tesis doctoral 2017 nuevos mecanismos y …

TESIS DOCTORAL

2017

NUEVOS MECANISMOS Y BIOMARCADORES DE LA

INTERACCIÓN DE LA VITAMINA A CON EL

METABOLISMO LIPÍDICO Y ENERGÉTICO Y SU PAPEL

EN LA PROGRAMACIÓN METABÓLICA

Andrea Arreguín Coronado

TESIS DOCTORAL

2017

Programa de Doctorado en Nutrigenómica

y Nutrición Personalizada

NUEVOS MECANISMOS Y BIOMARCADORES DE LA

INTERACCIÓN DE LA VITAMINA A CON EL

METABOLISMO LIPÍDICO Y ENERGÉTICO Y SU PAPEL

EN LA PROGRAMACIÓN METABÓLICA


Directores:

Dr. Joan Ribot Riutort y Prof. María Luisa Bonet Piña

Doctor por la Universitat de les Illes Balears

Los directores de Tesis Doctoral

Dr. Joan Ribot Riutort

Profesor Titular de Universidad

Bioquímica y Biología Molecular

Prof. María Luisa Bonet Piña

Catedrática de Universidad

Bioquímica y Biología Molecular

La interesada


Agradecimientos

“Ningún hombre, por más estudioso que sea,

le sobrevendrá nada más perfecto en la doctrina

que saberse doctísimo en la ignorancia”

Nicolás de Cusa

En primer lugar quiero agradecer de una manera muy especial a mis tutores, el Dr. Joan

Ribot Riutort y la Prof. María Luisa Bonet Piña. Al Dr. Joan por brindarme su confianza

y la oportunidad de aprender y crecer en el ámbito de la investigación. A la Prof. Luisa por

su ejemplo y constancia que son motivo de inspiración y entrega profesional. A ambos les

estoy enormemente agradecida por sus consejos, orientación, tiempo, dedicación y apoyo

para guiarme durante este trayecto. Han logrado que me sienta con más seguridad

profesional y con más gusto por la investigación.

Al Prof. Andreu Palou Oliver, por brindarme la oportunidad de integrarme en el Laboratorio

de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología de la UIB-CIBERobn, y a todos los profesores

de su equipo de trabajo por los consejos que me han dado durante estos años.

A la Lic. Enf. Claudia Elena González Acevedo, directora de la Facultad de Enfermería

y Nutrición de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí por el apoyo brindado para la

realización de mis estudios de doctorado.

Al Programa del Mejoramiento del Profesorado (PROMEP/103.5/13/5629) de la Secretaría de

Educación Superior del Gobierno de México por el financiamiento de mis estudios de postgrado, y

Gobierno de España, la fundación Ramón Areces y al Programa Marco 7 de Unión Europea

(proyectos DIABAT y BIOCLAIMS) por la financiación del proyecto de investigación de la tesis.

A todos mis compañeros de laboratorio por hacerme el trabajo más ameno y agradable y

por la ayuda prestada en todo momento. Especialmente a los que me brindaron sus consejos

y ayuda con el trabajo experimental.

A todos mis profesores que a lo largo de mi vida académica me han aportado todas las

habilidades y conocimientos que ahora dispongo. En especial a la Dra. Mariana Cifuentes

Köster que desde mi estancia en Chile me brindó su apoyo y motivación para adentrarme

al mundo de la investigación.

A mis incondicionales Mónica y Oso que siempre han estado conmigo. A Ailem, Pauli,

Dona, Shirley y todos mis amigos chilenos por creer en mí. A las personas que hicieron de

mi estancia más agradable y llevadera a Gemma, Carlos, Juanma, Laia, Natalia, Elisabeth,

vivimos momentos inolvidables. Y especialmente, a José Luis por ser lo mejor que me ha

dado Mallorca. A mis mejores compañeras de trabajo Nara y Andrea que siempre

estuvieron para escucharme, motivarme y aconsejarme, y brindarme su amistad que

siempre recordaré y sé que perdurará, logramos una hermandad chicas.

A mi familia por apoyarme, entenderme y confiar en mí siempre. Son el mejor regalo que

me ha dado la vida y por ustedes soy todo lo que soy. Los quiero.

Gracias

Tesis Doctoral


ix

Índice

Resum/Abstract/Resumen xi

Abreviaturas xv

1. Introducción 17

1.1. La vitamina A y el metabolismo de los retinoides 19

1.1.1. Mecanismos de acción de los retinoides 22

1.2. Actividad de la vitamina A en el control del metabolismo lipídico y

energético, la adiposidad corporal y la obesidad 23

1.2.1. Efectos de los retinoides en el tejido adiposo 25

1.2.2. Efectos de los retinoides en otros tejidos 27

1.3. Retinoides y biomarcadores metabólicos 27

1.3.1. Acilcarnitinas como biomarcadores: origen y significado

biológico 29

1.4. Retinoides y epigénetica 32

1.4.1. Mecanismos epigenéticos y programación metabólica 32

1.4.2. Los retinoides como agentes epigenéticos 34

2. Objetivo y Planteamiento Experimental 37

3. Materiales y Métodos 45

3.1. Estudios en animales 47

3.2. Estudio morfológico e inmunohistoquímico del tejido adiposo blanco

inguinal (TABi) de ratones 48

3.3. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de

ratón 48

3.4. Análisis metabolómico en plasma y células mononucleares de sangre

periférica (PBMC) 49

3.5. Aislamiento de la fracción celular estromal vascular (SVF) del tejido

adiposo y cultivo primario 49

3.6. Extracción de ácidos nucleicos 50

3.6.1. Extracción de ARN total 50

3.6.2. Extracción del ADN 51

3.6.3. Cuantificación y comprobación del estado del ARN y ADN 51

3.7. Análisis de ARNm por RT-qPCR a tiempo real 52

3.7.1. Retrotranscripción (RT) 52

3.7.2. qPCR a tiempo real 52

3.8. Contenido de ADN mitocondrial 55

3.9. Análisis de metilación de ADN por secuenciación con bisulfito 55

3.10. Análisis estadístico 56

4. Resultados y Discusión 60

4.1. Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización

del tejido adiposo blanco inducida por ácido retinoico 60

4.1.1. Antecedentes 61

4.1.2. Resultados 62

4.1.3. Discusión 81

4.1.4. Conclusiones 82

Tesis Doctoral


x

4.2. Capítulo 2: Biomarcadores metabólicos circulantes de la acción del

ácido retinoico: estudio in vivo 85





4.3. Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la

suplementación con vitamina A preformada o -caroteno durante la

lactancia 111





5. Recapitulación 151

6. Conclusiones 161

7. Referencias 165

Tesi Doctoral


Universitat de les Illes Balears, 2017 xi

Resum

Nous mecanismes i biomarcadors de la interacció de la vitamina A amb el

metabolisme lipídic i energètic i el seu paper en la programació metabólica

Els factors nutricionals a l’edat adulta i en etapes primerenques de la vida poden

condicionar el desenvolupament de la obesitat i malalties metabòliques. El nostre grup ha

estat pioner en l'estudi de l'activitat biològica de les formes actives de la vitamina A

(retinoids) i carotenoids provitamina A en relació al control de l'adipositat corporal i la salut

metabòlica, que apunta una acció antiobesogènica. L'objectiu principal de la present tesi ha

estat aprofundir en la interacció de la vitamina A amb el metabolisme energètic i el

desenvolupament del teixit adipós i els seus mecanismes, incloent mecanismes epigenètics

possiblement relacionats amb la programació metabòlica, i identificar nous biomarcadors

d'aquesta interacció. Per a això hem utilitzat diferents dissenys experimentals: a) ratolins

adults tractats amb àcid retinoic tot-trans (ATRA) o vehicle per via subcutània; b) cultius

primaris d'adipòcits exposats a ATRA i altres estímuls; i c) cries de rata suplementades amb

un excés moderat de vitamina A en forma de retinil palmitat o -carotè durant l'etapa de

lactància.

Els resultats mostren que el tractament amb ATRA va incrementar la capacitat funcional

oxidativa de les mitocòndries en el teixit adipós blanc (TAB) de ratolí i va afavorir

l'adquisició de certs marcadors de marronització o d'adipòcits beix/BRITE, incloent

l'expressió gènica de UCP1 i Cd137, encara que altres marcadors van mostrar una utilitat

limitada i va haver-hi variacions intrínseques entre els diferents dipòsits de greix (visceral

i subcutani). Aquests efectes de l'ATRA podrien ser deguts en part a mecanismes d'acció

indirectes, a través de la inducció de la IRISINA d'origen hepàtic i del propi teixit adipós.

Basant-nos en els resultats dels estudis en cultiu primari i en animals adults, identifiquem

la ràtio entre l'expressió de Rarb i Rxrg com un nou marcador transcripcional en teixit de

marronització i activació metabòlica del TAB. D'altra banda, el tractament amb ATRA va

afectar els nivells de diferents metabòlits circulants: alguns canvis podrien reflectir

l'activació de la mobilització i oxidació tissular de lípids (e.g., acilcarnitinas), mentre que

altres podrien jugar un paper més actiu o causal. L'anàlisi metabolòmic realitzat ens va

permetre identificar diversos marcadors plasmàtics d'activació del teixit adipós marró i

d'activació metabòlica del TAB, particularment el visceral. La suplementació amb vitamina

A durant la lactància va induir canvis en l'estat de metilació de l'ADN en el teixit adipós

inguinal en regions reguladores de gens relacionats amb la proliferació cel·lular, la

diferenciació i determinació adipogénica i la termogènesi, i de manera diferencial quan es

va administrar com a retinil palmitat o -carotè. Els efectes observats podrien ser deguts a

diferències en fenòmens de programació de les característiques i respostes del TAB en

etapes posteriors de la vida.

El coneixement de compostos actius en la programació metabòlica i en l'optimització de la

funció mitocondrial del teixit adipós, així com la disponibilitat de nous marcadors de la

mateixa, és d'interès ja que pot contribuir a noves estratègies de control de la obesitat i les

seves comorbiditats.

Doctoral Thesis


xii Universitat de les Illes Balears, 2017

Abstract

New mechanisms and biomarkers of the interaction of vitamin A with lipid and energy

metabolism and their role in metabolic programming

Nutritional factors in adulthood and in early stages of life can condition the development

of obesity and metabolic diseases. Our group has been a pioneer in the study of the

biological activity of the active forms of vitamin A (retinoids) and provitamin A

carotenoids in relation to body adiposity control and metabolic health, which points to an

antiadiposity action. The main objective of this thesis has been to further understand the

interaction of vitamin A with energy metabolism and the development of adipose tissue

and its mechanisms, including epigenetic mechanisms possibly related to metabolic

programming, and to identify new biomarkers of this interaction. To achieve this we have

used different experimental designs: a) adult mice treated subcutaneously with all-trans

retinoic acid (ATRA) or vehicle; b) primary cultures of adipocytes exposed to ATRA and

other stimuli; and c) rat pups supplemented with moderate excess of vitamin A in the form

of retinyl palmitate or -carotene during the lactation stage.

Our results show that ATRA treatment increased the functional capacity of the

mitochondria in mouse white adipose tissue (WAT) and favored the acquisition of markers

of beige/BRITE adipocytes, including the gene expression of Ucp1 and Cd137. Other

markers showed limited utility and there were intrinsic variations between the different fat

depots (visceral and subcutaneous). These effects of ATRA may result in indirect

mechanisms of action, through the induction of IRISINE of hepatic origin and of the

adipose tissue itself. In accordance to the results of studies in primary culture and adult

animals, we identified the ratio between Rarb and Rxrg expression as a new transcriptional

marker in the browning process and metabolic activation WAT. Moreover, treatment with

ATRA affected the levels of a whole series of circulating metabolites: some changes may

reflect the activation of tissue mobilization and oxidation of lipids (eg acylcarnitines), while

others may play a more active or causal role. The metabolomic analysis allowed us to

identify several plasma markers of brown adipose tissue activation and metabolic activation

of WAT, particularly visceral WAT. Vitamin A supplementation during lactation induced

changes in the state of DNA methylation in inguinal adipose tissue in regulatory regions of

genes related to cell proliferation, differentiation and adipogenic determination and

thermogenesis, and differently when administered as retinyl palmitate or -carotene. The

observed effects underlie the differences in the programming phenomena of the

characteristics and responses of WAT in the later stages of life.

Knowledge of active compounds in metabolic programming and in the optimization of the

mitochondrial function of adipose tissue, as well as the availability of new biomarkers, is

of great interest and may contribute to new strategies for obesity control and its

comorbidities.

Tesis Doctoral


Universitat de les Illes Balears, 2017 xiii

Resumen

Nuevos mecanismos y biomarcadores de la interacción de la vitamina A con el

metabolismo lipídico y energético y su papel en la programación metabólica

Factores nutricionales en edad adulta y en etapas tempranas de la vida pueden condicionar

el desarrollo de obesidad y enfermedades metabólicas. Nuestro grupo ha sido pionero en el

estudio de la actividad biológica de formas activas de la vitamina A (retinoides) y

carotenoides provitamina A en relación con el control de la adiposidad corporal y la salud

metabólica, que apunta a una acción antiobesogénica. El objetivo general de la presente

tesis ha sido profundizar en la interacción de la vitamina A con el metabolismo energético

y el desarrollo del tejido adiposo y sus mecanismos, incluyendo mecanismos epigenéticos

posiblemente relacionados con la programación metabólica, e identificar nuevos

biomarcadores de esta interacción. Para ello hemos utilizado diferentes diseños

experimentales: a) ratones adultos tratados con ácido retinoico todo-trans (ATRA) o

vehículo por vía subcutánea; b) cultivos primarios de adipocitos expuestos a ATRA y otros

estímulos; y c) crías de rata suplementadas con un exceso moderado de vitamina A en forma

de retinil palmitato o -caroteno durante la etapa de lactancia.

Los resultados muestran que el tratamiento con ATRA incrementó la capacidad funcional

oxidativa de las mitocondrias en el tejido adiposo blanco (TAB) de ratón y favoreció la

adquisición de ciertos marcadores de marronización o de adipocitos beige/BRITE,

incluyendo la expresión génica de Ucp1 y Cd137, si bien otros marcadores mostraron una

utilidad limitada y hubo variaciones intrínsecas entre los diferentes depósitos de grasa

(visceral y subcutánea). Estos efectos del ATRA podrían resultar en parte de mecanismos de

acción indirectos, a través de la inducción de la IRISINA de origen hepático y del propio

tejido adiposo. Basándonos en los resultados de los estudios en cultivo primario y en animales

adultos, identificamos la ratio entre la expresión de Rarb y Rxrg como un nuevo marcador

transcripcional en tejido de marronización y activación metabólica del TAB. Además, el

tratamiento con ATRA afectó los niveles de toda una serie de metabolitos circulantes:

algunos cambios reflejarían la activación de la movilización y oxidación tisular de lípidos

(e.g., acilcarnitinas), mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal. El

análisis metabolómico realizado nos permitió identificar varios marcadores plasmáticos de

activación del tejido adiposo marrón y activación metabólica del TAB, especialmente el

visceral. La suplementación con vitamina A durante la lactancia indujo cambios en el estado

de metilación del ADN en el tejido adiposo inguinal en regiones reguladoras de genes

relacionados con la proliferación celular, la diferenciación y determinación adipogénica y la

termogénesis, y de manera diferencial cuando se administró como retinil palmitato o -

caroteno. Los efectos observados podrían subyacer a diferencias en fenómenos de

programación de las características y respuestas del TAB en etapas posteriores de la vida.

El conocimiento de compuestos activos en la programación metabólica y en la optimización

de la función mitocondrial del tejido adiposo, así como la disponibilidad de nuevos

marcadores de la misma, es de interés ya que puede contribuir a nuevas estrategias de

control de la obesidad y sus comorbilidades.

Tesis Doctoral


xiv

Contribución personal a cada capítulo

Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido

adiposo blanco inducida por ácido retinoico. Llevé a cabo el manejo de animales

(seguimiento de la ingesta y el peso y colaboración en el sacrificio). Realicé la extracción

de ARN de los distintos depósitos de tejido adiposo diseccionados (marrón y blanco

inguinal, epididimal y retroperitoneal). Diseñé cebadores y analicé la expresión de genes

relacionados con la marronización y función mitocondrial en estos tejidos. Además, realicé

la extracción de ADN total de estos tejidos para la cuantificación de la ratio entre el ADN

mitocondrial y el nuclear. Participé en el análisis y representación gráfica de los resultados,

incluyendo el análisis estadístico.

Capítulo 2: Biomarcadores metabólicos circulantes de la acción del ácido retinoico:

estudio in vivo. En colaboración con otros autores, analicé la expresión en PBMCs de genes

relacionados con el metabolismo lipídico y energético cuya expresión se sabe alterada en

el hígado y el tejido adiposo en animales tratados con ácido retinoico. Participé en el

análisis, interpretación y representación gráfica de los resultados de expresión génica y

metabolómicos, incluyendo el análisis estadístico.

Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con

vitamina A preformada o β-caroteno durante la lactancia. En colaboración con otros

autores, realicé la extracción de ADN del tejido adiposo inguinal. Diseñé cebadores y

analicé el estado de metilación de promotores génicos seleccionados utilizando la

secuenciación por bisulfito. Participé en el análisis, interpretación y representación gráfica

de los resultados, incluyendo el análisis estadístico.

Tesis Doctoral


xv

Abreviaturas

AAA: aromatic amino acids, aminoácidos aromáticos

Actb: beta-actin, beta actina

AP1: activator protein 1, proteína activadora 1

ACOX: acyl-coenzyme A oxidase, acil-coenzima A oxidasa

ATRA: all-trans retinoic acid, ácido retinoico todo-trans

ATP5F1: ATP Synthase, H+ Transporting, Mitochondrial Fo Complex Subunit B1, ATP

sintasa subunidad b, mitocondrial

ARAT: acyl-CoA-retinol-acyltransferase, acilCoA-retinol aciltransferasa

AR: retinoic acid, ácido retinoico

BCAA: branched chain amino acids, aminoácidos de cadena ramificada

BC: -carotene, -caroteno

BCO1: -carotene 15,15’-oxygenase 1, -caroteno 15,15’-oxigenasa

CD36: cluster of differentiation 36, transportador de ácidos grasos CD36

CD137: Tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 9, miembro de

superfamilia del receptor de TNF9

C/EBPs: CCAAT-enhancer-binding proteins, proteínas de unión al potenciador CCAAT

COX: cytochrome c oxidase, citocromo c oxidasa

CPT: carnitine palmitoyltransferase, carnitina palmitoil transferasa

CRABPs: cellular retinoic acid binding proteins, proteínas celulares de unión a ácido

retinoico

CRBPs: cellular retinol binding proteins, proteinas celulares de unión a retinol

CYP26: cytochrome P450, citocromo P450

DNMTs: DNA methyltransferasea, ADN metiltransferasas

DHA: docosahexaenoic acid, ácido docosahexaenoico

EPA: eicosapentaenoic acid, ácido eicosapentaenoico

FABP5: fatty acid binding protein 5, proteína 5 de unión a ácido graso

FASN: fatty acid synthase, sintasa de ácidos grasos

FNDC5: fibronectin type III domain containing 5

FXR: farnesoid X receptor, receptor de farnesoide X

GNMT: glycine N-methyltransferase, N-glicina metiltransferasa

HOXC9: homeobox C9, proteína homeobox C9

LDLr: low density lipoprotein receptor, receptor de lipoproteínas de baja densidad

LPL: lipoprotein lipase, lipoproteina lipasa

LRAT: lecithin retinol acyltransferase, lecitina retinol aciltransferasa

Tesis Doctoral


xvi

LXRs: liver X receptor, receptores X hepáticos

NA: noradrenaline, noradrenalina

PCNA: proliferating cell nuclear antigen, antígeno nuclear de células proliferativas

PBMCs: peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares de sangre periférica

PPARs: peroxisome proliferator-activated receptors, receptores activados por

proliferadores de peroxisomas

p38 MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase, proteína quinasa activada por

mitógenos p38

RARs: retinoic cid receptors, receptores de acido retinoico

RARE: retinoic acid response element, elemento de respuesta a ácido retinoico

RALDH: retinaldehyde dehydrogenase, retinaldehído deshidrogenasa

RBP (RBP4): retinol binding protein, proteina de union a retinol

RDH: retinol dehydrogenase, retinol deshidrogenasa

RE: retinyl ester, éster de retinilo

REH: retinyl ester hydrolase, retinil ester hidrolasa

RXRs: retinoic X receptors, receptores X de retinoides

SAM: S-adenosyl methionine, S-adenosil metionina

SLC27A1: solute carrier family 27 (fatty acid transporter), member 1, miembro 1 de la

familia 27 de transportadores de solutos

STRA6: stimulated by retinoic acid 6, estimulada por ácido retinoico 6 (receptor de RBP)

SVF: fracción estromal vascular

TAB: tejido adiposo blanco

TAM: tejido adiposo marrón

TBX1: T-box transcription factor 1, proteína T-box 1

TR: thyroid hormone receptor, receptor de hormonas tiroideas

TMEM26: transmembrane protein 26, proteína trasnmembrana 26

TFB2M: transcription factor B2, mitochondrial, factor de transcripción mitocondrial B2

UCP1: uncoupling protein 1, proteína desacoplante 1

UCP2: uncoupling protein 2, proteína desacoplate 1

VDR: vitamin D receptor, receptores de vitamina D

YY1: YY1 transcription factor, factor de transcripción YY1

ZFP423: zinc finger protein 423, proteína zinc-finger 423

1. Introducción

Tesis Doctoral


18

Introducción

19

1.1. La vitamina A y el metabolismo de los retinoides

La vitamina A es un micronutriente liposoluble esencial para los seres humanos y otros

vertebrados que comprende un grupo de compuestos naturales relacionados estructural y

bioquímicamente con el retinol. Las diferentes formas activas de la vitamina A, más sus

metabolitos y análogos sintéticos, se denominan colectivamente retinoides. Estos se

definen como compuestos formados por cuatro unidades isoprenoides unidas cabeza con

cola. La estructura básica de un retinoide se compone de tres partes: un anillo ciclohexano

trimetilado hidrofóbico, una cadena lateral tetraeno conjugada y un grupo terminal polar

con un estado de oxidación que puede variar, siendo un grupo hidroxilo en el retinol,

aldehído en el retinal y carboxilo en los ácidos retinoicos, como se muestra en la Figura 1.1

(Das et al., 2014; de Oliveira et al., 2015).

Figura 1.1. Estructura de los retinoides. Adaptado de (Das et al., 2014).

Los retinoides son importantes para una gran variedad de funciones fisiológicas, entre ellas

la reproducción, la embriogénesis, la visión, el crecimiento, la diferenciación y

proliferación celular, el mantenimiento de la integridad de los epitelios y la función inmune

(Blomhoff and Blomhoff, 2006; von Lintig, 2010). Como se introducirá más adelante, más

recientemente se ha relacionado a la vitamina A con el control del metabolismo lipídico y

energético y la adiposidad corporal en mamíferos. Las formas biológicamente activas de la

vitamina A incluyen el cis y el trans retinol, el retinal todo-trans y 11-cis y el ácido retinoico

(AR) todo-trans y 9-cis, entre otros (Rhee and Plutzky, 2012). Clásicamente, el retinol,

además de ser el precursor de los demás retinoides, ha sido relacionado con la fertilidad, el

retinal (también llamado retinaldehído) con la visión y el AR con la regulación de la

expresión génica (véase el apartado 1.1.2). En la Figura 1.2 se representan las principales

formas activas de la vitamina A y sus interconversiones.

El metabolismo de los retinoides es muy complejo y altamente especializado e incluye la

acción de diferentes enzimas y proteínas intra y extracelulares de unión a retinoides

(D'Ambrosio et al., 2011; Gottesman et al., 2001; Harrison, 2012; Theodosiou et al., 2010).

Estas proteínas de unión ayudan a la solubilización de los retinoides en medio acuoso y

permiten dirigir los diferentes retinoides hacia las enzimas que los metabolizan u otras

dianas celulares particulares. En la Figura 1.3 se presenta un esquema del metabolismo de

la vitamina A.

Tesis Doctoral


20

Figura 1.2. Estructura química de los principales retinoides naturales biológicamente activos.

Adaptado de (Bonet et al., 2003).

La vitamina A se obtiene de la dieta, en la que se encuentra principalmente en forma de

retinol o ésteres de retinilo y de carotenoides provitamina A, sobre todo el β-caroteno, que

se derivan de fuentes animales y vegetales, respectivamente. Después del consumo, el

retinol dietético, los ésteres de retinilo y los carotenoides son liberados de la matriz del

alimento. La absorción de estos micronutrientes liposolubles se produce en el tracto

gastrointestinal superior de forma similar a la de otros lípidos dietéticos, después de la

dispersión micelar de la grasa de la dieta en el estómago y el duodeno (de Oliveira et al.,

2015). En los enterocitos, los ésteres de retinilo son hidrolizados por acción de la enzima

retinil ester hidrolasa (REH) para dar retinol, y parte del β-caroteno dietético es escindido

centralmente por la enzima β-caroteno 15,15’-oxigenasa (BCO1) en dos moléculas de

retinal, que a su vez es reducido a retinol por acción de enzimas deshidrogenasas. La

absorción intestinal del β-caroteno y su conversión en retinoides en los enterocitos es

dependiente del estatus en vitamina A, merced a un mecanismo de retroalimentación

negativa que implica la inducción por AR en los enterocitos de ISX; este es un factor de

transcripción específico del intestino delgado que inhibe la expresión de la enzima BCO1

y del receptor implicado en la absorción intestinal del β-caroteno (Lobo et al., 2010). El

retinol en los enterocitos se une a una proteína celular de unión (CRBP) y en esta forma es

sustrato para enzimas que catalizan su esterificación a un ácido graso, como la lecitina

retinol aciltransferasa (LRAT) y otras aciltransferasas. Los ésteres de retinilo resultantes,

junto con carotenoides intactos, son incorporados en los quilomicrones, que se secretan en

la linfa para pasar después a la circulación general.

Gran parte de la vitamina A de la dieta llega al hígado mediante endocitosis de los

quilomicrones remanentes que resultan de la hidrólisis de los quilomicrones circulantes por

la enzima lipoproteína lipasa (LPL). El hígado es el principal reservorio de vitamina A, en

forma de ésteres de retinilo. El retinol hepático puede ser movilizado y pasa a la circulación

unido a la proteína de unión a retinol RBP (también conocida como RBP4), a la que se le

une otra proteína, la transtiretina (TTR). La unión de la TTR impide la eliminación de los

complejos retinol-RBP por el riñón (RBP es una proteína muy pequeña). Los tejidos

Introducción

21

extrahepáticos toman el retinol de los complejos retinol-RBP-TTR: en este proceso

interviene, al menos en algunos tejidos, la proteína de la membrana plasmática STRA6

(estimulada por ácido retinoico 6), que es un receptor de alta afinidad para la RBP (Das et

al., 2014). Algunos tejidos periféricos, incluyendo el tejido adiposo, también pueden captar

el retinol de los ésteres de retinilo contenidos en las lipoproteínas circulantes, tras su

hidrólisis catalizada por la LPL (Theodosiou et al., 2010). El tejido adiposo es un reservorio

importante de vitamina A y puede, como el hígado, exportar retinol a la circulación unido

a RBP.

Figura 1.3. Metabolismo de la vitamina A en los adipocitos. Adaptado de (Bonet et al., 2003).

Abreviaturas: 9cRA, ácido 9-cis retinoico; tRA, ácido retinoico todo-trans; CRABP, proteína

celular de unión a ácido retinoico; CRBP, proteína celular de unión a retinol; LPL, lipoproteína

lipasa; NR, receptor nuclear hormonal; RAR, receptor de ácido retinoico; RXR, receptor rexinoide;

RBP, proteína de unión a retinol.

Después de entrar en las células, el retinol se une a la CRBP y unido a esta proteína es

transformado en ésteres de retinilo (por acción de la LRAT) u oxidado a retinaldehído (por

acción de la retinol deshidrogenasa, RDH, o de alcohol deshidrogenasas).

Subsiguientemente, el retinaldehído puede ser oxidado irreversiblemente a la forma

carboxílica, el AR, por acción de la retinaldehído deshidrogenasa (RALDH, también

llamada aldehído deshidrogenasa, ALDH). El AR se une a las proteínas celulares de unión

a ácido retinoico (CRABPs) o a la proteína 5 de unión de ácidos grasos (FABP5), que están

involucradas en el transporte del AR al núcleo y la transferencia del AR a receptores

nucleares específicos que mediarán efectos genómicos (véase el apartado 1.1.1). Dentro de

las células, el AR puede ser convertido en catabolitos oxidados inactivos, tales como ácido

4-hidroxi-retinoico y ácido 4-oxo retinoico, por enzimas de la superfamilia citocromo P450

(como CYP26A1) (Das et al., 2014).

Tesis Doctoral


22

La eficiencia de la escisión intestinal del β-caroteno en retinoides depende de la especie.

Las ratas adultas y ratones son muy eficientes, mientras que los seres humanos y otros

mamíferos como los caballos y los hurones lo son mucho menos. En las especies menos

eficientes, una cantidad sustancial del β-caroteno absorbido (aproximadamente del 17% al

45%) escapa a la escisión intestinal, es incorporado en los quilomicrones y viaja asociado

a lipoproteínas circulantes. Los carotenoides (dietéticos o contenidos en las lipoproteínas

circulantes) son captados por las células a través de receptores específicos de lipoproteínas

‒ tales como SR-BI (que es el receptor de las HDL), el receptor de lipoproteínas de baja

densidad (LDLr) o la misma LPL ‒ o el receptor de ácidos grasos CD36 (Shete and Quadro,

2013). El hígado, el tejido adiposo, el riñón, la piel y los pulmones son los principales sitios

de acumulación de β-caroteno y carotenoides en general (Shete and Quadro, 2013). Las

enzimas del metabolismo de carotenoides ‒ la ya citada BCO1 y la β-caroteno 9',10'-

oxigenasa (BCO2) ‒ se expresan en muchos tejidos, además de los enterocitos. BCO1

cataliza la rotura central del β-caroteno y algunos otros carotenoides provitamina A (-

caroteno, β-criptoxantina), para dar retinal. BCO2 cataliza la rotura excéntrica del β-

caroteno y de otros muchos carotenoides incluyendo licopeno y xantofilas para dar

apocarotenoides distintos de los retinoides, cuya actividad biológica es todavía mal

conocida (von Lintig, 2010).

1.1.1. Mecanismos de acción de los retinoides

Los retinoides son ligandos para factores de transcripción específicos que pertenecen a la

superfamilia de los receptores nucleares. Se han identificado dos clases distintas de

receptores de retinoides, los RARs (retinoic acid receptors) y los RXRs (retinoid X

receptors). Cada clase se compone de tres subtipos diferentes (α, β y ), cada subtipo

codificado por un gen distinto. El ácido retinoico todo-trans (ATRA) es el ligando natural

(endógeno) de los RAR. Su isómero cis, el ácido 9-cis-retinoico, puede activar tanto a los

RAR como a los RXR, al menos in vitro, y se ha venido considerando el ligando endógeno

natural de los RXR. No obstante esto último se ha puesto en duda, lo mismo que la propia

presencia de ácido 9-cis-retinoico en muchos tejidos, en los que no se detecta; la excepción

es el páncreas, en donde sí está presente (Zhang et al., 2015).

Más de 500 genes responden a ATRA o ácido retinoico 9-cis (Balmer and Blomhoff, 2002).

La expresión de la mayoría de genes diana de retinoides está controlada por heterodímeros

RAR:RXR; unos pocos genes están controlados por homodímeros RXR:RXR. Los dímeros

RAR:RXR y RXR:RXR reconocen secuencias específicas de ADN, que se denominan

elementos de respuesta a ácido retinoico (RAREs) y elementos de respuesta a retinoide X

(RXRE), respectivamente, ubicadas en regiones reguladoras de los genes diana

(promotores, enhancers). La unión de sus ligandos específicos permite que estos factores

de transcripción puedan disociarse de correpresores y pasar a reclutar coactivadores

transcripcionales, que ayudan al ensamblaje de la maquinaria general de transcripción sobre

el promotor mínimo del gen diana.

Además de lo anterior, los retinoides afectan la expresión génica por mecanismos

adicionales (Al Tanoury et al., 2013; Bonet et al., 2012; Zhang et al., 2015):

Introducción

23

- Además de activar a los RARs canónicos, se ha descrito que ATRA es un ligando

agonista de otro factor de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares, el

PPAR/, que es un miembro de la subclase de receptores activados por proliferadores

de peroxisomas (PPARs). PPAR/ activa la transcripción de genes relacionados con la

oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de la glucosa (Zhang et al., 2015). Se ha

aportado evidencia de que, dentro de las células, el ATRA unido a CRABPs es

transferido a RARs, y el unido a FABP5, al PPAR/ (Schug et al., 2007).

- Los receptores de retinoides activados por ligando pueden interferir con la actividad

de otros factores de transcripción tales como el factor nuclear B, la proteína activadora

1 (AP1) o las proteínas de unión al potenciador CCAAT (C/EBPs), lo que explicaría

buena parte de los efectos anti-inflamatorios, anti-proliferativos y anti-adipogénicos

descritos para los retinoides.

- Los RXRs son socios de dimerización obligatorios de muchos otros receptores

nucleares además de los RAR, tales como los PPARs (PPAR, PPAR y PPAR/), los

receptores X hepáticos (LXRs), el receptor de vitamina D (VDR), el receptor de

farnesoides X (FXR) y el receptor de hormonas tiroideas (TR). Algunos de estos

heterodímeros incluyendo PPAR:RXR se activan en respuesta a los respectivos

ligandos de ambos monómeros constituyentes, lo que proporciona un mecanismo para

efectos generalizados de los retinoides sobre la expresión génica (Aranda and Pascual,

2001).

Por otro lado, los retinoides tienen efectos genómicos y extra-genómicos que se derivan de

su capacidad (mediada o no por RARs) de activar importantes proteína quinasas

reguladoras, como la proteína quinasa activada por mitógenos p38 (p38 MAPK) y otras, y

de la reitoinilación de proteínas celulares por unión covalente a las mismas de AR, entre

otros mecanismos (Al Tanoury et al., 2013; Bonet et al., 2012; Zhang et al., 2015).

Otros retinoides distintos del ATRA, como el retinaldehído, así como derivados de

carotenoides diferentes de los retinoides (por ejemplo, apocarotenoides resultado de la

rotura excéntrica por BCO2) pueden interaccionar asimismo con receptores nucleares, para

promover o antagonizar, según el caso, la acción de estos factores de transcripción sobre

sus genes diana. Incluso moléculas intactas de carotenoides parecen ser capaces de

interactuar físicamente con receptores nucleares afectando su actividad transcripcional: en

particular, la astaxantina podría comportarse como un ligando antagonista del PPAR y la

-criptoxantina, como un ligando agonista de RAR (revisado en (Bonet et al., 2015)).

1.2. Actividad de la vitamina A en el control del metabolismo lipídico y energético, la

adiposidad corporal y la obesidad

La obesidad se define como un exceso de masa grasa resultado de un balance energético

positivo sostenido (más energía consumida que gastada), que conduce a una expansión

anormalmente grande de los depósitos grasos, ya sea por un almacenamiento excesivo de

energía en gotas de lípidos en los adipocitos, con aumento del tamaño de estos (obesidad

hipertrófica), y/o por el aumento de la adipogénesis, que conduce a un incremento del

Tesis Doctoral


24

número de adipocitos (obesidad hiperplásica) (Rutkowski et al., 2015). La cantidad y

distribución de la grasa corporal son factores determinantes de la susceptibilidad a muchos

trastornos metabólicos, siendo la grasa visceral especialmente deletérea, más que la

subcutánea, que podría incluso tener un efecto protector (Bays, 2011).

En los últimos años se ha consolidado el concepto de que, además de sus funciones clásicas,

la vitamina A, principalmente en forma de AR, participa en el control del metabolismo y

el balance energético en mamíferos, con implicaciones para la adiposidad corporal, la

obesidad y sus secuelas (Brun et al., 2013; Jeyakumar and Vajreswari, 2015; Zhang et al.,

2015). Esta es una línea de investigación en la que nuestro grupo de Nutrigenómica y

Obesidad de la UIB ha sido pionero y a la que ha hecho numerosas aportaciones, incluyendo

varias revisiones (Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Bonet et al., 2015). En general,

diversos resultados experimentales y epidemiológicos que se relacionan a continuación

apuntan a una acción anti-adiposidad de la vitamina A y el -caroteno, que vendría mediada

por retinoides como el ATRA:

- El tratamiento con ATRA exógeno contrarresta el desarrollo de obesidad inducida por la

dieta en ratones y reduce el peso y la adiposidad corporal en ratones obesos y no obesos, a

la vez que mejora el perfil lipídico y la sensibilidad a la insulina.

- La suplementación crónica de la dieta con -caroteno reduce la adiposidad corporal en

ratones de genotipo salvaje pero no en ratones genoanulados carentes de BCO1. Esto estaría

de acuerdo con un efecto anti-adiposidad de los retinoides derivados de la acción de la

BCO1 sobre el -caroteno.

- En estudios en animales, una dieta deficiente en vitamina A se ha asociado a una mayor

adiposidad corporal, mientras que, en el otro extremo, la suplementación de la dieta con

vitamina A en forma de retinil éster se ha asociado a una adiposidad reducida en algunos

estudios, aunque no en otros.

- Modelos dietéticos y genéticos de obesidad en ratones presentan una deficiencia en

vitamina A (retinol) en tejidos (pero no plasma) y una menor señalización transcripcional

por vitamina A en tejidos (Trasino et al., 2015).

- En humanos, numerosos estudios epidemiológicos han encontrado niveles reducidos de

carotenoides circulantes en la obesidad/sobrepeso y el síndrome metabólico. Es más, se ha

reportado que los niveles de -caroteno están reducidos no sólo en plasma sino también en

los adipocitos de humanos obesos (Osth et al., 2014).

- También hay estudios en humanos que asocian ingestas dietéticas altas de vitamina A y

carotenoides con una menor adiposidad corporal.

- Aunque no esté claro que los niveles endógenos (circulantes y en los tejidos) de ATRA

guarden una relación directa con el estatus en vitamina A, es de destacar que se ha

identificado el ATRA circulante como un factor protector frente al desarrollo del síndrome

metabólico en humanos (Liu et al., 2016).

- Para carotenoides específicos, entre ellos el β-caroteno y la β-criptoxantina, ambos con

actividad de provitamina A, se ha postulado una acción anti-obesidad a partir de los

Introducción

25

resultados de estudios experimentales y estudios piloto de intervención en humanos obesos.

En conjunto, se sugiere que una ingesta pobre en vitamina A/carotenoides super-impuesta

a una dieta obesogénica sería un factor que favorecería la ganancia de un exceso de

adiposidad. La acción anti-obesidad de los retinoides se ha atribuido a sus efectos en

diferentes tejidos y muy especialmente el tejido adiposo.

1.2.1. Efectos de los retinoides en los tejidos adiposos

Los depósitos adiposos configuran un órgano cuyo metabolismo, plasticidad y actividad

secretora es clave en la regulación de la homeostasis energética a nivel sistémico.

Clásicamente se consideran dos grandes tipos de tejido adiposo, el tejido adiposo blanco

(TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM). La principal función del TAB es almacenar el

exceso de energía en forma de triglicéridos para movilizarla en condiciones de escasez,

además de secretar hormonas y citoquinas importantes para regular el metabolismo

energético y la sensibilidad a la insulina. El TAM, por su parte, está especializado en la

disipación regulada de energía en forma de calor (termogénesis adaptativa), a través de la

proteína desacoplante 1 (UCP1), un desacoplador natural del sistema de fosforilación

oxidativa mitocondrial, que se expresa de manera exclusiva en los adipocitos marrones. El

proceso llamado de marronización (browning) consiste en la aparición, en los depósitos de

TAB, de células con capacidades metabólicas oxidativas y termogénicas semejantes a las

de los adipocitos marrones. Las células resultantes se han denominado brite (del inglés

brown-in-white, marrón-en-blanco) o beige; estas células podrían expresar proteínas

marcadoras específicas diferenciales, además de proteínas en común con los adipocitos

marrones y otras en común con los adipocitos blancos (Walden et al., 2012; Wu et al.,

2012). La marronización del TAB se da en respuesta a estímulos y agentes específicos,

muchos de los cuales también activan la función termogénica del TAM, incluyendo en

roedores la exposición al frío, los agonistas beta-adrenérgicos y diferentes estímulos

hormonales y nutricionales, entre ellos los retinoides (Bonet et al., 2013; Giralt and

Villarroya, 2013; Lo and Sun, 2013).

El órgano adiposo es un importante reservorio de vitamina A (retinol) y de -caroteno y

otros carotenoides. Se ha estimado que, en roedores, un 15-20% de todo el retinol corporal

se encuentra en el tejido adiposo, en particular en los adipocitos, mayoritariamente como

retinol no esterificado (Tsutsumi et al., 1992). El contenido en retinol en diferentes

depósitos de TAB (i.e., visceral y subcutáneo) y en TAM es similar. Además de retinol, en

el tejido adiposo se han podido detectar otros retinoides, como ATRA y retinaldehído

(Kane et al., 2008a; Kane et al., 2008b; Perumal et al., 2016) y es destacable que el ATRA

endógeno es mucho más abundante en los depósitos de TAB que en otros tejidos (Kane et

al., 2008a; Kane et al., 2008b; Perumal et al., 2016). Los adipocitos expresan las proteínas

necesarias para almacenar el retinol, movilizarlo y oxidarlo a AR, incluyendo las enzimas

BCO1 y BCO2 (Hessel et al., 2007; Landrier et al., 2012; Tourniaire et al., 2009) y la

producción de RBP (Tsutsumi et al., 1992). Esta última hace posible la exportación del

retinol de origen adipocitario a la circulación. Los adipocitos también expresan los

receptores de retinoides (RAR y RXR), de manera que pueden responder a los retinoides.

Se han descrito diferencias entre TAB y TAM en los patrones de expresión de las diferentes

Tesis Doctoral


26

isoformas de receptores de retinoides, lo que sugiere que la regulación de la expresión

génica por retinoides podría ser diferente en TAB y TAM: RAR, RARγ y RXR son

altamente expresados en el TAB, mientras que RARβ y RXRγ se expresan más en el TAM

(Landrier et al., 2012).

El retinol y los carotenoides provitamínicos almacenados en los adipocitos pueden servir

para regular la homeostasis de la vitamina A en el organismo, al nivel sistémico. Al mismo

tiempo, cabe esperar que las acciones de los retinoides sean importantes para la biología de

los tejidos adiposos. De hecho, numerosos estudios indican que retinoides como el

retinaldehído y principalmente el ATRA modulan aspectos clave de la biología del tejido

adiposo, incluyendo la diferenciación, la expansión hipertrófica, la capacidad para la

oxidación de grasas y la termogénesis, y la función secretora de los adipocitos (Bonet et

al., 2003; Bonet et al., 2012; Brun et al., 2013; Jeyakumar and Vajreswari, 2015).

El tratamiento con retinoides, especialmente ATRA, tiene los siguientes efectos destacados

sobre el metabolismo de los tejidos adiposos, de acuerdo a lo reportado en la literatura:

a) Inducción de la expresión de UCP1 y la termogénesis en el TAM. En el enhancer

distal del gen Ucp1 hay elementos de respuesta a RAR y el tratamiento con ATRA induce

la expresión de UCP1 y promueve el metabolismo oxidativo en el TAM, tanto in vivo como

en modelos celulares. Estos efectos dependen de la activación de RAR, RXR y la p38

MAPK. Estas acciones genómicas y no genómicas coordinadas podrían dar lugar a un gran

aumento de la actividad transcripcional en el promotor de UCP1 (Landrier et al., 2012). Es

más, estudios nutricionales en roedores muestran que la capacidad termogénica (contenido

en UCP1) del TAM disminuye cuando la alimentación es crónicamente deficiente en

vitamina A y aumenta con la suplementación dietética en vitamina A en forma de éster de

retinilo (Bonet et al., 2000; Bonet et al., 2003; Kumar et al., 1999). Por tanto, el estatus en

vitamina A parece ser un regulador fisiológico del sistema termogénico del TAM.

b) Inhibición de la adipogénesis y la lipogénesis en el TAB. El ATRA es un conocido

inhibidor de la adipogénesis, el proceso de diferenciación de adipocitos a partir de células

precursoras. Lo hace por diversos mecanismos no excluyentes. El RAR con ligando

(ATRA) unido interfiere con la actividad de un factor de transcripción temprano en la

cascada adipogénica, el C/EBP (Schwarz et al., 1997), a través de la inducción

dependiente de RAR de una proteína inhibidora del C/EBP, la Smad3 (Marchildon et al.,

2010). Además, por la vía CRABP-RAR, el ATRA induce la expresión en los preadipocitos

de proteínas específicas que inhiben la adipogénesis, en particular Pref-1, Sox9 y KLF2

(Berry et al., 2012). La inhibición de la adipogénesis es uno de los mecanismos mediante

los cuales el tratamiento crónico con ATRA contrarresta el desarrollo de obesidad inducida

por alimentación crónica con dieta rica en grasa en ratones (Berry et al., 2012; Noy, 2013).

Además de inhibir la formación de nuevas células adiposas, el ATRA favorece la

delipidación de los adipocitos maduros al inhibir la expresión y actividad en estas células

del PPAR. Este receptor nuclear es necesario para el mantenimiento del fenotipo del

adipocito maduro (Tamori et al., 2002) y para la hipertrofia de los adipocitos inducida por

una dieta rica en grasa (Kubota et al., 1999), aparte de ser esencial para la diferenciación

Introducción

27

adiposa. Proteínas producto de genes diana del PPAR facilitan la captación y activación

de los ácidos grasos para la síntesis de triacilgliceroles y la formación y el mantenimiento

de las gotas lipídicas, y la supresión de la actividad del PPAR en los adipocitos favorece

la movilización de la grasa almacenada en ellos (Tamori et al., 2002). La reducción de la

adiposidad corporal en ratones tras el tratamiento agudo con ATRA se correlaciona con la

regulación a la baja del PPARγ en los depósitos de TAB y TAM (Ribot et al., 2001).

También la reducción de la adiposidad corporal en ratones con BCO1 funcional

suplementados con BC está ligada a la represión del PPAR y sus genes diana en el TAB,

como lo indican distintos tipos de análisis incluido el análisis transcriptómico (Amengual

et al., 2011). Finalmente, en adipocitos 3T3-L1 maduros en cultivo se ha demostrado que

la exposición a BC reduce la expresión de PPAR y genes diana de PPAR y el contenido

en lípidos, al tiempo que da lugar a la producción de ATRA (Lobo et al., 2010).

c) Incremento del metabolismo oxidativo e inducción del proceso de marronización

del TAB. Se ha descrito que el tratamiento con ATRA in vivo promueve la remodelación

del TAB a un tejido más oxidativo, en particular más activo en la oxidación de grasas, con

inducción de la expresión de UCP1 en el TAB subcutáneo (inguinal) (Mercader et al.,

2006). Hay también evidencia de un efecto marronizador del ATRA en modelos celulares

de adipocitos (Mercader et al., 2007; Mercader et al., 2010; Tourniaire et al., 2015). El

precursor directo del ATRA, el retinaldehído, también ha sido descrito como un agente

promotor de la marronización del TAB (Kiefer et al., 2012).

1.2.2. Efectos de los retinoides en otros tejidos

El tratamiento con ATRA en modelos animales in vivo no sólo activa el metabolismo

oxidativo en los tejidos adiposos; también en hígado (Amengual et al., 2010) y músculo

esquelético (Amengual et al., 2008), donde se induce la expresión de genes relacionados

con la oxidación de ácidos grasos y la disipación de energía. En conjunto, los efectos del

ATRA en los diferentes tejidos contribuyen a la reducción de la adiposidad corporal y

conllevan, en dichos modelos animales, una mejora del perfil lipídico del plasma y de la

sensibilidad a la insulina (Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Das et al., 2014). La

activación del metabolismo oxidativo por ATRA ha sido relacionada con la activación de

los RAR y del PPARß/δ (Bonet et al., 2012; Noy, 2013).

1.3. Retinoides y biomarcadores metabólicos

Contar con biomarcadores del estatus del metabolismo oxidativo y termogénico en los

tejidos, incluyendo la marronización del TAB, es de interés en el contexto del tratamiento

de la obesidad y sus co-morbilidades. Los modelos animales de tratamiento con retinoides

pueden ser instrumentales en la identificación de este tipo de biomarcadores, dados sus

efectos sobre el metabolismo oxidativo en TAB y otros tejidos.

Un biomarcador es una característica que puede ser objetivamente medida y evaluada como

un indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos o respuestas a una

intervención terapéutica (Feigin, 2004). Los biomarcadores se utilizan como herramientas

en el diagnóstico y la detección temprana de la enfermedad, el pronóstico o la predicción

Tesis Doctoral


28

del resultado del tratamiento. Pueden proporcionar la base para el diseño, mejorar la

seguridad y la eficiencia y explicar los resultados empíricos de los ensayos clínicos

(Choong and Tsafnat, 2012). Idealmente, un biomarcador debe ser no invasivo y fácil de

obtener, además de fácil de medir, específico, sensible, cuantitativo y relacionado con el

mecanismo bioquímico. Para poder realizar tratamientos e intervenciones terapéuticas

tempranas, más que biomarcadores de enfermedad es necesario contar con biomarcadores

de salud, que permitan evaluar el estatus metabólico y detectar desviaciones de la

homeostasis en fases iniciales.

La investigación en animales puede ayudar a desvelar biomarcadores tisulares del estado

metabólico y de salud o de los efectos de fármacos o dietas en tejidos tales como tejido

adiposo, músculo o hígado. Este tipo de biomarcadores puede ser de gran utilidad de cara

a la investigación en animales en nuevas estrategias de intervención, por ejemplo

farmacológica o nutricional. Sin embargo, en voluntarios humanos es difícil disponer de

este tipo de tejidos. Interesan, por tanto, especialmente biomarcadores que residan en

fluidos biológicos fácilmente accesibles, entre ellos muy especialmente la sangre. Tanto las

células sanguíneas como los metabolitos presentes en la sangre pueden ser una fuente de

biomarcadores.

De las células sanguíneas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) ‒ que

comprenden principalmente monocitos y linfocitos, células del sistema inmunitario ‒

presentan características que las hacen especialmente interesantes para ser utilizadas como

fuente de biomarcadores de salud sistémica (de Mello et al., 2012). Las PBMC circulantes

entran en contacto con los diferentes tejidos y están expuestas a factores ambientales y

metabólicos. Las PBMC expresan aproximadamente el 80% de los genes codificados por

el genoma humano y su perfil de expresión génica puede reflejar la presencia y la extensión

de diferentes condiciones fisiopatológicas como la hipertensión, el cáncer, la aterosclerosis,

o el lupus eritematoso sistémico, entre otras (Liew et al., 2006). También se han demostrado

diferencias en el transcriptoma de las PBMC entre humanos normopeso y con diferentes

grados de obesidad, que reflejan la progresión de la inflamación del tejido adiposo y de

trastornos metabólicos asociados a la obesidad y que afectan a genes relacionados con el

metabolismo energético (Jung et al., 2016). La expresión génica en PBMC también se ve

afectada por fármacos y por factores dietéticos. En estudios nutricionales en animales, por

ejemplo, las PBMC son una fuente potencial de biomarcadores transcriptómicos para

probar la eficacia de estrategias dietéticas para la pérdida de peso (Reynes et al., 2015) y

para estudiar las alteraciones metabólicas causadas por la ingesta de dietas con una

composición desequilibrada en macronutrientes (Reynés et al., 2016). Resultados recientes

de nuestro grupo han mostrado que, en ratones tratados con ATRA, la expresión génica en

sangre total refleja algunos de los cambios de expresión de genes metabólicos que se

producen en el hígado y los tejidos adiposos relacionados con la capacidad de oxidación de

ácidos grasos, la termogénesis y la remodelación del TAB (Petrov et al., 2016a).

