADOS


Página 56

c) Identificación

Al llevar a cabo una búsqueda de alineamientos locales de nucleótidos (BLASTn) para

las secuencias nucleotídicas “sentido” de los fragmentos purificados en la base de

datos Genbank, se hallaron secuencias homólogas correspondientes al genoma

completo y al gen gag de aislamientos de HIV-1 de Argentina y Brasil (entre otros); y

por búsqueda de alineamientos locales de proteínas (BLASTp) para las secuencias

aminoacídicas de los mismos fragmentos, se hallaron secuencias homólogas a la p24

del gen gag de HIV-1. En todos los casos los valores de identidad para las secuencias

nucleotídicas estuvieron compredidos entre el 93 y el 97% y los valores esperados (e-

value) fueron de 0. Para las secuencias aminoacídicas los porcentajes de identidad

fueron del 92 al 98% y los valores esperados (e-value) mínimo y máximo fueron de 4e-

169 y 3e-157, respectivamente.

Para una de las secuencias tomada como ejemplo, los valores de identidad con las

secuencias nucleotídicas homólogas fueron superiores al 95 % y el valor esperado (e-

value) de 0; y para la secuencia de aminoácidos correspondiente a ese fragmento se

RESULTADOS


Página 57

hallaron secuencias homólogas correspondientes a p24 de HIV-1 con porcentajes de

identidad superiores al 96% y un valor esperado mínimo (e-value) de 1e-169 y máximo

de 9e-164. Ver resultados del BLAST de la secuencia tomada como ejemplo en Anexo

6.

De esta manera se verificó la identidad de todos los fragmentos obtenidos como

correspondientes a la proteína p24 de HIV-1.

4.2 Selección del fragmento de p24 a clonar

En la evaluación de la relación filogenética de las secuencias nucleotídicas de los

fragmentos en estudio con las secuencias presentes en el alineamiento de referencia

para subtipos de HIV-1 del Laboratorio Nacional Los Álamos, el modelo de evolución

que mejor se ajustó a los datos fue GTR (“General Time Reversible”) con

contemplación de la presencia de sitios invariables y de la heterogeneidad en la tasa

de sustitución entre sitios: GTR + I+G (α= 0,6980). De la inferencia filogenética por

Máxima Verosimilitud (“Maximum Likelihood”) utilizando este modelo evolutivo y un

soporte estadístico de los grupos por bootstrap (1000 réplicas) se obtuvo el árbol que

se muestra en la Figura 16.

Las secuencias 1, 2, 3, 4, 6 y 7 correspondientes a los fragmentos codificantes para

p24 en estudio quedaron incluidas en un grupo conformado por secuencias

correspondientes a las CRFs BF y BF1 y al subtipo F1, cuya formación estuvo

soportada con un 90% de bootstrap. La secuencia 5 quedó incluida en otro grupo

constituido por secuencias de CRFs BF y secuencias del subtipo B soportado con un

82% de bootstrap.

Este agrupamiento de las secuencias permitió comprobar que las mismas son

representativas de los subtipos circulantes en la región.

Por otro lado, a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas de los

fragmentos codificantes para p24 de las secuencias 1, 2, 3, 4, 6 y 7 en estudio con las

correspondientes a las secuencias de referencia con las que éstas agruparon en el

árbol filogenético, se obtuvo la matriz de identidad que mostró un porcentaje de

homología entre las secuencias superior al 88% en todos los casos (Figura 17), siendo

la secuencia en estudio número 3 la que presentó mayores porcentajes de identidad

con la mayoría de las secuencias de referencia presentes en el grupo. En este análisis

también se pudo comprobar el alto grado de conservación de la secuencia

aminoacídica de los fragmentos en estudio (Figura 18).

En base a los análisis realizados se continuó trabajando con la secuencia número 3.

RESULTADOS


Página 58

p24 7

Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF385936

Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ213780

Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ213781

p24 2

p24 1

Ref.38_BF1.UY.04.UY04_4022.FJ213782

Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU581827

Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.EU581828

Ref.17_BF.AR.02.AR02_ARG1139.EU581825

Ref.12_BF.AR.97.A32879.AF408629

Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ249238

Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

Ref.12_BF.AR.97.A32989.AF408630

p24 6

Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF005494

Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ358802

Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ358801

Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM026456

p24 3

p24 4

Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU170155

Ref.29_BF.BR.99.BREPM11948.DQ085871





Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771590

Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ670529

Ref.47_BF.ES.08.P1942.GQ372987

Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU735539

Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735540

Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU735538

Grupo 1

Ref.F2.CM.95.95CM_MP257.AJ249237

Ref.F2.CM.95.95CM_MP255.AJ249236

Ref.F2.CM.97.CM53657.AF377956

Ref.F2.CM.02.02CM_0016BBY.AY371158

Ref.K.CM.96.96CM_MP535.AJ249239

Ref.K.CD.97.97ZR_EQTB11.AJ249235

Ref.07_BC.CN.05.XJDC6441.EF368370

Ref.07_BC.CN.05.XJDC6431_2.EF368372

Ref.07_BC.CN.98.98CN009.AF286230

Ref.08_BC.CN.97.97CNGX_6F.AY008715

Ref.08_BC.CN.06.nx2.HM067748

Ref.C.ZA.04.04ZASK146.AY772699

Ref.C.IN.95.95IN21068.AF067155

Ref.C.ET.86.ETH2220.U46016

Ref.31_BC.BR.04.04BR142.AY727527

Ref.31_BC.BR.04.04BR137.AY727526

Ref.31_BC.BR.02.110PA.EF091932

Ref.C.BR.92.BR025_d.U52953

Ref.J.SE.93.SE9280_7887.AF082394

Ref.J.CM.04.04CMU11421.GU237072

Ref.J.CD.97.J_97DC_KTB147.EF614151

Ref.B.TH.90.BK132.AY173951

Ref.B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.K03455

Ref.B.NL.00.671_00T36.AY423387

Ref.B.US.98.1058_11.AY331295

p24 5

Ref.39_BF.BR.04.04BRRJ179.EU735535

Ref.39_BF.BR.03.03BRRJ327.EU735536

Ref.39_BF.BR.03.03BRRJ103.EU735534

Grupo 2

Ref.21_A2D.KE.99.KER2003.AF457051

Ref.21_A2D.KE.91.KNH1254.AY945737

Ref.21_A2D.KE.99.KSM4001.AF457072

Ref.05_DF.ES.99.X492.AY227107

Ref.05_DF.BE.93.VI961.AF076998

Ref.05_DF.BE.x.VI1310.AF193253

Ref.D.CD.83.ELI.K03454

Ref.D.CM.01.01CM_4412HAL.AY371157

Ref.19_cpx.CU.99.CU7.AY894994



Ref.D.TZ.01.A280.AY253311

Ref.10_CD.TZ.96.96TZ_BF110.AF289550

Ref.10_CD.TZ.96.96TZ_BF061.AF289548

Ref.10_CD.TZ.96.96TZ_BF071.AF289549

Ref.D.UG.94.94UG114.U88824

Ref.H.CF.90.056.AF005496

Ref.H.BE.93.VI997.AF190128

Ref.H.GB.00.00GBAC4001.FJ711703

Ref.H.BE.93.VI991.AF190127

Ref.24_BG.CU.03.CB471.AY900575

Ref.24_BG.CU.03.CB378.AY900574

Ref.24_BG.ES.08.X2456_2.FJ670526

Ref.20_BG.CU.99.Cu103.AY586545

Ref.23_BG.CU.03.CB347.AY900572

Ref.23_BG.CU.03.CB118.AY900571

Ref.G.KE.93.HH8793_12_1.AF061641

Ref.14_BG.PT.00.00PTHDE10.GU230137

Ref.14_BG.ES.00.X623.AF450097

Ref.14_BG.ES.00.X605.AF450096

Ref.G.PT.x.PT2695.AY612637

Ref.G.NG.92.92NG083.U88826

Ref.25_cpx.CM.06.06CM_BA_040.EU693240

Ref.G.BE.96.DRCBL.AF084936

Ref.25_cpx.SA.03.J11451.EU697908

Ref.25_cpx.SA.03.J11233.EU697906

Ref.27_cpx.FR.04.04CD_FR_KZS.AM851091

Ref.27_cpx.CD.97.97CDKTB49.AJ404325

Ref.43_02G.SA.03.J11456.EU697909

Ref.43_02G.SA.03.J11243.EU697907

Ref.43_02G.SA.03.J11223.EU697904

Ref.13_cpx.CM.02.02CM_A1394.DQ845388

Ref.13_cpx.CM.96.96CM_1849.AF460972

Ref.13_cpx.CM.04.04CM_632_28.DQ845387

Ref.26_AU.CD.97.97CD_KTB119.FM877777

Ref.26_AU.CD.02.02CD_KS069.FM877780

Ref.26_AU.CD.02.02CD_MBTB047.FM877782

Ref.A2.CY.94.94CY017_41.AF286237

Ref.A2.CM.01.01CM_1445MV.GU201516

Ref.A2.CD.97.97CDKTB48.AF286238

Ref.16_A2D.KR.97.97KR004.AF286239

Ref.16_A2D.KE.91.KNH1271.AY945736

Ref.06_cpx.EE.01.EE0359.AY535659

Ref.06_cpx.AU.96.BFP90.AF064699

Ref.06_cpx.GH.03.03GH173_06.AB286851

Ref.49_cpx.GM.97.N28353.HQ385478

Ref.49_cpx.GM.02.N18380.HQ385477

Ref.49_cpx.GM.03.N26677.HQ385479

Ref.45_cpx.CM.97.97CM_MP814.FN392876

Ref.45_cpx.CD.97.97CD_MBFE185.FN392874

Ref.09_cpx.SN.95.95SN1795.AY093603

Ref.09_cpx.US.99.99DE4057.AY093607

Ref.09_cpx.GH.96.96GH2911.AY093605

Ref.09_cpx.CI.00.00IC_10092.AJ866553

Ref.45_cpx.GA.97.97GA_TB45.FN392877

Ref.35_AD.AF.05.05AF094.EF158040

Ref.35_AD.AF.05.05AF026.EF158043

Ref.35_AD.AF.05.05AF095.EF158041

Ref.A1.UG.92.92UG037.AB253429

Ref.A1.RW.92.92RW008.AB253421

Ref.11_cpx.CM.95.95CM_1816.AF492624

Ref.11_cpx.CM.97.MP818.AJ291718

Ref.11_cpx.CM.96.96CM_4496.AF492623

Ref.A1.AU.03.PS1044_Day0.DQ676872

Ref.32_06A1.EE.01.EE0369.AY535660

Ref.03_AB.RU.97.KAL153_2.AF193276

Ref.18_cpx.CM.97.CM53379.AF377959



Ref.37_cpx.CM.97.CM53392.AF377957

Ref.37_cpx.CM.00.00CMNYU926.EF116594

Ref.02_AG.NG.x.IBNG.L39106

Ref.02_AG.LR.x.POC44951.AB485636

Ref.02_AG.CM.99.pBD6_15.AY271690

Ref.04_cpx.GR.97.GR84_97PVMY.AF119819

Ref.04_cpx.CY.94.94CY032_3.AF049337

Ref.04_cpx.GR.91.GR11_97PVCH.AF119820



Ref.22_01A1.CM.02.02CM_3097MN.GQ229529

Ref.22_01A1.CM.01.01CM_0001BBY.AY371159

Ref.01_AE.AF.07.569M.GQ477441

Ref.33_01B.MY.05.05MYKL045_1.DQ366662

Ref.33_01B.MY.05.05MYKL007_1.DQ366659

Ref.33_01B.ID.07.JKT194_C.AB547464

Ref.34_01B.TH.99.OUR2478P.EF165541

Ref.15_01B.TH.99.99TH_R2399.AF530576

Ref.15_01B.TH.99.99TH_MU2079.AF516184

Ref.15_01B.TH.96.M169.DQ354120

Ref.01_AE.TH.90.CM240.U54771

Ref.01_AE.CN.05.05GX001.GU564221

Ref.N.CM.95.YBF30.AJ006022

Ref.N.CM.97.YBF106.AJ271370

Ref.N.CM.02.DJO0131.AY532635

Ref.CPZ.CM.05.SIVcpzMT145.DQ373066

Ref.CPZ.US.85.US_Marilyn.AF103818

Ref.P.CM.06.U14788.HQ179987

Ref.P.FR.09.RBF168.GU111555

Ref.O.CM.91.MVP5180.L20571

Ref.O.SN.99.99SE_MP1300.AJ302647

Ref.O.BE.87.ANT70.L20587

Ref.O.CM.98.98CMU2901.AY169812

Ref.CPZ.CD.90.ANT.U42720

100

7298

100

79100

98

100

100

100

98

99

99

99

99

89

99

98

100

93

100

98

80

75

77

90

94

99

99

99

94

91

84

80

94

91

96

73

90

84

92

98

72

85

99

92

72

78

100

94

97

97

82

100

100

88

75

99

96

83

74

90

GRUPO 2

Ref.B.TH.90.BK132.AY173951

Ref.B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.K03455

Ref.B.NL.00.671_00T36.AY423387

Ref.B.US.98.1058_11.AY331295

p24 5

Ref.39_BF.BR.04.04BRRJ179.EU735535

Ref.39_BF.BR.03.03BRRJ327.EU735536

Ref.39_BF.BR.03.03BRRJ103.EU73553485

82

GRUPO 1

p24 7

Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF385936

Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ213780

Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ213781

p24 2

p24 1

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Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU581827

Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.EU581828

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Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ249238

Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

Ref.12_BF.AR.97.A32989.AF408630

p24 6

Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF005494

Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ358802

Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ358801

Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM026456

p24 3

p24 4

Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU170155






Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771590

Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ670529

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Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU735539

Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735540

Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU735538

83

74

100

8899

90

Figura 16. Filogenia de secuencias nucleotídicas. Árbol de Máxima Verosimilitud.

Condensado a grupos con soporte superior al 70% de bootstrap

RESULTADOS


Página 59

Figura 17. Matriz de identidad de las secuencias aminoacídicas p24

Grupo 1 del árbol de Máxima Verosimilitud

Secu

en

cia

s d

e la M

atr

iz d

e Id

en

tid

ad

1.R

ef.

12 B

F.A

R.9

9.A

RM

A159.A

F385936

10.R

ef.

29 B

F.B

R.0

2.B

RE

PM

119.A

Y771590

19.R

ef.

42 B

F.L

U.0

3.luB

F 0

5 0

3.E

U170155

28.R

ef.

F1.B

E.9

3.V

I850.A

F077336

2.R

ef.

12 B

F.A

R.9

7.A

32879.A

F408629

11.R

ef.

29 B

F.B

R.9

9.B

RE

PM

11948.D

Q085871

20.R

ef.

44 B

F.C

L.0

0.C

H80.F

J358521

29.R

ef.

F1.F

R.9

6.9

6F

R M

P411.A

J249238

3.R

ef.

12 B

F.A

R.9

7.A

32989.A

F408630

12.R

ef.

29 B

F.B

R.0

1.B

RE

PM

16704.D

Q085876

21.R

ef.

46 B

F.B

R.0

1.0

1B

R087.D

Q358801

X1.p24 1

4.R

ef.

17 B

F.A

R.0

2.A

R02 A

RG

1139.E

U581825

13.R

ef.

38 B

F1.U

Y.0

5.U

Y05 4

752.F

J213780

22.R

ef.

46 B

F.B

R.0

1.0

1B

R125.D

Q358802

X2.p24 2

5.R

ef.

17 B

F.B

O.0

2.B

O02 B

OL119.E

U581827

14.R

ef.

38 B

F1.U

Y.0

4.U

Y04 3

987.F

J213781

23.R

ef.

46 B

F.B

R.0

7.0

7B

R F

PS

625.H

M026456

X3.p24 3

6.R

ef.

17 B

F.P

E.0

2.P

E02 P

CR

0155.E

U581828

15.R

ef.

38 B

F1.U

Y.0

4.U

Y04 4

022.F

J213782

24.R

ef.

47 B

F.E

S.0

8.X

2457-2

.FJ670529

X4.p24 4

7.R

ef.

28 B

F.B

R.9

9.B

RE

PM

12313.D

Q085872

16.R

ef.

40 B

F.B

R.0

4.0

4B

RR

J115.E

U735538

25.R

ef.

47 B

F.E

S.0

8.P

1942.G

Q372987

X6.p24 6

8.R

ef.

28 B

F.B

R.9

9.B

RE

PM

12609.D

Q085873

17.R

ef.

40 B

F.B

R.0

5.0

5B

RR

J200.E

U735539

26.R

ef.

F1.B

R.9

3.9

3B

R020-1

.AF

005494

X7.p24 7

9.R

ef.

28 B

F.B

R.9

9.B

RE

PM

12817.D

Q085874

18.R

ef.

40 B

F.B

R.0

4.0

4B

RS

Q46.E

U735540

27.R

ef.

