Tesis Doctoral

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

BAacuteRBARA RIVERA POLO

Madrid 2012

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIacuteA MOLECULAR

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE MADRID

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

Tesis doctoral que presenta para optar al tiacutetulo de

Doctor por la Universidad Autoacutenoma de Madrid

la Licenciada en Biologiacutea

Baacuterbara Rivera Polo

Director de Tesis

Dr Miguel Urioste Azcorra

GRUPO DE GENEacuteTICA HUMANA

PROGRAMA DE GENEacuteTICA DEL CAacuteNCER HUMANO

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLOacuteGICAS (CNIO)

Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Grupo de Geneacutetica Humana del Programa

de Geneacutetica del Caacutencer Humano del Centro Nacional de Investigaciones

Oncoloacutegicas (CNIO) bajo la supervisioacuten de Miguel Urioste Azcorra

Las siguientes ayudas han permitido la realizacioacuten de la presente tesis doctoral

Contrato de Titulado Superior del Centro de Investigaciones Bioloacutegicas en Red

de Enfermedades Raras-CIBERER

Ayuda de Formacioacuten de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de

Educacioacuten y Ciencia AP-2008-00344

Ayuda de estancia corta de la European Asociation of Cancer Research-Travel

Award

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

AGRADECIMIENTOS

A Todos los que de alguacuten modo han contribuido a esta tesis

Mil Gracias

Baacuterbara

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIacuteA MOLECULAR

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE MADRID

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

Tesis doctoral que presenta para optar al tiacutetulo de

Doctor por la Universidad Autoacutenoma de Madrid

la Licenciada en Biologiacutea

Baacuterbara Rivera Polo

Director de Tesis

Dr Miguel Urioste Azcorra

GRUPO DE GENEacuteTICA HUMANA

PROGRAMA DE GENEacuteTICA DEL CAacuteNCER HUMANO

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLOacuteGICAS (CNIO)

Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Grupo de Geneacutetica Humana del Programa

de Geneacutetica del Caacutencer Humano del Centro Nacional de Investigaciones

Oncoloacutegicas (CNIO) bajo la supervisioacuten de Miguel Urioste Azcorra

Las siguientes ayudas han permitido la realizacioacuten de la presente tesis doctoral

Contrato de Titulado Superior del Centro de Investigaciones Bioloacutegicas en Red

de Enfermedades Raras-CIBERER

Ayuda de Formacioacuten de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de

Educacioacuten y Ciencia AP-2008-00344

Ayuda de estancia corta de la European Asociation of Cancer Research-Travel

Award

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

AGRADECIMIENTOS

A Todos los que de alguacuten modo han contribuido a esta tesis

Mil Gracias

Baacuterbara

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento

Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Grupo de Geneacutetica Humana del Programa

de Geneacutetica del Caacutencer Humano del Centro Nacional de Investigaciones

Oncoloacutegicas (CNIO) bajo la supervisioacuten de Miguel Urioste Azcorra

Las siguientes ayudas han permitido la realizacioacuten de la presente tesis doctoral

Contrato de Titulado Superior del Centro de Investigaciones Bioloacutegicas en Red

de Enfermedades Raras-CIBERER

Ayuda de Formacioacuten de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de

Educacioacuten y Ciencia AP-2008-00344

Ayuda de estancia corta de la European Asociation of Cancer Research-Travel

Award

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

AGRADECIMIENTOS

A Todos los que de alguacuten modo han contribuido a esta tesis

Mil Gracias

Baacuterbara

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento

CARACTERIZACIOacuteN DE LA POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR EN POBLACIOacuteN

ESPANtildeOLA ESTUDIO DE FAMILIAS

APCMUTYH NEGATIVAS

AGRADECIMIENTOS

A Todos los que de alguacuten modo han contribuido a esta tesis

Mil Gracias

Baacuterbara

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento

AGRADECIMIENTOS

A Todos los que de alguacuten modo han contribuido a esta tesis

Mil Gracias

Baacuterbara

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento

AGRADECIMIENTOS

INDICE

1

IacuteNDICE

ABREVIATURAS 7

ABSTRACT 11

INTRODUCCIOacuteN 15

1Poliposis Adenomatosa Familiar 16

2Epidemiologiacutea 16

3Caracteriacutesticas del siacutendrome 17

31 PAF claacutesica 17

32 PAF Atenuada (PAFA) 17

33 Criterios diagnoacutesticos 18

34 Diagnoacutestico diferencial 19

4Historia natural 20

5Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas 21

51 Riesgo de neoplasiashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24

6Bases moleculares de la poliposis adenomatosa 24

61 Gen APC 24

62 Gen MUTYH 26

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa 27

7Diagnoacutestico molecular 28

8 Correlacioacuten genotipo fenotipo 29

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico 30

10Familias con Poliposis Adenomatosa Familiar y estudio geneacutetico negativo 30

OBJETIVOS 33 45

MATERIALES Y MEacuteTODOS 37

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS 39

1Extraccioacuten de ADN y ARN 39

11 Extraccioacuten de ADN 39

12 Extraccioacuten de ARN 39

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN 40

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado 40

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado 41

2Estudios moleculares de los genes APC y MUTYH y anaacutelisis de las

caracteriacutesticas cliacutenicas de los pacientes 42

INDICE

2

21 Estudios moleculares del gen APC 42

211 Genotipado mediante dHPLC 42

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa 43

22 Estudio molecular del gen MUTYH 45

23 Anaacutelisis de grandes deleciones genoacutemicas 47

231 Visualizacioacuten 49

24 Anaacutelisis de las caracteriacutesticas cliacutenicas de los distintos grupos de pacientes seguacuten su

genotipo 50

3Estudios de expresioacuten aleacutelica diferencial en el gen APC 50

31 Genotipado de muestras 50

32 SnaPshot anaacutelisis de ADN genoacutemico 51

33 Medida de desbalance aleacutelico SNaPshot en cADN 51

4Estudios del Promotor de APC 52

41 Anaacutelisis mutacional de los promotores 1A y 1B del gen APC 52

42 Anaacutelisis de metilacioacuten germinal de los promotores del gen APC 52

421 Modificacioacuten con bisulfito soacutedico 52

422 Amplificacioacuten de los promotores del gen APC en DNA modificado 53

423 Clonacioacuten del ADN modificado y transformacioacuten de bacterias 54

424 Visualizacioacuten de colonias y crecimiento de bacterias en medio liacutequido 55

425 Minipreps y secuenciacioacuten 55

5Estudios de segregacioacuten de marcadores flanqueantes al locus de APC 56

6Estudio mutacional del gen APC en cADN 57

7Anaacutelisis del 3rsquoUTR del gen APC 58

8Estudio de mutaciones en los genes AXIN2 y GSK3β 58

82 Amplificacioacuten del genoma completo mediante GenomiPhiTM 58

83 Amplificacioacuten de los genes AXIN2 y GSK3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip59

9Estudio de las variantes encontradas en el anaacutelisis mutacional de los genes

APC AXIN2 y GSK3β 61

91 Mutaciones deleteacutereas o que afectan a las regiones de procesamiento alternativo

del gen APC 62

92 Variantes de significado desconocido encontradas en las regiones reguladoras

del gen APC 63

93 Estudio de posibles mosaicismos del gen APC 63

931Test de proteiacutena truncada en el exoacuten 15 del gen APChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