La metabolómica permite analizar una gran cantidad de metabolitos en matrices complejas

como biofluidos y tejidos de manera automatizada y relativamente rápida y es de gran

interés de cara al descubrimiento de biomarcadores tempranos de desviaciones de la

Introducción

29

homeostasia metabólica. La metabolómica de plasma u orina se ha utilizado en numerosos

estudios para identificar biomarcadores asociados al desarrollo de obesidad y las

alteraciones metabólicas que frecuentemente acompañan a la obesidad (Rauschert et al.,

2014). Aunque menos explotado, el metaboloma de las PBMC también puede ser

informativo, especialmente si se puede cotejar con el metaboloma del plasma. Entre los

posibles biomarcadores de obesidad identificados mediante estudios metabolómicos

destacan las acilcarnitinas, los aminoácidos de cadena ramificada y aromáticos, los ácidos

grasos no esterificados, ácidos orgánicos y fosfolípido (Rauschert et al., 2014). Cambios

de estos marcadores han sido relacionados con alteraciones del metabolismo energético que

serían frecuentes en la obesidad.

En esta tesis hemos querido ahondar en la interacción de la vitamina A con el metabolismo

oxidativo en los tejidos y en la identificación de biomarcadores asociados a esta interacción.

Para la identificación de biomarcadores circulantes, hemos analizado la expresión génica

en PBMC de genes puntuales candidatos y aplicado metabolómica dirigida en PBMC y

plasma, comparando ratones tratados con ATRA y sus controles. El análisis metabolómico

ha incluido fundamentalmente acilcarnitinas, que se introducen a continuación con más

detalle, y aminoácidos.

1.3.1. Acilcarnitinas como biomarcadores: origen y significado biológico

Las acilcarnitinas son metabolitos intermediarios oxidativos que comprenden un grupo

acilo esterificado a una molécula de carnitina. Son generadas por enzimas mitocondriales

y peroxisomales, como la carnitina palmitoil transferasa 1 (α) y la carnitina palmitoil

transferasa 2 (CPT2), y funcionan en el transporte transmembrana de grupos acilo (McCoin

et al., 2015; Reuter and Evans, 2012; Schooneman et al., 2013).

La mayor parte de las acilcarnitinas se derivan de la beta-oxidación mitocondrial de ácidos

grasos. Para poder entrar en las mitocondrias, los ácidos grasos de cadena larga (de 14 o

más C) tienen que ser convertidos de acil-CoA (su forma activa) a la correspondiente

acilcarnitina por acción de la CPT1, que se localiza en la membrana mitocondrial externa.

La acilcarnitina resultante entra en la matriz mitocondrial vía un transportador específico

(la carnitina-acilcarnitina translocasa) y aquí es reconvertida en acil-CoA por acción de la

CPT2, que está asociada a la membrana mitocondrial interna. El acil-CoA es sustrato de la

beta-oxidación mitocondrial, que rinde en cada ciclo sucesivo una unidad de acetil-CoA y

coenzimas reducidos que alimentan el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones

para la obtención de energía, junto con el acil-CoA acortado en 2 C.

Si la llegada de combustible excede la capacidad de producción de energía, es decir, si se

produce más acetil-CoA del que el ciclo de Krebs puede absorber, se acumulan en la

mitocondria acetil-CoA y acil-CoA intermediarios. A partir del exceso de acetil-CoA se

sintetizan cuerpos cetónicos, acetato y acetilcarnitina (AC2:0). Esta última es la

acilcarnitina más corta, y se forma en reacción catalizada por la carnitina acetil transferasa,

una enzima de la matriz mitocondrial que tiene preferencia por los ésteres de acilo de

cadena corta. Además, bajo estas condiciones la CPT2 puede funcionar en sentido opuesto

y reconvertir los acil-CoAs de cadena larga que no están siendo metabolizados en las

Tesis Doctoral


30

correspondientes acilcarnitinas. La acetilcarnitina y demás acilcarnitinas pueden salir de la

mitocondria al citosol celular y en último término fuera de la célula. Este es un mecanismo

importante para evitar el secuestro del CoA-SH mitocondrial en forma de acil-CoAs y los

efectos nocivos del exceso de acetil-CoA y acil-CoA de cadena larga sobre la función de

las mitocondrias, incluyendo la inhibición de la oxidación de glucosa (por inhibición de la

piruvato deshidrogenasa por el exceso de acetil-CoA) (Aguer et al., 2015; Noland et al.,

2009; Schooneman et al., 2013) (Figura 1.4).

Figura 1.4. Generación y transporte de acilcarnitinas de cadena larga. Adaptado de (Noland et al.,

2009). Abreviaturas: CPT1, carnitina palmitoil transferasa 1; CPT2, carnitina palmitoil transferasa

2; CACT, carnitna-acilcarnitina translocasa; LCAC, acilcarnitinas de cadena larga; PDH, piruvato

deshidrogenasa; TCA, ciclo de los ácidos tricarboxílicos; CrAT, carnitina aciltransferasa; PM,

membrana plasmática; OMM, membrana mitocondrial externa; IMM, membrana mitocondrial

interna.

Las acilcarnitinas también pueden proceder de la beta-oxidación peroxisomal de ácidos

grasos de cadena muy larga (>22 C) y ácidos grasos de cadena ramificada (como el

pristánico o el fitánico). Aunque la carnitina no está implicada en la entrada de estos ácidos

grasos en los peroxisomas, la oxidación peroxisomal no es completa, sino que rinde acetil-

CoA y acil-CoAs de cadena corta y media (como el octanoil-CoA, C8) que salen del

peroxisoma en forma de las correspondientes acilcarnitinas para terminar de oxidarse en

las mitocondrias (Poirier et al., 2006; Wanders et al., 2001). La síntesis de acilcarnitinas de

cadena media está favorecida por la presencia en los peroxisomas de la enzima carnitina

octanoil transferasa. Además, algunas acilcarnitinas pueden derivarse de cuerpos cetónicos

(C4-3OH-carnitina), del catabolismo de ciertos aminoácidos como lisina, triptófano, valina

Introducción

31

e isoleucina (C3- y C5-carnitina, L-isoC4-OH-carnitina), y del catabolismo de la glucosa

(acetilcarnitina) (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013).

Las acilcarnitinas circulantes se cree que provienen principalmente de tejidos como el

músculo y el hígado, pero también de los depósitos adiposos, de modo que en parte

reflejarían la movilización de los triglicéridos almacenados en el TAB (Schooneman et al.,

2014; Schooneman et al., 2016). Un estudio reciente en cerdos reveló un papel central del

hígado, más que el músculo, en los flujos de acilcarnitinas en el estado postprandial

(Schooneman et al., 2015). Los niveles de acilcarnitinas en plasma se ven influidos por la

dieta y el estado metabólico, en particular por el estatus de oxidación de ácidos grasos

(Schooneman et al., 2014). Niveles altos pueden ser indicativos de trastornos de la β-

oxidación mitocondrial (de hecho, el análisis de acilcarnitinas en sangre se emplea en el

diagnóstico de los errores hereditarios de la oxidación de ácidos grasos causados por

anomalías genéticas en la CPT2 u otras enzimas/proteínas implicadas), pero también se

asocian a condiciones fisiológicas en que la tasa de oxidación de lípidos está elevada, como

el ayuno a corto plazo o el ejercicio agudo (Longo et al., 2006; McCoin et al., 2015;

Schooneman et al., 2013). Las dietas obesogénicas ricas en grasa se asocian a incrementos

generalizados de los niveles de acilcarnitinas en músculo y de algunas especies en plasma

(Newgard et al., 2009; Noland et al., 2009; Wessels et al., 2015).

Se ha propuesto que, más allá de marcar el estatus metabólico, las acilcarnitinas podrían

jugar un papel regulador activo de la fisiología celular, tanto en condiciones normales como

fisiopatológicas (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). En este sentido, hay

estudios que indican que las acilcarnitinas de cadena larga pueden afectar sistemas

asociados a membranas celulares, incluyendo canales iónicos y proteínas implicadas en

vías de señalización intracelular, como las caspasas o la proteína quinasa C. Además, se

ha sugerido que las acilcarnitinas podrían influenciar la propia función mitocondrial,

aunque faltan estudios específicos al respecto (McCoin et al., 2015; Schooneman et al.,

2013).

Estudios metabolómicos en humanos y en modelos animales han identificado niveles

aumentados de acilcarnitinas en plasma y/o tejidos en la obesidad, la pre-diabetes y la

diabetes tipo 2 (Adams et al., 2009; Koves et al., 2008; Mihalik et al., 2010; Sampey et al.,

2012; Zhang et al., 2014b). Se ha sugerido que la sobrecarga de las células con lípidos crea

condiciones para una oxidación incompleta que favorece la acumulación de acilcarnitinas

y otros metabolitos (e.g., diacilglicerol, ceramidas, acil-CoAs) que pueden interferir con la

señalización de la insulina, especialmente en las células musculares, contribuyendo al

desarrollo de resistencia a la hormona (Muoio and Koves, 2007). En esta línea, hay estudios

en modelos celulares que muestran que la exposición a determinadas acilcarnitinas causa

resistencia a la insulina y estrés oxidativo en células musculares (caso de AC4:0, AC14:0

y AC16:0 (Aguer et al., 2015)) y la activación de vías proinflamatorias en macrófagos (caso

de AC12:0, AC13:0 y AC14:0 (Adams et al., 2009; Rutkowsky et al., 2014; Sampey et al.,

2012)). Por tanto, niveles elevados de acilcarnitinas podrían ser marcadores y a la vez

mediadores de la resistencia a la insulina, defectos en el metabolismo de grasas e

inflamación ligada a la obesidad.

Tesis Doctoral


32

No obstante lo anterior, la relación de las acilcarnitinas con la obesidad y la resistencia a la

insulina es compleja y no está clara (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). Hay

autores que consideran que los niveles de acilcarnitinas sólo reflejan la tasa de oxidación

de ácidos grasos, sin más. Se ha argumentado que, en condiciones de reposo, el flujo a

través del ciclo de Krebs es normalmente mucho menor que la máxima capacidad oxidativa

del músculo y que, de hecho, el flujo a través de la beta-oxidación de ácidos grasos tiene

que exceder el flujo a través del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria para que las células

puedan hacer frente a eventuales fluctuaciones de la demanda energética (McCoin et al.,

2015; Schooneman et al., 2013). Por tanto, se producen acilcarnitinas siempre, en

condiciones fisiológicas, y los niveles incrementados en la obesidad podrían ser una

respuesta natural a un mayor suministro de lípidos a los tejidos (Ramos-Roman MA et al.

2012). Un segundo argumento proviene de estudios que muestran que manipulaciones que

mejoran la sensibilidad a la insulina se asocian a incrementos (y no descensos) de los

niveles de acilcarnitinas. Por ejemplo, en un estudio en humanos, la pérdida de peso se

asoció a un aumento de las acilcarnitinas circulantes (consecuencia de un incremento de la

lipólisis y la oxidación de ácidos grasos) y, al mismo tiempo, a una mejora de la sensibilidad

a la insulina (Redman et al., 2011; Schooneman et al., 2016). En un estudio en ratas, los

niveles de carnitina libre y de acilcarnitinas de cadena larga (AC18:1, AC18:0 y AC16:0)

en músculo e hígado incrementaron con la restricción calórica y el ejercicio continuado y

se encontró una asociación directa entre los niveles de acilcarnitinas de cadena larga en

hígado y la sensibilidad a la insulina de los animales (Gopalan et al., 2016). En otro estudio,

la suplementación con carnitina por vía oral a ratones diabéticos mejoró la sensibilidad a la

insulina y se asoció a un marcado incremento de los niveles plasmáticos de acilcarnitinas

(Power et al., 2007). Recientemente, un estudio en ratones concluyó que los niveles

plasmáticos de acilcarnitinas y aminoácidos muestran valor predictivo en relación con la

propensión a la obesidad, pero no en relación con la sensibilidad futura a la insulina

(Horakova et al., 2016).

1.4. Retinoides y epigenética

1.4.1. Mecanismos epigenéticos y programación metabólica

La epigenética estudia los cambios heredables en la expresión génica que no van

acompañados de alteraciones en la secuencia de bases del ADN. Los principales

mecanismos epigenéticos son la metilación del ADN, las modificaciones postraduccionales

de las histonas y la remodelación de la cromatina inducida por ARNs pequeños o por la

actividad de complejos remodeladores dependientes de ATP. Los cambios epigenéticos

afectan muchos procesos reguladores en la célula, incluyendo: expresión de genes y micro

ARNs, interacciones ADN-proteína, supresión de la movilidad de elementos transponibles,

diferenciación celular, embriogénesis, inactivación del cromosoma X y fenómenos de

impronta genómica (Choi and Friso, 2010). El estado epigenético del ADN de los tejidos

de un individuo es tanto heredado como modificable, de manera que los patrones de

expresión del ADN pueden ser pasados de generación celular en generación celular y de

padres a hijos o pueden ser modificados en respuesta al ambiente. Cambios epigenéticos

Introducción

33

han sido asociados con estados de enfermedad, como los observados en el síndrome

metabólico y el cáncer (Smith and Ryckman, 2015).

La metilación del ADN es el paradigma de mecanismo epigenético y el mejor conocido.

La mayoría de las marcas de metilación en el ADN se producen por la adición enzimática

de un grupo metilo al carbono 5 de la citosina para formar 5-metilcitosina (m5C), reacción

catalizada por una familia de ADN metiltransferasas (DNMTs) (Moore et al., 2013). En los

mamíferos, las citosinas metiladas se encuentran por lo general en dinucleótidos CpG.

Estos dinucleótidos no están distribuidos uniformemente en el genoma: en la mayor parte

del genoma (98%) hay en promedio un CpG cada 100 pb, pero existen regiones (de 200 pb

a 1000 pb) que tienen una frecuencia mucho mayor, por ejemplo 1 CpG cada 10 pb,

denominadas "islas CpG". Las islas CpG a menudo coinciden con promotores génicos

(Rodriguez-Dorantes et al., 2004). Aproximadamente 70 a 90% de todos los sitios CpG

dispersos en el genoma humano (en genes o secuencias intergénicas) presentan las citosinas

metiladas, mientras que los sitios CpG contenidos en las islas CpG de promotores génicos

están mayoritariamente sin metilar (Fan and Zhang, 2009; Rodriguez-Dorantes et al., 2004;

Wilson et al., 2007). La metilación de los dinucleótidos CpG en estas islas se asocia

habitualmente a la silenciación génica, aunque no siempre (Rodriguez-Dorantes et al.,

2004).

Nutrientes y otros componentes bioactivos de los alimentos pueden propiciar la

modificación de marcas epigenéticas y alterar con ello la expresión de genes al nivel

transcripcional. En particular, el patrón de metilación del ADN (y de las histonas) es

sensible a factores dietéticos. Nutrientes y bioactivos afectan la metilación de los sustratos

biológicos, ya sea cambiando la disponibilidad de donantes de metilo o por modular la

actividad de las DNMTs (Romani et al., 2015). El mecanismo más ampliamente

investigado es la influencia de ciertos nutrientes sobre la vía del “metabolismo de un

carbono”, que rinde S-adenosil metionina (SAM), requerida para la metilación de todas las

moléculas biológicas incluyendo el ADN. Los nutrientes implicados en este mecanismo

son los donantes dietéticos de metilo y los micronutrientes que funcionan como sustratos o

cofactores de las enzimas implicadas en dicha vía, incluyendo folato, metionina, colina,

betaína y vitaminas B12, B6 y riboflavina. Una ingesta dietética insuficiente o un exceso

de estos nutrientes puede alterar la disponibilidad de SAM, que es el donante directo de

metilo en las reacciones biológicas de metilación, y de S-adenosil homocisteína, que es un

inhibidor de las DNMTs (Choi and Friso, 2010).

La nutricion durante el desarrollo intrauterino y postnatal temprano se cree que es crítica

en la programacion de los circuitos que regulan la homeostasia energética y puede dar lugar

a un reajuste permanente de los programas de expresion genica, mediado por la alteracion

de factores epigeneticos. Numerosos estudios epidemiológicos y en modelos animales han

confirmado que las condiciones nutricionales durante etapas críticas del desarrollo afectan

la susceptibilidad a desarrollar enfermedades crónicas en la edad adulta, incluyendo las

enfermedades cardiovasculares, la obesidad, la diabetes tipo II y la osteoporosis (Inadera,

2013; Lillycrop and Burdge, 2012; Pico et al., 2012; Tarry-Adkins and Ozanne, 2016). La

Tesis Doctoral


34

dieta materna en estas etapas puede alterar dinámicamente la regulación epigenética,

incluyendo el estado de metilación del ADN en tejidos del feto/neonato.

1.4.2. Los retinoides como agentes epigenéticos

Los retinoides afectan marcas epigenéticas, entre ellas marcas de metilación del ADN, con

consecuencias funcionales (Vieira, 2011). Los estudios que relacionan a los retinoides con

cambios en la metilación del ADN, ya sea a nivel genómico global o de genes específicos,

se han centrado fundamentalmente en la actividad epigenética del AR en los contextos

de la embriogénesis y el cáncer (Bar-El Dadon and Reifen, 2017).

En células madre embrionarias humanas el tratamiento con AR altera el estado de

metilación de 166 sitios CpG en todo el genoma y los niveles de expresión de 2013 genes:

para 19 genes se encontró una correlación entre los cambios de metilación y de expresión,

con 9 genes hipermetilados y reprimidos, 7 genes hipometilados e inducidos y 3 genes

hipermetilados e inducidos tras el tratamiento (Cheong et al., 2010). En ratones, los efectos

teratogénicos derivados de la exposición materna a AR exógeno han sido relacionados con

la hipometilación de islas CpG y del ADN global en los fetos (Kuriyama et al., 2008). En

otro estudio, este en ratas, una dieta deficiente en vitamina A durante las etapas

preconcepcional y gestacional condujo a defectos en el corazón de las crías que se

relacionaron con una hipermetilación, y en paralelo una menor expresión al nivel

transcripcional, del gen para GATA-4, que es un factor de transcripción involucrado en la

cardiogénesis y regulado por vitamina A (Feng et al., 2013).

En relación con el cáncer, en diferentes líneas celulares de cáncer y células transformadas

se ha reportado que la exposición a AR favorece la diferenciación y revierte el fenotipo

canceroso a la vez que causa hipometilación del ADN a nivel global (Miftakhova et al.,

2012; Stallings et al., 2011) o la hipometilación de genes supresores tumorales, con

aumento de sus niveles de expresión (Lim et al., 2011; Woo and Jang, 2012). Otros estudios

han revelado cambios ligados al cáncer del estado de metilación de genes relacionados con

el metabolismo y la actividad de los retinoides. Por ejemplo, en una proporción significativa

de tumores de mama y líneas de cáncer de mama hay hipermetilación y falta de expresión

del gen RAR2 (Sirchia et al., 2000) y en diferentes tipos de cáncer hay hipermetilación y

expresión reducida del gen CRBP1 (Esteller et al., 2002). Interesantemente, en pacientes

con cáncer colorrectal, una ingesta dietética alta de vitamina A (retinol) ha sido asociada

con una menor metilación de estos dos genes, RAR2 y CRBP1, en las biopsias de tejido

tumoral (Esteller et al., 2002).

Los estudios sobre la actividad epigenética del -caroteno son más escasos. Uno de los

pocos al respecto ha investigado la posible implicación de cambios epigenéticos en los

efectos pro-quimiotáctico y pro-angiogénico del -caroteno en modelos celulares (células

endoteliales de cordón umbilical humano y células endoteliales progenitoras). La

exposición a -caroteno se asoció a una hipometilación del ADN, global y específicamente

en genes relacionados con el homing y con la angiogénesis, como el receptor 2 del factor

de crecimiento del endotelio vascular, cuya expresión se vió aumentada (Kiec-Wilk et al.,

Introducción

35

2007; Kiec-Wilk et al., 2009). Se ha sugerido que estos cambios podrían estar conectados

con una posible acción pro-tumoral del -caroteno.

La actividad epigenética de la vitamina A en relación con la salud metabólica y la

homeostasis energética ha sido muy poco estudiada. En humanos adultos con

sobrepeso/obesidad se han descrito asociaciones del estado de metilación del ADN de

algunos genes candidatos inflamatorios (TNF, elementos HERV-w) en sangre total con

la ingesta dietética de carotenoides, -caroteno y retinol (Bollati et al., 2014). Dos estudios

recientes han investigado efectos epigenéticos de la vitamina A en la programación de

circuitos neurales implicados en el control de la ingesta. En el primero de ellos, la

alimentación con una dieta rica en vitamina A tras el destete (x10 veces el contenido

estándar en el pienso) redujo la ingesta y el peso corporal y contrarrestó en parte el fenotipo

obesogénico característico de la progenie macho de ratas suplementadas con

multivitaminas durante la gestación, y esto se acompañó de una hipometilación del

promotor del gen para la pro-opiomelanocortina (POMC) en el hipotálamo y de cambios

en la expresión de genes relacionados con el control de la ingesta (aunque no de POMC) y

el sistema de recompensa en el cerebro de los animales a los 8 meses de edad (Sanchez-

Hernandez et al., 2014). El otro estudio, del mismo grupo, muestra que una ingesta alta de

vitamina A durante la gestación modifica en ratas la expresión y estatus de metilación en

el hipocampo de genes del sistema de recompensa y reduce la preferencia por el azúcar en

edad adulta, aunque no afecta al peso corporal (Sanchez-Hernandez et al., 2016).

Los mecanismos de la actividad epigenética del AR en la metilación del ADN han sido

investigados principalmente en relación con el cáncer y en general están mediados por la

interacción del AR con sus receptores (Stefanska et al., 2012; Vieira, 2011). Estos

mecanismos son múltiples:

- Diferentes estudios muestran inhibición de la expresión y actividad de las DNMTs (1,

3a y 3b) tras el tratamiento de líneas celulares y tumores primarios con AR, que se

relaciona con desmetilación e incremento de la expresión de genes supresores

tumorales (Fazi et al., 2005; Lim et al., 2011). La inhibición de la DNMT1 se explicaría

por las capacidades del ATRA de, vía sus receptores, inducir la transcripción del gen

para p21 (la cual compite con DNMT1 por la unión a PCNA en la horquilla de

replicación) e inhibir la actividad transcripcional de AP1 (el cual transactiva

normalmente el gen para DNMT1). Además, el ATRA induce miRNAs dirigidos a los

ARNm de DNMTs (Stefanska et al., 2012).

- La vitamina A (retinil palmitato) y el ATRA regulan positivamente la abundancia y

actividad hepática de la N-glicina metiltransferasa, a la vez que favorecen la

hipometilación del ADN hepático (McMullen et al., 2002; Rowling et al., 2002). La

actividad de la N-glicina metiltransferasa consume el donador de metilo SAM (ya que

cataliza la reacción entre SAM y glicina para dar S-adenosil-homocisteína y sarcosina).

- En células tumorales, el tratamiento con ATRA inhibe la actividad de las metionina

adenosiltransferasas (Lai et al., 1997), que son enzimas implicadas en la biosíntesis

de SAM.

Tesis Doctoral


36

- El AR y el retinol revierten marcas de metilación del ADN en células embrionarias al

inducir la expresión de enzimas clave para la desmetilación activa del ADN (enzimas

ten-eleven translocation, en concreto TET2 y TET3); este borrado de marcas de

metilación favorece la reprogramación de estas células hacia la pluripotencia (Hore et

al., 2016).

Aunque en la mayoría de los estudios considerados en este apartado se ha puesto el énfasis

en la capacidad de los retinoides de favorecer la hipometilación del ADN, los retinoides

también pueden favorecer la hipermetilación del ADN (Cheong et al., 2010): depende de

los genes concretos y contexto biológico considerados. Finalmente, cabe señalar que,

además de afectar la metilación del ADN, los retinoides afectan otros mecanismos

epigenéticos, como la acetilación y metilación de histonas (Vieira, 2011).

Resultados previos de nuestro laboratorio (Granados et al., 2013; Musinovic et al., 2014)

sugieren una posible participación de la vitamina A en la regulación de la expresión génica

y la programación del metabolismo del TAB a través de factores epigenéticos, como la

metilación del ADN, que ha sido abordada como parte de esta tesis.

2. Objetivos y Planteamiento Experimental

Tesis Doctoral


38

Objetivos y Planteamiento Experimental

39

El objetivo general de esta tesis doctoral es ahondar en la interacción de la vitamina A con

el metabolismo energético especialmente en el tejido adiposo y sus mecanismos,

incluyendo mecanismos epigenéticos posiblemente relacionados con la programación

metabólica, e identificar nuevos biomarcadores de esta interacción.

El trabajo experimental se ha realizado mayoritariamente en el Laboratorio de Biología

Molecular, Nutrición y Biotecnología (LBNB) de la Universidad de las Islas Baleares,

dentro del grupo de investigación Nutrigenómica y Obesidad (NUO), dirigido por el

Profesor Andreu Palou y adscrito al CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición

(CIBEROBN) del Instituto de Salud Carlos III del Gobierno de España. La realización de

la tesis ha sido posible gracias a una beca a la doctoranda del Programa de mejoramiento

del Profesorado (PROMEP) de la Subsecretaría de Educación Superior de México.

Los objetivos de esta tesis se enmarcan en una de las principales líneas de investigación del

grupo NUO: la interacción de la nutrición con procesos y mecanismos moleculares y

celulares relacionados con el control de la adiposidad corporal, de interés en el control de

la obesidad y sus complicaciones metabólicas. La tesis parte de las investigaciones previas

del grupo sobre la actividad biológica en este sentido de la vitamina A y carotenoides

provitamina A. Como micronutriente esencial, la vitamina A juega un papel clave en la

salud general del individuo y es bien conocida por ser esencial para varias funciones vitales

como la visión, la inmunidad, la reproducción y el desarrollo embrionario. Más

recientemente se han atribuido a esta vitamina funciones en el control del metabolismo de

los lípidos, la respuesta a la insulina y la homeostasis energética. El grupo de la UIB ha

sido pionero en la identificación y caracterización de múltiples efectos del ATRA, derivado

carboxílico activo de la vitamina A, de potencial interés de cara al control del síndrome

metabólico, incluyendo una acción anti-obesidad. Aquí nos planteamos nuevos desarrollos

en esta línea, buscando incorporar conceptos y aspectos (e.g., biomarcadores,

nutriepigenética) que son parte de la evolución de la nutrición molecular en los últimos

tiempos, y aprovechar al mismo tiempo la experiencia acumulada y las oportunidades

surgidas de la participación de nuestro grupo de la UIB en proyectos de investigación

nacionales y europeos.

En particular, en relación con el objetivo general, se han planteado y desarrollado los

siguientes objetivos específicos:

Objetivo 1. Ahondar en los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la

activación por ATRA del metabolismo oxidativo en los tejidos adiposos.

Estudios previos mostraron que, en roedores, el tratamiento con ATRA promueve la

activación del TAM y un incremento de la capacidad para la oxidación de ácidos grasos y

la termogénesis en el TAB y, ligado a esto, una pérdida de grasa corporal y mejoras en la

tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina de los animales. También se ha

demostrado una remodelación metabólica hacia una mayor capacidad oxidativa y

termogénica en modelos celulares de adipocitos blancos en cultivo (e.g., adipocitos 3T3-

L1) expuestos a ATRA, que el grupo de la UIB acababa de relacionar al inicio de esta tesis

con un incremento de la función y abundancia de mitocondrias. Quedaban por estudiar los

Tesis Doctoral


40

efectos del ATRA sobre las mitocondrias del TAB in vivo. Además, si bien los resultados

en los modelos de adipocitos en cultivo indicaban que, en buena medida, la remodelación

metabólica inducida por ATRA en los adipocitos se deriva de efectos directos (autónomos)

del retinoide sobre las células adiposas, in vivo también pueden estar implicados efectos

sistémicos del ATRA.

Así las cosas, en esta tesis hemos estudiado el efecto del ATRA sobre la marronización y

la función mitocondrial adipocitaria centrándonos en aspectos no abordados anteriormente,

en particular: (i) la posible implicación in vivo de cambios en el contenido en mitocondrias

y en la expresión de genes marcadores candidatos de adipocitos beige/BRITE; (ii) la

modulación por ATRA de la expresión in vivo de irisina, una señal proteica estimuladora

de la marronización del TAB; y (iii) la modulación por ATRA de la expresión de receptores

nucleares y proteínas transportadoras intracelulares de retinoides, que puede permitir

identificar nuevos biomarcadores de marronización del TAB relacionados, así como

informar sobre las vías de señalización implicadas en la acción del ATRA en los adipocitos.

Algunos de estos estudios (del apartado (i)) se han realizado como parte de una

colaboración con el grupo del Dr. Jean François Landrier, del INRA-INSERM- Aix-

Marseille Université (Francia). Este grupo participa, al igual que nuestro grupo de la UIB,

en la acción COST CA15136 EUROCAROTEN, enfocada en la investigación en

carotenoides y moléculas relacionadas y sus aplicaciones agroalimentarias y en el campo

de la salud. Además, parte de la investigación de esta tesis se ha hecho dentro del marco de

la participación de nuestro grupo en un proyecto europeo sobre la conexión entre la

actividad termogénica de los adipocitos marrones y beige y la diabetes de tipo II

(DIABAT).

Para la consecución del objetivo 1, diseñamos y realizamos en el LBNB los siguientes

experimentos:

a) Experimento in vivo. Este experimento se hizo con ratones adultos NMRI. Los ratones

se mantuvieron a temperatura controlada (22ºC) y con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad,

con acceso libre a agua y pienso estándar. La mitad de los animales recibieron una

inyección subcutánea diaria de ATRA, a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal, durante

los 4 días anteriores al sacrificio, como está descrito en (Amengual et al., 2008); a la otra

mitad le fue inyectado el vehículo. Se determinaron diferentes parámetros bioquímicos y

biométricos (Figura 2.1). Para caracterizar el impacto del ATRA sobre la marronización

del TAB y sus mecanismos evaluamos en diferentes depósitos de TAB (inguinal,

retroperitoneal y epididimal), así como en TAM, la expresión de genes relacionados con la

función mitocondrial; genes marcadores de los adipocitos beige/BRITE; y genes para

transportadores y receptores de retinoides y otros receptores nucleares relacionados.

También analizamos en los distintos depósitos grasos el contenido en ADN mitocondrial y

la inmunohistoquímica de COXIV y UCP1. Este experimento se utilizó también para

analizar la expresión del gen de la irisina en hígado y los diferentes depósitos adiposos.


41

Figura 2.1. Esquema del experimento con ratones adultos NMRI tratados con ácido retinoico todo-

trans (ATRA) o vehículo. TAM, tejido adiposo marrón; TABi, TABrp, TABe, tejido adiposo

blanco inguinal, retroperitoneal y epididimal; PBMC, células mononucleares de sangre periférica.

(Veáse el apartado 3.1 de Materiales y Métodos).

b) Estudios en cultivos primarios de adipocitos. Se establecieron cultivos primarios de

adipocitos a partir de la fracción estromal-vascular aislada de TAM y de TAB inguinal y

epididimal de ratones NMRI. Las células fueron diferenciadas en las condiciones

habitualmente utilizadas para la diferenciación de los cultivos primarios de adipocitos

marrones, y fueron expuestas a ATRA o noradrenalina una vez diferenciadas,

procediéndose a la cosecha tras una incubación de 24 h (Figura 2.2). Se estudiaron los

efectos sobre la expresión de genes relacionados con la actividad termogénica y la

marronización y de genes relacionados con la señalización por retinoides.

Los resultados de estos estudios se presentan y discuten en el capítulo 1. Parte de estos

resultados se encuentran incluidos en un trabajo ya publicado del que la doctoranda es

coautora (Tourniaire et al., 2015).

Figura 2.2. Esquema del experimento con cultivos primarios de la fracción estromal vascular (SVF)

del tejido adiposo marrón (TAM) y del tejido adiposo blanco inguinal (TABi) y epididimal (TABe).

CM, cambio de medio de cultivo; NA, noradrenalina; ATRA, ácido retinoico todo-trans. (Véase el

apartado 3.5 de Materiales y Métodos).

Tesis Doctoral


42

Objetivo 2. Identificar/validar biomarcadores sanguíneos del incremento de la

capacidad oxidativa/termogénica en tejidos adiposos y otros tejidos, explotando el

modelo de tratamiento con ATRA.

Conseguir incrementar mediante tratamientos específicos la capacidad oxidativa/

termogénica tisular, en particular en los tejidos adiposos, es una posible estrategia de

control y tratamiento de la obesidad y sus co-morbilidades. Contar con biomarcadores

fácilmente accesibles que reflejen los cambios al efecto inducidos en tejidos internos por

agentes terapéuticos candidatos con efectos sistémicos beneficiosos es de gran interés de

cara a la identificación, evaluación y optimización de nuevas terapias. Puesto que, en

ratones, el tratamiento con ATRA induce la capacidad oxidativa y termogénica en

diferentes tejidos, incluyendo la marronización del TAB, hipotetizamos que este modelo

puede ser utilizado para identificar y/o validar biomarcadores circulantes de dichos efectos.

A partir de esta hipótesis, hemos realizado un análisis metabolómico en PBMC y plasma

de ratones tratados con ATRA empleando el modelo animal previamente descrito en el

objetivo 1 (Figura 2.1). Además, evaluamos en estas PBMC la expresión de genes

relacionados con el metabolismo oxidativo, mediante qPCR. El análisis metabolómico se

realizó como parte de una colaboración en el laboratorio del Dr. Jan Kopecký, del Instituto

de Fisiología de la Academia Checa de Ciencias (Praga, República Checa). Dicho grupo ha

sido partner en un proyecto europeo coordinado por nuestro grupo de la UIB sobre

“biomarcadores nutrigenómicos de robustez de la homeostasia metabólica de aplicabilidad

en la sustentación de alegaciones de salud en alimentos”, el proyecto BIOCLAIMS

(finalizado en 2015). El análisis metabolómico dirigido llevado a cabo se ha centrado en el

posible papel de biomarcadores circulantes candidatos identificados en el proyecto

BIOCLAIMS, fundamentalmente acilcarnitinas y aminoácidos.

Los resultados obtenidos en estos estudios, y su integración con los obtenidos en el

desarrollo del objetivo 1, se presentan y discuten en el capítulo 2.

Objetivo 3. Caracterizar efectos nutriepigenéticos de la suplementación durante la

lactancia con vitamina A, preformada y como -caroteno, de posible relevancia en la

programación metabólica del TAB

Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que la suplementación de crías de rata

durante el periodo de lactancia con un exceso (moderado) de vitamina A en forma de retinil

palmitato produce cambios en el desarrollo del TAB y favorece la hiperplasia y aumento

de la adiposidad con la exposición a un dieta alta en grasa tras el destete (Granados et al.,

2013). En concreto, la administración de vitamina A preformada (retinil palmitato) afecta

la expresión en TAB de genes claves relacionados con la diferenciación adipocitaria y la

proliferación celular. A diferencia del tratamiento con retinil palmitato, el tratamiento

durante la lactancia con una dosis equivalente de vitamina A en forma de -caroteno no

afecta la expresión de dichos genes (Musinovic et al., 2014).

La lactancia es un periodo crítico en el desarrollo del tejido adiposo en el que pueden quedar

condicionados cambios epigenéticos que impactan las características del tejido a largo

plazo, como parte de fenómenos de programación metabólica. La influencia de factores


43

nutricionales en etapas tempranas de la vida sobre la susceptibilidad a la obesidad vía

mecanismos epigenéticos es una línea de trabajo activa en el LBNB, desarrollada a través

de proyectos como el financiado por la fundación Ramón Areces “Nutriepigenética del

control de la adiposidad corporal: estudios en modelos animales de susceptibilidad

diferencial a la obesidad basados en intervenciones nutricionales en etapas vitales

tempranas” (2012-2015). Los retinoides vitamina A es sabido que influencian la metilación

del ADN, con implicaciones en el cáncer y el desarrollo embrionario.

Figura 2.3. Esquema del experimento con ratas Wistar lactantes tratadas con vitamina A

preformada (retinil palmitato), β-caroteno o vehículo durante la etapa de lactancia. TABi, tejido

adiposo blanco inguinal. *, 3-5 veces la dosis diaria de vitamina A ingerida con la leche materna;

**, cantidad equivalente en unidades internacionales de vitamina A a la suplementada como retinil

palmitato. (Véase el apartado 3.1 de Materiales y Métodos).

Por todo ello, en esta tesis nos planteamos estudiar la influencia del tratamiento durante la

lactancia con -caroteno o vitamina A preformada, ambos precursores dietéticos del

ATRA, sobre el estatus de metilación en tejido adiposo de promotores génicos diana

seleccionados, usando el modelo animal (Figura 2.3) descrito en (Musinovic et al., 2014).

Los genes seleccionados son genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y

determinación adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol

(Rbp4) y la termogénesis (Ucp1). Hemos analizado la expresión de estos genes y el estado

de metilación de tramos reguladores de los mismos (en promotores o enhancers) en el TAB

inguinal de crías de rata suplementadas durante la etapa postnatal temprana (los primeros

21 días de vida, coincidentes con la etapa de lactancia) con -caroteno, retinil palmitato o

vehículo. La expresión génica se determinó por qPCR a tiempo real y el estado de

metilación del ADN, mediante secuenciación por bisulfito (realizada en el LBNB y los

servicios generales de la UIB). Nuestra hipótesis de partida es que la suplementación

perinatal con vitamina A puede afectar marcas de metilación del ADN de estos genes y de

manera diferencial según sea aportada como retinil palmitato o como -caroteno.

Los resultados obtenidos en estos estudios se presentan y discuten en el capítulo 3.

Tesis Doctoral


44

3. Materiales y Métodos

Tesis Doctoral


46

Materiales y Métodos

47

3.1. Estudios en animales

Los diseños experimentales y protocolos usados en la presente tesis doctoral fueron

revisados y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) de la

Universidad de las Islas Baleares y siguen las recomendaciones generales para el uso y

cuidado de animales de laboratorio.

Para los estudios del Capítulo 1 y el Capítulo 2 se usaron 22 ratones machos NMRI adultos

(de unas 13 semanas de edad) obtenidos de Charles River Laboratories International, Inc.

(Barcelona, España). Los ratones se mantuvieron en jaulas con 2-3 animales por jaula, a

temperatura controlada (22ºC), con ciclos de 12 h de luz/oscuridad, y con acceso libre a

agua y pienso (dieta de mantenimiento A04; Panlab SL, Barcelona, España). La mitad de

los animales fueron tratados con una dosis de 50 mg de ácido retinoico todo trans (ATRA;

Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) por kg de peso corporal y día mediante

inyección subcutánea (100 μL) durante los 4 días anteriores al sacrificio, como está descrito

en (Amengual et al., 2008; Mercader et al., 2006). La otra mitad de los animales recibieron

solamente el vehículo (aceite de oliva; grupo control). Durante el periodo de tratamiento se

monitorizó el peso corporal y la ingesta de los animales. Justo antes del sacrificio se

recogieron muestras de sangre de la vena facial (200-400μL) en un tubo con 100μL de

citrato sódico al 3.8%, para la obtención de las células mononucleares de sangre periférica

(PBMC), y (~50 μL) en un tubo capilar heparinizado, para obtener el plasma. Los animales

fueron sacrificados por decapitación y a continuación los depósitos de tejido adiposo

marrón interescapular (TAM) y de tejido adiposo blanco inguinal (TABi), epididimal

(TABe) y retroperitoneal (TABr), así como el hígado se diseccionaron, se pesaron, se

congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su posterior procesamiento

y análisis. Un fragmento longitudinal de los distintos depósitos de tejido adiposo blanco

diseccionados se fijaron por inmersión en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1

M (pH=7,3), para los estudios morfológicos e inmunohistoquímicos. El plasma se obtuvo

por centrifugación a 1000 x g durante 10 min a 4ºC y se guardó en nuevos recipientes

estériles que se almacenaron a -80ºC hasta su posterior análisis.

Para los estudios del Capítulo 3 fue utilizado el TABi de la cohorte de animales estudiados

y descritos en una publicación previa de nuestro laboratorio (Musinovic et al., 2014).

Brevemente, después de un periodo de aclimatación, ratas hembras Wistar de 3 meses de

edad (obtenidas de Charles River Laboratories International, Inc.) fueron enjauladas con

ratas machos Wistar. Después del apareamiento, las ratas fueron individualmente

enjauladas y se mantuvieron bajo temperatura controlada (22ºC), con ciclos de 12 h de

luz/oscuridad, y con acceso libre a agua y pienso (Panlab, SL; 4,5 mg de vitamina A por

kg de dieta). El día del nacimiento se definió como día 0 de la lactancia. Al día 1, el exceso

de crías fue retirado para mantener diez crías por camada y las crías fueron aleatoriamente

asignadas a tres grupos que, desde el día 1 hasta el día 20 del periodo de lactancia,

recibieron diariamente de forma oral, con la ayuda de una pipeta, 10-15 μL de vehículo

(aceite de oliva; grupo control) o una emulsión de vitamina A en forma de retinil palmitato

(Sigma-Aldrich Inc.; grupo RE) o como -caroteno (Sigma-Aldrich Inc.; grupo BC) en

aceite de oliva. La cantidad suplementada fue entre tres y cinco veces la ingesta diaria de

Tesis Doctoral


48

vitamina A ingerida a través de la leche materna, que fue estimada en base al contenido de

retinol de la leche materna de rata (Granados et al., 2013), la cantidad de leche materna

ingerida por las crías (que se incrementa a medida que avanza la lactancia) (Kojima et al.,

1998) y la equivalencia en vitamina A del BC en aceite (Otten et al., 2006; van Lieshout et

al., 2001; Van Loo-Bouwman et al., 2014). Se usaron al menos 16 ratas jóvenes de al menos

cuatro diferentes madres por grupo experimental, y un número similar de machos y

hembras. De estos animales se ha dispuesto del peso corporal, la composición corporal

determinada por resonancia magnética (EchoMRI-900 analyzer; EchoMRI, Houston, TX,

EE.UU.), el peso del TABi, los niveles circulantes de glucosa, retinol y BC, los niveles de

retinol, retinil ésteres y BC en hígado, y los niveles de retinol total en TABi. Los niveles

de retinoides y carotenoides se determinaron por HPLC acoplado a un detector multidiodo

previa extracción (Granados et al., 2013; Musinovic et al., 2014).

3.2. Estudio morfológico e inmunohistoquímico del tejido adiposo blanco inguinal

(TABi) de ratones

Las muestras de TABi fueron fijadas en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M

(pH=7,3) durante toda la noche, y a continuación lavadas en tampón fosfato, deshidratadas

en una serie graduada de etanol y embebidas en bloques de parafina para los estudios

inmunohistoquímicos del Capítulo 1. Estos se realizaron mediante la técnica de avidina-

biotina (Hsu and Raine, 1981). Para ello, secciones de 5 μm se incubaron con un anticuerpo

primario policlonal de conejo anti-CoxIV (Cell Signalling Technology, Danvers, MA,

EE.UU.) diluido 1:100 en PBS o con un anticuerpo anticuerpo primario policlonal de

conejo anti-UCP1 (GeneTex Inc., Irvine, CA, EE.UU.) diluido 1:300 en PBS, luego con el

correspondiente anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG de conejo diluido 1:200

(Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.), y finalmente con complejo ABC

(Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). La actividad de la peroxidasa se reveló usando

clorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina al 0,075% como cromógeno (Sigma, St Louis, MO,

EE.UU.) en tampón Tris 0,05 M, pH 7,6. Las secciones se contrastaron con hematoxilina

y se montaron en Eukitt (Kindler; Freiburg, Alemania). Las secciones se observaron con el

microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con cámara digital AxioCam Icc3 (Carl Zeiss,

S.A., Barcelona, España). Se utilizaron controles positivos apropiados para comprobar la

especificidad del anticuerpo.

3.3. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratón

Las PBMC utilizadas en los Capítulos 1 y 2 se aislaron por un método de flotación,

siguiendo básicamente el protocolo Application Sheet C07 proporcionado por la casa

comercial Alere Technologies AS (Oslo, Noruega). Brevemente, la sangre recogida con el

citrato sódico de la vena facial de los ratones se transfirió a un tubo de 15 mL y se le

añadieron 5 mL de la solución de trabajo OptiPrep™ recién preparada (1,5 mL de

OptiPrep™ –Sigma-Aldrich Inc– en 5 mL de tampón tricina salino –TBS; 10 mM Tricina-

NaOH, 0.85% NaCl, pH=7,4– bien mezclado), mezclando suavemente por inversión. La

mezcla se cubrió cuidadosamente con 0,5 mL de TBS y se centrifugó a 1000 g durante 30

min a 20ºC. Tras la centrifugación se recogieron las PBMC desde el menisco hacia abajo,


49

hasta medio centímetro del pellet de eritrocitos. La suspensión celular se diluyó en dos

volúmenes de TBS y se centrifugó a 350 x g durante 10 min a 20ºC. Finalmente, el pellet

de células fue resuspendido en 120 μL de tampón fosfato salino (PBS; 50mM de fosfato de

potasio, 150mM NaCl, pH=7,2) y se guardó en dos alícuotas a -80ºC hasta su posterior

análisis. El número de células viables se estimó por contaje directo en una cámara de

Neubauer usando el colorante de exclusión Trypan blue (Sigma-Aldrich Inc.), obteniendo

5.81 x 105 ± 1.15 x 105 células viables a partir de 200-400 μL de sangre.

3.4. Análisis metabolómico en plasma y células mononucleares de sangre periférica

(PBMC)

En el Capítulo 2, a raíz de una colaboración internacional dentro del proyecto Europeo

BIOCLAIMS (FW7-Grant agreement no. 244995), determinamos los niveles de diferentes

especies de acilcarnitinas, aminoácidos y otros metabolitos, que representan un panel

ampliado para la detección de trastornos metabólicos innatos, a partir de 3 μL de plasma o

de suspensión de PBMCs de ratones control y tratados con ATRA. Las determinaciones se

efectuaron en el laboratorio del Dr. Jan Kopecky, del Institute of Physiology de Praga

(República Checa), por análisis de inyección de flujo acoplado a espectrometría de masas

en tándem con ionización por electroespray (FIA-ESI-MS/MS), utilizando el kit

MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines (Chromsystems, Gräfelfing Alemania) y

siguiendo el protocolo descrito en (Horakova et al., 2016; Horakova et al., 2012). Los

niveles de los metabolitos en el plasma o la suspensión de PBMCs se normalizaron por

volumen de muestra y por número de células respectivamente.

3.5. Aislamiento de la fracción celular estromal vascular (SVF) del tejido adiposo y

cultivo primario

Para establecer los cultivos primarios de (pre)adipocitos para los estudios incluidos en el

Capítulo 1 se usaron ratones NMRI machos de 2-3 meses de edad, obtenidos de Charles

River Laboratories International, Inc. Brevemente, los animales fueron sacrificados con

CO2, y los tejidos –de una parte el TAM interscapular, cervical y axilar, que se combinaron,

de otra el TABi, y finalmente el TABe– se diseccionaron, se trocearon en trozos pequeños,

se digirieron con 0.2% (w/v) colagenasa tipo II (Sigma-Aldrich Inc.) y se obtuvieron las

células de la fracción estromal vascular siguiendo el protocolo descrito en (Bonet et al.,

1997; Petrov et al., 2016b; Petrovic et al., 2008; Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al., 2012)

Las células fueron finalmente resuspendidas en medio de cultivo (0,5 mL/animal) y

sembradas (día 0) en placas de 6 pocillos en condiciones estériles (0,25 mL de suspensión

celular más 1,75 mL de medio de cultivo por pocillo). Las células se hicieron crecer a 37°C

y 8% de CO2 en una incubadora humidificada. El medio de cultivo fue Dulbecco’s modified

Eagle’s (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de new born calf serum (Linus; Cultek,

Madrid, España), 4 nM insulina, 25 μg/mL ascorbato de sodio, 10 mM HEPES, 4 mM

glutamina, 86 μM piruvato de sodio, 50 IU/ mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.

A día 1, las células se lavaron en DMEM precalentado a 37°C y se añadió medio de cultivo

recién preparado precalentado. A partir de aquí se cambió el medio de cultivo cada dos

días. Las células fueron tratadas con 1μM de ácido retinoico todo trans (ATRA; Sigma-

Tesis Doctoral


50

Aldrich Inc.) o 1μM de (±) Arterenol (noradrenalina, NA; Sigma-Aldrich Inc.) el día 7 de

cultivo, cuando ya habían alcanzado la confluencia y estaban en proceso de diferenciación,

hasta el día 8 (24 h). La monocapa de células se recogió directamente con el tampón de

lisado del kit E.Z.N.A.® total RNA kit I (Omega Bio-Tek, Norcross, GA) y se procedió a

la extracción del ARN total (ver más adelante). Se realizaron dos experimentos

independientes por duplicado.

3.6. Extracción de ácidos nucleicos

3.6.1. Extracción de ARN total

El ARN total se extrajo de las muestras de tejido (TAM, TAB inguinal, epididimal y

retroperitoneal e hígado) y de las células en cultivo primario usando el kit E.Z.N.A.® total

RNA kit I (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EE.UU.) y de las PBMC usando el kit Direct-

zolTM RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones

del fabricante.

Entre 10 a 15 mg de tejido adiposo o hígado se homogenizaron en 700 μL de TRK lysis

buffer, con ayuda de un homogeneizador (modelo VDI 12, VWR). El homogenado se

centrifugó a 13000 x g durante 5 min a temperatura ambiente con la finalidad de eliminar

la grasa y residuos celulares. Las células en monocapa se recogieron directamente del

pocillo en 350 μL de TRK lysis buffer. El sobrenadante o lisado celular resultante fue

transferido a otro tubo y se le añadió un mismo volumen (700 o 350 μL, respectivamente)

de etanol al 70%, mezclando vigorosamente. La mezcla se introdujo en columnas HiBind

RNA spin acopladas a un tubo colector, que se centrifugaron a 10000 x g durante 1 min a

temperatura ambiente descartando el eluido. A continuación se realizó un lavado de las

columnas con 350 μL de RNA Wash Buffer I, centrifugando a 10000 x g durante 1 min a

temperatura ambiente y descartando el eluido. Para eliminar la contaminación por ADN,

en cada columna se introdujeron 35 μL de reactivo con ADNasas y se incubó durante 15

min a temperatura ambiente. A continuación se realizó un segundo lavado de las columnas

con RNA Wash Buffer I seguido de 2 lavados con RNA Wash Buffer II, siempre en cada

lavado centrifugando a 10000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descartando el

eluido. Finalmente las columnas se centrifugaron a máxima velocidad (unos 20000 x g)

durante 2 minutos descartando el eluido, a fin de secarlas. Una vez secas, se les acopló un

nuevo tubo colector de 1,5 mL y el ARN total fue eluido con 40 μL de H2O libre de

ADNasas y ARNAasas (Sigma-Aldrich Inc.; añadida directamente sobre el centro de la

membrana de la columna), centrifugando a 10000 x g durante 2 min y recogiendo el eluido,

que se guardó a -80ºC hasta su posterior análisis.

