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Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California
Maestría en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en
Biotecnología Marina
Análisis transcriptómico y desarrollo de una biblioteca de los genes codificantes para anticuerpos IgNAR del tiburón
Heterodontus francisci
Tesis para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Presenta:
Vanessa Vázquez Padilla
Ensenada, Baja California, México 2018
Tesis defendida por Vanessa Vázquez Padilla
y aprobada por el siguiente Comité
Dr. Ricardo Alberto González Sánchez Codirector de tesis
Dr. Alexei Fedorovish Licea Navarro Codirector de tesis
Miembros del Comité
Dra. Clara Elizabeth Galindo Sánchez
Dr. Oscar Sosa Nishizaki
Dr. Luis Donis Maturano
Vanessa Vázquez Padilla © 2018 Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis.
Dra. Clara Elizabeth Galindo Sánchez Coordinador del Posgrado en Ciencias de la Vida
Dra. Rufina Hernández Martínez Directora de Estudios de Posgrado
ii
Resumen de la tesis que presenta Vanessa Vázquez Padilla como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Biotecnología Marina.
Análisis transcriptómico y desarrollo de una biblioteca de los genes codificantes para anticuerpos IgNAR del tiburón Heterodontus francisci
Resumen aprobado por:
Dr. Ricardo Alberto González Sánchez Codirector de tesis
Dr. Alexei Fedorovish Licea Navarro Codirector de tesis
Los anticuerpos convencionales están compuestos por cadenas polipeptídicas tanto pesadas como
ligeras, y los tiburones presentan anticuerpos conformados únicamente por cadenas pesadas llamados IgNAR (Inmunoglobulinas con Nuevo Receptor de Antígeno). Los anticuerpos IgNAR que han sido identificados en el suero de elasmobranquios, presentan una alta termoestabilidad, gracias a su conformación con una buena penetración en tejidos, depurándose rápidamente del organismo por su tamaño pequeño. Por lo anterior, son agentes terapéuticos y de diagnóstico con un alto potencial. La búsqueda de anticuerpos de manera convencional es un proceso largo y que requiere de una estandarización compleja. La secuenciación de RNA ofrece la posibilidad de acelerar la tasa de descubrimiento de las inmunoglobulinas. En este trabajo se extrajo RNA de células involucradas en la respuesta inmune del tiburón Heterodontus francisci, con el fin de construir dos bibliotecas de secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR, a partir de muestras de sangre y bazo, evaluar su variabilidad y finalmente generar un catálogo de las IgNAR presentes en el transcriptoma del tiburón H. francisci.
Palabras clave: elasmobranquio, IgNAR, inmunoglobulina, tiburón, transcriptoma
iii
Abstract of the thesis presented by Vanessa Vázquez Padilla as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Life Sciences with orientation in Marine Biotechnology. Transcriptomic analysis and development of a library of the sequences encoding for IgNAR antibodies
of the shark Heterodontus francisci
Abstract approved by:
Dr. Ricardo Alberto González Sánchez Codirector de tesis
Dr. Alexei Fedorovish Licea Navarro Codirector de tesis
Conventional antibodies are composed of heavy and light polypeptide chains, sharks have a type
of antibody formed only by heavy chains called IgNAR (Immunoglobulins with New Antigen Receptor). IgNAR antibodies have been identified in the serum of elasmobranchs. These immunoglobulins have high thermostability due to their conformation and have good tissue penetration due to their small size. Therefore, highlighting their potential as therapeutic and diagnostic agents. Conventionally, the search for antibodies is a long process and requires complex standardization. RNA sequencing offers the possibility of accelerating the discovery rate of immunoglobulins. We extracted RNA from cells involved in the immune response of the shark Heterodontus francisci to create libraries containing sequences that encode for IgNAR in blood and spleen samples, assessed their variability and generated a catalog of the different sequences present in H. francisci.
Keywords: Elasmobranch, immunoglobulin, IgNAR shark, transcriptome
iv
Dedicatoria A mi familia, principalmente a mis papás. A Andrés Eduardo Morfin Aguilar
v
Agradecimientos
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE) por brindarme un lugar
en el posgrado.
Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por brindarme el apoyo económico para realizar
mis estudios de maestría.
A mis directores por brindarme todas las facilidades para poder trabajar de la mejor manera, por hacer
tiempo para atender las dudas que iban surgiendo a lo largo de este proyecto y por sus valiosas
sugerencias.
A mi comité de tesis por sus multiples aportaciones y por tener siempre la mejor disposición para que este
proyecto se pudiera llevar a cabo.
Al laboratorio de Genómica Funcional Marina por permitirme el uso de sus instalaciones y recursos.
A Oscar Juárez por las horas de asesorías, a Erick Delgadillo y Mateo Sánchez por la ayuda con los
programas bioinformáticos y Daniel Fernández por su ayuda revisando y ayudando con mi escrito final.
A mi familia: mis papás, mi hermana y sobrino, mis tíos y mis abuelos. Por siempre creer en mi e interesarse
en mis metas.
A mis amigos que me brindaron apoyo intelectual y emocional. Gracias por las horas de tutorías, por sus
consejos, por siempre estar al pendiente. Eduardo Álvarez, Duahmet Ruiz, Fernanda Ariza, Anaid Meza,
Luis Eduardo Tellechea, Edgar Flores, Anayr Gómez, Mariela Blanco, Fernanda Menchaca, Rubén Garibay,
Jorge Castro, Jorge Kotkoff, Juan Carlos Perusquía, Nestor Durazo, Austin Montero, Carlos Iván Zúñiga.
vi
Tabla de contenido
Resumen en español. .................................................................................................................................... ii
Resumen en inglés ....................................................................................................................................... iii
Dedicatoria ................................................................................................................................................... iv
Agradecimientos ........................................................................................................................................... v
Lista de figuras ........................................................................................................................................... viii
Lista de tablas ............................................................................................................................................... ix
Capítulo 1. Introducción ............................................................................................................................... 1
1.1 Antecedentes ...................................................................................................................................... 1
1.1.1 Sistema inmunológico .................................................................................................................. 1
1.1.2 Inmunoglobulinas ......................................................................................................................... 2
1.1.3 Inmunidad adaptativa en tiburones ............................................................................................. 4
1.1.4 IgM ............................................................................................................................................... 5
1.1.5 IgW ............................................................................................................................................... 5
1.1.6 IgNAR ............................................................................................................................................ 6
1.1.7 Aplicación biomédica ................................................................................................................... 7
1.1.8 Heterodontus francisci……………………………………………………………………………………………………………..8
1.1.9 Transcriptómica ............................................................................................................................ 9
1.2 Justificación ...................................................................................................................................... 10
1.3 Hipótesis ............................................................................................................................................ 10
1.4 Objetivos .......................................................................................................................................... 11
1.4.1 Objetivo general ......................................................................................................................... 11
1.4.2. Objetivos específicos ................................................................................................................. 11
Capítulo 2. Metodología ............................................................................................................................. 12
2.1 Estandarización de metodología para separar células sanguíneas de tiburón Heterodontus francisci ................................................................................................................................................................. 12
2.1.1. Separación de células sanguíneas utilizando un gradiente de Ficoll ......................................... 12
2.1.2. Separación de células sanguíneas utilizando un gradiente de Percoll ...................................... 12
2.1.3. Separación de células sanguíneas utilizando buffer de lisis ...................................................... 13
2.1.4. Separación de células sanguíneas utilizando agua libre de nucleasas ...................................... 13
2.1.5. Conteos celulares ...................................................................................................................... 14
2.2. Selección e inmunización de tiburones Heterodontus francisci ....................................................... 14
2.3. Muestreo de sangre y bazo en tiburón Heterodontus francisci ....................................................... 14
vii
2.4. Extracción y cuantificación de RNA .................................................................................................. 15
2.4.1. Extracción de RNA con TRIzol .................................................................................................... 15
2.4.2. Cuantificación de RNA extraído ................................................................................................. 16
2.5. Preparación de la muestra para secuenciación ................................................................................ 16
2.6. Construcción de bibliotecas ............................................................................................................. 16
2.7. Secuenciación del transcriptoma ..................................................................................................... 17
2.8. Ensamblaje y análisis ........................................................................................................................ 17
2.8.1 Acceso al servidor ....................................................................................................................... 17
2.8.2 Carga y descarga de archivos al servidor .................................................................................... 18
2.8.3 Formato .slrm ............................................................................................................................. 18
2.8.4 Ensamblaje de novo del transcriptoma ...................................................................................... 18
2.8.5 Obtención de una base de datos preexistente ........................................................................... 19
2.8.6 BLAST y Blast2Go ........................................................................................................................ 20
2.8.7 Creación de base de datos en NCBI ............................................................................................ 22
2.8.8 Extracción de secuencias codificantes para IgNAR presentes en el transcriptoma ................... 22
2.8.9 Traducción de las secuencias de nucleótidos de IgNAR ............................................................. 23
2.8.10 Alineación de secuencias .......................................................................................................... 23
Capítulo 3. Resultados ................................................................................................................................. 24
3.1. Separación de células sanguíneas .................................................................................................... 24
3.2. Extracción de RNA ............................................................................................................................ 24
3.2.1. Concentraciones y pureza de RNA extraído .............................................................................. 24
3.2.2. Integridad de RNA extraído ....................................................................................................... 25
3.3. Eliminación de RNA ribosomal, construcción de bibliotecas de cDNA y preparación de templetes. ................................................................................................................................................................. 26
3.4. Secuenciación ................................................................................................................................... 28
3.5 Ensamblaje de novo ........................................................................................................................... 29
3.6 Ontología de genes ............................................................................................................................ 29
3.7 Secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR .............................................................................. 30
Anexos ......................................................................................................................................................... 43
viii
Lista de figuras Figura 1.-‐ Estructura y componentes de una Inmunoglobulina .................................................................... 3
Figura 2.-‐ Diversidad de isotipos de inmunoglobulinas en vertebrados ....................................................... 4
Figura 3.-‐ Inmunoglobulinas de secreción y transmembranales encontradas en los elasmobranquios ...... 5
Figura 4.-‐ Inmunización de tiburón H. francisci. ......................................................................................... 14
Figura 5.-‐ Criterios básicos incluidos en archivo .slrm ................................................................................ 18
Figura 6.-‐ Contenido de archivo .slrm para ensamblaje De Novo con Trinity ............................................. 19
Figura 7.-‐ Archivo .slrm para darle formato de base de datos a un archivo .fasta ..................................... 20
Figura 8.-‐ Archivo formato .slrm para correr un BLASTX ............................................................................ 21
Figura 9.-‐ Flujo de trabajo para ver ontología de genes en Blast2Go ......................................................... 21
Figura 10.-‐ Árbol filogenético neighbor-‐joining de distintos elasmobranquios .......................................... 22
Figura 11.-‐ Electroforesis de RNA ............................................................................................................... 25
Figura 12.-‐ Electroforesis por Nano Chip RNA ............................................................................................ 26
Figura 13.-‐ Lectura del Bioanalyzer de las concentraciones de cDNA amplificado obtenido en cada muestra ..................................................................................................................................... 27
Figura 14.-‐ Ontología de genes de procesos biológicos .............................................................................. 30
Figura 15.-‐ Alineamiento de secuencias ..................................................................................................... 33
ix
Lista de tablas
Tabla 1.-‐ Metodologías empleadas tradicionalmente para separar células sanguíneas. ........................... 12
Tabla 2.-‐ Concentraciones de Percoll utilizadas para hacer un gradiente .................................................. 13
Tabla 3.-‐ Determinación de la calidad de secuencia utilizando el puntaje de Phred .................................. 17
Tabla 4.-‐ Conteos celulares en muestras sanguíneas tratadas .................................................................. 24
Tabla 5.-‐ Evaluación de concentraciones y pureza de RNA ........................................................................ 25
Tabla 6.-‐ Chips utilizados para la secuenciación ......................................................................................... 27
Tabla 7.-‐ Resumen de resultados obtenidos a partir de la secuenciación .................................................. 28
Tabla 8.-‐ Genes y transcritos encontrados en cada transcriptoma ............................................................ 29
Tabla 9.-‐ Resultados del BLASTn ................................................................................................................. 31
1
Capítulo 1. Introducción
1.1 Antecedentes
Los anticuerpos monoclonales son considerados moléculas indispensables para aplicaciones terapéutica y
diagnósticas y son altamente rentables, produciendo más de $1 billón de dólares anualmente (Barelle y
Porter, 2015; Krah et al., 2016). La inmunización ha sido clave en el desarrollo de anticuerpos de uso
terapéutico ya que es un medio poderoso para inducir una respuesta de anticuerpos específicos. Una
complicación que surge al inmunizar mamíferos es que se puede provocar una respuesta inmune contra
proteínas conservadas de esta clase. Al implementar el uso de elasmobranquios, se elimina este problema
ya que son filogenéticamente distintos a los mamíferos (Barelle y Porter, 2015). Otra ventaja que presenta
el uso de los elasmobranquios es la presencia de Inmunoglobulinas de cadena sencilla. Estas
inmunoglobulinas poseen un dominio variable de aproximadamente 12 kDa, son termoestables y son
capaces de unirse a sus blancos con una alta afinidad y selectividad (Barelle y Porter, 2015).