94 Variantes de significado desconocido (VSD) encontradas en los genes AXIN2 64

941 Estudio de la VSD Arg463Cys en el gen AXIN2 64

INDICE

3

942 Estudio de la VSD Val317Phe en el gen GSK3β 65

95 Poblaciones control para el estudio de variantes mediante la tecnologiacutea de

genotipacioacuten KASPar 65

951 Plataforma de genotipado KASPar 65

952 Protocolo especiacutefico de genotipado 67

953 Interpretacioacuten de los resultados de genotipado por KASPar 68

10Estudio de la patogenicidad de la variante R463P del gen AXIN2 a nivel

somaacutetico 69

101 Estudio de la peacuterdida de heterocigosidad (LOH) en ADN obtenido de

poacutelipos parafinados del probando y su hermana afecta 69

102 Estudios de expresioacuten de proteiacutena a nivel de tejido Inmunohistoquiacutemica e

inmunofluorescencia 70

11Las micromatrices de tejido (TMA) y estudio inmunohistoquiacutemico 71

111 Las micromatrices de tejido (TMA) 71

112 Estudio inmunohistoquiacutemica (IHQ) 71

113 Seleccioacuten de marcadores 73

12 Anaacutelisis de resultados y test estadiacutesticos 73

121 Test estadiacutesticos para comparar caracteriacutesticas cliacutenicas de la serie

completa de FAP en poblacioacuten espantildeola 73

122 Anaacutelisis de agrupamiento o clustering no supervisado en los perfiles

inmunohistoquiacutemicos 74

123 Anaacutelisis supervisado de las muestras 74

RESULTADOS 76

1CARACTERIZACIOacuteN CLIacuteNICA Y MOLECULAR EN FAMILIAS CON POLIPOSIS

ADENOMATOSA FAMILIAR DE TIPO CLAacuteSICO 80

11 Descripcioacuten de la serie y mutaciones en APC 80

12 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 82

121 Edad de diagnoacutestico 82

122 Nuacutemero de Poacutelipos 83

123 Manifestaciones extracoloacutenicas 83

124 Familias PAF con estudio geneacutetico negativo 85

2ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 86

21 Estudio del gen APC 86

211Extremo 3rsquo del gen promotores 1A y 1B y 3rsquoUTR 87

212 Estudios de desbalance aleacutelico segregacioacuten con marcadores 87

microsateacutelites y metilacioacuten de ambos promotores del gen APC 87

INDICE

4

213 Estudio mutacional en cDNA Buacutesqueda de mutaciones localizadas en

regiones introacutenicas 90

214 Estudio de posibles mosaicismos somaacuteticos mediante el ldquoTest de

Proteiacutena Truncada (PTT)rdquo 91

215 Nuevo estudio de grandes reordenamientos del gen APC 92

22 Estudio validacioacuten de las variantes encontradas en el gen APC 92

221 Estudio de caracterizacioacuten y validacioacuten de la mutacioacuten localizada en

el introacuten 3 de APC 96

222 Estudio de expresioacuten inmunohistoquiacutemica de β-catenina y APC en

poacutelipos Estudio de LOH 100

23 Estudio del gen MUTYH 102

231 Estudio de mutaciones puntuales del gen MUTYH 102

232 Estudio de grandes reordenamientos del gen MUTYH 102

3ESTUDIO DE OTROS GENES WNT 103

31 Estudio del gen AXIN2 103

311 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c1387CgtT 103

32 Estudio del gen GSK3β 105

321 Validacioacuten de la patogenicidad de la variante c950GgtT en GSK3β 106

4ESTUDIO DE GENES QUE NO PERTENECEN A LA VIacuteA WNT 107

41 Cariotipado de pacientes 107

5 PERFIL INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POacuteLIPOS ADENOMATOSOS 108

51 Agrupamiento no supervisado de las muestras 108

521 Agrupamiento no supervisado y comparacioacuten supervisada entre los

perfiles IHQ de epitelios normales adenomas y adenocarcinomas 111

522 Marcadores de progresioacuten adenoma ndashadenocarcinoma 113

53 Agrupamiento no supervisado de los adenomas tempranos y tardiacuteos 115

54 Comparacioacuten supervisada de los poacutelipos seguacuten su base geneacutetica 117

DISCUSIOacuteN 121

1MUTACIONES EN APC 123

I1 Correlacioacuten genotipo-fenotipo 124

11ESTUDIO MOLECULAR EN FAMILIAS APCMUTYH NEGATIVAS 126

II1 Ampliacioacuten del estudio de APC 126

II2 Estudio del gen MUTYH 131

111PAPEL DE OTROS GENES DE LA VIacuteA WNT EN LAS FAMILIAS APCMUTYH

NEGATIVAS 131

INDICE

5

III1 Estudio del gen AXIN2 131

III2 Estudio del gen GSK3β 133

1VPAPEL DEL GEN BUB1B EN LAS FAMILAS APCMUTYH NEGATIVAS 134

VESTUDIO INMUNOHISTOQUIacuteMICO DE LOS POLIPOS ADENOMATOSOS 135

V2 Perfil IHQ de la progresioacuten desde un epitelio normal hasta un

adenocarcinoma en cuatro fases

(Normal-Adenoma-Adenoma Alto grado de diferenciacioacuten-Carcinoma) 136

CONCLUSIONES 139

ANEXO 1 145

Material Suplementariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 149

Test Estadiacutesticos 155

Cuestionario y Consentimientos Informados 175

Aacuterboles Familiares 190

Paacuteginas Webhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 199

ANEXO II PUBLICACIONES FRUTO DE ESTA TESIS 203

BIBLIOGRAFIA 207

ABREVIATURAS

9

APC Adenomatous Polyposis Coli ADN Aacutecido Desoxirribonucleico AINES Antiinflamatorios no esteroideos

ARN Aacutecido Ribonucleico

ASE Alellic Specific Expresion CCR Caacutencer Colorrectal cDNA ADN copia

CHPRE Congenital Hipertrofy of the Pigmentary Retinal Ephithelium CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas DHPLC Denaturing High Pressure Liquid Chromatography

DTT Ditiotreitol

EBS Element Biding Site

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ESP Exome Sequencing Project FAP Familiar adenomatous Polyposis FRET Transferencia de Energiacutea por Resonancia de Fluorescencia

GST Gen Supresor de Tumores HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina

HGMD Human Gene Mutation Database ICO Instituto Catalaacuten de Oncologiacutea IF Inmunofluorescencia

IHC Inmunohistochemistry

IHQ Inmunohistoquiacutemica IVD-BMOD ADN Control Metilado Universal- Modificado por Bisulfito

IVD-NMOD ADN Control Metilado Universal-No Modificado por Bisulfito

LB Luria Bertani Medium LN-BMOD ADN Control de Linfocitos Normales- Modificado por Bisulfito

LN-NMOD ADN Control de Linfocito Normales- No Modificado por Bisulfito

LOH Loss of Heterozygosity MCC Mitotic checkpoint Complex

MCR Mutation Cluster Region ME Manifestaciones Extracoloacutenicas

miRNA Micro RNA MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMR Missmatch Repair Gene MUTYH Mut Yeast Homologue NMD Nonsense Mediated Decay

PAAM Poliposis Adenomatosa Asociada a MUTYH PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

PAFA Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

PCR Polymerase chain reaction

ABREVIATURAS

10

PTC Papilar Thyroid Carcinoma PTT Test de la Proteiacutena Truncada QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescence fragments

RT- PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SAC Spindle Asembly Checkpoint

SNC Sistema Nervioso Central SNP Single Nuclotide Polymorfism TA Temperatura Ambiente

TEEA Trietil- amonio-acetato

TMA Micromatriz de tejido UGI Upper Gastrointestinal Polyps UV Luz ultravioleta VSD Variante de Significado Desconocido

ABSTRACT

15

Colorectal cancer is the second most frequent form of cancer in the developed world

accounting for around 600000 deaths in 2008 Hereditary colorectal cancer represents up

to 5 of all CRC and in particular Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is the second

most common form of hereditary colorectal cancer amounting to 1 of all CRC cases FAP

is a truly hereditary condition that confers almost 100 CRC susceptibility and inherits in an

autosomal dominant manner with near 100 of penetrance There are two different forms

of FAP the classical one diagnosed when the patient develops more than 100 polyps along

the colorectum during the second or third decade of life and the attenuated version that is

characterized by the development of 10-99 polyps with a 10 year later onset

Mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene are responsible for the great

majority of the cases (50-80 ) depending on the phenotype of the patient In 2002 the

implication of MUTYH gene a base excision repair gene was discovered in a small percentage

of FAP cases (up to 30 of the APC negative cases) mainly attenuated forms Still in around

15-20 of the classical forms of FAP and in up to 50 of the attenuated phenotypes no

mutation is found This apparent negativity is partially due to a failure in the screening

technique but also it might be possible that other genes are underlying the genetic cause of

these negative FAP patients

In the present study we collected a Spanish series of FAP to fully clinically and molecularly

characterize it and further study the previously described genotype ndashphenotype correlation

As a result of the characterization of the series we were able to identify a group of patients

where no mutation was found and which showed clinical differences to the APC positives

group These negative cases represent a problem facing genetic counseling but also it

constitutes an interesting group of research Therefore we hypothesized about the genetic

origin of the syndrome in these families and focused our effort on the thorough investigation

of these cases

The fact that a genetic test results negative does not rule out the possibility of an aberration

in APC or MUTYH existence There are mutations and other mechanisms of inactivation of

those genes that escape the available techniques in routine screening Through an in depth

study of those genes we were able to identify mutations in APC in around 40 of the

patients In order to test the possible implication of other genes in the syndrome we

selected two Wnt genes (AXIN2 and GSK3B) and BUB1B a SAC gene that interact with APC

in chromosomal segregation and we were able to confirm the presence of variants in AXIN2

and GSK3B that are likely related to the syndrome in two families

ABSTRACT

16

As a final step we have characterized a series of adenomatous polyps from APCMUTYH

negative patients and compared their expression profiles for a battery of proteins with APC

and MUTYH positive polyps oligopoliposis and sporadic adenomas to discard whether a

specific profile in IHC expression is associated with the negative cases

INTRODUCCIOacuteN

21

1 Poliposis Adenomatosa Familiar

Las formas hereditarias representan un 5 del total de caacutenceres colorrectales con dos

entidades principales el Siacutendrome de Lynch o Caacutencer Colorrectal Hereditario No

Polipoacutesico y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) que suponen el 3 y el 1 de los

caacutenceres colorrectales respectivamente (Lynch 2012)