F1.F

I.93.F

IN9363.A

F075703

RESULTADOS


Página 60

10 20 30 40 50 60 70 80....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PIVQNLQGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAADW Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF3859

.............SI...........I...................................................E. Ref.12_BF.AR.97.A32879.AF40862

.............A...K............................................................E. Ref.12_BF.AR.97.A32989.AF40863

..........M....T..............T............A.............S....................E. Ref.17_BF.AR.02.AR02_ARG1139.E

...........Y.T................................................................E. Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU

.............S............I...G.N.......T.....................................E. Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.E

.....I.......A............I...................................................E. Ref.28_BF.BR.99.BREPM12313.DQ0

.............A............I...................................................E. Ref.28_BF.BR.99.BREPM12609.DQ0

..............................G.N.............................................E. Ref.28_BF.BR.99.BREPM12817.DQ0

.....I........IA.........................................S....................E. Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771

.............AI.........................T.....................................E. Ref.29_BF.BR.99.BREPM11948.DQ0

..............I...........I...................................................E. Ref.29_BF.BR.01.BREPM16704.DQ0

.............SI...........I...................................................E. Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ2

.............A............I...................................................E. Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ2

.......X......I................................................................. Ref.38_BF1.UY.04.UY04_4022.FJ2

.............A............I...................................................E. Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU73

.............AI...........I................A.................................TE. Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU73

.............A............I...................................................E. Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735

.............AI............................A............X.....................E. Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU1

.............A..........................T.....................................E. Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

.............S............I...............................................D...E. Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ3588

.............S............I...................................................E. Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ3588

.............A..................................................P.....GG......E. Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM

.....A....M...I...............................C...............................E. Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ6705

.....A..H.I...I...............................C...............................E. Ref.47_BF.ES.08.P1942.GQ372987

.............S............I...................................................E. Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF00549

.............AI...........I...................................................E. Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

.............S............I......................T............................E. Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

..............I...........I...................................................E. Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ2492

.......XXXXX.N................................................................E. p24 1

.......X.....S................................................................E. p24 2

.............A............I...................................................E. p24 3

.......XX....A................................................................E. p24 4

.......---X..S............I...................................................E. p24 6

.............S..........................T.................................D...E. p24 7

90 100 110 120 130 140 150 160....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

DRLHPVHAGPIPPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIQWMTSNPPVPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEP Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF3859

...............................................D...................V............ Ref.12_BF.AR.97.A32879.AF40862

.............................N.....................................V...G........ Ref.12_BF.AR.97.A32989.AF40863

...................................................................V.....K...... Ref.17_BF.AR.02.AR02_ARG1139.E

......Q........I..............P....................................V............ Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU

......Q......................N.....................................V.....K...... Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.E

...................................................................V.....K...... Ref.28_BF.BR.99.BREPM12313.DQ0

.............................N.....A...............................V............ Ref.28_BF.BR.99.BREPM12609.DQ0

.............................N............................TTL.G....V.....K....DL Ref.28_BF.BR.99.BREPM12817.DQ0

..V................................................................V............ Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771

..V............................................D.........................K...... Ref.29_BF.BR.99.BREPM11948.DQ0

...................................................................V............ Ref.29_BF.BR.01.BREPM16704.DQ0

..I...Q........I.............N.....................................V............ Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ2

..V................................................................V............ Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ2

...................................................................V............ Ref.38_BF1.UY.04.UY04_4022.FJ2

...............I..........S..........I.G...........................V............ Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU73

...................................................................V............ Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU73

.......................................G...........................V............ Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735

.............................N.....................................V.........X.. Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU1

..V.......A........................G............................................ Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

...................................................................V............ Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ3588

.............................N.....................................V............ Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ3588

Y.F.T..............................................................V............ Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM

...............................................D...................V.....K...... Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ6705

...............................................D...................V.....K...... Ref.47_BF.ES.08.P1942.GQ372987

.....TQ........I.......................G........M..................VG........... Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF00549

...............................................D...................V............ Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

..........A............................G.......D...................V.....K...... Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

.....A.....L...................................D...................V............ Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ2492

..................................V................................V............ p24 1

...................................................................V............ p24 2

.............................N.....................................V.....K...... p24 3

...................................................................V............ p24 4

......Q........I..................V................................V............ p24 6

................................................................................ p24 7

170 180 190 200 210 220 230....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGSGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF3859

.................S....G.......................P......................... Ref.12_BF.AR.97.A32879.AF40862

......................G.......................P......................... Ref.12_BF.AR.97.A32989.AF40863

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......................G...E...................T......................... Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU

......................G...E...............R............................. Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.E

................C.....G.......................Q.................S....... Ref.28_BF.BR.99.BREPM12313.DQ0

................C.....G.......................P.................S....... Ref.28_BF.BR.99.BREPM12609.DQ0

.............L..C.....G........P........F.....P.PS...LT.PGP.....S....... Ref.28_BF.BR.99.BREPM12817.DQ0

..............................................P.................S....... Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771

................C.....G...............R.......P.S...............S....I.. Ref.29_BF.BR.99.BREPM11948.DQ0

................C.....G.......................P.................S....... Ref.29_BF.BR.01.BREPM16704.DQ0

..........A................................G..I......................... Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ2

..............................I..S............P..S..............S....... Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ2

..........V...........G..........X............T........A................ Ref.38_BF1.UY.04.UY04_4022.FJ2

.................S............................P......................... Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU73

..............................................P......................... Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU73

..............................................P......................... Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735

......................G.......................P......................... Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU1

..........................................R...P......................... Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

......................G.......................P.................A....... Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ3588

......................G.......................P......................... Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ3588

......................G.......................P.................S....I.. Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM

..........V........D......E......S............PQ.....................I.. Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ6705

..........V........D......E......S............PQ........................ Ref.47_BF.ES.08.P1942.GQ372987

......................G.......................P.................S....... Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF00549

..........A...........G................I...G..I...........R..........I.. Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

..........V......S.D..G.......................T.................S....... Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

.................S........ES.....S............P......................... Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ2492

..........................ES..................T........S...............- p24 1

......................G...E...................PA.S.....................- p24 2

..............................................P.................S.R....- p24 3

......................G.......I..S............P.................S......- p24 4

......................G.......................P..S.....................- p24 6

.................S.D..........................P.................S......- p24 7

Figura 18. Grado de conservación secuencias aminoacídicas de fragmentos p24:

Secuencias p24 en estudio y secuencias de referencia de mayor relación filogenética

RESULTADOS


Página 61

4.3 Clonado

4.3.1 Obtención del plásmido recombinante

a) Incorporación de sitios de restricción al fragmento codificante de p24

Una vez determinada la secuencia del fragmento codificante de p24 a clonar y

seleccionado el vector de expresión, se modificaron exitosamente los extremos del

fragmento a través de una reacción de amplificación por PCR en las condiciones

optimizadas para la amplificación original pero utilizando los cebadores modificados.

Se dellan en color las siguientes modificaciones:

- Verde: sitios de restricción correspondientes a las enzimas XhoI (Fw) y NcoI (Rv)

- Azul: bases necesarias para la correcta interacción de las enzimas con el fragmento

- Rojo: codón de terminación (codón “stop”)

Fw: 5´ AgT CTC gAg CCT ATA gTA CAg AAT CTT C 3´

Rv: 5´ CAC CCA Tgg TTA CAA AAC TCT TgC CTT AT 3’

Como resultado de la amplificación se obtuvo un producto de movilidad electroforética

y tamaño compatibles con el fragmento codificante de p24 modificado (714 pb) (Figura

19).

Figura 19. Amplificación del fragmento codificante de p24 modificado (PCR)

Agarosa 1,5 % en 1xTAE.

Calles1y 3: muestras; Calle2: Marcador ADN 100 pb; Calle 4: control negativo

RESULTADOS


Página 62

Luego, por electroforesis en gel de agarosa preparativo y posterior purificación, se

obtuvo el fragmento codificante de p24 modificado puro en una concentración de 40

ng/µl.

b) Restricción enzimática y purificación del fragmento p24 modificado y del

vector

Se logró una adecuada digestión enzimática asimétrica de los elementos a recombinar

utilizando en la misma mezcla las dos enzimas de restricción (NcoI y XhoI) (Figura 20).

Los productos de la digestión se purificaron a partir de geles de agarosa preparativos y

se los obtuvo en una concentración de 20 ng/µl.

A. Digestión enzimática fragmento p24 modificado B. Digestión enzimática pRSET A

Calle1: Sin digerir; Calle2: Marcador ADN 100 pb; Calle1: Doble digestión; Calle2: XhoI; Calle 3: NcoI

Calle 3: Doble digestión Calle 4: Sin digerir; Calle 5: Marcador ADN 100 pb;

Calle 6: Marcador ADN 1 Kpb

Figura 20. Digestión enzimática XhoI y NcoI


c) Ligación, transformación y selección de bacterias transformantes

En la reacción de ligación se favoreció la formación del vector recombinante

incluyendo los elementos digeridos en una relación molar inserto:vector de 3:1. Una

vez finalizada la misma, se llevó a cabo la electroporación de las bacterias

competentes E.coli JM 109 con la mezcla de ligación y las mezclas control. En las tres

reacciones se logró una adecuada intensidad y duración de los pulsos de corriente,

observándose constantes de electroporación comprendidas entre 4 y 5 milisegundos.

Una vez estabilizadas las bacterias por incubación en medio SOC, se procedió a la

RESULTADOS


Página 63

selección de las bacterias transformantes en ágar LB con 50 µg/ml de ampicilina y se

obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 3; Figura 21):

i) A partir de la reacción de electroporación llevada a cabo con una cantidad conocida

de vector original se obtuvo desarrollo de colonias de E.coli JM 109 transformantes en

las placas correspondientes a la siembra pura y a las diluciones 10-1 y 10-2. Esto

permitió confirmar que las bacterias conservaron adecuadamente el estado

competente. La eficiencia de transformación para esta reacción fue de 4,35 x 106 UFC/

µg de ADN.

ii) A partir de la reacción de electroporación realizada con el control sin agregado de

ADN no se obtuvo desarrollo. Esto permitió verificar la ausencia de contaminación de

las bacterias competentes y del ágar de selección con cepas resistentes al antibiótico,

y también aseguró una adecuada actividad del antibiótico en el medio de selección.

iii) La transformación por electroporación con la reacción de ligación entre los

elementos digeridos en relación molar inserto:vector 3:1 permitió la recuperación de

colonias bacterianas en el medio de selección con antibiótico en la placa

correspondiente a la siembra pura. Esto indica que ocurrió la incorporación del vector

circularizado conteniendo el gen de resistencia correspondiente. La eficiencia de

transformación para la reacción de ligación fue de 1,8 x 104 UFC/µg de ADN.

Tabla 3. Eficiencia de transformación E. coli JM 109

Transformación K

(mseg) Siembra LBa

Recuento

(UFC)

µg ADN

plaqueados

Eficiencia

(UFC/µg ADN)

Eficiencia promedio

(UFC/µg ADN)

Ligación 3:1 4,82 100 µl puros 9 5 x 10-4 1,8 x 104 1,8 x 104

Control vector

orginal 4,92

50 µl puros 2224 5 x 10-4 4,45 x 106

4,35 x 106 100 µl dil 10-1 420 1 x 10-3 4,20 x 106

100 µl dil 10-2 44 1 x 10-3 4,40 x 106

Control sin ADN 4,94 toda la mtra 0 --- --- ---

K: constante de electroporación

LBa: LB ágar con antibiótico de selección

UFC: unidades formadoras de colonias

RESULTADOS


Página 64

Figura 21. Transformación de E. coli JM 109.

Ágar LB con ampicilina 50 µg/ml

A. Reacción de ligación inserto:vector 3:1 puro (100 µl)

B. Control sin ADN y control con vector original

d) Verificación de la presencia del fragmento codificante de p24 modificado en

las bacterias transformantes

A través de la reacción de amplificación de p24 utilizando como templado colonias de

bacterias transformantes lisadas por calor (PCR-colony), se obtuvo una banda de

movilidad electroforética y tamaño compatibles con el fragmento codificante de p24

modificado (714 pb) en todos los clones evaluados (9/9) (Figura 22). De esta manera

se confirmó que el vector presente en los clones positivos contenía el fragmento de

interés y, por lo tanto, se trataba de clones transformantes recombinantes.

Figura 22. Amplificación de p24 modificado por PCR-colony. E. coli JM 109.


Calle 1: Marcador ADN 100 pb; Calles 2 al 10: Colonias transformantes1 al 9

RESULTADOS


Página 65

e) Purificación del vector recombinante

A través de una minipreparación en columna llevada a cabo a partir de una colonia de

E. coli JM 109 recombinante se purificó el plásmido recombinante en una

concentración de 115 ng/ µl (Figura 23).

Figura 23. Purificación por minipreparación del pRSET A recombinante


Calle 1: Marcador ADN 1 Kpb; Calles 2y 3: pRSET A de colonias 1 y 3

f) Confirmación de la secuencia del inserto del vector recombinante purificado

A través de la secuenciación del inserto presente en el vector recombinante purificado

se pudo confirmar que la secuencia codificante para la p24 recombinante se mantuvo

inalterada durante todo el proceso. (Ver electroferograma en Anexo 5).

En la Figura 24 se muestra el alineamiento de la secuencia correspondiente al

producto de amplificación de p24 original (secuencia 3) y la secuencia del fragmento

presente en el vector:

RESULTADOS


Página 66

Figura 24. Alineamiento de nucleótidos de secuencia 3 de p24 y secuencia del inserto

4.3.2 Obtención de bacterias de expresión recombinantes

Las tres reacciones de electroporación llevadas a cabo para la transformación de las

bacterias competentes E.coli BL21 (DE3) pLysS con el vector recombinante purificado,

con el vector original y con agua desionizada estéril, respectivamente, presentaron

pulsos de corriente de intensidad y duración adecuadas con constantes de

electroporación comprendidas entre 4 y 5 milisegundos en todos los casos. Una vez

lograda la estabilización de las bacterias por incubación en medio SOC, se procedió a

la selección de las bacterias transformantes en ágar LB con 50 µg/ml de ampicilina y

35 µg/ml de cloranfenicol y se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 4; Figura

25):

i) A partir de la reacción de electroporación llevada a cabo con la mezcla control que

contenía una cantidad conocida de vector original se obtuvo desarrollo de colonias de

E. coli BL21 (DE3) pLysS transformantes en las placas correspondientes a la siembra

pura y a las diluciones 10-1 y 10-2. Esto permitió confirmar que las bacterias

conservaron adecuadamente el estado competente. La eficiencia de transformación

para esta reacción fue de 2,27 x 106 UFC/ µg de ADN.

ii) A partir de la reacción de electroporación realizada con el agua desionizada estéril

no se obtuvo desarrollo. Esto permitió verificar la ausencia de contaminación de las

bacterias competentes y del ágar de selección con cepas resistentes a los antibióticos,

RESULTADOS


Página 67

y también aseguró una adecuada actividad de los antibióticos en el medio de

selección.

iii) La transformación por electroporación con el vector recombinante purificado

permitió la recuperación de colonias bacterianas en el medio de selección con

antibióticos en las placas correspondientes a la siembra pura y a la dilución 10-1. La

eficiencia de transformación para la reacción fue de 2,25 x 105 UFC/µg de ADN.

Tabla 4. Eficiencia de transformación E. coli BL21 (DE3) pLysS

Transformación K

(mseg) Siembra LBa

Recuento

(UFC)

µg ADN

plaqueados

Eficiencia

(UFC/µg ADN)

Eficiencia promedio

(UFC/µg ADN)

Vector

recombinante 4,92

50 µl puros 100 5,8 x 10-4 1,72 x 105

2,25 x 105

100 µl dil 10-1 32 1,15 x 10-3 2,78 x 105

Control vector

orginal 4,90

50 µl puros 1164 5 x 10-4 2,33 x 106

2,27 x 106 100 µl dil 10-1 208 1 x 10-3 2,08 x 106

100 µl dil 10-2 24 1 x 10-3 2,40 x 106

Control Agua 4,88 toda la mtra 0 --- --- ---

K: constante de electroporación

LBa: LB ágar con antibióticos de selección

UFC: unidades formadoras de colonias

Figura 25. Transformación de E. coli BL21 (DE3) pLysS.

Ágar LB con ampicilina 50 µg/ml y cloranfenicol 35 µg/ml.

A. Transformación con vector recombinante puro (50 µl)

B. Transformación con vector recombinante dilución 10-1(100 µl)

C. Control sin vector y control con vector original

RESULTADOS


Página 68

También en este caso fue posible la confirmación de la presencia del inserto en el

vector portado por las bacterias transformantes a través de una PCR-colony (Figura

26).

Figura 26. Amplificación de p24 modificado por PCR-colony. E. coli BL21 (DE3) pLysS.


Calles 1-4 y 6-9: Colonias 1 al 8; Calle 5: Marcador ADN 100 pb.

A partir de una colonia recombinante se conformó un stock de expresión (viales de

bacterias de expresión recombinantes en fase de crecimiento logarítmico) para la

obtención de la proteína de interés.

4.4 Expresión de la p24 recombinante

4.4.1 Piloto de expresión

El cultivo en medio líquido de E. coli BL21 (DE3) pLysS recombinantes generado a

partir del stock de expresión alcanzó la densidad óptica a 550 nm (DO550) necesaria

para la inducción de la expresión proteica a las 3 hs de incubación (T0). Una vez

agregado el inductor, se comprobó la continuidad de la adecuada multiplicación

bacteriana en el cultivo a través de la observación de un aumento progresivo de la

DO550 en las alícuotas tomadas cada una hora durante seis horas (T1 a T6) y over night

(T11=TON) (Tabla 5; Gráfico 1).

RESULTADOS


Página 69

Tabla 5. Multiplicación bacteriana en cultivo de expresión piloto

Tiempo* T-2 T-1 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T11=TON

DO550 0,106 0,271 0,544 0,684 0,708 0,753 0,875 0,994 1,065 1,810

* T: momento de toma de muestra (en horas) pre y post-inducción

Gráfico 1. Multiplicación bacteriana en cultivo de expresión piloto

Posteriormente, por análisis en SDS-PAGE (Figura 27) de los productos de sonicación

de las alícuotas tomadas del cultivo de expresión piloto, se pudo evidenciar la

presencia de una proteína a T0 que sufrió un aumento progresivo en su expresión

luego del agregado del inductor, alcanzando el mayor nivel de expresión luego de la

incubación del cultivo durante toda la noche. Esta proteína presentó un peso molecular

compatible con el esperado para la proteína p24 recombinante (30 KDa).

Con este ensayo también se pudo establecer que la proteína expresada se localizó en

la fracción celular insoluble ya que se la detectó en mayor concentración en los

sedimentos de los sonicados.