1.1.1 Sistema inmunológico
Los organismos procariotas son los principales responsables de conformar la biomasa marina, se estima
que existen alrededor de 1029 células procariotas en el océano (Tort et al., 2003), dentro de esta diversidad
celular existen organismos que resultan patógenos hacia otras formas de vida. Los organismos
pluricelulares han desarrollado mecanismos para mantener su integridad y hacer frente a elementos
potencialmente patógenos del medio. Estos mecanismos se engloban en un sistema conocido como
sistema inmunológico, el cual se encarga de mantener la homeostasis mediante la eliminación de células
y moléculas derivadas de diversas fuentes consideradas dañinas (Murphy et al., 2008). Este sistema tiene
cuatro tareas principales: i) reconocimiento inmunológico, ii) funciones efectoras, iii) regulación y iv)
memoria.
Se han descrito dos tipos de inmunidad: innata y adaptativa, cada una mediada por tipos celulares y
elementos proteínicos específicos (Alberts et al., 2002; Abbas et al., 2012). La inmunidad innata está
presente en prácticamente todos los seres vivos y es considerada la primera línea de defensa, sin embargo,
carece de elementos altamente específicos para el reconocimiento de patógenos (Tortora et al., 2007).
Esta inmunidad consiste en barreras físicas y químicas, células fagocíticas y natural killer (NK), proteínas
2
circulantes y citocinas (Abbas et al., 2012; Paul, 2013). La inmunidad adaptativa surge evolutivamente en
los vertebrados, tiene una gran especificidad contra distintas moléculas y la capacidad de generar
memoria. Existen dos tipos de respuesta, una es celular mediada por linfocitos T y otra es humoral mediada
por linfocitos B. (Lodish et al., 2008; Abbas et al., 2012). Este tipo de inmunidad tiene la capacidad de
generar proteínas receptoras que reconocen con gran especificidad a un antígeno, estas proteínas se
conocen como inmunoglobulinas o anticuerpos.
Como se observa en la Figura 1 las primeras moléculas receptoras de antígeno descritas dentro de la
inmunidad adaptativa fueron los receptores variables de linfocitos (VLRs), presentes en las células del
sistema inmune de los agnatos (vertebrados no mandibulados). Con la aparición de los gnatostomados
(vertebrados mandibulados) surgen los receptores de antígeno convencionales (Cooper y Alder, 2006).
Dentro de los seres vivos mandibulados se encuentra el grupo de los elasmobranquios, el linaje
filogenético más antiguo (Figura 2) en presentar un sistema inmune adaptativo similar al que se ha descrito
en la actualidad (Smith et al., 2015).
1.1.2 Inmunoglobulinas
Los anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas especializadas capaces de activar distintas respuestas
en el organismo (Lodish et al., 2008). Estas moléculas son propias de los linfocitos B y pueden existir de
dos formas: anclados a la membrana celular (transmembranales) actuando en la activación de otras
células; o de secreción, forma en la cual se liberan al medio extracelular. Estas inmunoglobulinas son
responsables de las funciones efectoras de la respuesta humoral (Rumfelt et al., 2004).
Las inmunoglobulinas son producidas en los órganos linfoides primarios, están codificadas por segmentos
de genes (exones) separadas por regiones no codificantes (intrones). El reacomodo de estos segmentos
de genes durante la maduración de las células B resulta en la producción de proteínas funcionales (Bonilla
et al., 2016). La mayoría de las inmunoglobulinas, son proteínas formadas por dos cadenas ligeras (L) y dos
cadenas pesadas (H) dispuestos a manera de una “Y” (Figura 1). Ambas cadenas tienen una región amino
terminal variable (V), que participa en el reconocimiento de los antígenos; y únicamente la cadena pesada
presenta una región carboxilo terminal constante (C) que se encarga de mediar las funciones efectoras.
3
Figura 1.-‐ Estructura y componentes de una Inmunoglobulina. Esquema de una molécula de IgG de secreción. La zona de unión al antígeno se compone por los dominios VL y VH. Las regiones constantes (C) concluyen en el carboxilo terminal o pieza de cola (Abbas et al., 2012).
La región variable cuenta con tres segmentos llamados “regiones determinantes de complementariedad
(CDRs)” conocidos como CDR1, CDR2 y CDR3. Existe una mayor variación en la secuencia del CDR3 siendo
esta la región que desempeña el papel más importante en el proceso de unión al antígeno (Simmons et
al., 2006). Las diferencias que existen entre los diversos CDR3 de las inmunoglobulinas les proporcionarán
afinidad por un antígeno específico. (Abbas et al., 2012).
Según la estructura de los dominios constantes los anticuerpos se pueden dividir en distintos isotipos que
determinan la respuesta que se lleva a cabo al reconocer un antígeno (Abbas et al., 2012). En la Figura 2
se ilustran los isotipos presentes en distintos vertebrados (Smith et al., 2014).
4
Figura 2.-‐ Diversidad de isotipos de Inmunoglobulinas en vertebrados. Imagen modificada de Pettinello y Dooley 2014; Smith y colaboradores (2014). Relación filogenética entre vertebrados con distintos tiempos de divergencia (mostrado en millones de años) y la variación de isotipos de inmunoglobulinas presentes.
1.1.3 Inmunidad adaptativa en tiburones
Los tiburones junto con las rayas y mantas forman parte de los elasmobranquios, uno de los grupos
filogenéticos más antiguos que poseen sistema inmune adaptativo. Estos seres vivos no poseen una
medula ósea, por lo que se sugiere que utilizan como órganos linfoides primarios el órgano epigonal,
asociado con la gónada, y el de Leydig, asociado con el esófago, ya que se han encontrado factores de
transcripción específicos para células B y T, como RAG1 y TdT expresados en dichos órganos (Flajnik, 2002;
Smith et al., 2014). Los elasmobranquios poseen además los componentes distintivos del sistema inmune
adaptativo: i) inmunoglobulinas, ii) receptores de células T (TCR), iii) moléculas polimórficas de MHC de
clase I y clase II, iv) timo y órganos linfoides secundarios (Criscitiello et al., 2006).
5
Figura 3.-‐ Inmunoglobulinas de secreción y transmembranales encontradas en los elasmobranquios. Imagen tomada de Smith et al., 2014.
1.1.4 IgM
IgM (Figura 2) fue la primera inmunoglobulina que se logró identificar en tiburones y es el BCR
predominante conservado entre todos los vertebrados, además es la única clase de Ig encontrada en todos
los vertebrados mandibulados de manera universal. Esta se presenta a manera de pentámero o monómero
y puede ser de secreción o transmembranal (Figura 3).
1.1.5 IgW
Se cree que la inmunoglobulina IgW (Figura 2) se originó hace 450 millones de años en peces cartilaginosos
y se considera el antecesor de la IgD. Se presenta en distintas longitudes a manera de inmunoglobulina de
secreción o transmembranal (Figura 3). Esta inmunoglobulina se descubrió en elasmobranquios,
posteriormente se encontró en el pez pulmonado Protopterus annectens y finalmente en la rana africana
Xenopus tropicalis (Smith et al., 2014).
6
1.1.6 IgNAR
En 1995 se describió un nuevo miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas en el tiburón nodriza
(Ginglymostoma cirratum) actualmente conocido como IgNAR (Figura 2) (Greenberg et al., 1995; Diaz et
al., 1998). Los IgNAR, han sido identificados en varias especies de elasmobranquios incluyendo el tiburón
Heterodontus francisci (Nuttall et al., 2001; Simmons et al., 2006).
Las IgNAR son inmunoglobulinas de aproximadamente 73 kilodaltons (kDa) que poseen dominios variables
en sus cadenas pesadas, pero carecen de cadenas ligeras y constan de tres a cinco dominios constantes
(Simmons et al., 2006). Se presenta en distintas longitudes a manera de inmunoglobulina de secreción o
transmembranal (Figura 3). Aparte de los de elasmobranquios, se ha descrito hasta el momento la
presencia de una inmunoglobulina libre de cadenas ligeras en los camélidos, los cuales presentan
anticuerpos de tipo VHH (Roux at al., 1998). Se ha demostrado que los IgNAR tienen dominios variables
termoestables y de tamaño pequeño de aproximadamente 12 kDa (Simmons et al., 2006), lo que facilita
su difusión a través de los tejidos así como una rápida depuración del organismo, otra característica
importante que presentan las IgNAR es la ausencia del CDR2 y presencia de un CDR3 con una mayor
longitud que los CDR3 reportados en inmunoglobulinas de otras especies (Streltsov et al., 2004). En el 2005
se observó por primera vez una respuesta de IgNAR antígeno específica, así como también se reportó su
capacidad de desarrollar memoria inmunológica (Dooley et al., 2005). Por las características antes
descritas, se ha explorado la aplicación de estas inmunoglobulinas en lugar de los anticuerpos
convencionales como alternativas terapéuticas y de diagnóstico (Wesolowski et al., 2009; Griffiths et al.,
2013).
En el año 2000 se inició el estudio del tiburón H. francisci con un enfoque biomédico en Baja California.
Los trabajos realizados se enfocan en la búsqueda de fragmentos de IgNAR neutralizantes de diversas
toxinas, citocinas y enzimas. A partir de estos trabajos se ha logrado desarrollar un tratamiento contra
retinopatía en humanos y una prueba diagnóstica contra enfermedades infecciosas en ganado (Licea,
2016); actualmente se trabaja con la obtención de fragmentos de anticuerpo de tiburón por medio de
despliegue en bacteriófagos y el desarrollo de un anticuerpo anticitocinas (VEGF) para su uso en
tratamientos contra el cáncer en mascotas. El diseño de los oligonucléotidos para amplificar y generar las
bibliotecas de VNAR de H. francisci, fueron realizados en base a las secuencias descritas previamente para
el tiburón G. cirratum, por lo que estas secuencias no son específicas para H. francisci y se pueden estar
generando bibliotecas con potencial limitado al no amplificarse todos los genes de VNAR (Licea et al.,
2016).
7
1.1.7 Aplicación biomédica
Los anticuerpos monoclonales se han vuelto indispensables para técnicas de diagnóstico, terapias y
procedimientos biotecnológicos. Tan solo en 2014 se autorizó la comercialización de cinco anticuerpos
recombinantes terapéuticos y se han iniciado prácticas para su regulación en Estados Unidos y Europa. A
pesar del éxito en el mercado de los anticuerpos convencionales, su eficacia se ha visto comprometida en
algunos casos debido a la complejidad de su estructura. Para solventar este inconveniente y aumentar las
posibilidades terapéuticas y de diagnóstico, se han desarrollado nuevas alternativas biológicas como,
conjugados de anticuerpos con fármacos, inmunocitocinas, proteínas de andamiaje e incluso fragmentos
de anticuerpos (Krah et al., 2016). Como consecuencia de lo anterior, se ha generado el desarrollo de la
ingeniería de anticuerpos como línea de investigación.
A la par de la ingeniería de anticuerpos, se han llevado a cabo las investigaciones con anticuerpos de
camélidos y de elasmobranquios, ya que ambos grupos presentan inmunoglobulinas poco convencionales,
que contienen únicamente cadenas pesadas en las que el sitio de reconocimiento al antígeno esta dado
por un solo dominio, conocido en camélidos como VHH y en elasmobranquios como VNAR. En el caso
particular de los VNAR, presentan una alta especificidad por el antígeno, una gran estabilidad fisicoquímica
y un menor tamaño, lo que les facilita la penetración en distintos tejidos. También se ha demostrado que
existe una gran cantidad de opciones para modificar su estructura y función. Estas moléculas con alta
especificidad han sido aislados contra una gran cantidad de antígenos, incluyendo antígenos virales,
toxinas, citocinas e incluso proteínas relacionadas al cáncer y la artritis (Wesolowski et al., 2009).
Comúnmente, los genes de VNAR se obtienen por PCR, clonando el repertorio del dominio variable de
tiburones inmunizados y son seleccionados mediante la técnica de despliegue de fagos. Hasta el momento,
en el área biomédica, los VNAR, se han utilizado para el marcaje de enzimas de leucocitos y proteínas de
superficie de membrana, marcaje de citocinas y proteínas solubles e incluso como vacunas. En el área
terapéutica, los VNAR se han utilizado para neutralización de toxinas y venenos, moléculas tóxicas
pequeñas y haptenos, así como para el marcaje de virus, bacterias patógenas y parásitos, ya que han
demostrado tener la capacidad de neutralizar proteínas solubles extracelulares incluidas toxinas, citocinas
y componentes coagulantes de la sangre. Denotando el potencial de estos anticuerpos como agentes
antiinflamatorios y moduladores inmunológicos (Wesolowski et al., 2009).
