testes de pirogÊnio e endotoxina bacteriana
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TESTES DE PIROGÊNIO E
ENDOTOXINA BACTERIANA
Felipe Rebello Lourenço
Setembro/2018
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HISTÓRICO
Panum: elevação da temperatura (febre) a
partir de substâncias pútridas,
termoestáveis e solúveis em água.
Billbroth: introduziu o termo pyrogen.
Produção de hipertermia em cachorros
pela injeção de água destilada.
Burdon-Sanderson: agente exógeno
(pirogênios) e agente endógeno.
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HISTÓRICO
Século XIX
Pelletier e Caventue: isolamento da
quinina (antipirético).
Centanni: isolamento de toxina bacteriana
responsável pela ação febril (endotoxina).
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HISTÓRICO
Século XX
Hort e Penfold: febre associada a
administração parenteral
(“febre das injeções).
Seibert (1923): febre decorrente de
pirogênios filtráveis, termoestáveis,
produzidos por Bactérias Gram-negativas.
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CONCEITO IMPORTANTE
ESTERILIDADE
APIROGENICIDADE
x
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FONTES DE PIROGÊNIO
Bactérias Gram-positivas
Fungos
Vírus
Fármacos
Bactérias Gram-negativas - LPS
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MORFOLOGIA MICROBIANA
CADEIA O-ESPECÍFICA
CADEIA FUNDAMENTAL
LIPÍDEO A
FOSFOLIPÍDEO
LIPOPROTEÍNA
PEPTIDEOGLICANO
ESPAÇO PERIPLASMÁTICO
MEMBRANA INTERNA
PROTEÍNAS
CITOPLASMA
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ESTRUTURA DO LPS
CADEIA O-ESPECÍFICA CADEIA FUNDAMENTAL LIPÍDEO A
Seqüência de
açúcares
Polissacaríreo Fosfolipídeo
Ação biológica
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DESPIROGENIZAÇÃO
POR INATIVAÇÃO
POR REMOÇÃO
x
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DESPIROGENIZAÇÃO
POR INATIVAÇÃO
Hidrólise ácido/base
Oxidação/Alquilação
Radiação Ionizante
Calor Seco
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Lavagem
Atração Eletrostática
Ultrafiltração
DESPIROGENIZAÇÃO
POR REMOÇÃO
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DETECÇÃO DE
ENDOTOXINAS
MÉTODO IN VIVO
MÉTODO IN VITRO
x
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PIROGÊNIO IN VIVO
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EFEITOS DO PIROGÊNIO
Pirogênio exógeno atua no centro termorregulador do hipotálamo
Leucócitos fagocitários liberam pirogênioendógeno
Aumento da temperatura corpórea (febre)Choque pirogênico (morte)
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PIROGÊNIO IN VIVO
Elevação de temperatura de coelhos após administração intravenosa da solução teste, provocada pela presença de pirogênio
Limitações: Alta variabilidade, falso positivo, fármacos antipiréticos, tóxicos e outros
Efeito bifásico de febre:
Pirogênio exôgeno: 1 hora
Pirogênio endôgeno: 3 horas
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PIROGÊNIO IN VIVO
Pré-teste: verificar temperatura dos coelhos
(variação < 1ºC)
Administração intravenosa da amostra pré-
aquecida a 372ºC
Registrar temperatura
a cada 30 minutos
por 3 horas
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PIROGÊNIO IN VIVO
Interpretação
1º etapa:
3 coelhos
Nenhum temperatura 0,5ºC
2ª etapa:
+ 5 coelhos (8 total)
Não mais que 3 temperatura 0,5ºC
Soma temperatura 3,3ºC
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MÉTODOS IN VITRO
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MÉTODO IN VITRO
1885: Sangue do caranguejo Limuluspolyphemus apresentava formação de coágulo em gel, associada a doenças provocadas por bactérias marinhas (Gram-negativas).
Levin e Bang: lise dos amebócitos do caranguejo acelerava a reação de formação de gel.