La PAF es un siacutendrome de predisposicioacuten al caacutencer de colon de herencia autosoacutemica

dominante Un tercio de los casos de PAF no muestran antecedentes de la enfermedad en la

familia y son considerados casos de novo (Rozen 2002) debido a mutaciones en el gen APC

descrito en 1881 por Sklifasouski y antildeos despueacutes por Smith (Nishisho 1991) Se caracteriza

por la presencia de poacutelipos adenomatosos en el colon que aparecen en la segunda deacutecada de

la vida y que evolucionaraacuten a caacutencer en el 100 de los casos si no se adoptan medidas

preventivas (Gardner 1951 Petersen 1991 Weitz 2005 Jasperson 2010) Junto a la poliposis

suelen aparecer otras manifestaciones extracoloacutenicas (Lida 1988 Thakker 1995 Kadmon

2001 Nieuwenhuis 2007 Alonso A 2010)

Su etiologiacutea comenzoacute a desentrantildearse en 1986 con la publicacioacuten de Herrera (Herrera

1986) en la que describioacute una del(5q) en un paciente con poliposis y otras alteraciones

Posteriormente en 1991 se identificaron mutaciones en el gen APC como responsables del

fenotipo (Groden 1991 Joslyn 1991) El tratamiento ha variado poco en los uacuteltimos 50 antildeos

y sigue siendo la intervencioacuten quiruacutergica temprana junto al uso preventivo de

antiinflamatorios no esteroideos (AINES)

2 Epidemiologiacutea

La incidencia de PAF se estima en 1 caso cada 5000-13000 nacidos vivos (Fearnhead 2001)

y una prevalencia de 229 por 100000 habitantes (Lynch 1979 Nishisho 1991 Vasen 2008

Knudsen 2010) La prevalencia de la PAF en Espantildea es difiacutecil de establecer con certeza

existen registros como el de Baleares basado en un pequentildeo nuacutemero de familias

identificadas en esas islas que establece una incidencia de PAF de 46 casos por milloacuten de

habitantes y por antildeo y una prevalencia de 3816 casos por milloacuten de habitantes en esa aacuterea

geograacutefica (Llompart 1992 Reyes Moreno 2007)

INTRODUCCIOacuteN

22

3 Caracteriacutesticas del siacutendrome

Ademaacutes de la PAF existe otra forma de poliposis adenomatosa recientemente descrita que

se relaciona con mutaciones en el gen MUTYH (PAAM) Las caracteriacutesticas generales y el

modelo de herencia de cada uno de estas dos entidades se resumen en la Tabla I-1

Tabla I-1 Siacutendromes de Poliposis Adenomatosa colorrectal

SNC Sistema Nervioso Central

La PAF (OMIM175100) (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine) se caracteriza

por presentar cientos a miles de poacutelipos adenomatosos en el colon junto a una serie de

manifestaciones extracoloacutenicas variables (Nishisho 1991 Rustgi 2007) Existen dos

presentaciones de la PAF atendiendo al nuacutemero de poacutelipos

31PAF claacutesica

Se caracteriza por la presencia de maacutes de cien poacutelipos adenomatosos distribuidos

por todo el colon incluidos sigma y recto que aparecen generalmente antes de la

segunda deacutecada de la vida y tiene un riesgo del 100 de progresar hasta caacutencer de

colon que suele detectarse en torno a los 40 antildeos si no se adoptan medidas

preventivas

Siacutendrome

Patroacuten de

herencia Fenotipos Principal caracteriacutestica

Gen

Responsable

Poliposis

Adenomatosa

Familiar (PAF)

Autosoacutemico

dominante

PAF

Claacutesica

Poacutelipos adenomatosos de colon

maacutes de 100 APC

PAF

Atenuada

Poacutelipos adenomatosos de colon

entre 10 y 99 APC

Siacutendrome

de Gardner

Poliposis adenomatosa de colon

asociada a otras manifestaciones

extracoloacutenicas

APC

Siacutendrome

de Turcot

Poliposis adenomatosa del colon

asociada a tumores del SNC

principalmente meduloblastoma

APC y MLH1

MSH2 etc

Poliposis

Adenomatosa

Asociada a

MUTYH (PAAM)

Autosoacutemico

recesivo

Poliposis

Colorrectal

Poacutelipos adenomatosos de colon

principalmente entre 10 y 99

excepcionalmente entre 100 y 500

MUTYH

INTRODUCCIOacuteN

23

32 PAF Atenuada (PAFA)

Es una forma menos severa de la enfermedad caracterizada por la presencia de entre 10 y

99 poacutelipos un promedio de 30 localizados generalmente en la regioacuten maacutes proximal del

colon La edad de diagnoacutestico del caacutencer de colon suele ser entre los 50 y los 55 antildeos unos

15 antildeos maacutes tarde que en la PAF claacutesica Las manifestaciones extracoloacutenicas suelen aparecer

con menor frecuencia siendo las maacutes comunes los adenomas gaacutestricos y duodenales y es

poco frecuente la hipertrofia congeacutenita del epitelio pigmentario de la retina El riesgo

acumulado de desarrollar caacutencer colorrectal es aproximadamente del 70 hasta la edad de

80 antildeos(Knudsen AL 2003 Lynch 2003 Knudsen 2010)

Los siacutendromes de Gardner (OMIM175100) y de Turcot (OMIM175100 y 278300) son

variantes cliacutenicas de la PAF El primero fue descrito en 1951 y se caracteriza por presentar

PAF claacutesica asociada a osteomas quistes sebaacuteceos y tumores desmoides (Gardner 1951) El

de Turcot se sospecha cliacutenicamente cuando la poliposis aparece asociada a tumores del

sistema nervioso central (SNC) El siacutendrome puede deberse tanto a mutaciones en el gen

APC como a mutaciones en uno de los genes reparadores de los errores de emparejamiento

del ADN cuyas mutaciones son responsables del siacutendrome de Lynch Cliacutenicamente se puede

observar la presencia de tumores del SNC como el meduloblastoma en individuos con

mutaciones en APC mientras que en los individuos con mutaciones en los genes

reparadores es maacutes frecuente el glioblastoma multiforme (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

Por su parte la Poliposis Adenomatosa asociada a MUTYH (OMIMmiddot608456) debe

sospecharse en un individuo sin antecedentes familiares de poliposis que presenta entre 10 y

99 poacutelipos adenomatosos de colon despueacutes de los 25 antildeos (muy similar a la PAFA) o

cuando se identifica un patroacuten de herencia autosoacutemico recesivo El siacutendrome es

consecuencia de mutaciones bialeacutelicas en el gen MUTYH y el riesgo de desarrollar caacutencer de

colon es similar al de la PAF (Sieber 2003)

33 Criterios diagnoacutesticos

El diagnostico cliacutenico de la PAF se basa fundamentalmente en dos criterios la edad de

debut de la enfermedad y el nuacutemero de poacutelipos La presencia o ausencia de manifestaciones

extracoloacutenicas no forma parte de los criterios para el diagnoacutestico pero sirven de ayuda para

subclasificar la enfermedad o para orientar el estudio geneacutetico

PAF claacutesica Debe presentar alguno de los siguientes criterios (Alonso A 2010)

Cien o maacutes poacutelipos adenomatosos de colon diagnosticados antes de los 40

antildeos

En menores de 20 antildeos maacutes de 20 poacutelipos adenomatosos y un progenitor

afecto

INTRODUCCIOacuteN

24

PAFA Existen dos criterios que pueden emplearse

Criterios de Nielsen et al (Nielsen M 2007)

Dos familiares mayores de 30 antildeos con un nuacutemero de adenomas entre 10 y

99

Un paciente con adenomas en colon entre 10 y 99 mayor de 30 antildeos y un

familiar de primer grado con caacutencer colorrectal con pocos adenomas

Criterios de Knudsen and Buumllow (Knudsen AL 2003)

Patroacuten de herencia autosoacutemico dominante

Entre 3 y 99 adenomas a los 20 antildeos o maacutes

PAAM (Alonso A 2010)

Maacutes de 15 poacutelipos adenomatosos colorrectales

Maacutes de 5 poacutelipos adenomatosos coloacutenicos antes de los 60 antildeos e historia

familiar de caacutencer de colon

El criterio maacutes determinante para distinguir la PAFA de la PAAM es el modelo de herencia

si es dominante probablemente sea una PAFA mientras que el modelo recesivo hace pensar

en la PAAM

34 Diagnoacutestico diferencial

La PAF se debe diferenciar de otros siacutendromes polipoacutesicos y de predisposicioacuten al caacutencer de

colon

- Siacutendrome de Lynch Asociado a caacutencer de colon a edades tempranas en

ocasiones con poacutelipos adenomatosos con un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante El

nuacutemero de poacutelipos es por lo general reducido suelen ser de mayor tamantildeo que los poacutelipos

esporaacutedicos y presentan ciertas caracteriacutesticas histoloacutegicas como un patroacuten de crecimiento

velloso alto grado de displasia y progresioacuten raacutepida de adenoma a carcinoma(Alonso A

2010)

En el siacutendrome de Lynch los CCR suelen localizarse en colon derecho y son frecuentes

otras neoplasias en el mismo individuo o en familiares como las de endometrio ovario

estoacutemago intestino delgado viacuteas hepatobiliares tracto urinario cerebro piel etc (Lynch