8
El dominio VNAR consta de aproximadamente 12 kDa, lo que los convierte en el dominio de unión
independiente más pequeño que existe de forma natural en vertebrados. El primer dominio VNAR que se
desarrolló para uso clínico fue el dominio específico para HSA, aislado de una biblioteca del tiburón Squalus
acanthias, el cual tiene como finalidad aumentar la vida media de ciertas proteínas de fusión en suero
requeridas para fines terapéuticos (Krah et al., 2016).
Actualmente se han aislado y caracterizado un gran número de dominios VNAR para diversos antígenos
blanco obtenidos de distintas especies de tiburón incluyendo al H. francisci y Chiloscyllium plagiosum. Un
ejemplo de dominio VNAR probado en ensayos pre-‐clínicos es el del dominio anti-‐TNF, T43, aislado
originalmente del tiburón H. francisci inmunizado con la variante humana de esta citocina (Barelle y Porter
2015).
1.1.8 Heterodontus francisci
El tiburón Heterodontus francisci es un miembro de la familia Heterodontidae. Este tiburón se distribuye
en las costas de California, Baja California y el Mar de Cortés. Los tiburones de esta especie acostumbran
a ser depredadores nocturnos y solitarios. Usualmente no son agresivos con los humanos por lo que no se
consideran como animales peligrosos (Compagno, 2001).
Esta especie de tiburón fue descrita por primera vez en 1854, presentan ciertas características diagnósticas
para su identificación; dos aletas dorsales, cada una se encuentra provista de una espina en su borde
craneal, son de color gris a café con puntos obscuros y pequeños y tienen dos tipos de dientes: incisivos a
manera de ganchos pequeños y filosos, y dientes planos similares a los molares. Una vez alcanzada la edad
adulta pueden medir entre 1 y 1.5 metros (Compagno, 2001).
Los tiburones H. francisci alcanzan la madurez sexual entre los 4 y 7 años y presentan una reproducción
ovípara, en la cual la hembra pone dos huevos a la vez con intervalos de 11 a 14 días durante los meses de
febrero a junio (Castellanos, 2017). El periodo de incubación de los huevos varía entre 6 y 10 meses
dependiendo de la temperatura del agua (Compagno, 2001).
El aprovechamiento que se les ha dado varía, desde pesca incidental, explotación de subsistencia y captura
para exhibición en acuarios con fines educativos y ornamentales (Compagno, 2001).
9
Debido a las facilidades de manejo en cautiverio de esta especie de elasmobranquio y a la presencia de
anticuerpos de tipo IgNAR, el tiburón H. francisci se ha convertido en un objeto de estudio apto para
implementar técnicas de análisis genómico con el fin de enriquecer el conocimiento que se tiene de la
especie.
Dentro de las técnicas actuales, una de las más novedosas para el estudio de los anticuerpos es la
transcriptómica, ya que utiliza el total de la expresión de RNA mensajeros en un tejido y momento
particular.
1.1.9 Transcriptómica
El genoma es el conjunto completo de DNA de un organismo que incluye todos sus genes. Se puede utilizar
para estudiar varios aspectos de un organismo como la variación genética, además ayuda a describir los
genes y comprender su papel en la biología de un organismo (Barnes y Breen, 2010).
El transcriptoma es el conjunto completo de RNAs presentes en una célula, tejido u órgano en un momento
determinado (Haas et al., 2011). El estudio del transcriptoma nos permite conocer un subconjunto de
genes expresados, sin tener que estudiar el genoma completo.
La secuenciación masiva de RNA, nos ofrece la posibilidad de descubrir genes y transcritos de una manera
rápida y eficiente, así como evaluar la modificación en la expresión de los transcritos en un solo ensayo
(Haas et al., 2011) y al mismo tiempo, se crea un nuevo recurso de secuencias para usar en futuros trabajos
o investigaciones (Chana-‐Munoz et al., 2017).
La conservación e investigación de elasmobranquios se ve beneficiada al tener recursos moleculares bien
documentados y de fácil acceso, por lo que se estableció la Colaboración Internacional de Bases de Datos
de Secuencias de Nucleótidos (Wayffels et al., 2014). Esta colaboración está compuesta por tres
repositorios, DNA Data Bank of Japan (DDJB), European Molecular Biology Laboratory-‐ European
Bioinformatics Institute (EMBL-‐EBI) y GenBank en el National Center for Biotechnology Information (NCBI),
formados para colectar y compartir secuencias de DNA y RNA (Wayffels et al., 2014). A pesar de contar
con estos recursos, actualmente existe muy poca información sobre elasmobranquios en cuanto a
10
genómica y transcriptómica, por lo que resulta necesario realizar más estudios en estas áreas (Chana-‐
Munoz et al., 2017).
Actualmente se encuentran disponibles la secuencia genómica de Callorhinchus milii, Rhincodon typus,
Carcharodon carcharias, Scyliorhinus canicula y Leucoraja erinacea. En el campo de la transcriptómica se
cuenta con las secuencias de corazón de C. carcharias; cerebro, hígado, páncreas y un embrión de S.
canícula; timo y bazo de G. cirratum; de testículos, ovarios, músculo, riñones y branquias de C. mili (Marra
et al., 2017) y de cerebro, hígado y riñón de S. acanthias (Chana-‐Munoz et al., 2017).
1.2 Justificación
El interés del descubrimiento de nuevos fármacos y técnicas de diagnóstico por parte de la industria
farmacéutica nos ha llevado a una búsqueda constante de nuevas alternativas, en particular el
aprovechamiento de los anticuerpos IgNAR de tiburón, debido a sus características físicas de tolerancia
térmica y penetración de tejidos. No se conoce el potencial inmunológico humoral de H. francisci, ya que
las bibliotecas generadas pueden estar restringidas por el origen de los oligonucleótidos. Por lo anterior,
este trabajo tiene como finalidad evaluar el potencial del sistema inmune presente en el transcriptoma
del tiburón Heterodontus francisci con fines biotecnológicos y biomédicos, al desarrollar un catálogo para
facilitar el descubrimiento de inmunoglobulinas (IgNAR o algún otro tipo de inmunoglobulina de interés)
presentes en el tiburón.
1.3 Hipótesis
Al evaluar el repertorio inmunológico del tiburón Heterodontus francisci, se encontrarán secuencias
nuevas que no han sido amplificadas con el juego de oligonucleótidos empleados actualmente.
11
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
Identificar las secuencias que codifican para anticuerpos IgNAR del tiburón Heterodontus francisci
mediante el análisis de su transcriptoma a partir de muestras de sangre y bazo.
1.4.2. Objetivos específicos
Eficientizar la extracción de RNA a partir de muestras de sangre y bazo, tejidos involucrados en la respuesta
inmune del tiburón H. francisci utilizando diferentes métodos.
Construir dos bibliotecas o catálogos de secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR del tiburón H.
francisci a partir de muestras de sangre y bazo.
Evaluar la variabilidad de las secuencias presentes en la biblioteca construida a partir de la sangre y otra a
partir del bazo.
Reconocer la mayor cantidad de secuencias codificantes para inmunoglobulinas tipo IgNAR a partir del
transcriptoma obtenido.
Utilizar las secuencias obtenidas de las muestras de sangre y de bazo para generar un catálogo de IgNAR
presentes en el transcriptoma del tiburón H. francisci.
12
Capítulo 2. Metodología
2.1 Estandarización de metodología para separar células sanguíneas de tiburón Heterodontus francisci
Se obtuvieron muestras de sangre proveniente de organismos de la especie H. francisci y se probaron
distintas metodologías para la separación de células sanguíneas buscando hacer más eficiente el estudio
de leucocitos y eritrocitos en las muestras de tiburones. Algunas de estas metodologías se enlistan en la
Tabla 1. A continuación se describen las metodologías.
Tabla 1.-‐ Metodologías empleadas tradicionalmente para separar células sanguíneas.
Metodología de separación de componentes sanguíneos Referencia
Ficoll (Berthold, 1981)
Percoll (Ulmer, 1984)
Buffer de lisis (Strasser, 1998)
Agua libre de nucleasas (González com. pers., 2016)
2.1.1. Separación de células sanguíneas utilizando un gradiente de Ficoll
Se utilizó Ficoll con una densidad de 1.078gr/ml. En un tubo se agregaron Ficoll y sangre en proporción de
1:1, en donde la parte de Ficoll va abajo y se agregó la sangre cuidadosamente sobre esta. Se centrifugó a
4,500 rpm por 30 minutos a temperatura ambiente.
2.1.2. Separación de células sanguíneas utilizando un gradiente de Percoll
El Percoll se diluyó en una proporción de 1:1 en PBS 10x. Esta dilución se consideró como Percoll al 100%.
Se preparó un gradiente agregando en un tubo de 1 a 2 ml de Percoll en las concentraciones enlistadas en
la Tabla 2, procurando que la fase inferior fuera de mayor concentración y la superior la de menor
concentración. Una vez formado el gradiente, se agregó cuidadosamente la sangre de tiburón sobre la fase
de Percoll al 25%. Se centrifugó a 4,500 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente sin utilizar freno.
13
Tabla 2.-‐ Concentraciones de Percoll utilizadas para hacer un gradiente y su posición
Concentración de Percoll
Posición en el gradiente
25% Fase superior
30% Fase intermedia
35% Fase intermedia
40% Fase intermedia
50% Fase inferior
2.1.3. Separación de células sanguíneas utilizando buffer de lisis
Se inició preparando buffer de lisis combinando 8.3 g de cloruro de amonio (150 mM), 1 g de carbonato
de potasio (7.23mM), 37 mg de sal de EDTA (0.1mM) y 900 ml de agua destilada. Una vez disueltos, se
ajustó el pH a 7.2 y finalmente se volvió a agregar agua destilada hasta lograr un volumen final de 1 litro.
Se centrifugó la muestra de sangre a 10,000 rpm por 5 minutos a una temperatura de 4 °C. Al finalizar, se
decantó el sobrenadante y se removió la mayor cantidad de eritrocitos posibles, quedándonos únicamente
con el botón del paquete celular. Se realizó un lavado con buffer de lisis, para lo que se agregó 1 ml a la
muestra y se volvió a centrifugar a 10,000 rpm por 5 minutos a 4 °C. Finalmente se decantó el
sobrenadante.
2.1.4. Separación de células sanguíneas utilizando agua libre de nucleasas
Se centrifugó 3 ml de sangre a 10,000 rpm por 10 minutos a una temperatura de 4 °C. Al finalizar, se
decantó el sobrenadante y se removió la mayor cantidad de eritrocitos posibles, quedándose únicamente
con el botón del paquete celular. Se realizó un lavado con agua libre de nucleasas, para lo que se agregó 1
ml a la muestra y se volvió a centrifugar a 10,000 rpm por 3 minutos a 4 °C. Finalmente se decantó el
sobrenadante.
14
2.1.5. Conteos celulares
Se realizaron conteos celulares a partir de las células obtenidas utilizando los métodos por separación con
buffer de lisis y agua libre de nucleasas. Se hizo una dilución de 1:10 con azul de tripano y se cargó un
volumen de 10 μL en una cámara de Neubauer.
2.2. Selección e inmunización de tiburones Heterodontus francisci
Se utilizaron cuatro tiburones, dos machos y dos hembras, a manera de réplica de la especie H. francisci
mantenidos en cautiverio en estanques con agua de mar con oxigenación constante. Se reporta que existe
una relación entre la cantidad de anticuerpos IgNAR antígeno específicos con el número de exposiciones
que tuvieron a éstos, especificando que la mayor expresión de IgNAR se logra con 4 inmunizaciones (De
Silva et al., 2017). Un macho y una hembra fueron inoculados con 500 μL de adyuvante completo de Freund
en 4 dosis distribuidas en un lapso de 42 días. La inmunización se realizó por medio de una inyección
intramuscular en el músculo epaxial como se observa en la Figura 4. Posteriormente se sacrificaron los
tiburones por medio de eutanasia.
Figura 4.-‐ Inmunización de tiburón H. francisci. La inmunización se lleva a cabo una inyección de adyuvante completo de Freund por vía intramuscular en el músculo epaxial.
2.3. Muestreo de sangre y bazo en tiburón Heterodontus francisci
En el momento que se realizó la eutanasia a los tiburones, se colectó el mayor volumen de sangre posible
e inmediatamente se llevó a cabo el método de separación de células utilizando buffer de lisis. Al mismo
tiempo, se realizó la disección de los tiburones y se extrajo el bazo el cual fue homogenizado
15
inmediatamente con Trizol (Ambion de Life Technologies) y mantenido en frio hasta que se terminó con
la separación de las células sanguíneas.
2.4. Extracción y cuantificación de RNA
2.4.1. Extracción de RNA con TRIzol
Se extrajo RNA de las muestras de sangre y de bazo del tiburón H. francisci por medio de Trizol (Ambion
de Life Technologies) siguiendo las recomendaciones del fabricante tanto para tejidos como para células
en suspensión.