Además, quedó demostrado que la proteína exógena no generó toxicidad en el cultivo

ya que éste progresó sin inconvenientes a pesar de que no hubo una restricción

completa de la expresión basal de la misma.

RESULTADOS


Página 70

Figura 27. SDS-PAGE alícuotas sonicadas del cultivo de expresión piloto – Coomassie.

Calle 1: marcador de PM de proteínas precoloreado (2 – 220 KDa)

Calle 2: sonicado completo de alícuota previa a la inducción (T0)

Calles 3, 5, 7 y 9: sobrenadantes de sonicado de alícuotas 2, 4, 6 y 11 hs post inducción (T2, 4, 6 y TON)

Calles 4, 6, 8 y 10: sedimentos de sonicado de alícuotas 2, 4, 6 y 11 hs post inducción (T2, 4, 6 y TON)

4.4.2 Expresión propiamente dicha

En el escalado de la expresión proteica también se produjo una adecuada

multiplicación bacteriana que se puso de manifiesto a través del aumento progresivo

de la DO550 durante todo el desarrollo de cultivo (Tabla 6).

Tabla 6. Multiplicación bacteriana en cultivo de expresión propiamente dicha

Tiempo* T-0,5 T0 T3 T5 T11=TON

DO550 0,292 0,526 0,876 0,927 1,938

* T: momento de toma de muestra (en horas) pre y post-inducción

En el Gráfico 2 se puede observar que en la expresión propiamente dicha se produjo

una dinámica de crecimiento bacteriano similar a la observada en la prueba piloto.

RESULTADOS


Página 71

Gráfico 2. Dinámica de crecimiento bacteriano: expresión piloto y escalado

4.5 Purificación de la proteína recombinante

Cromatografía de afinidad de metales

Dada la ubicación de la proteína recombinante en la fracción celular insoluble de las

bacterias del cultivo de expresión, se inició su purificación por medio de la lisis de las

bacterias en condiciones desnaturalizantes. Con este procedimiento se logró la

solubilización de la proteína de interés.

Con el sobrenadante de la lisis bacteriana desnaturalizante se llevó a cabo la

cromatografía de afinidad de metales que permitió recuperar la proteína recombinante

pura en tres fracciones independientes de 1 ml cada una (eluatos: E1, E2 y E3). (Ver

punto 4.7.1).

4.6 Cuantificación de la proteína purificada

En la reacción de cuantificación de proteínas utilizando el método de Bradford

modificado se verificó la proporcionalidad directa entre la concentración proteica

presente en las diluciones de la curva de calibración y la absorbancia medida a 595

nm (Tablas 7, Gráfico 3). Esto permitió establecer la cantidad de proteína

recombinante que se recuperó en cada uno de los eluatos de la purificación (Tabla 8).

En total se obtuvieron 3,26 mg de proteína recombinante a partir de 200 ml de cultivo.

RESULTADOS


Página 72

Tabla 7. Cuantificación proteínas totales. Método de Bradford modificado.

Curva de calibración.

Material Blanco St1

BSA 0,09 mg/ml

St 2

BSA 0,18 mg/ml

St3

BSA 0,35 mg/ml

St4

BSA 0,70 mg/ml

St5

BSA 1,40 mg/ml

DO 595

(duplicados) 0,463/0,417 0,531/0,489 0,510/0,520 0,594/0,584 0,820/0,829 1,197/1,153

Gráfico 3. Cuantificación de proteínas totales. Método de Bradford modificado.

Curva de calibración: diluciones de BSA 0,09 – 1,40 mg/ml

Tabla 8. Cuantificación proteínas totales: eluatos de cromatografía de afinidad.

Muestra Dilución DO 595 mn Promedio

CC proteica (mg/ml)

E1 1/10 0,562 2,39

E2 1/3 0,567 0,74

E3 Sin diluir 0,504 0,13

4.7 Caracterización de la proteína purificada

4.7.1 Estimación del tamaño y detección del dominio de fusión

En el ensayo de Western Blot (Figura 28) se detectó inmunológicamente (Ac anti 6x

HIS) la presencia de una banda proteica en los sobrenadantes de lisis bacteriana

desnaturalizante correspondientes al momento previo al agregado del inductor de

RESULTADOS


Página 73

expresión (SNCO) y a la cosecha de todo el cultivo (SNLisis), como así también en los

tres eluatos recolectados en la purificación por cromatografía de afinidad, siendo el

primero (E1) el más concentrado. De esta manera se verificó que se expresó y purificó

una proteína fusionada a una cola de histidinas.

Además, la transferencia a la membrana de nitrocelulosa de las bandas proteicas pre-

coloreadas de un marcador de peso molecular de proteínas, permitió verificar también

en este ensayo que la proteína presentó un peso molecular aproximado de 30 KDa,

compatible con el esperado para la proteína de interés.

Figura 28. Caracterización de la proteína recombinante: Western Blot

Anticuerpos: primario anti-cola histidinas; conjugado anti- IgG de ratón-HRP

Sustrato cromogénico: 4 CN

Calles 1, 2 y 3: Eluato 3 (E3), Eluato 2 (E2) y Eluato1 (E1)

Calles 4 y 5: Lavado 2 (W2) y Lavado 1 (W1)

Calle 6: Escurrido (FT)

Calles 7: Sobrenadante de lisis cosecha cultivo expresión (SNLisis)

Calle 8: Sobrenadante lisis cosecha alícuota T0 (SNC0)

Calle 9: Marcador de PM de proteínas pre-coloreado (2 – 220 KDa)

4.7.2 Identificación inmunológica

a) Detección de la cola de histidinas

En el ensayo de puntos sobre nitrocelulosa también fue posible poner de manifiesto la

presencia de la cola de histidinas en la proteína recombinante purificada. Se demostró

RESULTADOS


Página 74

una reacción inmunológica positiva para las dos concentraciones proteicas evaluadas

y con ambas diluciones de conjugado (Figura 29). La presencia del precipitado de

color azul en el dot generado por sensibilización con el anticuerpo marcado con HRP

indicó una adecuada actividad enzimática del conjugado, y el precipitado azul en los

dots generados con el anticuerpo primario indicó un adecuado reconocimiento de este

anticuerpo por parte del anticuerpo secundario (conjugado). Por otro lado, no se

detectó reactividad inespecífica en el dot correspondiente al blanco.

Figura 29. Caracterización de la proteína recombinante: Detección de cola de histidinas


b) Detección específica de la proteína p24

En el ensayo de puntos sobre nitrocelulosa llevado a cabo con el anticuerpo primario

anti p24 también se observó una reacción positiva con todas las concentraciones

proteicas ensayadas y con ambas diluciones del conjugado. (Figura 30). La presencia

del precipitado de color azul en el dot generado por sensibilización con el anticuerpo

marcado con HRP indicó una adecuada actividad enzimática del conjugado, y el

precipitado azul en el dot generado con el anticuerpo primario indicó un adecuado

reconocimiento de este anticuerpo por el anticuerpo secundario (conjugado). Por otro

lado, no se detectó reactividad inespecífica en el dot correspondiente al blanco.

Figura 30. Caracterización de la proteína recombinante: Detección específica de p24


RESULTADOS


Página 75

En ambos ensayos se logró una baja señal de fondo utilizando las siguientes

condiciones optimizadas de lavado:

- Post bloqueo: 3 x 5 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y

2 x 5 minutos con 1X TBS

- Post anti His: 3 x 5 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y


- Post conjugado: 3 x 5 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y


La señal de fondo fue mayor cuando no se utilizó Tritón X-100 en los pasos de lavado

que incluyen TBS-Tween y cuando se realizó un menor número de lavados post

conjugado.

4.8 Evaluación de la reactividad inmunológica

4.8.1 Diseño y optimización del ensayo inmunológico

Para el diseño del ensayo inmunológico de puntos (Dot Blot) se logró optimizar la

concentración de proteína recombinante y la dilución de conjugado que permitieron la

correcta detección de los anticuerpos anti p24 presentes en los plasmas de los

pacientes HIV-1 positivos en la misma dilución de muestra que se utiliza en el ensayo

comercial en línea (LIA) frente al que se compararon los resultados a posteriori.

En la siguiente figura se presentan los resultados de las pruebas de optimización:

A. Plasmas anti p24 positivos en LIA (4+, 2+ y 3+) B. Plasmas negativos: A y B

Figura 31. Optimización del ensayo inmunológico: plasmas anti p24 positivos

Concentración proteína recombinante: 0, 50,100 y 200 ng/dot

Control actividad enzimática: anti Humano conjugado con HRP

RESULTADOS


Página 76

Se realizaron las siguientes observaciones:

a) Los dots para control de actividad enzimática del conjugado presentaron reacción

de color en las tiras correspondientes a todas las muestras y con todas las diluciones

de conjugado evaluadas. Esto demostró la integridad del conjugado.

b) Los dots blanco presentaron en todas las tiras una tenue coloración, que fue

disminuyendo a medida que se aumentó la dilución de conjugado hasta tornarse

prácticamente no detectable.

c) Los dots prueba (p24 recombinante 50, 100 y 200 ng/dot) presentaron la siguiente

reactividad:

- Plasmas con banda p24 positiva en LIA (4+, 3+ y 2+): reacción de color franca para

las tres concentraciones proteicas evaluadas en todas las tiras. La intensidad de

reacción para cada plasma fue proporcional al grado de positividad de las bandas en

el método comercial, es decir que fue proporcional a la concentración de anticuerpos

anti p24 presentes en las muestras.

En las tiras correspondientes a las diluciones 1/500 y 1/1000 de conjugado todas las

concentraciones proteicas presentes en cada tira presentaron una intesidad de

reacción similar, indicando la presencia de un exceso de conjugado. En cambio, para

las diluciones 1/1500 y 1/2000 la intensidad del color desarrollado en los dots positivos

fue proporcional a la concentración proteica en cada dot.

- Plasmas negativos para banda p24 en LIA: reacción de color tenue en todas las tiras

para las tres concentraciones proteicas evaluadas, indicando la presencia de una leve

reactividad inespecífica. La intensidad de color varió de manera inversamente

proporcional a la dilución del conjugado, siendo para cada dilución muy inferior a la

desarrollada en los dots correspondientes a las muestras positivas.

d) Señal de fondo: ausente en todas las tiras. Esto fue indicativo de un adecuado

bloqueo y lavado. Las condiciones optimizadas de los lavados fueron las siguientes:

- Post bloqueo: 3 x 5 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y


- Post muestra: 4 x 5 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y


- Post conjugado: 4 x 10 minutos con 1X TBS + 0,05%Tween-20 + 0,2% Tritón X-100 y


RESULTADOS


Página 77

La señal de fondo fue mayor cuando no se utilizó Tritón X-100 en los pasos de lavado

que incluyen TBS-Tween y cuando se realizaron lavados post conjugado de menor

duración.

En base a estos resultados se seleccionó la combinación de condiciones que generó

la mayor intensidad de señal para las muestras positivas y la menor reactividad

inespecífica con las muestras negativas: sensibilización de la membrana con 100

ng/dot de proteína recombinante y detección con una dilución 1/2000 del conjugado.

4.8.2 Desempeño del ensayo inmunológico

El Dot Blot en las condiciones optimizadas fue capaz de discriminar la presencia y la

ausencia de anticuerpos anti-p24 en muestras de plasma.

Permitió la detección de la presencia de anticuerpos anti p24 en el 100% (30/30) de

las muestras que presentaron banda positiva para p24 (2+ a 4+) en el ensayo

comercial en línea (LIA), no presentando reacción de color franca en ninguna de las 14

muestras cuyas bandas de p24 resultaron negativas en el LIA (10 correspondientes a

pacientes HIV negativos y 4 correspondientes a pacientes HIV positivos) (Figura 32).

Figura 32. Desempeño Dot Blot vs LIA

RESULTADOS


Página 78

Si bien en la mayoría de las muestras positivas la intensidad de color desarrollada en

el dot prueba del ensayo optimizado fue proporcional a la que se observó en el LIA, en

algunas de ellas la intensidad fue un poco menor. Esto podría deberse a que los

anticuerpos presentes en esas muestras posean características de interacción

inmunológica diferentes con la proteína recombinante respecto de la que presentan

con la proteína del LIA.

Tal y como se previó en la optimización del ensayo de puntos, en el caso de las

muestras que no presentaron banda de p24 en el LIA, se observó una tenue

coloración en los dots prueba, aunque de menor intensidad que la observada para las

muestras con bandas clasificadas como positivas en el LIA. Por este motivo, la

coloración inespecífica no constituyó un impedimento para la adecuada evaluación de

la reactividad de las muestras.

Los dots blanco de las tiras de ensayo presentaron una coloración inespecífica

prácticamente imperceptible.

Los controles sin agregado de muestra no presentaron reactividad ni en el dot prueba

ni en el dot blanco, pero sí en el dot control de actividad del conjugado.

4.9 Materiales de referencia

4.9.1 Detección por ELISA de cuarta generación

La proteína recombinante purificada pudo ser detectada por el ELISA comercial de 4ta

generación en todos los plasmas que la contenían (Tabla 9).

En los casos del plasma negativo adicionado con 100 pg/ml (sin liofilizar y liofilizado

reconstituido) y 300 pg/ml, la relación de la DO450/punto de corte fue superior a 1 lo

que permitió clasificar a las muestras como positivas. Sin embargo, en el caso del

plasma negativo con agregado de p24 recombinante en una concentración de 50

pg/ml, si bien la DO450 fue superior a la presentada por el plasma negativo sin

agregado de proteína, la relación DO450 / punto de corte fue inferior a 0,9 por lo que el

resultado debió ser interpretado como negativo.

El límite de detección del método es inferior a 25 pg/ml, pero es posible que la

sensibilidad analítica se haya visto afectada debido a que las características de

interacción entre los anticuerpos anti p24 incluidos en el ensayo (fase sólida y

conjugado) y la proteína recombinante sean diferentes a las que presentan con la

proteína viral natural.

En esta prueba también se pudo verificar que el proceso de liofilización y la

conservación del liofilizado a temperatura ambiente durante una semana no

RESULTADOS


Página 79

provocaron alteraciones en la muestra que impidieran el reconocimiento de la proteína

recombinante.

Tabla 9. Resumen resultados detección p24 recombinante ELISA 4ta generación

Muestra DO450 (promedio) DO450/punto de corte* Interpretación#

Control positivo Ag HIV 1,40 N/A Válido

Control positivo Ac HIV 1,25 N/A Válido

Control negativo 0,11 N/A Válido

PP 3,98 12,84 Positivo

PN 0,11 0,35 Negativo

PN 50 0,26 0,84 Negativo

PN 100 0,37 1,19 Positivo

PN 300 0,81 2,61 Positivo

PNL 100 0,42 1,35 Positivo

* Punto de corte: 0,31

# Positivo >1; Negativo <0,9

N/A: no aplica

PP: plasma HIV positivo;

PN: plasma HIV negativo sin agregado de p24.

PN 50,100 y 300: plasma HIV negativo con agregado de p24 en concentración de 50, 100 y 300 pg/ml.

PNL 100: plasma HIV negativo con agregado de p24 en concentración 100 pg/ml liofilizado y reconstituido

con agua desionizada.

4.9.2 Ensayo de estabilidad

Para evaluar la estabilidad de las muestras no liofilizadas en las distintas condiciones

de conservación, se compararon los resultados obtenidos para cada una de ellas con

los correspondientes a la conservación a -70ºC, considerada como óptima (Tablas 10;

Gráfico 4).

Se observó lo siguiente:

a) La muestra que contenía una concentración de 300 pg/ml de proteína recombinante

fue marcadamente inestable tanto a temperatura ambiente como a 37ºC.

b) La muestra que contenía una concentración de proteína recombinante de 100

pg/ml, se mantuvo estable durante 3 días a temperatura ambiente (25ºC) pero también

presentó una marcada inestabilidad en las otras condiciones evaluadas.

RESULTADOS


Página 80

c) La muestra que contenía una concentración de proteína recombinante de 75 pg/ml

se mantuvo estable durante los 7 días de incubación a temperatura ambiente mientras

que a 37ºC mostró una leve disminución de la estabilidad a los 3 y 7 días de

incubación.

Tabla 10. Resumen resultados ensayo de estabilidad ELISA 4ta generación

Plasma no liofilizado

DO450

Muestra

Temperatura

óptima Temperatura Ambiente (25ºC) 37ºC

-70ºC 3d %Red 7d % Red 3d %Red 7d % Red

PN 0,10 N/D N/A N/D N/A N/D N/A N/D N/A

PN 75 0,20 0,21 0 0,20 0 0,19 5 0,18 10

PN 100 0,43 0,43 0 0,22 48,84 0,18 58,14 0,18 58,14

PN 300 0,91 0,47 48,35 0,46 49,45 0,36 60,44 0,24 73,63

N/D: no determinado

N/A: no aplica

PN: plasma HIV negativo sin agregado de p24.

PN 75,100 y 300: plasma HIV negativo con agregado de p24 en concentración de 75, 100 y 300 pg/ml.

Para evaluar la estabilidad del plasma liofilizado, se comparó su comportamiento

durante la incubación a 37ºC con el observado a temperatura ambiente (25ºC), que se

tomó como temperatura óptima de conservación (Tabla 11, Gráfico 4).

Tabla 11. Resumen resultados ensayo de estabilidad ELISA 4ta generación

Plasma liofilizado

DO450

Muestra

TA (25ºC) 37ºC

7d 3d %Red 7d % Red

PNL 0,11 N/D N/A N/D N/A

PNL 100 0,44 0,44 0 0,40 9,09

N/D: no determinado.

N/A: no aplica.

PNL: plasma HIV negativo sin agregado de p24 liofilizado y reconstituido con agua desionizada.