1979 Lynch 1999) El patroacuten de neoplasias extracoloacutenicas asociadas al siacutendrome de Lynch es

en parte similar al descrito en la PAAM aunque esta uacuteltima entidad sigue un modelo de

herencia recesivo como ya se ha indicado (Vogt 2009)

- Siacutendrome de Turcot Se trata de una entidad geneacuteticamente heterogeacutenea puede

ser una variante de la PAF generalmente asociada a meduloblastoma mientras que un tercio

de los casos es debido a mutaciones en los genes reparadores del ADN En estos uacuteltimos

INTRODUCCIOacuteN

25

casos es maacutes frecuente observar glioblastomas y la presencia de poacutelipos es menor que

cuando se asocia a mutaciones en APC (Hamilton SR 1995 Paraf 1997)

- Siacutendrome de Peutz-Jeghers El diagnoacutestico diferencial se basa en la presencia

de las alteraciones caracteriacutesticas del siacutendrome como es la hiperpigmentacioacuten mucocutaacutenea

en labios y boca La poliposis asociada al siacutendrome es hamartomatosa y generalmente

aparece en la nintildeez Es una entidad autosoacutemica dominante causada por mutaciones en el gen

STK11(Peutz 1921 Jeghers 1949)

- Siacutendrome de Poliposis Juvenil Se caracteriza por la presencia de diferentes

tipos de tumores entre los que se pueden encontrar un nuacutemero variable de poacutelipos

hamartomatosos en el tracto gastrointestinal especialmente en el estoacutemago intestino

delgado y colon Muestra un patroacuten de herencia autosoacutemico dominante y los genes que se

encuentran mutados en el 40 de los casos son SMAD4 o BMPR1A (Handra-Luca 2005)

- Siacutendrome PTEN-Tumores hamartomatosos Esta entidad agrupa a siacutendromes

cliacutenicamente diferentes como son el de Cowden (SC) el de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

(BRR) el de Proteus y el Proteus-like y alguno maacutes que en distintas proporciones son

producto de mutaciones en el gen PTEN (Marsh 1999 Blumenthal 2008) Todos ellos tienen

como caracteriacutestica principal la presencia de tumores hamartomatosos y rasgos como

macrocefalia lesiones en mosaico sobrecrecimientos corporales lesiones cutaacuteneas etc

cuya presencia es muy uacutetil de cara al diagnoacutestico diferencial con la PAF Tanto el SC como el

BRR son entidades autosoacutemicas dominantes mientras que el Proteus es esporaacutedico (Marsh

1999 Blumenthal 2008)

- Poliposis Hiperplaacutesica Se caracteriza por la presencia de un nuacutemero variable de

poacutelipos en el colon algunos miden maacutes de 10mm que histoloacutegicamente pueden ser

clasificados como poacutelipos hiperplaacutesicos o poacutelipos serrados Su patroacuten de herencia no estaacute

claramente definido y la mutacioacuten geneacutetica en liacutenea germinal no ha sido identificada

(Buchanan) En relacioacuten con el diagnoacutestico diferencial es conveniente recordar que es

frecuente encontrar poacutelipos hiperplaacutesicos junto a adenomatosos en pacientes con PAAM

(Jasperson 2010)

4 Historia natural

Los poacutelipos adenomatosos de colon en individuos portadores de mutacioacuten en el gen APC

suelen aparecer en la segunda deacutecada de la vida en torno a los 16 antildeos como media

excepcionalmente se han descrito en menores de 10 antildeos (Petersen 1991 Weitz 2005) Una

INTRODUCCIOacuteN

26

vez que aparecen su nuacutemero va en aumento hasta varios cientos o miles en el transcurso de

pocos antildeos sin tratamiento progresan inevitablemente a caacutencer colorrectal que suele ser

diagnosticado en torno a los 35-45 en la PAF claacutesica y 10-15 antildeos despueacutes en la PAFA

(Petersen 1991) En la PAAM la aparicioacuten de los poacutelipos suele ser sobre los 20 antildeos como

en la PAFA y el CCR suele diagnosticarse entre los 45 y los 60 antildeos

5 Manifestaciones cliacutenicas extracoloacutenicas

Ademaacutes de los poacutelipos y el caacutencer colorrectal un elevado porcentaje de los pacientes con

estos siacutendromes muestran otras manifestaciones fuera del colon La mayoriacutea son benignas

sin embargo otras como el hepatoblastoma los tumores desmoides y los poacutelipos en tracto

digestivo superior son hoy en diacutea las causantes de una alta morbi-mortalidad en estos

pacientes El tipo de manifestacioacuten cliacutenica la edad de presentacioacuten y la frecuencia de estas

manifestaciones son muy variables y distintas entre PAF y PAAM Las principales

manifestaciones extracoloacutenicas y su frecuencia pueden consultarse en la Tabla I-2

Tabla I-2 Manifestaciones extracoloacutenicas en PAF y PAAM

Adaptada de Nieuwenhuis and Vasen(Nieuwenhuis 2007)HCEPR Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la

Retina

Hipertrofia Congeacutenita del Epitelio Pigmentario de la Retina (HCEPR) Es

una alteracioacuten benigna muy comuacuten en los pacientes con PAF (Nieuwenhuis 2007) Los

afectados no presentan siacutentomas por lo que es necesaria una exploracioacuten oftalmoloacutegica para

su deteccioacuten Se ha observado en nintildeos de 3 meses de edad y se considera que puede estar

presente desde el nacimiento Cuando se relaciona con mutaciones del gen APC suele ser

muacuteltiple y bilateral (Traboulsi 1987 Chen 2006)

Manifestaciones extracoloacutenicas PAF

Porcentaje de casos

PAAM

Porcentaje de casos

HCEPR 70-75 -

Osteomas y alteraciones dentales 70-90 -

Poacutelipos en tubo digestivo superior

Duodeno

50- 90

21

Glaacutendulas fuacutendicas gaacutestricas 40-50 14

Antro gaacutestrico 5-20 -

Quistes epidermoides y lipomas 25-50 -

Tumor desmoide 10-15 0

Otros tumores malignos (tiroides hepatoblastoma

tumor cerebral) 3 -

INTRODUCCIOacuteN

27

Poliposis duodenal Es la segunda manifestacioacuten extracoloacutenica en orden de

frecuencia Suele aparecer unos 15 antildeos despueacutes de las manifestaciones coloacutenicas afectando

la regioacuten periampular En el 5 de los casos los poacutelipos duodenales malignizan entre la quinta

y sexta deacutecadas de la vida y son la principal causa de muerte oncoloacutegica en pacientes

colectomizados (Lida 1988 Wallace MH 1998 Offerhaus 1999 Kadmon 2001)

Poliposis gaacutestrica Se presentan como poacutelipos de las glaacutendulas fuacutendicas Pueden

ser poacutelipos hiperplaacutesicos o adenomas gaacutestricos y algunos estudios realizados en poblacioacuten

japonesa describen un incremento del caacutencer gaacutestrico relacionado con su presencia

(Offerhaus 1992 Offerhaus 1999)

Osteomas Los osteomas son proliferaciones de hueso compacto o medular de

caraacutecter benigno que aparecen frecuentemente en craacuteneo y mandiacutebula e incluso en los

huesos largos (Gardner 1953 Thakker 1995 Reyes 2002 Chimenos-Kustner 2005 Bisgaard

2006 Nieuwenhuis 2007) Se pueden presentar a partir de la nintildeez incluso antes de la

aparicioacuten de los poacutelipos adenomatosos con mayor frecuencia en el maxilar inferior aunque

pueden aparecer en cualquier tejido oacuteseo sin ocasionar problemas cliacutenicos No se han

descrito casos de malignizacioacuten (Utsunomiya 1975)

Quistes epidermoides Son lesiones benignas del tejido subcutaacuteneo Aunque se

observan en poblacioacuten general en los pacientes PAF su localizacioacuten suele ser distinta

(extremidades cara o cuero cabelludo) y su aparicioacuten maacutes temprana (Leppard 1975)

Alteraciones dentales Algunas pueden aparecer en los primeros antildeos de vida

como la ausencia de erupcioacuten dentaria o la presencia de dientes supernumerarios otras

aparecen maacutes tarde como la presencia de muacuteltiples quistes dentarios incluyendo

odontomas (Jarvinen 1982 Carl 1987)

Tumores desmoides Son tumores benignos que asientan en el mesenterio pared

abdominal o cualquier tejido blando Pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta

esporaacutedicamente o tras alguna intervencioacuten quiruacutergica (Clark 1999 Nieuwenhuis 2007

Vasen 2008) Se consideran un factor importante en la morbilidad y mortalidad en los

pacientes con PAF porque durante su crecimiento pueden comprometer diferentes sistemas

y tejidos como el gastrointestinal genitourinario vascular y nervioso (Wehrli 2001 Half

2009) Algunos estudios sugieren cierta tendencia a la agregacioacuten familiar y una mayor

frecuencia en mujeres (Reitamo 1986 Janinis 2003)