De cada tiburón se obtuvieron 5 gr de bazo y 27 ml de sangre, enseguida se agregaron 1 y 15 ml de TRI
respectivamente y se dejaron 5 min a temperatura ambiente. Se agregaron 0.2 ml de cloroformo a la
muestra de bazo y 3 ml del mismo a la muestra de sangre, se agitaron vigorosamente en el mezclador de
vórtice por 15 segundos y se dejaron a temperatura ambiente por 10 minutos.
Ambas muestras (sangre y bazo) se centrifugaron a 12,000 x g por 10 minutos a 4 °C. Las muestras se
separaron en 3 fases de distintas densidades: una fase acuosa (contiene RNA) en la superficie, una fase
intermedia (contiene DNA) y una fase orgánica de color rojo (contiene proteínas). Se obtuvieron 12.5 ml
de fase que contenía RNA de la muestra de bazo y 1.5 ml de la muestra de sangre.
La fase acuosa de cada muestra fué trasferida a dos tubos en donde se les agregó 0.5 ml isopropanol a la
de bazo y 7.5 ml a la de sangre, enseguida se agitaron e incubaron a temperatura ambiente por 10 minutos.
Se centrifugaron a 12,000 x g por 10 minutos a 4 °C. Una vez que se formó el botón en el fondo del tubo,
se removió el sobrenadante, se lavó el botón de RNA usando 1 y 15 ml de etanol 75% para la muestra de
bazo y sangre respectivamente, se mezcló mediante vortex y se centrifugó a 7,500 x g por 5 minutos a 4
°C. Posteriormente el alcohol remanente se decantó y dejó secar a temperatura ambiente de 5 a 10
minutos.
El RNA obtenido de bazo y sangre se resuspendió en 1 ml y 50 μL de agua libre de nucleasas
respectivamente y se almacenaron a -‐80º C.
16
2.4.2. Cuantificación de RNA extraído
Se utilizó un Nanodrop (Thermo Scientific) para medir de manera rápida la pureza del RNA y cuantificar el
RNA extraído de cada muestra, también se corrió un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio para
observar la integridad del RNA.
La preparación del gel se realizó utilizando 50 ml TAE 1x, agarosa al 1% y 7 μL bromuro de etidio. Las
muestras también se prepararon y fueron calentadas a 70 °C por un minuto antes de cargarse en el gel, se
utilizó una escalera de DNA de 1kb y se dejó correr a 80 Voltios durante 60 minutos. Al terminar, se
visualizó el gel utilizando un fotodocumentador con luz UV E-‐Gel Imager (Life Technologies).
Para realizar una cuantificación más exacta y estimar el número de integridad de RNA (RIN), se utilizó el
kit de Nano6000 del Bioanalyzer (Agilent) con un Chip Nano para RNA, para evaluar todas las muestras de
RNA de los tiburones al mismo tiempo.
2.5. Preparación de la muestra para secuenciación
Primero, se eliminaron la mayor cantidad de RNA ribosomal de las muestras de sangre y del bazo de los
tiburones inmunizados, para esto, se utilizaron los kits Low Input RiboMinus Eukariote System v2 y
RiboMinus Eukariote System v2 de Ambion, en ambos casos siguiendo las recomendaciones del fabricante.
2.6. Construcción de bibliotecas
Se utilizó el kit Ion Total RNA-‐Seq v2 siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este proceso constó
de la fragmentación del RNA por medio de la utilización de RNasas y posteriormente se llevó a cabo un
proceso de purificación. Una vez obtenidos estos fragmentos se utilizó solución de hibridación y
adaptadores para hibridar y ligar el RNA por medio de PCR. Posteriormente se llevó a cabo la transcripción
reversa (RT) para obtener cDNA. Este cDNA se amplificó por PCR utilizando a manera de oligonucleótidos
los códigos de barra del BC01-‐BC08 de Ion Xpress RNA-‐Seq Barcode BC primer. Finalmente se purificó el
cDNA amplificado y se analizó con el Bioanalyzer. Para la preparación de los templados se empleó el kit
17
Ion PGM Hi-‐Q Chef y a su vez se utilizó el sistema de Ion Chef de Ion Torrent. Finalmente se verificó el
tamaño del inserto utilizando nuevamente el Bioanalyzer.
2.7. Secuenciación del transcriptoma
Se secuenciaron las muestras utilizando la plataforma Ion PGM de LifeTechnologies debido a su capacidad
de evaluar fragmentos de 400 pares de bases. Estos fragmentos son útiles en proyectos de secuenciación
de RNA, ya que nos permiten descubrir o detectar isoformas y transcritos novedosos.
Se analizó la calidad de las secuencias obtenidas utilizando el programa FastQC, ya que realiza gráficas
evaluando la calidad de las secuencias por base, contenido de bases por secuencia y contenido GC. Al
finalizar se obtuvo un archivo de salida con el formato “fastq”; el cual tiene las secuencias previamente
filtradas sin primers y con un control de calidad (Phred superior a 20) (Tabla 3).
Tabla 3.-‐ Determinación de la calidad de secuencia utilizando el puntaje de Phred
Puntaje de Phred Probabilidad de error en
la predicción de una base
Porcentaje de precisión
en la predicción de bases
10 1 en 10 90%
20 1 en 100 99%
30 1 en 1,000 99.9%
40 1 en 10,000 99.99%
50 1 en 100,000 99.999%
2.8. Ensamblaje y análisis
2.8.1 Acceso al servidor
Se solicitó una cuenta y se accedió al servidor omica por medio de la terminal (command prompt) del
ordenador utilizando línea de comando para Mac OS X (Anexo 1). Se accedió al servidor OMICA de CICESE,
ya que cuenta con 22 CPUs y 120 GB de memoria para poder llevar a cabo el procesamiento de las
secuencias.
18
2.8.2 Carga y descarga de archivos al servidor
Se instaló el programa FileZilla para facilitar las tareas de visualización, edición, carga y descarga de
archivos entre la computadora y el servidor omica disponible para este tipo de análisis en CICESE.
Se cargaron los 6 transcriptomas .fastq obtenidos a partir de la secuenciación de las muestras de bazo y
sangre de los tiburones a una carpeta generada dentro del servidor OMICA de CICESE, donde se creó un
transcriptoma de referencia en el que se incluyeron los 6 transcriptomas previamente secuenciados, para
esto se utilizó el comando Cat dentro de la terminal (Anexo 1).
2.8.3 Formato .slrm
Se creó un archivo con formato .slrm en donde se incluyen los criterios básicos para el uso de un programa
dentro del servidor a manera de templado (Figura 5).
Figura 5.-‐ Criterios básicos incluidos en archivo .slrm: 1) Nombre de partición 2) Nombre de tarea 3) Archivo de error 4) Registro de tarea 5) Tiempo máximo de ejecución 6) Número máximo de nodos.
2.8.4 Ensamblaje de novo del transcriptoma
Para esto se utilizó la paquetería Trinity (Grabher et al., 2011), esta nos permite ensamblar el
transcriptoma utilizando tres módulos: Inchworm, Chrysalis y Butterfly. Inchworm convierte cada lectura
en k-‐meros permitiendo la construcción de contigs iniciales. Chrysalis agrupa los contigs y construye
19
gráficas las cuales son simplificadas cuando es posible por Butterfly. Para poder utilizar este programa, se
creó un archivo .slrm con las especificaciones mostradas en la Figura 6.
Figura 6.-‐ Contenido de archivo .slrm para ensamblaje De Novo con Trinity: Azul marino) ruta del programa, Verde) tipo de formato, Morado) máximo de memoria disponible, Naranja) sentido (en el caso de solo tener un sentido de la secuencia se pone single, si se tiene “pair end” se especifica left y right con la respectiva ruta de cada archivo) de la secuencia y su ruta, Rojo) CPU disponibles, Azul Claro) comando para que Trinity no utilice Bowties ya que es secuenciación De Novo.
Se modificó el archivo .slrm para cada una de los 7 transcriptomas. Para que corra en el servidor se debe
insertar el comando sbatch (Anexo 1) seguido por el nombre del archivo que se desea utilizar. Al finalizar
las corridas se obtuvieron archivos de salida en formato .fasta, estos archivos son los transcriptomas
ensamblados.
2.8.5 Obtención de una base de datos preexistente
Una vez ensamblados los transcriptomas, se descargó la base de datos de Swiss-‐Prot disponible en Uni-‐
Prot para poder utilizar este archivo, fue necesario aplicarle formato de base de datos una vez que se cargó
al servidor. Esto se llevó a cabo creando un archivo .slrm como el que se muestra en la Figura 7.
20
Figura 7.-‐ Archivo .slrm para darle formato de base de datos a un archivo .fasta. Incluye la ruta del programa a utilizar (formatdb de BLAST), la ruta del archivo que se desea modificar y el tipo de base de datos que se busca crear ( -‐p de proteína).
2.8.6 BLAST y Blast2Go
Para poder realizar una comparación entre uno o más transcritos con las secuencias contenidas en una
base de datos se utilizó BLAST (Altschul et al., 1990), ya que es la estrategia más ampliamente usada y
confiable para buscar similitudes entre secuencias y caracterizarlas (Pearson, 2013). BLAST (por sus siglas
en inglés) es la herramienta de búsqueda de alineación local básica, que se encarga de comparar
secuencias de nucleótidos y proteínas con las bases de datos de secuencias (Altschul et al., 1990). Debido
a la naturaleza de los datos obtenidos se optó por utilizar BLASTX, esta herramienta nos permite comparar
secuencias de nucleótidos que serán traducidos a secuencias de amino ácidos y compararlos con una base
de datos de proteínas.
Se corrió un BLASTX (Figura 8) con la base de datos de Swiss-‐Prot para cada transcriptoma con la intención
de identificar la mayor cantidad de secuencias que coincidieran con proteínas reportadas. Se eligió .xml
como formato para los archivos obtenidos de BLAST (Altschul et al., 1990), ya que es compatible con el
programa Blast2Go que nos permite realizar la anotación funcional de proteínas, así como facilitar el
manejo y búsqueda de información de las secuencias.
21
Figura 8.-‐ Archivo formato .slrm para correr un BLASTX. Se debe incluir la ruta del programa, la ruta del archivo al cual se le quiere realizar el BLAST (Altschul et al., 1990), la ruta de la base de datos que se va a utilizar, el evalue, cantidad de "threads" disponibles, máximo de alineaciones a guardar y el formato y nombre del archivo de salida.
El archivo con los hits de BlastX fue utilizado para recuperar la anotación funcional con el software
Blast2GO (Götz et al., 2008), utilizando la base de datos de Ontología de Genes (GO, por sus siglas en
inglés), con los parametros recomendados por el programa (Figura 9). Estas ontología puede ser función
molecular, componente celular o proceso biológico.
Figura 9.-‐ Flujo de trabajo para ver ontología de genes en Blast2Go (Götz et al., 2008)
22
2.8.7 Creación de base de datos en NCBI
A su vez, se creó una nueva base de datos a partir de 51 secuencias reportadas en la NCBI para anticuerpos
IgNAR, tanto transmembranales como de secreción partiendo de 6 especies de elasmobranquios:
Ginglimostoma cirratum, Triakis scyllum, Squalus acanthias, Orectolobus maculatus, Scyliorrhinus canicula
y Rhinobatos productus y a manera de grupo externo, una secuencia de anticuerpo VHH en Lama pacos.
Para crear la base de datos en formato .fasta en la base de datos de NCBI, se seleccionaron las secuencias
de interés y en la parte inferior de la página aparece la opción de send to, se elige la opción archivo y el
formato FASTA.
2.8.8 Extracción de secuencias codificantes para IgNAR presentes en el transcriptoma
Se corrió un BLASTn con la base de datos de secuencias de nucleótidos de IgNAR creada en el apartado
6.8.7; esto con el fin de encontrar las secuencias de nucleótidos de los anticuerpos en los transcriptomas
obtenidos. Se seleccionaron los transcritos con una longitud mínima de 800 pares de bases y se creó un
listado o catálogo a partir de sangre, otro de bazo y uno total. A su vez, los resultados del blast se abrieron
en el programa Blast2Go (Götz et al., 2008) para visualizar la clave de las secuencias que presentaron
homología con aquellas presentes en la base de datos. Por medio de estas claves se localizaron y
extrajeron las secuencias dentro del transcriptoma para crear un nuevo archivo .fasta.
Figura 10.-‐ Árbol filogenético neighbor-‐joining de distintos elasmobranquios. Obtenido en MEGA7 (Kumar et al., 2015) utilizando las secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR más representativas de cada especie incluida en la base de datos, usando como grupo externo la secuencia de VHH de Lama pacos.
23
2.8.9 Traducción de las secuencias de nucleótidos de IgNAR
Se creó una base de datos con secuencias completas de amino ácidos de IgNAR provenientes de distintas
especies de tiburones, esto con el fin de determinar el marco de lectura más probable de las secuencias
de nucleótidos obtenidas. Se corrió un BLASTx del archivo .fasta creado en el punto 6.8.8 contra la base y
posteriormente se abrió el archivo resultante en el programa Blast2Go (Götz et al., 2008). Se abrió cada
secuencia y eligió la opción de ver la secuencia, esta se copió a un archivo en formato .fasta. Se repitió el
proceso hasta tener las secuencias de amino ácidos de todos las transcritos codificantes para IgNAR
encontradas en los transcriptomas.