Las PBMC en suspensión (unas 500 mil células en 100 µL) se lisaron añadiendo 0,3 mL

de TripureTM (Sigma-Aldrich Inc.), mezclando vigorosamente e incubando la mezcla

durante 5 minutos a temperatura ambiente. El lisado se centrifugó a 12000 x g durante 1

min a temperatura ambiente con la finalidad de eliminar residuos celulares. El sobrenadante

resultante fue transferido a otro tubo y se le añadieron 400 μL de etanol al 95-100%, se

mezcló vigorosamente y se introdujo en las columnas Zymo-SpinTM IIC RNA spin,

acopladas a un tubo colector, las cuales se centrifugaron a 13000 x g durante 1 min a


51

temperatura ambiente descartando el eluido. A continuación se realizaron dos lavados de

las columnas con 400 μL de Direct-zol RNA PreWash seguidos de un último lavado con

RNA Wash Buffer, siempre en cada lavado centrifugando a 13000 x g durante 1 min a

temperatura ambiente y descartando el eluido. Finalmente las columnas se centrifugaron a

13000 x g durante 2 min descartando el eluido, a fin de secarlas. Una vez secas, se les

acopló un nuevo tubo colector de 1,5 mL y el ARN total fue eluido con 10 μL de H2O libre

de ADNasas y ARNasas (Sigma-Aldrich Inc.; añadida directamente sobre el centro de la

membrana de la columna) y se centrifugaron a máxima velocidad (unos 20000 x g) durante

2 min. El eluido de ARN se guardó a -80ºC hasta su posterior análisis.

3.6.2. Extracción del ADN

El ADN se extrajo de las muestras de tejido adipso (TAB inguinal, epididimal y

retroperitoneal) usando el kit DNeasy® Tissue & Blood Kit (QIAGEN GmbH, Hilden

Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para ello, se pesaron aproximadamente 50 mg de tejido adiposo. Las muestras se

homogeneizaron en 180 μL de Buffer ATL con 20 μL de proteinasa K y se incubaron a 56ºC

durante 4 h, con agitación vigorosa ocasional para dispersar la muestra. Posteriormente, se

añadieron 200 μL de Buffer AL y 200 μL de etanol (96-100%) a cada muestra y se mezcló

vigorosamente. El sobrenadante resultante se introdujo en las columnas DNeasy Mini spin

acopladas a un tubo colector y se centrifugó a 7500 x g durante 1 min a temperatura

ambiente descartando el eluido. A continuación se realizaron dos lavados de las columnas

con 500 μL de Buffer AW1 y AW2, respectivamente, el primer lavado se centrifugó a 7500

x g durante 1 min y el segundo a 20000 x g durante 3 min a temperatura ambiente, se

descartaron los eluidos. Finalmente las columnas se centrifugaron a máxima velocidad

(20000 x g) durante 2 min descartando el eluido; una vez secas las columnas se acoplaron

a un tubo de 1,5 mL nuevo, se añadieron 100 μL de Buffer AE y se incubaron a temperatura

ambiente durante 5 min, después se centrifugaron a 750 x g durante 1 min para recoger el

eluido de ADN.

3.6.3. Cuantificación y comprobación del estado del ARN y ADN

Las concentraciones de ARN y ADN se determinaron por absorbancia a 260 nm a partir de

2 μL de muestra utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop

Technologies Inc., Wilmington, DE, EE.UU.). Asimismo se determinó la absorbancia a

280 nm y 230 nm para la estimación de la pureza de las muestras mediante los ratios

260/280 y 260/230.

La integridad del ARN se estimó por visualización en electroforesis en gel de agarosa de

las bandas del ARN ribosómico 28S y 18S y la del ADN se estimó por la visualización de

una sola banda de ADN de alto peso molecular. Un total de 250 ng de ácido nucleico por

muestra se mezclaron con un tampón de carga (50% de glicerol y 2,5 mg/mL de azul de

bromofenol), se cargaron en un pocillo y se separaron en un gel de agarosa al 1% (para

ARN) y al 2% (para ADN) en TBE (44,5 mM de Tris base, 44,5 mM de ácido bórico y 1

mM de EDTA) 0.5X, teñido con SYBER® Safe DNA Gel Stain (10 μL por cada 100 mL de

Tesis Doctoral


52

TBE). Las condiciones de electroforesis fueron 80V durante 30 min para ambos geles y las

bandas se visualizaron en un transiluminador de UV (ChemiGeninus Bio, Syngene).

3.7. Análisis de ARNm por RT-qPCR a tiempo real

Los niveles de ARNm de los genes seleccionados (que se especifican en cada capítulo) en

muestras de tejido (TAM, TAB inguinal, epididimal y retroperitoneal e hígado), células en

cultivo primario y PBMC se determinaron por RT-qPCR a tiempo real.

3.7.1. Retrotranscripción (RT)

Para la retrotranscripción, 0,25 μg de ARN total (en 5 μL de agua libre de ARNasas) fueron

primero desnaturalizados a 65ºC durante 10 min en un termociclador (Thermal Cycler

2720, Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.). A continuación, el ARN

desnaturalizado fue retrotranscrito a ADN complementario (cADN) tras añadir, a cada

muestra, 7,5 μL de RT-mix que contenía: 1,25 μL de Buffer 10x, 1,25 μL de MgCl2 25 mM,

2 μL de dNTPs 2,5 mM, 0,5 μL de random hexamers (Applied Biosystems), 0,5 μL de

inhibidor de ARNasas (Applied Biosystems), 0,5 μL de transcriptasa reversa (MuLV;

Applied Biosystems) y 1,5 μL de agua libre de ARNasas, siguiendo las recomendaciones

del fabricante. Las condiciones de la reacción de retrotranscripción fueron: 15 min a 20ºC,

30 min a 42ºC y un paso final de 5 min a 95ºC; luego se refrigeró y mantuvo a 4ºC.

Para las PBMCs, 0,05 μg de ARN total fueron primero desnaturalizados para, a

continuación, ser retrotranscritos usando el iScript™ cDNA synthesis kit (Bio Rad

Laboratories, Madrid, Spain), que emplea a la vez ramdom hexamers y oligoT como

cebadores, siguiendo las instrucciones del fabricante.

3.7.2. qPCR a tiempo real

El cDNA obtenido en la RT fue usado para la cuantificación de los niveles de ARNm de

los genes seleccionados. Se utilizaron 2 μL del producto de RT (dilución 1/20 o 1/5) y se

le añadieron 9 μL de la PCR-mix que contenía: 3,1 μL de H20 libre de ARNasas, 0,45 μL

de cada cebador (a una concentración de 2,5-10 μM) y 5 μL de Power Syber Green PCR

Master Mix (Applied Biosystems), siguiendo las recomendaciones del fabricante. En la

Tabla 3.1 se detallan las parejas de cebadores (primers) usadas. Todos los cebadores se

obtuvieron de Sigma Genosys (Sigma Aldrich Química SA, Madrid, España).

La reacción de amplificación y cuantificación se realizó en un termociclador

StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific,

Waltham, MA, EE.UU.), con las siguientes condiciones: una activación/ desnaturalización

de 10 min a 95ºC, seguida de 40 ciclos de dos temperaturas: 15 s a 95ºC (desnaturalización)

y 1 min a 60ºC (alineamiento y elongación) y por último una curva de fusión para verificar

la pureza de los productos obtenidos siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ciclo

umbral (Ct, del inglés threshold cycle) se calculó con el software del equipo (StepOne

Software v2.0) y la expresión relativa del gen de interés en cada muestra se calculó respecto

a la expresión del gen de referencia β-actina, que se ha usado ampliamente como un gen de

referencia para el tejido adiposo, hígado y las PBMC de ratones y ratas y para cultivos


53

primarios de (pre)adipocitos (Amengual et al., 2010; Granados et al., 2013; Mercader et

al., 2006; Musinovic et al., 2014; Petrov et al., 2016a; Petrov et al., 2016b) usando el

método 2-ΔCt. Se probaron diferentes genes de referencia con resultados similares.

Tabla 3.1. Secuencias de los cebadores usados para las PCR a tiempo real

Primer 5 a 3´

Forward (F) y Reverse (R)

Actb F: TACAGCTTCACCACCACAGC Mus/Rat 120

R: TCTCCAGGGAGGAAGAGGAT

Acox1 F: CCGCCACCTTCAATCCAG Mus 456

R: ACTCTTGGGTCTTGGGGTCA

Adlh9a1 F: AGACCATCAACAACGGGAAG Mus 199

R: TGGAAGGGATAGTTCCATGC

Atp5f1 F: GGGAACGGCTACATAAAGCA Mus 166

R: TTGGCAATGGTCTCCTTTTC

Cd137 F: AAGCAACCATTTAAGAAGGCGG Mus/rat 115

R: GGATGGCACATTACAGCTCG

Cpt1a F: CGAGAAGGGAGGACAGAGAC Mus/Rat 201

R: GGACACCACATAGAGGCAGAA

Cox8b F: TGCGAAGTTCACAGTGGTTC Mus 170

R: TGCTGCGGAGCTCTTTTTAT

Crabp2 F: AGGACTCAGCGTCCAGTGTT Mus 162

R: CACAGCGATCTTCCTCATCA

Cyp26a1 F: TGGGAGAGGGGAGAGAGGCTGGA Mus 290

R: CGAAACCCTCCTGGAACCGGA

Fabp5 F: ACTGAGACGGTCTGCACCTT Mus 165

R: CCCTCATTGCACCTTCTCAT

Fasn F: CGGCGAGTCTATGCCACTAT Mus 222

R: ACACAGGGACCGAGTAATGC

Fndc5 F: ATGAAGGAGATGGGGAGGAA Mus 102

R: GCGGCAGAAGAGAGCTATAACA

Hoxc9 F: CGGCAGCAAGCACAAAGA Mus/rat 138

R: AGAAACTCCTTCTCCAGTTCCA

Pcna F: TATTGGAGATGCTGTGGTGA Rat 204

R: AGTGGAGTGGCTTTTGTGAA

Ppara F: CGTTTGTGGCTGTGCAAGTT Mus 163

R: AGAGAGGACAGATGGGGCTC

Pparb/d F: GGAACAGCCACAGGAGGA Mus/Rat 155

R: AGGGAGGAAGGGGAGGAA

(Continúa)

Tamaño del

producto (pb)Gen Especie

Tesis Doctoral


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(Continúa)

Pparg F:AGAGCCTTCAAACTCCCTCA Mus/rat 230

R:GAGACATCCCCACAGCAAG

Ppargc1b F: TGAGGTGTTCGGTGAGATTG Mus 165

R: CCATAGCTCAGGTGGAAGGA

Rara F: TCTCCCTGGACATTGACCTC Mus 196

R: GTGTCTTGCTCAGGCGTGTA

Rarb F: GCCTCTGGGACAAATTCAGTGAAC Mus 272

R: GGCAAAGGTGAACACAAGGTCAG

Rarg F: AGGTCACCAGAAATCGATGC Mus 212

R: CTGGCAGAGTGAGGGAAAAG

Rxra F: TACCCACCACACCCACATT Mus 420

R: GGTTCCGCTGTCTCTTGTC

Rxrb F: AACCCTGGAGAGGTGGAGAT Mus 156

R: CAGGTGCTCCAGACACTTGA

Rxrg F: GCAAGAAGAAAGGCAGAGGA Mus/Rat 223

R: CCACTCAACGAGGGTGAAAA

Slc27a1 F: CAGGAGTGGAGGGGAAAG Mus/rat 131

R: CAGAAGACGCAGGAAGATGG

Srebp1c F: CAGCGGTTTTGAACGACA Mus 165

R: GCCAGAGAAGCAGAAGAGAAG

Tbx1 F: ACCCTCGAAAAGACAGCGAG Mus/rat 109

R: TGCGTGATCCGGTGATTCTG

Tfb2m F: CCAGAGTGGTTGCCTTTGA Mus 64

R: TTCCTCTGTAAGGGCTCCA

Tmem26 F: GCTGTTCCTGTTGCATTCCC Mus/rat 159

R: GGAGAAAGCCATTTGTAGCCTC

Ucp1 F: ACACCTGCCTCTCTCGGAAA Mus 76

R: TAGGCTGCCCAATGAACACT

Ucp1 F: GGGCTGATTCCTTTTGGTCT Rat 229

R: GGTGGTGATGGTCCCTAAGA

Ucp2 F: CCTACAAGACCATTGCACGA Mus/Rat 149

R: TGTCATGAGGTTGGCTTTCA

Yy1 F: TGAGAAAGCATCTGCACACC Mus 175

R: CGCAAATTGAAGTCCAGTGA

Zfp423 F: GTCACCAGTGCCCAGGAAGAAGAC Mus/Rat 144

R: AACATCTGGTTGCACAGTTTTACACTCAT


55

3.8. Contenido de ADN mitocondrial

El contenido relativo de ADN mitocondrial se determinó mediante la amplificación y

cuantificación de un fragmento de ADN mitocondrial específico de Rattus novergicus y de

un gen nuclear de una sola copia (beta-2-microglobulina, β2M) por qPCR en tiempo real.

El gen β2M ha sido descrito previamente como un buen marcador para identificar el ADN

nuclear (Venegas et al., 2011). Las PCRs se llevaron a cabo usando 0,02 ng de ADN y los

cebadores en una concentración final de 0.25 µM cada uno (para el fragmento de ADN

mitocondrial, Forward: 5´-GAGCATCTTATCCACGCTTCC-3’ y Reverse: 5’GGTG

GTACTCCCGCTGTAAA3’; para el gen β2M, Forward: 5´TGTCAGATATGTC

CTTCAGCAAGG-3’ y Reverse: 5’TGCTTAACTCTGCAGGCGTATG-3’) siguiendo

básicamente el protocolo descrito en el apartado anterior. El Ct se calculó con el software

del equipo (StepOne Software v2.0) y el contenido relativo del ADN mitocondrial en cada

muestra se calculó respecto al ADN nuclear como se describe en (Venegas et al., 2011).

3.9. Análisis de metilación de ADN por secuenciación con bisulfito

El ADN genómico del TABi, purificado con el kit Genomic DNA Clean & Concentrator

(Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.), se utilizó para determinar el patrón de metilación

de los sitios CpG en tramos reguladores (promotor o enhancer) de los genes Pparg2,

Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1, por secuenciación directa tras conversión con bisulfito.

Brevemente, 200 ng de ADN genómico se sometieron a reacción con bisulfito usando el

Kit EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research), de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Paralelamente, un estándar comercial universal de ADN metilado de ratón

(Zymo Research) fue convertido con bisulfito para monitorizar dicha reacción.

Se consideró que la reacción de conversión con bisulfito fue óptima cuando la conversión

del estándar comercial de ADN metilado fue > 99%. A continuación, el ADN tratado con

bisulfito (BS-DNA) se eluyó en 20 μL de H20 libre de ADNasas y ARNasas y su

concentración fue determinada con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Para la

amplificación de cada región a estudiar se utilizaron 5 ng (en 2µL) del BS-DNA y la DNA

polimerasa JumpStart™ REDTaq® ReadyMix™P (Sigma, Madrid, España), junto con los

cebadores específicos bisulfito correspondientes (forward y reverse, véase la Tabla 3.2).

Tras comprobar su integridad en un gel de agarosa, el producto de la PCR se purificó

usando el kit QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y se cuantificó con el

espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Aproximadamente 20±5 ng (en un 1µL) de ADN

se secuenciaron con el Kit BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Madrid,

España) utilizando el cebador reverse y siguiendo las instrucciones del fabricante, en un

termociclador (Applied Biosystems Termociclador 2720, Madrid, España). Los fragmentos

obtenidos se purificaron por precipitación en etanol y acetato de sodio y resolvieron

mediante electroforesis capilar en un Analizador Genético 3130 (Applied Biosystems,

Madrid, España).

Las secuencias obtenidas fueron alineadas con la secuencia original (no convertida)

utilizando el programa BiQ Analyzer (Bock et al., 2005) para un control de calidad. Todas

Tesis Doctoral


56

las muestras experimentales cumplieron con los estándares de calidad del programa (>80%

de alineación y >90% de conversión).

Con el tratamiento con bisulfito, las citosinas metiladas en el ADN permanecen intactas

mientras que las citosinas no metiladas son convertidas en uracilo y detectadas como

timinas tras la PCR. Para la cuantificación del grado de metilación de cada CpG de interés

en las muestras de tejido, la altura del pico de la citosina (phc) para esa posición se dividió

por la suma de los picos de citosina y timina (phc+t) y se multiplicó por 100 (phc/phc+t *

100) (Jiang et al., 2010), utilizando el software Chromas Lite versión 2.01 (Technelysium

Pty Ltd 2007).

Tabla 3.2. Secuencias de los cebadores específicos bisulfito utilizados

Programas utilizados para el diseño de los cebadores específicos bisulfito: a MethPrimer (Li and Dahiya,

2002), b BiSearch (Aranyi et al., 2006; Tusnady et al., 2005) y c PerlPrimer (Marshall, 2004).

3.10. Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media±error estándar de la media (SEM). Para

determinar la significancia estadística de las diferencias entre grupos se utilizó el test de la

t de Student de dos colas o el test no paramétrico U de Mann-Whitney (cuando el número

de individuos fue bajo) y el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc

DMS cuando se compararon entre sí más de dos grupos. Los coeficientes de correlación de

Pearson (r) o de Spearman (ρ) se utilizaron para identificar las asociaciones entre las

variables estudiadas, considerando todos los grupos conjuntamente. El umbral de

significación se estableció en P<0,05. En el Capítulo 2, se realizó un análisis de

componentes principales (PCA) para evaluar las relaciones entre los niveles relativos de

metabolitos en plasma, expresión de genes de interés en los tejidos y parámetros

Primer 5 a 3´

Forward (F) y Reverse (R)

Pcna a

F: TGGGTTAGTGTTGTGATGTTATAATTT 17 231

R: CCTAAATCAAACATACCTCAAACATAATA

Pparg2 a

F: AAATATTGAATGTGTGGGTTATTGG 4 433

R: CAACAACATCAAAAATAAACTTTACCTTAT

Rbp4 a,b

F: TTAGGGTAATAGGATTTGGAGGATATT 9 224

R: AAACTTACATAACCCTCCCTAACTCA

F: GTTTAGGYGGTGAGTTAGGGAGGG 25 215

R: ACCRCTCACCAACAAAAACC

Ucp1 c

F: GGTTATGTTGGGAGGGTTTAGAT 13 276

R: TATCCCCAAAAAACCTAATTCATACT

Zfp423 a

F: GTTTTTTTTATTTTTTTAGGGAGTT 2 265

R: AAAAATATCCCTCAACTCAACCTACT

F: GTTTTTGGTTTATGGAGGTAGTTAG 1 322

R: ATATCCCTCAACTCAACCTACTTAA

Núm. de

sitios CpG

Tamaño del

producto (pb)Gen


57

biométricos en los animales tratados con ATRA (50 mg/kg peso corporal) o con vehículo.

Las variables originales (117 variables) se tipificaron restándole a cada dato su media y

dividiéndolo por la desviación estándar. El análisis se basó en la matriz de correlación y los

componentes principales se consideraron significativos si aportaron más del 6% para la

varianza total (Priego et al., 2013). Los gráficos de puntuación biplot de PC1, PC2 y PC3

se utilizaron para examinar la posible contribución de estos componentes para discriminar

entre los animales tratados con ATRA o con vehículo (animales control). El análisis

estadístico se realizó utilizando el programa SPSS para Windows versión 23.0 (IBM SPSS

statistics, Chicago, IL, EE.UU.).

Tesis Doctoral


58

4. Resultados y Discusión

4.1. Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido adiposo

blanco inducida por ácido retinoico (Capítulo 1)

Tesis Doctoral


60

Resultados y Discusión

Capítulo 1

61

Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido

adiposo blanco inducida por ácido retinoico

4.1.1. Antecedentes

Los adipocitos blancos típicos son pobres en mitocondrias y tienen una baja capacidad

oxidativa. Debido a esto, la contribución del tejido adiposo blanco (TAB) al gasto

energético se considera relativamente pequeña. Sin embargo, hay estudios en humanos y

roedores que documentan una asociación inversa entre la capacidad oxidativa mitocondrial

en el TAB y la obesidad, así como ejemplos de intervenciones nutricionales y

farmacológicas en animales que confieren resistencia al desarrollo de obesidad en paralelo

a un aumento del metabolismo oxidativo en el TAB (Boudina and Graham, 2014; Flachs

et al., 2013). La estimulación de la capacidad oxidativa mitocondrial de los adipocitos

blancos ligada a un aumento del gasto energético en estas células a través de un mayor

desacoplamiento y/o desperdicio de energía vía ciclos fútiles, emerge, por tanto, como un

posible objetivo en el control de la obesidad y sus complicaciones médicas asociadas

(Bonet et al., 2013; Flachs et al., 2013).

La activación metabólica del TAB puede implicar la aparición de adipocitos más parecidos

al clásico adipocito del tejido adiposo marrón (TAM), rico en mitocondrias y especializado

en la respiración desacoplada y la termogénesis vía la proteína desacoplante 1 (UCP1). Este

proceso se denomina marronización (browning) y los adipocitos tipo marrón que aparecen

en el TAB se denominan adipocitos marrones inducibles, beige o BRITE (de brown-in-

white) (Giralt and Villarroya, 2013). La función termogénica final de los adipocitos

beige/BRITE no diferiría de la de los adipocitos marrones clásicos, aunque su contribución

al gasto energético global es menor (Shabalina et al., 2013). Los adipocitos beige/BRITE

y los marrones comparten la expresión de toda una serie de genes ligados a la termogénesis

y mecanismos comunes de inducción (por ejemplo, inducción mediada por agentes

noradrenérgicos como el frío) (Shabalina et al., 2013). Hay controversia en cuanto al origen

de los adipocitos beige/BRITE. Por una parte se cree que derivan de células precursoras

diferentes de las clásicas del TAM, de hecho se cree que están más cerca del linaje de los

adipocitos blancos (Park et al., 2014). Por otra parte, se cree que su aparición en el TAB

puede implicar procesos de transdiferenciación o remodelación metabólica de adipocitos

blancos a marrones. Las células beige/BRITE tienen un patrón de expresión génica distinto

del de los adipocitos blancos o marrones clásicos, lo que permite identificarlas y

monitorizar el proceso de marronización del TAB (Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al.,

2012; Wu et al., 2012). No obstante, la mayor parte de los marcadores de adipocito

beige/BRITE identificados en los últimos años no tienen funciones termogénicas o

adipogénicas aparentes, y se ha argumentado que el hecho deque se expresen o no tiene

poco que ver con la estructura y función de los adipocitos, sino que más bien reflejan

etapas/nichos durante el desarrollo (de Jong et al., 2015; Long et al., 2014).

El tratamiento in vivo con ácido retinoico todo trans (ATRA), la principal forma activa de

la vitamina A (retinol), induce en ratones la expresión de genes relacionados con la

oxidación de ácidos grasos y la termogénesis en depósitos de TAB (Berry and Noy, 2009;

Mercader et al., 2006). El TAB es, de hecho, un importante sitio de almacenamiento y

Tesis Doctoral


62

metabolismo de la vitamina A, así como un objetivo principal de la acción del ATRA

(Bonet et al., 2015; Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Landrier et al., 2012; Tourniaire

et al., 2009), que es una molécula altamente bioactiva que impacta muchos procesos

celulares por mecanismos genómicos y no genómicos (Theodosiou et al., 2010). El

tratamiento con ATRA también incrementa la capacidad oxidativa de lípidos en otros

tejidos como el TAM (Bonet et al., 2000; Puigserver et al., 1996), el músculo esquelético

(Amengual et al., 2008; Berry and Noy, 2009) y el hígado (Amengual et al., 2010). Como

resultado de todo ello, el tratamiento con ATRA reduce el peso corporal y la adiposidad

independientemente de cambios en la ingesta de alimento y mejora la tolerancia a la glucosa

y la sensibilidad a la insulina en ratones delgados y obesos (Berry and Noy, 2009; Bonet et

al., 2000; Felipe et al., 2004; Felipe et al., 2005; Mercader et al., 2006; Puigserver et al.,

1996; Ribot et al., 2001).

Más recientemente, en nuestro grupo hemos estudiado de una manera más específica el

impacto del ATRA sobre las mitocondrias de los adipocitos, en colaboración con el grupo

del Dr. Landrier (Universidad de Marsella). Hemos descrito en adipocitos 3T3-L1 maduros

en cultivo que la exposición a ATRA (1 M-10 M), además de reducir los lípidos

intracelulares y aumentar la tasa de oxidación de ácidos grasos (Mercader et al., 2007),

aumenta el consumo de oxígeno y el contenido en mitocondrias (Tourniaire et al., 2015).

Sin embargo, al inicio de esta tesis se sabía poco sobre los efectos del ATRA en las

mitocondrias del TAB en el animal intacto. Además, aunque los resultados en modelos

celulares apuntan a efectos directos del ATRA sobre el metabolismo oxidativo mitocondrial

en adipocitos, no se pueden descartar efectos indirectos del ATRA en este mismo sentido

in vivo, por ejemplo derivados de cambios en la producción de moléculas señal de secreción

que pueden favorecer la marronización del TAB, derivadas del propio TAB u otros tejidos.

Por todo lo anterior, el objetivo del presente capítulo ha sido caracterizar efectos directos

(i) e indirectos (ii) del tratamiento con ATRA sobre la capacidad funcional de las

mitocondrias y la expresión de marcadores de marronización y de adipocitos beige/BRITE

en depósitos de TAB de ratón in vivo. Además (iii), hemos querido explotar el modelo de

inducción de marronización por ATRA para identificar y validar nuevos marcadores

tisulares de marronización basados en transcritos de ARNm.

4.1.2. Resultados

4.1.2.1. Efecto del tratamiento con ATRA sobre la expresión de genes relacionados

con la función mitocondrial y marcadores de marronización y de adipocitos

beige/BRITE en el tejido adiposo blanco de ratón

El tratamiento con ATRA (50 mg de ATRA por kg de peso corporal y día, durante los 4

días precedentes al sacrificio) produjo en ratones NMRI una reducción significativa del

peso (Figura 4.1.1A) y de la adiposidad corporal (Figura 4.1.1E), sin cambios significativos

en la ingesta (Figura 4.1.1B), de acuerdo con trabajos previos del grupo (Amengual et al.,

2010; Mercader et al., 2006; Ribot et al., 2001). Los animales tratados con ATRA

exhibieron una reducción del 13,6% del peso corporal en comparación con los animales

control, siendo significativa dicha reducción del peso corporal a partir del segundo día de


Capítulo 1

63

tratamiento. La ingesta acumulada durante el tratamiento fue menor, aunque no

significativamente, en los animales tratados con ATRA, lo que podría contribuir en parte a

la pérdida de peso (Figura 4.1.1B). Por otro lado, la eficiencia energética (peso corporal

ganado en g por comida consumida en kg) durante el tratamiento fue 5 veces menor en los

ratones tratados con ATRA, lo que apunta a la implicación importante de mecanismos

metabólicos (Figura 4.1C). Al sacrificio, los animales tratados con ATRA exhibieron una

reducción del 15,1% de la adiposidad corporal (medida como la suma de los pesos de todos

los depósitos adiposos diseccionados y expresado relativo al peso del animal) en

comparación con los animales control, pero no en el peso relativo del hígado (Figura

4.1.1E). La reducción en la adiposidad afectó por igual todos los depósitos adiposos

estudiados, independientemente de su localización anatómica o tipología metabólica

(Figura 4.1.1D).

Figura 4.1.1. Ratones NMRI de 13 semanas de edad fueron tratados con 50 mg de ATRA por kg

de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria (; 100 µL)

durante los cuatro días previos al sacrificio. Los paneles muestran la evolución del peso corporal

(A), ingesta acumulada (B) y eficiencia energética (C) durante el tratamiento; el peso de los tejidos

adiposo marrón (TAM), adiposo blanco inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal

(TABe) e hígado (D) y el peso relativo (por 100 g de peso corporal, PC) de todos los tejidos adiposos

sumados (TA) y del hígado (E). Los datos de peso corporal y de pesos de tejido son la media±SEM

de 10-11 animales por grupo. La ingesta acumulada y la eficiencia energética se calcularon por

jaula y son la media±SEM de 4 jaulas por grupo (2-3 animales por jaula). * Diferente del grupo

control tratado con vehículo (P<0,05; prueba t de Student de dos colas).

Tesis Doctoral


64

Figura 4.1.2. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y de marcadores de

adipocitos beige/BRITE en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi, A), retroperitoneal

(TABrp, B) y epididimal (TABe, C) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso

corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días

previos al sacrificio. Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan

en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. *

Diferente del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando

0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).


Capítulo 1

65

Figura 4.1.3. Niveles de expresión de genes relacionados con la termogénesis y la mitocondria en

el tejido adiposo marrón (TAM) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso

corporal o vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos

al sacrificio (A). Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la

termogénesis y la mitocondria en TAM y tejido adiposo blanco inguinal (TABi) en el grupo control

(B). Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje

respecto al grupo control (en A) y en porcentaje respecto al TABi (en B), y son la media±SEM de

8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo y # diferente del TABi

(P<0,05; prueba t de Student de dos colas).

Figura 4.1.4. Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y

de marcadores de adipocitos beige/BRITE entre los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi),

retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) en ratones NMRI (grupo control). Los datos

normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al

depósito inguinal y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía

seguido de la prueba post-hoc DMS.

Sabíamos al iniciar esta tesis, por investigaciones previas en las que ha participado nuestro

grupo del LBNB, que el tratamiento con ATRA aumenta el consumo de oxígeno y el

contenido mitocondrial en adipocitos 3T3-L1 maduros en cultivo, desencadenando

cambios en la expresión génica que incluyen un aumento de la expresión de un conjunto de

genes vinculados a la replicación y transcripción del ADN mitocondrial, la biogénesis

mitocondrial y la fosforilación oxidativa (OXPHOS), como se desprende de un análisis

transcriptómico (Tourniaire et al., 2015). Entre los genes relacionados con la mitocondria

Tesis Doctoral


66

inducidos por ATRA en los adipocitos cultivados se encontraron los genes Ucp1, Ppara,

Ppargc1b, Tfb2m, Yy1, Atp5f1 y Cox8b. Para investigar el impacto del ATRA sobre las

mitocondrias del TAB in vivo, cuantificamos la expresión de los ARNm de estos genes en

los depósitos inguinal, retroperitoneal y epididimal de TAB en los ratones tratados con 50

mg de ATRA por kg de peso corporal en comparación con los animales control tratados

con vehículo. Como se puede observar en la Figura 4.1.2, los ARNm estudiados

aumentaron significativamente sus niveles, especialmente en los depósitos viscerales, en

los ratones tratados con ATRA. También analizamos la expresión de algunos de estos genes

en el TAM, en donde el tratamiento in vivo con ATRA incrementó los niveles de expresión

de Ucp1, Ppara y Cox8b, pero no de Atp5f1 (Figura 4.1.3A). A modo de control del

tratamiento, se constató que la expresión de Cyp26a1 resultó fuertemente inducida en los

tejidos adiposos de los ratones tratados con ATRA, lo que se muestra para el TAM en la

misma Figura 4.1.3A (Cyp26a1 es un gen diana del ATRA que codifica para una proteína

implicada en su catabolismo intracelular).

Asimismo, cuantificamos el impacto del tratamiento con ATRA sobre los niveles de

expresión en los depósitos de TAB de una serie de genes que han sido propuestos como

marcadores del fenotipo beige/BRITE, en concreto Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y

Tbx1 (descritos en (de Jong et al., 2015; García-Ruiz et al., 2015; Wu et al., 2012)). El

tratamiento con ATRA aumentó la expresión de Cd137 en todos los depósitos estudiados

pero la expresión de Slc27a1, Hoxc9 y Tbx1 sólo en algunos de ellos, principalmente los

depósitos viscerales (Figura 4.1.2). Además, se encontró una disminución de la expresión

de Tmem26 en todos los depósitos de TAB en los ratones tratados con ATRA (Figura 4.1.2).

En la Figura 4.1.4 se presenta la expresión relativa de estos diferentes genes en los tres

depósitos de TAB en los animales control. Comparativamente, el depósito de TAB inguinal

(subcutáneo) mostró mayores niveles de expresión del gen Ucp1 y de genes que codifican

para factores de transcripción y cofactores que rigen la expresión génica de la β-oxidación

de ácidos grasos y la biogénesis mitocondrial (esto es Ppara y Ppargc1b) respecto de los

depósitos viscerales, mientras que los depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal)

mostraron una mayor expresión con respecto al subcutáneo de genes que codifican para la

maquinaria OXPHOS (especialmente Atp5f1 y Cox8b). Aunque siempre muy por debajo

de los niveles de expresión observados para dichos genes en el TAM (véase la Figura

4.1.3B). En cuanto a los genes relacionados con el fenotipo beige/BRITE, la mayoría se

encontraron expresados a mayor nivel en TAB inguinal (subcutáneo) que en los depósitos

viscerales: esto fue así para Slc27a1, Tmem26 y Tbx1 y también para Cd137, más expresado

en TABi que en TABe (P=0,014, t de Student de dos colas) (Figura 4.1.4). La excepción

fue Hoxc9, que encontramos más expresado en los depósitos viscerales (retroperitoneal y

epididimal) (Figura 4.1.4). En conjunto, estos resultados están de acuerdo con resultados

previos que indican que el TAB subcutáneo es más propenso a la marronización que el

TAB visceral (Seale and Lazar, 2009) y que los adipocitos viscerales de roedores y

humanos contienen más mitocondrias y tienen una mayor capacidad oxidativa que los

adipocitos subcutáneos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe et al., 2010).


Capítulo 1

67

Figura 4.1.5. Microfotografías representativas de secciones de tejido adiposo blanco inguinal

(TABi, A), retroperitoneal (TABrp, B) y epididimal (TABe, C) de ratones NMRI tratados con 50

mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva; control) por inyección

subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los recuadros en la parte superior

derecha de las microfotografías muestran la inmunopositividad de COXIV, y los recuadros en la

parte inferior izquierda, la inmunopositividad de UCP1.

Para profundizar más en el impacto del ATRA sobre las mitocondrias del TAB, se realizó

tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-COXIV y anti-UCP1 y se determinaron

los niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear en los depósitos de TAB

inguinal, retroperitoneal y epididimal de los ratones tratados con 50 mg de ATRA por kg

de peso corporal en comparación con los animales control tratados con vehículo. En la

Tesis Doctoral


68

Figura 4.1.5 se muestran microfotografías representativas de estos diferentes depósitos de

TAB. El estudio histológico reveló adipocitos más pequeños en todos los depósitos de TAB

estudiados y la presencia de células multiloculares específicamente en el depósito

subcutáneo (TAB inguinal) en los ratones tratados con ATRA, en concordancia con

estudios previos (Mercader et al., 2006). El estudio inmunohistológico, por su parte, reveló

una mayor positividad de COXIV en todos los depósitos de TAB estudiados en los animales

tratados con ATRA. En depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal), el tratamiento

con ATRA conllevó una mayor positividad de COXIV en el citoplasma de adipocitos

uniloculares, sin positividad para la UCP1 (Figura 4.1.5B y C). Mientras que en el depósito

subcutáneo (inguinal) el tratamiento con ATRA conllevó la aparición de adipocitos

multiloculares que fueron altamente positivos para ambas proteínas, COXIV y UCP1

(Figura 4.1.5A).

Figura 4.1.6. Niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear en los tejidos adiposos

blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) (A) y en el tejido adiposo

marrón (TAM) (B) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con

vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al

sacrificio. Comparación de los niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear entre los

distintos tejidos adiposos blancos estudiados (C) y entre el TAM y el TABi (D) en el grupo control.

Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto

al grupo control (en A y B) o en porcentaje respecto al TABi (en C y D) y son la media±SEM de 8-

11 animales por grupo. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05)

de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS. # Diferente del

TABi (P<0,05; prueba t de Student de dos colas).


Capítulo 1

69

A diferencia de lo que sucede en los adipocitos 3T3-L1 (Tourniaire et al., 2015), los niveles

de ADN mitocondrial respecto al nuclear no se encontraron aumentados en ninguno de los

depósitos de TAB estudiados tras el tratamiento con ATRA in vivo (Figura 4.1.6A), y

tampoco en el TAM (Figura 4.1.6B). Los resultados obtenidos del tejido entero representan

la suma de las contribuciones de todos los tipos de células en el tejido y pueden generar

resultados diferentes a los observados en las condiciones/dosis del cultivo celular de

adipocitos maduros. Además, en otros sistemas celulares se ha demostrado que el ATRA

puede incrementar la bioenergética mitocondrial y el consumo de oxígeno, incluso sin

ningún aumento en el número de mitocondrias (Xun et al., 2012). Comparando la ratio

ADN mitocondrial/ADN nuclear entre los distintos depósitos de TAB en los animales

control (Figura 4.1.6C) vemos que los depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal)

presentaron un mayor contenido de ADN mitocondrial que el depósito subcutáneo

(inguinal), en concordancia con nuestros resultados de expresión de genes que codifican

para la maquinaria OXPHOS (también más expresados en los depósitos adiposos

viscerales) y resultados previos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe et al., 2010), y siempre

por debajo de los niveles de ADN mitocondrial observados en el TAM (Figura 4.1.6D).

En conjunto, los resultados presentados en esta sección demuestran un aumento de la

función mitocondrial en el TAB de los animales tratados con ATRA. Los resultados

también indican que, de los diferentes marcadores candidatos de adipocito beige/BRITE

ensayados, sólo Cd137 y tal vez Slc27a1 marcan la marronización del TAB inducida por

el tratamiento in vivo con ATRA en ratones. Mientras que otros marcadores candidatos,

como Hoxc9 y Tbx1, no cumplen el criterio de aumentar tras un estímulo de marronización

in vivo.

4.1.2.2. Efecto del tratamiento con ATRA sobre la expresión del gen de la IRISINA

en tejido adiposo e hígado de ratón

El músculo esquelético secreta toda una serie de moléculas señal reguladoras,

colectivamente denominadas mioquinas, como parte de cambios adaptativos,

especialmente cambios metabólicos asociados a la actividad física. Estas mioquinas no sólo

pueden actuar localmente en el músculo de manera autocrina/paracrina, sino que también

son liberadas al torrente sanguíneo como factores endocrinos para regular procesos

fisiológicos en tejidos distantes. Se ha propuesto que algunas mioquinas pueden ser señales

mediadoras de las acciones biológicas beneficiosas de la actividad física.

La IRISINA, derivada de la escisión de la proteína de membrana FNDC5, es una mioquina

que induce la marronización del TAM y un aumento concomitante del gasto energético

(Rodríguez et al., 2017). El tratamiento con ATRA en ratones provoca, junto con la

marronización del TAB (apartado anterior y (Mercader et al., 2006)), cambios metabólicos

en el músculo esquelético que recuerdan a los asociados a la actividad física, esto es,

aumenta la capacidad de oxidación de ácidos grasos, la respiración mitocondrial y la

termogénesis y reduce el contenido de lípidos intramiocelulares (Amengual et al., 2008;

Berry and Noy, 2009; Felipe et al., 2003). Interesantemente, el tratamiento con ATRA (en

las mismas condiciones usadas en esta tesis) incrementa los niveles circulantes de IRISINA

en ratones pero no la expresión de Fndc5 en músculo esquelético (Ribot J, Bonet ML y

Tesis Doctoral


70

Palou A, datos no publicados). Por otro lado, se ha descrito que el tejido adiposo no sólo

constituye un objetivo para la IRISINA, sino que también expresa el gen Fndc5 y secreta

IRISINA, aunque en menor medida que el músculo esquelético (Moreno-Navarrete et al.,

2013; Roca-Rivada et al., 2013). Más recientemente se ha descrito que el hígado también

expresa el gen Fndc5 y secreta IRISINA (Mo et al., 2016). El tratamiento con ATRA afecta

el metabolismo del hígado (Amengual et al., 2010), el TAM (Bonet et al., 2000; Puigserver

et al., 1996) y el TAB (Bonet et al., 2007; Mercader et al., 2006; Ribot et al., 2001), por lo

que podría afectar la producción en estos tejidos de señales de secreción reguladoras, como

la IRISINA.

Figura 4.1.7. Niveles de expresión de Fndc5 en hígado, tejido adiposo marrón (TAM) y tejido

adiposo blanco inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) de ratones NMRI

tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección

subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio (A). Comparación de los niveles de

expresión de Fndc5 entre los distintos tejidos adiposos estudiados (B) y entre el hígado y el TABi

(C) en el grupo control. Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se

expresan en porcentaje respecto al grupo control (en A) o en porcentaje respecto al TABi (en B y

C) y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con

vehículo y # diferente del TABi (P<0,05; prueba t de Student de dos colas). Letras diferentes indican

diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía

seguido de la prueba post-hoc DMS.


Capítulo 1

71

Por todo ello, en esta tesis hemos analizado la expresión del gen Fndc5 en el hígado, el

TAM y en el TAB inguinal, retroperitoneal y epididimal de ratones NMRI (de 13 semanas

de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de

oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.

Como se puede ver en la Figura 4.1.7A, el tratamiento con ATRA incrementó los niveles

de expresión del gen Fndc5 en hígado, TAM y TAB epididimal, y tendió a incrementarlos

en los otros dos depósitos de TAB estudiados. Comparativamente, entre los tejidos

adiposos la menor expresión de Fndc5 se encontró en el TAB epididimal (Figura 4.1.7B),

lo que estaría de acuerdo con resultados previos en ratas que indican menores niveles de

IRISINA en TAB visceral que en subcutáneo (Roca-Rivada et al., 2013), y es destacable

que los niveles de expresión de Fndc5 fueron mucho más altos en hígado que en cualquiera

de los tejidos adiposos (Figura 4.1.7C).

En conjunto, nuestros datos sugieren un origen hepático del incremento de la IRISINA

circulante en los animales tratados con ATRA y que los efectos del ATRA sobre la

marronización del TAB en parte podrían ser debidos a una acción indirecta a través de la

IRISINA de origen hepático. Se ha descrito que la inducción de Fndc5 selectivamente en

hígado induce la marronización del TAB en ratones (Mo et al., 2016). Nuestros resultados

también sugieren un efecto potenciador de la activación de la termogénesis y marronización

de los tejidos adiposos por un mecanismo autocrino/paracrino de la IRISINA de origen

adiposo, asimismo estimulado por el tratamiento con ATRA. En esta línea, se ha descrito

que la secreción de IRISINA por células 3T3-L1 resulta potenciada después de inducir en

ellas características de marronización mediante el knockdown de la proteína del

retinoblastoma (Moreno-Navarrete et al., 2013).

4.1.2.3. Identificación de la ratio Rarb/Rxrg como nuevo marcador transcriptómico de

marronización del TAB in vivo

En los últimos años se han dirigido numerosos esfuerzos a la identificación de marcadores

transcriptómicos que permitan distinguir los preadipocitos y adipocitos beige/BRITE

(Petrovic et al., 2010; Wu et al., 2012) y diferenciar los depósitos grasos en función de su

riqueza en diferentes tipos de adipocitos (beige/BRITE, marrón y blanco) (de Jong et al.,

2015). No obstante, los marcadores de adipocito beige/BRITE identificados en general no

tienen funciones termogénicas o adipogénicas aparentes, y su expresión parece estar más

ligada a la localización anatómica de los depósitos grasos que a las características

estructurales y funcionales de estos (Long et al., 2014).

Por ello, aquí nos planteamos investigar en marcadores de marronización del TAB con una

función bioquímica/metabólica. Concretamente, marcadores basados en la expresión en

TAB de factores de transcripción y proteínas de unión a lípidos que median las acciones

celulares del ATRA, un potente remodelador metabólico del TAB en roedores (Mercader

et al., 2006). En adipocitos y músculo esquelético, la actividad del ATRA está mediada en

gran parte por la activación de los heterodímeros de los receptores X de retinoides (RXRs)

con los receptores de ácido retinoico (RARs) o con el receptor activado por proliferadores

peroxisomales (PPAR) β/δ y sus respectivas proteínas intracelulares de unión a ácido

Tesis Doctoral


72

retinoico asociadas, CRABP-II (que transfiere el ATRA al RAR) y FABP5 (que transfiere

el ATRA al PPARβ/δ), lo que lleva a una mayor oxidación de lípidos, funcionalidad y

biogénesis mitocondrial y disipación de energía (Amengual et al., 2008; Berry and Noy,

2009; Mercader et al., 2006; Tourniaire et al., 2015).

Figura 4.1.8. Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y

marcadores de adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para factores de transcripción y proteínas de

unión a lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos no estimulados (células

control) derivados de la fracción estromal vascular (SVF) del tejido adiposo marrón (TAM), tejido

adiposo blanco inguinal (TABi) y TAB epididimal (TABe) de ratones NMRI. Los datos

normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las

células derivadas del TABi y son la media±SEM de dos experimentos independientes por

duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con

el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.

En una primera fase, que podríamos llamar de prospección, se establecieron cultivos

primarios a partir de la fracción estromal vascular (SVF) de TAM, TAB inguinal y TAB

epididimal de ratones NMRI, una cepa de ratón relativamente propensa genéticamente a la

marronización en comparación con otras (Petrovic et al., 2010). Las células se dejaron

diferenciar (de manera espontánea) in vitro en adipocitos maduros, utilizando un protocolo

de diferenciación idéntico para las tres SVF, el empleado rutinariamente para cultivos


Capítulo 1

73

primarios de (pre)adipocitos marrones (Bonet et al., 1997; Petrov et al., 2016b; Petrovic et

al., 2010; Siersbæk et al., 2012). A día 7, cuando más del 50% de las células se habían

diferenciado en adipocitos llenos de lípidos, se trataron con dos de los principales

reguladores de la expresión de la UCP1 (Palou et al., 1998; Silva and Rabelo, 1997), esto

es noradrenalina (NA) o ATRA, durante 24h, para evidenciar el fenotipo celular. En los

cultivos estimulados y en cultivos control no estimulados determinamos la expresión de

Ucp1 y otros genes relacionados con la termogénesis, genes marcadores de adipocitos

beige/BRITE y genes para factores de transcripción y proteínas de unión a lípidos asociadas

que median la acción del ATRA.

Como era de esperar (Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al., 2012), los adipocitos derivados

de TAM, TAB inguinal y TAB epididimal mostraron en condiciones basales (sin

estimulación por NA o ATRA) perfiles de expresión génica que reflejan las características

termogénicas y metabólicas de sus respectivos depósitos (Figura 4.1.8). Los adipocitos

derivados de TAM mostraron una expresión incrementada de Ucp1, Prdm16, Ppargc1a,

Cpt1b y Cox8b, todos ellos genes clásicamente relacionados con la termogénesis y el TAM,

y de Pparg, gen fundamental para la diferenciación/función de todo tipo de adipocitos

(Koppen and Kalkhoven, 2010), con respecto a los adipocitos derivados de TAB; los

adipocitos derivados del depósito de TAB epididimal fueron los que mostraron los niveles

más bajos de expresión de estos genes. Por otro lado, los adipocitos derivados de TAB,

especialmente del depósito inguinal, mostraron una expresión incrementada de los

marcadores de adipocito beige/BRITE Slc27a1, Hoxc9 y Tbx1 respecto de los adipocitos

derivados de TAM. También encontramos diferencias entre los adipocitos cultivados

derivados de los distintos depósitos grasos en la expresión de los receptores de ATRA y

sus proteínas asociadas (Figura 4.1.8B), que igualmente reflejan características de los

tejidos y depósitos de origen (Alvarez et al., 1995; Landrier et al., 2012; Villarroya et al.,

1999). Así, encontramos una mayor expresión de Rarb y menor de Rara en los adipocitos

derivados de TAM frente a los derivados de TAB, y una menor expresión de Rxrb, Rxrg,

Pparb/d y Fabp5 y mayor de Rarg y Crabp2 en los adipocitos derivados del depósito

blanco por excelencia, el TAB epididimal, con respecto a los derivados de TAM y TAB

inguinal.

Al estimular las células se hizo evidente que los adipocitos cultivados derivados de TAM,

TAB inguinal y TAB epididimal presentaron, en los tres casos, características de adipocito

tipo marrón ya que, en todos ellos, la estimulación aguda (1µM durante 24h) con NA indujo

la expresión de Ucp1 y Ppargc1a y la estimulación aguda con ATRA, la de Ucp1 (Figuras

4.1.9A, 4.1.10A y 4.1.11A). Aunque no se puede descartar que algunas de las diferencias

de expresión génica observadas aquí (del Pparg y otros genes) obedezcan en parte a

diferencias en el grado de diferenciación de los cultivos (Alvarez et al., 1995; Berry et al.,

2010; Koppen and Kalkhoven, 2010; Villarroya et al., 1999), los resultados sustentan la

existencia de al menos dos tipos de adipocitos diferentes en lo que respecta a su expresión

basal de genes termogénicos, pero ambos susceptibles de inducir la expresión de Ucp1, y

que se corresponderían, por tanto, con adipocitos marrones y adipocitos beige/BRITE. No

obstante, los marcadores de adipocito beige/BRITE Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y

Tesis Doctoral


74

Tbx1 no cumplieron los criterios esperables de resultar inducidos tras un estímulo de

activación de la capacidad termogénica como es el tratamiento agudo con NA o ATRA

(Figuras 4.1.9A, 4.1.10A y 4.1.11A), lo que nos animó en nuestra idea de identificar nuevos

marcadores de adipocitos beige/BRITE funcionales.

Figura 4.1.9. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y marcadores de

adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión a

lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos derivados de la fracción

estromal vascular del tejido adiposo marrón (TAM) estimulados a día 7 de cultivo con 1µM

noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos normalizados

a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las células control

no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por duplicado. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis

ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.

Nos centramos en la búsqueda de marcadores de adipocitos beige/BRITE funcionales

relacionados con la señalización por ATRA. Al analizar la expresión génica de los factores

de transcripción (Rara, Rarb, Rarg, Rxra, Rxrb, Rxrg y Pparb/d) y las proteínas de unión

a lípidos asociadas a ellos (Crabp2 y Fabp5) que median las acciones celulares del ATRA

observamos que el tratamiento agudo con ATRA indujo o tendió a aumentar la expresión

de Rarb, Rarg y Crabp2 e inhibió o tendió a disminuir la de Rara en los adipocitos marrones

derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y los adipocitos beige/BRITE derivados de TAB

inguinal y TAB epididimal (Figuras 4.1.10B y 4.1.11B). Esto está de acuerdo con


Capítulo 1

75

resultados previos que indican que los efectos del ATRA sobre la capacidad termogénica

de los adipocitos estarían canalizados por la vía CRABP2-RAR (Alvarez et al., 1995;

Berry and Noy, 2009; Murholm et al., 2013; Tourniaire et al., 2015). Es interesante destacar

que el tratamiento agudo con NA también moduló la expresión de algunos genes

relacionados con la señalización del ATRA en los cultivos primarios de adipocitos.

