testy serologiczne.pdf
TRANSCRIPT
TESTY IMMUNOLOGICZNETESTY IMMUNOLOGICZNE
Istnieje wiele odmian testów immunologicznych;• wszystkie polegają na zajściu reakcji wiązania się antygenu ze swoistymi(rozpoznającymi go) przeciwciałami,• różnią się natomiast sposobem wykrywania tej reakcji.
Testy immunologiczne pośredniewykrywają immunoglobuliny, któreuprzednio związały się ze swoistymantygenem.
Opierają się one na na założeniu, że jeśliorganizm kręgowca zetknął się z konkretnymantygenem, to w surowicy tego organizmubędą się znajdywały swoiste wobec tegoantygenu przeciwciała. Ponieważimmunoglobuliny jako takie mają właściwościimmunogenne (wywołują odpowiedźimmunologiczną), można uzyskać swoisteprzeciwciała skierowane wobecimmunoglobulin innego gatunku.
Charakteryzują się większą czułością, gdyżwykorzystują naturalną zdolność układuimmunologicznego - amplifikację sygnału, jakidociera do układu immunologicznego wpostaci antygenu.
BEZPOŚREDNIEBEZPOŚREDNIE POŚREDNIEPOŚREDNIE
Testy immunologiczne bezpośredniewykrywają określony antygen przy pomocyznakowanych przeciwciał.
Antygeny wirusowe czy bakteryjne występują jednakczęsto w ustroju w bardzo niewielkiej ilości, któraznalazła by się poniżej progu detekcji. Z tego względuczęsto stosuje się testy immunologiczne pośredniewykrywające immunoglobuliny, które uprzedniozwiązały się ze swoistym antygenem.
AglutynacjaHemaglutynacjaPrecypitacjaOdczyn wiązania dopełniacza
Testy immunoenzymatyczne Testy immunofluorescencyjne IFATesty radioimmunologiczne RIA
Ag + Ab Ag + Ab WYNIK WYNIK Ag + Ab + AbAg + Ab + Ab22 WYNIK WYNIK
TESTY SEROLOGICZNETESTY SEROLOGICZNE
REAKCJA PRECYPITACJIREAKCJA PRECYPITACJI
Stężenie antygenu
Ilość
spre
cypi
tow
anyc
h p
rzec
iwci
ał
Nadmiar antygenu
Strefa równowagi
Nadmiar przeciwciał
Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a rozpuszczalnym antygenemnp. białkiem, wyizolowanym polisacharydem bakterii itp.
Wszystkie testy przeprowadza się w obecności roztworu elektrolitów.
Precypitacja probówkowa
Przeciwciała
W miejscu wytrącania się kompleksówimmunologicznych pojawia się opalizującyprążek
Rozpuszczalnyantygen
PRECYPITACJA W ŻELUPRECYPITACJA W ŻELU
Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego• służy do ilościowej oceny antygenu
• przeciwciała unieruchomione są w żelu agarowym, antygen dyfunduje
Reakcja podwójnej dyfuzji wg Ouchterlony’ego• dyfundują cząsteczki antygenu i przeciwciała
Miejsce naniesieniaroztworu antygenu
Poleprecypitacji
Miejsce naniesieniaroztworu antygenu
Miejsce naniesieniaroztworu przeciwciał
Poleprecypitacji
Pole precypitacji jest wprost proporcjonalnedo stężenia antygenu.
Znane stężenia antygenu x?
a b c x stęż
enie
ant
ygen
u
średnicax
Żel agarowyzawierający określonerozcieńczenie przeciwciał
24 h
REAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGOREAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGO
Pozwala określić czy badane antygeny zawierają identyczne, wspólne, czy też różnedeterminanty antygenowe.
Przeciwciała swoiste wobecokreślonego antygenu
Badanyantygen
Znanyantygen
A
A
A B + C
Szybkość dyfuzji antygenu w żelu zależy od jego wielkości(jest odwrotnie proporcjonalna do masy cząsteczki).