En la PAAM se observan manifestaciones extracoloacutenicas en alrededor del 30 de los

pacientes seguacuten los estudios con mayor nuacutemero de casos (Nielsen 2005 Vogt 2009)

INTRODUCCIOacuteN

28

Principalmente se describen adenomas duodenales y poliposis de glaacutendulas fuacutendicas Los

datos reales de frecuencias son muy escasos debido a la carencia de estudios con un nuacutemero

suficiente de casos Siacute existen sin embargo varias publicaciones en las que se han descrito

distintas manifestaciones intra- y extraintestinales como los poacutelipos duodenales y gaacutestricos o

los carcinomas duodenales (Isidro 2004) Dentro de las alteraciones benignas se han

comunicado casos de HCEPR osteomas adenomas sebaacuteceos pilomatricomas aunque no es

mucha la informacioacuten existente (Sieber 2003 Baglioni 2005) Las neoplasias extracoloacutenicas

recogidas en la literatura incluyen carcinomas sebaacuteceos caacutencer de mama y endometrio

(Isidro 2004 Barnetson 2007 Tricarico 2009)

Tabla I-3 Resumen de las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM

Tabla adaptada de Vogt et al (Vogt 2009)

En la Tabla I-3 se resumen las manifestaciones extracoloacutenicas asociadas a PAAM que se han

descrito como miacutenimo dos veces en la misma serie de pacientes (Vogt 2009) Existe tambieacuten

una amplia serie de manifestaciones que se han descrito soacutelo en un paciente (Vogt 2009)

MANIFESTACIONES EXTRACOLOacuteNICAS Frecuencia () Incidencia Riesgo acumulado ()

Poacutelipos duodenales 26150 (17 )

Poacutelipos gaacutestricos 17150 (11)

Caacutencer Duodenal 2150 (2)

caacutencer gaacutestrico 3150 (3)

Caacutencer de esoacutefago 2150 (2)

CANCERES EXTRACOLOacuteNICOS

Esoacutefago 2150 (2) 55 2

Estoacutemago 3276 42 1

Duodeno 2150 (2) 129 4

Vejiga 4276 (15) 72 6

Piel 13276 (5) 28 17

Pulmoacuten 2276 06 3

Mama en mujeres 8118 (7) 21 25

Mama en hombres 1158 535 15

Ovario 3118 (25) 57 10

Endometrio 2118 (17) 2 3

TODOS los caacutenceres extracoloacutenicos 19 38

TUMORES BENIGNOS

Adenomas sebaacuteceos epitelioma 5276 (18)

Quistes epidermoidesateroma 3276 (1)

Otros tumores benignos de piel 22276 (8)

Lipoma 8276 (3)

Tumor endometroide benigno 4118 (34)

Tumor mama benigno 4118(34)

INTRODUCCIOacuteN

29

51 Riesgo de neoplasias

El riesgo para CCR es muy elevado en todas las formas de poliposis adenomatosa Pero

ademaacutes del riesgo para CCR los pacientes con la enfermedad tienen riesgos para otras

neoplasias En la Tabla I-4 se muestran estos riesgos (Hughes 1992 Burt 1993 Giardiello

1996 Groves 2002 Truta 2005 Herraiz 2007)

Tabla I-4 Riesgos de neoplasias en pacientes con Poliposis Adenomatosa

Tabla de adaptada de Jasperson et al (Jasperson 2010)

6 Bases moleculares de la poliposis adenomatosa

61 Gen APC

El origen de la PAF se debe a mutaciones en el gen APC (Adenomatous Poliposis Coli)

localizado en la regioacuten cromosoacutemica 5q21-q22 que fue identificado y clonado en

1991(Groden 1991 Joslyn 1991 Nishisho 1991 Kinzler 1996)

El gen APC es un gen supresor de tumores (GST) que codifica para una proteiacutena que en su

isoforma maacutes frecuente tiene 2843 aminoaacutecidos La proteiacutena Apc cumple funciones

importantes en la ruta de sentildealizacioacuten Wnt y se relaciona con procesos celulares como la

apoptosis diferenciacioacuten neuronal adhesioacuten y migracioacuten celular asiacute como en la segregacioacuten

de los cromosomas (Hanson 2005)

PAF CLAacuteSICA PAFA PAAM

Colon 100 70 80

Hepatoblastoma 1-2

Duodeno 4-12 4-12 4

Estoacutemago lt1 1

Paacutencreas 2

Tiroides 1-2 1-2

Meduloblastoma lt1

INTRODUCCIOacuteN

30

La ruta Wnt estaacute implicada en desarrollo y diferenciacioacuten y consta de al menos 3 viacuteas

diferentes de las cuales la principal se conoce como viacutea canoacutenica (Canonical Wnt pathway) en

la que Apc desempentildea un papel central (wwwgenomejpdbgetbinwww_bget

pathway+hsa04310) Apc junto con Axin2 Gsk3-β y CasK forma el ldquocomplejo de

destruccioacuten de la β-cateninardquo marcaacutendola para su degradacioacuten por el proteosoma Cuando

APC estaacute mutado la β-catenina se acumula en exceso en el citoplasma y pasa al nuacutecleo Su

acumulacioacuten en el nuacutecleo hace que interaccione con TCF lo que provoca una activacioacuten

continua del oncogeacuten c-MYC

Mutaciones en APC explican la mayoriacutea de los casos con PAF con claras diferencias en las

tasa de mutacioacuten detectadas entre las formas de PAF claacutesica aproximadamente un 75-85

(Rozen 2002) y atenuada alrededor del 30-50 (Moisio 2002 Bertario 2003)

En poblacioacuten espantildeola existen varios trabajos que describen unas frecuencias mutacionales

del gen APC que van desde el 353 en poblacioacuten gallega (Ruiz-Ponte 2001) 39 en un

estudio realizado en Cataluntildea y Galicia (Gomez-Fernandez 2009) 83 en poblacioacuten balear

(Gonzalez 2005) y 867 descrito en el sur de Espantildea (Garcia-Lozano 2005)

La mayoriacutea de las mutaciones en APC se concentran en la mitad 5rsquo del gen y ademaacutes

existen zonas altamente mutables como la regioacuten MCR (Mutation Cluster Region) Los

codones 1061 y 1309 del MCR son puntos especialmente ldquocalientesrdquo por la presencia de

secuencias altamente repetitivas donde la posibilidad de fallos de la polimerasa es mayor

Como sucede en otros genes supresores de tumores las alteraciones del gen APC siguen el

modelo de los dos hits formulado por Knudson (Knudson 1971 Knudson 2001) Seguacuten esta

hipoacutetesis para que el caacutencer se desarrolle es necesario que ocurran dos eventos

mutacionales En las enfermedades hereditarias como la PAF la primera mutacioacuten es

heredada y por lo tanto constitucional y la segunda es una mutacioacuten somaacutetica en el otro

alelo del gen que da lugar al desarrollo del tumor

En la PAF se piensa que las caracteriacutesticas del primer hit mutacional condicionan el segundo

Asiacute la mutacioacuten germinal la heredada influye en el tipo y la localizacioacuten de la mutacioacuten

somaacutetica Seguacuten Lamlum et al (Lamlum 1999) distintas mutaciones en el gen APC confieren a

la ceacutelula ventajas evolutivas diferentes siendo las mutaciones en torno al codoacuten 1300 las maacutes

representativas de esta circunstancia (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998) Cuando se hereda

una mutacioacuten en el codoacuten 1300 el segundo hit acostumbra a ser la peacuterdida de

heterocigosidad que supone la peacuterdida del alelo salvaje la conservacioacuten del alelo con la

mutacioacuten truncante y el desarrollo de un fenotipo maacutes severo Por su parte en las

mutaciones germinales fuera del MCR el segundo hit suele ser a una mutacioacuten somaacutetica en

INTRODUCCIOacuteN

31

las proximidades del codoacuten 1300 en vez de la peacuterdida aleacutelica (Lamlum 1999 Crabtree 2003

Heinen 2009) En estos casos podriacutea ocurrir un tercer hit consistente en la peacuterdida aleacutelica

del alelo mutado germinalmente para que de esta manera la ceacutelula conserve la mutacioacuten en

el MCR que para ella es la maacutes ventajosa

La razoacuten por la que unos alelos confieren mayor o menor ventaja a la ceacutelula probablemente

esteacute en el balance entre la unioacuten y la degradacioacuten de la β-catenina o quizaacutes en un balance

entre los dominios N y C-terminal de APC y sus distintas funciones entre las que figurariacutea

un efecto dominante negativo de algunos alelos (Rubinfeld 1997 Laurent-Puig 1998 Gomez-

Fernandez 2009)

62 Gen MUTYH

El gen MUTYH fue identificado como causante de poliposis adenomatosa en el antildeo 2002 en

una familia con un patroacuten recesivo de la enfermedad en la que se observoacute una alta frecuencia

de transversiones GCgtTA en el ADN tumoral (Al-Tassan 2002) MUTYH es una glicosilasa

que interviene en la ruta BER de reparacioacuten del dantildeo oxidativo mediante el mecanismo de

excisioacuten de bases (Lu 2001) El fallo de este mecanismo de reparacioacuten deriva en la

acumulacioacuten de transversiones GC a TA en el tejido tumoral Tras examinar los

alrededores de las aacutereas mutadas vieron que con frecuencia eran dominios GAA (Jones