2.8.10 Alineación de secuencias
Las secuencias de amino ácidos se alinearon empleando el programa Jalview utilizando secuencias
completas de IgNAR de S. acanthis, G. cirratum y O. maculatus como referencia para poder identificar los
dominios variables y constantes de estas inmunoglobulinas y encontrar regiones conservadas dentro de
las secuencias. Finalmente se buscaron las secuencias de nucleótidos que resultarían en estas regiones
conservadas de amino ácidos utilizando BLAST (Altschul et al., 1990) como herramienta.
24
Capítulo 3. Resultados
3.1. Separación de células sanguíneas
Al comparar el uso de gradientes (Ficoll y Percoll) contra centrifugación directa (Buffer de lisis y agua libre
de nucleasas). Se encontró que la muestra de sangre no se comportó de manera esperada según la
literatura en el gradiente de Ficoll ya que esta se coagulaba y no atravesaba el gradiente. En el gradiente
de Percoll la muestra se dividía en varias fases por densidades, en machos se formaban 4 fases y en
hembras 5 fases. Se desconoce qué poblaciones celulares se encuentran localizadas en cada fase y se corre
el riesgo de perder alguna población de leucocitos.
Al comparar los conteos celulares obtenidos a partir de muestras de sangre de tiburón tratadas con agua
libre de nucleasas y buffer de lisis, se encontraron mayores concentraciones celulares por mililitro
utilizando el buffer de lisis como se puede ver en la Tabla 4.
Tabla 4.-‐ Conteos celulares en muestras sanguíneas tratadas con agua libre de nucleasas y buffer de lisis.
Agua Buffer de lisis
Macho inmunizado 4.6 millones por ml 38 millones por ml
Hembra inmunizada 1 millón por ml 20 millones por ml
Macho no inmunizado 2.7 millones por ml 35 millones por ml
Hembra no inmunizada 1 millón por ml 30 millones por ml
3.2. Extracción de RNA
3.2.1. Concentraciones y pureza de RNA extraído
Se utilizó un Nanodrop (Thermo Scientific) para la evaluación inicial de concentraciones de RNA, así como
pureza de la extracción dando los siguientes resultados encontrados en la Tabla 5.
25
Tabla 5.-‐ Evaluación de concentraciones y pureza de RNA extraído de muestras de sangre y bazo en distintos organismos
Animal Muestra A260/A280 Concentración
Hembra inmunizada Bazo 2.12 1525.4 ng/ μL
Hembra inmunizada Sangre 2.09 430.0 ng/ μL
Hembra no inmunizada Bazo 2.13 2456.8 ng/ μL
Hembra no inmunizada Sangre 2.07 1743.9 ng/ μL
Macho inmunizado Bazo 2.15 1694.3 ng/ μL
Macho inmunizado Sangre 2.27 637.5 ng/ μL
Macho no inmunizado Bazo 1.81 2576.8 ng/ μL
Macho no inmunizado Sangre 2.18 1704.5 ng/ μL
3.2.2. Integridad de RNA extraído
Para evaluar la calidad del RNA y asegurar que este no estuviera degradado se utilizó un
fotodocumentador con luz UV E-‐Gel Imager (Life Technologies) permitiendo visualizar las bandas que
aparecieron en el gel de agarosa al 1%. Se utilizó una escalera de DNA 1 kb como referencia y en la Figura
11 se pueden observar las bandas pertenecientes al 18S y 28S.
Figura 11.-‐ Electroforesis de RNA. Gel de agarosa al 1% con muestras de RNA de sangre y bazo de tiburón Heterodontus francisci a 80V por una hora.
26
Se utilizó el kit de Nano6000 del bioanalizer (Agilent) con un Nano Chip RNA para evaluar las muestras
obtenidas. En la Figura 12 se pueden observar las bandas 18S y 28S del RNA y se obtuvo un número de
integridad de RNA de 9.3 en una muestra de bazo y de sangre.
Figura 12.-‐ Electroforesis por Nano Chip RNA. RNA extraído de muestras de sangre y bazo de tiburón H. francisci.
3.3. Eliminación de RNA ribosomal, construcción de bibliotecas de cDNA y preparación de templetes.
Al llevar a cabo el proceso de la eliminación de RNA ribosomal se realizó una evaluación antes y después
por medio del Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer. De esta manera se verificó que disminuyera la
concentracion de este tipo de RNA al observar el cambio enlos picos de 18S y 28S en cada muestra. Una
vez realizado este proceso se evaluaron nuevamente utilizando el Bioanalyzer (Figura 13), en donde a
27
partir de las concentraciones de cDNA y volumen disponible de cada muestra y siguiendo el criterio que
indica que menos del 50% de este DNA esté en el rango de 50-‐160 pares de bases.
Figura 13.-‐ Lectura del Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer de las concentraciones de cDNA amplificado obtenido en cada muestra. H: hembra, M: macho, S: inmunizado, N: no inmunizado.
Para la preparación de templados se continuó con las muestras de bazo y sangre de la hembra inmunizada,
el bazo del macho sin inmunizar y un pool de las muestras de sangre de la hembra inmunizada, macho
inmunizado y macho sin inmunizar. Para la secuenciación de éstas librerías, fueron utilizados cuatro chips
(Tabla 6).
Tabla 6.-‐ Chips utilizados para la secuenciación de muestras obtenidas a partir de bazo y sangre de tiburón H. francisci.
Chip Tipo de Muestra
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1 Bazo de hembra no inmunizada
2 Sangre de hembra no inmunizada
3 Bazo de macho inmunizado
4
Sangre macho no inmunizado
Sangre hembra inmunizada
Sangre macho inmunizado
3.4. Secuenciación
Una vez que se llevó a cabo la secuenciación empleando el PGM de Ion Torrent, se utilizaron aquellas
lecturas con un valor Phred (Q) superior a 20 (esto significa que la probabilidad de error de cada base
secuenciada es de 0.01). En la Tabla 7 se pueden ver los resultados del total de bases obtenidas a partir de
cada muestra, cuantas de estas tiene una Q superior a 20, el total de lecturas obtenidas y el tamaño
promedio que tuvieron. En este caso se puede observar que las muestras de hembras brindaron una mayor
cantidad de lecturas que los machos.
Tabla 7.-‐ Resumen de resultados obtenidos a partir de la secuenciación utilizando el PGM de Ion Torrent.
Tipo de Muestra N Total de bases
Bases Q>20
Total de lecturas
Tamaño promedio de lectura
Bazo Hembra no inmunizada 996 M 701 M 6.1 M 162 pb
Sangre Hembra no inmunizada 1.22 G 1 G 6.1 M 197 pb
Bazo Macho inmunizado 606 M 440 M 4.6 M 129 pb
Sangre Macho no inmunizado 245 M 220 M 1.6 M 149 pb
Sangre Hembra Inmunizada 618 M 542 M 3.6 M 169 pb
Sangre Macho Inmunizado 141 M 123 M 0.7 M 180 pb
29
3.5 Ensamblaje de novo
Al terminar el ensamblaje de novo de los siete transcriptomas se identificaron distintas cantidades de
genes y transcritos a partir de cada muestra (Tabla 8). Se encontró una mayor cantidad de genes y
transcritos en las muestras de hembras que de machos.
Tabla 8.-‐ Genes y transcritos encontrados en cada transcriptoma después de ser ensamblados.
Tipo de Muestra Genes Transcritos
Bazo Hembra No Inmunizada 87093 87788
Sangre Hembra No Inmunizada 266500 278394
Bazo Macho Inmunizado 49245 49741
Sangre Macho Inmunizado 36082 36342
Sangre Hembra Inmunizada 152657 153942
Sangre Macho No Inmunizado 62356 63434
3.6 Ontología de genes
La ontología de los genes encontrados en cada transcriptoma se graficó para ver distribución de las
secuencias identificadas. Otra función que cumple este tipo de análisis es la de validar el transcriptoma
ya que se pueden encontrar secuencias de genes conservados en vertebrados. En la Figura 14 podemos
observar que un fragmento de los transcritos totales pertenece a procesos del sistema inmune, por lo cual
se continuó con la búsqueda de secuencias codificantes para anticuerpos de cadena sencilla.
30
Figura 14.-‐ Ontología de genes de procesos biológicos. Clasificación de los transcritos en el transcriptoma de referencia del tiburón H. francisci en procesos biológicos según su homología y ontología de genes con las proteínas reportadas en Uni-‐Prot.
3.7 Secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR
En la tabla 9 se muestran el numero de transcritos que coinciden con las secuencias de anticuerpos IgNAR,
la especie homologa y el tamaño de la frecuencia. La mayoría de los transcritos del tiburón Heterodontus
francisci presentaron homología con secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR del tiburón Squalus
acanthias. En el caso del bazo se sigue observando el patrón general en el cual las hembras presentaron
mayores resultados que los machos. Comparando los resultados de la hembra no inmunizada, se puede
observar que el bazo tuvo mayor cantidad de secuencias con hits, pero estas fueron de menor tamaño que
las secuencias encontradas en la sangre. No se encontraron secuencias codificantes para anticuerpos
IgNAR en los transcriptomas de la sangre de la hembra inmunizada, sangre de macho no inmunizado y
sangre de macho inmunizado (Tabla 9 ), posiblemente debido a las bajas concentraciones de material
genético que se lograron secuenciar.
31
Tabla 9.-‐ Resultados del BLASTn entre los transcriptomas obtenidos en este trabajo y la base de datos creada en el punto 6.8.7 de la metodología descrita.
Las secuencias de nucleótidos mayores a 800 pares de bases encontradas en los transcriptomas están
incluidas en los Anexos dependiendo del tipo de muestra (muestras de bazo Anexo 2.1, sangre Anexo 2.2
y las que corresponden al transcriptoma de referencia Anexo 2.3. Se obtuvieron secuencias de anticuerpos
tanto transmembranales como de secreción. Sin embargo, únicamente la muestra de sangre presentó
anticuerpos de secreción.
Se tradujeron las secuencias de nucleótidos a secuencias de amino ácidos. Las secuencias obtenidas en los
trasncriptomas son fragmentos, por lo cual se alinearon las secuencias que se distribuyen a lo largo de los
dominios de las secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR (Figura 15). Se utilizaron las secuencias
tomadas de la base de proteínas de NCBI de tres especies de tiburones. En la Figura 15 se ilustran los
dominios, cisteínas conservadas, triptófanos conservados y sitios de N-‐glicosilación propuestos por
Simmons y colaboradores (2006) y Feige y colaboradores (2013).
Se obtuvo una secuencia conscenso para el tiburón H. francisci (Figura 15):
LGADLTCCFASSLLTYADGAWHRCLTVNSGLPPAPPTINLLYSATDELRIKGLVQLFCASSVNTSQKALQSAGRRMETPYS
Transcriptoma Hits Tamaño de secuencias
Secuencias >800 pares de
bases
Referencia 52 51 Squalus acanthias 1 Scyliorhinus canicula
217-‐1292 pb 3
Bazo hembra no inmunizada
22 21 Squalus acanthias 1 Triakis scyllium
231-‐890 pb 1
Bazo macho inmunizado 12 11 Squalus acanthias 1 Scyliorhinus canicula
212-‐1309 1
Sangre hembra no inmunizada
14 14 Squalus acanthias
238-‐2118 7
Sangre hembra inmunizada
0 -‐ 0
Sangre macho no inmunizado
0 -‐ 0
Sangre macho inmunizado 0 -‐ 0
32
LAFTTTSPTKTSNGDFSSRSILKPLQEWSSGSVYSCQVSHSATNSVQRKDIRSKSEITVFLRDPSIEDIWINKTAALLCEVVS
TVPTEIAISWTVDGKMRIEGVQIEAATKDGNQYLTISRLTSSVEEWDSGVEYSCSAHGGQSSNPVTKQTRKTKVEPIQPK
VRKVRLLPPSPEEIQNTSTAILTCLIRGFYPDKITVSWEKDGVALNSNVTSFPTALEQDQSFSTSSLLILPAAEWKKGETYTC
SASHPPSDSTVKRAISKPKDDCHEADISVNILNPRFEEIWTQRTATIVCEILYSDLESVIVSWQVDGSGKTEGVETQSPEW
NGSKFAUVSKLKVTAAEWDSGVEYVCFIEDSELPTPVKTSTRKVKVGEMHPPKVYVLLPSAEEIGTEQTATLVCLVTGFYP
AEIYIAWMANDTLLDSGSPSQAEIEKRNGSSSIASRLKLTAVEWNSGTTYTCLVGHPSLQRDLRRSINKSYGKPTSVNVSL
VLSDSVKSCT
33
FR 1 CD
R1
FR 2 HV 2
FR 3 HV 4
FR 3 CD
R3
FR 4
1 1 2 3 1 1 1 2 2 3 3 4 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 4 4 4
Figura 15.-‐ Alineamiento de secuencias. Creada utilizando Jalview (Waterhouse et al.,2009) en donde se comparan tres secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR de distintas especies de tiburón con secuencias de los transcriptomas creados en este trabajo. Cada recuadro horizontal representa un dominio, siendo el rojo el variable (Wesolowski et al. 2009) y los negros los constantes. Resaltado en rojo se encuentran posibles sitios conservados de N-‐glicosilación y en azul las cisteínas con el potencial para participar en enlaces disulfuro entre cadenas (Simmons et al. 2006). En los recuadros delineados con azul se resaltan las cisteínas que se cree forman puentes disulfuro en los dominios constantes. En los recuadros delineados con amarillo se resaltan los triptófanos conservados (Feige et al. 2013).