PNL 100: plasma HIV negativo con agregado de p24 en concentración 100 pg/ml liofilizado y reconstituido

con agua desionizada.

RESULTADOS


Página 81

A. Plasmas no liofilizados B. Plasmas liofilizados

(PN, PN 75, 100 y 300 pg/ml) (PNL, PNL 100 pg/ml)

Gráfico 4. Detección p24 recombinante Elisa 4ta generación:

Efecto condiciones de conservación

Se comprobó que el plasma liofilizado se mantuvo estable durante 3 días a 37ºC,

mostrando una leve disminución de la señal luego de 7 días de incubación a dicha

temperatura.

En este ensayo, al igual que en el de detección, se verificó que la señal obtenida para

el liofilizado con 100 pg/ml de p24 recombinante (PNL 100) mantenido durante 7 días

a temperatura ambiente (temperatura óptima liofilizados) fue similar a la obtenida para

el plasma no liofilizado con 100 pg/ml de p24 recombinante (PN 100) conservado

durante 7 días a -70ºC (temperatura óptima no liofilizados).

A partir de estos resultados se pudo inferir que los plasmas no liofilizados adicionados

con la proteína recombinante se deben conservar a -70ºC, mientras que los liofilizados

podrían mantenerse a temperaturas entre 25 - 37ºC durante una semana sin que se

modifique significativamente su estabilidad.

En este ensayo, al igual que en la prueba de detección, se observó una menor

sensibilidad analítica para la detección de la proteína recombinante que para la

proteína viral natural ya que los resultados obtenidos en la condición de conservación

óptima para la muestra no liofilizada con 75 pg/ml de p24 recombinante fue inferior al

punto de corte.

DISCUSIÓN


Página 82

5. DISCUSIÓN

Las líneas de investigación y desarrollo de la Administración Nacional de Laboratorios

e Institutos de Salud (ANLIS) del Ministerio de Salud de la Nación se encuentran

orientadas a la producción científico-tecnológica que contribuya al mejoramiento de la

Salud Pública. Una de sus áreas de incumbencia es la Producción y Abastecimiento

de Insumos Estratégicos para la Salud. Las actividades relacionadas al área incluyen

la producción de materiales de referencia, la producción y distribución de paneles de

control de calidad, y el diseño y distribución de reactivos de diagnóstico.

En este contexto se emprendió el presente trabajo y, dado que se alcanzaron

exitosamente los objetivos planteados, se espera poder contribuir a la mejora continua

de los laboratorios clínicos y de investigación a través de la producción de materiales

de referencia (estándares, calibradores, controles, y paneles de control de calidad

interno y externo) que puedan ser incluidos en el diseño e implementación de

programas de aseguramiento de la calidad. Además, también se espera contribuir al

desarrollo local de métodos inmunológicos rápidos, sensibles y específicos que

resulten adecuados para su utilización en el diagnóstico y/o en proyectos de

investigación de HIV/SIDA en la región.

Las evaluaciones que se llevaron a cabo en este desarrollo para establecer la

reactividad inmunológica y la aptitud para la producción de materiales de referencia de

la p24 recombinante, constituyen una primera etapa de los estudios que se realizarán

a futuro para establecer si la proteína cumple adecuadamente con los requisitos de las

diversas aplicaciones para las que se propone su utilización.

Con el objeto de preservar a largo plazo el material codificante obtenido y asegurar así

la disponibilidad continua de la proteína recombinante, se clonaron los fragmentos

correspondientes al gen gag y a la p24 en vectores de mantenimiento más estables

que pRSET (datos no mostrados). En una próxima instancia, también se evaluará la

posibilidad de recuperar la proteína en su forma nativa, en el mismo sistema de

expresión o en otro, para poder comparar su desempeño en relación con el de la

proteína desnaturalizada.

En lo que respecta a la producción de materiales de referencia, los resultados

obtenidos de las pruebas piloto indican que la proteína recombinante purificada es

adecuada para este fin. Una vez verificada su reactividad con otros métodos

comerciales de tamizaje y ampliados los estudios de estabilidad, podrá ser utilizada

para la elaboración de paneles de control de calidad interno y externo que podrían ser

implementados en los laboratorios del país como parte de un programa de

aseguramiento de la calidad y para la elaboración de estándares que permitan la

DISCUSIÓN


Página 83

validación de nuevas metodologías. La estabilidad demostrada de las muestras en la

presentación liofilizada garantiza la factibilidad de su distribución en adecuadas

condiciones de conservación en todo el territorio nacional.

Para el desarrollo de métodos inmunológicos rápidos, si bien a través del Dot Blot

utilizado en el trabajo fue posible verificar que la proteína recombinante es capaz de

reconocer los anticuerpos anti p24 presentes en las muestras de los pacientes HIV

positivos, será necesario ampliar la caracterización de su reactividad y re-optimizar las

condiciones de ensayo según el diseño y el propósito del método en cuestión. Ya sea

que se utilice esta proteína individualmente o en conjunto con otros candidatos

moleculares (antígenos y/o anticuerpos), los nuevos estudios deberán incluir:

evaluación de reactividad inmunológica frente a paneles de anticuerpos de distintos

subtipos de HIV-1, frente a paneles con bajo título de anticuerpos anti HIV-1 y frente a

paneles de anticuerpos dirigidos contra otros patógenos (sensibilidad y especificidad

analítica), y también evaluación de la sensibilidad y especificidad clínica, entre otros

parámetros de validación de la metodología. En este sentido, otra investigación que se

encuentra actualmente en desarrollo en nuestro Laboratorio está avocada a la

obtención de otras proteínas recombinantes del HIV-1 para ser utilizadas junto a la p24

en estos diseños.

La concreción de estas propuestas permitirá la ampliación del conocimiento científico

en el tema, la intensificación de la vigilancia epidemiológica y un mayor control de la

diseminación de la infección, contribuyendo así al mejoramiento de la calidad de vida

de la población.

CONCLUSIONES


Página 84

6. CONCLUSIONES

A través de la aplicación de múltiples herramientas de biología molecular, se logró la

obtención de la proteína p24 recombinante del HIV-1 en un sistema procariota para la

expresión de proteínas, siendo el rendimiento general del proceso de 3,26 mg de

proteína a partir de 200 ml de cultivo de expresión.

La identidad de la proteína recombinante obtenida se confirmó con estudios de

caracterización en los que se determinó el peso molecular y la reactividad frente a

anticuerpos específicos anti-p24 de HIV-1.

Por medio del diseño de un ensayo de puntos (Dot Blot), fue posible verificar la

reactividad inmunológica de la proteína recombinante dado que la misma pudo ser

reconocida por los anticuerpos anti-p24 presentes en los plasmas de pacientes que

conviven con el HIV/SIDA.

Se observó una buena correlación entre el ensayo diseñado y el método comercial en

línea (LIA) ya que se pudo clasificar adecuadamente la reactividad de todos los

plasmas frente a p24.

Fue posible establecer la aptitud de la proteína recombinante para la producción de

materiales de referencia dado su adecuado reconocimiento en un método comercial de

diagnóstico de la infección por HIV y su estabilidad en presentaciones liofilizadas.

Se logró estandarizar el protocolo de producción de la proteína en pequeña escala.

Una vez estandarizado el protocolo de producción a mayor escala y ampliados los

estudios de caracterización, la proteína recombinante obtenida se utilizará en diversas

aplicaciones: a) desarrollo local de métodos de diagnóstico e investigación de la

infección por HIV-1, b) elaboración de materiales de referencia para el diseño de

paneles de control de calidad interno y externo de métodos ya implementados, y para

el diseño de paneles de validación/verificación de nuevas metodologías, c) control

positivo de ensayos que incluyan la detección de antígeno p24 de HIV-1, y d) la

producción de anticuerpos anti p24 por inmunización de animales de experimentación.

El presente trabajo permitió ampliar las capacidades del Laboratorio de HIV del

Departamento de Virología del I.N.E.I. en los campos de Investigación y Desarrollo a

través de la incorporación de métodos moleculares asociados al clonado de material

genético y a la producción de proteínas recombinantes. Esto constituye un logro

importante del Sector para la contribución al desarrollo y a la transferencia de

tecnología aplicada en Salud Pública, uno de los pilares de trabajo de la

Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (A.N.L.I.S.).

ANEXOS


Página 85

7. ANEXOS

Anexo 1: Vector de expresión

a) Mapa del vector:

b) Secuencia del sitio de clonado múltiple del pRSET A:

ANEXOS


Página 86

Anexo 2: Escherichia coli BL 21 (DE3) pLys S

Esquema de Regulación de la expresión de proteínas recombinantes:

ANEXOS


Página 87

Anexo 3: Reactivos y Medios de Cultivo

a) Antibióticos

i) Ampicilina sódica

Solución madre: 50 mg/ml en agua desionizada. Esterilizar por filtración con filtro de

0,22 µm de poro. Almacenar a -20ºC.

Concentración final en medio de cultivo: 50 µg/ml.

ii) Cloranfenicol

Solución madre: 35 mg/ml en etanol absoluto. No requiere esterilización. Almacenar a

-20ºC.

Concentración final en medio de cultivo: 35 µg/ml.

b) Medios de cultivo

i) LB ágar: 10 g triptona; 5 g extracto de levadura; 10 g NaCl; 15 g ágar en 950 ml de

agua desionizada y ajustar el pH a 7 con 5N NaOH. Agregar 15 g de ágar. Llevar el

volumen a 1 L y autoclavar.

ii) LB caldo: se prepara de la misma manera que el medio agarizado pero no se le

agrega el ágar.

iii) SOC (para 1 L): Disolver 20 g triptona; 5 g extracto de levadura; 0,5 g NaCl; 186 mg

KCl en 950 ml de agua desionizada y ajustar el pH a 7 con 5N NaOH. Llevar el

volumen a 1 L y autoclavar. Agregar 10 ml de 1M Mg2+ estéril (MgCl2 o MgSO4) y 10 ml

de 50% P/V glucosa.

c) Inductor de expresión

IPTG solución madre: 100 mM. Disolver en agua desionizada y esterilizar por filtración

con filtro de 0,22 µm de poro. Almacenar a -20ºC.

d) Electroforesis

i) Geles de agarosa

- TAE:

Solución madre 50X: disolver 242 g de Tris en 750 ml de agua desionizada.

Agregar cuidadosamente 57,1 ml de ácido acético glacial y 100 ml de 0,5 M

EDTA (pH8). Ajustar el volumen a 1L (pH final 8,5). Almacenar a temperatura

ambiente.

Solución de trabajo 1X: Diluir la solución madre 1/50 en agua desionizada.

Composición final: 40 mM Tris acetato; 1 mM EDTA, pH 8,0.

ANEXOS


Página 88

- Tampón de siembra 10X: 0,2% azul de bromofenol; 0,2% xilen-cianol y 30%

glicerol en Tris-EDTA.

ii) SDS-PAGE

- Acrilamida – Bisacrilamida (29:1):

Solución madre: 29% P/V acrilamida y 1% P/V bisacrilamida.

Preparar la solución en agua desionizada tibia. Verificar pH menor o igual a 7.

Almacenar a TA en frasco oscuro.

- Tris 1,0 M (pH 6,8):

Para 1L: disolver 121,1 g de Tris base en 800 ml de agua desionizada y

agregar HCl concentrado, una vez que alcance TA ajustar pH final. Luego

llevar volumen a 1 L. Alicuotar y autoclavar.

- Tris 1,5 M (pH 8,8):

Para 1L: disolver 181,65 g de Tris base en 800 ml de agua desionizada y

agregar HCl concentrado, una vez que alcance TA ajustar pH final. Luego

llevar volumen a 1 L. Alicuotar y autoclavar.

- SDS solución madre: 10 % P/V

Para 1L: disolver 100 g de SDS en 900 ml de agua desionizada, calentar a

68ºC con agitación magnética. Si es necesario, ajustar el pH a 7,2. Llevar el

volumen a 1 L. No requiere esterilización. NO AUTOCLAVAR. Almacenar a TA.

- Perulfato de amonio solución madre: 10 % P/V

Disolver 0,1 g en 1 ml de agua desionizada. Conservar a 4ºC por un máximo

de 2 semanas.

- Gel de estaqueo: Concentración de mezcla de acrilamida-bisacrilamida: 5%

Composición (Volumen: 8 ml para DOS minigeles)

Agua 5,5 ml

30% mezcla acrilamida 1,3 ml

1 M Tris (pH 6,8) 1,00 ml

10% SDS 0,08ml

10% persulfato de amonio 0,08 ml

TEMED 0,008 ml

- Gel de corrida: Concentración de mezcla de acrilamida-bisacrilamida: 12%

Composición (Volumen 15 ml para DOS minigeles):

Agua 4,9 ml

30% mezcla acrilamida 6,0 ml

ANEXOS


Página 89

1,5 M Tris (pH 8,8) 3,8 ml

10% SDS 0,15 ml

10% persulfato de amonio 0,15 ml

TEMED 0,006 ml

- Solución tampón para siembra de muestras 2X:

100 mM Tris-Cl (pH 6,8); 4% P/V SDS; 0,2% P/V Azul de bromofenol; 20% V/V

glicerol. Agregar 0,1% V/V 2-mercaptoetanol en el momento de uso.

- Solución tampón de corrida: Tris - glicina - SDS

25 mM Tris; 250 mM glicina (grado electroforesis) pH 8,3; 0,1% P/V SDS.

Preparación solución madre 5X:

Disolver 15,1 g de Tris base y 94 g de glicina en 900 ml de agua desionizada.

Agregar 50 ml de solución madre de 10% P/V SDS y ajustar volumen a 1L con

agua desionizada.

- Tinción con azul de Coomassie:

Colorante: Preparar una mezcla de 50 partes de metanol con 40 partes de

agua y luego agregar 10 partes de ác. acético glacial. Disolver 0,25 g de

Coomassie Brilliant Blue R-250 por cada 100 ml de mezcla. Filtrar con papel

Whatman Nº 1. Colorear en agitación durante 2 horas.

Decolorante: Preparar una mezcla de 50 partes de metanol con 40 partes de

agua y luego agregar 10 partes de ác. acético glacial. Agitar toda la noche,

luego renovar el decolorante dos veces y realizar dos enjuagues con agua

destilada.

e) Western Blot

i) Solución tampón de transferencia: Tris - glicina - Metanol

25 mM Tris; 250 mM glicina (grado electroforesis) pH 8,3; 20% V/V Metanol.

ii) TBS 1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 500 mM NaCl.

iii) TBS-Tween-Tritón: 1X TBS; 0,05% V/V Tween-20; 0,2% V/V Titón X-100.

iv) Solución bloqueante y diluyente de anticuerpos: 3% P/V BSA en 1X TBS; 0,1% V/V

Tween-20.

v) Reactivo cromogénico (para 100 ml):

- Disolver 60 mg de 4 cloro naftol (4 CN) en 20 ml de metanol. Proteger de la luz.

ANEXOS


Página 90

- Inmediatamente antes de usar, agregar 60 µl de 30% agua oxigenada pre-enfriada a

0ºC a 100 ml de 1X TBS.

Al momento de revelar mezclar ambas soluciones a temperatura ambiente y utilizar de

inmediato.

f) Dot Blot

i) TBS 1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 500 mM NaCl.

iii) TBS-Tween-Tritón: 1X TBS; 0,05% V/V Tween-20; 0,2% V/V Tritón X-100.

iv) Solución bloqueante: 3% P/V BSA en 1X TBS; 0,1% V/V Tween-20.

v) Diluyente de muestras y de conjugado: 1% P/V BSA en 1X TBS; 0,1% V/V Tween-

20.

vi) Reactivo cromogénico: preparar de la misma forma que para Western Blot.

g) Solución tampón de lisis desnaturalizante: 100 mM NaH2PO4; 10 mM Tris; 8 M

Urea. Ajustar pH a 8.