LAL: Lisado dos Amebócitos do Limulus
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REAGENTE LAL
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MÉTODOS DE ENSAIO
Gel-Clot (End-Point)
Cromogênico (End-Point)
Cromogênico (Kinetic)
Turbidimétrico (End-Point)
Turbidimétrico (Kinetic)
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MÉTODO DE GELIFICAÇÃO
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GEL-CLOT
Mecanismo de Reação
Proenzima Enzima ativada
Coagulogênio Coagulina
Formação
de Gel
Endotoxina
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CONDIÇÕES DO TESTE
Amostra
Amostra +
Endotoxina
Endotoxina
Diluente
(Água)
+
+
+
Banho-Maria
37 ºC
60 minutos
Positivo:
gel presente
Negativo:
gel ausente
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MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA
MDV =Limite X Concentração
Sensibilidade
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MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA
MDV =0,5 EU/mg X 2,0 mg/mL
0,125 EU/mL
Limite = 0,5 EU/mg
Concentração = 2,0 mg/mL
Sensibilidade = 0,125 EU/mL
= 8X
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DILUIÇÃO DA AMOSTRA
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MÉTODO DE GELIFICAÇÃO
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REALIZAÇÃO DO TESTE
Solução de teste Réplicas
A: Água (Controle negativo) 2
B: Água + Endotoxina 2 (Controle positivo) 2
C: Água + Amostra 2
D: Água + Amostra + Endotoxina 2 2
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INTERPRETAÇÃO
Negativo Válido
A: (-) (-)
B: (+) (+)
C: (-) (-)
D: (+) (+)
Resultado Inválido
Falha dos controles
negativo ou positivos
Positivo Válido
A: (-) (-)
B: (+) (+)
C: (+) (+)
D: (+) (+)
Reteste
Respeitando a MDV
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FATORES DE INFLUÊNCIA
pH
entre 6,0 e 8,0 (reagentes tamponados)
Temperatura
37 1 ºC
Tempo 60 2 minutos
Substâncias interferentes
Cálcio / Magnésio / -glucanos
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VALIDAÇÃO DE TESTE
Confirmação da sensibilidade do LAL
Qualificação do analista
Confirmação da Não-Interferência do Produto
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SENSIBILIDADE DO LAL
Preparar soluções de endotoxina com
concentrações: 4, 2 , , ½ e ¼
Determinar os pontos finais (PF)
Calcular a média geométrica
Média geométrica entre ½ e 2
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SENSIBILIDADE DO LAL
4 2 ½ ¼ PF
(+) (+) (+) (+) (-) ½
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
Média geométrica 0,84
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QUALIFICAÇÃO ANALISTA
Preparar soluções de endotoxina com
concentrações: 4, 2, , ½ e ¼
Determinar os pontos finais (PF)
Calculas a média geométrica
Média geométrica entre ½ e 2
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QUALIFICAÇÃO ANALISTA
4 2 ½ ¼ PF
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (-) (-) (-) 2
Média geométrica 1,19
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INTERFERÊNCIAS
Inibição
Falso negativo
Diluição
Ajuste de pH
Aquecimento
Exacerbação
Falso positivo
Diluição
Eliminar Ca++ / Mg++
Aquecimento
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INTERFERÊNCIA PRODUTO
1ª ETAPA
Testar a amostra em diversas diluições
com controle positivo de 2
Escolher menor diluição em que ocorre
formação de gel para o controle positivo
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1ª ETAPA
Diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
Amostra(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Amostra +
Endotoxina
2
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
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INTERFERÊNCIA PRODUTO
2ª ETAPA
Testar a diluição escolhida na 1ª etapa com controle positivo de 4, 2, , ½ e ¼
Determinar pontos finais (PF) e calcular média geométrica
Média geométrica entre ½ e 2
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2ª ETAPA
4 2 ½ ¼ PF
(+) (+) (+) (+) (-) ½