Concretamente el tratamiento con NA indujo la expresión de Crabp2 en los adipocitos

marrones derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y disminuyó o tendió a disminuir la expresión

de Rxrg en los adipocitos marrones derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y en los adipocitos

beige/BRITE derivados de TAB inguinal (Figura 4.1.10B).


adipocitos beige/BRITE (A) y de genes de los factores de transcripción y proteínas de unión a


estromal vascular del tejido adiposo blanco inguinal (TABi) estimulados a día 7 de cultivo con

1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos


células control no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por



Tesis Doctoral


76


adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión a


estromal vascular del tejido adiposo blanco epididimal (TABe) estimulados a día 7 de cultivo

con 1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos


células control no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por



Considerando (i) los efectos de los dos tratamientos “pro-termogénicos” aplicados sobre la

expresión de genes clave de la señalización por ATRA, que muestran inducción de Rarb

por ATRA (en adipocitos marrones y beige/BRITE) y represión de Rxrg por NA

(especialmente en adipocitos beige/BRITE) y (ii) los niveles de expresión basales de estos

genes en los adipocitos derivados de TAM y de TAB, que muestran una expresión de Rarb

mucho mayor en los adipocitos derivados de TAM, proponemos la ratio entre el nivel de

expresión de Rarb y de Rxrg como un nuevo marcador de marronización en adipocitos

derivados de TAB. Como se observa en la Figura 4.1.12 la ratio Rarb/Rxrg se encuentra

incrementada significativamente en los adipocitos derivados de TAB tratados con NA y con

ATRA con respecto a sus respectivos controles, mientras que en los adipocitos derivados de

TAM solamente se ve incrementada con el tratamiento con ATRA.


Capítulo 1

77

Figura 4.1.12. Ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg en adipocitos derivados de la

fracción estromal vascular del tejido adiposo marrón (TAM), tejido adiposo blanco inguinal (TABi)

y TAB epididimal (TABe) estimulados a día 7 de cultivo con 1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido

retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos se expresan en porcentaje respecto a las células

control no estimuladas de cada tejido y son la media±SEM de dos experimentos independientes por



A continuación quisimos validar nuestro nuevo marcador de marronización en el modelo

animal caracterizado en los apartados anteriores. Para ello, analizamos la expresión de los

factores de transcripción (Rara, Rarb, Rarg, Rxra, Rxrb, Rxrg y Pparb/d) y proteínas de

unión a lípidos asociadas (Crabp2 y Fabp5) que median la acción del ATRA, junto con la

de Pparg, en diferentes depósitos de TAB y en el TAM de ratones NMRI tratados con 50

mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección

subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.

Figura 4.1.13. Comparación de los niveles de expresión de genes de los factores de transcripción

y proteínas de unión a lípidos asociadas que median la acción del ATRA en el tejido adiposo marrón

(TAM) y en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal

(TABe) en ratones NMRI (grupo control). Los datos normalizados a la expresión del gen de

referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al depósito inguinal y son la media±SEM de 8-

11 animales por grupo. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05)

de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.

Tesis Doctoral


78

Como se observa en la Figura 4.1.13, encontramos diferencias en la expresión de los receptores

del ATRA y sus proteínas asociadas entre los distintos tipos de tejido adiposo (blanco y marrón)

y entre los distintos depósitos TAB (inguinal, retroperitoneal y epididimal) de los ratones

NMRI. En general, estas diferencias están en concordancia con los datos publicados (Alvarez

et al., 1995; Landrier et al., 2012; Villarroya et al., 1999). Así, encontramos una expresión

mucho mayor de Rarb, Rxra, Rxrg y Crabp2 en el TAM con respecto al TAB. Y una mayor

expresión de Rarb y Rxrb y menor de Rara, Rxrg y Pparb/d en el depósito de TAB con mayor

capacidad de remodelación (el inguinal) con respecto al TAB por excelencia (el epididimal).

La expresión del Pparg fue máxima en el TAM, seguido de los depósitos viscerales de TAB.

En la Figura 4.1.14 (A-D) se presentan los efectos del tratamiento con ATRA in vivo en ratones

sobre la expresión de estos genes. El tratamiento con ATRA aumentó o tendió a aumentar la

expresión de Rarb, Rarg y Crabp2 y redujo la de Fabp5 en todos los tejidos adiposos

estudiados, lo que está en consonancia con nuestros resultados en los cultivos primarios de

(pre)adipocitos y con la bibliografía que indica que los efectos del ATRA sobre la capacidad

termogénica de los adipocitos están mediados por la vía CRABP2-RAR (Alvarez et al., 1995;

Berry and Noy, 2009; Murholm et al., 2013; Tourniaire et al., 2015). Además, el tratamiento

in vivo con ATRA aumentó la expresión de Rxrb y Rxrg en el TAM y redujo la de Rara en los

depósitos de TAB inguinal y TAB retroperitoneal. La expresión de Pparg, por su parte, se vio

disminuida en los depósitos viscerales de TAB (epididimal y retroperitoneal), en concordancia

con resultados previos que muestran al TAB epididimal como el más sensible a los efectos

antiadipogénicos del ATRA (Ribot et al., 2001).


Capítulo 1

79

Figura 4.1.14. Niveles de expresión de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión

a lípidos asociadas que median la acción del ATRA en el tejido adiposo marrón (TAM, A) y en los

tejidos adiposos blancos inguinal (TABi, B), retroperitoneal (TABrp, C) y epididimal (TABe, D)

en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de

oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos

normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al grupo

control y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con

vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).

Al calcular la ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg como nuevo marcador de

marronización del TAB en nuestro modelo animal, observamos que dicha ratio Rarb/Rxrg

se ve significativamente incrementada tras el tratamiento con ATRA en todos los

depósitos de TAB, pero no en el TAM (Figura 4.1.15A). El nuevo marcador propuesto

aquí muestra en nuestro modelo un comportamiento parecido al de algunos marcadores de

adipocito beige/BRITE previamente descritos y aquí ensayados, como el Cd137 y tal vez

Slc27a1 (Figura 4.1.2). Interesantemente, la ratio Rarb/Rxrg como marcador muestra el

proceso de marronización de TAB diferenciado del proceso de activación del TAM. Así,

encontramos una correlación directa significativa entre la ratio Rarb/Rxrg y la expresión

de Ucp1 en el TAB pero no en el TAM (Figuras 4.1.15B y C, respectivamente).

Tesis Doctoral


80

Figura 4.1.15. Ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg (A) en el tejido adiposo marrón

(TAM) y en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal

(TABe) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo

(aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.

Correlación del ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg con los niveles de expresión de

Ucp1 en el TAB (B) y en el TAM (C). Los datos se expresan en porcentaje respecto al grupo control

y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo

(P<0,05; prueba t de Student de dos colas). r, Coeficiente de Pearson.

Los biomarcadores son particularmente interesantes si están ligados a muestras no

invasivas, fácilmente accesibles. Por ello, evaluamos la traslación de estos hallazgos en

TAB a la expresión génica de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Sin

embargo, la ratio Rarb/Rxrg no se encontró incrementada en las PBMC de los animales

tratados con ATRA (tratados con vehículo versus ATRA: 100±2 versus 67±17, n=3-5, no

significativo, U de Mann-Whitney), como tampoco la expresión génica en estas células

reflejó los efectos del ATRA de inhibir la adipogénesis y la expresión de ciertas

adipoquinas en TAB y adipocitos blancos (Petrov et al., 2016a). Así, nuestros resultados

apoyarían la idea de que la expresión génica en sangre total/PBMC refleja preferentemente

los efectos o imita el escenario metabólico encontrado en tejidos muy densamente

vascularizados como hígado o TAM (Petrov et al., 2016a) o procesos en TAB

estrechamente asociados con una activación de la angiogénesis (Voigt et al., 2015).


Capítulo 1

81

4.1.3. Discusión

Los adipocitos blancos de los depósitos de TAB son pobres en mitocondrias y tienen una

baja capacidad oxidativa y termogénica en concordancia a su función de almacén de

energía, mientras que lo contrario es cierto para los adipocitos marrones de los depósitos

de TAM, dada su especialización en la disipación regulada de energía o termogénesis

adaptativa a través de la actividad de la UCP1. La estimulación del gasto energético en el

TAB es una estrategia antiobesidad potencial, que puede lograrse activando en los

adipocitos blancos la termogénesis mediada por UCP1 y/o un ciclo de sustrato fútil de

hidrólisis de triacilgliceroles intracelulares y subsiguiente reesterificación de ácidos grasos

(ciclo TAG/FA) (Flachs et al., 2013). En estudios previos se demostró que el ATRA puede

inducir la UCP1 (Mercader et al., 2010; Tourniaire et al., 2015) y estimular un ciclo

TAG/FA en adipocitos blancos maduros cultivados, en asociación con un aumento de la β-

oxidación (Mercader et al., 2007). Además, se ha descrito un efecto positivo del ATRA

sobre la capacidad oxidativa y termogénica del TAB, vinculado a su efecto antiobesogénico

(Berry and Noy, 2009; Mercader et al., 2007; Mercader et al., 2006). Es importante destacar

que la activación de cualquiera de los dos mecanismos (UCP1 o ciclo fútil) debe

acompañarse de la inducción de la β-oxidación de los ácidos grasos y de la capacidad

OXPHOS mitocondrial para alcanzar un efecto significativo sobre el contenido intracelular

de lípidos o el gasto energético. Aquí, presentamos pruebas de un aumento de la función

mitocondrial en el TAB de los animales tratados con ATRA, necesaria para ambos

mecanismos de disipación de energía, los dependientes de UCP1 y los independientes de

UCP1.

Interesantemente, el tratamiento in vivo con ATRA indujo en el TAB subcutáneo (inguinal)

la aparición de células multiloculares similares a los adipocitos marrones y positivas para

UCP1 ‒ es decir, adipocitos beige/BRITE ‒ mientras que en los depósitos viscerales el

tratamiento con ATRA aumentó la capacidad OXPHOS sin inducir la aparición de tales

células. Además, nuestros resultados refuerzan la idea que el TAB subcutáneo es más

propenso a la marronización que el visceral, mientras que los depósitos de TAB viscerales

contienen más mitocondrias y tienen mayor capacidad oxidativa que los subcutáneos.

Parece, por lo tanto, que el tratamiento con ATRA es capaz de potenciar capacidades

intrínsecas diferenciales de cada tipo de depósito adiposo.

El efecto marronizante del TAB inducido por el ATRA in vivo sería consecuencia de

efectos directos sobre los adipocitos, pero podría estar potenciado por mecanismos de

acción indirectos. De hecho, nuestros resultados apuntan a una posible participación de la

IRISINA de origen hepático y de la IRISINA producida por el propio tejido adiposo, ya

que muestran que la expresión de esta señal marronizadora se induce en estos tejidos en

los animales tratados con ATRA.

En tanto que se considera la marronización del tejido adiposo como una potencial diana

antiobesidad (Bonet et al., 2013), la identificación y validación de marcadores de

marronización de TAB es de interés, ya que estos marcadores pueden servir para simplificar

y acortar ensayos en animales de nuevos ingredientes u otras intervenciones dietéticas

antiobesidad, y encontrar aplicabilidad en la sustanciación de declaraciones de propiedades

Tesis Doctoral


82

saludables en alimentos en relación con la obesidad, la adiposidad y problemas de salud

relacionados con la obesidad. Los adipocitos beige/BRITE muestran un patrón de expresión

génica distintivo (Wu et al., 2012), lo que ha llevado a la identificación de marcadores

transcriptómicos específicos para distinguirlos (de Jong et al., 2015; Petrovic et al., 2010;

Wu et al., 2012). Todavía no está claro si el empleo de estos marcadores de fenotipo

beige/BRITE para medir el grado de marronización en el TAB representa una mejora con

respecto a la evaluación de las transcripciones de los genes termorreguladores. De hecho,

mientras que la mayoría de dichos marcadores se expresan claramente en adipocitos

beige/BRITE en cultivo, hay discrepancias en cuanto a la especificidad de algunos de estos

marcadores para identificar marronización in vivo por su pequeño rango dinámico, potencia

del estímulo de marronización y edad de los ratones, cosa que pueden limitar su utilidad

(Garcia et al., 2016).

Nuestros resultados indican que Cd137 y tal vez Slc27a1 pueden tener utilidad como

marcadores de marronización en el TAB y discriminar adipocitos beige/BRITE, así como

adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada, de adipocitos blancos

puros in vivo. No obstante, otros marcadores de adipocitos beige/BRITE ensayados de los

propuestos en la literatura no cumplieron el criterio de aumentar tras un estímulo de

marronización como es el tratamiento con ATRA. Esto nos reafirmó en nuestro objetivo de

identificar nuevos marcadores de marronización funcionales, para lo que explotamos

paradigmas de marronización de adipocitos en cultivo primario (tratamiento con NA y

ATRA) y de marronización in vivo (tratamiento con ATRA por vía subcutanea).

Los resultados en adipocitos en cultivo primario sustentaron la existencia de al menos dos

tipos de adipocitos en lo que respecta a su expresión basal de genes termogénicos y de

genes relacionados con la señalización por ATRA, los adipocitos derivados de TAM (que

se corresponderían con adipocitos marrones) y los derivados de TAB (que se

corresponderían con adipocitos beige/BRITE). La consideración integrada de las

diferencias entre ambos tipos de adipocitos en el estado basal (no estimulado) y de los

efectos de los dos tratamientos “pro-termogénicos” aplicados nos ha llevado a proponer la

ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg como un posible nuevo marcador

de marronización. Este nuevo marcador incrementa en los adipocitos derivados de TAB

estimulados con NA y ATRA e, interesantemente, puede discriminar entre la activación del

TAM y la marronización del TAB in vivo, al menos en los animales tratados con ATRA.

4.1.4 Conclusión

En resumen, este trabajo demuestra que el ATRA, en su efecto antiobesogénico, impacta

en las mitocondrias de los adipocitos blancos, lo que lleva a una mayor funcionalidad

mitocondrial, necesaria tanto para los mecanismos de disipación de energía dependientes

de UCP1 como los independientes de UCP1 (e.g. ciclo fútil de hidrólisis de triacilgliceroles

intracelulares y reesterificación de ácidos grasos) (Bonet et al., 2013; Flachs et al., 2013).

Más aún, el tratamiento con ATRA es capaz de potenciar capacidades intrínsecas

diferenciales de cada depósito de TAB. Así, mientras que adipocitos tipo marrón

(multiloculares y que expresan UCP1) son fácilmente inducidos in vivo en el TAB

subcutáneo (inguinal) de ratones tratados con ATRA, en los depósitos viscerales


Capítulo 1

83

(retroperitoneal y epididimal) el tratamiento con ATRA aumenta la capacidad funcional de

las mitocondrias sin inducir la aparición de tales células. Algunos marcadores de adipocito

beige/BRITE (notablemente Cd137) son inducidos en el TAB subcutáneo y visceral de los

ratones tratados con ATRA, mostrando utilidad como marcadores de marronización o

activación metabólica del TAB, al marcar in vivo tanto los adipocitos tipo marrón inducidos

como los adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada. Además,

nuestros datos nos permiten identificar la ratio Rarb/Rxrg como un nuevo marcador de

marronización o activación metabólica del TAB. Nuestros datos también apoyan la idea de

que los efectos del ATRA sobre la capacidad oxidativa de los adipocitos estarían

canalizados vía Rarb/Crabp2 y sugieren que el efecto marronizante del TAB inducido por

el ATRA podría estar potenciado por mecanismos de acción indirectos a través de la

IRISINA de origen hepático y del propio tejido adiposo.

Tesis Doctoral


84

4.2. Biomarcadores circulantes de la acción metabólica del ácido retinoico: estudio

in vivo (Capítulo 2)

Tesis Doctoral


86


Capítulo 2

87

Capítulo 2: Biomarcadores circulantes de la acción metabólica del ácido retinoico:

estudio in vivo

4.2.1. Antecedentes

Resultados previos de nuestro grupo y otros grupos, expandidos en esta tesis (véase el

capítulo 1), indican que en ratones el tratamiento con ATRA incrementa la capacidad para

el metabolismo oxidativo en diferentes tejidos, incluyendo el TAB, en donde se evidencian

signos de marronización tras el tratamiento, el TAM, el hígado y el músculo esquelético

(revisado en (Bonet et al., 2012)). Junto con cambios en la expresión de genes metabólicos,

el tratamiento in vivo con ATRA conlleva la reducción del contenido en grasa corporal y

efectos beneficiosos sobre la tolerancia a la glucosa, la sensibilidad a la insulina y los

niveles de lípidos circulantes. En general, un incremento de la oxidación de combustibles

en los tejidos puede oponerse a la acumulación de grasa y contribuir a reducir los niveles

circulantes de glucosa y lípidos, por lo que puede ser interesante para el control y

tratamiento de la obesidad y complicaciones metabólicas como la diabetes o la

hiperlipidemia, frecuentemente asociadas a la obesidad. Los agentes capaces de inducir tal

incremento son por tanto de posible interés terapéutico.

Para avanzar en la identificación y evaluación de agentes/condiciones capaces de activar el

metabolismo oxidativo a nivel tisular, y así en nuevas estrategias para la prevención y el

tratamiento de la obesidad y sus complicaciones, es importante contar con biomarcadores

fácilmente accesibles, cuyos niveles en sangre u otros fluidos corporales reflejen los

cambios metabólicos propiciados por estos agentes en los tejidos internos. La identificación

de este tipo de biomarcadores puede contribuir asimismo a una mejor definición de los

propios mecanismos de acción de dichos agentes/condiciones, y con ello a una mejor

comprensión del control del metabolismo oxidativo tisular.

La sangre se viene utilizando tradicionalmente como una fuente de marcadores del estado de

salud, la progresión de la enfermedad y la respuesta a intervenciones nutricionales y

farmacológicas frente a ella. Muchos de los biomarcadores establecidos son metabolitos

discretos, cuyos niveles en plasma (o, en casos particulares, en células sanguíneas) son

informativos del estado de salud o de patologías puntuales. Más recientemente se está utilizando

la expresión génica en células sanguíneas como una fuente de posibles marcadores basados en

los niveles de determinados ARN mensajeros o conjuntos de ARN mensajeros. En este sentido,

resultados previos de nuestro grupo ya mostraron que, en ratones tratados con ATRA, la

expresión génica en sangre total refleja algunos de los cambios de expresión de genes metabólicos

que se producen en el hígado y los tejidos adiposos relacionados con la capacidad de oxidación

de ácidos grasos, la termogénesis y la remodelación del TAB (Petrov et al., 2016a).

Las tecnologías ómicas permiten un análisis exhaustivo, no sesgado, de los metabolitos,

proteínas y ARNs presentes en muestras biológicas. Por ello, el análisis metabolómico,

proteómico y transcriptómico de la sangre se está revelando como una fuente de nuevos

marcadores potencialmente útiles en diferentes contextos, incluyendo la obesidad y sus co-

morbilidades. La metabolómica, en particular, se considera una herramienta muy potente a

este fin. Estudios metabolómicos en animales experimentales y en humanos

Tesis Doctoral


88

obesos/diabéticos han llevado a proponer una serie de posibles marcadores plasmáticos que

estarían alterados en etapas tempranas del desarrollo de la obesidad y sus complicaciones,

o que incluso podrían servir para predecir la susceptibilidad futura a la obesidad. Entre los

biomarcadores asociados a la obesidad propuestos están los niveles de aminoácidos de

cadena ramificada (BCAA, del inglés branched chain amino acids), aminoácidos

aromáticos (AAA, aromatic amino acids), ácidos grasos no esterificados, ácidos orgánicos,

acilcarnitinas y fosfolípidos (Rauschert et al., 2014).

En esta tesis, nos planteamos como objetivo específico identificar y validar/contrastar

marcadores sanguíneos del incremento de la capacidad oxidativa/termogénica en tejidos

adiposos y otros tejidos explotando el modelo de tratamiento con ATRA detallado en el

apartado 3 de Materiales y Métodos (50 mg ATRA/kg peso ratón/día, por vía subcutánea, los

4 días anteriores al sacrificio). Para ello realizamos metabolómica dirigida de plasma y PBMC

de ratones control (a los que se había administrado el vehículo) y ratones tratados con ATRA.

En particular, se cuantificaron simultáneamente los niveles de acilcarnitinas y aminoácidos, así

como una serie de ácidos grasos y metabolitos clave del metabolismo intermediario, mediante

FIA-ESI-MS/MS. El método analítico utilizado es en esencia una extensión de una prueba

diagnóstica empleada rutinariamente en pediatría para detectar enfermedades metabólicas.

También analizamos la expresión en PBMC de genes seleccionados.

4.2.2. Resultados

4.2.2.1. Análisis metabolómico del plasma

En las Figuras 4.2.1 a 4.2.4 se presentan los niveles relativos de las diferentes metabolitos

analizados en plasma de ratones control (n=11) y ratones tratados con ATRA (n=11).

En general, los niveles plasmáticos de acilcarnitinas fueron mayores en los animales tratados

con ATRA. Estos presentaron niveles significativamente incrementados de acilcarnitinas de

cadena corta (C2-C7), en concreto AC2:0 (↑74%) y AC4OH (↑80%); de cadena media (C8–

C14), en concreto AC8:0 (↑72%) y AC12:1 (↑137%); y de cadena larga (C16–C20), en

concreto AC16DC (↑47%), AC18:1 (↑86%) y AC18:2 (↑91%). Los niveles plasmáticos de

carnitina libre también fueron significativamente mayores (↑53%) en los ratones tratados con

ATRA en comparación con los controles (Figura 4.2.1). El pico de AC4OH puede representar

distintos esteroisómeros que no se pueden resolver por el método de análisis empleado, en

concreto puede tratarse de: D-C4-OH-carnitina, derivada del cuerpo cetónico beta-

hidroxibutirato; L-C4-OH carnitina, derivada del intermediario de la oxidación de ácidos

grasos L-3-hidroxibutiril-CoA; y L-isoC4-OH-carnitina, derivada del intermediario del

catabolismo de la valina L-3-hidroxibutiril-CoA (Schooneman et al., 2013).

En lo que respecta a los niveles plasmáticos de aminoácidos, los ratones tratados con ATRA

presentaron niveles significativamente incrementados de cistina (↑51%) y creatina (↑31%) y

reducidos de citrulina (31%) (Figura 4.2.2). Los niveles de ornitina tendieron a ser menores

en el grupo ATRA (22%, P=0,128; prueba t de Student de dos colas), mientras que los de

arginina fueron muy similares en ambos grupos. La biodisponibilidad global de arginina, que

se define como la ratio entre los niveles de arginina y los de citrulina+ornitina (Tang et al.,


Capítulo 2

89

2009), resultó ser significativamente mayor en un 35% en el grupo ATRA (P=0,000; prueba t

de Student de dos colas). Además, aunque con importantes diferencias interindividuales, los

niveles plasmáticos de glicina y, especialmente, taurina tendieron claramente a ser mayores en

los ratones tratados con ATRA, por un factor de ~2 para la glicina (P=0,133; prueba t de

Student de dos colas) y de ~7 para la taurina (P=0,074). Los niveles de otros aminoácidos en

plasma, incluyendo aminoácidos de cadena ramificada (leucina, isoleucina, valina) y

aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano, tirosina), no mostraron cambios destacables

entre los dos grupos experimentales, con la excepción de una tendencia a la baja de los niveles

plasmáticos de serotonina en los ratones tratados con ATRA (Figura 4.2.2).

Figura 4.2.1. Niveles plasmáticos de acilcarnitinas en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA

por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los

cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje

respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo

control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de

Student de dos colas).

Figura 4.2.2. Niveles plasmáticos de aminoácidos en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA


cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje

respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo

control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de

Student de dos colas).

Tesis Doctoral


90

Figura 4.2.3. Niveles plasmáticos de colesterol y de los ácidos grasos palmítico, oleico,

araquidónico, eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) en ratones NMRI tratados con

50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea

diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan

en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente

del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba

t de Student de dos colas).

Figura 4.2.4. Niveles plasmáticos de metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo

intermediario en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con

vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al

sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje respecto al grupo control

y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo

(P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).

En la Figura 4.2.3 se presentan los niveles plasmáticos relativos de colesterol y de los ácidos

grasos palmítico (16:0), oleico (18:1), araquidónico (ARA, 20:4n-6), eicosapentaenoico (EPA;

20:5n-3) y docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3). Los ratones tratados con ATRA presentaron

niveles incrementados de ácido araquidónico (↑35%), EPA (↑29%) y, especialmente, DHA

(↑63%) en plasma. La ratio n-6/n-3 (ARA/EPA+DHA) fue un 15% menor en el grupo ATRA

(P=0,015; prueba t de Student de dos colas). Los niveles plasmáticos de ácido palmítico, ácido

oleico y colesterol no revelaron diferencias entre los grupos control y ATRA.


Capítulo 2

91

Finalmente, la Figura 4.2.4 muestra los niveles plasmáticos relativos de una serie de

metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo intermediario (hexosas, hexosas-

fosfato, lactato, citrato-isocitrato, malato, AMP, nicotinamida, colina y urea) en los grupos

control y tratado con ATRA. No se encontraron diferencias significativas, aunque los

niveles plasmáticos de lactato (P=0,150; prueba t de Student de dos colas) y, especialmente,

malato (P=0,087) tendieron a ser considerablemente más elevados y los de hexosas-fosfato

más reducidos (P=0,087) en el grupo ATRA.

4.2.2.2. Análisis metabolómico de las PBMC

En las Figuras 4.2.5 a 4.2.8 se presentan los niveles relativos de las diferentes metabolitos

analizados en PBMC de ratones control (n=3) y ratones tratados con ATRA (n=5).

Dificultades durante el aislamiento de las PBMC nos impidieron obtener esta fracción de

todos los animales, por lo que los resultados deben ser tomados con cautela, máxime teniendo

en cuenta que en el grupo control la dispersión de los resultados fue bastante grande.

Figura 4.2.5. Niveles de acilcarnitinas en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA


cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje

respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente del grupo

control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba U de

Mann-Whitney).

Aún así, los resultados apuntan a una reducción generalizada de los niveles relativos de

prácticamente todos los metabolitos analizados, excepto el EPA, en las PBMC de los

ratones tratados con ATRA en comparación con sus controles. Entre las acilcarnitinas, la

reducción llegó a ser significativa para la AC5:0 (66%) y clara para la AC4:0 (76%)

(Figura 4.2.5). En cuanto a los niveles de aminoácidos, la tendencia a la baja en las PBMC

del grupo ATRA fue manifiesta para todos ellos, alcanzándose la significancia estadística

para aspartato, glutamina, histidina, ornitina, serina y taurina, y con P<0,100 para alanina,

arginina, creatinina, cistina, glutamato, serotonina y tirosina (Figura 4.2.6); los niveles de

estos aminoácidos fueron entre un 65% y un 84% más bajos en las PBMC del grupo ATRA.

Los niveles de oleico fueron menores (81%) en las PBMC de los ratones tratados con

Tesis Doctoral


92

ATRA, que también tendieron a presentar niveles reducidos de colesterol (87%,

P=0,071), ácido palmítico (55%, P=0,143; prueba U de Mann-Whitney), ácido

araquidónico (40%, P=0,143; prueba U de Mann-Whitney) y DHA (67%, P=0,393;

prueba U de), aunque no de EPA (Figura 4.2.7). También los niveles plasmáticos relativos

de hexosas, hexosas-fosfato, citrato-isocitrato, AMP, colina, nicotinamida y urea tendieron

a ser menores en las PBMC del grupo ATRA, con P<0.100 para colina y urea, mientras

que lactato y malato fueron indetectables en las PBMC (Figura 4.2.8).

Figura 4.2.6. Niveles plasmáticos de aminoácidos en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg

de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria

durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en

porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente


U de Mann-Whitney).

Figura 4.2.7. Niveles de colesterol y de los ácidos grasos palmítico, oleico, araquidónico,

eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg

de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria

durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje

respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente del grupo control

tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba U de Mann-

Whitney).


Capítulo 2

93

Figura 4.2.8. Niveles de algunos metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo

intermediario en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o

con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al

sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje respecto al grupo control y

son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. Valores de P indicados cuando P<0,1 al analizar las

diferencias entre grupos mediante la prueba U de Mann-Whitney). n.d., no detectado.

4.2.2.3. Expresión génica en PBMC

En estudios previos, nuestro grupo había estudiado en ratones si la expresión génica en

sangre total podía reproducir cambios en la expresión génica inducidos por el ATRA en

tejidos internos (Petrov et al., 2016a). Aquí quisimos ir un paso más allá y usar

específicamente ARN extraído de PBMC aisladas, en lugar de ARN extraído de sangre

total, para así poder relacionar más directamente cambios en el metaboloma del plasma y

las PBMC con cambios en la expresión génica en estas células sanguíneas. Es conocido

que las PBMC expresan receptores de retinoides, RARs y RXRs (Szabova et al., 2003).

Seleccionamos para este análisis un conjunto de genes discretos, sensibles al ATRA en

tejidos de acuerdo con estudios previos y/o que pudieran estar relacionados con los cambios

más destacados revelados por el análisis metabolómico realizado (descritos en los apartados

anteriores). En concreto, determinamos por RT-qPCR a tiempo real en PBMC de ratones

control (n=3/4) y tratados con ATRA (n=5) los niveles de expresión de genes para:

proteínas desacoplantes (Ucp1 y Ucp2); enzimas limitantes de la beta-oxidación

mitocondrial y peroxisomal de ácidos grasos (Cpt1a y Acox1, respectivamente); proteínas

relacionadas con la lipogénesis y su control (Fasn y Srebp1c); posibles marcadores de

adipocitos beige/BRITE (Tmem26); una aldehído deshidrogenasa que interviene en la ruta

de biosíntesis de carnitina y es inducida por ATRA en tejido adiposo (Aldh9a1) (Berry and

Noy, 2009); y Cyp26a1 a modo de control positivo, ya que este gen codifica para una

proteína del catabolismo del ATRA y se induce en condiciones de abundancia de ATRA.

Los resultados mostraron una inducción de Cyp26a1 (~x130) y una tendencia a una mayor

expresión de Cpt1a (~x7) y menor de Aldh9a1 (42%) en las PBMC del grupo ATRA.

También apreciamos la tendencia a una menor expresión de los genes lipogénicos Fasn

(60%, P=0,190; prueba U de Mann-Whitney) y Srebp1c (76%, P=0,556; prueba U de

Tesis Doctoral


94

Mann-Whitney) en las PBMC del grupo ATRA, que no alcanzó la significancia estadística

debido al bajo número de animales en el grupo control y las importantes diferencias

interindividuales entre ellos. No se detectaron cambios destacables con el tratamiento con

ATRA en los niveles de expresión de Ucp1, Ucp2, Tmem26 y Acox1 en las PBMC (Figura

4.2.9).

Figura 4.2.9. Niveles de ARNm de los genes indicados en PBMC de ratones NMRI tratados con

50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea

diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan

en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente


U de Mann-Whitney).

4.2.2.4. Análisis de componentes principales y de correlaciones

Se realizó un análisis estadístico de componentes principales (PCA, principal components

analysis) y un análisis de correlaciones con el fin de estudiar posibles relaciones entre el

perfil metabolómico del plasma y la eficiencia energética, la adiposidad (peso de los tejidos

adiposos) y los marcadores relacionados con la capacidad oxidativa/termogénica en los

tejidos adiposos estudiados en el capítulo 1.

En el análisis PCA, los tres primeros componentes (PC1, PC2 y PC3) explicaron

aproximadamente la mitad de la varianza total y se representan dos a dos en la Figura

4.2.10. El análisis por PCA, y particularmente el PC2, discriminó claramente entre los

grupos ATRA y control. El PC1 quedó definido por los niveles plasmáticos de las AC de

cadena larga y media insaturadas y los de algunos aminoácidos; el PC3, por los niveles

plasmáticos de metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo intermediario; y el

PC2, por variables “clásicas” que ya sabíamos afectadas por el ATRA por estudios

anteriores, como la eficiencia energética, la adiposidad corporal y la expresión de Ucp1 en

TAM y de Ppara y Pparg en TAB retroperitoneal, junto con parámetros metabolómicos

revelados en esta tesis, en concreto los niveles plasmáticos de carnitina, algunas AC

(AC2:0, AC3DH/AC4OH, AC8:0 y AC16DC) y DHA (ver Anexo 2A).

A continuación analizamos posibles correlaciones entre los niveles plasmáticos de los

metabolitos más significativos incluidos en el componente PC2 (carnitina, AC2:0,

AC3DH/AC4OH, AC8:0, AC16DC y DHA) y las variables relativas a las capacidades

metabólicas del TAM y del TAB subcutáneo (inguinal) y visceral (retroperitoneal +


Capítulo 2

95

epididimal) analizadas. Como se muestra en la Tabla 4.2, los niveles plasmáticos de AC2:0,

AC8:0, AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA, pero no los de carnitina, correlacionaron

inversamente con la eficiencia energética y el peso del TAM y el TAB subcutáneo, y

directamente con los niveles de ARNm de Ucp1 y Ppara en el TAM. Los niveles

plasmáticos de acilcarnitinas (especialmente AC2:0) y de DHA también correlacionaron

directamente con los niveles de ARNm de Ucp1 y Ppara en el TAB (especialmente en los

depósitos viscerales) e, interesantemente, con la ratio entre la expresión génica de Rarb y

Rxrg (Rarb/Rxrg) en el TAB, identificada en el capítulo 1 de esta tesis como un marcador

de marronización/activación metabólica del TAB. También encontramos correlaciones

inversas entre los niveles plasmáticos de acilcarnitinas (especialmente la AC2:0) y DHA y

los niveles de ARNm de Pparg en los depósitos de TAB visceral. Por su parte, los niveles

plasmáticos de carnitina correlacionaron directamente con los de ARNm de Ucp1 y la ratio

Rarb/Rxrg en el TAB visceral.

Figura 4.2.10. Gráfico de puntuación biplot del componente principal (PC) 1, PC2 y PC3. Se realizó

un análisis de componentes principales (PCA) con 117 variables ‒ incluyendo metabolitos en

plasma, expresión de genes de interés en tejidos y parámetros biométricos ‒ de ratones NMRI

tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección

subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio (11 animales por grupo). Entre

paréntesis se indica el % de varianza explicada por cada PC.

Tesis Doctoral


96

Tabla 4.2. Correlaciones entre parámetros seleccionados más significativos

Se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman. En la tabla se muestra el coeficiente de

correlación (ρ), la significancia estadística y el número de animales. La correlación positiva

significativa se muestra resaltada en amarillo y la negativa en azul; las correlaciones significativas

más fuertes (ρ≥0,500) se resaltan con un color amarillo o azul más oscuro y las más débiles

(ρ<0,500), con un color amarillo o azul más claro. ** indica que la correlación es significativa en

el nivel 0,01 (bilateral) y * indica que la correlación es significativa en el nivel 0,05 (bilateral). UA,

unidades arbitrarias.

Carnitine AC2:0 AC3DC/AC4OH AC8:0 AC16DC DHA

(UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %)

ρ -,270 -,759** -,521* -,490* -,727** -,665**

Sig. ,224 ,000 ,013 ,021 ,000 ,001

N 22 22 22 22 22 22

ρ -,365 -,744** -,470* -,462* -,591** -,642**

Sig. ,113 ,000 ,036 ,040 ,006 ,002

N 20 20 20 20 20 20

ρ ,335 ,783** ,474* ,618** ,513* ,658**

Sig. ,128 ,000 ,026 ,002 ,015 ,001

N 22 22 22 22 22 22

ρ ,346 ,484* ,469* ,467 ,761** ,781**

Sig. ,160 ,042 ,050 ,050 ,000 ,000

N 18 18 18 18 18 18

ρ ,038 ,129 ,202 ,348 -,085 ,051

Sig. ,867 ,566 ,368 ,112 ,706 ,820

N 22 22 22 22 22 22

ρ ,445* ,273 ,095 -,087 -,126 -,090

Sig. ,043 ,232 ,683 ,708 ,586 ,699

N 21 21 21 21 21 21

ρ -,390 -,698** -,597** -,405 -,551* -,542*

Sig. ,089 ,001 ,005 ,076 ,012 ,014

N 20 20 20 20 20 20

ρ ,203 ,215 -,145 ,192 ,129 ,183

Sig. ,391 ,363 ,541 ,416 ,587 ,439

N 20 20 20 20 20 20

ρ ,258 ,435 ,357 ,451 ,247 ,461*

Sig. ,286 ,063 ,133 ,053 ,307 ,047

N 19 19 19 19 19 19

ρ ,116 ,082 ,036 -,039 ,005 ,042

Sig. ,608 ,717 ,875 ,863 ,982 ,852

N 22 22 22 22 22 22

ρ ,043 ,517* ,439* ,344 ,423* ,319

Sig. ,848 ,014 ,041 ,117 ,050 ,148

N 22 22 22 22 22 22

ρ -,109 -,196 -,171 -,080 -,247 -,176

Sig. ,502 ,225 ,290 ,625 ,125 ,278

N 40 40 40 40 40 40

ρ ,487** ,552** ,443** ,102 ,434** ,352*

Sig. ,001 ,000 ,004 ,530 ,005 ,026

N 40 40 40 40 40 40

ρ ,273 ,164 ,140 ,138 ,222 ,171

Sig. ,088 ,312 ,390 ,395 ,169 ,292

N 40 40 40 40 40 40

ρ -,274 -,502** -,263 -,206 -,353* -,385*

Sig. ,092 ,001 ,106 ,208 ,027 ,016

N 39 39 39 39 39 39

ρ ,397* ,619** ,311 ,441** ,357* ,521**

Sig. ,014 ,000 ,057 ,006 ,028 ,001

N 38 38 38 38 38 38

mRNA Ucp1 (%)

mRNA Ppara (%)

mRNA Pparg (%)

Ratio Rarb/Rxrg (%)

mRNA Ucp1 (%)

mRNA Ppara (%)

mRNA Pparg (%)

Ratio Rarb/Rxrg (%)

Peso tejido (mg)

Tejido adiposo blanco subcutáneo (inguinal)

Tejido adiposo blanco visceral (retroperitoneal + epididimal)

Peso tejido (mg)

Ratio Rarb/Rxrg (%)

Tejido adiposo marrón (TAM)

Eficiencia

energética (g/kg)

Peso tejido (mg)

mRNA Ucp1 (%)

mRNA Ppara (%)

mRNA Pparg (%)


Capítulo 2

97

4.2.3. Discusión

El análisis realizado muestra que el modelo de tratamiento con ATRA en ratones tiene un

profundo impacto sobre el metaboloma del plasma y nos ha permitido identificar

marcadores sanguíneos potenciales del incremento de la actividad oxidativa/termogénica

tisular. A continuación se discuten los resultados más destacados.

El tratamiento con ATRA conllevó un aumento generalizado de los niveles de

acilcarnitinas en plasma. Estos niveles se cree que constituyen una “foto fija” que refleja

la exportación de acilcarnitinas desde los diferentes tejidos, así como la captación de

acilcarnitinas circulantes por estos. De acuerdo con esta idea, un estudio en ratones

sometidos a ayuno concluyó que los cambios cualitativos y cuantitativos en las

acilcarnitinas circulantes no se corresponden completamente con los cambios detectados a

nivel tisular en músculo, hígado, TAB o TAM, aunque sí que, en general, niveles

incrementados en plasma se corresponden con niveles incrementados en estos diferentes

tejidos (Schooneman et al., 2014).

Niveles altos de acilcarnitinas en plasma pueden ser indicativos de trastornos de la β-

oxidación mitocondrial pero también se asocian a condiciones fisiológicas en que la tasa

de oxidación de ácidos grasos está elevada, como el ayuno a corto plazo o el ejercicio

(Longo et al., 2006; McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). El aumento

generalizado observado estaría, por tanto en consonancia con resultados previos que

indican que el tratamiento con ATRA activa la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos en

diversos tejidos. Así, el tratamiento con ATRA resulta en una reducción de la masa de los

depósitos de TAB y de los niveles circulantes de leptina (Felipe et al., 2004; Mercader et

al., 2006; Ribot et al., 2001); un aumento de los niveles circulantes de cuerpos cetónicos,

pero no de ácidos grasos libres (que serían oxidados, activamente) (Amengual et al., 2010);

y una reducción de los triacilgliceroles tisulares en hígado (Amengual et al., 2010) y

músculo esquelético (Amengual et al., 2008). Estos cambios son paralelos a la inducción

de la expresión de genes para proteínas implicadas en el metabolismo oxidativo en TAB

(Mercader et al., 2006; Tourniaire et al., 2015), hígado (Amengual et al., 2010) y músculo

(Amengual et al., 2008), y en la termogénesis en el TAM (Bonet et al., 2003).

En particular, el tratamiento con ATRA induce la expresión de la enzima limitante de la

beta-oxidación mitocondrial de ácidos grasos, la CPT1, en hígado, músculo y TAB, y de la

enzima limitante de la beta-oxidación peroxisomal, la ACOX1, en músculo esquelético

(pero no en hígado). Es importante destacar que el tratamiento con ATRA también induce

la expresión de genes para proteínas que están corriente abajo de la beta-oxidación en el

metabolismo oxidativo mitocondrial, como son: la aconitasa del ciclo de Krebs en depósitos

de TAB (Tourniaire et al., 2015); componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, en

concreto subunidades de la citocromo oxidasa, en músculo esquelético y TAB (Amengual

et al., 2008; Mercader et al., 2006); y proteínas desacoplantes, a saber UCP1 en TAM,

UCP2 en hígado y UCP3 en músculo esquelético (Bonet et al., 2012). La activación del

metabolismo oxidativo tras el tratamiento in vivo con ATRA en buena parte se derivaría de

efectos directos sobre las células, ya que la exposición a ATRA incrementa la expresión de

genes del metabolismo oxidativo y la oxidación de palmitato exógeno en adipocitos

Tesis Doctoral


98

(Mercader et al., 2007), células hepáticas HepG2 (Amengual et al., 2012) y miotubos

C2C12 (Amengual et al, resultados no publicados). Los efectos del ATRA sobre el

metabolismo oxidativo han sido relacionados con la activación de diversos receptores

nucleares y vías de señalización (Bonet et al., 2012).

Los resultados muestran los siguientes efectos destacados del tratamiento con ATRA sobre

el perfil plasmático de acilcarnitinas:

− Un aumento de la serie AC18:1, AC16:1, AC14:1 y AC12:1 (significativo para

AC18:1 y AC12:1), que sugiere que el tratamiento con ATRA estimula la

movilización y oxidación de ácido oleico (18:1), que es uno de los ácidos grasos más

abundantes en el TAB, tanto en humanos como en ratones (Ahn et al., 2010).

− Un incremento significativo de los niveles de AC8:0, que podría reflejar un

incremento de la oxidación peroxisomal de ácidos grasos, ya que esta rinde

específicamente en abundancia AC8:0 (Poirier et al., 2006), que se avendría con el

incremento de la expresión de ACOX1, enzima limitante de la beta-oxidación

peroxisomal, descrito en músculo esquelético de ratones tratados con ATRA

(Amengual et al., 2008).

− Un incremento significativo de los niveles del AC16DC, que podría reflejar un

incremento de la omega-oxidación de ácidos grasos de cadena larga. La omega-

oxidación ocurre en el retículo endoplásmico, fundamentalmente en el hígado, sobre

ácidos grasos de cadena media y larga, y consiste en la oxidación del grupo metilo

terminal de la cadena de acilo, rindiendo un ácido dicarboxílico que es degradado vía

beta-oxidación (Wanders et al., 2001).

− Un incremento significativo de los niveles de acetilcarnitina (AC2:0, derivada de

acetil-CoA) y de AC4OH (posiblemente derivada de beta-hidroxibutirato), que

reflejaría una oxidación aumentada de ácidos grasos hasta acetil-CoA en diversos

tejidos y una cetogénesis hepática incrementada.

− Un incremento significativo de los niveles de carnitina libre en plasma, que permitiría

encarar el incremento de la oxidación de los ácidos grasos movilizados del TAB

(véase más abajo).

Aunque el pico de AC4OH en nuestros análisis puede representar distintos esteroisómeros

(D-C4-OH-carnitina, L-C4-OH carnitina o L-isoC4-OH-carnitina), nuestra interpretación

es que se trataría mayoritariamente de D-C4-OH-carnitina derivada de beta-hidroxibutirato,

porque el tratamiento con ATRA se acompaña de un incremento de los niveles circulantes

de este cuerpo cetónico (Amengual et al., 2010) y en cambio no altera los niveles

circulantes de valina (cuyo catabolismo rinde L-isoC4-OH-carnitina). Pensamos que la

AC4OH incrementada en plasma provendría principalmente del hígado, porque el hígado

es el principal sitio de síntesis de cuerpos cetónicos y porque resultados previos muestran

que en células hepáticas (HepG2) la exposición a ATRA incrementa la conversión de

palmitato exógeno en CO2 y en productos ácidos solubles que incluyen cuerpos cetónicos

(además de acetil-CoA, acilcarnitinas de cadena corta e intermediarios del ciclo de Krebs)

(Amengual et al., 2012). [El tratamiento con ATRA también estimula el metabolismo


Capítulo 2

99

oxidativo en músculo esquelético, que también es un sitio de síntesis de cuerpos cetónicos

(Soeters et al., 2012), pero resultados de nuestro grupo indican que en células musculares

(miotubos C2C12) la exposición a ATRA incrementa la oxidación completa de ácidos

grasos hasta CO2, pero no los niveles de productos ácidos solubles (Amengual et al.,

resultados no publicados)].

Niveles incrementados de acilcarnitinas de cadena larga en plasma y tejidos han sido

descritos en asociación a la obesidad y la resistencia a la insulina (Adams et al., 2009;

Koves et al., 2008; Mihalik et al., 2010; Sampey et al., 2012; Zhang et al., 2014b), pero

también tras la pérdida de peso y con el ejercicio, junto con incrementos de la sensibilidad

a la insulina a nivel sistémico (Gopalan et al., 2016; Redman et al., 2011; Schooneman et

al., 2016). Es interesante destacar que, mientras que el incremento de acilcarnitinas de

cadena larga que se produce en condiciones de obesidad, dieta rica en grasa o estrés lipídico

se asocia a la depleción del fondo de carnitina intracelular y a niveles plasmáticos de

carnitina libre disminuidos (Seiler et al., 2014; Wessels et al., 2015), la acumulación de

acilcarnitinas que se produce en condiciones de pérdida de peso o ejercicio es paralela a un

aumento de los niveles de carnitina libre en tejidos y/o plasma (Gopalan et al., 2016;

Schooneman et al., 2016). En este sentido, es destacable nuestro resultado de que, junto

con el incremento de los niveles circulantes de acilcarnitinas, el tratamiento con ATRA

conllevó un incremento de los niveles de carnitina libre en plasma. Resultados previos

han mostrado que el tratamiento con ATRA en ratones aumenta la tolerancia a la glucosa

y la sensibilidad a la insulina (con reducción del índice HOMA) y mejora el perfil de

adipoquinas relacionadas con la resistencia a la insulina, como la resistina y la RBP4

(Felipe et al., 2004; Mercader et al., 2008). Por tanto, en conjunto los resultados de esta

tesis refuerzan la idea de que niveles incrementados de acilcarnitinas reflejan

primariamente aumentos en el flujo a través de la beta-oxidación, más que defectos en la

sensibilidad a la insulina, particularmente cuando se acompañan de un incremento de los

niveles de carnitina libre.

En relación con la base molecular del incremento de los niveles plasmáticos de carnitina

libre en el grupo ATRA, cabe señalar que en preadipocitos y adipocitos en cultivo

expuestos a ATRA y en TAB de ratones tratados in vivo con ATRA se ha descrito la

inducción de la expresión génica de una enzima clave en la síntesis de novo de carnitina, la

ALDH9A1 (es la 4-N-trimetil-aminobutiraldehído deshidrogenasa que cataliza el tercer

paso de esta ruta) (Berry and Noy, 2009). Así pues, el incremento observado podría reflejar,

al menos en parte, un incremento de la síntesis endógena de carnitina, aunque no pueden

descartarse otras explicaciones. La carnitina se obtiene mayoritariamente de alimentos de

origen animal en la dieta, pero en parte es sintetizada a partir de lisina y metionina (con la

participación de ácido ascórbico, nicotinamida, vitamina B6 y hierro como cofactores),

fundamentalmente en hígado, riñón y cerebro, y es captada por el músculo y otros órganos

a través de un transportador de membrana (OCTN2) (Reuter and Evans, 2012). En roedores

y otros mamíferos, el ayuno incrementa la síntesis endógena y la captación de carnitina por

los tejidos, un efecto que viene mediado por la activación del PPAR, que transactiva genes

de la biosíntesis de carnitina así como el gen para OCTN2 (Ringseis et al., 2009; van Vlies

et al., 2007). Desde un punto de vista etiológico, parece lógico que agentes/condiciones

Tesis Doctoral


100

que promueven la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos, como el ayuno o, en nuestro

caso, el tratamiento con ATRA, favorezcan también un incremento de la disponibilidad de

carnitina, necesaria para este metabolismo.

Incrementos de los niveles de carnitina como los propiciados por el tratamiento con ATRA

pueden ser de interés de cara al mantenimiento de la salud metabólica, especialmente en un

ambiente obesogénico. Estudios en modelos animales han mostrado que la insuficiencia en

carnitina a nivel sistémico es común en estados de resistencia a la insulina ligados a la edad

avanzada, la diabetes genética y la obesidad inducida por la dieta, y se asocia a alteraciones

del metabolismo energético mitocondrial (Noland et al., 2009). En ratas de edad avanzada

alimentadas crónicamente con dieta rica en grasa, la suplementación por vía oral con

carnitina incrementa los niveles en plasma y tejidos y mejora la condición metabólica a

nivel sistémico y la función de las mitocondrias musculares, asociado a un incremento de

la exportación (efflux) y la excreción urinaria de acilcarnitinas (Noland et al., 2009). Esto

viene a subrayar la importancia de la carnitina a la hora de exportar de la mitocondria el

exceso de carbonos combustibles, que podrían interferir con la función mitocondrial de no

ser eficientemente exportados (Noland et al., 2009). Otros estudios han mostrado efectos

positivos de la suplementación con carnitina en pacientes con síndrome metabólico (Zhang

et al., 2014a) y en modelos animales de obesidad y diabetes (Cha, 2008; Power et al., 2007;

Wu et al., 2015), si bien hay resultados discrepantes (Wessels et al., 2015).

Niveles incrementados de acetilcarnitina (AC2:0) como los observados a nivel plasmático

en los ratones tratados con ATRA pueden asimismo ser de interés de cara a la salud

metabólica. Resultados en ratas indican que la suplementación (por vía oral o

intraperitoneal) con acetilcarnitina revierte los efectos del envejecimiento sobre las

mitocondrias de músculo esquelético y corazón, potenciando la biogénesis y función

mitocondrial (Lesnefsky et al., 2006; Pesce et al., 2010). También en adipocitos murinos

3T3-L1 se han descrito efectos complementarios de acetilcarnitina y ácido lipoico

favoreciendo la biogénesis mitocondrial (Shen et al., 2008). Los beneficios de la

suplementación con acetilcarnitina sobre la función mitocondrial, y con ello la salud

metabólica, se han atribuido especulativamente a diferentes mecanismos, incluyendo la

potenciación de la acetilación de diferentes proteínas incluyendo histonas, factores de

transcripción y enzimas mitocondriales (Rosca et al., 2009).