ANEXOS


Página 91

Anexo 4: Alineamientos

a) Alineamiento de las secuencias nucleotídicas correspondientes al gen gag de

las secuencias de genoma completo de HIV-1 de Argentina y Brasil tomadas de

la base de datos GenBank

A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T A G A T G G G A Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

10 20 30 40 50

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T A C A T G G G A gag ARG DQ1890088-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A C T A G A T G C A T G G G A gag ARG AF332867 -1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A G A T G G G A gag ARG AF385936-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T G A G C G G G G G A G A A T T G G A T A G A T G G G A gag ARG AF408626-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A C G C G G G G G A A A A T T A G A T G A A T G G G A gag ARG AF408627-1.seq

1 A T G G G T G C C A A A G C G T C G G T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T A G A T G G G A gag ARG AF408628 -1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T G G A T A G A T G G G A gag ARG AF408629 -1.seq



1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A T A T A G A T G G G A gag ARG AF408632-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A G A T G G G A gag ARG AY536237 -1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A A A T G G G A gag ARG AY536238 -1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A A T A T T A A G A G G C G A A A A A T T A G A T A A T T G G G A gag ARG AY968312 -1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A A T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T G C A T G G G A gag ARG DQ383754-1.seq

1 A T G G G C G C A A G A G C T T C A T T A T T A A G C G G G G G A A A A T T G G A T A G A T G G G A gag BR DQ085871-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A A T A T T A A G A G G C G G A A A A T T A G A T G C T T G G G A gag BR U52953-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T G C T T G G G A gag BR AF005494-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A A T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A A A T G G G A gag BR AF005495-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G A G G C G A A A A A T T A G A T A C T T G G G A gag BR AF286228-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C G G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A G A T G G G A gag BR AY173956-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A C T A G A T G C A T G G G A gag BR AY173957-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A G C T A G A T G C A T G G G A gag BR AY173958-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A G A T G G G A gag BR AY455778-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A A T A C T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T A A A T G G G A gag BR AY455779-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C G G T A T T A A G C G G G G G A G A A T T A G A T A G G T G G G A gag BR AY455780-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A A T A T T A A G C G G C G G A A A A T T A G A T A G A T G G G A gag BR AY771588-1.seq

1 A T G G G T G C G A G A G C G T C A G T A T T A A G C G G G G G A A A A T T A G A T A A A T G G G A gag BR AY771591-1.seq

1 A T G G T T G C A A A A C C T T C A T T T T T A A - C G G G G G A A A A T T T A A T A A A T G G G A gag BR DQ085867-1.seq

A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A T T A A A A C A T Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

60 70 80 90 100

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

51 A A A G A T T - C G G T T A A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A C T G A A A C A T gag ARG DQ1890088-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A M T G A A A C A T gag ARG AF332867 -1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T G A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A T T A A A A C A T gag ARG AF385936-1.seq

51 G A A A A T T - C G G T T A C G G C C A G G A G G A A A G A A A A A A T A T A G A C T A A A A C A T gag ARG AF408626-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A G T A T A G A A T G A A A C A T gag ARG AF408627-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A A T T A A A A C A T gag ARG AF408628 -1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G A G G A A A G A A A A A A T A T A G A C T A A A A C A T gag ARG AF408629 -1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A C G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A T T A A A A C A T gag ARG AF408630 -1.seq

51 G A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A A T T A A A A C A T gag ARG AF408631 -1.seq

51 A A G A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A C T T A A A A C A T gag ARG AF408632-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T G A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A T T A A A A C A T gag ARG AY536237 -1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A A T T A A A A C A T gag ARG AY536238 -1.seq

51 A A G A A T T - A A G T T A A G A C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G G A T G A A A C A C gag ARG AY968312 -1.seq

51 A A A A A T T - C G G C T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A G A T A T A G A T T A A A G C A T gag ARG DQ383754-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A T T T A A A A C T T gag BR DQ085871-1.seq

51 A A G A A T T - A A G T T A A A G C C A G G G G G A A A G A A A C A C T A T A T G A T G A A A C A C gag BR U52953-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A C T A A A A C A T gag BR AF005494-1.seq

51 A A A A A T T - A G G T T A A G G C C A G G A G G A C A T A A A A A A T A T A G A T T A A A A C A T gag BR AF005495-1.seq

51 A A G A A T T - A G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A C G C T A T A T G A T G A A A C A C gag BR AF286228-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G G T T A A A A C A T gag BR AY173956-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T G A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A A T A T A G A T T G A A G C A T gag BR AY173957-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T G A G G C C G G G G G G A A A G A A A A A A T A T T G C T T G A A G C A T gag BR AY173958-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A G A T A T A G A T T A A A A C A T gag BR AY455778-1.seq

51 A A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A C A A T A T A A A T T A A A A C A T gag BR AY455779-1.seq

51 G A A A A T T - C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A G A T A T A A A T T A A A A C A T gag BR AY455780-1.seq

51 A A A A A T T - C G A T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A A T T A A A A C A T gag BR AY771588-1.seq

51 A A G A A T T - C G G T T A C G G C C A G G A G G A A A G A A A A A A T A T A A G T T A A A A C A T gag BR AY771591-1.seq

50 A A A A A T T T C G G T T A A G G C C A G G G G G A A A G A A A A A A T A T A A A T T A A A A C A T gag BR DQ085867-1.seq

A T A G T A T G G G C A A G C A G G G - A G C T A G A A C G A T T C G C A G T T A A T C C T G G C C Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

110 120 130 140 150

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T T T T A G A A A C A T C A G A A G G C T G T A G A C A A A T A A T A G G A C A G C T A C A A C C A Majority

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160 170 180 190 200

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ANEXOS


Página 92

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T C C C T T C A G A C A G G A T C A G A A G A G C T T A G A T C A T T A T A T A A T A C A G T A G C Majority

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210 220 230 240 250

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A G T C C T C T A T T G T G T A C A T C A A A A G A T A G A G G T A A A A G A C A C C A A G G A A G Majority

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310 320 330 340 350

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299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A C C A A A A T A A A A G T C A G C A A A A G A G A C A G gag ARG DQ1890088-1.seq

299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A A A C A G gag ARG AF332867 -1.seq

299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A A A C A C A G gag ARG AF385936-1.seq

299 C T T T A G A C A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G C A A A G A G C A C A G gag ARG AF408626-1.seq

299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A C A C A G gag ARG AF408627-1.seq

299 C T T T A G A G A A A C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G G C A C A G gag ARG AF408628 -1.seq

299 C T T T A G A T A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A C A C A G gag ARG AF408629 -1.seq

299 C T T T A G A T A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G G C A C A G gag ARG AF408630 -1.seq

299 C C T T A G A T A A G T T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A C A C A G gag ARG AF408631 -1.seq

299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A C A C A G gag ARG AF408632-1.seq

299 C T T T A G A G A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A A G C A C A G gag ARG AY536237 -1.seq

299 C T T T A G A C A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A G A A A A G T C A G C A A A A G A T A C A G gag ARG AY536238 -1.seq

299 C C T T A G A C A A A A T A A A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A - - - - - - - - - gag ARG AY968312 -1.seq

299 C T T T A G A A A A G A T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A G G C A C A G gag ARG DQ383754-1.seq

299 C T T T A G A C A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A A G C A C A G gag BR DQ085871-1.seq

299 C C T T A G A C A A A A T A A A G G A A G A A C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A A A C A C A G gag BR U52953-1.seq

299 C T T T A G A G A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A G G T C G G C A A A A G A C A C A G gag BR AF005494-1.seq

300 C T T T A G A A A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A - G T A A G A A A A A G G C A C A G gag BR AF005495-1.seq

299 C C T T A G A C A A A G T A A A G G A A G A A C A A A G C A A A A G T C A G C A A G A A A C A C A G gag BR AF286228-1.seq

299 C T T T A G A G A A G G T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A A G C A C A G gag BR AY173956-1.seq

299 C T T T A G A C A A G C T A G A G G A A G A A C A A A A C A A A A A T C A G C A A A A G A C A A A G gag BR AY173957-1.seq

299 C T T T A G A C A A G C T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T C A G C A A A A G A C A A A G gag BR AY173958-1.seq

299 C T T T A G A G A G G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A A G C A C A G gag BR AY455778-1.seq

299 C T T T A G A C A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A G G C A C A G gag BR AY455779-1.seq

299 C T T T A G A G A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G C A A A A A G C A C A G gag BR AY455780-1.seq

299 C C T T A G A T A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A C A A A G G C A C A G gag BR AY771588-1.seq

ANEXOS


Página 93

299 C T T T A G A A A A A A T A G A G G A G G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A G G C A C A G gag BR AY771591-1.seq

299 C T T T A G A G A A G A T A G A G G A A G A G C A A A A C A A A A G T A A G A A A A A G G C A C A G gag BR DQ085867-1.seq

- - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G A C A - - - - A A - - - - - - - - - A Majority

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360 370 380 390 400

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG DQ1890088-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C C A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF332867 -1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF385936-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C - - - T G G C A C A G G A A A C A - - - - - - G gag ARG AF408626-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF408627-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G A C A - - - - - - - - - - - - - - - - gag ARG AF408628 -1.seq

349 C A - - - A A A G A C G C A G C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF408629 -1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF408630 -1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G A C A - - - - - - - - - - - - - - - - gag ARG AF408631 -1.seq

349 C A G C A A A A G A C A C A G C A A G C G G C A G C - - - T G C T G - - - - - - - - - - - - - - - A gag ARG AF408632-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G A A G C - - - T G G C A C A G G A A A C A - - - - - - G gag ARG AY536237 -1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G A C A C A G G G G C C A G T C A A A A gag ARG AY536238 -1.seq

340 - - - - - - - - - - - - - - - - - - G C A G A A G C G G C T G G C A - - - - A A - - - - - - - - - - gag ARG AY968312 -1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C - - - T G A C A C A G G A A G T A - - - - - - G gag ARG DQ383754-1.seq

349 C A A G C A - - - - C A G C A - - A G C G G C A G C - - - T A A C A C A G G A A G T A - - - - - - G gag BR DQ085871-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A G G C A G A A G C G G C T G A C A - - - - A A - - - - - - - - - - gag BR U52953-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G A C T G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag BR AF005494-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C - - - T A A C A C A G G A A A C A - - - - - - A gag BR AF005495-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A G G C A G A A G C G G C T G A C A - - - - A A - - - - - - - - - - gag BR AF286228-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C A G C T G A C G C A G G A A C C A - - - - - - G gag BR AY173956-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag BR AY173957-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C G G C A G C - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - A gag BR AY173958-1.seq

349 C A A G C A A - - - C A G C A C A A G C A G C G G C - - - T G G C A C A G G A A A C A - - - - - - G gag BR AY455778-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C - - - T G A C A C A G G A A A - - - - - - - - - gag BR AY455779-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G C - - - T G C C A C A G G A A G T A - - - - - - G gag BR AY455780-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A A C - - - T G A C A C A G G A A A C A - - - - - - A gag BR AY771588-1.seq

349 - - - - - - - - - - - - - - - C A A G C A G C A G G - - - T G G C A C A G G A A A C A - - - - - - A gag BR AY771591-1.seq

349 C A A G C A - - - - - - - - - - - - - - - A A G G C - - - T G A C A C A G G A A A - - - - - - - - - gag BR DQ085867-1.seq

C A G A G A G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G G C A A A Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

410 420 430 440 450

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

363 C A C A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T G T A G T A C A G A A T C C T C A G G G A C A A A gag ARG DQ1890088-1.seq

363 C A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF332867 -1.seq

363 C A A A G G G G T C A G T C A G A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF385936-1.seq

375 C A G C C A G G C C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C A T C C A G G G G C A A A gag ARG AF408626-1.seq

363 C A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T G T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF408627-1.seq

365 - - A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF408628 -1.seq



365 - - A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF408631 -1.seq

381 C A A A G G G G T C A A T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AF408632-1.seq

375 C A G C C A G G C C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C A T T C A G G G A C A A A gag ARG AY536237 -1.seq

381 C A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag ARG AY536238 -1.seq

358 - G G A A A T G T C A G T C A A A A T T A T C C T A T A G T G C A G A A T C T C C A A G G G C A A A gag ARG AY968312 -1.seq

375 C A G T C A A G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C A T G C A G G G G C A A A gag ARG DQ383754-1.seq

384 C A G C C A A G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A A A A T C T T C A G G G G C A A A gag BR DQ085871-1.seq

370 - G G A A A G G T C A G T C A A A A T T A T C C T A T A G T A C A G A A T C T C C A A G G G C A A A gag BR U52953-1.seq

363 A A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag BR AF005494-1.seq

375 C A G C C A G G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C C T T C A G G G G C A A A gag BR AF005495-1.seq

370 - G G A A A G G T C A G T C G A A A T T A T C C T A T A G T G C A G A A T C T C C A A G G G C A A A gag BR AF286228-1.seq

378 C A G C C A G G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C A T G C A G G G G C A A A gag BR AY173956-1.seq

363 C A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag BR AY173957-1.seq

363 C A A A G G G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A gag BR AY173958-1.seq

387 C A G T C A G G T C A G C C A A A A C T A C C C T A T A G T G C A G A A C C T G C A G G G G C A A A gag BR AY455778-1.seq

372 C A G C C A G G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A A A A C C T C C A G G G G C A A A gag BR AY455779-1.seq

375 C A G C C A G G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C A T C C A A G G G C A A A gag BR AY455780-1.seq

375 C A G T C A G G T C A G T C A A A A T T A C C C T A T A G T A C A G A A C C T C C A G G G G C A A A gag BR AY771588-1.seq

375 C A G C C C G G T G A G C C A A A A T T T C C C T A T A G T G C A G A A T C T T C A G G G G C A A A gag BR AY771591-1.seq

372 C A G C C A G G T C A G C C A A A A T T A C C C T A T A G T G C A G A A C C T A C A G G G G C A A A gag BR DQ085867-1.seq

T G G T A C A T C A G G C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G Majority

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460 470 480 490 500

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

413 T G G T A T A C C A G T C C T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T G A A G G T G gag ARG DQ1890088-1.seq

413 T G G T A C A C C A G T C T T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF332867 -1.seq

413 T G G T A C A C C A G C C T T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C C T G G G T A A A G G T G gag ARG AF385936-1.seq

425 T G G T A C A T C A G G C A A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag ARG AF408626-1.seq

413 T G G T A T A C C A G T C T C T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G C G gag ARG AF408627-1.seq

413 T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF408628 -1.seq

425 T G G T A C A T C A G T C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF408629 -1.seq

413 T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C T A A A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF408630 -1.seq

413 T G G T A C A C C A G C C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF408631 -1.seq

431 T G A C A C A C C A G C C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AF408632-1.seq

425 T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AY536237 -1.seq

431 T G G T A C A T C A G T C T C T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG AY536238 -1.seq

407 T G G T A C A C C A G C C C A T A T C A G C T A G A A C T T T G A A T G C A T G G G T A A A G G T A gag ARG AY968312 -1.seq

425 T G G T A C A T C A G C C C C T A T C A C C T A G A A C A T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag ARG DQ383754-1.seq

434 T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C G A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR DQ085871-1.seq

419 T G G T A C A C C A G C C C A T A T C A G C T A G A A C T T T G A A T G C G T G G G T A A A G G T A gag BR U52953-1.seq

413 T G G T A C A C C A G T C T T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR AF005494-1.seq

425 T G G T A C A C C A G G C C A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag BR AF005495-1.seq

419 T G G T A C A C C A G C C C A T G T C A G C T A G A A C T T T G A A T G C G T G G G T A A A G G T A gag BR AF286228-1.seq

428 T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T G gag BR AY173956-1.seq

413 T G G T A C A T C A G T C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR AY173957-1.seq

413 T G G T A C A T C A A T C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR AY173958-1.seq

437 T G G T A C A T C A G C C C T T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR AY455778-1.seq

422 T G G T A C A T C A G G C C C T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag BR AY455779-1.seq

425 T G G T A C A T C A G G C T A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G gag BR AY455780-1.seq

425 T G G T A C A T C A A G C C A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag BR AY771588-1.seq

425 T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag BR AY771591-1.seq

422 T G G T A C A T C A G G C C C T A T C A C C T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A gag BR DQ085867-1.seq

G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T Majority

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510 520 530 540 550

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

463 G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag ARG DQ1890088-1.seq

463 G T G G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag ARG AF332867 -1.seq

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475 A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag ARG AF408629 -1.seq

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481 A T A G A A G A G A A G G C T T T T A C C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag ARG AF408632-1.seq

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481 A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag ARG AY536238 -1.seq

457 G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T gag ARG AY968312 -1.seq

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484 G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A C T gag BR DQ085871-1.seq

ANEXOS


Página 94

469 G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T gag BR U52953-1.seq

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469 G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T gag BR AF286228-1.seq

478 A T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T gag BR AY173956-1.seq

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A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G Majority

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560 570 580 590 600

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531 A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G gag ARG AF408632-1.seq

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G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A Majority

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610 620 630 640 650

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569 G G G G A C A C C A A G C A G C C A T G C A A A T G T T A A A A G A T A C C A T C A A T G A G G A G gag BR U52953-1.seq

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G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C Majority

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660 670 680 690 700

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613 G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C A T C C A G C G C A T G C A G G G C C T A T C C C A C C gag ARG DQ1890088-1.seq

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613 G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C A T C C A G T G C A G G C A G G A C C T A T T C C A C C gag ARG AF408627-1.seq

613 G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C gag ARG AF408628 -1.seq

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631 G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T T C C A C C gag ARG AF408632-1.seq

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631 G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C A T C C A G T G C A G G C A G G A C C T A T C C C A C C gag ARG AY536238 -1.seq

607 G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C A T C C A G T A C A T G C A G G G C C T G T C G C A C C gag ARG AY968312 -1.seq

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634 G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C G C C gag BR DQ085871-1.seq

619 G C T G C A G A A T G G G A T A G A T T A C A T C C A G T G C A T G C A G G G C C T G T C G C A C C gag BR U52953-1.seq

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619 G C T G C A G A A T G G G A T A G A T T A C A T C C A G T G C A G G C A G G G C C T A T C G C A C C gag BR AF286228-1.seq

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622 G C T G C A G A A T G G G A C A G A A T A C A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A A C C C A C C gag BR DQ085867-1.seq

A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A Majority

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710 720 730 740 750

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663 C G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG DQ1890088-1.seq

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663 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AF385936-1.seq


ANEXOS


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663 A G G C C A G A T T A G G G A A C C T A G G G G G A G T G A T A T A G C T G G A C C T A C T A G T T gag ARG AF408627-1.seq

663 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AF408628 -1.seq

675 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AF408629 -1.seq

663 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A C A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AF408630 -1.seq

663 A G G C C A G A T A A G G G A A C C G A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AF408631 -1.seq


675 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C C A C T A G T A gag ARG AY536237 -1.seq

681 A G G A C A G A T A A G G G A A C C A A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag ARG AY536238 -1.seq

657 A G G C C A A A T G A G A G A A C C A A G G G G A A G T G A C A T A G C A G G A A C T A C C A G T A gag ARG AY968312 -1.seq

675 G G G T C A G A T A A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C G G G A A C T A C T A G T A gag ARG DQ383754-1.seq

684 A G G C C A A A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C G G G A A C T A C T A G T A gag BR DQ085871-1.seq

669 A G G C C A A A T G A G A G A A C C A A G G G G A A G T G A C A T A G C A G G A A C T A C C A G T A gag BR U52953-1.seq