34
Capítulo 4. Discusión
En este trabajo se llevó a cabo la secuenciaron del transcriptoma del tiburón Heterodontus francisci. Se
utilizaron cuatro ejemplares, incluyendo variables como sexo, inmunizados, sin inmunizar y muestras de
distintos tejidos, para lograr una cobertura más completa de los genes que expresa la especie. De esta
manera, generando una herramienta de consulta para futuras investigaciones tanto en inmunología como
en otras áreas de interés biológico.
Los eritrocitos de tiburón son células nucleadas con material genético y una densidad celular similar a la
de los leucocitos, además, la alta osmolaridad de su sangre provoca que sea inapropiado el uso de
metodologías empleadas para separar los componentes sanguíneos de mamíferos. Se compararon
distintas metodologías reportadas para la separación de leucocitos y eritrocitos buscando aquella que
resultara en una mayor concentración de leucocitos. Smith y colaboradores (2014) han reportado que con
variaciones en la velocidad de centrifugado es posible separar ambos tipos celulares, basados en dichos
procedimientos se utilizó una centrifugación de alta velocidad y de forma complementaria un lavado con
buffer de lisis para finalmente obtener un botón celular de leucocitos con el cual se pudo realizar
adecuadamente este trabajo.
Al no contar con un genoma de referencia para esta especie, se llevó a cabo un ensamble de novo, para
esto, se utilizó el ensamblador Trinity. Los resultados mostraron un promedio de 111, 606 transcritos por
transcriptoma. Este valor es comparable con otros estudios realizados en peces en los que se han obtenido
promedios de 132,985 y 121,517 transcritos por transcriptoma (Chana-‐Munoz et al., 2017; Marra et al.,
2017).
Se analizó la ontología de los transcritos obtenidos con la base de datos de SwissProt, en donde se
encontró un promedio de 46,349 coincidencias con alguna proteína con función reportada, siendo que en
otros trabajos realizados con transcriptomas de elasmobranquios se han obtenido en promedio 42,380 y
11,120 (Chana-‐Munoz et al., 2017; Marra et al., 2017). A pesar de que se encontraron 5,179 transcritos
relacionados con procesos del sistema inmune, únicamente se pudo detectar una secuencia relacionada a
un IgNAR. Lo que indica la necesidad de tener una mayor identificación de dominios de estos anticuerpos
a través de estudios desde un punto de vista genómico (Marra et al., 2017).
El siguiente paso fue realizar una búsqueda utilizando las secuencias que codifican para IgNARs en la base
de datos de nucleótidos de NCBI ya que es menos específica que SwissProt. Se encontraron un total de
35
100 secuencias dentro de los siete transcriptomas que coincidían con IgNARs, de las cuales 97% de ellas
coincidieron con aquellas presentes en la base de datos para S. acanthias. De estas, 34 secuencias fueron
obtenidas de bazo y 14 de sangre; 36 secuencias de hembra sin inmunizar y 12 de macho inmunizado. Por
la naturaleza de los cebadores, los parámetros y el modo en el que se realizó la secuenciación, se
obtuvieron secuencias parciales; teniendo eso en consideración, se seleccionaron las secuencias que
rebasaban las 800 pares de bases. Se tradujeron las 12 secuencias con mayor longitud y se alinearon
utilizando tres secuencias de aminoácidos provenientes de las siguientes especies de tiburones: S.
acanthias ya que es la especie con la que presentó mayor homología, G. cirratum por ser un organismo
modelo y Orectolobus maculatus como referencia para delimitar los dominios de IgNAR publicados por
Simmons y colaboradores (2006).
Observaciones de Marra y colaboradores (2017) señalan que las diferencias genéticas en el sistema
inmune adaptativo de los elasmobranquios no solo existen a nivel genómico, sino que además pueden
observarse a nivel transcriptómico entre especies o grupos de especies. En este proyecto se encontró que
existen diferencias entre las regiones constantes de los anticuerpos IgNAR, no solo entre especies, pero
dentro de un mismo individuo se pueden observar varios subtipos apoyando la observación de los autores.
Se utilizó el trabajo de Wesolowsky y colaboradores (2009) para identificar las regiones que conforman a
los VNAR y se logró identificar una secuencia con dos cisteínas en el marco de referencia 1 (FR1) una no
conservada y otra conservada; y otra no conservada en el marco de referencia 4 (FR4). Podemos suponer
entonces que este VNAR es de tipo I (Barelle y Porter 2015; Zielonka et al., 2015). En el 2015 Zielonka y
colaboradores publicaron que los IgNAR con región variable tipo I solo se han identificado en el tiburón G.
cirratum. Esto podría significar la primera evidencia de un VNAR tipo I en el Heterodontus francisci. A su
vez, la secuencia CLTVN encontrada en el FR4 se puede utilizar para el diseño de oligonucleótidos
específicos para este tipo de VNAR de tiburón H. francisci.
Los IgNAR tienen regiones conservadas que comparten incluso con imunoglobulinas de tipo IgG de
mamíferos, como: un enlace disulfuro, rodeado por residuos de aminoácidos hidrófobos y un triptófano
en la zona central. Una de las diferencias de algunos dominios IgNAR presentes en nuestro transcriptoma
con respecto a los IgG es la ausencia de un residuo de prolina en la quinta posición después del aminoácido
hidrofóbico. Esta ausencia de prolina se da mayormente en el dominio C4 (Feige et al., 2014).
En el dominio C1 del IgNAR, la secuencia de bazo de macho inmunizado (BMS) presenta cambios en la
primera cisteína conservada y el primer residuo de triptófano, el resto de las secuencias cuentan con el
36
enlace disulfuro y el triptófano en las posiciones uno y dos. Así mismo, la secuencia REF2 no cuenta con la
segunda cisteína conservada flanqueada por residuos hidrofóbicos. En este dominio se identificaron al
menos dos secuencias con potencial para el diseño de oligonucleótidos específicos; METPYSLA resultó
conservada en todos los alineamientos de secuencias codificantes para IgNAR de H. francisci y VPLQEW
que permaneció consevada en los alineamientos tanto de H. francisci como en las demás especies de
elasmobranquios presentes en la Figura 15. Basados en esta observación, se propone VPLQEW como una
secuencia que puede ser utilizada para generar nuevas bibliotecas de VNARs en otras especies de
tiburones.
La secuencia BMS presenta una diferencia de tamaño en la región interdominio entre C1 y C2.
En el dominio C2 tenemos un sitio de N glicosilación que solo está ausente en la secuencia REF2, la primera
cisteína conservada se encuentra presente en todas las secuencias, pero en REF2 no se encuentran los
aminoácidos hidrófobos que la flanquean. Todas las secuencias presentan los residuos de triptófano y la
segunda cisteína conservada con sus respectivos aminoácidos hidrófobos. En el espacio interdominio entre
C2 y C3, las secuencias de sangre de la hembra no inmunizada (SHN2, SHN3 y SHN4) presentan una mayor
cantidad de aminoácidos.
Para el dominio C3 todas las secuencias tienen la primera cisteína conservada con su región hidrófoba
asociada al igual que el primer residuo de triptófano y el sito de N glicosilación. La secuencia SHN2 tiene
una sustitución del segundo residuo de triptófano por una metionina y finalmente todas las secuencias
poseen la segunda cisteína conservada con sus residuos hidrofóbicos. Además, en la región interdominio
entre C3 y C4 se puede encontrar tres patrones de secuencias: la de REF4 es más corta y no contiene la
cisteína conservada, mientras que las secuencias de SHN2, SHN3 y SHN4 presentan la cisteína conservada
y secuencias similares, así como SHN5 y SHN6 sí presentan la cisteína conservada y secuencias similares.
En el dominio C4 se cuentan con todas las regiones compartidas con IgGs anteriormente mencionadas, y
la característica ausencia de prolina. El espacio interdominio entre C4 y C5 no presenta diferencias entre
las secuencias.
En el dominio C5 todas las secuencias cuentan con la primera cisteína conservada con su región hidrófoba
y el primer residuo de triptófano. Todas las secuencias comparten el primer sitio de N glicosilación. En el
segundo sitio de N glicosilación SHN2 y SHN4 presentan distintas secuencias con respecto al resto de las
muestras, pero son similares entre ellas. Todas las muestras cuentan además con la segunda cisteína
37
conservada, su región de residuos hidrófobos y el segundo triptófano. Finalmente, en la región carboxilo
terminal de IgNAR se puede observar un sitio de N glicosilación conservado en todas las secuencias, así
como una cisteína conservada en la penúltima posición excepto para SHN1.
Se ha reportado que los IgM, IgA, IgW e IgNAR de secreción tienen una sección carboxilo terminal de
tamaño pequeño, uniforme y que además contienen invariablemente una asparagina en su sitio de
glicosilación y una cisteína en la penúltima posición (Rumfelt et al., 2004), basados en esta información se
puede argumentar que en los transcriptomas de sangre de la hembra no inmunizada se detectaron al
menos tres secuencias para IgNAR de secreción.
La importancia de las cisteínas conservadas está dada por su papel en la formación de enlaces disulfuro
que forman la unión entre los dominios C3 y C4 de los IgNAR. Estas uniones entre las cadenas parecen ser
suficientes para llevar a cabo la dimerización (Simmons et al., 2006).
Resulta relevante mencionar que en las secuencias obtenidas se pudo detectar una que no contaba con
los elementos conservados antes mencionados, la secuencia para SHN1 carecía de las cisteínas
conservadas presentes en los espacios interdominio, a pesar de que se ha demostrado la importancia que
tienen dentro de la función de las IgNAR.
38
Capítulo 5. Conclusiones
Los resultados de este trabajo representan una contribución significativa de recursos genéticos en el
campo de la transcriptómica del sistema inmune de elasmobranquios, favoreciendo futuros estudios en
distintas áreas de investigación.
Este es el primer trabajo de investigación que se ha realizado para la búsqueda, descripción y clasificación
de secuencias codificantes de IgNAR en el transcriptoma del tiburón H. francisci.
Las secuencias que codifican para IgNARs de H. francisci presentan patrones de aminoácidos
evolutivamente conservados que se pueden encontrar en inmunoglobulinas de otros vertebrados.
A partir de los resultados obtenidos, se generó una secuencia consenso de aminoácidos que codifican para
IgNAR de tiburón H. francisci.
Existen diferencias en las regiones constantes de los IgNAR en distintas especies de tiburones.
Se pueden usar las secuencias encontradas para realizar comparaciones de la organización única de un
anticuerpo entre distintas especies.
Dentro de las secuencias disponibles de IgNAR la especie que presenta más similitudes con H. francisci es
S. acanthias.
Se identificaron secuencias de al menos 11 subtipos de anticuerpos IgNAR en el transcriptoma de H.
francisci.
Las secuencias codificantes de IgNAR para H. francisci pueden presentar variaciones en el tamaño de las
regiones interdominio.
Se identificó una secuencia parcial que representa un primer acercamiento para determinar la presencia
de una región variable de IgNAR de tipo 1 para H. francisci.
Hasta ahora, los oligonucleótidos utilizados para la generacón de bibliotecas de VNAR en el Departamento
de Innovación Biomédica del CICESE se han obtenido a partir de secuencias de G. cirratum. En este trabajo
39
se identificó la secuencia CLTVN que no había sido considerada dentro de las antes mencionadas y que
además es específica para H. francisci.
Dentro de el dominio C1 se pueden encontrar dos secuencias con potencial para ser utilizadas en el diseño
de oligonucleotidos específicos; METPYSLA para IgNAR de H. francisci y se propone VPLQEW como una
secuencia consenso para IgNAR de elasmobranquios.