El otro gran componente del análisis metabolómico llevado a cabo han sido los

aminoácidos, incluyendo proteicos y no proteicos. No hubo diferencias significativas entre

los ratones tratados con ATRA y sus controles en los niveles plasmáticos de BCAA

(leucina, isoleucina, valina) ni de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano,

tirosina), que son dos grupos de aminoácidos que estudios pioneros y estudios

metabolómicos más recientes han encontrado que están aumentados en la

obesidad/resistencia a la insulina (Felig et al., 1969; Newgard et al., 2009; Wang et al.,

2011) y normalizados tras intervenciones que mejoran dichas condiciones (Lien et al.,

2009), y que por tanto cabría hipotetizar, a priori, que estuvieran disminuidos en los ratones

tratados con ATRA. No obstante sí que hubo diferencias en otros aminoácidos que han sido

relacionados directa o más indirectamente con la salud metabólica.


Capítulo 2

101

Uno de estos aminoácidos es la citrulina, cuyos niveles relativos en plasma fueron

significativamente menores en el grupo ATRA que en el grupo control. Interesantemente,

un estudio metabolómico de 2013 concluyó que niveles plasmáticos incrementados de

citrulina marcan la obesidad inducida por dieta hipergrasa y predicen el desarrollo de

síndrome metabólico en ratones (Sailer et al., 2013). En dicho estudio, los niveles

plasmáticos incrementados de citrulina conllevaron una menor “biodisponibilidad global

de arginina” en los ratones alimentados con dieta hipergrasa. Este índice se define como

la ratio entre los niveles circulantes de arginina y los de sus productos catabólicos

ornitina+citrulina, refleja mejor la biodisponibilidad a nivel sistémico de arginina para la

biosíntesis de óxido nítrico que los niveles circulantes de arginina y está disminuido en

modelos animales de síndrome metabólico y humanos con riesgo incrementado de

enfermedad cardiovascular o diabetes tipo 2 (Erdely et al., 2010; Sailer et al., 2013; Tang

et al., 2009; Tripolt et al., 2012). En nuestro experimento, la biodisponibilidad global de

arginina fue significativamente mayor en el grupo tratado con ATRA, por tener los

animales de este grupo niveles reducidos de citrulina y (en menor medida) ornitina en

plasma en comparación con los controles, con iguales niveles de arginina.

La mayor biodisponibilidad global de arginina en el grupo ATRA sugiere que el tratamiento

con ATRA puede favorecer la biosíntesis de óxido nítrico, que es un importante modulador

de la función endotelial, crítico para la homeostasia y salud vascular, y también un

activador de la mitocondriogénesis y la actividad del TAM (Nisoli et al., 1997). Además,

el óxido nítrico señaliza vía guanilato ciclasa y GMPc, y el incremento del GMPc en TAB

favorece la marronización y una expansión saludable del tejido graso (Mitschke et al.,

2013). Por tanto, incrementos en la producción de óxido nítrico podrían contribuir a la

activación del TAM y la marronización del TAB inducidas por ATRA exógeno. De la

misma manera, efectos sobre la producción de óxido nítrico podrían explicar en parte la

asociación inversa entre niveles de ATRA circulantes y riesgo de síndrome metabólico

reportada recientemente en humanos (Liu et al., 2016). De hecho, hay estudios que indican

que el ATRA incrementa la producción de óxido nítrico en células endoteliales, lo que se

asociaría a efectos positivos sobre el endotelio vascular (Uruno et al., 2005), y que el ATRA

(vía RAR:RXR) transactiva la expresión del gen de la óxido nítrico sintasa inducible

humana (Zou et al., 2007). Aunque hay resultados controvertidos, que indicarían inhibición

en vez de activación de la producción de óxido nítrico por ATRA en células endoteliales y

otros tipos celulares (e.g. (Cho et al., 2005)), es de destacar que, en uno de los pocos

estudios al respecto in vivo, la suplementación con ATRA (10 mg/kg, por vía

intraperitoneal) incrementó en ratones la producción de óxido nítrico inducida por

lipopolisacárido bacteriano (Devaux et al., 2000). Nuestros resultados sugieren que el

ATRA podría favorecer la síntesis de óxido nítrico por una doble vía: mediante efectos

transcripcionales directos sobre la maquinaria enzimática implicada y mediante efectos

metabólicos que conllevarían un aumento de la disponibilidad de arginina, el sustrato de

las enzimas óxido nítrico sintasas.

Los ratones tratados con ATRA presentaron, en comparación con los controles, niveles

plasmáticos significativamente incrementados de cistina. Este aminoácido resulta de la

oxidación del grupo tiol de dos moléculas de cisteína, que pasan a quedar unidas por un

Tesis Doctoral


102

puente disulfuro. La pareja cisteína/cistina en plasma funciona como un tampón redox que

puede afectar el estado de oxidación de los grupos tiol en proteínas extracelulares,

incluyendo proteínas de la membrana endotelial, con posibles implicaciones para la

enfermedad cardiovascular. Se ha descrito que la cisteína se encuentra relativamente más

oxidada con la edad, el tabaquismo y enfermedades relacionadas con el envejecimiento,

como la degeneración macular (Go and Jones, 2011). En cualquier caso, la forma oxidada,

la cistina, es habitualmente la forma predominante en plasma (Go and Jones, 2011).

Además, la cisteína se oxida fácilmente y nuestro protocolo pre-analítico no estaba

específicamente diseñado para evitar la oxidación de la cisteína ni para distinguir cisteína

y cistina. Por tanto, los niveles incrementados de cistina observados en el plasma de los

ratones tratados con ATRA son de difícil interpretación. En todo caso, cabe destacar que

no hubo diferencias entre los dos grupos experimentales en los niveles plasmáticos de

homocisteína, un homólogo de la cisteína (producto derivado de la desmetilación de la

metionina) que es considerado un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular y que está

elevado en plasma en el síndrome metabólico. Tampoco hubo diferencias en los niveles

plasmáticos de homocistina, homólogo de la cistina que resulta de la oxidación de dos

moléculas de homocisteína.

Los ratones tratados con ATRA presentaron niveles plasmáticos significativamente

incrementados de creatina en comparación con el grupo control. El sistema creatina-

fosfocreatina juega un papel importante en la bioenergética muscular, especialmente en

momentos de trabajo intenso, cuando la reacción de la creatina quinasa puede, a partir de

fosfocreatina, liberar ATP en el citosol de la célula (Wyss and Kaddurah-Daouk, 2000). El

catabolismo de ácidos grasos en músculo esquelético y otros tejidos aumenta con el

tratamiento con ATRA (véase el apartado 1 Introducción), y sugerimos que, en estas

condiciones de “plenitud de combustible”, posiblemente los músculos descansen menos en

el sistema creatina-fosfocreatina y por tanto capten menos creatina de la circulación, lo que

explicaría el aumento de los niveles plasmáticos de creatina observado (hay que tener en

cuenta que el músculo no es un sitio de síntesis de creatina, sino que la capta de la

circulación). En favor de esta interpretación, se ha reportado que la entrada de [14C-

creatina] en músculo de ratón (tras inyección i.p. de [14C-creatina]) resulta inhibida en

condiciones de ayuno, cuando está incrementada la oxidación de ácidos grasos (Kim et al.,

1983). También hay trabajos que asocian la depleción de creatina intramuscular a

incrementos de la captación de combustibles (glucosa y ácidos grasos) y la oxidación de

ácido grasos por el músculo, lo que sugiere la existencia de un mecanismo regulador

compensatorio (Pandke et al., 2008). Un incremento de los niveles de creatina en plasma

puede ser de interés para la salud metabólica, considerando que la suplementación con

creatina se ha asociado a efectos beneficiosos en relación con la diabetes tipo 2 y el hígado

graso, especialmente cuando se administra en conjunción con ejercicio físico, además de

asociarse a posibles mejoras del rendimiento muscular durante el ejercicio (Deminice et al.,

2016; Gualano et al., 2012; Pinto et al., 2016).

Los niveles plasmáticos de taurina y, en menor grado, glicina claramente tendieron a ser

más altos en el grupo ATRA que en el grupo control. La diferencia alcanza la significancia

estadística si se comparan los niveles de ambos aminoácidos combinados (taurina+glicina,


Capítulo 2

103

unidades arbitrarias; control, 519855673; ATRA, 16468956231; n=11/grupo, P=0,050).

Taurina y glicina son aminoácidos específicamente relacionados con la producción de

ácidos biliares (la conjugación a estos aminoácidos incrementa la solubilidad de los ácidos

biliares y facilita su paso en forma de sales a la bilis), y el incremento observado de sus

niveles circulantes podría reflejar una inhibición de la síntesis hepática de ácidos biliares

por ATRA, que de hecho ha sido descrita (Yang et al., 2014). En todo caso, es importante

señalar que, aunque los ácidos biliares son la principal forma de excreción de colesterol del

cuerpo, en los ratones suplementados con ATRA la inhibición de la producción de ácidos

biliares no se acompaña de un incremento de la colesterolemia, que al contrario se ve

disminuida (o en todo caso, no modificada (Ribot et al., 2001)), lo que se ha atribuido a una

disminución de la absorción intestinal de colesterol por efecto del tratamiento (He et al.,

2013; Yang et al., 2014).

La taurina (y derivados como la cloramina de taurina) tiene efectos beneficiosos en el

contexto de la obesidad y el síndrome metabólico independientes de la producción de

ácidos biliares, incluyendo efectos antiinflamatorios y antioxidantes, efectos anorécticos y

modulación del metabolismo de glúcidos y lípidos (Murakami, 2015). Hay estudios que

relacionan un déficit de taurina con la obesidad y la diabetes. La concentración de taurina

en plasma está reducida en la obesidad y la diabetes humana, así como en modelos animales

de obesidad (revisado en (Murakami, 2015). La producción de taurina en el TAB podría

jugar un papel especialmente importante en la prevención de la obesidad, ya que en ratones

con obesidad dietética la expresión de la cisteína dioxigenasa (enzima clave en la

biosíntesis de taurina) está reducida selectivamente en TAB, pero no en otros tejidos

productores de taurina como TAM o hígado; incluso se ha propuesto que la taurina podría

ser considerada una adipoquina con efecto antiobesidad (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006).

En estudios en animales, la suplementación de dietas estándar o aterogénicas con taurina o

glicina, o la ingesta de fuentes proteicas especialmente ricas en estos aminoácidos, tiene

efectos positivos sobre los lípidos plasmáticos (Park and Lee, 1998) y en la prevención de

la obesidad inducida por la dieta y sus secuelas (Liaset et al., 2011; Tastesen et al., 2014;

Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006). La suplementación dietética con taurina se acompaña de

un incremento de la taurina en plasma, del gasto energético basal y de la expresión de genes

para el metabolismo energético en TAB (e.g., Pgc1a, Ppara, Nrf2, Lpl, Aco y Ucp2; Ucp1

no fue analizado), más que en TAM (donde la expresión de Ucp1 no se vio afectada) o

músculo esquelético (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006). La suplementación con taurina

también se opone al desarrollo de obesidad en ratas tratadas con monosodio glutamato (un

modelo farmacológico), induciendo Pgc1a en TAB y TAM y por tanto posiblemente el

metabolismo oxidativo en ambos tejidos adiposos (Cao et al., 2016; Nardelli et al., 2011).

En humanos, hay estudios que han mostrado beneficios de la suplementación oral con

taurina (3g/día, 7-8 semanas) en la obesidad (Rosa et al., 2014; Zhang et al., 2004), aunque

los estudios al respecto en humanos son pocos y han empleado concentraciones mucho

menores que los estudios en animales.

Considerando lo expuesto en el párrafo anterior, se sugiere que el incremento observado en

los niveles de taurina podría contribuir causalmente a la reducción de la adiposidad corporal

y otros efectos metabólicos del ATRA. La taurina (ácido 2- aminoetanosulfónico) es

Tesis Doctoral


104

sintetizada endógenamente, pero también es proporcionada por la dieta (es especialmente

abundante en pescado y marisco). Un incremento de taurina en plasma como el observado

aquí puede tener diferentes orígenes: una mayor absorción intestinal y/o reabsorción renal,

un aumento de la producción endógena de taurina en los tejidos productores, y/o una

redistribución entre plasma y tejidos (quizás como consecuencia de cambios en la

producción de ácidos biliares). Los bajos niveles plasmáticos de taurina en la diabetes

humana se relacionan con una mayor excreción urinaria, sugiriendo que la reabsorción

renal de taurina está disminuida en la diabetes (Merheb et al., 2007). En este contexto es

interesante destacar que el ATRA o el ácido retinoico 9-cis, en sinergia con la vitamina D

y vía activación de VDR:RXR, induce la expresión de la proteína transportadora de taurina

(TauT) y la captación de taurina en una línea celular de epitelio renal (Chesney and Han,

2013). Este antecedente sugiere que el incremento de taurina en plasma en los ratones

tratados con ATRA podría obedecer, en parte, a un incremento de la reabsorción renal,

además de (posiblemente) un menor consumo de taurina para la producción de sales

biliares. Un incremento de la síntesis endógena de taurina ‒ que es sintetizada a partir de

cisteína o, en menor medida, metionina ‒ no se puede descartar, aunque choca con los

niveles plasmáticos aumentados de cistina y no alterados de metionina observados.

Los niveles plasmáticos de ácidos grasos poliinsaturados, especialmente los de DHA (n-

3), fueron significativamente más elevados en los ratones tratados con ATRA, que

presentaron un ratio ARA/EPA+DHA (n-6/n-3) en plasma significativamente menor que

los controles. Estos son efectos interesantes, porque los PUFA n-3 (EPA y DHA) han sido

relacionados con múltiples acciones metabólicas beneficiosas en el contexto del síndrome

metabólico, incluyendo la activación de la termogénesis en el TAM y de la marronización

del TAB ‒ vía efectos directos sobre los adipocitos mediados por la activación del receptor

4 de ácidos grasos libres (FFAR4, también conocido como receptor 120 acoplado a

proteína G, GPR120) y efectos indirectos, dependientes de la interacción de los n-3 con el

receptor TRPV1 en el tracto gastrointestinal y la subsecuente activación del sistema

nervioso simpático (Kim et al., 2016; Kim et al., 2015; Quesada-Lopez et al., 2016). La

reducción de la ratio n-6/n-3 es interesante en sí misma, ya que mientras que los ácidos

grasos n-3 promueven la marronización del TAB, el ARA (n-6) la inhibe y además podría

favorecer especialmente la adipogénesis blanca (Fleckenstein-Elsen et al., 2016; Pisani et

al., 2014). De hecho, ratios n-6/n-3 elevados en la dieta se han relacionan con el sobrepeso

y la obesidad (Muhlhausler and Ailhaud, 2013).

El origen de los niveles incrementados de PUFA, y especialmente DHA, en los ratones

tratados con ATRA es intrigante. Un estudio reciente indica que los adipocitos marrones

diferenciados en cultivo, pero no los blancos, pueden sintetizar DHA (22:6n-3) a partir de

ácido alfa-linolénico (18:3n-3) y otros estudios muestran que los tejidos con una alta tasa

oxidativa tienden a producir más DHA y que desaturasas implicadas en esta síntesis son

enzimas mitocondriales (Qin et al., 2016). Por tanto, una posibilidad a explorar en futuros

estudios es que la activación del TAM y de la marronización del TAB en respuesta a agentes

como el ATRA u otros conlleve un incremento en la producción por estos tejidos de PUFA

de cadena larga, con cambios en sus niveles relativos que podrían funcionar a modo de


Capítulo 2

105

retroalimentación positiva o negativa, y que tendrían también reflejo en sus niveles

plasmáticos.

Nuestro análisis ha incluido metabolitos puntuales especialmente relevantes en el

metabolismo intermediario. Aunque para ninguno de ellos hubo diferencias significativas

entre los grupos ATRA y control, los ratones tratados con ATRA tendieron a presentar

niveles aumentados de malato y lactato y reducidos de hexosas-fosfato en plasma.

Mayores niveles de malato en plasma podrían indicar una liberación aumentada de malato

desde los tejidos y ser consistentes con una acción del ATRA incrementando la capacidad

celular para el metabolismo oxidativo a través del ciclo de Krebs. En un estudio

metabolómico en humanos, esta fue la interpretación dada por los autores al aumento

observado de los niveles plasmáticos de malato tras una intervención que mejoró el estado

de salud metabólica en mujeres obesas, sedentarias y resistentes a la insulina (Campbell et

al., 2014). Además, en un estudio en el que se comparó el metaboloma de sangre arterial y

venosa humana, el malato ‒ junto con lactato, alanina, glutamina, fenilalanina, succinato y

ácido siálico ‒ exhibió un patrón “de liberación” con niveles significativamente

incrementados en sangre venosa versus sangre arterial (en oposición a un patrón “de

captación”, que se asociaría a niveles incrementados en sangre arterial) (Ivanisevic et al.,

2015). Por otra parte, niveles plasmáticos reducidos de hexosas-fosfato y aumentados de

lactato son consistentes con una mayor utilización de glucosa por la vía glucolítica en los

ratones ATRA, aunque el incremento de lactato también podría reflejar una menor

captación de lactato por los tejidos, que se explicaría por la mayor utilización de ácidos

grasos como combustible en las células. En conjunto, estos resultados casarían con

resultados previos, ya referidos, que muestran una mejor tolerancia a la glucosa y

sensibilidad sistémica a la insulina y una expresión aumentada de componentes del ciclo

de Krebs y la cadena respiratoria en diversos tejidos tras el tratamiento con ATRA en

ratones.

Las PBMC están en contacto directo con el plasma y producen acilcarnitinas; de hecho, las

células T naive (no activadas por antígeno) obtienen la energía fundamentalmente de la

oxidación de ácidos grasos (Wang and Green, 2012) y hasta se ha descrito un método para

la confirmación del diagnóstico de desórdenes genéticos del metabolismo de ácidos grasos

basado en el análisis del perfil de acilcarnitinas en PBMC humanas tras la carga de estas

células ex vivo con lípido (Schulze-Bergkamen et al., 2005). No obstante, la posible

contribución de las PBMC al pool de acilcarnitinas circulante es un aspecto que ha sido

poco estudiado. En nuestro experimento, parece poco probable que esta contribución haya

sido significativa, ya que en los ratones tratados con ATRA los niveles en PBMC de todas

las acilcarnitinas tendieron a estar disminuidos, en contraste con el aumento generalizado

observado en plasma para la mayoría de especies. Tampoco parece que haya una buena

correspondencia inversa, ya que las especies de acilcarnitinas más claramente reducidas en

las PBMC de los animales tratados con ATRA (AC4:0 y AC5:0) no fueron las más

claramente incrementadas en su plasma. No obstante, no puede descartarse que estos

resultados reflejen efectos distintivos del ATRA sobre las PBMC y que, en otras

condiciones, sí que las PBMC contribuyan al pool de acilcarnitinas circulante.

Tesis Doctoral


106

Aunque en las PBMC de los ratones ATRA todas las especies de acilcarnitinas tendieron a

la baja, la única para la que la bajada fue significativa respecto de los niveles en el grupo

control fue la AC5:0. Esta acilcarnitina se deriva del catabolismo de BCAA, en concreto

del catabolismo de leucina e isoleucina, y forma parte de un clúster de metabolitos (que

incluye a los BCAA y productos finales de su catabolismo como AC3:0 y AC5:0) que se

encuentran aumentados en plasma en la obesidad y la resistencia a la insulina en humanos

y modelos animales, de acuerdo con estudios metabolómicos (Newgard, 2012; Newgard et

al., 2009). Los menores niveles de AC5:0 en PBMC de ratones tratados con ATRA se

avendrían con la tendencia a menores niveles de leucina+isoleucina en las PBMC en este

grupo. No obstante, hay que recalcar que la tendencia a la baja en las PBMC del grupo

ATRA fue evidente para todos los aminoácidos y no llegó a ser significativa para

leucina+isoleucina cuando sí lo fue para otros aminoácidos (aspartato, glutamina, histidina,

ornitina, serina y taurina). Estas observaciones nos llevan a descartar, en principio, la idea

de que la reducción de los niveles de BCAA y su metabolito AC5:0 en PBMC sea un efecto

específico del tratamiento con ATRA.

La reducción generalizada de los niveles relativos de acilcarnitinas, aminoácidos y demás

metabolitos analizados (a excepción del EPA) en las PBMC de los ratones tratados con

ATRA detectada en esta tesis llama la atención. Aunque no sabemos explicarla, cabe

recordar que el ácido retinoico es un modulador de la diferenciación de células inmunitarias

y de las respuestas inmunológicas e inflamatoria (Brown and Noelle, 2015; Escribese et al.,

2008). El ATRA podría condicionar cambios distintivos (respecto de su acción en otros

tejidos) en el metabolismo de las células inmunitarias, tal vez asociados a la funcionalidad

de estas, que podrían implicar una reducción del tono metabólico general y de la síntesis

proteica en PBMC.

En este sentido, cabe señalar que en nuestro experimento las PBMC han reflejado algunos

de los efectos transcripcionales del ATRA previamente descritos en tejidos, básicamente la

inducción de Cyp26a1 y de Cpt1a (descrita en diferentes tejidos), pero no otros, como la

modulación de Ucp1, Ucp2, Tmem26 o Aldh9a1 (descrita en tejidos adiposos) ((Amengual

et al., 2007; Berry and Noy, 2009; Mercader et al., 2006; Ozpolat et al., 2005) y esta tesis).

La expresión de Cpt1a en PBMC es particularmente sensible a cambios en el estado

nutricional y energético (Diaz-Rua et al., 2016). Cyp26a1 es una diana clásica de los RAR

que codifica para una enzima implicada en el catabolismo intracelular del ATRA, y su

inducción masiva indica que, efectivamente, en los ratones tratados el ATRA exógeno se

ha repartido bien y ha entrado en las PBMC (recordemos que el tratamiento aplicado es por

vía subcutánea). La inducción de Cpt1a y de Cyp26a1 ya fue descrita en sangre total de

ratones tratados con ATRA (Petrov et al., 2016a). La tendencia a menores niveles de

expresión de genes lipogénicos (Srebp1c y Fasn) en las PBMC de los ratones ATRA

detectada aquí podría ser reminiscente de los cambios a nivel hepático (Amengual et al.,

2010) y en todo caso concordaría con una ralentización general del metabolismo de las

PBMC tras el tratamiento con ATRA.

Volviendo a nuestro objetivo, hemos identificado marcadores sanguíneos del incremento

de la capacidad oxidativa/termogénica en tejidos adiposos explotando el modelo de


Capítulo 2

107

tratamiento con ATRA. Así, un análisis de componentes principales (PCA) realizado a

partir de los datos de eficiencia energética, adiposidad (peso de los tejidos adiposos), los

marcadores relacionados con la capacidad oxidativa/termogénica en los tejidos adiposos

estudiados en el capítulo 1 y el perfil metabolómico del plasma estudiado en este capítulo,

ha mostrado que los niveles plasmáticos de carnitina, AC2:0, AC3DH/AC4OH, AC8:0,

AC16DC y DHA son variables importantes para discriminar los animales tratados con

ATRA de los animales del grupo control. El análisis de correlaciones posterior indica que

los niveles plasmáticos altos de AC2:0, AC8:0, AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA se

correlacionan con un incremento de la capacidad termogénica del TAM y la capacidad

oxidativa/marronización del TAB (reflejada esta, entre otros, por la ratio entre la expresión

génica de Rarb y Rxrg) y con una disminución de la capacidad adipogénica/lipogénica en

el TAB visceral (con menores niveles de expresión de Pparg). Mientras que los niveles

plasmáticos altos de carnitina se correlacionan más específicamente con un incremento de

la capacidad oxidativa/marronización del TAB visceral.

4.2.4. Conclusiones

En este estudio hemos identificado marcadores plasmáticos de la interacción de la vitamina

A con el metabolismo oxidativo y la salud metabólica, entre los que destacan: niveles

incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas; niveles

disminuidos de citrulina y mayor biodisponibilidad global de arginina; niveles

incrementados de creatina y de taurina; y una disminución de la ratio PUFA n-6/n-3.

Algunos de estos marcadores reflejarían fundamentalmente la estimulación de la

movilización y oxidación tisular de lípidos promovida por el ATRA (e.g., acilcarnitinas),

mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal, ya que su disponibilidad

podría mejorar la función mitocondrial y el metabolismo, directa o más indirectamente

(e.g., carnitina, creatina, taurina; biodisponibilidad global de arginina vía incrementos del

óxido nítrico). Además, los resultados del análisis metabolómico realizado estarían de

acuerdo con la idea de que, en condiciones de alta tasa de oxidación de ácidos grasos y

disponibilidad de carnitina, la síntesis y secreción de acetilcarnitina y otras acilcarnitinas,

con el consiguiente aumento en plasma, puede servir para favorecer un normal

funcionamiento de la actividad mitocondrial y del metabolismo celular de la glucosa.

En los ratones tratados con ATRA, el perfil metabolómico de las PBMC fue muy distinto

del plasma, lo que sugiere un diferente impacto del ATRA sobre el metabolismo de estas

células en comparación con los tejidos homeostáticos (hígado, músculo, tejidos adipososo),

posiblemente asociado a su funcionalidad, aunque los resultados de las PBMC deben

tomarse con cautela por el bajo número de muestras individuales disponibles. La expresión

génica de Cyp26a1 y Cpt1a en PBMC resultó de interés especial como biomarcadores del

tratamiento con ATRA.

Tesis Doctoral


108

Anexo 2A

Varianza total explicada y Matriz de componente de los cinco primeros componentes

principales (PC) del análisis de reducción de datos (PCA) a partir de 117 variables de

ratones NMRI (de 13 semanas de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso

corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro

días previos al sacrificio (N = 11). En la Matriz de componente se destacan las 15 variables

que más contribuyen (en azul negativamente y en amarillo positivamente).

Total % de varianza % acumulado Total % de varianza % acumulado

1 26,502 22,651 22,651 26,502 22,651 22,651

2 21,296 18,202 40,853 21,296 18,202 40,853

3 11,620 9,931 50,785 11,620 9,931 50,785

4 6,994 5,978 56,762 6,994 5,978 56,762

5 6,390 5,461 62,224 6,390 5,461 62,224

1 2 3 4 5

peso TAM ,118 -,793 ,248 ,026 ,394

E. energética ,510 -,730 ,223 ,056 -,126

peso TABi ,161 -,712 ,296 ,172 ,307

rp_Tmem26 ,035 -,684 ,081 -,129 -,098

rp_Pparg ,016 -,655 -,482 -,081 -,215

peso TABrp ,182 -,480 ,524 ,079 ,467

e_Pparg ,057 -,359 ,201 ,362 ,022

peso TABe ,173 -,332 ,472 ,243 ,380

i_Tmem26 -,007 -,325 ,056 ,598 -,231

e_Tmem26 ,437 -,324 ,143 ,115 -,132

HexoseP ,137 -,284 ,700 -,225 ,274

i_Cox8b -,176 -,266 ,229 -,059 -,025

Palmitic acid -,572 -,252 ,515 ,190 -,155

Serotonin -,207 -,232 ,316 -,168 -,254

AC10:0 -,165 -,200 -,053 ,016 ,066

i_Atp5f1 -,447 -,181 ,046 -,173 ,151

i_Hoxc9 ,314 -,172 -,491 ,676 ,297

Citrulline ,716 -,166 ,438 -,015 ,086

tam_Tmem26 -,017 -,099 ,199 ,469 -,203

i_Yy1 ,263 -,063 -,375 ,682 ,388

AMP -,385 -,053 ,276 -,225 -,388

e_Hoxc9 -,284 -,042 -,102 -,533 -,223

Nicotinamide -,302 -,037 ,625 -,316 ,179

Aspartate ,329 -,013 ,681 -,155 -,015

rp_Tbx1 ,193 ,002 -,140 -,114 ,075

i_Pparg ,314 ,009 ,199 -,080 ,129

e_Ppara ,181 ,019 -,291 -,598 -,147

Oleic acid -,234 ,032 ,574 ,098 ,229

i_Tbx1 ,248 ,044 -,316 ,344 ,225

e_Yy1 -,480 ,082 -,235 -,328 ,349

Ornithine ,797 ,113 ,505 ,048 -,134

Urea ,782 ,120 ,200 -,094 -,094

Creatinine ,327 ,125 ,293 -,304 ,132

tam_Atp5f1 ,102 ,153 -,023 ,325 -,435

Proline ,862 ,159 ,263 ,036 -,216

Homocystine -,628 ,171 ,258 ,176 -,502

Homocysteine ,879 ,188 ,285 ,086 -,098

Tryptophan ,510 ,197 ,123 ,382 -,175

Glutamate ,465 ,199 ,647 -,145 -,006

rp_Pgc1b -,238 ,203 -,129 -,176 -,457

Cholesterol ,336 ,228 -,199 ,399 -,286

Continúa

Matriz de componente

Varianza total explicada

Componente

Autovalores iniciales Sumas de extracción de cargas al cuadrado

Método de extracción: análisis de componentes principales.

Variable

Componente


Capítulo 2

109

Continúa

AC14:0 -,718 ,228 ,457 ,123 -,082

tam_ratio ,356 ,245 ,040 -,191 ,208

i_Tfb2m -,721 ,254 ,249 -,042 ,272

Methionine ,799 ,255 ,247 ,045 -,079

AC16:0 -,693 ,263 ,412 -,079 -,050

i_Pgc1b -,089 ,270 ,005 ,031 ,204

i_Cd137 -,737 ,285 ,196 -,161 -,014

Valine ,743 ,288 ,438 ,016 -,156

Threonine ,850 ,304 ,168 ,004 -,076

e_Atp5f1 -,246 ,304 ,029 -,267 ,464

AC18:0 -,729 ,313 ,239 -,150 ,040

Choline ,325 ,315 ,729 ,057 ,102

Tyrosine ,880 ,315 ,208 ,165 ,044

AC4:0 ,411 ,316 ,164 -,117 -,401

Serine ,637 ,329 ,448 -,170 -,016

tam_Pparg -,149 ,329 ,325 ,484 -,259

e_Cox8b ,190 ,334 -,346 ,062 ,224

Leucine - Ile ,618 ,341 ,533 ,030 -,107

i_Ucp1 -,228 ,364 -,060 ,580 ,028

Arginine ,836 ,369 ,206 -,037 -,063

AC16:1 -,807 ,374 ,396 ,060 ,015

e_Pgc1b -,054 ,379 -,186 ,258 ,468

e_ratio -,476 ,383 -,047 ,552 -,072

rp_Tfb2m -,041 ,392 -,335 -,016 -,361

EPA -,516 ,392 ,430 -,013 ,329

AC12:0 -,768 ,396 ,407 ,065 -,050

AC5OH ,477 ,400 ,174 -,369 ,181

AC20:4 -,711 ,401 ,508 ,020 ,114

rp_Cd137 ,187 ,401 -,016 -,376 ,068

Citrate - isocitrate ,593 ,403 -,091 ,234 ,278

i_Ppara -,101 ,407 -,002 ,500 ,300

tam_Ppara -,409 ,411 ,297 ,447 -,155

AC18:1 -,814 ,419 ,353 ,038 ,067

Lactate ,225 ,422 -,121 ,186 ,169

Hexose ,683 ,429 -,151 ,198 ,288

rp_ratio -,042 ,432 -,422 -,102 ,439

AC4DC ,421 ,439 ,171 -,315 ,292

rp_Atp5f1 ,230 ,442 -,564 -,239 -,219

AC14:1 -,782 ,449 ,309 ,178 -,027

Arachidonic acid -,558 ,463 ,289 ,121 ,114

rp_Ucp1 ,179 ,473 -,238 -,061 ,084

AC18:2 -,785 ,483 ,314 ,073 -,053

e_Cd137 ,086 ,484 -,291 ,195 ,560

Phenylalanine ,697 ,485 ,292 ,142 -,076

e_Tfb2m -,551 ,486 -,285 -,185 ,365

Creatine ,341 ,486 ,131 -,462 ,293

Alanine ,768 ,487 ,083 -,267 -,003

i_ratio -,499 ,495 -,397 -,332 -,021

AC12:1 -,757 ,499 ,266 ,063 ,121

AC5:0 -,187 ,505 ,616 ,003 -,031

i_Slc27a1 -,090 ,509 ,098 ,163 -,262

rp_Cox8b ,326 ,527 -,270 -,217 -,331

rp_Hoxc9 ,128 ,533 -,241 -,255 -,315

e_Slc27a1 -,335 ,552 -,274 ,087 ,325

Glycine ,390 ,552 ,012 ,092 -,290

e_Tbx1 -,066 ,553 -,099 ,188 -,053

AC6:0 -,111 ,559 ,055 -,161 -,341

Malate ,367 ,564 -,150 ,126 ,077

e_Ucp1 ,087 ,567 -,379 -,277 ,452

Asparagine ,625 ,568 ,349 ,028 -,103

AC3:0 ,583 ,576 -,081 -,137 -,278

rp_Yy1 -,295 ,579 -,082 ,202 -,240

Histidine ,668 ,586 ,200 ,167 ,208

Cystine ,511 ,587 -,015 -,305 ,180

tam_Cox8b ,103 ,588 -,407 ,056 -,393

rp_Slc27a1 -,096 ,594 -,472 ,137 -,062

Continúa

Tesis Doctoral


110

Continúa

Taurine ,386 ,597 -,116 ,127 -,007

AC16DC -,402 ,606 ,060 -,087 -,021

AC8:0 -,570 ,609 ,042 ,109 -,097

rp_Ppara -,343 ,621 -,121 ,058 -,148

AC3DC/AC4OH -,557 ,625 ,282 -,173 -,045

Carnitine ,507 ,646 -,223 -,015 ,244

Glutamine ,668 ,650 ,173 ,167 ,103

DHA -,329 ,715 ,147 ,090 ,094

tam_Ucp1 -,215 ,761 -,370 ,037 -,172

AC2:0 -,117 ,894 -,069 -,045 ,137

Método de extracción: análisis de componentes principales.

Se ordena en PC2

4.3. Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con vitamina

A preformada o β-caroteno durante la lactancia (Capítulo 3)

Tesis Doctoral


112


Capítulo 3

113

Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con

vitamina A preformada o -caroteno durante la lactancia

4.3.1. Antecedentes y planteamiento experimental

La metilación del ADN en las citosinas de dinucleótidos CpG es la modificación

epigenética más ampliamente estudiada (Anderson et al., 2012), es esencial para el

desarrollo animal (Bird, 2002), contribuye a la regulación de la expresión génica (Wrzodek

et al., 2012) y responde a estímulos nutricionales y otros estímulos ambientales (Casanello

et al., 2016; Niculescu, 2012; Smith and Ryckman, 2015). En los últimos años está

creciendo el interés por el impacto de la dieta y la nutrición sobre la metilación del ADN y

sus posibles consecuencias funcionales y para la salud. Se ha investigado el impacto de

condiciones nutricionales genéricas (e.g., malnutrición proteica, restricción calórica global,

dieta alta en grasa) y de bioactivos y nutrientes específicos, principalmente nutrientes como

colina, metionina, ácido fólico o vitaminas B12 y B6 que participan en la biosíntesis de S-

adenosil metionina (SAM), la molécula que aporta directamente el grupo metilo en todas

las reacciones biológicas de metilación (Jimenez-Chillaron et al., 2012; Parle-McDermott

and Ozaki, 2011). En general, se va consolidando la idea de que factores ambientales,

incluyendo la dieta y la nutrición, pueden influenciar procesos fisiológicos y patológicos a

través de alteraciones epigenéticas, que a su vez influencian la expresión génica (Niculescu,

2012).

La influencia del ambiente en los fenómenos epigenéticos es especialmente importante en

etapas vitales críticas como el desarrollo embrionario, fetal y postnatal temprano, que son

etapas de gran actividad epigenética, en que se borran y reescriben muchas marcas. La

metilación del ADN en estas etapas juega un papel muy importante en los procesos de

diferenciación celular y tisular y posiblemente en los fenómenos de programación

metabólica (Casanello et al., 2016; Smith and Ryckman, 2015). Estudios en animales y

evidencia epidemiológica sólida indican que un entorno perinatal adverso puede aumentar

el riesgo de desarrollar enfermedades a largo plazo en la vida adulta, particularmente

obesidad y síndrome metabólico, por mecanismos que incluyen cambios epigenéticos

(Navarro et al., 2016; Pico and Palou, 2013; Tarry-Adkins and Ozanne, 2016).

Características de la dieta en estas etapas pueden afectar, en un sentido u otro, marcas

epigenéticas en genes relacionados con aspectos o procesos relevantes de cara al control de

la adiposidad corporal, como son la celularidad (número de adipocitos) y perfil metabólico

de los tejidos adiposos, el metabolismo oxidativo y lipídico en otros tejidos homeostáticos

o el control de la ingesta, entre otros.

La vitamina A puede afectar la formación de los adipocitos y la regulación de la expresión

de genes adipogénicos (Wang et al., 2016a) y, fundamentalmente en forma de ácido

retinoico (AR), impacta sobre eventos epigenéticos y en particular sobre la metilación del

ADN, ya sea a nivel genómico global o de genes específicos, provocando cambios que han

sido particularmente estudiados en los contextos del desarrollo embrionario y el cáncer

(Bar-El Dadon and Reifen, 2017; Vieira, 2011).

Tesis Doctoral


114

La lactancia es una etapa vital crítica para el desarrollo del tejido adiposo en la rata (Cryer

and Jones, 1979; Wang et al., 2016a). Resultados previos de nuestro grupo mostraron que

un exceso moderado de vitamina A en forma de retinil éster (RE, en concreto retinil

palmitato) durante este periodo produce en la rata cambios en el desarrollo del tejido

adiposo blanco (TAB) que favorecen la hiperplasia y el aumento de la adiposidad corporal

tras la exposición a una dieta alta en grasa. Estos cambios incluyen una menor expresión

del factor maestro adipogénico PPAR junto con la retención de una mayor capacidad

proliferativa, reflejada en una expresión aumentada del antígeno nuclear de células en

proliferación (PCNA), al destete (Granados et al., 2013). A diferencia de la suplementación

con RE, la suplementación durante la lactancia con un exceso equivalente de vitamina A

pero en forma de -caroteno (BC) no afecta la expresión de PPAR o PCNA en el TAB, a

pesar de que las ratas lactantes se demostraron capaces de absorber y metabolizar

parcialmente el BC que habían recibido por vía oral (Musinovic et al., 2014).

A partir de los resultados descritos en el párrafo anterior, surge nuestra hipótesis de que la

suplementación durante la lactancia con vitamina A puede afectar marcas de metilación del

ADN de genes específicos relacionados con el desarrollo y metabolismo del TAB, y de

manera diferencial según esta vitamina sea aportada en la dieta del lactante como retinil

palmitato o como BC. Para investigar en esta hipótesis, hemos analizado el estado de

metilación de promotores de genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y

determinación adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol

(Rbp4) y la capacidad termogénica (Ucp1) en el TAB inguinal (TABi) de crías de rata

suplementadas durante la etapa postnatal temprana (los primeros 21 días de vida,

coincidentes con la etapa de lactancia) con 10-15 μL de vehículo (aceite de oliva; ratas

grupo control) o una emulsión de vitamina A en forma de retinil éster (en concreto retinil

palmitato, ratas grupo RE) o BC (ratas grupo BC) en aceite de oliva. La cantidad de

vitamina A administrada fue entre tres y cinco veces la proporcionada diariamente por la

leche materna (véase el apartado 3 de Materiales y Métodos). Los análisis se han hecho a

partir de ADN aislado de muestras de TABi de un experimento previo del LBNB

(Musinovic et al., 2014), empleando la técnica de secuenciación por bisulfito.

Para ahondar en la relevancia funcional de los cambios de metilación del ADN detectados

y su relación con el estatus en vitamina A al nivel tisular y sistémico, hemos realizado, para

cada uno de los genes estudiados, un análisis de correlaciones de Spearman entre el

porcentaje de metilación de los sitios CpG analizados ‒ considerados individualmente y en

conjunto ‒ con los niveles de expresión del correspondiente ARNm en TABi y con los

niveles de: retinol total en TABi; retinil ésteres, retinol libre y BC en hígado; y retinol y

BC en suero. También investigamos posibles correlaciones entre el estado de metilación

del ADN en estos sitios y parámetros biométricos y la glucemia de los animales. En los

análisis de correlaciones consideramos conjuntamente los diferentes grupos experimentales

(animales controles, RE y BC).


Capítulo 3

115

4.3.2. Resultados

4.3.2.1. Efectos de la suplementación con vitamina A durante la lactancia sobre

parámetros biométricos y niveles tisulares de retinoides y carotenoides

En la Tabla 4.3.1 se recogen los valores medios de las variables biométricas y bioquímicas

de los animales para las que hemos analizado posibles correlaciones con los resultados de

los análisis de metilación de ADN. El experimento animal fue realizado y estos valores

publicados con anterioridad a esta tesis (Musinovic et al., 2014). Como se puede observar

en la Tabla, los niveles de retinol total en TABi y de retinil ésteres y retinol libre en hígado

(analizados por HPLC) fueron mayores en los grupos RE y BC que en el grupo control, y

mayores en el grupo RE que en el grupo BC. En lo que respecta al BC, este pudo detectarse

por HPLC únicamente en suero e hígado (pero no TAB) de los animales del grupo BC. Por

otro lado, la suplementación durante la lactancia con BC o RE no afectó de manera

significativa el peso corporal, el porcentaje de masa grasa, el peso del TABi, la glucosa

sérica o el retinol sérico de las ratas, todo ello en el momento del destete (punto final del

experimento, día 21 de vida).

Tabla 4.3.1. Variables biométricas y bioquímicas de ratas de 21 días tratadas durante el periodo de

lactancia (días 1 a 20 de vida) con vehículo (control) o una dosis moderada de vitamina A como

retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC)1

1 Los datos representan la media±SEM de 14-15 animales (machos y hembras) para los grupos

control y BC y 28 para el grupo RE. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos

(P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA

de una vía ha indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la columna de la

derecha). 2 Los valores de grasa corporal fueron determinados justo antes del sacrificio, mediante

Echo-MRITM y se expresan en relación al peso corporal. n.d., no detectado. n.s., no significativo.

En la Tabla 1 del Anexo 3B se muestra el análisis de correlaciones entre estas variables.

Los niveles de retinol total en TABi correlacionaron directa y fuertemente con los de retinil

ésteres (ρ=0,856) o retinol libre (ρ=0,671) en hígado, pero no en suero, lo que sugiere que

el estatus en vitamina A del TABi se corresponde con el del hígado. Los niveles de retinol

en TABi o hígado mostraron una correlación inversa significativa (débil, con valores de ρ

en torno a -0,3) con los de BC en suero o hígado, lo que sugiere que retinol y BC pueden

compensarse mutuamente, al menos en parte, a efectos funcionales. Hubo correlaciones

P

46,0 ± 0,7 45,5 ± 0,6 46,4 ± 0,9 n.s.

10,1 ± 0,3 10,5 ± 0,2 10,5 ± 0,3 n.s.

580 ± 25 576 ± 22 640 ± 36 n.s.

120 ± 4 119 ± 2 115 ± 3 n.s.

1,33 ± 0,08a

3,61 ± 0,19b

1,69 ± 0,09c

<0,001

76,6 ± 3,1a

389 ± 20b

136 ± 6c

<0,001

2,2 ± 0,11a

5,08 ± 0,33b

2,65 ± 0,18a

<0,001

34,4 ± 2,2

0,426 ± 0,019 0,436 ± 0,013 0,420 ± 0,021 n.s.

0,16 ± 0,02

Retinol en suero (µM)

β-Caroteno en suero (µM) n.d. n.d.

Glucosa suero (mg/dL)

Retinol total en TABi (nmol/g)

Retinil ester en hígado (nmol/g)

Retinol en hígado (nmol/g)

β-Caroteno en hígado (nmol/g) n.d.

Control RE BC

Peso corporal (g)

Masa grasa (g/100g) 2

Peso TABi (mg)

n.d.

Tesis Doctoral


116

directas significativas de los niveles de retinol en suero con el peso corporal (ρ=0,399), el

porcentaje de masa grasa (ρ=0,311) y el peso del TABi (ρ=0,338), aunque estos parámetros

biométricos no fueran diferentes entre los grupos experimentales; estos resultados sugieren

que el estatus en vitamina A del animal puede influir sobre el crecimiento y el desarrollo

del tejido adiposo durante el período de lactancia, favoreciéndolos. Se encontraron otras

correlaciones directas previsibles, en concreto entre: los niveles hepáticos de retinol libre y

esterificado (ρ=0,844); los niveles de -caroteno en hígado y en suero (ρ=0,976); el peso

corporal y el porcentaje de masa grasa corporal (ρ=0,295); y el peso del TABi con respecto

al peso corporal o al porcentaje de masa grasa corporal (ρ=0,644 y ρ=0,571,

respectivamente).

4.3.2.2. Efectos de la suplementación con vitamina A durante la lactancia sobre los

niveles de expresión de los genes seleccionados en tejido adiposo

En la Figura 4.3.1 (A-D) se muestran, para los diferentes grupos experimentales, los niveles

en TABi del ARNm de los genes cuyo estado de metilación hemos analizado.

Figura 4.3.1. Niveles de

ARNm de los genes

indicados en el TAB inguinal

de ratas de 21 días

suplementadas durante la

etapa de lactancia con

vehículo (grupo control),

retinil palmitato (RE) o β-

caroteno (BC). Los datos

normalizados a la expresión

del gen de referencia β-

actina se expresan en

porcentaje respecto al grupo

control y son la media±SEM

de 12-15 animales por grupo

(26-28 para el grupo RE).

Letras diferentes indican

diferencias significativas

entre grupos (P<0,05) de

acuerdo con el análisis post-

hoc DMS, el cual se ha

realizado cuando el test

ANOVA de una vía ha

indicado diferencias con un

valor de P<0,10 (valores

mostrados en la figura). n.s.,

no significativo.

De acuerdo con resultados previos (Musinovic et al., 2014), la expresión génica de Pparg2

se encontró disminuida en el grupo RE pero no en el grupo BC (Figura 4.3.1A), mientras

que la expresión génica de Pcna tendió a encontrarse aumentada en el grupo RE más que

en el grupo BC (Figura 4.3.1B). La expresión de Zfp423 fue mayor en los dos grupos


Capítulo 3

117

suplementados con vitamina A, como RE o como BC (Figura 4.3.1C). La expresión de

Rbp4 tendió a ser menor en los grupos suplementados con vitamina A, y de manera más

clara en el grupo RE (Figura 4.3.1D). La expresión génica de Ucp1 en TABi estuvo por

debajo del límite de detección por qPCR a tiempo real (con valores de Ct >35 ciclos o sin

señal).

El análisis de correlaciones de los datos de expresión génica con los parámetros biométricos

y los niveles de retinoides y carotenoides reveló una única correlación significativa, directa

y débil (ρ=0,291) entre la expresión del ARNm de Rbp4 en TABi y los niveles de retinol

en suero (Tabla 1, Anexo 3B).

4.3.2.3. La suplementación con vitamina A durante la lactancia incrementa la

metilación del ADN en CpG específicos del promotor del Pparg2

PPAR es un factor de transcripción regulador clave para la adipogénesis y para el

mantenimiento del fenotipo funcional de los adipocitos. En esta tesis hemos analizado el

estado de metilación en TABi de los 4 CpGs contenidos en una región de 411 pb que

flanquea el sitio de inicio de la transcripción (TSS, del inglés transcription start site) del

ARNm del Pparg2 de rata, comprendida entre las posiciones -267 y +144 (Figura 4.3.2 A).

Estos 4 CpG, numerados de 1 a 4, se sitúan a -223, -207, +12 y +128, respectivamente. La

región analizada se corresponde con un tramo del promotor de Pparg2 que se desmetila

durante la adipogénesis de preadipocitos murinos 3T3-L1 y que se encuentra hipermetilada

en el TAB de ratones diabéticos (Fujiki et al., 2009). En el Anexo 3A de este capítulo se

presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo de ADN analizado. En la rata, esta

región contiene 153 secuencias consenso de unión putativa a factores de transcripción

detectadas por Genomatix MatInspector (Genomatix Software v3.7); las que se han

considerado más relevantes en el contexto de esta tesis por unir factores de transcripción

relacionados con la biología de los tejidos adiposos y/o los retinoides se indican en la misma

Figura 4.3.2A. Entre ellas hay secuencias consenso para factores de transcripción de tipo

bZIP (C/EBPs) previamente descritas como funcionales en el control de la expresión de

Pparg2 (Fajas et al., 1997; Zhu et al., 1995). [NOTA: para todos los genes, hemos tomado

como TSS el primer nucleótido del primer exón del transcrito inmaduro (con intrones) de

acuerdo a las bases de datos del EMBL-EBI y del NCBI. Siguiendo la convención, se asigna

al TSS la posición +1, numerándose sucesivamente con signo menos las posiciones

corriente arriba, hacia 5’, y con signo + las corriente abajo, hacia 3’, sin cero].

En promedio, considerando conjuntamente los 4 sitios CpG del promotor del Pparg2

analizados, la metilación global fue mayor en los grupos suplementados con vitamina A,

tanto en forma de RE (14%) como de BC (17%), en comparación con el grupo control

(Figura 4.3.2B). Yendo a los niveles de metilación de los 4 sitios CpG individuales, la

metilación fue mayor para tres de ellos en el grupo RE (los CpG 1, 2 y 4) y para dos de

ellos en el grupo BC (los CpG 2 y 4) (Figura 4.3.2C). Al contrastar los resultados de los

análisis epigenéticos con los de expresión génica (disminuida en el grupo RE pero no en el

BC, Figura 4.3.1A), y asumiendo que generalmente más metilación del ADN conlleva

menos expresión, se sugiere que la metilación del CpG 1 (-223) podría ser especialmente

Tesis Doctoral


118

determinante de la tasa de transcripción del gen Pparg2 en nuestras condiciones

experimentales.

Figura 4.3.2. Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de transcripción en

la región promotora del gen Ppar g analizada (A). Los CpGs se muestran en negrita, numerados del

1 al 4 (situados a -223, -207, +12 y +128, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica

con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en

su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios

CpG individuales (C) de la región promotora de Pparg analizada en el TAB inguinal (TABi) de

ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil

palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 12-15 animales por grupo (26-

27 para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de

acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha

indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.

Los resultados del análisis de correlaciones se muestran en la Tabla 2 del Anexo 3B. Entre

las correlaciones significativas (P<0.05) destacan: (i) una correlación inversa de la

metilación promedio en los 4 sitios CpG (ρ=-0,397) y en los CpG 1 (ρ=-0,340) y 3 (ρ=-


Capítulo 3

119

0,371) con los niveles de ARNm de Pparg en TABi; y (ii) una correlación directa de la

metilación promedio en los 4 sitios CpG con los niveles de retinol total en TABi o los de

retinil ésteres en hígado (ρ=0,323 para ambas) (Figura 4.3.3). Hubo asimismo una

correlación directa de la metilación del CpG 4 con los niveles de BC en hígado (ρ=0,431)

o suero (ρ=0,459). Finalmente, detectamos una correlación directa relativamente fuerte

(ρ=0,530) entre la metilación en los sitios CpG 1 y 2, que sugiere una regulación común por

vitamina A de la metilación de estos dos sitios, que están próximos entre sí (a -223 y -207), y

una correlación directa más débil (ρ=0,305) entre la metilación en los sitios CpG 3 y 4.