663 A G G T C A G A T A A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag BR AF005494-1.seq

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669 A G G C C A G A T A A G A G A A C C A A G G G G A A G T G A C A T A G C A G G A A C T A C C A G T A gag BR AF286228-1.seq

678 A G G C C A A A T G A G A G A A C C A A G G G G A A G T G A C A T A G C A G G A A C T A C T A G T A gag BR AY173956-1.seq

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687 A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag BR AY455778-1.seq

672 A G G T C A G A T G A G G G A A C C T A G A G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag BR AY455779-1.seq

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672 A G G T C A G A T G A G G G A A C C T A G G G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A gag BR DQ085867-1.seq

C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G Majority

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760 770 780 790 800

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713 C T C C T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag ARG DQ1890088-1.seq

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713 C C C C T C A G G A C C A A G T A C A A T G G A T G A C A A G C C A C C C A C C T G T C C A A G T G gag ARG AF408627-1.seq



713 A C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag ARG AF408630 -1.seq



725 C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag ARG AY536237 -1.seq

731 C C C T T G C G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C G G T C C C A G T G gag ARG AY536238 -1.seq

707 C C C T T C A G G A A C A A A T A G C A T G G A T G A C A A G T A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag ARG AY968312 -1.seq

725 C C C T G C A G G A A C A G A T A C A G T G G A T G A C A A A C A A C C C A C C T A T C C C A G T G gag ARG DQ383754-1.seq

734 C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR DQ085871-1.seq

719 C C C T T C A G G A A C A A A T A A C A T G G A T G A C A A A T A A C C C A C C T G T C C C A G T A gag BR U52953-1.seq

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725 C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR AF005495-1.seq

719 C C C T T C A G G A A C A A A T A G C A T G G A T G A C A A A T A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR AF286228-1.seq

728 C C C T T C A G G A A C A A A T A G G A T G G A T G A C A A A T A A T C C A C C T A T C C C A G T A gag BR AY173956-1.seq

713 C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR AY173957-1.seq


737 A C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR AY455778-1.seq

722 C C C T T C A G G A G C A A A T A C A A T G G A T G A C A G G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR AY455779-1.seq


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722 C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G gag BR DQ085867-1.seq

G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

810 820 830 840 850

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

763 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG DQ1890088-1.seq

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775 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408626-1.seq

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763 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408628 -1.seq

775 G G A G A C A T T T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G G T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408629 -1.seq

763 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408630 -1.seq

763 G G A G A G A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408631 -1.seq

781 G G A G A C A T T T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AF408632-1.seq

775 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AY536237 -1.seq

781 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AY536238 -1.seq

757 G G A G A C A T C T A T A A A A G A T G G A T A A T T C T G G G G T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG AY968312 -1.seq

775 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T T A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag ARG DQ383754-1.seq

784 G G A G A C A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR DQ085871-1.seq

769 G G A G A C A T C T A T A A A A G A T G G A T A A T T C T G G G G T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR U52953-1.seq

763 G G A G A A A T G T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AF005494-1.seq

775 G G A G A A A T T T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AF005495-1.seq

769 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T A A T T C T G G G G T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AF286228-1.seq

778 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T A A T C C T G G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AY173956-1.seq

763 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AY173957-1.seq

763 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T T C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR AY173958-1.seq



775 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A G A T A G T A A G gag BR AY455780-1.seq



772 G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G gag BR DQ085867-1.seq

A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

860 870 880 890 900

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

813 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A A G C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG DQ1890088-1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF332867 -1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF385936-1.seq

825 A A T G T T T A G C C C T G T T A G C A T T C T A G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408626-1.seq

813 A A T G T T T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408627-1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T T G G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408628 -1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G A C C A A A G G A A C gag ARG AF408629 -1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G G C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408630 -1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T A C T A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408631 -1.seq

831 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AF408632-1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A A A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AY536237 -1.seq

831 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A T A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG AY536238 -1.seq

807 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T C T G G A C A T A A A A C A A G G G C C A A A G G A A C gag ARG AY968312 -1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag ARG DQ383754-1.seq

834 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T T T G G A C A T A A A A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR DQ085871-1.seq

819 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A A A C A A G G G C C A A A G G A A C gag BR U52953-1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T C G G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR AF005494-1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T C T G G G C A T A A G A C A A G G A C C A A A G G A A C gag BR AF005495-1.seq

819 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T T T G G A C A T A A A A C A A G G A C C A A A G G A A C gag BR AF286228-1.seq

828 G A T G T A T A G C C C T A T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G A C C A A A G G A A C gag BR AY173956-1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A G G A G C gag BR AY173957-1.seq

813 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A G G A G C gag BR AY173958-1.seq

837 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR AY455778-1.seq

822 A A T G T A T A G C C C T G T C A A C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR AY455779-1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR AY455780-1.seq

825 A A T G T A T A G C C C T A C C A G C A T T C T G G A C A T A A A A C A A G G A C C A A A G G A A C gag BR AY771588-1.seq

ANEXOS


Página 96

825 A A T G T A T A G T C C T A C C A G C A T T C T A G A C A T A A G A C A A G G A C C A A A G G A A C gag BR AY771591-1.seq

822 A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T T T G G A C A T A C G A C A A G G G C C A A A A G A A C gag BR DQ085867-1.seq

C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A Majority

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910 920 930 940 950

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863 C T T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A G C C C T A A G A G C T G A A C A G gag ARG DQ1890088-1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T G G A C A G G T T C T T T A A A A C C T T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF332867 -1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF385936-1.seq


863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A G T T C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF408627-1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF408628 -1.seq

875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF408629 -1.seq

863 C T T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF408630 -1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C T C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AF408631 -1.seq


875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AY536237 -1.seq

881 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag ARG AY536238 -1.seq

857 C C T T T C G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C T T T A A G A G C A G A A C A A gag ARG AY968312 -1.seq

875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C T T T A A G A G C A G A A C A A gag ARG DQ383754-1.seq

884 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag BR DQ085871-1.seq

869 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C C G G T T C T T T A A A A C T C T A A G A G C A G A G C A A gag BR U52953-1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag BR AF005494-1.seq

875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A T C G A T T T T A T A A A A C T C T A A G A G C A G A G C A A gag BR AF005495-1.seq

869 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C C G G T T C T T T A A A A C T T T A A G A G C A G A A C A A gag BR AF286228-1.seq

878 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C C G G T T C T A T A A A A C T C T A A G A G C C G A G C A G gag BR AY173956-1.seq

863 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag BR AY173957-1.seq


887 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T C A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A gag BR AY455778-1.seq

872 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G G T T C T T T A A A G T C C T A A G A G C C G A G C A A gag BR AY455779-1.seq


875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C C G G T T C T A T A A A A C T C T A A G A G C A G A G C A A gag BR AY771588-1.seq

875 C C T T T A G A G A C T A T G T A G A T C G G T T C T A T A A A A C T C T A A G A G C A G A G C A A gag BR AY771591-1.seq

872 C T T T T A G A G A C T A T G T G G A C A G G T T C T T T A A A A C T C T A A G A G C A G A G C A A gag BR DQ085867-1.seq

G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

960 970 980 990 1000

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

913 G C T A C A C A G G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG DQ1890088-1.seq

913 G C T W C A C A G G A T G T A A A G A A T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF332867 -1.seq

913 G C T A C A C A G G A A G T A A A G A A T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF385936-1.seq

925 G C T A C A C A G G A R G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408626-1.seq

913 G C T T C A C G G G A A G T A A A G A A T T G G A T G A C A G A C A C C T T A T T G G T C C A A A A gag ARG AF408627-1.seq

913 G C T T C A C A G G A A G A A A G G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408628 -1.seq

925 G C T T C A C A G G A A G T A A A A G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408629 -1.seq

913 G C T A C A C A G G A A G T A A A A G G G T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408630 -1.seq

913 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G G T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408631 -1.seq

931 G C T A C A C A G G A G G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A C A C T T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AF408632-1.seq

925 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G A T C C A A A A gag ARG AY536237 -1.seq

931 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A A A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AY536238 -1.seq

907 G C T A C C C A A G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A T A C C T T G T T G G T C C A A A A gag ARG AY968312 -1.seq

925 G C T A C C C A A G A G G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A A A C C T T G T T A G T C C A A A A gag ARG DQ383754-1.seq

934 T G T A C A C A G G A A G T A A A A G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR DQ085871-1.seq

919 G C T A C C C A A G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A T A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR U52953-1.seq

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919 G C T A C C C A A G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A T A C C T T G T T A G T C C A A A A gag BR AF286228-1.seq

928 G C T T C A C A G G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A A A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY173956-1.seq

913 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY173957-1.seq

913 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY173958-1.seq

937 T G T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY455778-1.seq

922 G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G C T G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY455779-1.seq

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925 G C T T C A C A G G A T G T A A A A A A T T G G A T G A C A G A A A C T T T G T T G G T C C A A A A gag BR AY771591-1.seq

922 T G T A C A C A G G A A G T A A A G A A T T G G A T G A C A G A A T C C T T A T T G G T C C A A A A gag BR DQ085867-1.seq

T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1010 1020 1030 1040 1050

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G G A T T G G G A T C A G G G G C T A gag ARG DQ1890088-1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF332867 -1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A T C A G G G G C T A gag ARG AF385936-1.seq

975 T G C A A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF408626-1.seq

963 T G C A A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C G G G G G C T A gag ARG AF408627-1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T A G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF408628 -1.seq

975 T G C G A A C C C A G A C T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF408629 -1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T A T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF408630 -1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A G A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AF408631 -1.seq

981 T G C A A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G C A G C C A gag ARG AF408632-1.seq

975 T G C A A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A C T G G G A C C A G G G G C T A gag ARG AY536237 -1.seq

981 T G C G A A C C C A G A T T G T A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G C G G C T T gag ARG AY536238 -1.seq

957 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A G A G C A T T A G G G C C A G G G G C T A gag ARG AY968312 -1.seq

975 T G C A A A T C C A G A C T G T A A G A C C A T C T T A A G A G C A T T A G G G C C A G G G G C T A gag ARG DQ383754-1.seq

984 T G C G A A C C C A G A T T G T A G G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G G C C A G G G T C T A gag BR DQ085871-1.seq

969 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A G A G C A T T A G G G C C A G G G G C T T gag BR U52953-1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag BR AF005494-1.seq

975 T G C G A A C C C A G A T T G C A A A A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G C A G C T A gag BR AF005495-1.seq

969 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T C T A A G A G C A T T A G G G C C A G G G G C T T gag BR AF286228-1.seq

978 T G C R A A C C C A G A T T G T A A G A C T A T T T T A A A A G C A T T A G G A C C A G C A G C T A gag BR AY173956-1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag BR AY173957-1.seq

963 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag BR AY173958-1.seq

987 T G C R A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T C T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag BR AY455778-1.seq

972 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A A C A G G G G C T A gag BR AY455779-1.seq

975 T G C A A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A gag BR AY455780-1.seq

975 T T C A A A T C C A G A T T G T A A G A C T A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G A G C T A gag BR AY771588-1.seq

975 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T A G G A C C A G C A G C T A gag BR AY771591-1.seq

972 T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C A T T T T A A A A G C A T T G G G G C C A G C G G C T A gag BR DQ085867-1.seq

C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1060 1070 1080 1090 1100

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T A G C C A T gag ARG DQ1890088-1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF332867 -1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF385936-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G G C C T A G C C A T gag ARG AF408626-1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T A G C C A T gag ARG AF408627-1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T A G C C A T gag ARG AF408628 -1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A A G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF408629 -1.seq

1013 C G C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF408630 -1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF408631 -1.seq

1031 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AF408632-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G G C C T A G C C A T gag ARG AY536237 -1.seq

1031 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag ARG AY536238 -1.seq

1007 C A A T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A C gag ARG AY968312 -1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A A G G A G T G G G A G G A C C C G G C C A T gag ARG DQ383754-1.seq

1034 C A T T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C G A G T C A T gag BR DQ085871-1.seq

ANEXOS


Página 97

1019 C A T T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A C gag BR U52953-1.seq

1013 C A C T A G A G G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T A G C C A T gag BR AF005494-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G G G G A C C C G G C C A T gag BR AF005495-1.seq

1019 C A T T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A C gag BR AF286228-1.seq

1028 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C C G G T C A T gag BR AY173956-1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag BR AY173957-1.seq

1013 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag BR AY173958-1.seq

1037 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T A G C C A T gag BR AY455778-1.seq

1022 C A T T A G A A G A A A T G A T G T C A G C A T G T C A G G G A G T A G G A G G G C C T A G C C A T gag BR AY455779-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G G G G G C C T G G C C A T gag BR AY455780-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G G G G A C C C G G C C A T gag BR AY771588-1.seq

1025 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G G G G A C C C A G C C A T gag BR AY771591-1.seq

1022 C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T gag BR DQ085867-1.seq

A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - - - - A C Majority

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1110 1120 1130 1140 1150

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A G T - - - - - - A C gag ARG DQ1890088-1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A G T - - - - - - A C gag ARG AF332867 -1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A A G C A A T G A G C C A A G C A A C A A G T - - - - - - A C gag ARG AF385936-1.seq

1075 A A G G C A A G A A T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A G G T - - - - - - G C gag ARG AF408626-1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A G T - - - - - - A C gag ARG AF408627-1.seq

1063 A A G G C A A G A A T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - - - - A C gag ARG AF408628 -1.seq

1075 A A G G C A A G G G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - A C gag ARG AF408629 -1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - - - - A C gag ARG AF408630 -1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A C T A A C A A G T - - - - - - A C gag ARG AF408631 -1.seq

1081 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A C G T A A C A A A T - - - - - - A C gag ARG AF408632-1.seq

1075 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - A C gag ARG AY536237 -1.seq

1081 A A G G C A A G A G T C T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - - - - G C gag ARG AY536238 -1.seq

1057 A A A G C A A G A G T G T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A A C A A T - - - - - - A C gag ARG AY968312 -1.seq

1075 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - G C gag ARG DQ383754-1.seq

1084 A A G G C A A G A A T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A G G T - - - - - - G C gag BR DQ085871-1.seq

1069 A A A G C A A G A G T G T T G G C T G A G G C A A T G A G C A A A G T A A A C A A T - - - - - - A C gag BR U52953-1.seq

1063 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - A C gag BR AF005494-1.seq

1075 A A A G C A A G A G T T T T G G C A G A A G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - T C A G G gag BR AF005495-1.seq

1069 A A A G C A A G A G T G T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A A C A A T - - - - - - A C gag BR AF286228-1.seq

1078 A A A G C A A G R G T T T T G G C G G A A G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T A G T T C A G C gag BR AY173956-1.seq

1063 A A G G C G A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - G C gag BR AY173957-1.seq

1063 A A G G C G A G G G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - G C gag BR AY173958-1.seq

1087 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A G T - - - - - - A C gag BR AY455778-1.seq

1072 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C A A C A A A T - - - - - - G C gag BR AY455779-1.seq

1075 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G C C A C A A A T - - - - - - C C gag BR AY455780-1.seq

1075 A A A G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A - - - A A T - - - G C A G C gag BR AY771588-1.seq

1075 A A A G C A A G A A T T T T G G C T G A A G C A A T G A G C C A A G T A A C A A A T - - - C C A T C gag BR AY771591-1.seq

1072 A A G G C A A G A G T T T T G G C T G A G G C A A T G A G C C A A G T A A C A A G T - - - - - - A C gag BR DQ085867-1.seq

A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A A T T G T T A Majority

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1160 1170 1180 1190 1200

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1107 A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G C A A T T T T A A G G G C C A G A A A A G G A T A G T T A gag ARG DQ1890088-1.seq

1107 A W C T G T A C T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A A T T G T T A gag ARG AF332867 -1.seq

1107 A G C T G T A C T G A T G C A G A A A A G T A G C T T T A A T G G C C A A A G A A G A A T T G T T A gag ARG AF385936-1.seq

1119 A G C T G T A A T G A T G C A G A G A A A T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A A A A T T G T T A gag ARG AF408626-1.seq

1107 A G C T G T A C T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A A T T G T T A gag ARG AF408627-1.seq

1107 A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A A A A T T G T T A gag ARG AF408628 -1.seq

1119 A G C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A A T T G T T A gag ARG AF408629 -1.seq

1107 A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C C A A G A A G A A T T A T T A gag ARG AF408630 -1.seq

1107 A A A T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T C A G G G C C A A A G A A A A A T T G T T A gag ARG AF408631 -1.seq

1125 A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C C A A G A A G A A C T G T T A gag ARG AF408632-1.seq

1119 A G C T G T A A T G A T G C A G A G A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A A A A G A A T T A T T A gag ARG AY536237 -1.seq

1125 A A C T G T A A T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A A A A T T A T T A gag ARG AY536238 -1.seq

1101 A A A C A T A A T G A T G C A G A G A A G C A A T T T T A A A G G T C C T A A A A G A A C T A T T A gag ARG AY968312 -1.seq

1119 A G C T G T G A T G A T G C A A A A A A G T A A C T T T A A G G G C C C A A A A A G A A C T G T T A gag ARG DQ383754-1.seq

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1113 A A A C A T A A T G A T G C A A A G A A G C A A T T G T A A A G G C C C T A A A A G A A C T A T T A gag BR U52953-1.seq

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1122 T A C C A T A A T G A T G C A G A G A G G C A A T T T T A G G A A C C A A A G A A A G A C T A T T A gag BR AF005495-1.seq

1113 A A A C A T A A T G A T G C A G A G A G G C A A T T T T A A A G G C C C T A A A A G A A T T A T T A gag BR AF286228-1.seq