A
Łukprecypitacji
Przeciwciałaanty-A
Antygeny zawierają różnedeterminanty antygenowe
Antygeny zawierają identyczne determinanty antygenowe
Przeciwciałaanty-A i anty-B
A B
Antygeny zawierają wspólną determinantę antygenową
A + B
anty-B
Przeciwciałaanty-A i anty-B
anty-B
Antygeny zawierają różnedeterminanty antygenowe
Przeciwciałaanty-A, anty-B i anty-C
anty-B
anty-C
TESTY SEROLOGICZNETESTY SEROLOGICZNE
AGLUTYNACJAAGLUTYNACJA
Najbardziej efektywnymi aglutyninami są IgM.Aby doszło do porównywalnej aglutynacji antygenu z przeciwciałami IgG,potrzeba 100 lub nawet 1000 razy więcej cząsteczek IgG.
Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a upostaciowanym antygenem.Reakcję można zaobserwować w postaci „kłaczków”.
Antygen może znajdować się na powierzchni komórek bakteryjnych, eukariotycznychlub być związany z cząstkami lateksu.
Bakteria
Przeciwciała IgM wiążą się z epitopamibakterii
HEMAGLUTYNACJAHEMAGLUTYNACJA
Erytrocyty w roztworze soli fizjologicznej tworzą zawiesinę pojedynczych komórek -nie zlepiają się. Powierzchnia jest erytrocytu naładowana ujemnie (ze względu naobecność reszt kwasu sjalowego w błonie komórkowej) i otoczona warstwą kationów.
Erytrocyty, które stosuje się w testach aglutynacji specjalnie przygotowuje się: np.traktuje się je kwasem taninowym, a następnie inkubuje z antygenem, który adsorbujesię na ich powierzchni.
Erytrocyty opłaszczone antygem często nazywa się krwinkami „uczulonymi”.
Jeśli w badanej surowicy znajdująsię przeciwciała swoiste wobec tegoantygenu, dochodzi do aglutynacjierytrocytów.
Jeśli badana surowica nie zawieraprzeciwciał swoistych wobec tegoantygenu, nie dochodzi do aglutynacjierytrocytów.
krwinkiopadająna dno
Testy wykorzystujące zjawisko hemaglutynacji:
• odczyn biernej hemaglutynacji
• test hamowania hemaglutynacji
• test Coombsa (odczyn antyglobulinowy)
stosuje się do oznaczania grupy Rh
http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/titration/fig1.html
Odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do określania mianaprzeciwciał.
ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJIODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI
Miano przeciwciał - rozcieńczenie, przyjakim nastąpiła hemaglutynacja -wynosi 1:80
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 K
aglutynacja brak aglutynacji
Kolejne rozcieńczenia surowicy
Miano przeciwciał w surowicywyznacza dodatnia reakcjaantygen-przeciwciało uzyskanaz najwyższym rozcieńczeniemsurowicy
W przypadku niektórych chorób np. zakaźnych i autoimmunizacyjnych określeniemiana przeciwciał w surowicy może mieć wartość diagnostyczną!Np. podwyższenie miana może wskazywać na aktywny proces chorobowy.Obecnie do oznaczenia miana przeciwciała stosuje się inne, nowocześniejsze metody.
SEROKONWERSJA - pojawienie sięw organizmie przeciwciał skierowanychprzeciwko określonemu antygenowi.
Zmiana statusu serologicznego osoby zujemnego do dodatniego.
Typowe dla zakażeń HIV, HBV.
Poziomprzeciwciał
czas
Poziomdetekcji
zakażenie
- - - - + + + +
Pacjentseronegatywny
Pacjentseropozytywny
TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJITEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI
Białka niektórych wirusów mają zdolność do zlepiania erytrocytów.
Niektóre hemaglutyninywirusowe
• hemaglutynina wirusagrypy
• hemaglutynina wirusaodry, świnki i różyczki
erytrocyty wirusy aglutynacja erytrocytów
Właściwość ta nie ma nic wspólnego z reakcjami serologicznymi,jest jednak wykorzystywana w diagnostyce - w teście hamowaniahemaglutynacji.