Figura 4.3.3. Correlación del nivel de metilación global de la región promotora de Pparg analizada

en TABi con los niveles de ARNm de Pparg2 en TABi (A), de retinol total en TABi (B) y de retinil

ésteres en hígado (C). ρ, Coeficiente de correlación de Spearman.

En conjunto, los resultados sugieren que la metilación del tramo de ADN promotor

analizado puede contribuir al silenciamiento de la expresión de Pparg2 en TAB y que

niveles altos de vitamina A, específicamente como retinol en TAB e hígado, favorecen esta

metilación.

4.3.2.4. La suplementación con vitamina A durante la lactancia disminuye la

metilación del ADN en CpG específicos del promotor del gen Zfp423

Durante la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos intervienen críticamente el

PPARγ y factores que controlan la expresión y actividad del PPARγ, principalmente

factores de transcripción de la familia C/EBP (C/EBPβ y C/EBPδ) y la proteína de unión

al elemento de respuesta a esteroles (SREBP-1c). La proteína zinc-finger 423 (ZFP423,

también llamada ZNF423) se ubica funcionalmente corriente arriba de estos factores

adipogénicos “tradicionales”. Así, ZFP423 ha sido más recientemente descrita como un

regulador transcripcional de la determinación en preadipocito, capaz de inducir la expresión

de PPARγ2 y la diferenciación adipocitaria (Gupta et al., 2010).

Hay 7 CpGs en el tramo de 1324 pb que precede al sitio de inicio de la transcripción de

Zfp423 en la rata, identificado de acuerdo con los datos disponibles para esta especie en

NCBI. Hemos analizado el estado de metilación de tres de ellos, los situados en las

posiciones -769, -464 y -423 (CpG 1, 2 y 3, respectivamente); otros tres CpGs más

proximales al TSS (situados entre -100 y +1) se han presumido no metilados por analogía

con los resultados de (Yang et al., 2013). Estos autores han descrito en ratones la

transcripción del gen Zfp423 a partir de un promotor (distinto del aparentemente funcional

Tesis Doctoral


120

en la rata) excepcionalmente rico en dinucleótidos CpG que contiene tramos distales (entre

-1324 y -764) cuyo estado de metilación cambia en tejido fetal en función de la obesidad

materna y tramos más proximales al TSS cuyos CpG están invariablemente no metilados

(Yang et al., 2013). Para el análisis utilizamos dos parejas de cebadores, una para amplificar

el tramo de -784 a -725 (que contiene el CpG 1) y otra para amplificar el tramo de -484 a -

365 (que contiene los CpGs 2 y 3) (Figura 4.3.4A). El software Genomatix MatInspector

identificó la presencia de 21 sitios putativos para la unión de factores de transcripción en

el primer tramo analizado y 17 en el segundo, entre los que se destacan los indicados en la

Figura 4.3.4A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo

de ADN genómico próximo al gen Zfp423 de rata investigado.


la región promotora del gen Zfp423 analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita,

numerados del 1 al 3 (situados a -769, -464 y -423, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción

se indica con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran

subrayados en su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación

de los sitios CpG individuales (C) de la región promotora de Zfp423 analizada en el TAB inguinal

de ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil

palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 10-15 animales por grupo (25-

27 para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de




Capítulo 3

121

Globalmente, considerando el promedio de metilación de los 3 CpGs, el promotor de

Zfp423 se encontró relativamente desmetilado en el grupo BC (36% menos metilación) e

igualmente metilado en el grupo RE en comparación con el grupo control (Figura 4.3.4B).

Considerando los 3 sitios CpG por separado, la metilación fue menor para los CpGs 1 y 3

en el grupo BC y para el CpG 3 en el grupo RE, siempre respecto del grupo control (Figura

4.3.4C). La metilación de cada uno de los 3 CpG correlacionó positivamente con la

metilación promedio, lo que sugiere que los tres sitios están regulados de manera similar

(Tabla 3, Anexo 3B). Como ya se ha comentado, los niveles de ARNm Zfp423 en TABi

fueron mayores en los dos grupos suplementados con vitamina A (RE y BC) que en el

grupo control (Figura 4.3.1C). Por tanto, en conjunto los resultados a nivel de grupo

sugieren que la hipometilación del promotor de Zfp423, particularmente la del sitio CpG 3,

podría contribuir al incremento del nivel de transcripción de Zfp423 en TABi observado en

los dos grupos suplementados.

No obstante lo anterior, los resultados del análisis realizado (Tabla 3, Anexo 3B) no sostienen

una correlación a nivel individual entre la regulación epigenética y la regulación

transcripcional, lo que indica que deben existir factores adicionales, sujetos a variabilidad

interindividual, que serían más determinantes de la expresión de Zfp423 en TAB que la

metilación de los CpGs estudiados. Por otro lado, detectamos una correlación inversa entre la

metilación (promedio y de CpGs individuales) en TAB del promotor de Zfp43 y los niveles de

BC en hígado o suero, especialmente fuerte y clara para el CpG situado más corriente arriba,

el CpG 1; en cambio, no hubo correlación entre la metilación del promotor de Zfp43 en TAB,

promedio o en CpGs individuales, y los niveles de retinol en TAB, hígado o suero. Estos

resultados refuerzan la idea de que la metilación del promotor Zfp43 sería especialmente

sensible a la suplementación con BC, que conlleva una menor metilación.

4.3.2.5. La suplementación con vitamina A durante la lactancia afecta la metilación

del ADN en CpG específicos del promotor del gen Pcna, de manera opuesta según sea

aportada como retinil palmitato o como -caroteno

PCNA es un cofactor de la ADN polimerasa que juega un papel clave en la replicación del

ADN y en la reproducción de las marcas epigenéticas de la cromatina de generación en

generación celular (Moldovan et al., 2007). Hemos analizado el estado de metilación en

TABi de los 17 CpGs presentes entre las posiciones -168 y +44 en torno al TSS del gen

Pcna de rata (Figura 4.3.5A). Este tramo presenta 66 sitios de unión a factores de

transcripción detectados por Genomatix MatInspector, entre los que se destacan los

indicados en la Figura 4.3.5A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y

ratón del tramo de ADN analizado. Es interesante destacar que 9 de los 17 sitios CpG

analizados se encuentran conservados en las tres especies (Anexo 3A).

Considerando conjuntamente los 17 CpGs del promotor de Pcna estudiados, respecto del

grupo control encontramos una hipometilación significativa (~32%) en el grupo RE y una

hipermetilación no significativa (~51%) en el grupo BC. Como resultado, el grupo BC

presentó el promotor de Pcna significativamente hipermetilado (~120%) comparado con el

grupo RE (Figura 4.3.5B). Considerados individualmente, 3 de los 17 CpGs presentaron

niveles de metilación significativamente menores en el grupo RE respecto del control

Tesis Doctoral


122

(CpGs 1, 14 y 15) y 6, niveles de metilación significativamente mayores en el grupo BC

respecto del control (CpGs 1, 2, 6, 7, 10,16); 14 CpGs presentaron niveles de metilación

significativamente mayores en el grupo BC respecto del RE (Figura 4.3.5C). Es destacable

que, exceptuando el sitio CpG 1, no hay coincidencia entre los sitios CpG hipometilados

en el grupo RE y los hipermetilados en el grupo BC.


la región promotora del gen Pcna analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita,

numerados del 1 al 17 (situados a -137, -129, -118, -116, -103, -101, -99, -87, -85, -75, -69, -65, -

48, -30, -16, -9 y +14, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica con +1. Los sitios

de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en su posición relativa.

Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios CpG individuales (C)

de la región promotora de Pcna analizada en el TAB inguinal de ratas de 21 días suplementadas

durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC).

Los datos son la media±SEM de 12-15 animales por grupo (28 para el grupo RE). Letras diferentes

indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS,

el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha indicado diferencias con un valor de

P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.

Los resultados del análisis de correlaciones se resumen en la Tabla 4 del Anexo 3B. La

metilación en cada uno de los 17 CpG individuales correlacionó positivamente con la

metilación promedio. Detectamos una correlación directa (ρ=0,359) significativa entre la

metilación del CpG 13 (situado en -48) y el peso corporal, y una correlación inversa (ρ=-

290) entre la metilación del CpG 11 (situado en -69) y la glucosa sérica, cuyo significado

biológico es dudoso. Como resultado más destacado, el porcentaje de metilación, promedio


Capítulo 3

123

y en diferentes CpGs individuales, correlacionó inversamente con los niveles de retinol

total en TABi, retinil ésteres en hígado o retinol libre en hígado, y positivamente con los

niveles de BC en hígado o suero. Por tanto, claramente hubo un efecto diferente, opuesto,

de la suplementación con vitamina A como RE o BC sobre la metilación del promotor del

gen Pcna. La hipometilación observada en el grupo RE, particularmente en los CpGs 14 y

15, se podría relacionar con la tendencia de este grupo a presentar una mayor expresión del

ARNm de Pcna en TABi (Figura 4.3.1B), si bien no se encontró correlación a nivel

individual entre el estado de metilación y los niveles de ARNm.

4.3.2.6. La suplementación con vitamina A durante la lactancia afecta la metilación

del ADN en CpG específicos del promotor del gen Rbp4, de manera opuesta según sea

aportada como retinil palmitato o como -caroteno

La retinol binding protein 4 (RBP4, o simplemente RBP) es una proteína específica para

el transporte de retinol en sangre que es producida por tejidos capaces de almacenar retinol

y movilizarlo, como el hígado y el TAB. El gen Rbp4 se induce fuertemente durante la

diferenciación de los preadipocitos en adipocitos, de modo que su expresión se considera

un marcador del adipocito maduro (Friebe et al., 2011).

Utilizando dos juegos de cebadores hemos podido analizar el estado de metilación de 34 de

los 37 sitios CpG presentes entre las posiciones -340 y +34 del promotor del gen Rbp4 de

rata (Figura 4.3.6A). Este tramo presenta 183 secuencias consenso putativas para la unión de

factores de transcripción detectadas por Genomatix MatInspector, entre las que se destacan

las indicadas en la Figura 4.3.6A. De los 37 CpGs contenidos en el tramo de ADN analizado,

17 están conservados en hombre, rata y ratón, según el alineamiento realizado (Anexo 3A).

En la Figura 4.3.6B se presentan los niveles globales de metilación del promotor del gen

Rbp4 en los tres grupos experimentales estudiados. La metilación promedio fue menor en

el grupo BC (32%) en comparación con el grupo control o el grupo RE. De los 34 sitios

CpG analizados, en el grupo BC se encontraron 2 hipometilados respecto del grupo control

(los CpGs 4 y 9) y 7 hipometilados respecto del grupo RE. Aunque la metilación promedio

no se vio afectada, 4 sitios CpG se encontraron hipermetilados en el grupo RE respecto del

grupo control (los CpGs 2, 6, 15 y 18) (Figura 4.3.6C). La metilación de los sitios 1 a 9,

15, 18, 28, 30, 32 y 33 correlacionó positivamente con la metilación promedio, y hubo

asimismo una fuerte correlación de la metilación de los sitios CpG 1 a 9 entre sí, sugiriendo

una regulación coordinada del estado de metilación de estos sitios (Tabla 5 del Anexo 3B).

No encontramos correlación de la metilación promedio o en sitios CpG individuales de los

analizados del promotor de Rbp4 con los niveles de expresión de su ARNm en TABi (Tabla

5 del Anexo 3B). Es de destacar, no obstante, que, a nivel de grupo, el RE presentó junto

con la ya mencionada hipermetilación de 4 sitios CpG una expresión de ARNm Rbp4 que

tendió a ser menor que la del grupo control (Figura 4.3.1D). Por otro lado, la metilación

promedio y la de CpGs individuales correlacionó directamente con la concentración de

retinol en TABi e hígado e inversamente con la concentración de BC en suero e hígado

(Tabla 5 del Anexo 3B). Por tanto, concluimos que la suplementación con BC favorece la

hipometilación del promotor del gen Rbp4 en TABi, si bien esto no se traduce en cambios

Tesis Doctoral


124

en el nivel de expresión del correspondiente ARNm, mientras que la suplementación con

RE favorece la hipermetilación de ciertos sitios CpG de este promotor, lo que se acompaña

de una expresión a la baja. Es destacable que no hay ninguna coincidencia entre los sitios

CpG hipermetilados en el grupo RE y los hipometilados en el grupo BC.


Capítulo 3

125

Encontramos una correlación directa, débil pero significativa, de la metilación promedio

del promotor de Rbp4 con el peso corporal (ρ=0,276) y el porcentaje de grasa corporal

(ρ=0,273), y una correlación también directa entre el grado de metilación en varios CpGs

específicos (17, 21, 26, 33, 34) y la glucemia (Tabla 5 del Anexo 3B). El significado de

estas correlaciones no es obvio, pero son resultados sugerentes, teniendo en cuenta que

RBP4 como adipoquina se ha descrito aumentada en la obesidad y relacionada con la

resistencia a la insulina (Kotnik et al., 2011).

4.3.2.7. La suplementación con -caroteno durante la lactancia disminuye la

metilación del ADN en CpG específicos del enhancer distal del gen Ucp1

El ácido retinoico todo trans, metabolito activo de la vitamina A, induce (principalmente vía

RAR:RXR) la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP1) en adipocitos marrones y

favorece la remodelación del TAB en ratones adultos, aumentando el metabolismo oxidativo,

disminuyendo el contenido tisular de triglicéridos e induciendo la expresión de UCP1, al

menos a nivel de ARNm (capítulo 1 y (Bonet et al., 2003; Mercader et al., 2006; Musinovic

et al., 2014). Aunque la suplementación con vitamina A durante la lactancia, ya sea como RE

o como BC, no indujo la expresión del gen Ucp1 en el TABi (donde el correspondiente

ARNm no pudo ser detectado por qPCR a tiempo real), hemos analizado posibles efectos de

la suplementación sobre la metilación del enhancer distal del gen Ucp1. Se trata de una región

potenciadora de 221 pb, muy conservada entre especies, que en rata y ratón se sitúa a -2.5 kb

corriente arriba del TSS y en la especie humana a -3,9 kb (Kozak et al., 1994). Este enhancer

contiene elementos cis que regulan la transcripción del gen Ucp1, incluyendo sitios de unión

para diversos receptores nucleares (PPARs, RARs, receptor de hormona tiroidea) y para el

factor de transcripción activado por la señalización adrenérgica, CREB (cAMP response

element binding protein) (del Mar Gonzalez-Barroso et al., 2000; Shore et al., 2010). En

concreto, para el análisis seleccionamos los 12 dinucleótidos CpG presentes en un fragmento

de 288 pb, localizado entre -2696 a -2415 corriente arriba del TSS del gen Ucp1 de rata, que

comprende el enhancer distal (Shore et al., 2010) (Figura 4.3.7A). El fragmento analizado

contiene 70 secuencias consenso putativas para la unión de factores de transcripción

detectadas por Genomatix MatInspector, entre las que se destacan las indicadas en la Figura

4.3.7A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo de ADN

del enhancer de Ucp1 analizado.

◄ Figura 4.3.6. (Página anterior) Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de

transcripción en la región promotora del gen Rbp4 analizada (A). Los CpG analizados se muestran

en negrita, numerados del 1 al 9 (situados a -296, -278, -267, -249, -199, -192, -171, -159, -148) y

del 13 al 37 (situados a -105, -102, -91, -87, -81, -70, -68, -55, -53, -45, -39, -37, -23, -8, +1, +4,

+10, +13, +20, +22, +24, +26, +28, +32, +34, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se

indica con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran

subrayados en su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación

de los sitios CpG individuales (C) de la región promotora de Rbp4 analizada en el TAB inguinal de

ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil

palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 13-15 animales por grupo (28

para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de



Tesis Doctoral


126

La metilación promedio en la región potenciadora del gen Ucp1 fue ligeramente menor

(~3-4 %) en el grupo BC en comparación con el grupo RE (Figura 4.3.7B). Los resultados

CpG a CpG muestran hipermetilación de uno de los 12 CpG estudiados en el grupo RE

respecto del grupo control (el CpG 11) e hipometilación de dos de ellos en el grupo BC

respecto del grupo control (los CpGs, 10 y 12) (Figura 4.3.7C).


el enhancer del gen Ucp1 analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita, numerados

del 1 al 12 (situados a -2640, -2634, -2608, -2599, -2586, -2580, -2541, -2538, -2521, -2511, -2508

y -2455, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica con +1. Los sitios de unión de

factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en su posición relativa. Nivel

global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios CpG individuales (C) del

enhancer de Ucp1 analizada en el TAB inguinal de ratas de 21 días suplementadas durante la etapa

de lactancia con vehículo (grupo control), retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son

la media±SEM de 13-15 animales por grupo (27-28 para el grupo RE). Letras diferentes indican

diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual

se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha indicado diferencias con un valor de P<0,10

(valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.

Los resultados del análisis de correlaciones se resumen en la Tabla 6 del Anexo 3B. La

metilación de cada uno de los 12 CpG individuales correlacionó positivamente con la


Capítulo 3

127

metilación promedio. Hay correlaciones significativas, directas y relativamente fuertes, de

la metilación promedio (ρ=0,459) y en múltiples CpGs específicos (CpGs 2, 3, 5, 6, 7, 9,

12) del enhancer de Ucp1 con la glucemia en el momento del sacrificio. Curiosamente,

encontramos correlaciones inversas, estas más débiles pero también significativas, de la

metilación promedio (ρ=-0,279) y específicamente de los CpGs 7 (ρ=-0,297) y 8 (ρ=-0,291)

con el peso corporal. Para estos mismos CpGs, 7 y 8, detectamos asimismo una correlación

inversa entre su grado de metilación y el peso del TABi (ρ=-0,268 y -0,280,

respectivamente). Finalmente, destacar que la metilación promedio o en CpGs específicos

del enhancer de Ucp1 no correlacionó con los niveles de retinol en suero o tejidos, pero sí,

inversamente, con los de BC en suero e hígado.

4.3.3. Discusión

Los mecanismos epigenéticos median interacciones entre genes, medio ambiente y factores

nutricionales, particularmente durante etapas vitales tempranas críticas. La actividad

epigenética de la vitamina A ha sido estudiada en relación al cáncer y la morfogénesis

durante el desarrollo embrionario, pero muy poco en relación con la salud metabólica y la

homeostasis energética y su programación. Recientemente, se han descrito efectos

epigenéticos de la vitamina A en la programación de circuitos neurales implicados en el

control de la ingesta en la rata (Sánchez-Hernández et al., 2014; Sánchez-Hernández et al.,

2016). Nuestro estudio es, que sepamos, el primero en abordar posibles efectos

nutriepigenéticos de la vitamina A durante la lactancia en relación con la diferenciación y

el desarrollo del tejido adiposo.

Los resultados más destacados son: (i) que un exceso moderado de vitamina A durante el

periodo de lactancia altera marcas de metilación en genes implicados en la diferenciación

y metabolismo del tejido adiposo (TAB) en formación en la rata y (ii) que, a estos efectos,

suplementar la vitamina A en forma de ésteres de retinol (vitamina A preformada) o BC

(carotenoide pro-vitamina A) no es equivalente, sino que hay efectos nutriepigenéticos

diferenciales en el TAB de la crías. Cabe recordar que la rata lactante se ha propuesto como

un modelo animal apropiado en estudios sobre la actividad biológica del BC ya que,

contrariamente a la rata adulta, no hidroliza a nivel intestinal todo el BC dietético, sino que

(aún a dosis moderadas) una parte lo absorbe intacto, asemejándose así a la situación en

seres humanos (Keijer et al., 2005; Musinovic et al., 2014). Las diferencias entre la

actividad nutriepigenética de la suplementación con RE o BC durante la lactancia tienen

que ver con los CpG concretos que se ven afectados y con el sentido del cambio (hipo o

hipermetilación respecto del grado de metilación observado en el grupo control). Las

diferencias más notables se han encontrado para los genes Pcna (hipometilación en

múltiples CpG en el grupo RE e hipermetilación de otros en el grupo BC), Rbp4

(hipermetilación en múltiples CpG en el grupo RE e hipometilación de otros en el grupo

BC) y Ucp1 (con enhancer ligeramente hipometilado en el grupo BC respecto del grupo

RE). También cabe destacar un sitio CpG en el promotor del PPAR2 (el CpG 1 de los

analizados, situado a -223), que se encontró hipermetilado en el grupo RE, pero no en el

grupo BC.

Tesis Doctoral


128

La base molecular de la actividad nutriepigenética de la vitamina A sobre el TAB en

formación y de las diferencias al respecto entre la suplementación con RE y BC requiere

más estudio. Estas últimas podrían tener que ver con una cuestión de concentración: la

suplementación como RE conllevó un incremento mucho más importante de los niveles de

retinol en TAB que la suplementación con BC, y puede ocurrir que los efectos sobre la

metilación del ADN sean distintos dependiendo de la concentración de retinol en las células

adiposas. También puede tener que ver con efectos diferenciales del BC intacto respecto

de los retinoides: aunque no se pudo detectar la presencia de BC en el TAB de las ratas en

el momento del sacrificio (Musinovic et al., 2014), no se puede descartar que haya habido

internalización del BC circulante en el TAB inmaduro durante el periodo de la

suplementación, o que el BC circulante haya actuado sobre las células del TAB desde la

membrana de estas. Finalmente, no se puede descartar que las diferencias de metilación de

ADN observadas en TAB obedezcan a señales dirigidas al TAB procedentes del hígado u

otros tejidos (como el intestino), que se producirían secundariamente a las diferencias en el

estatus en retinol y BC observadas (o presumibles) en estos tejidos. Estos conceptos se

ilustran en la Figura 4.3.8, y también podrían atañer a las diferencias de expresión génica

en TABi observadas entre los grupos BC y RE. En este sentido, cabe señalar que, de todos

los genes analizados en el TABi de los animales usados en esta tesis – Pparg2, aP2, LPL,

Mest, Pcna, Rbp4, Zfp423 (esta tesis y (Musinovic et al., 2014) – el único gen cuya

expresión se vio afectada significativamente en el grupo BC respecto del grupo control fue

el Zfp423.

Figura 4.3.8. Posibles mecanismos de la actividad nutriepigenética de la vitamina A sobre el TAB

en formación y de las diferencias al respecto entre la suplementación con retinil palmitato y β-

caroteno (BC) en ratas lactantes. RE, retinil ésteres; Rol, retinol; RBP, proteína de unión a retinol;

Rald, retinaldehído.


Capítulo 3

129

Nuestros resultados en general parecen estar de acuerdo con el paradigma de que

habitualmente (aunque no siempre) la metilación del ADN silencia la transcripción, por

interferir con la unión de factores de transcripción y/o por otros mecanismos (Klose and

Bird, 2006). Esto es especialmente claro en el caso del PPAR2, para el que encontramos

una correlación negativa entre el grado de metilación de su promotor (global y en 2 de los

4 sitios CpGs analizados) y los niveles de su ARNm en TABi. También en el caso del

promotor de Rbp4, hipermetilado en ciertas posiciones sólo en el grupo RE y con tendencia

a presentar una menor expresión especialmente en este grupo. Recíprocamente, para Zfp423

y Pcna, la desmetilación de ciertos CpG en su ADN promotor se acompaña de una mayor

expresión (o tendencia a ella) a nivel de ARNm en uno o ambos grupos suplementados con

vitamina A.

A continuación, se discuten los resultados más destacados en relación con cada gen

investigado, enmarcándolos en la evidencia previa de regulación del gen en cuestión por

metilación del ADN y por vitamina A:

PPARγ2 es clave para la adipogénesis y para el mantenimiento del fenotipo de adipocito

maduro, implicado por tanto en la lipogénesis en los adipocitos, la prevención de la

lipotoxicidad por deposición de grasa en sitios ectópicos (páncreas, músculo,…) y la

sensibilización sistémica a la insulina (Kersten et al., 2000; Kintscher and Law, 2005).

Estudios previos han mostrado que durante la adipogénesis de preadipocitos murinos 3T3-

L1 la expresión de PPARγ2 se induce en paralelo a una desmetilación progresiva de su

promotor, y que la expresión de PPARγ2 está reprimida y su ADN promotor hipermetilado

en el TAB de ratones con obesidad y diabetes inducidas por una dieta hipergrasa (Fujiki et

al., 2009). La represión de la expresión de Pparg2 en el TAB de las ratas lactantes

suplementadas con RE está de acuerdo con el conocido efecto de los retinoides de inhibir

la adipogénesis y con resultados que indican que ácido retinoico y productos de la acción

de la BCO1 sobre el BC dietético inhiben la expresión y actividad transcripcional del

PPARγ2 en el TAB de ratones adultos (Amengual et al., 2011; Ribot et al., 2001) y en

adipocitos maduros en cultivo (Lobo et al., 2010). Los resultados de esta tesis sugieren que

la metilación del ADN promotor sería un mecanismo que podría contribuir a esta represión.

De los 4 CpGs contenidos en el tramo del promotor de Pparg2 estudiado, nuestros

resultados apuntan a un papel funcional destacado del CpG 1 (el situado a -223), ya que la

metilación de este sitio correlaciona inversamente con la expresión de Pparg2 en TABi y,

además, es el único CpG hipermetilado específicamente en el grupo RE, que es el grupo

que mostró una expresión significativamente reducida de ARNm de Pparg2 (otros CpGs

también se encontraron hipermetilados en el grupo BC, en el que en cambio los niveles de

ARNm de Pparg2 no fueron distintos a los del grupo control). Interesantemente, el CpG 1

es el único de los 4 CpGs estudiados que está conservado en el promotor de Pparg2 en

hombre, rata y ratón, según se desprende de nuestro análisis de alineación (Anexo 3A).

También es interesante destacar que este CpG 1 solapa con un sitio de unión a E2F1. Es

conocido que factores de transcripción de la familia E2F regulan la adipogénesis mediante

la modulación de la expresión del gen Pparg: en concreto E2F1 induce la expresión de la

isoforma PPARγ1, que se induce antes que la 2 y que juega un papel muy importante

Tesis Doctoral


130

durante la fase inicial de expansión clonal de los preadipocitos ya confluentes (Fajas et al.,

2002; Miard and Fajas, 2005). Que sepamos, no se ha estudiado específicamente la acción

de los E2F sobre el promotor del Pparg2, que es el que hemos estudiado parcialmente aquí

a nivel de metilación. Las isoformas PPARγ1 y PPARγ2, esta última de expresión

restringida en los tejidos adiposos, comparten la mayoría de exones C-terminal, pero se

transcriben a partir de promotores diferentes (Fajas et al., 1997).

ZFP423 es un iniciador de la determinación de células progenitoras en preadipocitos y un

inductor de la expresión de PPARγ (de manera indirecta) y de la diferenciación adipocitaria

(Gupta et al., 2010). De acuerdo con ello, Zfp423 es crítico para el desarrollo del TAB

subcutáneo durante el desarrollo fetal del ratón (Shao et al., 2016). Nuestros resultados

muestran que la suplementación durante la lactancia con una dosis moderada de vitamina

A, como RE o BC, favorece una expresión aumentada del gen Zfp423 en TABi y la

desmetilación en ambos grupos suplementados de uno de los sitios CpG analizados, el sitio

CpG 3. Este CpG se sitúa cerca de un sitio de unión putativo para factores de transcripción

HNF3 (hepatocyte nuclear factor-3, también llamados Foxa 1-3), que están implicados en

la adipogénesis (Wolfrum et al., 2003). No obstante, no hemos encontrado evidencia en la

bibliografía de una conexión entre HNF3 y la expresión de Zfp423.

La interacción de la vitamina A con el gen Zfp423 es compleja. En ratones carentes de

aldehído deshidrogenasa 1 (Aldh1), enzima que cataliza la producción de ácido retinoico

a partir de retinaldehído, la expresión de Zfp423 y Pparg se encuentra disminuida en un

70% en el tejido adiposo visceral, el cual se presenta muy atrofiado (Reichert et al., 2011).

Estos y otros resultados han llevado a proponer que el ácido retinoico sintetizado

endógenamente puede ser necesario para la adipogénesis in vivo por inducir la expresión

de Zfp423 (Reichert et al., 2011). Por otro lado, según un abstract reciente, el ácido

retinoico exógeno inhibe la adipogénesis de células madre totipotentes ya que previene la

desmetilación del ADN promotor del gen Zfp423, reprimiendo así su expresión. En el

mismo abstract se describe que la suplementación con vitamina A (retinol) en el agua de

bebida (30 UI/mL) inhibe el desarrollo de obesidad dietética en ratones adultos y atenúa la

expresión de Zfp423 y Pparg en el TAB (Wang et al., 2016b). La represión de Zfp423

podría contribuir a contrarrestar la obesidad dietética no sólo por inhibir la adipogénesis,

sino también favoreciendo la marronización (browning) del TAB, ya que se ha descrito que

la inactivación de Zfp423 in vivo promueve la conversión de los adipocitos maduros en

adipocitos beige (Shao et al., 2016). En este sentido, es sugerente que la administración de

ácido retinoico exógeno haga esto mismo en ratones adultos: inhibe la adipogénesis

promovida in vivo por una dieta obesogénica (Berry et al., 2012) y favorece el metabolismo

oxidativo y la marronización del TAB ((Mercader et al., 2006) y esta tesis), resultando en

un efecto anti-obesidad. En nuestro experimento, la suplementación con vitamina A durante

la lactancia se asoció a la desmetilación de un sitio CpG específico en el promotor de

Zfp423 y a una expresión aumentada de Zfp423 en el TABi al destete, lo que podría estar

de acuerdo con los resultados de (Reichert et al., 2011). Por tanto, los efectos de los

retinoides sobre la expresión del gen Zfp423 podrían ser dependientes de la dosis y del

momento del desarrollo, prevaleciendo un efecto estimulador a dosis moderadas y en

momentos tempranos del desarrollo. De hecho, contamos con resultados que indican que


Capítulo 3

131

la expresión de Zfp423 está reprimida en el TAB visceral (retroperitoneal) de ratones

adultos tratados con ácido retinoico (Anexo 3C).

En ratones, la obesidad materna disminuye la metilación del ADN promotor de Zfp423 en

tejido fetal (Yang et al., 2013) y en TAB (y específicamente en células progenitoras dentro

del TAB) al destete (Liang et al., 2016) y esto va en paralelo a una mayor expresión de

Zfp423 y una mayor adipogénesis de células progenitoras. Posiblemente a través de sus

efectos epigenéticos sobre Zfp423, la obesidad materna programa una diferenciación

adipogénica prematura, que agota el pool de células progenitoras adipogénicas, limitando

la expansibilidad por hiperplasia del TAB cuando (tras el destete) los ratones son

alimentados con una dieta rica en energía; esto conduce a una hipertrofia excesiva de los

adipocitos y a signos de inflamación y disfunción metabólica a los tres meses de edad

(Liang et al., 2016). La situación es distinta en nuestro experimento, porque en el grupo RE

la mayor expresión de Zfp423 en TAB no se acompañó de una mayor expresión de Pparg2,

sino todo lo contrario, esta fue menor. Los resultados apuntan por tanto a efectos

discordantes de la suplementación temprana con RE sobre la expresión de estos dos genes

pro-adipogénicos, Zfp423 y Pparg2, una discordancia que también se detecta al nivel de la

metilación de su respectivo ADN promotor. De hecho, cuando (tras el destete) las ratas

tratadas con RE son alimentadas con una dieta rica en grasas se detecta una mayor

expansión del TAB con predomino del componente hiperplásico (Granados et al., 2013).

PCNA favorece la síntesis de ADN durante la proliferación celular (Moldovan et al., 2007),

por lo tanto su estudio es relevante para la comprensión de procesos de desarrollo y

diferenciación. Es más, PCNA interviene críticamente en el desarrollo del TAB: la

fosforilación de PCNA en un residuo específico de tirosina (Y114) es necesaria para la

adipogénesis inducida por una dieta alta en grasa en ratones y para la expansión clonal

mitótica que precede a la diferenciación terminal de fibroblastos embrionarios de ratón en

adipocitos (Lo et al., 2013). Nuestros resultados muestran que la suplementación con RE

durante la lactancia promueve en TABi la desmetilación del ADN en los sitios CpG -137,

-30 y -16 del promotor de Pcna y sugieren que la desmetilación de estos sitios favorece la

transcripción a partir de este promotor, ya que los niveles de ARNm de Pcna tendieron a

ser más altos en el grupo RE (esta tesis y (Musinovic et al., 2014)). Es más, las ratas tratadas

con RE durante la lactancia presentan en el momento del destete adipocitos más pequeños

y más núcleos positivos para PCNA en TABi que las ratas controles (Musinovic et al.,

2014). De los 3 sitios CpG indicados, sería particularmente relevante la desmetilación de

los CpGs -30 y -16, próximos entre sí y al TSS, ya que la hipermetilación del sitio CpG -

137 no redundó en una menor expresión del ARNm de Pcna en el grupo BC. Cabe destacar

que el CpG -30 solapa con sitios putativos de unión de VDR y E2F4, factores de

transcripción que han sido implicados en la adipogénesis y otros aspectos de la biología del

tejido adiposo (Ding et al., 2012; Landsberg et al., 2003; Miard and Fajas, 2005; Mutt et

al., 2014) y también en el control de la expresión de PCNA (Eelen et al., 2004; Takashima

et al., 2001).

La hipermetilación de múltiples sitios CpG en el promotor Pcna observada en el grupo BC

respecto del grupo control no se acompañó de cambios en el nivel de expresión de su

Tesis Doctoral


132

ARNm. En todo caso, es interesante destacar que, en el estudio de Musinovic et al. (2014),

las ratas que recibieron BC durante la lactancia presentaron en el momento del destete

menos núcleos positivos para PCNA en TABi que las que recibieron RE (Musinovic et al.,

2014), un resultado que podría estar en consonancia con los de esta tesis, que muestran

hipermetilación del ADN promotor de Pcna en el grupo BC respecto del grupo RE.

RBP4 es responsable del transporte y distribución de la vitamina A en el organismo y es

producida principalmente por el hígado y el tejido adiposo. Sus niveles circulantes están

incrementados en la obesidad y la RBP4, particularmente la de origen adiposo, ha sido

implicada en la resistencia a la insulina, aunque hay resultados controvertidos (Kotnik et

al., 2011; Norseen et al., 2012). La expresión de RBP4 está estrechamente ligada a la

diferenciación de los adipocitos (Friebe et al., 2011), por lo que puede ser considerada un

marcador del adipocito maduro. Además de resultar inducida durante la adipogénesis,

RBP4 modula en conjunción con su receptor de membrana (STRA6) la adipogénesis en

modelos celulares de preadipocitos (Muenzner et al., 2013) y se ha descrito que RBP4

inhibe la adipogénesis de preadipocitos en cultivo (Cheng et al., 2013) y la adipogénesis in

vivo en ratones jóvenes (Cheng et al., 2014).

La expresión de RBP4 está modulada por vitamina A. En el genoma humano, el promotor

de Rbp4 contiene un elemento de respuesta a ácido retinoico particular, funcional en células

de origen hepático (HepG2), consistente en dos sitios de unión a RAR degenerados

separados por un fragmento de 30 nucleótidos que incluye un sitio de unión a Sp1

(Panariello et al., 1996). Este elemento no está conservado en la rata, en donde sólo se

reconoce el sitio de unión a Sp1 (véase la alineación en hombre, ratón y rata en el Anexo

3A). La modulación de la expresión de RBP4 por vitamina A es diferente en hígado y tejido

adiposo: el tratamiento con ácido retinoico suprime la expresión de RBP4 en TAB de

ratones y en adipocitos en cultivo, mientras que no afecta o induce la expresión de RBP4

en hígado de ratones y células hepática en cultivo (Jessen and Satre, 2000; Mercader et al.,

2008; Mourey et al., 1994). Hay también evidencia de que la metilación del ADN juega un

papel en el control de la expresión del gen para RBP4: en mujeres con diabetes gestacional

se ha descrito hipometilación del gen RBP4 ligada a una mayor expresión de su ARNm en

la placenta (Rong et al., 2015). Esto estaría de acuerdo con una implicación de la RBP4 en

la resistencia a la insulina y específicamente la diabetes gestacional.

La suplementación con BC conllevó la hipometilación global y de varios sitios CpG del

tramo promotor de Rbp4 analizado, lo que no se acompañó de cambios destacables de los

niveles de ARNm. Por otro lado, nuestros resultados indican hipermetilación de otros

cuatro sitios CpG de dicho tramo en los animales suplementados con RE (los CpGs 2, 6,

15 y 18, distintos de los hipometilados en el grupo BC y situados entre -278 y -55) y una

tendencia a menores niveles de expresión del ARNm de Rbp4 en este grupo. Este último

resultado estaría en consonancia con literatura previa que indica que el ácido retinoico

suprime la expresión del ARNm de Rbp4 en el tejido adiposo y en adipocitos en cultivo

(Mercader et al., 2008). De los 4 sitios hipermetilados en el grupo RE, la metilación de tres

de ellos, los CpGs 2, 15 y 18, correlacionó positivamente con los niveles de retinol total en

TABi. Los CpGs 15 y 18 se encuentran próximos a sitios de unión para factores de


Capítulo 3

133

transcripción de las familias E2F y Kruppel-like, muy relacionadas con la adipogénesis

(Miard and Fajas, 2005; Wu and Wang, 2013). No se ha encontrado evidencia bibliográfica

de un papel de estos factores de transcripción en el control del gen Rbp4.

Los retinoides derivados de la vitamina A son activadores transcripcionales de la expresión

génica de UCP1 en adipocitos y estudios en animales indican que el estatus en vitamina A

condiciona la capacidad termogénica del tejido adiposo marrón y que el tratamiento con

ácido retinoico promueve la expresión de UCP1 en TABi (Bonet et al., 2012). Además, el

gen Ucp1 está controlado por metilación de sus elementos reguladores, particularmente la

región potenciadora (enhancer) distal. La expresión selectiva de Ucp1 en tejido adiposo

marrón se asocia a una menor metilación de CpGs de dicho enhancer en este tejido, en

comparación con otros (Shore et al., 2010). Adicionalmente, hay evidencia de que RIP140,

un correpresor de receptores nucleares que suprime la transcripción de numerosos genes

metabólicos oxidativos, dirige la metilación de la región potenciadora de Ucp1 en

adipocitos blancos (Kiskinis et al., 2007). Aunque no se pudo detectar expresión de Ucp1

en el TABi en ninguno de los grupos experimentales, nuestros resultados muestran una

desmetilación ligera pero significativa de tres sitios CpG específicos del enhancer de Ucp1,

los CpGs 10, 11 y 12, en el grupo tratado con BC respecto de los grupos control o RE. Los

sitios 10, 11 y 12 son próximos o solapantes a sitios de unión para factores de transcripción

CREB y PPAR importantes para la expresión de Ucp1 (Rim and Kozak, 2002).

4.3.4. Conclusiones

En conclusión, la suplementación temprana con vitamina A modula en el TABi el perfil de

metilación de regiones reguladoras de Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 de manera

diferencial según sea aportada por vía oral como retinil palmitato o como -caroteno. Los

efectos observados podrían subyacer a diferencias en fenómenos de programación de las

características y respuestas del TAB en etapas posteriores de la vida.

Los resultados muestran efectos discordantes de la suplementación con RE durante la

lactancia sobre la expresión y la regulación epigenética en TABi de Zfp423 y Pparg2:

aumento de la expresión génica de Zfp423 acompañada de hipometilación de un CpG

específico su promotor y disminución de la expresión génica de Pparg2 acompañada de

hipermetilación de su promotor. Los cambios inducidos por la suplementación con RE

sobre la expresión y metilación de Rbp4, un marcador de adipocitos maduros, van en el

mismo sentido que para el Pparg2: disminución de la expresión e hipermetilación. Además

la expresión de Pcna se encuentra aumentada en el TABi en el grupo RE, en paralelo a la

hipometilación de su ADN promotor. En conjunto, vemos que un exceso moderado de

vitamina A como RE resulta en un TAB que mantiene células altamente comprometidas a

diferenciarse en adipocitos pero relativamente poco diferenciadas y que retienen más

capacidad proliferativa. Estas características propician una expansión mayor, pero tal vez

más “saludable” del TAB subcutáneo ante una dieta rica en grasa administrada tras el

destete (Granados et al., 2013), y a ellas contribuirían efectos sobre la metilación de ADN

en el promotor de estos cuatro genes.

Tesis Doctoral


134

La suplementación con BC tiene efectos similares a los de la suplementación con RE sobre

la metilación y expresión de Zfp423, pero diferentes sobre la metilación del promotor de

Pcna, Rbp4 y (parcialmente) Pparg2, si bien los cambios de metilación de estos últimos no

se traducen en cambios a nivel de expresión.


Capítulo 3

135

Anexo 3A

Alineamiento de secuencias de rata, ratón y humano de la región promotora/enhancer de los

genes: Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 (CLUSTALW v.1.83, DNA Data Bank of Japan:

http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html). Las secuencias se obtuvieron de las bases de datos

del EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/). Para todos los genes, la secuencia analizada de cada

gen se muestra en azul con los CpGs estudiados subrayados y en negrita. La secuencia del

transcrito inmaduro (con intrones) se muestra resaltada en gris claro y la secuencia codificante

en gris oscuro; hemos tomado como sitio de inicio de la transcripción (TSS) el primer

nucleótido del primer exón del transcrito inmaduro de acuerdo a las bases de datos del EMBL-

EBI y del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para el gen Zfp423 la región promotora

estudiada (5’ corriente arriba del TSS descrito en rata) se corresponde con una región

intragénica en humanos y ratones (se resaltada en verde la secuencia del exón).

Gen Pparg2

Homo sapiens GTACAGTTCACGCCCCTCACAAGACACTGAACATGTGGGTCACCGGCGAGACAGTGTGGC

Mus musculus GTACAGTTCACGCCCCTCACAGAACAGTGAATGTGTGGGTCACTGGCGAGACAATGTAGC

Rattus novergicus GTACAGTTCACACCCCTCACA-AACACTGAATGTGTGGGTCACTGGCGAGACAGTGTAGC

*********** ********* *** **** ********** ********* *** **

Homo sapiens AATATTTTCCCTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGCAGTGAAC---ATTATGACACAAC

Mus musculus AACGTTTTCCTTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGCAGCAGACAGCATTATGACACACC

Rattus novergicus AACGTTTTCCTTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGAAGCAGACAGCATTATGACACACC

** ****** ************************* ** ** *********** *

Homo sapiens TTTTTGTCACAGCTGGCTCCTAAT-AGGACAGTGCCAGCCAATTCAAGCCCAGTCCTTTC

Mus musculus ATTTTGTCACAACTGGCTCTCAGTCAGGACAGTGCCAGCCAATTCAGGCCTGATTCTTTC

Rattus novergicus ATTTTGTCACAGCTGGCTCTCAATCAGGACAGTGCCAGCCAATTCAGGCCTGATCCTTTC

********** ******* * * ********************* *** * *****

Homo sapiens TGTGTTTATTCCCATCTCTCCCAAATATTTGGAAACTGATGTCTTGACTCATGGGTGTAT

Mus musculus TGTGTTTATTCCCACCTCTCCCAAATATTTGAAAACTGGTGTCTTGACTTATTAGCATAT

Rattus novergicus TGTGTTTATTCCCACCTCTCCCAAATATTTGAAAACTGGTGTCTTGACTCATTAGCATAT

************** **************** ****** ********** ** * ***

Homo sapiens TCACAAATTCTGTTACTTCAAGTCTTTTTCTTTTAACGGATTGATCTTTTGCTAGATAGA

Mus musculus TCATAAGCTCGATGACCATAAGCCTTTTTCCTTTAACCAACCAATCTTTTGCAAGACATA

Rattus novergicus TCATAAGCTCAATGACCACAAGCCTTTTTCCTTTAACCAACCGATCTTTTACAAGACACA

*** ** ** * ** *** ******* ****** * ******* * *** * *

Homo sapiens GACAAAATATCAGTGTGAATTACAGCAAACCCCTATTCCATGCTGTTATGGGTGAAACTC

Mus musculus GACAAAACACCAGTGTGAATTACAGCAAATCTCTGTTTTATGCTGTTATGGGTGAAACTC

Rattus novergicus GACAAAACATCAGTGGGAATTAAGGCAAATCTCTGTTTTATGCTGTTATGGGTGAAACTC

******* * ***** ****** ***** * ** ** *********************

Homo sapiens TGGGAGATTCTCCTATTGACCCAGAAAGCGATTCCTTCACTGATACACTGTCTGCAAACA

Mus musculus TGGGAGATTCTCCTGTTGACCCAGAGCATGGTGCCTTCGCTGATGCACTGCCTATGAGCA

Rattus novergicus TGGGAGATCCTCCTGTTGACCCAGAGCATGGTGCCTTCGCTGATGCACTGCCTATGAGCA

******** ***** ********** * * ***** ***** ***** ** * **

Gen Zfp423

Homo sapiens CAAACTCTTCGTGGCTCTCACTACCTGTAAGACCTCAGACACCCCTCTGAGAGTCCGTTG

Mus musculus C-----TTTGATAGGAGAAAATGCCTGCAAGA--TTAGGGACTGTTCTGAGT-TCTGC--

Rattus norvergicus C-----TTTGATAGCAGAAAATGCCTGCAAGA--TTAGGGGCTGTTCTGAGT-TTTGC--

* ** * * * * **** **** * ** * ****** * *

Homo sapiens AGGAAGACGAAACCCAGTGATGGCTGCAAAGCCCCAGCACAGTGCCTGGCTCAGTGTGCA

Mus musculus -------CTCATTTCTGTG--GGTGGCAGTTATTTTGCTCG-TGAGTGGAA-ACTATGTA

Rattus norvergicus -------CTCGTTTCTGTG--GGTGGCAGATGTTTTGCTCA-TGAGTGGAA-ACTATGTT

* * *** ** *** ** * ** *** * * **

Tesis Doctoral


136

Homo sapiens CCCAC----GTGGTGCC----AGCAAGAACATC-GACA-----GTGCAGAGAGAACTGG-

Mus musculus CTAATGGTTGTAGCACTGAATAGAAAAAGCTTCTGAT--GTCTGTATGGAGGCAGT-GCT

Rattus norvergicus CTAATGGTTGTAGTACTGAATAGAAAAAGCTTCTGATATGTCTGTCTGGAGACAGTTGCT

* * ** * * ** ** * * ** ** ** *** * *

Homo sapiens GTGGTTCAT-GGTGGCTTCAGCCTGCACATATGCAGAGCTAGAAAGGCCATTAAATCTGA

Mus musculus GGGATTGATTAGTGATGTCTGCCAGGT----TGCAGGGCTGTGGAAAC-AT--AGTGGAG

Rattus norvergicus GTGATTGATTAGTGATGTCTGTCAGAA----TGCAGGGCTGTGGAAAC-AT--AGTGGAG

* * ** ** *** ** * * * ***** *** * * ** * *

Homo sapiens AAAATACTGTGTATGCACATTTTTGGCTTAAACAAAGTTCCATTTACAAAGTCCATAACC

Mus musculus ACAGTACT-TACCCGC-CGTTCATG-TTTGA------TTCGTTTTATTA--TTTATAATC

Rattus norvergicus ACAGTACC-TACCTGC-CATTCATG-TTTGA------TTCTTTTTACTA--TTTATAATC

* * *** * ** * ** ** ** * *** **** * * **** *

Homo sapiens CAGCTTTA----------------------------------------------------

Mus musculus T--CT-------------------------------------------------------

Rattus norvergicus T--CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTCTCTCTCTGTGTGTG

**

Homo sapiens ---ATAT-TAT-TACATGCCCCAGACTGGGATTAATTCCAGGACAA----GAGTGTTG--

Mus musculus ---GTGTGTGTGTACATGTGTATGTGTAGGACAAA-----GAGTGACATTGGGAGTTGGT

Rattus norvergicus TGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTAGGATGAA-----GGACGACATTCAGTGATGGT

* * * * * ** * * *** ** * * * * **

Homo sapiens --TTATGCTGTGTAGTGTTTCTCCCATATTCTCCTAGTG--CATGGCCTCTACCAGCCTG

Mus musculus CCTTGCTATTTATCTTGTTTGAGACAGAATCTCTTGTTTGCCATTGTGTCCATCAGGCTA

Rattus norvergicus CCTTGCCCTTTATTTTGTTTGCAACGGTATTTCTTGTTTGCCATTGTATACACCAGGCTA

** * * * ***** * * ** * * *** * * * *** **

Homo sapiens GGCTTATGTCCTGGGGTGTGGGATGGTGGGGACACCCTATCTCTGCCCAGCTTGGTTC-T

Mus musculus ---------CCAGACCTATGAGCTGCTGGAAATTTCCCGTCTTCGCCT--CCACTCTCAT

Rattus norvergicus ---------CCAGACCTATGAAGTTCTGGAAATT-CCCATCTTCACCT--CCAAGTTCAT

** * * ** * *** * ** *** ** * ** *

Homo sapiens GTGGGGTCCTGGGTGGAAT----------GGGGGGGAGGCTGGTTGCCTTCTGA------

Mus musculus AAAAGCACTTGGATTAGA------------------------------------------

Rattus norvergicus AAAAGTGCCTGGATTAGATACATGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGACAGAGATACA

* * *** * *

Homo sapiens TGTTGTCAGCTCATGAGT-TGCAGTGCTCAGA----CGTGCTGTCATTGGGAGA------

Mus musculus ------------------------------------------------------------

Rattus norvergicus TGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGATGAGAGATACATG

Homo sapiens --GTTGACCTCAGCGTGTCCT--------GAGGTCTAT-CTGTGGGTCAGGTCT------

Mus musculus ------------------------------------------------------------

Rattus norvergicus CTATGGACAGAGATACATGCTATGGATCAGAGATATATGCTATGGGTTAGAGATACATGC

Homo sapiens -------------------CAGCAGGGTCATGAGCACTCACCACTTTGCTGATCTCTGAG

Mus musculus -------------------------------GA-TACACGCTA------TGGTGTC----

Rattus norvergicus TATGGGGTAGAGATACATGCTATGGGGTAGAGA-TACATGCTA------TGGTGTC----

** ** * * ** * **

Homo sapiens AGCAACCTTAT-TGGTTTCTTGAGGCAGTGCTGAGATTGATTAGTGATGTCTGCCAGGGG

Mus musculus --CAGCTTTGTGTGGGTTCTGGGGAC----TCGAACTCAGGTCCTCATGCTTGCA-----

Rattus norvergicus --CAGCTTCGTGTGGGTTCTGGAGGC----TCGAACTCAGCTCCTAA-GCTTGCA-----

** * * * *** **** * * * ** * * * * * ***

Homo sapiens CACAGGGCTGGGGAAACCATAACTGATCCAGCACTTAACTTGCTTGCTATTCCTGTTTTA

Mus musculus --------TGACAGTACTTTATC--------CACTGATCCTGGTC-CTGT----GCCTTA

Rattus norvergicus --------TGGTGGTAC-----C--------CACCGTACATGCTC-CTGT----GCTTTA

** ** * *** * ** * ** * * ***


Capítulo 3

137

Homo sapiens TTCCGATCATT-TTACATCTCTGTGAAACCAATAAAGGCCTCTTTG---TAGGCTTTGCC

Mus musculus TTCTGATCACCATTGCATCTCTGTGAGACCAACAAA------TTTG---TAGGTTTTGTG

Rattus norvergicus GTCTCATCCCTATTTGATCTGTGTGACACCAACAAAAGCTATCTTGGCATAGATTTTGTG

** *** ** **** ***** ***** *** *** *** ****

Homo sapiens CCCTCTCC----CCTGGTGATGGGTATTATAATAAGGACCCCCACAAATGTTCCTTCTTC

Mus musculus CCCCCCCCTTGCCCCCGTG---GATAGCATA-TAAATACTCCCACAGGGCTCCCATCTTC

Rattus norvergicus TCCCTTCC--ACCCCAATGTCAGATAGCATA-TAGATACCCCTGTAGGGTTCCCATGTTC

** ** ** ** * ** *** ** ** ** * * ** * ***

Homo sapiens CTCGCCCTGTGCCTT----ACC---TGATCTATTTGTACAGCCTTCAAACTCACAGGCCC

Mus musculus TCTGACCTGTGTCTT----ACCCCATGACCCGTGTATGCAGCTTCCAAACTCACAGCCCT

Rattus norvergicus TCTGACCTGTGTCCTACCTACCCCATGACCTGTGTGTTCAGCTTCCAAACTCACAGCCCT

* ****** * * *** *** * * * * **** * *********** **

Homo sapiens ATCTCTGTTCTCTCTTTCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCAGACTTCTCGCTGGCCTGGGA