40
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43
Anexos 1. Tabla de comandos modificada de la guía Ubuntu
Comando Descripción
bash / sh / ksh / csh Existen varias shells para Unix, Korn-‐Shell (ksh), Bourne-‐Shell (sh), C-‐Shell (csh),bash.
cat Muestra el contenido del archivo en pantalla en forma continua, el prompt retornará una vez mostrado el contenido de todo el archivo. Permite concatenar uno o más archivos de texto. || Sintaxis: cat nom_archivo.
cat fichero Muestra el contenido de un fichero
cd Cambia de directorio. || Sintaxis: cd nom_directorio.
cd -‐ Vas a la ubicación donde estabas antes
cd .. Sube un nivel de directorios
cd nom_directorio Cambia de directorio
chmod Utilizado para cambiar la proteción o permisos de accesos a los archivos. r:lectura w:escritura x:ejecución +: añade permisos -‐:quita permisos u:usuario g:grupo del usuario o:otros || Sintaxis: chmod permisos nom_archivo
clear Limpia la pantalla, y coloca el prompt al principio de la misma. || Sintaxis: clear.
exit Cierra las ventanas o las conexiones remotas establecidas o las conchas abiertas. Antes de salir es recomendable eliminar todos los trabajos o procesos de la estación de trabajo. || Sintaxis: exit.
history Muestra el listado de comandos usados por el usuario (~/.bash_history)
history -‐c Es Utilizado para Borra el Historial de Comandos
job Lista los procesos que se están ejecutando en segundo plano. || Sintaxis: jobs K
less Muestra el archivo de la misma forma que more, pero puedes regresar a la página anterior presionando las teclas “u” o “b”. || Sintaxis: less nom_archivo
less fichero Muestra el contenido de un archivo de forma paginada
logout Las sesiones terminan con el comando logout. || Sintaxis: logout.
ls Lista los archivos de un determinado directorio
ls -‐a Lista todos los archivos, incluidos los ocultos y los del sistema
44
ls -‐F Lista archivos y directorios mostrando un '/' adicional el que indica rutas diferenciando carpetas de archivos
ls -‐l Lista también las propiedades y atributos
make Es una herramienta que controla la creación de ejecutables y otros archivos de un programa a partir de los archivos fuente. || Sintaxis: make.
man Ofrece información acerca de los comandos o tópicos del sistema UNIX, así como de los programas y bibliotecas existentes. || Sintaxis: man comando.
man comando Muestra el manual de un comando, útil para aprender a utilizar sus argumentos
mkdir Crea un nuevo directorio. || Sintaxis: mkdir nom_directorio.
mkdir nom_directorio
Crea directorio nom_directorio
more Muestra la salida estándar de forma paginada
more fichero Muestra el contenido de un archivo de forma paginada
passwd Cambia la contraseña del usuario
pwd Visualiza el directorio actual o de trabajo
rm Remueve o elimina un archivo. Sintaxis: rm nom_archivo.
rmdir Elimina el directorio indicado, el cual debe estar vacío. Sintaxis: rmdir nom_directorio.
rmdir nom_directorio
Borra directorio nom_directorio
rmmod Descarga de memoria un módulo, pero sólo si no está siendo usado. Sintaxis: rmmod.
sbatch Comando para presentar un script a Slrm
scancel Cancela un trabajo
squeue Muestra fecha y hora de entrada a ejecución de los trabajos que se están realizando actualmente en el servidor
ssh (Secure Shell Client)
Es un programa para conectarse en una máquina remota y ejecutar programas en ella. Utilizado para reemplazar el rlogin y rsh, además provee mayor seguridad en la comunicación entre dos hosts. El ssh se conecta al host indicado, donde el usuario de ingresar su identificación (login y password) en la máquina remota, la cual realiza una autentificación del usuario. Sintaxis: ssh maquina_remota.
45
su o sudo Con este comando accedemos al sistema como root. En Ubuntu se puede utilizar gksudo mientras en Kubuntu: kdesudo. Sintaxis: su. T
vi Permite editar un archivo en el directorio actual de trabajo. Es uno de los editores de texto más usado en UNIX. Sintaxis: vi nom_archivo.
view Es similar al vi, solo que no permite guardar modificaciones en el archivo, es para leer el contenido del archivo. Sintaxis: view nom_archivo. W
wc Cuenta los caráteres, palabras y líneas del archivo de texto. Sintaxis: wc nom_archivo.
whereis Devuelve la ubicación del archivo especificado, si existe. Sintaxis: whereis nomb_archivo.
2.1 Secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR encontrados en transcriptomas de muestras de
bazo en tiburón Heterodontus francisci >BHN transmembrane form cds 890
ACAGAACAGTCAGTGCTGAGGTCTGGAGCTCACTTTGTTTAAATTGTTCCCTGCTGGTGA ACAAACCATGAATATTGTTTGGGTTTCGGTCCTTTTAACCTGGTTACCAAATGCCTTTCA
CTGCAAGAGTGAACCAAACACCAAGAATGGCAACGAGAGAGACAGGCGAATCCCTAACCA TTAACTGCGTCCTCGTTGATGCTTAACTGTGGTTTTGTCCGGCACATCTTGGTTTCCGAA
ATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATATGTTGAATCAG TCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTG TCACCTATTACTGCAAAGCGCTTCGATACTCCGGTGCATGCGATGAGAGCTCCAGTTACT ACTACGACGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAACTCTGGACCTGCTCCACCAACCATCA ATCTCCTCTACTCTGCAACTGACGAACTGAGAATAAAAGGGTTGGTACAACTGTTTTTGC CTCATTCAGTGAATACAAACCAGAAAGCATTACAGTCAGCTGGGAGAAGAATGGAAACTC CATACAGTCTGGCTTTACCACCACATCCCCAACTAAAACATCGAATGGAGATTTTAGCTC CAGAAGCATCCTTTAAAGTGCCCCTGCAGGAATGGAGTAGCGGTTCTGTGTACAGCTGCC AGGTATCCCATTCTGCAACCAACAGTGTACAGCGGAAAGACATTTAGATCAAAATCAGAA ATCACAGTATTTCTCAGAGATCCCTCCATTGAAGATTATCTGGATCAATAAGACTGCCGC
CCTGTTGTGTGAAGTGGTCTCTACAGTTCCCACTGAGATTGCGATCTCTT >BMS transmembrane form 1309
CCCTCTTCACGGTAGAGTCTGAAAGGTGGAATGTGAAGGCAAGAAAACAAGGTGTAATGT TTCTCCCTTTTCCAATTCAAGCTGCAAGGTAAAAAATGAGAAAGGCTGCTTGTGCTGAAA GCTCTGGTCCTGTTCAAAGAAGCAAGTGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAAAAGC AAACTCCGTCCTTCTCCCAAGGAAAAAACGGTGAATTTTAATCAAGGAATAAGAAAAATC CTCTTAATCAAAAGCAATGTGAAGAAAATGGCGGTGCTGGTAATTTTGAAAATCTCCTCT GGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCTTTCTTGTT TGTTTTGTTAACCGGAATTTGAATGAATTGGCCCCCATGTGCTGAAGCATGAAGTAATTC AAACCCCGCTAATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGGCTGATTGTCAGGTACTGG TTTCCATCCTTTGTAGCTGCTTCGATTTGAACTCCTTCAATCCTCATCTTACCATCAACT
GTCCAAGAGATCGCAATCTCAGTGGGATCTGTAGAGACCACTTCACACACCAGGGTGGCA GTCTTATTGATCCAGATGTCTTCAATGGAGGGATCTCTGAGAAATACTGTGATTTCTGTC ACTGATTTTGATCTAATGTCTTTCCGCTGTACACTGTTGGTTGCAGAATGGGATACTTGG CAGCTGTACACAGAACCGCTACTCCATTCCTGCAGGGGCACTTTAAGGATGCTTCTGGAG CTAAAATCTCCATTCGATGTTTTAGTTGGGGATGTGGTGGTAAAAGCCAGACTGTATGGA GTTTCCATTCTTCTCCCAGCTGACTGTAATGCTTTCTGGCTTGTATTCACTGATGAGGCA AAAAACAGTTGTACCAACCCTTTTATTCTCAGTTCGTCAGTTGCAGAGTAGAGGAGATTG
46
ATGGTTGGTGGAGCAGGTCCAGAGTTCACAGTCAAGCAACGGTGCCAAGCTCCGTCGTAA GTAAGTAAACTGGAAGCAAAACAACAAGTCAAGTCAGCTCCCAAGTCAAGTCCAGTTCAA AAAGAAGGGTCAAAATGAAAAAAAACAAAAGGTCCGTTAAAAATAAAAAAATAATAAAAC AAAAAGTAAAAACAACTGAATCAAAAAAGGAATCATTCGAAAATAATTGCAAGTGAATTA AAATAAAAAATCTTCATTTTCCTGTCAAGTTGCTAATCCAATCCAAGAATAATTTTCTAT
GTGCAAATGCGAAACTCCTGTAGCTCTGAAAAAAAAAAACAAATCCGCT 2.2 Secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR encontrados en transcriptomas de muestras de
sangre en tiburón Heterodontus francisci >SHN transmembrane form 843
GGATAAACAGGATGACAAAAGCGATCACTGTTGCAGCAGAGTTTGCATCCTCATCGAAAT TTTCTAATTCTTTCTTCCTCTACCTCGAGGTCTTCTGGATTTTCCATTATTTGAGGAGTT
TCATAAGATTTATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAA CAGGTGTACGTGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATG GAGCTGGAACCATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGG GTGTCATTGGCCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACAC ACCAGAGTAGCCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACT TTAGGAGGATGCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGT AATTCGCTGTCCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTG ACTTTCAGTTTACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCG ACTCCTTCCGTTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCG CTGTAAAGGATTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGG GGGTTCAATATATTGACAGAAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTTCGGTTTGCTGAT GGCCCTCTTCACGGTCGAGTCTGAAGGTGAATGTAAGGCGGAACAGGTGTATGTTTCTCC
CTT >SHN secretory form 1378
TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGAT TTATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTAC GTGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAA CATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTTCGGTTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTCGAGTCTGAAGGTGAATGTAAGGCGGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTTCCATT CAGCTGCAGGTAAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAG TGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGA TTTTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGTGCTGGTATTTTGAAT CTCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTC
47
>SHN secretory form cds 1552 TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGAT TTATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTAC GTGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAA CATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTTCGGTTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTCGAGTCTGAAGGTGAATGTAAGGCGGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTTCCATT CAGCTGCAGGTAAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAG TGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGA TTTTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGGTGCTGGTATTTTGAA TCTCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCT TTCTTGTTTGTTTTGTTACCGGATTTGATGATTGGCCCCCATGTGCTGAGCATGAGTATT CAACCCCGCTATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGCTGATTGTCAGGTACTGGTT
TCCATCCTTTGTAGCTGCTTCGATTTGAACTCATCAGAAAGCGTTTACAGTG >SHN secretory form 1880
TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGATT TATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTACG TGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAAC CATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTCCGGGTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTAGAGTCTGAAGGTGGATGTGAGGCAGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTTCCATT CAGCTGCAGGTAAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAG TGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGA TTTTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGGTGCTGGTATTTTGAA
48
TCTCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCT TTCTTGTTTGTTTTGTTACCGGATTTGATGATTGGCCCCCATGTGCTGAGCATGAGTATT CAACCCCGCTATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGCTGATTGTCAGGTACTGGTT TCCATCCTTTGTAATTGCTTCGATTTGAACTCCTTCAATCCTCATCTTACCATCAACTGT
CCAAGAGATCGCAATCTCAGTGGGATCTGTAGAGACCACTTCACACACCAGGGTGGCAGT CTTATTGATCCAGATGTCTTCAATGGAGGGATCTCTGAGAAATACTGTGATTTCTGTCAC TGATTTTGATCTAATGTCTTTCCGCTGTACACTGTTGGTTGCAGAATGGGATACTTGGCA GCTGTACACAGAACCGCTACTCCATTCCTGCAGGGGCACTTTAAGGATGCTTCTGGAGCT AAAATCTCCATTCGATGTTTTAGTTGGGGATGTGGTGGTAAAGCCAGACTGTATGGAGTT
TCCATCCTTCTCCCAGCTCA >SHN secretory form 1880
TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGAT TTATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGAGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTACG TGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAAC CATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTTCGGTTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTCGAGTCTGAAGGTGAATGTAAGGCGGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTTCCATT CAGCTGCAGGTAAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAG TGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGA TTTTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGGTGCTGGTATTTTGAA TCTCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCT TTCTTGTTTGTTTTGTTACCGGATTTGATGATTGGCCCCCATGTGCTGAGCATGAGTATT CAACCCCGCTATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGCTGATTGTCAGGTACTGGTT TCCATCCTTTGTAATTGCTTCGATTTGAACTCCTTCAATCCTCATCTTACCATCAACTGT
CCAAGAGATCGCAATCTCAGTGGGATCTGTAGAGACCACTTCACACACCAGGGTGGCAGT CTTATTGATCCAGATGTCTTCAATGGAGGGATCTCTGAGAAATACTGTGATTTCTGTCAC TGATTTTGATCTAATGTCTTTCCGCTGTACACTGTTGGTTGCAGAATGGGATACTTGGCA GCTGTACACAGAACCGCTACTCCATTCCTGCAGGGGCACTTTAAGGATGCTTCTGGAGCT AAAATCTCCATTCGATGTTTTAGTTGGGGATGTGGTGGTAAAGCCAGACTGTATGGAGTT
TCCATCCTTCTCCCAGCTCA >SHN secretory form 2046
TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG
49
ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGATT TATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTACG TGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAAC CATTTCTCTTCTTGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTTCGGTTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTCGAGTCTGAAGGTGAATGTAAGGCGGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTCCATTC AGCTGCAGGTAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAGTG GGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGATT TTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGGTGCTGGTATTTTGAATC TCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCTTT CTTGTTTGTTTTGTTACCGGATTTGATGATTGGCCCCCATGTGCTGAGCATGAGTATTCA ACCCCGCTATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGCTGATTGTCAGGTACTGGTTTC CATCCTTTGTAGCTGCTTCGATTTGAACTCCTTCAATCCTCATCTTACCATCAACTGTCC
AAGCGATCGCAATCTCAGTGGGAACTGTAGAGACCACTTCACACAACAGGGCGGCAGTCT TATTGATCCAGATATCTTCAATGGAGGGATCTCTGAGAAATACTGTGATTTCTGATTTTG ATCTAATGTCTTTCCGCTGTACACTGTTGGTTGCAGAATGGGATACTTGGCAGCTGTACA CAGAACCGCTACTCCATTCCTGCAGGGGCACTTTAAGGATGCTTCTGGAGCTAAAATCTC CATTCGATGTTTTAGTTGGGGATGTGGTGGTAAAGCCAGACTGTATGGAGTTTCCATTCT TCTCCCAGCTGACTGTAATGCTTTCTGGTTTGTATTCACTGATGAGGCAAAACAGTTGTA CCAACCCCTTTATTCTCAGTTCGTCAGTTGCAGAGTAGAGGAGATTGATGGTTGGTGGAG CAGCTCCAGAGTTCACAGTCAGCACGGTGCCAGCGCCGTCGTAGTAGTGTCTGTAGCTAC
ACATTC >SHN secretory form 2118
TTTTTTTTTTTAAGTTTTCATTCAGCATTTATTGCAATTAGCGGATCCACATACAGACTA AAGCACAATTTCCTATTCATCCAATAACATCACTAAACCCTTCAAGGGATCTTCAAAACG ATTGCAGCTGTGTTAAGGTTATCCAGGGTTATCGGATTCTAACCAAAGCAATCCTTCATT GACTGATATGGTTTCATATATTACTGAAATATCTCAACAATTATTCGTCGACATAGAGGG TGACAGTGACATGTGATAAACAGGAGATTCACTGACTCAGATACTCAAACAGTTATGAAC ATCACAACAGTAACACTTCTATGGGAAACAGATATTCACCCACACTGGGTTATGTACATG ATTTAACACTGTCAGATAGGACAAGTGAAACATTAACTGAAGTAGGTTTACCATAAGATT TATTTATGCTTCTGCGTAAATCCCTTTGGAGGGACGGGTGTCCCACTAAACAGGTGTACG TGGTGCCGCTGTTCCACTCCACTGCAGTGAGTTTCAATCTGCTGGCAATGGAGCTGGAAC CATTTCTCTTCTCGATCTCTGCTTGGCTAGGAGAACCTGAATCCAAAAGGGTGTCATTGG CCATCCAAGCGATGTAAATCTCAGCAGGATAAAAACCAGTGACTAGACACACCAGAGTAG CCGTCTGCTCAGTGCCTATCTCTTCCGCTGATGGAAGTAGAACGTAGACTTTAGGAGGAT GCATTTCACCAACCTTTACTTTCCTGGTGGAAGTTTTCACTGGTGTTGGTAATTCGCTGT CCTCTATGAAGCAGACGTATTCCACCCCACTGTCCCACTCTGCCGCAGTGACTTTCAGTT TACTAACGATGGCGAATTTGCTTCCATTCCACTCGGGACTCTGAGTCTCGACTCCTTCCG TTTTCCCACTCCCATCCACTTGCCAGGACACGATGACGCTTTCTAAGTCGCTGTAAAGGA TTTCACAAACAATGGTCGCCGTTCGTTGAGTCCAAATCTCTTCAAAGCGGGGGTTCAATA TATTGACAGAAATGTCTGCCTCATGACAATCATCTTCCGGGTTGCTGATGGCCCTCTTCA CGGTAGAGTCTGAAGGTGGATGTGAGGCAGAACAGGTGTATGTTTCTCCCTTTTTCCATT CAGCTGCAGGTAAAATGAGAAGGCTGCTTGTGCTGAAGCTCTGGTCCTGTTCAAGAGCAG
50
TGGGGAAACTGGTGACGTTCGAGTTTAAAGCAACTCCGTCCTTCTCCCAGGAAACGGTGA TTTTATCAGGATAGAATCCTCTTATCAAGCATGTGAGAATGGCGGTGCTGGTATTTTGAA TCTCCTCTGGTGATGGAGGCAGGAGGCGGACCTTTGGCTGTATTGGCTCGACTTTTGTCT TTCTTGTTTGTTTTGTTACCGGATTTGATGATTGGCCCCCATGTGCTGAGCATGAGTATT CAACCCCGCTATCCCACTCTTCCACGCTGCTTGTCAAGTGCTGATTGTCAGGTACTGGTT TCCATCCTTTGTAGCTGCTTCGATTTGAACTCCTTCAATCCTCATCTTACCATCAACTGT
CCAAGCGATCGCAATCTCAGTGGGAACTGTAGAGACCACTTCACACAACAGGGCGGCAGT CTTATTGATCCAGATATCTTCAATGGAGGGATCTCTGAGAAATACTGTGATTTCTGATTT TGATCTAATGTCTTTCCGCTGTACACTGTTGGTTGCAGAATGGGATACTTGGCAGCTGTA CACAGAACCGCTACTCCATTCCTGCAGGGGCACTTTAAGGATGCTTCTGGAGCTAAAATC TCCATTCGATGTTTTAGTTGGGGATGTGGTGGTAAAGCCAGACTGTATGGAGTTTCCATT CTTCTCCCAGCTGACTGTAATGCTTTCTGGTTTGTATTCACTGATGAGGCAAAACAGTTG TACCAACCCTTTTATTCTCAGTTCGTCAGTTGCAGAGTAGAGGAGATTGATGGTTGGTGG AGCAGCTCCAGAGTTCACAGTCAGGATGGTGCCAGCTCGTCGTAGTAGTATGTTGTTTGA TCCTCACAACTGAACATATGCCAAGTCCCGCTTATGTTGTATCCTCTTTGCGCTTTACAG
TAATAGGTGACACTGTCT
2.3 Secuencias codificantes para anticuerpos IgNAR encontrados en transcriptomas de tiburón Heterodontus francisci
>Referencia transmembrane form 854
GATGTGGGAACAAAAATGCAACAGCCCATGGTGATTTATACTCACTGCTCATGGTCTCTC AAAGCCGCCCTATGCAAAAATCAGCCTAGTCTCCCCAGGTTTATAAGGTCGGTGTTCAGA CACACACCGTTACACAGAACAGTCAGTGCTGAGGTCTGGAGCTCACTTTGTTTAAATTGT TCCCTGCTGGTGAACAAACCATGAATATTGTTTGGGTTTCGGTCCTTTTTAACCTGGTTA
CCAAATGCCTTCACTGCAAGAGTGAACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGC GAATCCCTGACCATTAACTGCGTCTTCACTGATTCTAAATGTGGTTTGTACGGCACATCT
TGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATAT GTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTT GAAGACAGTGTCACCTATTACTTCTAAGAGCAAACAGCATCTATTCTACAGTAGGGGTAC CCTGCGATGACACAGTGATTCAGGCAACAGCACAAACCTCTCAGACAGTTATTTCCTTGA CTATTAGTGAATGTGGCTGCATAATGCGATTTCTTCCTCATCGTTGCTACTACACAGAGT TTGAAATCAATTTTAGGTCGACCTTTGTTTGAAATTTAATCTCCAGGGTTAATTGCTATT
ATCCAAAATAAATACTGAGATGCAGTGGCAGACATTAAGGAGATATTTTATAACACTCGG CAAAGATCTATTCCAGTGAGAAAGAAAGACTCTGAGAAGGATGCACCATCTTTGGCTAAC
TAAGGAAGTTAAGG >Referencia transmembrane form 1288
GATGTGGGAACAAAAATGCAACAGCCCATGGTGATTTATACTCACTGCTCATGGTCTCTC AAAGCCGCCCTATGCAAAAATCAGCCTAGTCTCCCCAGGTTTATAAGGTCGGTGTTCAGA CACACACCGTTACACAGAACAGTCAGTGCTGAGGTCTGGAGCTCACTTTGTTTAAATTGT TCCCTGCTGGTGAACAAACCATGAATATTGTTTGGGTTTCGGTCCTTTTTAACCTGGTTA
CCAAATGCCTTCACTGCAAGAGTGAACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGC GAATCCCTGACCATTAACTGCGTCTTCACTGATTCTAAATGTGGTTTGTACGGCACATCT
TGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATAT GTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTT GAAGACAGTGTCACCTATTACTTCTAAGAGCAAACAGCATCTATTCTACAGTAGGGGTAC CCTGCGATGACACAGTGATTCAGGCAACAGCACAAACCTCTCAGACAGTTATTTCCTTGA CTATTAGTGAATGTGGCTGCATAATGCGATTTCTTCCTCATCGTTGCTACTACACAGAGT TTGAAATCAATTTTAGGTCGACCTTTGTTTGAAATCTATCCTCATTCTCCGATGTTAAAT CAGCGGATTGTTTTTTTCAGAGCTACAGGAGTTCACATTGTACATAGAAAATAGCTGGAT
51
GGATAGCAACTGACAGGAAAATGAAGATTTATTGATCACTAATATATTCGAATGATCCTT TTGATCAGTGTTACTTTGTTATATTTTATTAACGGACCTTTTGTTTTTCATTGACCCTTT
TTGAACTGGGCTGACTGGGAGCTGACTGACTGTGTAGCTCCAGTGACTACGACGGAGCTG GCACCGTGCTGACTGTGAACTCTGGTAAGTCACCTCTCTTGCTACTTTATCACTAAAATC TTTTCGATAGAGGATTAGAAAATTCAGTGTTCTCGTTTCAAAATCGCCTGAACATGAAAC GCAATAGCTATAGTTTTTTTCAACTTGACTTCGGTTTAGGTTTTAGCTTCTTCAGTTAAT TTGGCTTTTAAAAATTTATTAATTATTATTTTTTTCAAAAGCGATTTTTTACCCAAGAAT TAAATTGAACATGGATTTTAATTTCTTGTTAATTTTACCTTCTTCATTGTTATTGACTTT
AGGTTACTTGATTTTTGAATTAGATTGA >Referencia transmembrane form 1292
GATGTGGGAACAAAAATGCAACAGCCCATGGTGATTTATACTCACTGCTCATGGTCTCTC AAAGCCGCCCTATGCAAAAATCAGCCTAGTCTCCCCAGGTTTATAAGGTCGGTGTTCAGA CACACACCGTTACACAGAACAGTCAGTGCTGAGGTCTGGAGCTCACTTTGTTTAAATTGT TCCCTGCTGGTGAACAAACCATGAATATTGTTTGGGTTTCGGTCCTTTTTAACCTGGTTA
CCAAATGCCTTCACTGCAAGAGTGAACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGC GAATCCCTGACCATTAACTGCGTCTTCACTGATTCTAAATGTGGTTTGTACGGCACATCT
TGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATAT GTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTT GAAGACAGTGTCACCTATTACTTCTAAGAGCAAACAGCATCTATTCTACAGTAGGGGTAC CCTGCGATGACACAGTGATTCAGGCAACAGCACAAACCTCTCAGACAGTTATTTCCTTGA CTATTAGTGAATGTGGCTGCATAATGCGATTTCTTCCTCATCGTTGCTACTACACAGAGT TTGAAATCAATTTTAGGTCGACCTTTGTTTGAAATCTATCCTCATTCTCCGATGTTAAAT CAGCGGATTGTTTTTTTCAGAGCTACAGGAGTTCACATTGTACATAGAAAATAGCTGGAT GGATAGCAACTGACAGGAAAATGAAGATTTATTGATCACTAATATATTCGAATGATCCTT TTGATCAGTGTTACTTTGTTATATTTTATTAACGGACCTTTTGTTTTTCATTGACCCTTT
TTGAACTGGGCTGACTGGGAGCTGACTGACTGTGTAGCTCCAGTGACTACGACGGAGCTG GCACCGTGCTGACTGTGAACTCTGGACCTGCTCCACCAACCATCAGTCTCCTCTACTCTG CAAGTGACGAACAGAGAATAAAGGGGTTGGTACAACTGTTTTTGCCTCATCAGTGAATAC AAACCAGAAAGCATTACAGTCAGCTGGGAGAAGAATGGAAACTCCATACAGTCTGGCTTT ACCACCACATCCCCAACTAAAACATCGAATGGAGATTTTAGCTCCAGAAGCATCCTTAAA GTGCCCCTGCAGGAATGGAGTAGCGGTTCTGTGTACAGCTGCCAAGTATCCCATTCTGCA
ACCAACAGTGTACAGCGGAAAGACATTAGATC