Erytrocyty przeciwciała wirusy nie dochodzi doneutralizujące wirusy aglutynacji erytrocytów
AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCHAGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH
Komercyjne testy aglutynacji wykorzystują kuleczki lateksu opłaszczoneantygenem lub przeciwciałami.
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność antygenu.
Kuleczki opłaszczone są przeciwciałamiswoistymi wobec wykrywanegoantygenu.
Wynik pozytywny: aglutynacja
Wynik negatywny: brak antygenu = brakaglutynacji
lateks
antgen
Test aglutynacji bezpośredniej
Wykrywanie czynnikareumatoidalnego w surowicypacjenta z podejrzeniemreumatoidalnego zapaleniastawów
Kuleczki lateksu opłaszczone sąprzeciwciałami IgGskierowanymi przeciwczynnikowi reumatoidalnemu.
aglutynacja
brak aglutynacji
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność swoistych przeciwciał.
Kuleczki opłaszczone są określonymantygenem.
Wynik pozytywny: aglutynacja
Wynik negatywny: brak swoistychprzeciwciał = brak aglutynacji
Test aglutynacji pośredniej
wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi:
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNETESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
CDC/Dr. William Cherry
Test immunoflurescencyjny. Bakterie Legionella pneumophila
Cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie(poprzez grupy aminowe lizyny).
FITC
izotiocyjanian tetrametylorodaminy,po wzbudzeniu emituje kolor czerwonyTRITC
izotiocyjanian fluoresceiny,po wzbudzeniu emituje kolor zielony
bakteria
przeciwciała znakowanefluorescencyjnie
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność antygenu/ bakterii.
Wynik pozytywny: fluorescencjaobserwowana pod mikroskopemfluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak antygenu = brakfluorescencji
Test immunofluorescencyjny bezpośredni
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNETESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanychfluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się zeswoistym antygenem. Charakteryzują się większą czułością.
Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji
Test immunofluorescencyjny pośredni
Diagnostyka kiły Wykrywanie autoprzeciwciałprzeciwjądrowych
(układowe schorzenia autoimmunizacyjne)
Dodajemy surowicę pacjenta
www.primer.ru/std/gallery_std/ treponema.htm
Dodajemy przeciwciałaznakowane fluorescencyjnie
przepłukujemy
T. pallidum Skrawektkanki
Krętek kiłyJądrokomórkowe
https://courses.stu.qmul.ac.uk/smd/kb/pathology/funmedpics/pathtes2.htm
ANA testJeśli pacjentbył/jest zakażonykiła, obserwuje sięświecenie krętków
Przeciwciałapacjenta
Przeciwciałapacjenta
TESTY IMMUNOENZYMATYCZNETESTY IMMUNOENZYMATYCZNE
wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcjiimmunologicznej.Cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub z biotyną.
Po dodaniu do próbki substratu - chromogenu, enzym przekształca go w barwnyprodukt. W miejscu związania się przeciwciał pojawia się kolorowy precypitat.
Testy immunoenzymatyczne charakteryzują się większą czułością niż testy immunofluorescencyjne,ponieważ jedna cząsteczka enzymu związana z przeciwciałami może katalizować powstanie wielucząsteczek produktu.
Najczęściej stosowane enzymy:
• peroksydaza chrzanowa
• alkaliczna fosfataza
chromogen
kolorowyprecypitat
Najczęściej stosowane substraty:
• DAB
• AEC
• 4-chloro-1-naftol
Aby zwiększyć czułość reakcji immunoenzymatycznej można stosować przeciwciałaznakowane awidyną (białko jaja kurzego) lub streptawidyną (białko Streptomycesgriseus), które wykazuje silne powinowactwo do biotyny (witamina H). Enzymemznakuje się wówczas biotynę.
immunoglobulinaz cząsteczką enzymu
wykrywają antygen in situ (w tkankach) - testy immunohistochemiczne
wykrywają antygen lub przeciwciała w roztworze - test ELISA