Mus musculus ---TCTTTCTTCTCTTCCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCGGACTTCTCGCTGGCCTGGGA

Rattus norvergicus ---TCTTTCTTCTCTTTCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCGGACTTCTCGCTGGCCTGGGA

*** * ****** ********************** ********************

Gen Pcna

Homo sapiens GCCCCGCCCTGCGCCCGCTTCCTCCAATGTATGCTCTAGGGGGCGGGCCTCGCGGGGAGC

Mus musculus GCCCCGCCTT-----------------TGCATACGCGGTGGGGCGGGCCTTGCTCAAACC

Rattus novergicus GCTCCGCCTC-----------------TGTATACGCGGCGGGGCGGGCCTTGCTCAAACC

** ***** ** ** * * *********** ** * *

Homo sapiens ATGGACACGATTGGCCCTAAAGTCTTCCCCGCAAGGCCGTGGGCTGGACAGCGTGGTGAC

Mus musculus ACGGGTACGATTGGTCCTTGAG--------GAGAGG---TGGGTGGATCAGCGCTGTGGC

Rattus novergicus ACGGATACGATTGGTTCTAGAG--------GAGAGG---TGGGTGGGTCAGCGCTGTGAC

* ** ******** ** ** * *** **** * ***** *** *

Homo sapiens GTCGCAACGCGGCGCAGGGTGAGAGCGCGCGCTTGCGGACGCGGCGGCATTAAACGGTTG

Mus musculus GTCATGACCTCGCGCAGGGAAAAGGCGCGCGCCTA-GGAAGCCGCGGCATTAGACGGTTG

Rattus novergicus GCCACAACCTCGCGCACTGAAAGAGCGCGCGCCTA-GGAAGCCGCGGCATTAGACGGTTG

* * ** ***** * * ******** * *** ** ********* *******

Homo sapiens CAGGCGTAGCAGAGTGGTCGTTGTCTTTCTAGGTCTCAGCCGGTCGTCGCGACGTTCGCC

Mus musculus CGGGCGCAGAGGGTTGGTAGTTGTCGCTGTAGGCCT-------TCGCTGCCGCTTCTGCA

Rattus novergicus CGGGCGCAGGTGACTGGTTATCGTCCCTCCTGGTCT-------TCAC-GCTACTTCTGCA

* **** ** * **** * *** * ** ** ** ** * * **

Homo sapiens CGCTCGCTCTGAGGCTCCTGAAGCCGAAACCAGCTAGACTTTCCTCCTTCCCGCCTGCCT

Mus musculus TCGTGAATCGGGGGACCTTG---------GCAGCCAGACCTCGTTCCTCTTAGAGTAGCT

Rattus novergicus TCGTGAGTCGGGGTACCTTG---------TCAGCAAGACCTCGCTCCCCTTACAGTAACT

* ** * * * ** **** **** * *** * **

Homo sapiens GTAGCGGCGTTGTTGCCACTCCGCCACCATGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGGGCTCCAT

Mus musculus CTCATCTAGTCGCCACAACTCCGCCACCATGTTTGAGGCACGCCTGATCCAGGGCTCCAT

Rattus novergicus CTCATCTAGACGTCGCAACTCCGCCACCATGTTTGAGGCACGCCTGATCCAGGGCTCCAT

* * * * **************** ***** ****** *************

Gen Rbp4

Homo sapiens GTCCGCTCTCGCTCTGTGAGGCCACGGTCTTCCCGCCAGGTTGACTCGAGCCTCCTGCCA

Mus musculus GTCCCTTTTCGCTCAGTGAGGCCACCATCACCACACCATGGCCACGTAGGCCTCCAGCCA

Rattus novergicus GTCCCTTCTTGCTCAGTGAGGCCACCATCATCACACCATGGCCACGTAGGCCTCCAGCCA

**** * * **** ********** ** * * *** * ** ****** ****

Homo sapiens GAGCCACTGGCCCCGGAGGCCACCCTAGACCGCAGCTGGCG-----GCCGCTGG--CACG

Mus musculus GGGCAACAGGACCTGGAGGCCACCCAAGACTGCAGCTGGCT-----GCCGCTGGGTCCCC

Rattus novergicus GGGCAACAGGACCTGGAGGACACTCAAGACCGCAGCTGGCTGTGCTGTCGCTGGATTCCC

* ** ** ** ** ***** *** * **** ********* * ****** *

Homo sapiens AGTGCAGGGTAACTGAGCC--AGGGCC-------GCTGGCGCATTTGGCCTGGCCGAGGC

Mus musculus GGGCCAGCTC--TTGGCCCCGATGGATCCTCTGGGCTGGAGAGTTTGGCTCCACCGAGAC

Rattus novergicus GGCCCAGCTC--TTGGCCCCGATGGCTCGTCTGGGCTGGAGAGTTTGGCTCCACCAAGAC

* *** ** ** * ** ***** * ****** ** ** *

Tesis Doctoral


138

Homo sapiens CACCCCGCGCGGCCGCTCCACTGTGCCCGAGGCTGTCCTGGA--GGTGAGGCCGGCCCAC

Mus musculus CACCCTGAGCGGA-GCTC----GGAGCATAGGC-GACGTGGGACGGCAAGGCTGAC--GG

Rattus novergicus CACCCTGAGCGGA-GCTC----GTAGCCTAGGC-ATCATGGGGCGGCAAGGCTGAC--GG

***** * **** **** * * **** * *** ** **** * *

Homo sapiens AGGGACCCTGCCCGTGCCCGGGCTCCGGTGAGTCAGGGCGCGTTATGCAAGT--------

Mus musculus AGGGGCCCCGCGTGCGTTCAGG----AGTGAGTCAGGGAGCGTTATGCAAGCTCGGCCGC

Rattus novergicus AGGGGCCCCGCGTGCGTTCAGGC---GGTGAGTCAGGGAGGGTTATGCAAGCTCCGCCGC

**** *** ** * * * ** *********** * **********

Homo sapiens -------------GCCCCCGGCGCCTCCCCTTCGGTCTTTCACCCCGCGCGGTTACGAAA

Mus musculus CCCCCCCCCTCCCGCCCCCGGCACCTCCCCG-CGGTCTTTCACCCCGCGCGGTTACGAAA

Rattus novergicus CCCCCTCCCGCCCGCCCCCGGCACCTCCCCG-CGGTCTTTCACCCCGCGTGGTTACGAAA

********* ******* ***************** **********

Homo sapiens GCGCGACCCCCTCCCCCCGGCGCTATAAAGCAGCGGGGCGGCCGCGGCGCGCTCGCCTCC

Mus musculus GCGCGACCCCCTCCCCCCGGAGCTATAAAG--GACCGACGGCCGC-------TCGGCTCC

Rattus novergicus GCGCGACCCCCTCCCCCCGGAGCTATAAAG--GTCGGGAAGCCGC-------TCGCCTCC

******************** ********* * * ***** *** ****

Homo sapiens CTCGCTCCACGCGCGCCCGGACTCGGCGGCCAGGCTTGCGCGCGGTTCCCCTCCCGGTGG

Mus musculus GTCGCTCCACGCGCGCGCGAACGCGGCGGCCAGGCTTGCACGCGG-----CTCCTGCTGG

Rattus novergicus GTCGCTTCACGCGCGCGCGAACGCGGCGGCCAGGCTTGCACGCGG-----CTTCTGCTGG

***** ********* ** ** **************** ***** ** * * ***

Homo sapiens TGAGTCGCGGC-CGGGGCCTCGGGGCCGGCGGCGGGATGGGCCGGGGTGGGGTGGGGTGG

Mus musculus TGAGCCGCCGCGCGCTCCCCCGGGGAC--CTGCAGGG-----CGGGGTGGGGCGGGAGGG

Rattus novergicus TGAGCGGTCGCGCGCTCCCCCCGGGAC--CTGCGGGG-----CGGGGTGGGGTGGGAGGG

**** * ** ** ** * *** * * ** ** ********** *** **

Homo sapiens GGTGAGGTGGGATACGGCGGCGGGGGTCGGCTGCCGG----GCACTGACGGAGGCGCGTC

Mus musculus GGCGACG--------GGCGGCCTCGGTC--CT-CCGGCCCCGCGTTTACCC-TGCGCCTG

Rattus novergicus GGCGACG--------GGTGGC-TCGGTC--CT-CCGGATCCGCGCTCACCC-GGCGCCTG

** ** * ** *** **** ** **** ** * ** **** *

Homo sapiens TCCCGCAGGGCGGATTCCTGGGCAAGATGAAGTGGGTGTGGGCGCTCTTGCTGTTGGCGG

Mus musculus TCCCGCAGGGCAGACTCCGGGGTGAGATGGAGTGGGTGTGGGCGCTCGTGCTGCTGGCGG

Rattus novergicus TCCTGCAGGGCAGACTCCGGTGTGAAATGGAGTGGGTGTGGGCGCTCGTGCTGCTGGCGG

*** ******* ** *** * * * *** ***************** ***** ******

Gen Ucp1

Homo sapiens ATAACAGGGTATTTCCCAGTGGTGGCTAATGAGAGA--ATTATGGGAAAGTA--------

Mus musculus ACGCCCTGACACGTCCTCCTGGAGACAGATAAGAAGTTACGACGGGAGGAGCAGATGGAG

Rattus novergicus ACGCCCTGACCTTTCCTGCTGGAGACAGATAAGAGGTCATGCTGGGAGGGTT--------

* * * *** *** * * ** *** * ****

Homo sapiens -TAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATG---ATTTTTATTTAATAGGAAGACATT

Mus musculus GCAAAGCGCTGTGATGCTTTTGTGGTTTGAGTGCACACATTTGTTCAGTG-------ATT

Rattus novergicus -CAGACCCCTGCT-CACAGCAGAGCACTGAAGGCACGAGTTCGTTCACTG-------ATC

* * * ** * ** * ** ** * * **

Homo sapiens TTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATG-TGTTCTA

Mus musculus CTGTGAA-------ATGAGTGAGCAAATGGTGACCGGGTGC-CCTGTAAATGGTGTTCTA

Rattus novergicus CTGTGAG-------CACACAGCGCACACAGCGAGCAGGTGC-CCCGTAAACGGTGTTCTA

**** * * ** * ** * **** ** ** * *******

Homo sapiens CATTTTCAAAAAGGAA--AGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGC

Mus musculus CATCTTAAGAGAAGAACACGGACACTAGG---TAAGTGAAGCTTGCTGTCACTCCTCTAC

Rattus novergicus CATCCTAAGAGAAGAACTAGGACACTGGGCGGCGAGTGAACCTTGCTGCCGCTCCTTTGC

*** * * * * *** *** * * * * ******* * ***** * *

Homo sapiens TACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGACCTATTCTTTACCTCTCTGCTTC

Mus musculus AGCGTCACAGAGGGTCAGTCACCCTTGACCACACTGAACTAGTCGTCACCTTTCCACTCT

Rattus novergicus GACGTCACAGTGGGTCAGTCACCCTTGATCACACTGCACCAGTCTTCACCTTTCCACGCT

***** * ******** ****** ** **** * * ** * **** ** *


Capítulo 3

139

Homo sapiens TTCTTTGTGCCAGAAGAGTAGAAATCTGACCCTTTGGGGATACCACCCTCTCCCCTACTG

Mus musculus TCCT----GCCAGAAGAGCAGAAATCAGACTCTCTGGGGATATCAGCCTCACCCCTACTG

Rattus novergicus TCCT----GCCAGA---GCATGAATCAGGCTCTCTGGGGATACCGGCCTCACCCCTACTG

* ** ****** * * **** * * ** ******** * **** *********

Homo sapiens CTCTCTCCAACCTGAGGCAAACTTTCTCCTACTTCCCAGAGCCTGTCAGAAGTGGTGAAG

Mus musculus CTCTCTCCATTATGAGGCAAACTTTCTTTCACTTCCCAGAGGCTCTGGGG-GCAGCAAGG

Ratus novergicus --------------AGGCAAACTTTCTCCCACTTCTCAGAGGCTCTGAGG-GCAGCAAGG

************* ***** ***** ** * * * * * *

Homo sapiens CCAGCCTGCTCCTTGGAATCCAGAACTACTTTCAGAATCTTGAACTTCTGTGACCTCTCA

Mus musculus TCAACCCTTTCCTCAGACTCTAGAACCACTCCCTG--CCTTGAGTT-----GACATCACG

Ratus novergicus TCAGCCCTTTCTTTGGAATCTAGAACCACTCCCTG--TCTTGAGCT-----GACATCACA

** ** ** * ** ** ***** *** * * ***** * *** ** *

Homo sapiens GGGTCCCC-TTGTGTGAAGTTTTTGACGTCAGCTTCTCCTGTGACCCTTAGAAGTCAC-T

Mus musculus GGGCCTCC-TTGAGCGAGAATTTCA-----------TTCTGCCAT------ATGCCACAT

Ratus novergicus GGGCCCCCCTTGAGTGAGGTTTTCA-----------TCTGGCCAC------ATGCCACGT

*** * ** *** * ** *** * * * * * *** *

Homo sapiens CTTGTGTCTAGCACATCCCAGGTGCTCAGTCACCATTGAACTAC-AGTCATACTATCT-C

Mus musculus TTTGGGCTCAGGAGTTCAGGAAAGCCT--TTGC---TGGGTAATAATTCTTTCTATTCAC

Ratus novergicus TCTGGGGTCAGCA-TTCATGAAAGCCT--TCGCCGCTAGGTGATGAGTCTTCCTGTTGGC

** * ** * ** ** * * * * * ** * ** * *

Homo sapiens CTGGCAAAGGCTCTTAACTGTCCATGTTAGCCTGATATTAATATCCTGGAAGCTTATACT

Mus musculus ATCACAGAAAT----GACTTGATGTGTGGAGCTGA-----GTAGCC--GAAG--------

Ratus novergicus ACCGCAGAGAC----GACACGGTGTGTTGAGCTGA-----GTGTCT--GAAG--------

** * ** *** **** * * ****

Homo sapiens GTCGTTCTTCCTTCCAGGTTTAAATAAGGCAGCCCCTTTATCCTGTCACAGGTCCTCTCT

Mus musculus ----------------GGTTCAG----GGTGGTC---------------GGGACCT----

Ratus novergicus ----------------AGTTCAG----GGTGGCT---------------GGAACCC----

*** * ** * * **

Homo sapiens CCCTACCTATCCTTACCTGTTTTGGATAACAACCTTTCTTATTTCTAATAGATTTATTTA

Mus musculus ----------------------TGGTGAGAAACA-------------ACAGA--------

Ratus novergicus ----------------------TGGTGAGGAACC-------------ACAGA--------

*** * *** * ***

Hom sapiens TTTCTCACATTTCCTTCCCTTATCATAGTTTTCCTCTCACTTTCTCCTCTAGTTTGTCAT

Mus musculus --------AGCTCCTAT-------CTGGTC--CCTCTCA-----------AGCATACCAT

Ratus novergicus --------GGTGCCTTC-------AAGGTG--CCTCTCA-----------AGCATGACAC

*** ** ******* ** * **

Homo sapiens ACTCTGGCTTTAAAACATGCAAACATGTGCCTTATGGGGAAAAAAAGACAATTTTAATTT

Mus musculus CCTC---------------------------------------AAGGGCA--TTTGA---

Ratus novergicus CCTC---------------------------------------AAGGACG--TTTGACTT

*** ** * * *** *

Homo sapiens ACCTTGCTTCTTCTTTACAAATGTATTGTGGCTTCTTCTTATAGTCCAAATCTAAAACTC

Mus musculus ---------TTTTTTTA------TGCCGTG------------------------------

Ratus novergicus -------TGTTTTTTTA------TGCAGTG------------------------------

** **** * ***

Homo sapiens TTTACCCACCCACTGCCTTGAACTCCTTCCTCGTTGTGAAAGTAGGATGGGGCAAAGAGA

Mus musculus ---GCCCA-----------GGGCTCC-------------GAGT-----------------

Ratus novergicus ---ACCCA-----------GGGCTCC-------------AAGT-----------------

**** * **** ***

Homo sapiens GAATGCATGCCCCTCCCAACTGCTCAAACAAGTAAAGGTGCTGTTACAGTTATCTTTTGC

Mus musculus --------GCCACTCCT-----CTTAGACCA-TA-----GCTGT----GGTTCCCAGGGC

Ratus novergicus --------GCCATTCCT-----CTTAGACCA-TA-----GCTGT----GTTTCCT-----

*** *** ** * ** * ** ***** * * *

Homo sapiens TACCTTAATACAATAATTATTTTATTATATCTCACAATTTTATGGATCAGGAAT----TT

Mus musculus T--CCGAGTGCCACTCCTCTTAGACCATAGCT-GTGGTTCCCAGGGCTCCGAGTGCCATT

Ratus novergicus -------------------------------T-ACGGTTT--------------------

* **

Tesis Doctoral


140

Homo sapiens AGACTGGGCTCAGCTAGGCGATTCTTCTGCTTTACTGACATCATAGGAGATCACTTGGTG

Mus musculus CCTCTAAGACCATAGCTTGGTTCCTCATGCTTTGTTCCTGTCTCCTT---TCA-------

Ratus novergicus -------------------GTTCCC--TGCCTCGTTC-------------TCA-------

* * * *** * * ***

Homo sapiens GTATTCAACTGTCAGGTAGGCTTATCTGGAGGGTCCA-AGATAGCTGTACTCTGGTGCCT

Mus musculus --ATCCGGCTGT-------GCTCATTC-------CCACAGAAAGTT-----------ACC

Ratus novergicus --ATCCCACTGT-------GCTCATTC-------CCACAGAAAGTT-----------CCT

** * **** *** ** *** *** ** * *

Homo sapiens GGTGCCTTGGTAAAGAGGGATGATGATGTGGGGCCTCTCCAGCATGAACAGC---CTCAG

Mus musculus AGTTCCTT--------------------------CACTACCCTACTAACCAC---CTCCG

Ratus novergicus ACTTCCTT--------------------------TCCCCCCACACCGACGACGACTTCCG

* **** * * * ** * ** *

Homo sapiens AGAAGTTTGCTTTCTTACATGCTGGCCCAGGGCTCCAAGAGCAAATGTTGCAGTGAGTAA

Mus musculus A------TACCT-------------CTCAG------------------------------

Ratus novergicus AG-----CACCT-------------CTCAG------------------------------

* * * * ***

Homo sapiens AGCAGAAGATACAAGGACTTTTATAATCTGGTCTCAGAAGCCACATGGCATCAGTTCTGT

Mus musculus -----------------CTTTGAT-------TCTCTGATG-CAAGTAGCATGACGCTT--

Ratus novergicus -----------------TTTCCAT-------TCTCTG----CATGTAGCATGACTTTC--

** ** **** * ** * **** *

Homo sapiens ATTATTCTATTGGTCAAAACATTCATAAGCCTGCCAGATGCAAGGGGAAGGCATATGTAC

Mus musculus -----CCTATGGG--------------ATCATGATGCAAGCAG-----------------

Ratus novergicus -----TCTATGGG--------------AGC------------------------------

**** ** * *

Homo sapiens CCTCATCTTTTGATGGGAGGAATGTGATGGATTTGCAATTATGTTTTAAAACTACTACAG

Mus musculus CATGATGTTTTAATGAAAACAT-------------CAATGCCATTTT----CTCCTA---

Ratus novergicus -------TTCTCAC-AAAGCAC-------------CAATGACGTTTT----CTCCTA---

** * * * * **** **** ** ***

Homo sapiens ACAGAACCACTGAGAAAGATTCATGGGTAGCTTTGGGGTGAGGACTGGGAATTAACCTGT

Mus musculus --ATAATC-CTAAAACGGA-----------------------------------------

Ratus novergicus --ACAATC-CTAAGACAGA-----------------------------------------

* ** * ** * * **

Homo sapiens TGATAGCAGAGGTTCACTAGAGTCAACAAGGAATAAGGTCTCCTCTTGTACACTTTAGTC

Mus musculus ---------AAGTT-------------------------------------------GCC

Ratus novergicus ---------AAGTT-------------------------------------------GTC

* *** * *

Homo sapiens ATACTATACCAACATTCTTAACCACTGCTTAGCCATCAGCCTCACAACATAACAACTCCA

Mus musculus ATCTTATA--AAGAGTAT------TTACTT-GCCAACTGCTTTGTGACA-ATCAA-----

Ratus novergicus GTCTTATG--AAGAGTCTAAAA-GCCACCT-GCCAACGGCTTTGGGACA-ATTGA-----

* *** ** * * * * * **** * ** * *** * *

Homo sapiens TCATAGTTGTACTCCCTAAGATCACCAACAATGTTAGAGTCAAATCCGGTAGGTTTTTCT

Mus musculus --GTGGAAACA-TTGCCAAGACTGC-GGCCATCTTC---TCAAGT---GTAGAGTCATTT

Ratus novergicus --GTGGCAACA-TCGCCAAGACCGC-GACCATCCTC---TCGAAT---GCAGAGTCATCT

* * * * * **** * * ** * ** * * * ** * * *

Homo sapiens TTGTTTTTGTCCTCCTGACATTTTTTCTAAACTTGACACTGGTCAGACCCAATCTTTCTT

Mus musculus T-------------CTAATAATCTCT---GACTCCATAGT------AACC---CTTTCTT

Ratus novergicus T-------------CTAATAATGTTT---GACTCCATAGT------ACCC---CTTTCTT

* ** * * * * * *** * * * * ** *******

Homo sapiens TAATCATATTCTTAAATACCAGTTCTATCACTGGATATGTTACTGTTTCTTGTTCTCACT

Mus musculus AAGCTGTATT-------ATCTG-------GTTAGATGTGTCA----TTCATGT-------

Ratus novergicus AAGCTGTGTT-------AGCTG-------GCGAGATGAGTCG----TTCGTGT-------

* * ** * * * *** ** *** ***

Homo sapiens CTACCTTTGACAAAGCCATTCTTTCCAGACTATAACTCTGGGTCTGGGTCCCCCTATGGT

Mus musculus -----------GAGCACA--GTTTACGATCTA-----CCAAGCCC---------TGCA--

Ratus novergicus -----------AAGACCA--CTTTACAGTCTG-----CCAAGCCCAAG-CCCCTTACA--

* ** *** * ** * * * *


Capítulo 3

141

Homo sapiens TTGGCCCTTGAATTCTTTTCCTAGTCCTATTTGACTAGCCCCATTTTCCCGTGAAAAGCA

Mus musculus -CAACATAT-AA--------------------GATGAACTCA-----CATGCAGAAAGGA

Ratus novergicus -CGGGGTAAGAA--------------------GATGAACCCA-----CACGCAGAAAGGG

** ** * * * * * ****

Homo sapiens TGCCCCTTTCATTGCATCCATATCATGACTAC-CAAATACCTCCTCTATTTCTTCCTCTT

Mus musculus TGCTC--------ACAGACTGCCGTTTATTATACTGTTGTTGCTGCTG-------CTGTT

Ratus novergicus TGCTC--------ACGGCC--------ATTACACAGTGG---CCGCTG-------CTGTT

*** * * * * ** * * ** ** **

Homo sapiens TTAGCATGTTAAATGCAGCTTCCTAAGCTCTCTATCTGGATATCAACAGTATTCTCTCCA

Mus musculus TGGG------------GGTTT------------------ATTCTAG--------CCTC--

Ratus novergicus CTGG------------AGTTT------------------ATTTGAGACAGGGTTCCTCTG

* * ** ** * ***

Homo sapiens AATAATTCTAAGACTTTAAAAATTGGTTTAATCTTCTTACCCCTAAAATCACCCCCCTTA

Mus musculus GGCAGCCCT--GGCTGT------------------------CCTAGAA--------CTCA

Ratus novergicus AGTAGCCCT--GGCTGT------------------------CCTAGAA--------CTCA

* ** * ** * **** ** ** *

Homo sapiens CCAACTGCCTCATGACAATCATTGGTACTGTCACTGAGCTTGCAACCCATGTTCTTAAAC

Mus musculus CT--CTG---------------TAG-------ACCAGGCTGGC--CTCAAACTCACAAAG

Ratus novergicus CT--CTG---------------TAG-------ACCAGGCTGGC--CTCA------CAAAG

* *** * * ** *** ** * ** ***

Homo sapiens ATAGA--GTAATCTTTGACTCCACATCTAATCATTCATAAAGCTGTATTGTCTATCAAAT

Mus musculus ACCCCTTGCTGCTTTGGCCTCTGCCTC--------CCTGGTGCTG-----------GGAT

Ratus novergicus ACCC------ACCT--GCCTCTGCCTC--------CTGAGTGCTG-----------GGAT

* * * *** * ** * **** **

Homo sapiens TAAATCTGACATTTATGTGAGAGCACTTCATAGTCTGTAAAGCACTACACAGGTGATAAC

Mus musculus TAAAGGTG-----TGTGT------------------------CACCAC-----------C

Ratus novergicus TATAGGTG-----TGTGT------------------------CACCAC-----------C

** * ** * *** *** ** *

Homo_sapiens ATGAAGCTACACTCATAATGGATTTGCAGGCTCTGCTTCTCATTTGGCTTCTACAGCCTC

Mus_musculus ACTAGGCTGCT----TA------TTACA-------CTTTTCAT-------CCATAGGTC-

Ratus_novergicus ACCTGGCTGTG----TA------TTACA-------CTGTTCAT-------CCATAGCT--

* *** ** ** ** ** **** * * **

Homo sapiens ATCCCTCACCAACTTCTTGCCCTACCTCTCTCTTTCTTCCCCATC----ACCCAATTTCC

Mus musculus ------TTGCAGCTTCCTGCCCC-TGCCCCTCTTTTCTCCCCGCCCCCCATTCAGTTTCC

Ratus novergicus ------TAGCAGCTTCCTGCCCC-TATCCCTCTTT-CTCCCCATC----ACTCAGTTTCC

** **** ***** * ****** ***** * * ** *****

Homo sapiens CAGTCAGTCAGGCCAACAGAATGCATTCTATATACGCGACTTGCTTTCCCCAACATCTTT

Mus musculus CAGCCC-CC-----------AGGCATTCT-------------GCTCCCCTCCATATCATT

Ratus novergicus CAGCCA-CTGGGCCAACAAAAGGCATTCT-------------GCTTGCCTC--------T

*** * * ******* *** ** * *

Homo sapiens GCCTGTATGCATGCCACTTATTTGCCTCAGTTGATCTTTATTTCAACAAGTGTTTGCAGA

Mus musculus GTCTTCACACACACCACT-GACTG---------CTCATCACTGC------TGTT------

Ratus novergicus GTCTTCACACATGTCACT-GCCCGTCTCTGTTACTCATCACTGC------GGTT------

* ** * ** **** * ** * * * * ***

Homo sapiens GGAGAAACCTCGCTGGCTCCTTCTCCTTTCTATTTTTTTTCAGAGGCTACCCGTCAGGTC

Mus musculus ------------CTGGCTC------------------------AAGTT-----CCAGGTG

Ratus novergicus ------------CTGGGTC------------------------AAGCT-----CCAGGTG

**** ** * * * *****

Homo sapiens AACAT---------------TGCCTTTTTCAGGGAAGCTCTGCAAGCCTGACCTCCCTTG

Mus musculus TGTAT---------------------------------TTTAT-----TG--------TG

Ratus novergicus TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG--------TG

* * * ** **

Homo sapiens GAAGTGCCTTAGGACTGGCTTCTTGCACAGTACACAACCTT---TACTTATAGAGGGT-T

Mus musculus GAAGC-TCCCAGGACTAGGTTCTTGCTTAGTGTGCACGCTTGCCCCTTTAAATGTGGTGT

Ratus novergicus TGTGT-TATTGCCTCAGGGTTCTTGCTTATTGTGCACACTT-TCCCTTTACATGTAGT--

* * * ******* * * ** *** *** * **

Tesis Doctoral


142

Homo sapiens TGGAGATTATTCTTTATTCATGTCTTATTTCTCCTGCTCCTGGAGGAGATGACTCTGACT

Mus musculus CCAGGGGTGTT--------GTCTCTTACATGCCCCAATCCAGG---AGATGAGTCCCACC

Ratus novergicus --AGGGGTGTT--------GTGTCTTACATGCTGTACTCCTG----AGAGGAGTCTGACT

* * ** * ***** * *** * *** ** ** **

Homo sapiens TCCACTGACTCTTTTGGGGGGCTTAAGTCAGGGTTGAGTACCAGAGGCCCTAAATAGCTG

Mus musculus T-CCTTCACTCTCCTGGG-------A-CCACG-CTGAGTAGCAGAA--CCTGGCCAACCA

Ratus novergicus TGCCTTCACTCTCCCGGG-------AACCATG-CTGCAGAGCAGAA--CCTAGACACTGA

* * * ***** *** * ** * ** * **** *** *

Homo sapiens GACGTGGATTCTGGTAATATCAAATCCATCTTTGGCTTAACTGAGAGGTTCTGAAAGCTG

Mus musculus GG-GAGGATACAGAGAACAGG-----CATCG-----------------------------

Ratus novergicus GG-GAGAATGTGGATAATGTG-----CCTCGCTGGTGTCTTTGGGGGATCCTG-------

* * * ** * ** * **

Homo sapiens GGACCTGACCTTGTCCATTTCCCTCTTTCTCCA--GTTTCCTATTATTTCCCACTGTTTT

Mus musculus -GCTCCAGCC------TGCTCTCTTTCTCACCA---TTTCTTA------CGTAGTATTTT

Ratus novergicus -GACCCAGCC------AGCTCTCTTTCTCATCACAGTTTCTTA------CCGAGTATTTT

* * ** ** ** * ** ** **** ** * * * ****

Homo sapiens TTTTAAAAGTTTTTTGTTTTCTTAAGTTTTCACAAGAATAAACATTGAAAATAAAATTTG

Mus musculus TTTT-AAAGCTTTT------------------CAAATACAAATCTT------------TG

Ratus novergicus TA---AAAGCTTTT------------------CAAATGTAAATCTT------------TG

* **** **** *** *** ** **

Homo sapiens CACAAAGATCGAACTAGGAAAGGC---CACACAACCAACACATA----------TTACAT

Mus musculus CTCAAAGATAGAAGTAAGAAACACCCCCCCCCCACACACACACACACCAACAAACCACCT

Ratus novergicus CTCAAAGACAGAAGGAAGAAAAACTTTCCCTTACCA-ATACAC-----------CCACCT

* ****** *** * **** * * * * * *** ** *

Homo sapiens CATTATAGGTAAGTTAGCAG-GGAGATTTCAGACCTGGGCTAGCTCTGGAACCACATTTT

Mus musculus TACAATGTCTGAACTGGCACTAGGGATAACAAGAGT---TCAAATCTGGGACTATATTTG

Ratus novergicus TGCAATGTCTGAACTGGCACTAGGGGTAACAGGATT---TCAA-TCTGGGACTATATTTG

** * * * *** * * * ** * * ***** ** * ****

Homo sapiens ACACTGTTGAAAATAAAAGCTGGAGTACAGATGACTTTCCCAGGTTCACAGAGTTGGTAA

Mus musculus ACACAATCACAAACCAAAGCTAGAG-------GACTTTCTCAGGGTCACGAAGCTGGTCA

Ratus novergicus GCACAGTCACAAACCAAAGCTGGAG-------GACTTTCTCGGGGTCACGAAGCTGGTCA

*** * *** ****** *** ******* * ** **** ** **** *

Homo sapiens GCTGGAG-AGCTGCACCTGGAGCCAAGCAACCTGCCCTGTCCTTTCCACTGCACCCTCTA

Mus musculus GATGGCTTGGTTGCATCTGCAGCCAACCAACC--CTCTGTCCTT-CCAGGGCTCCTGCTA

Ratus novergicus GATGGCTTAGTTGTGTCTGCAGCCAAGC------CTCTGCCCTT-CTAGGGCTCCTGCTA

* *** * ** *** ****** * * *** **** * * ** ** ***

Homo sapiens AGAAATCTAATTAGAAGGAACAGGTGGTATCTCATTTTGTACGGTGCTTTAGCAATGTAC

Mus musculus AGAACT---ATTCAAAGGAGCAAGGGCT--------------------------------

Ratus novergicus AGAGCT---ATCCAAAGAAGCAAAGGCTAGCCTTCCCTGCAGAGATCCACAA--------

*** * ** *** * ** * *

Homo sapiens TATTTGCTTTCTAG-TGTGTCTATTGTCTCGTTTGACATCTTCTCTCAAAAAGTGATGAA

Mus musculus ----GGCTTA-----TGAG--------CTTAGTTGATCTCGCCCAACTAAAAGTGACCAC

Ratus novergicus ----GGCTTGCTAGCTGAG--------CTCTATTGACATCTCCTTAATAAAAGTGACCAC

**** ** * ** **** ** * ******** *

Homo sapiens ACGAAACGCTCTTTTT----GACAAGTTCAGAGTGCTCTTGGTTCCTGTGTGGGATTCTT

Mus musculus ACGATGCACTCACTTTCTCGAAAAAGTTTAGGGCGTTATTAGTTTTTGCATGGATTCCCT

Ratus novergicus ACAAAGCACTCACTTTCTGGGGAAAGTTTAGAGCGTTATTAGTTTTTGCACGGATTTCCT

** * * *** *** ***** ** * * * ** *** ** ** * * *

Homo sapiens CC---------AAGTCT-------------------------GAATTTGGTAGTGGGAA-

Mus musculus CC---CCTCCCACATCCTCATCCCCACCCCATCCAGTCACCCAAATCTGAAGGTGACATT

Ratus novergicus CCCCCCCTCCCACACCCCCACCCGCGCCCCATCGG--------AATCTGAAGGTGACATT

** * * *** ** *** *

Homo sapiens -GAGAAGGAATCCGGAGGAAGGAGGATGAGAAGTTTAAAGGAGAGGAAAGGGAAGCAGAG

Mus musculus TGAAAAGGAATGTAAAGAAAGGGACATTCAGAATTGAAAGGAGAAGAATCAGTAG----C

Ratus novergicus TGGAAAGGAATGTAAAGAAAGGCTCGTTCAGAACTGAAAGGGGAAGAAAGGGTAG----G

* ******* ** **** * * * ***** ** *** * **


Capítulo 3

143

Homo sapiens AAGGCCGCAAGGTGCCTGCAAGATGTCTGGGGAGTTGGAGGAATGGAAGAGTGCCCCGCT

Mus musculus CAAGT----AGATGCATG--GGA-----AGGGGGCCCG-GGACTGGGA--------CGTT

Ratus novergicus CAGGC----AGATGCCAGCCAGG-----GAAGGGCCTG-GGACTGGGA--------CGTT

* * ** *** * * * * * *** *** * ** *

Homo sapiens CTTCCTTCTGGGAGAGCTCCAGCTAGGCAGAACCTTTCACCAAGG-CTCTGAT-------

Mus musculus CATCCTAC---AGCTATTCTAGCT--GTGGAACTTTTCAGCAAAATCTCGGAGGAGATCA

Ratus novergicus CATCCTAC---AAGAA----AGCT--GTGGAACTTTTCAGCAACATCTCAGAA---ATCA

* **** * **** * **** ***** *** *** **

Homo sapiens -ATCGTGCTGGTTTCCGAAAGCCCCAGCCGAAGGTGTGCAGCC-----------------

Mus musculus GATCGCGCTTATT--CAAGGGAACCAGCCCCTGCTCTGCGCCCTGGTCCAAGGCTGTT--

Ratus novergicus GATCGCACTTATT--CAAAGGAGCCAGGCCCTGCTCTGCGCCCTGGTG-GAGGCTCCTCA

**** ** ** * * * **** * * * *** **

Homo sapiens ---AAAGGGTGACAGAAGGTGAGGCACG-TGCGGGGGCGCGGGTGCTGACCGCCGCGGTG

Mus musculus ---GAAGAGTGACAAAAGGCAC--CACGCTGCGGGGACGCGGGTG--AAGCCCCTCTGTG

Ratus novergicus TGTGAAGAGTGACAAAAGGCAC--CATGTTGTGGATACG-GGGCG--AAGCCCCTCCGTG

*** ****** **** ** * ** ** ** *** * * * ** * ***

Homo sapiens CGCCCTCCCTCCGACGTGCGGTGTGCGGGGCGCAGACAACCAGCGGCCGGCCCAGGGCTT

Mus musculus TGTCCTCT-----GGGCATAAT---CAGG--------AACTGGTG-CCAAATCAGAGGTG

Ratus novergicus TGTCCTCC-----AGGCATCAT---CAGG--------AACTAGTG-CCAAAGCAGAGGTG

* **** * * * ** *** * * ** *** * *

Homo sapiens TCGGGGAGCGAAGCAGGGCTCCCGAGGCACCGAGCGAGAATGGGAATGGGAGGGACCCGG

Mus musculus ATGTG--GC----CAGGGCTTTGGGAGTGACGCGCGGC--------TGGGAGG---CTTG

Ratus novergicus CTG----GC----CAGGGCTTTGGGAGTGACGCGCGTC--------TGGGAGG---CTTG

* ** ******* * * ** *** ******* * *

Homo sapiens TGCTCCC-GGACACGCCCCCGGCAGGTCCCACGCCCGGGTCTTCTGAGACCTCGCGCGGC

Mus musculus CGCACCCAAGGCACGCCCCTGCCAAGTCCCACTAGCAGCTCTTTGGAGACCTGGGCCGGC

Ratus novergicus TGCGCCCAGGGCACGCCCCTGCCGATTCCCACTAGCAGGTCTTGGGGGACCTGGGCCGGC

** *** * ******** * * ****** * * **** * ***** * ****

Homo sapiens CCAGCC-----------------CGGGAGCGGCCCAGCTATATAAGTCCCAGCGGAAGAC

Mus musculus TCAGCCACTTCCCCCAGTCCCTCCTCCGGCAAG-GGGCTATATAGATCTCCC----AGGT

Ratus novergicus TCTGCC-------------CCTCCTCCAGCAATCGGGCTATAAAGCTCTTCC----AAGT

* *** * ** ****** * ** *

Homo sapiens CGGAACGCAGAGGGTCCTGCTGGCGCGAGGGTGGGTAGGAGGG--------------GAC

Mus musculus CAGGGCGCAGAAG----TGCCGG-GCAATC-TGGGCTTAACGGGTCCTCCCTGCCCGAGC

Ratus novergicus CAGGGCGCAGAAG----TGCCGG-GCGATC-CGGGCTTAAAG---------------AGC

* * ****** * *** ** ** * *** * * *

Homo sapiens GCGGGGACTCGGCCCCCAACACCGCGCTCCGTCTGCAGCCGCCGCCTCTGCACCGCCG—

Mus musculus AAGAGGAAGGGACGCTCACCTTTGAGCTGC-TCCACAGCG-CCGCCTCTGCACTGGCACT

Ratus novergicus GAGAGGAAGGGACGCTCACCTTTGAGCTCC-TCCACAAA---------------------

* *** * * * ** * * *** * ** **

Homo sapiens ---CTGCCC-GGCGGTCGGTTCAAAAAACAGAAATC--GGGTTTGCTGCCCGGCGGACAG

Mus musculus ACCTAGCCCAGGTGGCT-CTGCAGGAGTCCGAAGTCGCGGGTTTCGTGCCC-----GCA-

Ratus novergicus ---TAGCCCTGGTGGCTGCCACAGAAGTTCGAAGTTGAGAGTTCGGTACCC-----ACA-

**** ** ** ** * *** * * *** * *** **

Homo sapiens GCGTGAAGAGCAAGGGAAAGGAACTTCCTCCACCTTCGGGGCTGGAGCCCTTTTCCTCT-

Mus musculus ----------TCAGGCAACAGTGCCACTGTTGTCTTCAGGGCTG-AGTCCTTTTGTTCTT

Ratus novergicus ----------TCAGGCAACAGTGCCACTGTTGTCTTCAGGGCTG-ATTCCTTTTGGTCT-

*** ** * * * **** ****** * ****** ***

Homo sapiens --------GCATCTCCAGTCTCTGAGTGAAGATGGGGGGCCTGACAGCCTCGGACGTACA

Mus musculus GCACTCACGCCTCTCTGCCCTCCAAGCCAGGATGGTGAACCCGACAACTTCCGAAGTGCA

Ratus novergicus --------------CTGCCCTCCGAGCCAAGATGGTGAGTTCGACAACTTCCGAAGTGCA

* *** ** * ***** * **** * ** ** ** **

Tesis Doctoral


144

Anexo 3B C

orr

elac

iones

entr

e lo

s dif

eren

tes

par

ámet

ros

anal

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os.

Se

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el c

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icie

nte

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elac

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neg

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azu

l; l

as

corr

elac

iones

sig

nif

icat

ivas

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(ρ≥

0,5

00

) se

res

alta

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n c

olo

r am

aril

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l m

ás o

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ro y

las

más

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iles

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0,5

00)

con

un c

olo

r am

aril

lo o

azu

l m

ás c

laro

. ** i

ndic

a que

la c

orr

elac

ión e

s si

gnif

icat

iva

en e

l niv

el 0

,01 (

bil

ater

al)

y *

indic

a que

la c

orr

elac

ión

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ignif

icat

iva

en e

l niv

el 0

,05 (

bil

ater

al).

Tab

la 1

. C

orr

elac

ion

es e

ntr

e p

arám

etro

s m

orf

om

étri

cos,

par

ámet

ros

circ

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nte

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de

reti

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noid

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AB

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e lo

s gen

es e

studia

dos.

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Bi

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saP

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Glu

cosa

Reti

no

l to

tal

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nil é

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sR

eti

no

lβ-C

aro

teno

Reti

no

lβ-C

aro

teno

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l (g

)co

rpo

ral (g

/10

0 g

)T

AB

i (m

g)

(md/d

L)

(nm

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)(n

mo

l/g

)(n

mo

l/g

)(n

mo

l/g

)(μ

M)

(μM

)

0,1

41

-0,0

10

0,2

53

0,2

36

-0,2

30

-0,1

82

-0,2

17

0,1

26

0,0

90

0,1

41

-0,0

65

-0,1

47

-0,0

95

0,2

07

0,1

95

0,1

39

-0,0

38

0,1

78

-0,0

41

0,1

94

-0,2

37

0,0

69

0,0

63

0,0

99

0,0

92

0,1

77

0,0

85

0,0

01

-0,1

24

0,0

13

0,1

41

0,0

67

-0,0

25

0,1

21

-0,0

39

-0,0

73

-0,0

55

-0,1

08

0,2

91*

-0,1

34

--

--

--

--

--

0,2

95*

0,6

64**

-0,0

45

-0,1

06

-0,0

99

0,0

80

0,0

69

0,3

99**

0,1

13

0,5

71**

0,0

46

-0,0

41

0,0

85

0,1

59

0,0

27

0,3

11*

0,0

70

-0,0

49

-0,1

02

-0,0

81

0,0

34

0,1

99

0,3

38*

0,2

45

-0,0

41

-0,0

50

-0,1

35

-0,1

63

0,0

80

-0,1

35

0,8

56**

0,6

71**

-0,3

09*

-0,0

42

-0,3

29*

0,8

44**

-0,1

97

0,0

15

-0,2

18

-0,2

87

0,1

59

-0,3

23*

-0,1

17

,976**

-0,0

81

β-C

aro

teno

en h

íga

do

(nm

ol/g

)

Reti

no

l en s

uero

(µ

M)

β-C

aro

teno

en s

uero

(µ

M)

Peso

TA

Bi (m

g)

Glu

cosa

suero

(m

g/d

L)

Reti

no

l to

tal en T

AB

i (n

mo

l/g

)

Reti

nil é

stere

s en h

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do

(nm

ol/g

)

Reti

no

l en h

íga

do

(nm

ol/g

)

AR

Nm

Rbp4

(%

)

AR

Nm

Ucp

1 (

%)

Peso

Co

rpo

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)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/10

0g

)

AR

Nm

Zfp

42

3 (

%)

AR

Nm

Ppa

rg (

%)

AR

Nm

Pcn

a (

%)

Híg

ado

Suero


Capítulo 3

145

T

ab

la 2

. C

orr

elac

iones

entr

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% d

e m

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n d

e lo

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y

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iones

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la

regió

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dia

da

del

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(B

).

A.

CpG

1 (

-22

3)

CpG

2 (

-20

7)

CpG

3 (

+1

2)

CpG

4 (

+1

28)

pro

medio

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*-0

,248

-0,3

71

**

-0,2

49

-0,3

97

**

-0,0

54

0,0

19

-0,0

51

-0,1

27

-0,0

81

0,0

93

0,0

00

0,0

25

-0,1

77

-0,0

52

0,1

41

0,0

47

-0,0

28

-0,1

57

-0,0

22

-0,1

78

-0,0

50

0,0

10

-0,0

18

-0,1

71

0,2

52

0,1

32

-0,1

13

0,2

24

0,3

23*

0,2

46

0,1

17

-0,1

89

0,2

61

0,3

23*

0,1

98

-0,0

22

-0,2

29

0,0

61

0,1

30

-0,0

08

0,2

55

0,1

57

0,4

31**

0,2

33

-0,0

61

-0,0

56

-0,1

89

-0,1

66

-0,1

82

-0,0

12

0,2

59

0,1

66

0,4

59**

0,2

41

B.

CpG

1 (

-22

3)

CpG

2 (

-20

7)

CpG

3 (

+1

2)

CpG

4 (

+1

28)

pro

medio

CpG

1 (

-22

3)

0,5

30**

0,1

48

0,2

55

0,7

66**

CpG

2 (

-20

7)

0,0

86

0,1

71

0,7

76**

0,3

05*

0,1

99

0,4

75**

Meti

laci

ón (

%)

Reti

no

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(µ

M)

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teno

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uero

(µ

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arg

2

Pp

arg

2

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laci

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%)

CpG

3 (

+1

2)

CpG

4 (

+1

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Nm

Ppa

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(%

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Peso

Co

rpo

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)

Gra

sa c

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ora

l (g

/10

0g

)

Peso

TA

Bi (m

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Glu

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suero

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L)

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do

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)

β-C

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Tab

la 3

. C

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ion

es e

ntr

e el

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ació

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e lo

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s C

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42

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es

(A).

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nd

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rom

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regió

n e

stu

dia

da

del

gen

Zfp

42

3 (

B).

A

.

CpG

1 (

-76

9)

CpG

2 (

-46

4)

CpG

3 (

-42

3)

pro

medio

-0,0

44

-0,0

56

0,0

08

0,1

74

-0,0

44

0,1

61

-0,1

54

0,0

20

0,0

45

0,1

71

0,0

12

0,0

21

-0,2

35

0,2

60

-0,1

89

-0,0

67

0,0

49

-0,1

12

0,2

33

0,1

55

0,1

18

0,0

89

-0,1

78

-0,0

80

0,0

62

0,0

67

-0,2

22

-0,1

14

0,0

82

0,1

38

-0,2

03

-0,0

80

-0,5

20

**

-0,3

01

*-0

,389

**

-0,3

93

**

0,1

48

0,0

53

-0,0

36

0,1

77

-0,4

58

**

-0,2

25

-0,3

55

**

-0,3

77

**

B.

CpG

1 (

-76

9)

CpG

2 (

-46

4)

CpG

3 (

-42

3)

pro

medio

CpG

1 (

-76

9)

0,2

68*

0,4

10**

0,5

19**

CpG

2 (

-46

4)

0,2

22

0,5

65**

CpG

3 (

-42

3)

0,6

99**

β-C

aro

teno

en s

uero

(µ

M)

Zfp

42

3

Meti

laci

ón (

%)

Glu

cosa

suero

(m

g/d

L)

Reti

no

l to

tal en T

AB

i (n

mo

l/g

)

Reti

nil é

stere

s en h

íga

do

(nm

ol/g

)

Reti

no

l en h

íga

do

(nm

ol/g

)

β-C

aro

teno

en h

íga

do

(nm

ol/g

)

Reti

no

l en s

uero

(µ

M)

Peso

TA

Bi (m

g)

Zfp

42

3

Meti

laci

ón (

%)

AR

Nm

Zfp

42

3 (

%)

Peso

Co

rpo

ral (g

)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/10

0g

)

Tesis Doctoral


146

A.