2002)

El tejido coloacutenico estaacute expuesto a un alto estreacutes oxidativo y una de las claves del desarrollo

de adenomas y de CCR en los portadores de mutaciones en MUTYH es la circunstancia de

que el gen APC contiene 216 sitios GAA en su secuencia lo que le confiere una especial

vulnerabilidad (Babbs 1990 Cheadle 2003 Sampson 2005)

Se han descrito dos mutaciones recurrentes en MUTYH Y165C y G382D que en poblacioacuten

caucaacutesica representan el 80 del total de mutaciones(Sieber 2003 Lipton 2006) Estos alelos

reducen considerablemente la funcioacuten proteica Se ha visto que en otros grupos eacutetnicos hay

diferentes alelos que aparecen reiteradamente aunque se desconocen sus frecuencias reales

(Sampson 2005)

La frecuencia de portadores heterocigotos de una de las mutaciones recurrentes en

poblacioacuten general variacutea entre el 03 y el 2 Hay cierta controversia en el riesgo de caacutencer

en portadores heterocigotos Se han llevado a cabo algunos estudios sin conclusiones

definitivas aunque la informacioacuten parece apuntar a que podriacutean comportarse como alelos de

baja penetrancia (Jenkins 2006)(Webb 2006 Jones 2009)

INTRODUCCIOacuteN

32

Hay muy poca informacioacuten sobre el papel del gen MUTYH en poblacioacuten espantildeola En una

poblacioacuten del norte de Espantildea el 141 de las poliposis adenomatosas estaba asociado a

mutaciones bialeacutelicas en MUTYH (Gomez-Fernandez 2009) A pesar de que las mutaciones

bialeacutelicas en MUTYH se asocian maacutes frecuentemente con fenotipos atenuados un pequentildeo

porcentaje tambieacuten son responsables de formas claacutesicas de poliposis (7)(Sieber 2003

Segditsas 2006) En poblacioacuten espantildeola se han descrito cifras de 44 aunque la informacioacuten

es muy limitada (Rivera 2011)

63 Otros genes implicados en poliposis adenomatosa

Mutaciones en otros genes de la ruta Wnt podriacutean ser causa de algunos tipos de poliposis

En particular AXIN2 y GSK3β ambas piezas clave en el complejo de destruccioacuten de la β-

catenina constituyen los dos genes candidatos maacutes loacutegicos Axin2 puede compararse con el

andamio sobre el que se ensambla el complejo cuenta con un dominio de unioacuten a Apc y

otro a β-catenina Existen estudios en la literatura que apuntan a AXIN2 como el factor

limitante de la formacioacuten de dicho complejo sometido a una estricta regulacioacuten (Huang

2009)

Se han descrito tres casos con mutaciones deleteacutereas en el gen AXIN2 que ademaacutes de la

poliposis coloacutenica mostraban signos de displasia ectodeacutermica Dos de los casos eran

familiares en los que se observoacute una penetrancia casi completa y el tercero un caso

esporaacutedico En los tres casos hubo signos de displasia ectodeacutermica con prevalencia de

oligodontia y una amplia variabilidad cliacutenica incluso intrafamiliar tanto en el nuacutemero e

histologiacutea de los poacutelipos como en las manifestaciones de la displasia ectodeacutermica (Lammi

2004 Marvin 2011)

En lo que a la Gsk3-β se refiere es la proteiacutena kinasa encargada de fosforilar la β-catenina

para que el proteosoma pueda reconocerla Esta accioacuten constituye pues el paso final de

marcaje para la degradacioacuten de la β-catenina El papel real del GSK3-β en el CCR no se

conoce bien del mismo modo su regulacioacuten es auacuten una incoacutegnita

No existen estudios publicados hasta la fecha que describan asociacioacuten alguna entre

mutaciones en este gen y el desarrollo de alguna forma de poliposis Cinco variantes

descritas en este gen han sido relacionadas con ciertos transtornos neurodegenerativos

como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Benedetti 2004 Kwok 2005 Lachman

2007 Schaffer 2008 Hur 2010)

Varios estudios describen la expresion de esta proteiacutena a nivel inmunohistoquiacutemico en

tumores colorrectales (Wang 2011)

INTRODUCCIOacuteN

33

En lo que respecta a genes no pertenecientes a la viacutea Wnt recientemente se ha descrito la

implicacioacuten del gen BUB1B en un paciente que presentaba neoplasia gastrointestinal (Rio Frio

2010) El gen BUB1B forma parte del Mitotic Checkpoint Complex (MCC) esto es el complejo

de proteiacutenas que interviene en el checkpoint mitoacutetico Dicho de otro modo el gen participa

en la ruta SAC (Spindle Asembly Checkpoint) una de las principales rutas en ciclo celular El

paciente con la alteracioacuten de BUB1B fue diagnosticado de varios caacutenceres gastrointestinales

primarios (ampolla de vaacuteter adenocarcinoma de colon y varios adenocarcinomas gaacutestricos)

Durante el seguimiento el paciente desarrolloacute una poliposis adenomatosa muacuteltiple con

poacutelipos tanto colorrectales como gaacutestricos Tras el estudio negativo de los genes implicados

en poliposis adenomatosa y en Siacutendrome de Lynch el cariotipo del paciente reveloacute una

aneuploidiacutea variegada en mosaico y resultoacute finalmente ser portador de una mutacioacuten en

homocigosis del gen BUB1B En el estudio de Rio Friacuteo et al (Rio Frio 2010) se demuestra la

interaccioacuten de APC con Bubr1 proteiacutena codificada por BUB1B y la conexioacuten molecular

entre el genotipo y el fenotipo de este paciente Cabe destacar que el gen APC tiene una

funcioacuten primordial en la separacioacuten del huso mitoacutetico mediante la unioacuten al factor Eb1

tambieacuten conocido como Mapre1 que a su vez forma parte de los genes SAC El papel

concreto de BUB1B y otros genes de la ruta SAC en la poliposis adenomatosa estaacute auacuten por

determinar pero deberiacutean ser tenidos en cuenta de cara al diagnoacutestico geneacutetico en pacientes

con poliposis adenomatosas sin causa geneacutetica identificada Un caso similar al anterior fue

descrito por de Voer et al (de Voer 2011) donde una paciente portadora de una mutacioacuten

en el gen BUB1 desarrolloacute aneuploidiacutea variegada en mosaico y muacuteltiples neoplasias de colon

7 Diagnoacutestico molecular

El diagnoacutestico molecular de la poliposis adenomatosa se basa en el cribado mutacional de los

genes APC y MUTYH Los algoritmos de trabajo dependen en primer lugar de una buena

definicioacuten del fenotipo del paciente de la historia familiar y de la posible identificacioacuten del

modelo de herencia En liacuteneas generales siempre que el modelo de herencia se ajuste al

patroacuten recesivo deberiacutea plantearse primero el estudio del gen MUTYH mientas que si existe

un modelo dominante deberaacute plantearse el estudio de APC siempre y cuando no se trate

de familias con muacuteltiple consanguinidad La presencia de manifestaciones extracoloacutenicas

tambieacuten puede orientar hacia queacute gen estudiar Cuando no hay antecedentes familiares de la

enfermedad y el fenotipo es atenuado o si existe consanguinidad podriacutea ser conveniente

comenzar por MUTYH

Si se trata de un fenotipo severo podriacutea comenzarse el estudio del gen APC por los

codones 1309 y 1061 seguido del resto de la regioacuten MCR En las siguientes fases se

INTRODUCCIOacuteN

34

completariacutea el estudio del exoacuten 15 y de la mitad 5acutedel gen donde aparecen la mayoriacutea de las

mutaciones (Bertario 2003) Respecto a los grandes reordenamientos se ha descrito que

pueden representar hasta el 8-12 de todos los casos (Aretz 2005 Nielsen 2007)

Tambieacuten conviene tener presente que los fenotipos atenuados se relacionan con mutaciones

en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen asiacute como a la regioacuten de procesamiento alternativo del introacuten

9 aunque mutaciones en esta regiones tambieacuten pueden verse en formas claacutesicas de la

enfermedad (Knudsen 2003 Rivera 2011)

Por su parte el estudio en el gen MUTYH se centra baacutesicamente en el anaacutelisis en primera

instancia de las mutaciones recurrentes en nuestra poblacioacuten Ademaacutes de las mencionadas

Y165C y G382D se suele realizar el estudio de otras mutaciones como la

c1186_1187insGG pE396fsX437 en el codoacuten 1186 o las mutaciones missense c692GgtA y

c462GgtA y la delecioacuten c1395_1397delGGA que tambieacuten han aparecido en repetidas

ocasiones en nuestra poblacioacuten Cuando se detecta una mutacioacuten recurrente se deberaacute

realizar el estudio del gen completo Igualmente tambieacuten es conveniente completar el

estudio del gen cuando no se detecta ninguna mutacioacuten recurrente pero la historia cliacutenica es

muy sugerente de la implicacioacuten de MUTYH

8 Correlacioacuten genotipo- fenotipo

Durante los uacuteltimos antildeos varios estudios han buscado una correlacioacuten entre la localizacioacuten

de la mutacioacuten y el fenotipo desarrollado por los pacientes (revisado en detalle por