1128 T G C C A T A A T G A T G C A G A A A G G C A A T T T T A G A A A C C A A A G A A A G A T T G T T A gag BR AY173956-1.seq

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1107 A A C T A T A A T G A T G C A G A A A A G T A A T T T T A A G G G C C A A G G A A G A A T T G T A A gag BR AY173958-1.seq

1131 A A A T G T A A T G A T G C A A A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A A T T G T T A gag BR AY455778-1.seq

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1119 T C C C A T A A T G A T G C A G A G A G G C A A C T T T A G G G A C C A A A G A A A G A C T G T T A gag BR AY771588-1.seq

1122 T G C C A T A A T G A T G C A G A G A G G C A A T T T T A G G A A C C A A A G A A A A A C T G T T A gag BR AY771591-1.seq

1116 A A C T G T A C T G A T G C A G A A A A G T A A C T T T A A G G G C C A A A G A A G A G T T G T T A gag BR DQ085867-1.seq

A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C Majority

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1210 1220 1230 1240 1250

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1157 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G T A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG DQ1890088-1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G C A G G G A A G G A C A C A T A G C C A A A M A T T G C A G G G C C gag ARG AF332867 -1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A A C A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A A G G C T gag ARG AF385936-1.seq

1169 A A T G G T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408626-1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408627-1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408628 -1.seq

1169 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408629 -1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G C A G A G A A G G C C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408630 -1.seq

1157 A A T G T T T C A A T T G T G G T A A A A T A G G A C A C A T A G C A A A A C A T T G C A G G G C C gag ARG AF408631 -1.seq

1175 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AF408632-1.seq

1169 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AY536237 -1.seq

1175 A A T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C T A A A A A T T G C A G G G C C gag ARG AY536238 -1.seq

1151 A A T G C T T C A A C T G T G G C A A G G A A G G G C A C T T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag ARG AY968312 -1.seq

1169 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G A G G G A C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag ARG DQ383754-1.seq

1178 A A T G C T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag BR DQ085871-1.seq

1163 A A T G C T T C A A C T G T G G C A A G G A A G G G C A C T T A G C C A G A A A T T G C A G G G C T gag BR U52953-1.seq

1157 A A T G C T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AF005494-1.seq

1172 A G T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G G C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AF005495-1.seq

1163 A A T G C T T C A A C T G T G G C A A G G A A G G G C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AF286228-1.seq

1178 A G T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G G C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AY173956-1.seq

1157 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G C A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G T A G G G C C gag BR AY173957-1.seq

1157 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G C A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AY173958-1.seq

1181 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A C T G C A G G G C C gag BR AY455778-1.seq

1166 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag BR AY455779-1.seq

1169 A A T G T T T T A A T T G T G G C A G G G A A G G G C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag BR AY455780-1.seq

1169 A G T G T T T C A A T T G T G G C A A A G T A G G G C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR AY771588-1.seq

1172 A G T G T T T C A A T T G T G G C A A A G A A G G G C A C A T A G C C A G A A A T T G C A G G G C C gag BR AY771591-1.seq

1166 A A T G T T T T A A T T G T G G C A A A G A A G G A C A C A T A G C C A A A A A T T G C A G G G C C gag BR DQ085867-1.seq

C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A Majority

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1260 1270 1280 1290 1300

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1207 C C C A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG DQ1890088-1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF332867 -1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF385936-1.seq

1219 C C T A G G A A A A A G G G C T G G T T G A A A T G T G G G C A A G A A A G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408626-1.seq

ANEXOS


Página 98

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408627-1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A A A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408628 -1.seq

1219 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G G C A C C A A A T G A A gag ARG AF408629 -1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408630 -1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408631 -1.seq

1225 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A G G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AF408632-1.seq

1219 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AY536237 -1.seq

1225 C C T A G A A A A A A G G G T T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AY536238 -1.seq

1201 C C T A G G A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A G G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG AY968312 -1.seq

1219 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag ARG DQ383754-1.seq

1228 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A G T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR DQ085871-1.seq

1213 C C T A G G A A A A A A G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A G T G A A gag BR U52953-1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A G T G T G G A A G A G A G G G A C A C C A A A T G A A gag BR AF005494-1.seq

1222 C C T A G G A A A A A G G G C T G C T G G A A A T G T G G A A A G G A A G G A C A C C A G A T G A A gag BR AF005495-1.seq

1213 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A G G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR AF286228-1.seq

1228 C C T A G G A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A G G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR AY173956-1.seq

1207 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A G A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR AY173957-1.seq




1219 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR AY455780-1.seq

1219 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A G G A G G G A C A C C A A A T G A A gag BR AY771588-1.seq

1222 C C C A G G A A A A A G G G C T G C T G G A A A T G T G G A A G G G A A G G A C A C C A A A T G A A gag BR AY771591-1.seq

1216 C C T A G A A A A A A G G G C T G T T G G A A A T G T G G A A A A G A A G G A C A T C A A A T G A A gag BR DQ085867-1.seq

A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C Majority

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1310 1320 1330 1340 1350

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1257 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag ARG DQ1890088-1.seq

1257 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag ARG AF332867 -1.seq

1257 A G A C T G C C C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag ARG AF385936-1.seq

1269 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T T A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T T C C gag ARG AF408626-1.seq

1257 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A A G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag ARG AF408627-1.seq


1269 A G A C T G T A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A G A C T T T G G C C T T C C A gag ARG AF408629 -1.seq



1275 A G A C T G C A C T G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag ARG AF408632-1.seq

1269 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag ARG AY536237 -1.seq

1275 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag ARG AY536238 -1.seq

1251 A G A C T G T A C T G A G A G G C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag ARG AY968312 -1.seq

1269 G G A C T G T A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A G A A T T T G G C C T T C C C gag ARG DQ383754-1.seq

1278 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T C C C A gag BR DQ085871-1.seq

1263 A G A C T G T A C T G A G A G G C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR U52953-1.seq

1257 G G A C T G C A C T G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C A gag BR AF005494-1.seq

1272 A G A T T G T A C T G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T C T G G C C T T C C C gag BR AF005495-1.seq

1263 A G A T T G T A C T G A G A G G C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR AF286228-1.seq

1278 A G A T T G T T C A G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A G A T C T G G C C T T C C T gag BR AY173956-1.seq

1257 A G A C T G C A C T G A A G G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR AY173957-1.seq

1257 A G A C T G C A C T G A A G G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR AY173958-1.seq

1281 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR AY455778-1.seq

1266 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR AY455779-1.seq

1269 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T C T G G C C T T C C C gag BR AY455780-1.seq

1269 A G A G T G C A C T G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A G T T T G G C C T T C C C gag BR AY771588-1.seq

1272 A G A T T G T A C T G A G A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T C T G G C C T T C C A gag BR AY771591-1.seq

1266 A G A C T G C A C T G A A A G A C A G G C T A A T T T T T T A G G G A A A A T T T G G C C T T C C C gag BR DQ085867-1.seq

A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1360 1370 1380 1390 1400

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag ARG DQ1890088-1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C T G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF332867 -1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF385936-1.seq

1319 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G G A A T T T T A T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A A G gag ARG AF408626-1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C G G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408627-1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408628 -1.seq

1319 A C A A - - - G G G A A G G C C A G G G A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408629 -1.seq

1307 A C A G - - - G G G G A G G C C A G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408630 -1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C G G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408631 -1.seq

1325 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AF408632-1.seq

1319 A C A A - - - G G G G A G G C C A G G G A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AY536237 -1.seq

1325 A G A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G G gag ARG AY536238 -1.seq

1301 A C A A - - - G G G G A G G C C A G G A A A C T T C C T C C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag ARG AY968312 -1.seq

1319 A C A A A G G G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A G C A G A C C A G A A C C A A G A gag ARG DQ383754-1.seq

1328 A C A A - - - G G G G A G G C C T G G G A A T T T C C T T C A G A A C A G G A C A G A G A A C A G G gag BR DQ085871-1.seq

1313 A C A G - - - G G G G A G G C C A G G A A A T C T T C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G A gag BR U52953-1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A C T T C A T C C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR AF005494-1.seq

1322 A C A A - - - G G G A A G G C C A G G G A A T T T C C T T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag BR AF005495-1.seq

1313 A C A A - - - G G G G A G G C C A G G A A A T T T C C T C C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag BR AF286228-1.seq

1328 A C A A - - - G G G A A G G C C A G G G A A C T T C C T T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag BR AY173956-1.seq

1307 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR AY173957-1.seq


1331 A C A A - - - G G G G A G G C C A G G G A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR AY455778-1.seq

1316 A C A A - - - G G A A A G G C C C G G G A A T T T C C C T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR AY455779-1.seq


1319 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C C T C A A A C - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR AY771588-1.seq

1322 G C A A - - - A G G G A G G C C A G G G A A T T T C C T T C A G A G - - - - - - - - - - - - C A G A gag BR AY771591-1.seq

1316 A C A A - - - G G G G A G G C C C G G A A A T T T C C T T C A G A A - - - - - - - - - - - - C A G G gag BR DQ085867-1.seq

C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C G G A G A G G A G - - Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1410 1420 1430 1440 1450

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C A G A G A G G A G - - gag ARG DQ1890088-1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C A G A G A G G A G - - gag ARG AF332867 -1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G A G - - gag ARG AF385936-1.seq

1354 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C G G C A G A G A C T T T C G G G T T T G G A G A G G A G - - gag ARG AF408626-1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G A A - - gag ARG AF408627-1.seq

1342 C C A G A G C C A T C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C A G A G A G G A G - - gag ARG AF408628 -1.seq

1354 C C A G A G C C A A C A G C C C C T C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G G G - - gag ARG AF408629 -1.seq

1342 C C A G A A C C A A C A G C C C C A C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G A G - - gag ARG AF408630 -1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T T G G T T T C G G A G A G G A G - - gag ARG AF408631 -1.seq

1360 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T T G G A G A G G A G - - gag ARG AF408632-1.seq

1354 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T T G G A G A G G A G - - gag ARG AY536237 -1.seq

1360 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G A G - - gag ARG AY536238 -1.seq

1336 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G C A G A G A G C T T C A A G T T C G A G G A - - - - - - gag ARG AY968312 -1.seq

1369 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C G G A G A G G A G - - gag ARG DQ383754-1.seq

1375 A C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C G G A G A G G A G - - gag BR DQ085871-1.seq

1348 A C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G A A G A G A G C T T C A G G T T T G G G G A A G A G A C gag BR U52953-1.seq

1342 C C A G A G C C G T C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C A G G T T C G G G G A G G A G - - gag BR AF005494-1.seq

1357 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G C A G A G A G C T T C A G G T T T G G G G A A G A G G T gag BR AF005495-1.seq

1348 C C A G A G C C A T C A G C C C C A C C A G A G G A G A G C T T C A G G T T C G A G G A - - - - - - gag BR AF286228-1.seq

1363 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G A A G A G A T C T T C A G G T T T G G G G A A G A G A C gag BR AY173956-1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C A G A G A G G A G - - gag BR AY173957-1.seq

1342 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C A G A G A G G A G - - gag BR AY173958-1.seq

1366 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T T G G G T T C G G A G A G G A G - - gag BR AY455778-1.seq

1351 C T A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C G G G G A G G G G - - gag BR AY455779-1.seq

1354 C C A G A G C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T T G G A G A G G A G - - gag BR AY455780-1.seq

1354 C T A G A G C C A A C G G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C A G A G A G G A G - - gag BR AY771588-1.seq

ANEXOS


Página 99

1357 C C A G A G C C A A C A G C C C C A C C A A T G G A G A G C T T C A G G T T T G G G G A A G A G A C gag BR AY771591-1.seq

1351 C C A G A A C C A A C A G C C C C G C C A G C A G A G A G C T T C G G G T T C G G A G A G G A G - - gag BR DQ085867-1.seq

- A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1460 1470 1480 1490 1500

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1390 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG DQ1890088-1.seq

1390 - A T A A C C C C C T C T C C G A G G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C A G T A C C C T C gag ARG AF332867 -1.seq

1390 - A T A A C C T C C T C T C C G A A G C G G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C A G T A C C C T C gag ARG AF385936-1.seq

1402 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G C C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG AF408626-1.seq

1390 - A A A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG AF408627-1.seq

1390 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T G C C C T C gag ARG AF408628 -1.seq

1402 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG AF408629 -1.seq

1390 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C A G T A C C C T C gag ARG AF408630 -1.seq

1390 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG AF408631 -1.seq

1408 - A C A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag ARG AF408632-1.seq

1402 - A T A A C C C C C T C T C C G A A A C A G G A G C A G A A A G C C G A G G G A C A G T A C C C T C gag ARG AY536237 -1.seq

1408 - A T A A C C C C C C C T C C G A A G C G G G A G C A G A A G G A C G A G G G A C C G T A C C C T C gag ARG AY536238 -1.seq

1380 G A C A A C C T C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C A G G G A A C - - - - - - - - - gag ARG AY968312 -1.seq

1417 - A T G A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A A A A G A G C G A G G G A C T T T A C C C T C gag ARG DQ383754-1.seq

1423 - A C A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G G A A G T A C C C T T gag BR DQ085871-1.seq

1398 A A C A A C T C C C T C T C G G A A G C A G G A G A C G A T A G A C A A G G A A C T G - - - C - - - gag BR U52953-1.seq

1390 - A C A A C C C C A T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C T G T A C C C T C gag BR AF005494-1.seq

1407 A A C A A C T C C C T C T C A G A A A C A G G A G C C G A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - gag BR AF005495-1.seq

1392 G A C A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C A G G G A A C - - - - - - - - - gag BR AF286228-1.seq

1413 A A C A A C T C C C T C T C A T A A G C A G G A G A C G A A A G A C A A G G A G T T G T A T C - - - gag BR AY173956-1.seq

1390 - A T A A A C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A A G A G G G A C T G T A C C C T C gag BR AY173957-1.seq

1390 - A C A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A A G A G G G A C T G T A C C C T C gag BR AY173958-1.seq

1414 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G A A G G A G C A C A A A G A G G A G G G A C T G T A C C - T C gag BR AY455778-1.seq

1399 - A T A A C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G A C G A G G G A C A G T A C C C T C gag BR AY455779-1.seq

1402 - A T A A C C C C C C C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A G - - - A G G G A C T G T A C C C T C gag BR AY455780-1.seq

1402 - A C A A C T C C T C C T C A G A A A C A G G A G C C G A C A G A C A A G G A A C T G T A T C - - - gag BR AY771588-1.seq

1407 A A C A G C G C C T G C T C A G A A G C A G G A G C C G A T A G A C A A G G A A G T G T A T C - - - gag BR AY771591-1.seq

1399 - A T A G C C C C C T C T C C G A A G C A G G A G C A G A A A A A C G A G G G A C A G T A C C C T C gag BR DQ085867-1.seq

C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G X X X X X X X X X Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1510 1520 1530 1540 1550

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG DQ1890088-1.seq

1439 C T T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AF332867 -1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AF385936-1.seq

1451 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A T T C A C A A T A A gag ARG AF408626-1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AF408627-1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AF408628 -1.seq


1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C A T A G gag ARG AF408630 -1.seq


1457 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C A A T A G gag ARG AF408632-1.seq

1451 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AY536237 -1.seq

1457 C C T T A G C T T C C C T C A G A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag ARG AY536238 -1.seq

1421 C C T T A A C T T C C C T C A A A T C A C T G T T T G G C A G C G A C C C C T T G T C A C A A T A A gag ARG AY968312 -1.seq

1466 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C A G T A G gag ARG DQ383754-1.seq

1472 C C T T A A C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C A T A G gag BR DQ085871-1.seq

1442 C C T T A A C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A G C G A C C C C T T G T C A A C A T A A gag BR U52953-1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag BR AF005494-1.seq

1436 - - - T A G gag BR AF005495-1.seq

1433 C T T T A A C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A G C G A C C C C T T G T C A C A A T A A gag BR AF286228-1.seq

1460 C T T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T C G T C A C A G T A A gag BR AY173956-1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C A C T A G gag BR AY173957-1.seq

1439 C C T T A G C T T C C C T C A R A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C A C T A G gag BR AY173958-1.seq

1462 C C T T A G gag BR AY455778-1.seq

1448 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag BR AY455779-1.seq

1448 C C T T A G C C T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C G T A G gag BR AY455780-1.seq

1448 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C T T A G T C A C A G T A A gag BR AY771588-1.seq

1454 C T T T A G C T T C C C T C A G A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T C G T C A C A A T A A gag BR AY771591-1.seq

1448 C C T T A G C T T C C C T C A A A T C A C T C T T T G G C A A C G A C C C C T A G gag BR DQ085867-1.seq

b) Alineamiento de las secuencias nucleotídicas correspondientes al fragmento

codificante de p24 de las secuencias de genoma completo de HIV-1 de Argentina

y Brasil tomadas de la base de datos GenBank

C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C T A T A T C A C C Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

10 20 30 40 50

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1 C C T G T A G T A C A G A A T C C T C A G G G A C A A A T G G T A T A C C A G T C C T T A T C A C C p24 ARG DQ1890088-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G T C T T T A T C A C C p24 ARG AF332867 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G C C T T T A T C A C C p24 ARG AF385936-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C A T C C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C A A T A T C A C C p24 ARG AF408626-1.seq