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
(+) (+) (+) (-) (-)
Média geométrica 0,84
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MÉTODOS QUANTITATIVOS
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MÉTODOS QUANTITATIVOS
CROMOGÊNICO
Intensidade da coloração amarela inversamente proporcional ao log da concentração de endotoxina
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CROMOGÊNICO
Mecanismo de Reação
Proenzima Enzima ativada
Coagulogênio
+ Substrato
Coagulina +
p-nitroanilina
Leitura a 405 nm
Endotoxina
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CROMOGÊNICO END-POINT
Preparar curva padrão de endotoxina
Preparar amostras (diluição adequada)
Incubar por tempo pré-determinado a 37 ºC
(sensibilidade depende do tempo)
Leitura em espectrofotômetro (405 nm)
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CROMOGÊNICO END-POINT
[pNA] (A)
Tempo (min)
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CROMOGÊNICO END-POINT
pNA (A)
Log[LPS]
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CROMOGÊNICO KINETIC
Preparar curva padrão de endotoxina
Preparar amostras (diluição adequada)
Incubar em leitora/incubadora de microplaca
(ELISA) a 37 ºC com 40 leituras em
intervalos de 150 segundos
Determinar tempo de reação para atingir
variação de 200 mOD a 405 nm
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CROMOGÊNICO KINETIC
pNA (A)
Tempo (min)
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CROMOGÊNICO KINETIC
pNA (A)
Log[LPS]
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MÉTODOS QUANTITATIVOS
TURBIDIMÉTRICO
Intensidade da turbidez inversamente proporcional ao log da concentração de endotoxina
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TURBIDIMÉTRICO
Mecanismo de Reação
Proenzima Enzima ativada
Coagulogênio Coagulina
Leitura a 340 nm
Endotoxina
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TURBIDIMÉTRICO END-POINT
Preparar curva padrão de endotoxina
Preparar amostras (diluição adequada)
Incubar por tempo pré-determinado a 37 ºC
(sensibilidade depende do tempo)
Leitura em espectrofotômetro (340 nm)
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Turbidez
Tempo (min)
TURBIDIMÉTRICO END-POINT
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Turbidez
Log[LPS]
TURBIDIMÉTRICO END-POINT
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TURBIDIMÉTRICO KINETIC
Preparar curva padrão de endotoxina
Preparar amostras (diluição adequada)
Incubar em leitora/incubadora de microplaca
(ELISA) a 37 ºC com 100 leituras em
intervalos de 60 segundos
Determinar tempo de reação para atingir
variação de 30 mOD a 340 nm
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Turbidez
Tempo (min)
TURBIDIMÉTRICO KINETIC
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Turbidez
Log[LPS]
TURBIDIMÉTRICO KINETIC
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EQUIPAMENTO
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SOFTWARE
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ENDOTOXINA BACTERIANAMÉTODO VANTAGENS DESVANTAGENS
GEL-CLOT ◼Facilidade de execução
◼Não necessita equipamentos
◼Baixo custo (em relação aos métodos turbidimétrico e
cromogênico)
◼Ensaio semi-quantitativo
◼Baixa sensbilidade (em relação aos métodos
turbidimétrico e cromogênico)
TURBIDIMÉTRICO ◼Ensaio quantitativo
◼Alta sensibilidade (em relação ao método gel-clot)
◼Interferência de amostras
coloridas
◼Alto custo dos reagentes
(em relação ao método gel-clot)
CROMOGÊNICO ◼Ensaio quantitativo
◼Alta sensibilidade (em relação aos métodos
turbidimétrico e gel-clot)
◼Alto custo dos reagentes
(em relação aos métodos turbidimétrico e gel-clot)
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REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
BRITISH PHARMACOPEIA
EUROPEAN PHARMACOPEIA
FARMACOPÉIA BRASILEIRA
JAPANESE PHARMACOPEIA
PINTO, KANEKO & PINTO. Controle Biológico de
Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e
Cosméticos (2014)
UNITED STATES PHARMACOPEIA