CpG

1 (

-137)

CpG

2 (

-129)

CpG

3 (

-118)

CpG

4 (

-116)

CpG

5 (

-103)

CpG

6 (

-101)

CpG

7 (

-99)

CpG

8 (

-87)

CpG

9 (

-85)

CpG

10 (

-75)

CpG

11 (

-69)

CpG

12 (

-65)

CpG

13 (

-48)

CpG

14 (

-30)

CpG

15 (

-16)

CpG

16 (

-9)

CpG

17 (

+14)

pro

medio

-0,0

18

0,1

28

0,0

84

0,1

14

0,1

37

0,0

59

-0,0

54

-0,0

33

0,1

92

0,0

92

0,0

33

0,0

58

-0,1

52

-0,0

86

0,1

27

0,0

87

-0,0

52

-0,0

73

0,0

32

0,0

85

0,1

21

0,0

13

0,0

75

0,2

26

0,0

73

0,1

59

0,1

63

0,2

17

-0,0

12

-0,1

91

0,3

59**

-0,1

88

0,0

46

-0,1

91

-0,0

83

0,0

85

-0,1

04

-0,0

11

0,0

45

-0,0

07

0,0

57

0,0

29

-0,1

12

0,0

15

0,0

10

-0,0

10

-0,2

13

-0,2

39

0,0

19

-0,2

42

-0,0

39

-0,1

57

-0,1

69

0,0

39

0,0

72

0,0

78

0,1

11

0,0

46

0,1

34

0,1

65

0,2

10

0,2

54

0,1

68

0,1

87

-0,1

39

-0,1

23

0,2

51

-0,0

99

0,1

61

-0,0

77

-0,0

51

0,2

13

-0,1

87

-0,1

28

0,1

37

-0,0

04

0,0

43

0,0

08

-0,1

98

-0,1

66

-0,1

32

-0,2

09

-0,2

90*

-0,2

31

-0,0

65

-0,2

37

-0,0

36

-0,1

87

-0,2

54

-0,0

39

-0,2

68*

-0,2

0-0

,445**

-0,1

49

-0,3

19*

-0,3

11*

-0,2

80*

-0,3

26*

-0,3

18*

-0,1

40

-0,3

23*

-0,3

12*

-0,1

94

-0,3

30*

-0,4

44**

-0,1

54

-0,1

62

-0,3

93**

-0,3

37*

-0,1

9-0

,330*

-0,1

05

-0,1

46

-0,2

15

-0,2

37

-0,2

86*

-0,1

33

-0,1

41

-0,1

87

-0,2

74*

-0,2

51

-0,3

28*

-0,3

85**

-0,1

93

-0,1

78

-0,3

54**

-0,3

02*

-0,1

8-0

,249

-0,1

08

-0,1

26

-0,1

96

-0,1

20

-0,2

16

-0,0

79

-0,1

17

-0,2

04

-0,1

88

-0,2

60

-0,2

86*

-0,3

19*

-0,2

07

-0,1

97

-0,2

73*

0,5

39**

0,3

76**

0,2

84*

0,1

52

0,3

34*

0,3

32*

0,3

43**

0,4

49**

0,3

59**

0,4

62**

0,2

84*

0,3

25*

0,3

67**

0,4

01**

0,3

26*

0,3

72**

0,3

61**

0,4

49**

-0,1

53

-0,2

10

-0,1

11

-0,1

68

-0,0

56

-0,0

53

-0,1

26

-0,1

40

-0,1

35

-0,1

58

-0,2

53

-0,3

00*

0,0

20

-0,2

37

-0,0

79

-0,2

59

-0,1

39

-0,2

13

0,5

09**

0,3

71**

0,2

66*

0,1

11

0,3

15*

0,3

05*

0,3

01*

0,4

23**

0,3

39*

0,4

25**

0,2

58

0,3

06*

0,3

40*

0,3

81**

0,3

22*

0,3

74**

0,3

59**

0,4

25**

B.

CpG

1 (

-137)

CpG

2 (

-129)

CpG

3 (

-118)

CpG

4 (

-116)

CpG

5 (

-103)

CpG

6 (

-101)

CpG

7 (

-99)

CpG

8 (

-87)

CpG

9 (

-85)

CpG

10 (

-75)

CpG

11 (

-69)

CpG

12 (

-65)

CpG

13 (

-48)

CpG

14 (

-30)

CpG

15 (

-16)

CpG

16 (

-9)

CpG

17 (

+14)

pro

medio

CpG

1 (

-137)

0,5

70**

0,2

40

0,2

27

0,1

98

0,2

54

0,3

48**

0,5

13**

0,2

31

0,5

98**

0,2

58

0,4

71**

0,3

87**

0,5

52**

0,4

03**

0,6

11**

0,4

95**

0,5

62**

CpG

2 (

-129)

0,4

30**

0,3

85**

0,4

08**

0,4

72**

0,3

78**

0,5

03**

0,4

17**

0,4

90**

0,2

50,3

00*

0,3

01*

0,1

75

0,4

64**

0,5

14**

0,4

80**

0,3

14*

CpG

3 (

-118)

0,7

25**

0,7

47**

0,8

18**

0,5

46**

0,6

03**

0,7

41**

0,3

45**

0,4

74**

0,1

93

0,1

88

0,3

09*

0,6

28**

0,3

43**

0,4

26**

0,5

69**

CpG

4 (

-116)

0,7

02**

0,6

94**

0,4

07**

0,5

03**

0,5

97**

0,3

30*

0,3

14*

0,1

15

0,0

24

0,2

19

0,5

09**

0,3

78**

0,5

03**

0,3

96**

CpG

5 (

-103)

0,8

69**

0,5

92**

0,5

35**

0,6

82**

0,3

94**

0,5

08**

0,1

99

0,1

28

0,2

52

0,5

62**

0,2

75*

0,4

51**

0,3

94**

CpG

6 (

-101)

0,6

30**

0,6

07**

0,7

24**

0,4

66**

0,5

19**

0,1

37

0,2

27

0,2

54

0,4

92**

0,3

10*

0,4

03**

0,4

18**

CpG

7 (

-99)

0,6

41**

0,6

19**

0,5

66**

0,5

40**

0,3

21*

0,3

99**

0,3

38*

0,5

21**

0,4

11**

0,5

11**

0,5

40**

CpG

8 (

-87)

0,5

80**

0,6

46**

0,3

97**

0,3

57**

0,2

49

0,3

52**

0,5

68**

0,5

36**

0,5

48**

0,5

81**

CpG

9 (

-85)

0,4

36**

0,6

08**

0,3

26*

0,1

95

0,2

49

0,5

98**

0,3

70**

0,4

48**

0,4

28**

CpG

10 (

-75)

0,3

91**

0,3

73**

0,5

46**

0,3

35*

0,3

67**

0,5

29**

0,4

93**

0,5

70**

CpG

11 (

-69)

0,5

30**

0,3

19*

0,4

89**

0,4

67**

0,3

06*

0,3

55**

0,4

31**

CpG

12 (

-65)

0,3

08*

0,7

35**

0,3

72**

0,5

85**

0,4

59**

0,4

86**

CpG

13 (

-48)

0,2

73*

0,2

97*

0,2

58

0,2

36

0,5

01**

CpG

14 (

-30)

0,3

40*

0,5

24**

0,4

22**

0,5

74**

CpG

15 (

-16)

0,5

06**

0,5

23**

0,5

12**

CpG

16 (

-9)

0,7

05**

0,4

94**

CpG

17 (

+14)

0,4

41**

AR

Nm

Pcn

a (

%)

Pcn

a

Meti

laci

ón (

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Glu

cosa

suero

(m

g/d

L)

Reti

nol to

tal en T

AB

i (n

mol/g)

Reti

nil é

stere

s en h

ígado (

nm

ol/g)

Peso

Corp

ora

l (g

)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/100g)

Peso

TA

Bi (m

g)

β-C

aro

teno e

n s

uero

(µ

M)

Pcn

a

Meti

laci

ón (

%)

Reti

nol en h

ígado (

nm

ol/g)

β-C

aro

teno e

n h

ígado (

nm

ol/g)

Reti

nol en s

uero

(µ

M)

Tab

la 4

. C

orr

elac

iones

en

tre

el %

de

met

ilac

ión d

e lo

s si

tios

CpG

y d

el p

rom

edio

en l

a re

gió

n e

studia

da

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gen

Pcn

a y

los

niv

eles

de

AR

Nm

en

tej

ido

ad

ipo

so

bla

nco

inguin

al (

TA

Bi)

, lo

s p

arám

etro

s m

orf

om

étri

cos

y c

ircu

lante

s, y

los

niv

eles

tis

ula

res

de

reti

noid

es y

car

ote

noid

es (

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Corr

elac

ion

es e

ntr

e el

% d

e

met

ilac

ión d

e lo

s si

tio

s C

pG

in

div

idual

es y

el

% d

e m

etil

ació

n p

rom

edio

en l

a re

gió

n e

studia

da

del

gen

Pcn

a (

B).

Tab

la 5

. (P

ágin

a s

igu

ien

te)

Co

rrel

acio

nes

entr

e el

% d

e m

etil

ació

n d

e lo

s si

tios

CpG

y d

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rom

edio

en

la

regió

n e

stu

dia

da

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gen

Rb

p4 y

lo

s n

ivel

es d

e A

RN

m

en t

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o a

dip

oso

bla

nco

ingu

inal

(T

AB

i),

los

par

ámet

ros

morf

om

étri

cos

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ircu

lante

s, y

los

niv

eles

tis

ula

res

de

reti

noid

es

y c

arote

noid

es (

A).

Co

rrel

acio

nes

entr

e el

% d

e m

etil

ació

n d

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s si

tios

Cp

G i

ndiv

idual

es y

el

% d

e m

etil

ació

n p

rom

edio

en l

a re

gió

n e

stu

dia

da

del

gen

Rb

p4

(B

).

▼


Capítulo 3

147

A

.

CpG

1 (

-296)

CpG

2 (

-278)

CpG

3 (

-267)

CpG

4 (

-249)

CpG

5 (

-199)

CpG

6 (

-192)

CpG

7 (

-171)

CpG

8 (

-159)

CpG

9 (

-148)

CpG

13 (

-105)

CpG

14 (

-102)

CpG

15 (

-91)

CpG

16 (

-87)

CpG

17 (

-81)

CpG

18 (

-70)

CpG

19 (

-68)

CpG

20 (

-55)

pro

medio

-0,1

60

0,1

69

0,0

13

-0,0

55

0,0

69

-0,0

45

-0,0

01

0,0

49

0,0

15

0,0

83

0,0

65

0,0

79

0,0

63

-0,0

82

0,1

02

-0,0

47

0,1

14

0,0

30

0,0

53

0,2

39

0,1

44

0,2

16

0,2

35

0,1

22

0,2

09

0,2

41

0,2

28

-0,0

40

0,2

32

0,0

09

-0,0

35

0,1

71

0,0

74

-0,1

78

0,0

65

0,2

76*

0,0

74

0,1

23

0,2

18

0,1

05

0,1

90

0,1

77

0,1

03

0,2

11

0,1

25

-0,0

30

-0,2

12

0,0

43

0,0

72

0,1

82

0,0

50

0,3

50*

0,2

89

0,2

73*

0,0

39

0,0

22

0,1

40

0,1

96

0,2

15

0,1

20

0,1

61

0,1

62

0,1

63

-0,1

59

-0,1

78

-0,1

44

0,0

18

0,1

81

0,0

76

0,0

21

0,0

49

0,1

19

-0,1

73

-0,0

34

-0,1

17

-0,1

99

-0,0

19

-0,0

59

-0,1

60

-0,1

43

-0,1

60

0,3

42*

0,1

79

0,1

54

0,1

59

0,3

45*

0,2

36

0,1

86

0,2

63

0,0

37

0,1

76

0,4

27**

0,0

38

0,0

83

0,2

37

0,2

57

0,1

55

0,0

64

0,0

63

-0,0

21

-0,2

31

0,3

34*

0,0

13

0,0

80

0,4

97**

-0,0

70

0,2

64

0,3

06*

0,1

47

0,4

00**

0,0

84

0,1

14

0,2

78*

0,2

99*

0,1

72

0,1

32

0,1

21

0,0

04

-0,2

64

0,2

54

0,0

43

0,1

47

0,4

15**

-0,0

04

0,2

15

0,2

26

0,1

48

0,3

71**

0,1

25

0,1

25

0,2

19

0,2

69*

0,1

63

0,1

51

0,1

56

0,0

15

-0,1

66

0,2

15

0,0

73

0,1

61

0,4

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0,0

55

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98

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-0,2

69*

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31*

-0,3

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63*

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-0,2

39

-0,3

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0,0

75

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46

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14

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19

-0,4

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59

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B.

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medio

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59**

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29**

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14

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33

-0,0

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+10)

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+34)

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59

Rb

p4

Meti

laci

ón (

%)

Rb

p4

Meti

laci

ón (

%)

β-C

aro

teno e

n s

uero

(µ

M)

Reti

nol en s

uero

(µ

M)

AR

Nm

Rbp4 (

%)

Peso

Corp

ora

l (g

)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/100g)

Peso

TA

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g)

Glu

cosa

suero

(m

g/d

L)

Reti

nol to

tal en T

AB

i (n

mol/g)

Reti

nil e

ster

en H

ígado (

nm

ol/g)

Reti

nol en H

ígado (

nm

ol/g)

β-C

aro

teno e

n H

ígado (

nm

ol/g)

Tesis Doctoral


148

A.

(con

t.)

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-53)

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+24)

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+32)

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66

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-0,0

85

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12

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-0,0

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21**

B.

(con

t.)

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0,1

04

0,4

10**

CpG

9 (

-148)

0,0

79

0,0

21

0,1

48

0,5

20**

0,2

34

0,1

67

0,1

50

0,1

35

0,0

21

0,0

12

0,0

27

-0,0

19

0,1

07

0,0

92

-0,0

05

0,0

65

0,0

34

0,5

00**

CpG

13 (

-105)

0,2

19

0,2

83

0,0

22

0,5

21**

0,4

50**

0,3

65*

0,2

12

0,1

23

-0,0

23

0,4

06**

0,0

72

0,3

01

0,3

90*

0,1

62

0,1

32

0,0

17

-0,0

65

0,0

61

CpG

14 (

-102)

0,1

00

0,2

78

-0,1

84

0,0

85

-0,0

43

0,4

11**

0,3

64*

0,2

90

0,2

81

-0,0

18

0,1

20

0,0

59

0,1

44

0,2

79

-0,0

26

-0,1

38

-0,0

06

0,0

26

CpG

15 (

-91)

,324*

0,0

23

-0,0

81

-0,2

07

-0,0

41

0,0

01

0,2

61

0,5

14**

0,3

12*

0,0

66

0,2

48

0,1

15

0,3

03

0,2

62

-0,0

78

-0,0

25

0,1

34

0,3

90*

CpG

16 (

-87)

0,2

29

0,0

78

-0,2

59

0,1

24

-0,2

12

0,1

89

,331*

0,2

98

-0,1

24

0,1

03

0,2

40

-0,1

37

0,2

51

0,3

23*

-0,1

84

-0,0

28

0,2

58

0,2

52

CpG

17 (

-81)

-0,0

03

-0,0

64

-0,1

98

0,0

04

-0,1

63

0,1

22

0,1

04

0,2

70

0,2

60

-0,0

38

-0,1

05

-0,1

39

0,0

50

0,1

67

-0,2

58

-0,1

87

-0,0

45

0,1

25

CpG

18 (

-70)

0,1

06

0,1

92

0,0

54

0,0

13

0,1

07

-0,0

94

0,1

48

0,1

34

0,1

08

0,0

22

0,0

98

0,0

69

0,2

47

0,0

90

-0,0

29

-0,0

47

-0,0

07

0,4

33**

CpG

19 (

-68)

0,1

78

0,3

00

-0,1

36

0,1

82

0,1

06

0,2

01

0,2

16

-0,0

97

0,2

66

0,3

92*

0,0

64

0,0

46

0,1

88

0,2

12

-0,0

13

-0,1

03

0,1

77

0,1

37

CpG

20 (

-55)

0,0

12

0,1

09

0,0

08

0,1

25

0,2

87

-0,0

75

0,1

99

0,1

17

0,3

31*

0,3

67*

0,2

13

,511**

0,2

99

0,1

06

-0,0

61

0,0

32

0,2

91

CpG

21 (

-53)

0,0

28

0,3

00

0,2

18

0,5

42**

,327*

0,1

16

0,0

73

-0,0

40

0,2

51

0,2

07

0,4

30**

0,4

63**

-0,1

74

0,0

23

0,2

09

0,1

55

CpG

22 (

-45)

0,2

62

0,3

50*

-0,0

05

0,1

38

0,2

38

0,3

32*

0,1

61

0,1

10

-0,0

52

0,1

57

0,1

70

0,0

09

-0,0

55

0,0

70

0,1

37

CpG

23 (

-39)

0,4

95**

0,2

75

0,1

89

-0,0

47

0,0

82

0,1

56

0,1

93

,339*

0,1

76

0,1

39

-0,2

14

-0,1

04

0,1

53

-0,0

57

CpG

24 (

-37)

0,3

94**

0,0

87

0,0

01

0,3

06*

0,2

54

0,0

35

0,2

50

0,3

54*

0,1

01

-0,0

92

-0,1

14

-0,0

43

0,0

04

CpG

25 (

-23)

0,3

55*

0,0

34

0,2

87

0,0

39

0,0

73

0,0

02

0,1

67

0,2

32

-0,2

72

-0,1

73

-0,0

25

0,0

17

CpG

26 (

-8)

0,3

57*

0,3

64*

0,0

93

0,1

76

0,2

24

0,2

56

0,2

96

-0,0

77

0,0

42

0,0

38

0,3

00

CpG

27 (

+1)

0,1

82

0,4

28**

0,4

02**

0,2

67

0,1

77

0,0

81

0,3

04*

-0,1

25

-0,1

47

0,0

49

0,1

91

CpG

28 (

+4)

0,3

08*

0,1

60

0,2

40

0,1

92

0,2

65

0,2

15

0,0

74

-0,0

47

0,1

04

0,3

43*

CpG

29 (

+10)

0,2

48

0,0

69

0,2

39

0,1

11

0,1

51

-0,1

06

-0,1

07

0,1

08

0,2

54

CpG

30 (

+13)

0,1

60

0,3

45*

0,4

20**

0,1

94

0,2

57

0,0

51

0,2

63

0,3

07*

CpG

31 (

+20)

0,3

10*

0,2

78*

0,1

14

0,1

88

0,2

96*

0,3

72**

0,2

01

CpG

32 (

+22)

0,4

29**

0,2

23

0,3

31*

0,1

87

0,1

73

0,3

71**

CpG

33 (

+24)

0,5

37**

-0,0

52

0,0

81

0,1

55

0,5

15**

CpG

34 (

+26)

-0,2

38

0,0

47

0,0

74

0,2

27

CpG

35 (

+28)

0,4

05**

0,1

25

0,1

52

CpG

36 (

+32)

0,2

50

0,1

62

CpG

37 (

+34)

0,2

59

Rb

p4

Meti

laci

ón (

%)

Rb

p4

Meti

laci

ón (

%)

β-C

aro

teno e

n s

uero

(µ

M)

Reti

nol to

tal en T

AB

i (n

mol/g)

Reti

nil e

ster

en H

ígado (

nm

ol/g)

Reti

nol en H

ígado (

nm

ol/g)

β-C

aro

teno e

n H

ígado (

nm

ol/g)

Reti

nol en s

uero

(µ

M)

AR

Nm

Rbp4 (

%)

Peso

Corp

ora

l (g

)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/100g)

Peso

TA

Bi (m

g)

Glu

cosa

suero

(m

g/d

L)


Capítulo 3

149

A.

CpG

1 (

-2640)

CpG

2 (

-2634)

CpG

3 (

-2608)

CpG

4 (

-2599)

CpG

5 (

-2586)

CpG

6 (

-2580)

CpG

7 (

-2541)

CpG

8 (

-2538)

CpG

9 (

-2521)

CpG

10 (

-2511)C

pG

11 (

-2508)C

pG

12 (

-2455)

pro

medio

--

--

--

--

--

--

-

-0,2

62

-0,1

21

-0,0

68

-0,2

45

-0,1

16

-0,1

04

-0,2

97*

-0,2

91*

-0,3

38*

-0,1

58

-0,0

19

-0,2

80*

-0,2

79*

-0,0

31

-0,1

38

-0,1

42

-0,1

31

-0,2

03

-0,2

11

-0,1

45

-0,1

52

-0,2

03

-0,0

72

-0,2

44

-0,0

94

-0,0

79

-0,1

21

-0,1

16

-0,1

30

-0,1

71

-0,2

33

-0,1

54

-0,2

68*

-0,2

80*

-0,2

48

-0,2

15

-0,0

50

-0,1

24

-0,2

17

0,1

83

0,4

37**

0,3

04*

0,2

57

0,4

23**

0,4

88**

0,2

67*

0,1

51

0,3

20*

0,2

65

0,0

93

0,2

94*

0,4

59**

-0,0

35

0,2

14

-0,0

96

-0,0

70

0,0

90

0,0

17

0,0

80

0,1

81

0,1

66

0,0

93

0,3

33*

0,0

22

0,1

90

0,0

47

0,0

16

-0,1

65

-0,1

25

-0,0

06

-0,1

01

-0,0

06

0,1

42

0,0

60

0,0

61

0,2

36

-0,1

68

0,0

76

0,0

12

-0,0

82

-0,1

31

-0,1

71

-0,0

03

-0,1

49

-0,0

69

0,1

74

-0,0

76

0,0

37

0,2

18

-0,2

34

-0,0

75

-0,2

98*

-0,3

55**

-0,1

10

-0,1

33

-0,1

51

-0,1

32

-0,0

79

-0,1

16

-0,0

75

-0,4

19**

-0,3

75**

-0,3

44**

-0,3

99**

0,0

03

-0,1

11

0,0

32

0,0

37

0,0

57

0,0

24

-0,1

96

-0,0

68

-0,2

27

-0,1

43

-0,0

51

-0,1

72

-0,1

53

-0,3

30*

-0,3

69**

-0,0

98

-0,1

30

-0,1

49

-0,1

45

-0,0

87

-0,1

46

-0,1

19

-0,3

77**

-0,4

04**

-0,3

65**

-0,4

16**

B.

CpG

1 (

-2640)

CpG

2 (

-2634)

CpG

3 (

-2608)

CpG

4 (

-2599)

CpG

5 (

-2586)

CpG

6 (

-2580)

CpG

7 (

-2541)

CpG

8 (

-2538)

CpG

9 (

-2521)

CpG

10 (

-2511)C

pG

11 (

-2508)C

pG

12 (

-2455)

pro

medio

CpG

1 (

-2640)

0,2

50

0,2

14

0,3

96**

0,1

47

0,2

73*

0,2

37

0,4

01**

0,3

96**

0,4

12**

0,4

96**

0,4

76**

0,5

52**

CpG

2 (

-2634)

0,2

89*

0,4

43**

0,4

66**

0,4

41**

0,2

82*

0,3

04*

0,5

19**

0,2

11

0,3

31*

0,4

46**

0,5

16**

CpG

3 (

-2608)

0,7

16**

0,6

25**

0,6

34**

0,5

81**

0,3

14*

0,4

94**

0,4

20**

0,3

76**

0,2

65*

0,4

42**

CpG

4 (

-2599)

0,5

80**

0,6

53**

0,5

63**

0,3

62**

0,6

00**

0,4

57**

0,4

33**

0,4

29**

0,4

79**

CpG

5 (

-2586)

0,5

76**

0,3

98**

0,1

08

0,5

59**

0,2

56

0,2

60

0,2

33

0,2

78*

CpG

6 (

-2580)

0,6

38**

0,3

74**

0,4

55**

0,4

57**

0,4

44**

0,4

48**

0,5

40**

CpG

7 (

-2541)

0,4

29**

0,5

11**

0,4

93**

0,4

83**

0,2

12

0,5

72**

CpG

8 (

-2538)

0,3

04*

0,3

28*

0,4

74**

0,2

55

0,3

87**

CpG

9 (

-2521)

0,3

28*

0,4

22**

0,3

07*

0,5

61**

CpG

10 (

-2511)

0,4

94**

0,2

98*

0,4

83**

CpG

11 (

-2508)

0,3

31*

0,4

83**

CpG

12 (

-2455)

0,6

46**

Ucp

1

Meti

laci

ón (

%)

Reti

nol en h

ígado (

nm

ol/g)

β-C

aro

teno e

n h

ígado (

nm

ol/g)

Reti

no

l en

su

ero

(µ

M)

Reti

nil é

stere

s en h

ígado (

nm

ol/g)

Peso

Co

rpo

ral

(g)

Gra

sa c

orp

ora

l (g

/10

0g

)

Peso

TA

Bi

(mg

)

β-C

aro

ten

o e

n s

uero

(µ

M)

Ucp

1

Meti

laci

ón (

%)

AR

Nm

Ucp

1 (

%)

Glu

co

sa s

uero

(m

g/d

L)

Reti

no

l to

tal

en

TA

Bi

(nm

ol/

g)

Tab

la 6

. C

orr

elac

iones

en

tre

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de

met

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e lo

s si

tios

CpG

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el p

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Ucp

1 y

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nco

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TA

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los

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A).

Corr

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ació

n p

rom

edio

en l

a re

gió

n e

studia

da

del

gen

Ucp

1 (

B).

Tesis Doctoral


150

Anexo 3C

Niveles de expresión de Zfp423 en el tejido adiposo marrón (TAM) y en los tejidos adiposos

blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) en ratones NMRI (de 13

semanas de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de

oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos

normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al

grupo control y son la media ± SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control

tratado con vehículo (P<0,05; prueba t de Student de dos colas)

5. Recapitulación

Tesis Doctoral


152

Recapitulación

153

Esta tesis doctoral parte de y da continuidad a la investigación de nuestro grupo del LBNB

sobre la actividad biológica de formas activas de la vitamina A (retinoides) y carotenoides

provitamina A en relación con el control de la adiposidad corporal y la salud metabólica.

La tesis se enfoca en el estudio de la interacción de la vitamina A con la biología del

tejido adiposo y emplea diseños experimentales en animales adultos, crías lactantes y

adipocitos en cultivo. Hemos estudiado el impacto del ácido retinoico todo trans (ATRA)

‒ el retinoide más activo, requerido para una amplia gama de procesos biológicos ‒ sobre

la capacidad oxidativa mitocondrial del tejido adiposo blanco (TAB) en ratones adultos

in vivo y en adipocitos primarios cultivados, y perseguido la identificación de nuevos

biomarcadores tisulares y circulantes del impacto metabólico del ATRA, derivados de

análisis de expresión génica y por metabolómica dirigida. Además, hemos continuado

estudios previos de nuestro grupo sobre la interacción de la vitamina A con el TAB en

desarrollo in vivo, abordando un aspecto novedoso que puede proporcionar nuevas claves

mecanísticas: la posible implicación de cambios epigenéticos en genes clave para la

diferenciación adipocitaria. En conjunto, pues, en esta tesis tratamos la interacción de la

vitamina A con la biología del tejido adiposo en diferentes etapas del desarrollo: desde

efectos en etapas tempranas del desarrollo postnatal que pueden condicionar la

programación metabólica del TAB a largo plazo hasta efectos sobre el TAB a corto plazo

de la intervención con ATRA en animales adultos que pueden beneficiar la salud

metabólica.

La función mitocondrial (medida como potencial de membrana, utilización de fosfato

inorgánico o actividad de la cadena respiratoria) está reducida en el TAB en modelos

animales de obesidad (e.g., ratones ob/ob) y en humanos obesos y esta reducción ha sido

relacionada con alteraciones metabólicas asociadas a la obesidad, como la resistencia a la

insulina y la diabetes (Boudina and Graham, 2014). La estimulación de la capacidad

oxidativa mitocondrial de los adipocitos blancos es, por tanto, un posible objetivo en el

control de la obesidad y sus complicaciones médicas asociadas (Bonet et al., 2013; Flachs

et al., 2013). El conocimiento de nutrientes y co-factores capaces de optimizar la función

mitocondrial en el TAB y sus mecanismos de acción es de interés, ya que puede contribuir

al diseño de nuevas estrategias de tratamiento.

En el primer capítulo de la tesis ahondamos en mecanismos y biomarcadores tisulares

de la activación del metabolismo oxidativo en los tejidos adiposos inducida por ATRA.

Sabíamos por estudios previos que el tratamiento con ATRA incrementa la lipólisis y la

capacidad para la oxidación de ácidos grasos y la disipación de energía en TAB y otros

tejidos (Berry and Noy, 2009; Bonet et al., 2012; Mercader et al., 2006). No obstante, el

impacto del ATRA sobre la biogénesis y la capacidad funcional de las mitocondrias del

TAB había sido poco estudiado. Tampoco se había estudiado cómo afecta el tratamiento

con ATRA a la expresión en TAB de marcadores de marronización o de adipocitos

beige/BRITE propuestos en la literatura reciente, ni si la expresión génica relacionada

con la señalización por ATRA tiene potencial como fuente de nuevos marcadores de

marronización. Así pues, diseñamos dos experimentos que nos permitieron estudiar

efectos del tratamiento con ATRA sobre las capacidades funcionales de las mitocondrias

y la expresión de marcadores de marronización y de adipocitos beige/BRITE en el TAB

Tesis Doctoral


154

de ratón in vivo y en cultivos primarios de adipocitos establecidos a partir de diferentes

depósitos adiposos.

El primer experimento fue llevado a cabo en ratones adultos que recibieron una

inyección subcutánea diaria de ATRA o vehículo (controles) durante cuatro días. Tras el

sacrificio se obtuvieron distintos depósitos de TAB (inguinal, epididimal y

retroperitoneal). En estos depósitos cuantificamos los niveles de expresión de una serie

de genes relacionados con la termogénesis y la fosforilación oxidativa (OXPHOS)

mitocondrial: Ucp1, codificante de la proteína desacoplante termogénica por excelencia,

cuya actividad desacopla la OXPHOS para producir calor; Ppara, un receptor nuclear

activador de genes del catabolismo de ácidos grasos que se considera un marcador

distintivo del tejido adiposo marrón frente al blanco (Villarroya et al., 2007); Ppargc1b,

que codifica para PGC1β, un coactivador transcripcional que induce específicamente

(más que el PGC1α) la función mitocondrial en adipocitos blancos (Gao et al., 2011; Ji et

al., 2012; Pardo et al., 2011); Tfb2m, codificante del factor de transcripción mitocondrial

B2, implicado en la transcripción y mantenimiento del ADN mitocondrial; Yy1 (yin-yang

1), que codifica un factor de transcripción para muchos genes mitocondriales respiratorios

(Cunningham et al., 2007; Lescuyer et al., 2002); Atp5f1, que codifica una subunidad de

la ATP sintasa mitocondrial; y Cox8b, el gen de la subunidad VIIIb de la citocromo c

oxidasa de la cadena respiratoria. Previamente, nuestro grupo había comprobado

(mediante análisis transcriptómico) que estos genes son fuertemente inducidos por ATRA

en adipocitos maduros 3T3-L1 cultivados, junto con otros genes relacionados con la

mitocondria. También cuantificamos los niveles de expresión en los diferentes depósitos

de TAB de una serie de genes que han sido propuestos como marcadores de adipocito

beige/BRITE: Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1 (descritos en (de Jong et al.,

2015; Garcia-Ruiz et al., 2015; Wu et al., 2012)). Además, realizamos tinción

inmunohistoquímica con anticuerpos anti-COXIV y anti-UCP1 y determinamos los

niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear.

Cuando comparamos la expresión de los genes seleccionados en los tres depósitos de

TAB en los animales control, vemos que nuestros resultados están de acuerdo con

resultados previos que indican que el TAB subcutáneo es más propenso a la

marronización que el TAB visceral (Seale and Lazar, 2009), mostrando mayores niveles

de expresión de marcadores de adipocito marrón (como Ucp1 y Ppara) y de adipocitos

beige/BRITE, mientras que los depósitos de TAB visceral tienen una mayor capacidad

oxidativa mitocondrial que los adipocitos subcutáneos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe

et al., 2010), mostrando una mayor expresión de genes que codifican para la maquinaria

OXPHOS (especialmente Atp5f1 y Cox8b) y una mayor ratio ADN mitocondrial/ADN

nuclear, indicativo de un mayor número de mitocondrias (aunque muy por debajo de la

ratio en el tejido adiposo marrón (TAM)).

Al analizar los efectos del tratamiento con ATRA, vemos niveles aumentados de los

ARNm de genes relacionados con la termogénesis y la función OXPHOS mitocondrial

(Ucp1, Ppara, Ppargc1b, Tfb2m, Yy1, Atp5f1 y Cox8b) en los depósitos de TAB de los

ratones tratados, especialmente en los depósitos de grasa visceral, en donde prácticamente

todos los genes de esta categoría analizados resultaron inducidos, más que en el depósito

Recapitulación

155

de TAB subcutáneo inguinal, en donde el tratamiento indujo específicamente la expresión

de Ucp1, Ppara y Tfb2m. Aunque los niveles de ADN mitocondrial respecto al nuclear

no se encontraron aumentados en los depósitos de TAB tras el tratamiento con ATRA in

vivo, el estudio inmunohistoquímico reveló, junto a adipocitos más pequeños, una mayor

positividad de COXIV en todos los depósitos de TAB estudiados en los animales tratados

con ATRA, lo que está de acuerdo con un incremento de la capacidad para la OXPHOS.

No obstante, la presencia de adipocitos multiloculares positivos para UCP1 por

inmunohistoquímica sólo fue visible en el TAB subcutáneo de los animales tratados con

ATRA, en concordancia con estudios previos (Mercader et al., 2006). Referente a los

genes relacionados con el fenotipo beige/BRITE, el tratamiento con ATRA aumentó o

tendió a aumentar la expresión de Cd137 y Slc27a1 en los tres depósitos de TAB

estudiados, pero los resultados fueron menos claros para Hoxc9 y Tbx1, cuya expresión

no aumentó de manera consistente en los distintos depósitos, y para Tmem26, para el que

incluso encontramos una disminución de su expresión en todos los depósitos de TAB en

los ratones tratados con ATRA.

Este primer experimento también lo utilizamos para analizar el impacto del tratamiento

agudo in vivo con ATRA sobre la expresión génica de IRISINA en tejidos adiposos e

hígado. La IRISINA es una señal proteica codificada en el gen Fndc5, identificada como

un regulador metabólico secretado por el musculo esquelético capaz de promover la

marronización del TAB (Bostrom et al., 2012). Nuestro interés en analizar la expresión

de IRISINA en hígado y tejidos adiposos de los ratones tratados con ATRA se justifica

por varios motivos: (i) aunque los resultados en modelos celulares apuntan a efectos

directos del ATRA sobre el metabolismo oxidativo mitocondrial en adipocitos, no se

puede descartar la contribución de mecanismos indirectos implicando mediadores

humorales como la IRISINA; (ii) es más, sabíamos que el tratamiento con ATRA (en las

mismas condiciones usadas en esta tesis) incrementa los niveles circulantes de IRISINA

pero no su expresión en el músculo esquelético de los animales (Ribot J, Bonet ML y

Palou A, datos no publicados); y (iii) se ha descrito que, además del músculo, tejidos

adiposos (Moreno-Navarrete et al., 2013; Roca-Rivada et al., 2013) e hígado (Mo et al.,

2016) expresan el gen Fndc5 y secretan IRISINA.

Los resultados mostraron que el tratamiento con ATRA incrementa significativamente

los niveles de expresión del gen Fndc5 en hígado, TAM y TAB epididimal, y tendió a

incrementarlos en los otros dos depósitos de TAB estudiados. También es de destacar que

la expresión del gen Fndc5 fue mucho más alta en hígado que en todos los tejidos

adiposos. En conjunto, nuestros resultados sugieren un origen hepático de la IRISINA

circulante en los animales tratados con ATRA y que incrementos de la IRISINA de origen

hepático y adipocitario pueden contribuir a potenciar la marronización del TAB inducida

por el tratamiento con ATRA, por mecanismos endocrinos y autocrino/paracrinos. En

concordancia, se ha descrito que la sobreexpresión de Fndc5 en hígado induce la

marronización del TAB (Mo et al., 2016) y que la marronización de los adipocitos

favorece su secreción de IRISINA (Moreno-Navarrete et al., 2013). Esto último sugiere

un lazo de retroalimentación positiva entre la marronización de adipocitos y la IRISINA

de origen adiposo.

Tesis Doctoral


156

El segundo experimento se realizó en cultivos primarios de adipocitos establecidos a

partir de preadipocitos derivados de diferentes depósitos adiposos de ratones adultos:

TAM, TAB inguinal y TAB epididimal. Las células en vías de diferenciación fueron

expuestas a ATRA y noradrenalina (NA), dos estímulos marronizadores, por 24h, al

objeto de contrastar marcadores de marronización o de adipocito beige/BRITE basados

en ARNm previamente propuestos en la literatura e identificar nuevos marcadores de

marronización con una función bioquímica/metabólica. Concretamente, nos interesaba

estudiar si la expresión en TAB de proteínas implicadas en la señalización por ATRA ‒

factores de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares y proteínas de unión

a lípidos que, en conjunto, median las acciones celulares del ATRA ‒ podía servir como

fuente de marcadores de marronización funcionales o de activación del metabolismo

oxidativo en adipocitos blancos.

Los resultados de este segundo experimento mostraron que la estimulación aguda (1µM

durante 24h) con ATRA o NA induce características de adipocito tipo marrón en todos

los cultivos primarios, tanto los derivados de TAM como los derivados de TABs, en

concreto la expresión de Ucp1 y también la de Ppargc1a en el caso de la exposición a

NA. No obstante los marcadores de marronización o de adipocito beige/BRITE Slc27a1,

Cd137, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1 no cumplieron los criterios esperables de aumentar tras

un estímulo de activación de la capacidad termogénica como son el tratamiento agudo

con NA o ATRA. Al considerar los efectos de los dos tratamientos pro-termogénicos

aplicados sobre la expresión de genes clave de la señalización por ATRA, observamos

inducción de Rarb tras la exposición a ATRA (en adipocitos marrones derivados de TAM

y beige/BRITE derivados de TAB) y represión de Rxrg tras la exposición a NA (en

adipocitos beige/BRITE derivados de TAB). Además, al considerar los niveles de

expresión basales de estos genes (en los adipocitos no estimulados), observamos una

expresión de Rarb mucho mayor en los adipocitos derivados de TAM que en los

derivados de TABs. A partir de estas observaciones, definimos la ratio entre el nivel de

expresión de Rarb y de Rxrg como un nuevo marcador de marronización en adipocitos

derivados de TAB. Esta ratio se encontró significativamente incrementada en los

adipocitos derivados de TAB (epididimal o inguinal) tratados con NA y con ATRA

respecto de sus respectivos controles, mientras que en los adipocitos derivados de TAM se

encontró incrementada con el tratamiento con ATRA. Para validar este nuevo marcador de

marronización utilizamos el modelo animal caracterizado en el primer experimento

(tratamiento agudo in vivo con ATRA) y observamos que, efectivamente, la ratio

Rarb/Rxrg estaba incrementada significativamente en todos los depósitos de TAB (pero

no en el TAM) de los animales tratados. Sería interesante comprobar si la ratio Rarb/Rxrg

como marcador transcriptómico en TABs responde in vivo a otros estímulos inductores

de marronización.

En conjunto, los resultados de esta primera parte de la tesis muestran que el ATRA, en su

efecto antiobesogénico, impacta en las mitocondrias del TAB, favoreciendo una mayor

funcionalidad mitocondrial, necesaria tanto para los mecanismos de disipación de energía

dependientes de UCP1 como los independientes de UCP1 (e.g., ciclo fútil de hidrólisis

de triacilgliceroles intracelulares y reesterificación de ácidos grasos) (Bonet et al., 2013;

Recapitulación

157

Flachs et al., 2013). Además, los resultados sugieren que el tratamiento con ATRA puede

potenciar capacidades intrínsecas diferenciales de cada tipo de depósito de TAB,

favoreciendo la aparición de adipocitos tipo marrón multiloculares y que expresan la

UCP1 en el TAB subcutáneo (inguinal) y de adipocitos con una capacidad oxidativa

mitocondrial incrementada, pero uniloculares y negativos para UCP1, en los depósitos

viscerales (retroperitoneal y epididimal). De los nuevos marcadores de marronización o

de adipocito beige/BRITE ensayados (Cd137, Slc27a1, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1), sólo

Cd137 resultó inducido de una manera consistente en los diferentes depósitos de TAB

(subcutáneo y viscerales) en los ratones tratados con ATRA, y ninguno resultó inducido

en los adipocitos cultivados derivados de TABs en respuesta a estímulos que sí

aumentaron la capacidad termogénica (vía Ucp1), como son la exposición a NA o ATRA.

Por tanto, la utilidad de estos genes como marcadores funcionales de marronización o

activación metabólica del TAB es limitada. Por otro lado, nuestros datos apoyan la idea

de que los efectos del ATRA sobre la capacidad oxidativa de los adipocitos está

canalizada vía Rarb/Crabp y apuntan a la ratio Rarb/Rxrg como un nuevo marcador

funcional de adipocito beige/BRITE, que marca asimismo la marronización o activación

metabólica del TAB inducida por el tratamiento con ATRA in vivo. Además, in vivo este

nuevo marcador es capaz de discriminar entre la activación del TAM y la marronización

del TAB, al menos en los animales tratados con ATRA.

En el segundo capítulo de la tesis se identificaron y validaron biomarcadores sanguíneos

del incremento de la capacidad oxidativa y termogénica en tejidos adiposos y otros

tejidos, explotando el modelo de tratamiento con ATRA in vivo. Contar con

biomarcadores fácilmente accesibles que reflejen los cambios inducidos por agentes

terapéuticos candidatos en tejidos internos, y que se asocien a efectos sistémicos

beneficiosos, es de interés de cara a la identificación, evaluación y optimización de nuevas

terapias. Puesto que el tratamiento con ATRA induce la capacidad oxidativa y

termogénica en diferentes tejidos, incluyendo la marronización del TAB, este modelo

puede ser utilizado para identificar biomarcadores circulantes asociados a estos efectos,

que son de interés en el contexto del control y tratamiento de la obesidad y sus co-

morbilidades.

Empleando el modelo animal del primer experimento del capítulo 1, realizamos un

análisis metabolómico en PBMC y plasma de ratones tratados con ATRA y sus controles.

También evaluamos la expresión en PBMC de genes relacionados con el metabolismo

oxidativo. En los ratones tratados con ATRA, el perfil metabolómico del plasma mostró

niveles incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas;

niveles disminuidos de citrulina, con aumento del índice de biodisponibilidad global de

arginina (ratio entre los niveles de arginina y los de citrulina+ornitina); niveles

incrementados de creatina; niveles incrementados de taurina; y una disminución de la

ratio PUFA n-6/n-3. El perfil metabolómico en PBMC, por su parte, mostró una reducción

generalizada de los niveles relativos de prácticamente todos los metabolitos analizados

(e.g., acilcarnitinas, aminoácidos), excepto el EPA, en los ratones tratados con ATRA. La

expresión génica de Cyp26a1 y Cpt1a en PBMC se encontró incrementada después del

tratamiento con ATRA.

Tesis Doctoral


158

En conjunto, en este experimento identificamos marcadores plasmáticos de la interacción

de la vitamina A con el metabolismo oxidativo y la salud metabólica. Principalmente las

acilcarnitinas reflejarían la estimulación de la movilización y oxidación tisular de lípidos

promovida por el ATRA, mientras que otros metabolitos como la carnitina, creatina y

taurina, así como la biodisponibilidad global de arginina, podrían jugar un papel más

activo o causal, ya que su mayor disponibilidad podría mejorar la función mitocondrial y

el metabolismo, directa o indirectamente, de acuerdo a la bibliografía. En los ratones

tratados con ATRA, el perfil metabolómico de las PBMC fue muy distinto del plasma, lo

que sugiere un diferente impacto del ATRA sobre el metabolismo de estas células en

comparación con los tejidos homeostáticos (hígado, músculo, tejidos adiposos),

posiblemente asociado a su funcionalidad. No obstante, los resultados de la expresión de

genes específicos en PBMC, en concreto Cpt1a, sí reflejaría la respuesta a ATRA en otros

tejidos que da lugar a aumentar el uso de los ácidos grasos como fuente de energía; sin

embargo, los resultados en PBMC deben tomarse con cautela dadas las limitaciones del

estudio (n pequeña para los análisis en PBMC).

En el tercer capítulo de la tesis estudiamos eventuales efectos nutriepigenéticos de la

suplementación durante la lactancia con vitamina A, preformada o como -caroteno, de

posible relevancia en la programación metabólica del TAB. Estudios previos de nuestro

laboratorio habían mostrado que, en ratas, la suplementación dietética a las crías durante

el periodo de lactancia con una dosis moderada de vitamina A en forma de retinil

palmitato produce cambios en el TAB que favorecen su hiperplasia con la exposición a

una dieta alta en grasa tras el destete (Granados et al., 2013), y que el tratamiento con una

dosis equivalente de vitamina A en forma de -caroteno no tiene los mismos efectos sobre

el TAB en desarrollo que el tratamiento con retinil palmitato (Musinovic et al., 2014). La

lactancia es un periodo crítico del desarrollo del tejido adiposo en el que pueden quedar

condicionados cambios epigenéticos que impactan las características del tejido a largo

plazo, y los retinoides se sabe que influencian la metilación del ADN en el contexto del

cáncer y el desarrollo embrionario. A partir de aquí, hipotetizamos que la suplementación

durante la lactancia con vitamina A puede afectar el estatus de metilación en el TAB de

promotores génicos diana relacionados con el desarrollo y metabolismo del tejido, y de

manera diferencial según esta vitamina sea aportada en la dieta del lactante como retinil

palmitato o como BC.

Para testar esta hipótesis, utilizamos el experimento animal descrito en (Musinovic et al.,

2014), en el cual las crías de rata fueron suplementadas durante la etapa postnatal

temprana (los primeros 21 días de vida, coincidentes con la etapa de lactancia) con -

caroteno (BC), retinil éster (RE, en concreto retinil palmitato) o vehículo. En este

experimento, la cantidad de vitamina A extra administrada fue entre tres y cinco veces la

proporcionada diariamente por la leche materna. Analizamos el estado de metilación de

promotores de genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y determinación

adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol (Rbp4) y la

capacidad termogénica (Ucp1) en el TAB inguinal de los animales de este experimento,

utilizando la técnica de secuenciación por bisulfito.

Recapitulación

159

Los resultados mostraron un perfil alterado de metilación de las regiones promotoras

estudiadas por la suplementación moderada de vitamina A, con efectos diferenciales entre

los grupos RE y BC. Las diferencias se relacionaron con CpG específicos afectados en su

grado de metilación con respecto al grupo control. Los resultados más notables fueron

para Pcna (hipometilación de varios CpGs en el grupo RE e hipermetilación de otros en

el grupo BC), Rbp4 (hipermetilación de varios CpGs en el grupo RE e hipometilación de

otros en el grupo BC) y Ucp1 (hipometilación en varios CpGs en el grupo BC y ausencia

de efectos en el grupo RE). También cabe destacar un sitio CpG en el promotor del

Pparg2 (localizado a -223) que se encontró significativamente hipermetilado en el grupo

RE, pero no en el grupo BC. Los resultados de expresión génica obtenidos en general

están en consonancia con el concepto de que la metilación del ADN suele silenciar la

transcripción. Esto fue especialmente claro en el caso del Pparg2, para el cual los niveles

de metilación se correlacionaron inversamente con los niveles de ARNm y directamente

con los niveles de retinol en TAB inguinal.

Los resultados indican que la suplementación con vitamina A durante la lactancia modula

el perfil de metilación de regiones reguladoras de Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 en

el TAB inguinal de ratas, y de manera diferencial según sea aportada en la dieta como

retinil palmitato o como -caroteno. Los efectos observados podrían subyacer a

diferencias en fenómenos de programación de las características y respuestas del TAB en

etapas posteriores de la vida.

Los resultados de esta tesis definen al ATRA como un agente capaz de potenciar la

función mitocondrial en diferentes depósitos de TAB in vivo. El conocimiento generado

podría ser de interés en el contexto de la obesidad y sus secuelas metabólicas. Por un lado,

la modulación del metabolismo oxidativo del tejido adiposo puede contribuir a la

reducción de la adiposidad y, más allá de la obesidad, el conocimiento de factores capaces

de modular las mitocondrias podría encontrar aplicación en el tratamiento de trastornos

causados por el mal funcionamiento de estos orgánulos. Por otro lado, la identificación

de marcadores tisulares y circulantes de perfiles/procesos metabólicos en el tejido adiposo

puede facilitar el seguimiento de su evolución y, en definitiva, la gestión de la obesidad.

Además, los resultados del análisis metabolómico realizado abren la puerta a nuevas

hipótesis de trabajo sobre los mecanismos de la actividad anti-síndrome metabólico del

ATRA. Finalmente, esta tesis es, que sepamos, pionera en abordar posibles efectos

nutriepigenéticos de la vitamina A durante la lactancia en relación con la diferenciación

y el desarrollo del tejido adiposo.

Tesis Doctoral


160

6. Conclusiones

Tesis Doctoral


162

Conclusiones

163

1. El tratamiento con ATRA, en su efecto antiobesogénico, incrementa la capacidad

funcional de las mitocondrias del tejido adiposo blanco (TAB) y potencia

capacidades intrínsecas diferenciales de cada depósito de TAB. Así, el tratamiento

favorece la aparición de adipocitos tipo marrón, multiloculares y que expresan la

UCP1, en el TAB subcutáneo (inguinal) y de adipocitos con una capacidad oxidativa

mitocondrial incrementada, pero uniloculares y negativos para UCP1, en los depósitos

viscerales (retroperitoneal y epididimal).

2. El tratamiento con ATRA induce en el TAB subcutáneo y visceral algunos

marcadores de adipocito beige/BRITE, notablemente Cd137 y en menor medida

Slc27a1, que serían por tanto útiles como marcadores de marronización o

activación metabólica del TAB, al marcar in vivo tanto los adipocitos tipo marrón

inducidos como los adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada.

No obstante, otros marcadores de adipocitos beige/BRITE ensayados de los

propuestos en la literatura no se ven inducidos con el tratamiento con ATRA, lo que

vendría a sumarse a la controversia en torno a la utilidad de estos marcadores para

identificar la marronización del TAB in vivo.

3. Los efectos del ATRA sobre la capacidad termogénica/OXPHOS de los

adipocitos estarían canalizados por la vía Rarb/Crabp2. Además, el efecto

marronizante o de activación metabólica del TAB inducido por el tratamiento

con ATRA in vivo podría estar potenciado por mecanismos de acción

endrocrinos/paracrinos indirectos, a través de la IRISINA de origen hepático y

del propio tejido adiposo.

4. La ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg se muestra como un nuevo

marcador de marronización o activación metabólica del TAB in vivo. Este nuevo

marcador incrementa en los adipocitos derivados de TAB estimulados con dos

tratamientos “pro-termogénicos” (noradrenalina y ATRA) y en los depósitos de TAB

(pero interesantemente no en el TAM) de los animales tratados con ATRA.

5. El tratamiento con ATRA afecta de manera diferencial el metaboloma

(acilcarnitinas + aminoácidos) del plasma y de las PBMC. El análisis

metabolómico en plasma de ratones tratados con ATRA muestra niveles

incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas; niveles

disminuidos de citrulina y una mayor biodisponibilidad global de arginina; niveles

incrementados de creatina y taurina; y una disminución de la ratio PUFA n-6/n-3.

Algunos de estos marcadores reflejarían fundamentalmente la estimulación de la

movilización y oxidación tisular de lípidos promovida por el ATRA (e.g.,

acilcarnitinas), mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal. Por otra

parte, el perfil metabolómico de las PBMC sugiere un diferente impacto del ATRA

sobre el metabolismo de estas células en comparación con los tejidos homeostáticos,

posiblemente asociado a su funcionalidad en el sistema inmunitario.

Tesis Doctoral


164

6. Los niveles plasmáticos altos de AC2:0 (especialmente), AC8:0,

AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA se muestran como marcadores plasmáticos

de activación del TAM y, junto con los niveles plasmáticos altos de carnitina, de

la activación metabólica del TAB visceral in vivo, al menos en los animales tratados

con ATRA.

7. Un exceso moderado de vitamina A durante el periodo de lactancia altera marcas

de metilación en las regiones promotoras de genes implicados en la

diferenciación y metabolismo (Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1) del tejido

adiposo (TAB inguinal) en formación en la rata, que podrían subyacer a

fenómenos de programación de las características y respuestas del TAB en

etapas posteriores de la vida.

8. Suplementar la vitamina A en forma de ésteres de retinol (vitamina A

preformada) o β-caroteno (carotenoide pro-vitamina A) no es equivalente, sino

que hay efectos nutriepigenéticos diferenciales en el TAB de la crías, que tienen

que ver con los CpG concretos que se ven afectados y con el sentido del cambio (hipo

o hipermetilación respecto del grado de metilación observado en el grupo control).

7. Referencias

Tesis Doctoral


166

Referencias

167

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