1 C C T G T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A T A C C A G T C T C T A T C A C C p24 ARG AF408627-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C p24 ARG AF408628 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A T C A G T C T A T A T C A C C p24 ARG AF408629 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C p24 ARG AF408630 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G C C T A T A T C A C C p24 ARG AF408631 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G A C A C A C C A G C C T A T A T C A C C p24 ARG AF408632-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C A T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G G C T T T A T C A C C p24 ARG AY536237 -1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A T C A G T C T C T A T C A C C p24 ARG AY536238 -1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A T C T C C A A G G G C A A A T G G T A C A C C A G C C C A T A T C A G C p24 ARG AY968312 -1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C A T G C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G C C C C T A T C A C C p24 ARG DQ383754-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T C C A A G G G C A A A T G G T A C A C C A G C C C A T A T C A G C p24 BR U52953-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A C C A G T C T T T A T C A C C p24 BR AF005494-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C C T T C A G G G G C A A A T G G T A C A C C A G G C C A T A T C A C C p24 BR AF005495-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A T C T C C A A G G G C A A A T G G T A C A C C A G C C C A T G T C A G C p24 BR AF286228-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C A T G C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C p24 BR AY173956-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A T C A G T C T A T A T C A C C p24 BR AY173957-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A T C T T C A G G G A C A A A T G G T A C A T C A A T C T A T A T C A C C p24 BR AY173958-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C C T G C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G C C C T T A T C A C C p24 BR AY455778-1.seq

1 C C T A T A G T G C A A A A C C T C C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C C C T A T C A C C p24 BR AY455779-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C A T C C A A G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C T A T A T C A C C p24 BR AY455780-1.seq

1 C C T A T A G T A C A G A A C C T C C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A A G C C A T A T C A C C p24 BR AY771588-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A T C T T C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C p24 BR AY771591-1.seq

1 C C T A T A G T G C A G A A C C T A C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C C C T A T C A C C p24 BR DQ085867-1.seq

1 C C T A T A G T G C A A A A T C T T C A G G G G C A A A T G G T A C A T C A G G C C A T A T C A C C p24 BR DQ085871-1.seq

T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

60 70 80 90 100

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

ANEXOS


Página 100

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T G A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG DQ1890088-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T G G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AF332867 -1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C C T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AF385936-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A G T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 ARG AF408626-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G C G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AF408627-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A A G C T T T T A G C C p24 ARG AF408628 -1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AF408629 -1.seq

51 T A A A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A A G C T T T T A G C C p24 ARG AF408630 -1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A A A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AF408631 -1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T T A C C C p24 ARG AF408632-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AY536237 -1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 ARG AY536238 -1.seq

51 T A G A A C T T T G A A T G C A T G G G T A A A G G T A G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C p24 ARG AY968312 -1.seq

51 T A G A A C A T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 ARG DQ383754-1.seq

51 T A G A A C T T T G A A T G C G T G G G T A A A G G T A G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR U52953-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G T C p24 BR AF005494-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 BR AF005495-1.seq

51 T A G A A C T T T G A A T G C G T G G G T A A A G G T A G T A G A G G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR AF286228-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR AY173956-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 BR AY173957-1.seq



51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A G T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR AY455779-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR AY455780-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A G T A G A A G A G A A G G C T T T C A G C C p24 BR AY771588-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A G T A G A A G A A A A G G C T T T C A G C C p24 BR AY771591-1.seq

51 T A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A A G T A A T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 BR DQ085867-1.seq

51 G A G A A C T T T A A A T G C A T G G G T A A A G G T G G T A G A A G A G A A G G C T T T T A G C C p24 BR DQ085871-1.seq

C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A Majority

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110 120 130 140 150

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG DQ1890088-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF332867 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF385936-1.seq

101 C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A G C A G A A G G A G C C A C Y C C A C A A p24 ARG AF408626-1.seq

101 C A A A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A T p24 ARG AF408627-1.seq

101 C A C A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF408628 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF408629 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C C C C A C A A p24 ARG AF408630 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF408631 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG AF408632-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 ARG AY536237 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C T C C A C A A p24 ARG AY536238 -1.seq

101 C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 ARG AY968312 -1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 ARG DQ383754-1.seq

101 C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR U52953-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 BR AF005494-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AF005495-1.seq

101 C A G A G G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AF286228-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AY173956-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 BR AY173957-1.seq



101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C C T T G T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AY455779-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A G C C G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AY455780-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AY771588-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G A G C C A C C C C A C A A p24 BR AY771591-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T T C A G C A T T A T C A G A A G G G G C C A C T C C A C A A p24 BR DQ085867-1.seq

101 C A G A A G T A A T A C C C A T G T T T A C A G C A C T A T C A G A A G G G G C C A C C C C A C A A p24 BR DQ085871-1.seq

G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

160 170 180 190 200

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG DQ1890088-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C T A T G C A p24 ARG AF332867 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T A G G A G G A C A T C A A G C A G C T A T G C A p24 ARG AF385936-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AF408626-1.seq


151 G A C T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AF408628 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G A G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AF408629 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G T G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AF408630 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AF408631 -1.seq


151 G A T T T A A A C A C C A T G Y T A A A T A C A G T G G G A G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AY536237 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AY536238 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T G A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 ARG AY968312 -1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G A G G A C A T C A A G C A G C T A T G C A p24 ARG DQ383754-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A C C A A G C A G C C A T G C A p24 BR U52953-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AF005494-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C T A T G C A p24 BR AF005495-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A C C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AF286228-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A C A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY173956-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY173957-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C G A T G C A p24 BR AY173958-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY455778-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY455779-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY455780-1.seq

151 G A C T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C G G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR AY771588-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G C T A A A C A C G G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C T A T G C A p24 BR AY771591-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR DQ085867-1.seq

151 G A T T T A A A C A C C A T G T T A A A T A C A G T G G G G G G A C A T C A A G C A G C C A T G C A p24 BR DQ085871-1.seq

A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C Majority

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210 220 230 240 250

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201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG DQ1890088-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AF332867 -1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A C T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AF385936-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AF408626-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T T A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AF408627-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T T A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C p24 ARG AF408628 -1.seq



201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C p24 ARG AF408631 -1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AF408632-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G G A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AY536237 -1.seq

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201 A A T G T T A A A A G A T A C T A T C A A T G A T G A G G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 ARG AY968312 -1.seq

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201 A A T G T T A A A A G A T A C C A T C A A T G A G G A G G C T G C A G A A T G G G A T A G A T T A C p24 BR U52953-1.seq

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201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A A G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 BR AY173958-1.seq


ANEXOS


Página 101


201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T A A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A T T A C p24 BR AY455780-1.seq

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201 A A T G T T A A A A G A G A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A T A G A T T G C p24 BR AY771591-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A A T A C p24 BR DQ085867-1.seq

201 A A T G T T A A A A G A C A C C A T C A A T G A G G A A G C T G C A G A A T G G G A C A G A G T A C p24 BR DQ085871-1.seq

A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G Majority

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260 270 280 290 300

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251 A T C C A G C G C A T G C A G G G C C T A T C C C A C C C G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG DQ1890088-1.seq

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251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG AF385936-1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T T C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG AF408626-1.seq

251 A T C C A G T G C A G G C A G G A C C T A T T C C A C C A G G C C A G A T T A G G G A A C C T A G G p24 ARG AF408627-1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG AF408628 -1.seq

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251 A T C C A G T G C A K G C A G G A C C T A T T C C A C C A G G C C A G A T A A G G G A A C C G A G G p24 ARG AF408631 -1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T T C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG AF408632-1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C A C C A G G C C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 ARG AY536237 -1.seq

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251 A T C C A G T A C A T G C A G G G C C T G T C G C A C C A G G C C A A A T G A G A G A A C C A A G G p24 ARG AY968312 -1.seq

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251 A T C C A G T A C A T G C A G G G C C T A T T G C A C C A G G C C A G A T G A G A G A A C C A A G G p24 BR AY771591-1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A A C C C A C C A G G T C A G A T G A G G G A A C C T A G G p24 BR DQ085867-1.seq

251 A T C C A G T G C A T G C A G G A C C T A T C C C G C C A G G C C A A A T G A G G G A A C C T A G G p24 BR DQ085871-1.seq

G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G Majority

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310 320 330 340 350

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301 G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A C T C C T C A G G A A C A A A T A C A A T G p24 ARG DQ1890088-1.seq

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301 G G G A G T G A T A T A G C T G G A C C T A C T A G T T C C C C T C A G G A C C A A G T A C A A T G p24 ARG AF408627-1.seq



301 G G A A G T G A C A T A G C T G G A A C T A C T A G T A A C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G p24 ARG AF408630 -1.seq



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301 G G A A G T G A T A T A G C T G G A A C T A C T A G T A C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G p24 BR AY173958-1.seq

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301 G G A A G T G A T A T A G C G G G A A C T A C T A G T A C C C T T C A G G A A C A A A T A C A A T G p24 BR DQ085871-1.seq

G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A Majority

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360 370 380 390 400

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351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A p24 ARG DQ1890088-1.seq

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351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A p24 ARG AF408628 -1.seq

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351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A C A T T T A T A A A A G A T G G A p24 ARG AF408632-1.seq

351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A p24 ARG AY536237 -1.seq

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351 G A T G A C A A A T A A T C C A C C T A T C C C A G T A G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A p24 BR AY771591-1.seq

351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A A A T C T A T A A A A G A T G G A p24 BR DQ085867-1.seq

351 G A T G A C A A G C A A C C C A C C T G T C C C A G T G G G A G A C A T C T A T A A A A G A T G G A p24 BR DQ085871-1.seq

T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T Majority

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410 420 430 440 450

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401 T C A T C C T A G G A T T A A A T A A A A T A G T A A G A A T G T A T A G C C C T G T C A G C A T T p24 ARG DQ1890088-1.seq

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ANEXOS


Página 102

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T T G G A C A T A A G A C A A G G G C C A A A A G A A C C C T T T A G A G A C T A T G T A G A C A G Majority

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460 470 480 490 500

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G T T C T T T A A A A C C C T A A G A G C T G A G C A A G C T A C A C A G G A A G T A A A G G G T T Majority

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510 520 530 540 550

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G G A T G A C A G A C A C C T T G T T G G T C C A A A A T G C G A A C C C A G A T T G T A A G A C C Majority

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560 570 580 590 600

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A T T T T A A A A G C A T T G G G A C C A G G G G C T A C A C T A G A A G A A A T G A T G A C A G C Majority

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610 620 630 640 650

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ANEXOS


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A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C T G G C C A T A A G G C A A G A G T T T T G Majority

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------

660 670 680 690

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------

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651 A T G T C A G G G A G T G G G A G G A C C G A G T C A T A A G G C A A G A A T T T T G p24 BR DQ085871-1.seq

ANEXOS


Página 104

c) Alineamiento de secuencias aminoacídicas de los fragmentos codificantes

para p24 en estudio (1, 2, 3, 4, 6 y 7) con las correspondientes a las secuencias

de referencia con las que presentaron una mayor relación en la inferencia

filogenética

10 20 30 40 50 60 70 80

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PIVQNLQGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAADW Ref.12_BF.AR.99.ARMA159.AF3859

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PIVQNLQXXMVHQALSPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEW p24 4

PIVQNLQ---XHQSLSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEW p24 6

PIVQNLQGQMVHQSLSPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINDEAAEW p24 7

90 100 110 120 130 140 150 160

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

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170 180 190 200 210 220 230

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

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FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTETLLVQNANPDCKTILKALGTGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.17_BF.BO.02.BO02_BOL119.EU

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTETLLVQNANPDCKTILRALGSGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.17_BF.PE.02.PE02_PCR0155.E

FRDYVDRFFKTLRAEQCTQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGQGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.28_BF.BR.99.BREPM12313.DQ0

FRDYVDRFFKTLRAEQCTQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.28_BF.BR.99.BREPM12609.DQ0

FRDYVDRFFKTLRLEQCTQEVKGWMTDTLLVPNANPDCKTFLKALGPGPSLEELTTPGPGVGGPSHKARVLA Ref.28_BF.BR.99.BREPM12817.DQ0

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.29_BF.BR.02.BREPM119.AY771

FRDYVDRFFKTLRAEQCTQEVKGWMTDTLLVQNANPDCRTILKALGPGSTLEEMMTACQGVGGPSHKARILA Ref.29_BF.BR.99.BREPM11948.DQ0

FRDYVDRFFKTLRAEQCTQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.29_BF.BR.01.BREPM16704.DQ0

FRDYVDRFFKALRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKGLGIGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.38_BF1.UY.05.UY05_4752.FJ2

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLIQNSNPDCKTILKALGPGASLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.38_BF1.UY.04.UY04_3987.FJ2

FRDYVDRFFKVLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNXNPDCKTILKALGTGATLEEMMAACQGVGGPGHKARVLA Ref.38_BF1.UY.04.UY04_4022.FJ2

FRDYVDRFFKTLRAEQASQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.40_BF.BR.04.04BRRJ115.EU73

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.40_BF.BR.05.05BRRJ200.EU73

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.40_BF.BR.04.04BRSQ46.EU735

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.42_BF.LU.03.luBF_05_03.EU1

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILRALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.44_BF.CL.00.CH80.FJ358521

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPAHKARVLA Ref.46_BF.BR.01.01BR087.DQ3588

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.46_BF.BR.01.01BR125.DQ3588

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARILA Ref.46_BF.BR.07.07BR_FPS625.HM

FRDYVDRFFKVLRAEQATQDVKNWMTETLLVQNSNPDCKTILKALGPQATLEEMMTACQGVGGPGHKARILA Ref.47_BF.ES.08.X2457_2.FJ6705

FRDYVDRFFKVLRAEQATQDVKNWMTETLLVQNSNPDCKTILKALGPQATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.47_BF.ES.08.P1942.GQ372987

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.F1.BR.93.93BR020_1.AF00549

FRDYVDRFFKALRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKIILKGLGIGATLEEMMTACRGVGGPGHKARILA Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

FRDYVDRFFKVLRAEQASQDVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGTGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLA Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

FRDYVDRFFKTLRAEQASQEVKNWMTESLLVQNSNPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLA Ref.F1.FR.96.96FR_MP411.AJ2492

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTESLLVQNANPDCKTILKALGTGATLEEMMSACQGVGGPGHKARVL- p24 1

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAASLEEMMTACQGVGGPGHKARVL- p24 2

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHRARVL- p24 3

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLIQNSNPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVL- p24 4

FRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKGWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGASLEEMMTACQGVGGPGHKARVL- p24 6

FRDYVDRFFKTLRAEQASQDVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVL- p24 7

ANEXOS


Página 105

Anexo 5: Electroferogramas de secuenciación capilar

a) Secuencias parciales del gen gag de HIV-1

i. Cadena “sentido”

ANEXOS


Página 106

ii. Cadena “antisentido”

ANEXOS


Página 107

b) Secuencias del fragmento codificante de p24 de HIV-1 amplificado por PCR

con cebadores originales

i. Cadena “sentido “

ANEXOS


Página 108


ANEXOS


Página 109

c) Secuencia del fragmento codificante para p24 de HIV-1 presente en el vector

recombinante

i. Cadena “sentido”

ANEXOS


Página 110


ANEXOS


Página 111

Anexo 6: Resultados de búsqueda de alineamientos locales (BLAST)

a) BLAST cadenas nucleotídicas parciales del gen gag

i) Cadena parcial “sentido”

ANEXOS


Página 112

ANEXOS


Página 113

ANEXOS


Página 114

ANEXOS


Página 115

ANEXOS


Página 116

ii) Cadena parcial “antisentido” (revertida y complementaria)

ANEXOS


Página 117

ANEXOS


Página 118

ANEXOS


Página 119

ANEXOS


Página 120

ANEXOS


Página 121

ANEXOS


Página 122

b) BLAST de cadena nucleotídica “sentido” correspondiente a una secuencia de

p24 en estudio (ejemplo).

ANEXOS


Página 123

ANEXOS


Página 124

ANEXOS


Página 125

ANEXOS


Página 126

ANEXOS


Página 127

ANEXOS


Página 128

c) BLAST de secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de p24

en estudio utilizada como ejemplo para el BLAST de secuencia nucleotídica.

ANEXOS


Página 129

ANEXOS


Página 130

ANEXOS


Página 131

ANEXOS


Página 132

Anexo 7: Código genético estándar

a) Codones nucleotídicos:

b) Nomenclatura de aminoácidos:

Abreviatura Aminoácido

A Ala Alanina

C Cys Cisteína

D Asp Ác. Aspártico

E Glu Ác. Glutámico

F Phe Fenilalanina

G Gly Glicina

H His Histidina

I Ile Isoleucina

K Lys Lisina

L Leu Leucina

M Met Metionina

N Asn Asparragina

P Pro Prolina

Q Gln Glutamina

R Arg Arginina

S Ser Serina

T Thr Treonina

V Val Valina

W Trp Triptofano

Y Tyr Tirosina

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/

AGRADECIMIENTOS


Página 139

9. AGRADECIMIENTOS

A mi familia por brindarme un soporte incondicional que me alienta permanentemente

a superarme en todos los órdenes de la vida.

A todos mis compañeros de trabajo del Laboratorio de HIV y del resto de los sectores

del Departamento de Virología - INEI - ANLIS quienes colaboraron de una u otra forma

en la concreción de este proyecto.

Al personal de la UOCCB - ANLIS y del Servicio de Antimicrobianos - INEI - ANLIS

quienes contribuyeron al avance de diversas etapas del proyecto.

A la Dra. Virginia Alonio, Jefa del Departamento de Virología - INEI - ANLIS y a la

Profesora Dra. Laura Todaro del Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo” por el

asesoramiento.

A mi director de tesis, Dr. Alexis Edelstein, por la transmisión de su experiencia en el

diseño y desarrollo de proyectos de investigación.

tesis de maestrÍasgc.anlis.gob.ar/bitstream/123456789/584/1/t_mmm_zak.pdftesis de maestrÍa...

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