Nieuwenhuis y Vasen(Nieuwenhuis 2007)) Esta informacioacuten puede tener un importante

intereacutes cliacutenico ya que contribuye a mejorar el consejo geneacutetico y hace maacutes aacutegil el anaacutelisis

mutacional Sin embargo es posible que la informacioacuten actualmente disponible no tenga una

aplicacioacuten universal y su validez quede restringida a algunas poblaciones aquellas de las que

proceden los datos

Una de las asociaciones maacutes ampliamente aceptadas es aquella entre las mutaciones en la

regioacuten MCR en concreto en el codon 1309 con los fenotipos maacutes severos caracterizados

por la presencia de maacutes de un millar de poacutelipos y con un debut de la enfermedad en torno a

10 antildeos antes de lo que cabriacutea esperar (Caspari 1994 Ficari 2000) Otra de las asociaciones

claacutesicas es la que relaciona mutaciones en los extremos 5rsquo y 3rsquo del gen con el desarrollo de

un fenotipo atenuado concretamente aquellas mutaciones anteriores al codon 157 y

posteriores al 1517 (Knudsen 2003 Half 2009) En el extremo 5rsquo este efecto se explicariacutea

por la presencia de un segundo sitio de inicio de transcripcioacuten en el codoacuten 184 que en parte

solventariacutea el efecto de una mutacioacuten anterior a esa zona (Heppner Goss 2002) La regioacuten

INTRODUCCIOacuteN

35

de procesamiento alternativo del exoacuten 9 se ha asociado tambieacuten a fenotipos PAFA (Knudsen

2003)

No obstante esta informacioacuten podriacutea no ser aplicable en la poblacioacuten espantildeola Son

necesarios estudios con series amplias de familias para conocer si son vaacutelidas estas

asociaciones

9 Importancia de las manifestaciones extracoloacutenicas en el diagnoacutestico

cliacutenico

La presencia de una manifestacioacuten extracoloacutenica en el paciente unido a la severidad del

siacutendrome puede orientar el diagnoacutestico hacia la buacutesqueda de mutaciones en un gen

determinado Por ejemplo podriacuteamos iniciar el estudio por MUTYH cuando aparecen

pilomatricomas o quistes epidermoides (Baglioni 2005) incluso plantear la posibilidad de un

Siacutendrome de Lynch (Muir Torre) Mientras que en los casos donde se observe poliposis

tumor desmoide u osteoma estariacuteamos frente a una posible FAP claacutesica con mutaciones en

APC Ademaacutes aunque puntualmente se han descrito en PAAM los tumores desmoides y los

osteomas son manifestaciones infrecuentes en esa entidad (Sieber 2003) Tambieacuten la

presencia de caacutencer de mama o de endometrio en el paciente o en la familia podriacutea

orientar hacia el estudio de MUTYH ya que ambas neoplasias que no se considera como una

manifestacioacuten extracoloacutenica en la FAP claacutesica (Nielsen 2005 Barnetson 2007 Tricarico

2009) Poacutelipos serrados e hiperplaacutesicos tambieacuten pueden asociarse a mutaciones en MUTYH

(Boparai 2008)

10 Familias con Poliposis Adenomatosa y estudio geneacutetico negativo

En un 15-20 de los casos con fenotipo claacutesico y hasta en el 70 de los casos con atenuado

no se detectan mutaciones ni en APC ni en MUTYH Estos casos plantean un problema para

el consejo geneacutetico y el manejo de las familias Cabe pensar que alguno de estos casos

podriacutean ser falsos negativos que realmente presenten mutaciones en alguno de los dos

genes conocidos que las teacutecnicas actuales no permiten detectar Alternativamente

mutaciones en genes diferentes de APC y MUTYH auacuten no identificados podriacutean ser

responsables de algunos otros casos Esta uacuteltima circunstancia podriacutea explicar las diferencias

cliacutenicas entre las familias con y sin mutacioacuten detectable en APC o MUTYH observados en

algunos estudios (Renkonen 2005 Rivera 2011) Sea como sea en estos casos de PAF o

PAAM con estudio geneacutetico negativo conviene ofrecer a los miembros familiares a riesgo

INTRODUCCIOacuteN

36

las medidas de seguimiento consensuadas para las familias positivas y que se mencionaraacuten

maacutes adelante

En el presente trabajo nos proponemos profundizar en estas familias con estudio geneacutetico

negativo intentando descartar la participacioacuten de los genes claacutesicamente implicados APC y

MUTYH y buscar otros genes que puedan explicar estas formas de poliposis

Este trabajo se enmarca dentro de un amplio estudio con un importante nuacutemero de familias

con PAF procedentes de diversos puntos del paiacutes

OBJETIVOS

41

Objetivos

1- Caracterizacioacuten cliacutenica y estudio geneacutetico de una serie de familias espantildeolas

con una forma claacutesica de Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)

2- Anaacutelisis de la correlacioacuten genotipo-fenotipo en la serie de familias espantildeolas

con PAF

3- Estudio de las bases geneacuteticas de las familias APCMUTYH negativas afectas de

PAF claacutesica

4- Caracterizacioacuten molecular de los poacutelipos adenomatosos de pacientes

APCMUTYH negativos y su comparacioacuten con los perfiles de expresioacuten

inmunohistoquiacutemica de poacutelipos de pacientes APC y MUTYH positivos

oligopoliposis y poacutelipos esporaacutedicos

MATERIALES Y MEacuteTODOS

45

PACIENTES Y DATOS CLIacuteNICOS

Los pacientes con una sospecha cliacutenica de FAP fueron evaluados en una unidad de consejo

geneacutetico y se llevoacute a cabo el estudio molecular en dos centros espantildeoles Institut Catalaacute

drsquoOncologiacutea (ICO) y Centro Nacional de Investigaciones Oncoloacutegicas (CNIO) En todos los

casos se recogioacute la historia cliacutenica de todos los miembros afectos y un aacuterbol familiar

detallado En el Anexo 1 se recoge un modelo de cuestionario cliacutenico consentimiento

informado para los pacientes y los aacuterboles de las familias incluidas en el estudio El caso

iacutendice o probando fue considerado el primer miembro que asistioacute a la consulta de consejo

geneacutetico En la gran mayoriacutea de los casos los probandos estaban afectos Los estudios

realizados fueron aprobados por un Comiteacute Eacutetico en los hospitales de procedencia Todos

los pacientes firmaron un consentimiento informado especiacutefico para este proyecto

1 EXTRACCIOacuteN DE ADN Y ARN

11 Extraccioacuten de ADN de sangre perifeacuterica Se obtuvo ADN de una muestra de

linfocitos de sangre perifeacuterica mediante un procedimiento automaacutetico usando el MagNA

PURE LC Instrument procedure (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante

12 Extraccioacuten de ARN total se llevoacute a cabo a partir de 7ml de sangre total siguiendo el

protocolo detallado a continuacioacuten

1-Rotular tubos Falcon de plaacutestico esteacuteriles

2-Dispensar 9 ml de FICOL-HISTOPAQUE en los tubos y sobre el ficol echar lentamente 7ml de

sangre perifeacuterica con una pipeta Pasteur dejando resbalar la sangre poco a poco sobre la pared del

tubo evitando asiacute su mezcla con el ficol

3-Centrifugar 30 min a 2700 rpm a 20ordmC (seleccionar el programa de acelerado y frenado lento)

4-Separar la capa de linfocitos

a Recoger con cuidado la fase intermedia (nube de leucocitos) con una pipeta Pasteur de

cristal en otro Falcon rotulado y esteacuteril de 15ml Llenar el Falcon con PBS1x+01DEPC Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 3000 rpm a TA

b Decantar el sobrenadante resuspender el pellet con 15 ml de PBS1x+01DEPC y

transferirlo a un eppendorf de 2 ml para un segundo lavado llenar el eppendorf hasta arriba Agitar

suavemente y centrifugar 10 min a 14000 rpm a 4ordmC

c Decantar el sobrenadante antildeadir 15ml de TRI-REAGENT y homogeneizar bien la mezcla

con la punta de la pipeta hasta deshacer por completo los agregados que se formen

d Incubar 15 min a TA o a -20ordmC toda la noche

e Antildeadir 300 ul de cloroformo y agitar vigorosamente en el vortex

f Incubar 15 min a TA

MATERIALES Y MEacuteTODOS

46

g Centrifugar 15 min a 14000 rpm a TA

5 Precipitacioacuten del ARN

a Transferir la fase acuosa a un tubo limpio

b Antildeadir 750 ul de Isopropanol e incubar 10 min a TA o toda la noche a -20ordmC

c Centrifugar 8 min a 14000 rpm a 4-25ordmC y decantar el sobrenadante

6 Lavado y solubilizacioacuten del ARN

a Antildeadir 1 ml de etanol al 75 y agitar mediante vortex

b Centrifugar 5 min a 14000 rpm a 4ordmC y decantar el sobrenadante

c Dejar evaporar las trazas de etanol a TA durante 3-5 min Es muy importante no secar

completamente el pellet para no disminuir mucho su solubilidad

d Resuspender en 50100 ul de agua-DEPC 01 seguacuten la cantidad de precipitado

e Incubar y mantener en hielo si se van a procesar inmediatamente o congelar a -20ordmC y

posteriormente a -80ordmC

La concentracioacuten de ARN total se midioacute usando el nanodrop y analizando su integridad en un gel

de agarosa al 1 previa desnaturalizacioacuten en formamida

13 Retro-transcripcioacuten de ARN a cADN

La retrotranscripcioacuten de ARN a ADN copia se llevoacute a cabo utilizando la enzima Superscript II

Reverse Transcriptase de la casa comercial Invitrogen El protocolo utilizado fue el siguiente

1 Partimos de 500ng de ARN total en un tubo eppendorf esteacuteril y libre de nucleasas

2 Antildeadimos 1 ul de primers universales a 500 ngul y 1 ul dNTP Mix (10 mM de cada

desoxirribonucleoacutetido)

3 Antildeadir agua esteacuteril y destilada hasta 12 ul

4 Incubar la mezcla a 65ordmC durante 5min y enfriar posteriormente hasta 4ordmC

5 Antildeadir

4 ul del tampoacuten de siacutentesis de cADN 5x First-Strand Buffer

2 ul de DTT 01 M

1 ul de ARNseOUT (40 unidadesul) de la casa comercial Invitrogen

6 Mezclar en el tubo e incubar a 25ordmC durante 2min

7 Antildeadir 1ul (200 unidades) de Superscript II Reverse Transcriptase y mezclar pipeteando arriba y

abajo en el tubo

8 Incubar a 25ordmC durante 10min

9 Incubar a 42ordmC durante 50min

10 Inactivar la reaccioacuten mediante una incubacioacuten a 70ordmC de 15min de duracioacuten

14 Extraccioacuten de ADN de tejido parafinado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo (Qiagen

Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones el cual se detalla brevemente a continuacioacuten

MATERIALES Y MEacuteTODOS

47

1 Colocar en un eppendorf 4 cortes de 10 μm del tumor y antildeadir 800 μlde xilol seguido de agitacioacuten

fuerte para disolver la parafina

2 Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min a TA

3 Desechar sobrenadante

4 Repetir paso 2

5 Antildeadir 1200 μl de etanol 100 seguido de agitacioacuten fuerte

6 Repetir paso 2

7 Repetir paso 5

8 Repetir paso 2

9 Dejar secar el pellet entre 10-15 min a 37ordmC o a TA

10 Resuspender en 180200 μl de tampoacuten ATL dependiendo de la cantidad de tejido

11 Antildeadir 20-40 μl de proteinasa K (20 mgml) dependiendo de la cantidad de tejido agitar e

incubar durante 1-3 h a 55ordmC con agitacioacuten de vez en cuando

12 Antildeadir maacutes proteinasa K si el tejido no se ha degradado despueacutes del tiempo previsto y dejar

que la reaccioacuten actuacutee durante toda la noche (16 h)

13 Antildeadir 200400 μl de tampoacuten AL dependiendo de la cantidad de tejido y mezclar

inmediatamente

14 Antildeadir 200400 μl de etanol 100 y agitar fuertemente

15 Pipetear la mezcla en las ldquoDNeasyrdquo mini-columnas provistas de tubos colectores de 2 ml

16 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min Desechar sobrenadante

17 Repetir pasos 15 y 16 si todaviacutea queda mezcla debido a los voluacutemenes utilizados previamente

dependientes de la cantidad de tejido

18 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW1

19 Repetir el paso 16

20 Antildeadir a la columna 500 μl de tampoacuten AW2

21 Centrifugar a 12000 rpm durante 3 min

22 Diluir el ADN retenido en las mini-columnas antildeadiendo 100 μl de agua Braum a 65ordmC o de

tampoacuten Tris-EDTA (TE 101 pH=80) o tampoacuten AE (provisto por el kit comercial) a TA

Esperar durante 5 min a TA

23 Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min No eliminar el volumen diluido

24 Repetir pasos 22 y 23 Se han recuperado ~200 μl de volumen en el que estaacute diluido el ADN

tumoral

25 Medir concentracioacuten en espectrofotoacutemetro Nanodrop y correr 5 μl en gel de agarosa al 1

para analizar tamantildeo del ADN

15 Extraccioacuten de ADN de tejido congelado

Para la extraccioacuten de ADN de material parafinado se utilizoacute el mismo kit ldquoDNAse Tissue Kitrdquo

(Qiagen Chatswoth CA USA) con algunas modificaciones

MATERIALES Y MEacuteTODOS

48

1 Cortar el tejido congelado e incluido en OCT Tissue -Tek con ayuda de un criostato

2 Colocar en un eppendorf 15 cortes de 10 μm del tejido

3 Continuar con el paso 10 del protocolo detallado en el apartado anterior

2 ESTUDIOS MOLECULARES DE LOS GENES APC Y MUTYH Y ANAacuteLISIS DE

LAS CARACTERIacuteSTICAS CLIacuteNICAS DE LOS PACIENTES

21 Estudios moleculares del gen APC

Para la buacutesqueda de mutaciones puntuales en el gen APC se utilizoacute la tecnologiacutea Denaturing

High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) y secuenciacioacuten directa Las muestras fueron

amplificadas mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) en 32 fragmentos

diferentes Los primers utilizados para la amplificacioacuten del gen en 32 amplicones se recogen

en la Tabla M1

En un primer paso los amplicones heterocigotos fueron discriminados utilizando el dHPLC

211 Genotipado mediante dHPLC

El dHPLC es un meacutetodo basado en la deteccioacuten de especies heteroduplex Los heteroduplex

se forman mediante la desnaturalizacioacuten por calor del ADN y posterior renaturalizacioacuten del

mismo lo cual produce un desemparejamiento en individuos heterocigotos Estos

heteroduplex son distinguibles de los homoduplex formados por las dos cadenas ideacutenticas

presentes en individuos homocigotos

El dHPLC se basa en la utilizacioacuten de una columna compuesta por moleacuteculas hidrofoacutebicas

que en fase reversa uniraacute especies de ADN mediante TEEA (trietil- amonio-acetato) El

ADN es eluido de la columna mediante la incorporacioacuten del compuesto hidrofoacutebico

acetonitrilo en un porcentaje de acuerdo a la longitud y composicioacuten GC del fragmento a

estudiar La adecuada temperatura de desnaturalizacioacuten parcial del fragmento nos permitiraacute

discriminar especies homoduplex de las heteroduplex por el tiempo que el fragmento esteacute

retenido en la columna (Figura M1)

MATERIALES Y MEacuteTODOS

49

Figura MI Discriminacioacuten aleacutelica mediante DHPLC A Columna hidrofoacutebica En verde bolas hibrofoacutebicas en

gris moleacutecula de doble cadena de ADN en naranja TEAA (elemento de unioacuten entre el ADN y los componentes

hidrofoacutebicos de la columna B Esquema representativo de un cromatograma y su correspondencia con las

diferentes especies (homo y heteroduplex) Los picos del cromatograma se distinguen por tiempo de retencioacuten

Posteriormente los productos de PCR se purificaron mediante ExoSap-IT (USB Corporation

Ohio USA) y se secuenciaron directamente por el meacutetodo Sanger con un secuenciador 3730

de Applied Biosystems

212 Genotipado por secuenciacioacuten directa

Para algunas exones y determinadas muestras se empleoacute la secuenciacioacuten directa para la

buacutesqueda de mutaciones El estudio del gen MUTYH se realizoacute praacutecticamente en su totalidad

mediante esta teacutecnica como se explica en el siguiente apartado de estos Meacutetodos Tambieacuten

se empleoacute la secuenciacioacuten directa como confirmacioacuten de los resultados obtenidos en otras

plataformas de genotipado (dHPLC o KASpar) Se realizaron reacciones de PCR

convencional en un volumen total de 25 μl y empleando para la amplificacioacuten un

termociclador epgradient S (Eppendorf) Para el disentildeo de primers se utilizoacute el programa

Primer3 (httpbiotoolsumassmededubioappsprimer3_wwwcgi)

El protocolo general de amplificacioacuten fue

1 Desnaturalizacioacuten inicial 5 min a 94ordmC

2 Ciclos de desnaturalizacioacutenhibridacioacutenelongacioacuten 30 seg a 94ordmC 30 seg a la temperatura de

hibridacioacuten (Th) especiacutefica (ver Tabla 4) 30 seg a 72ordmC Para optimizar el rendimiento de la PCR

se realizaron un total de 35 ciclos distribuidos en 5 ciclos con una Th=x+4 otros 5 ciclos con una

Th=x+2 y 25 ciclos con la Th oacuteptima para ese fragmento