TetR Family Member PsrA Directly Binds the Pseudomonas rpoS and psrA Promoters

M. Kojic, C. Aguilar, and V.Venturi

中興大學生化所 徐如貞

Journal of Bacteriology. 2002. 184 : 2324-2330

Introduction

? RpoS sigma factor (也稱作 ? S或 ? 38) 為 gram-negative bacteria 在 stationary phase的 central regulator。RpoS與 core RNA polymerase 結合，改變 RNA polymerase 對 promoter 的 specificity，造成基因表現的改變，使得 gram-negative bacteria 能夠適應環境壓力 (如 starvation，osmosis，oxidation 以及 temperature change 等 ) 。

?作者已證實 PsrA在 stationary phase 會活化 rpoS的表現，亦即為 rpoS的 activator；此外，也會進行自我負調控，抑制 psrA的表現。

?在 E.coli，RpoS的表現受到 transcription，translation 和 protein stability 三個層面的調控。這些不同調控層面彼此的協調以及環境中導致 RpoS調控的訊號尚未明瞭，值得進一步研究。

?如同其他 sigma factors，RpoS的濃度也受到調控。研究發現 rpoS基因的調控與 cell density 有關，在 stationary phase 時 RpoS的濃度會大量增加。

?而在 Pseudomonas spp.，rpoS基因的調控近來也受到注意。研究發現 stationary phase 時 RpoS濃度的增加與好幾個 regulators 有關，其中包括近來發現的一個TetR family regulator (PsrA)。

?本篇研究進一步探討在 P.putida WCS358內，rpoS和 psrA promoters 的位置以及PsrA與 rpoS和 psrA promoters 結合的情形。

實驗設計

定出 rpoS promoter 的位置

定出 rpoS和 psrA的 transcriptionstart site

PsrA與 rpoS和 psrA promoters 結合的情形

定出 rpoS和 psrA promoters 的 PsrA-binding sites

( Primer extension ) ( DNA mobility shift assays )

( DNase I protection assays )

( Reporter gene fusion assays )

nlpD rpoS

Hind III Aat II

ATG

Hind III Aat II

Hind III Aat II

Xho IXho I

Xho I/Taq I614

Pst I492

EcoR V400

Alu I312

Taq I214

Xho I38

Taq I214

Taq I214

Taq I214

Alu I312

EcoR V400

EcoR V400

EcoR V400

Pst I492

Pst I492

Pst I492

Taq I614

Taq I614

lacZpRPO220B (已證實具有 promoter activity)

P. putida WCS358 genome

1) 以片段上所標示的 enzyme 將 fragments 從 pRPO220B 切下接至 pBluescript KS*的相對切位。

2) 再以 BamH I 和 Kpn I 將片段從pBluescript KS 切下，分別接至 pMP220 (promoter probe vector) 的 Bgl II 和 Kpn I 位置。

C. 測定 ? – galactosidase activity。*

※片段上的數字為相對 genome 上 ATG codon的距離

3) 將構築好的 plasmids 從 E.coli DH5?以 triparental mating*送至 P. putidaWCS358 ，培養至 stationary phase (16 hr)。

962 bp (含 ATG 上游的 920 bp )

A.

B. 構築 rpoS promoter – lacZ fusions

Reporter gene fusion assays (rpoS promoter)

由以上可看出 rpoS promoter 位於 Pst I – Alu I DNA fragment (180 bp) 內，亦即在 rpoS基因轉譯起始位置 (ATG) 上游的 312 ~ 492 bp之間。

Xho I/Taq I614 Pst I

492EcoR V

400Alu I312

Taq I214

Xho I38

Taq I214

Taq I214

Taq I214

Alu I312

EcoR V400

EcoR V400

EcoR V400

Pst I492

Pst I492

Pst I492

Taq I614

Taq I614

Plasmid name

pRPO-XX

pRPO-TT

pRPO-PT

pRPO-PA

pRPO-TE

pRPO-PE

pRPO-ET

? -galactosidase activity (promoter activity)

+

+

+

+

-

-

-

※片段上的數字為相對 genome 上 ATG codon的距離

Results：(rpoS promoter)

+ : ? -galactosidase activity of 20000 to 25000 Miller units- : no activity

Primer Extension

5’– *CCTTGACCTGCTGCCCCTCCC – 3’

? 以同樣的 primer 將 genomic DNA 以Sanger 方法定序。

( complementary to nucleotides – 223 ~ - 243from the ATG start codon on the rpoS mRNA )rpoS – 250

以 Kinase和[ ??– 32P ] ATP label

? Preparation of the radiolabeled primers

cDNA

5’3’

3’5’

mRNA

5’– *TCTGCAAACCTCTTTCC – 3’

( complementary to nucleotides + 56 ~ +73from the ATG start codon on the psrA mRNA )

以 Kinase和[ ??– 32P ] ATP label

psrA + 60

Transcription start site

P. putida WCS358 genomic DNA

? RNA from bacterial culture pellet is purifiedwith the RNeasy kit (Qiagen)。

putative transcription start site

5’GGACAGCCTGTTTTTGCTG3’

由上可得知 rpoS transcription start site 位於 ATG start codon上游 373 bp的位置。

GGGGTGCTGATTGGAAAATTTGCTTCAAACGGTAGTTTGAAT

5’CTGCAGAGCGTGCGGTAGGGGGCTGGACCTGGCCGGCCAAC

AAAGGCATTGATATCGCCGGTGATTTGGGACAGCCTGTTTTT

GCTGCGTCTGGTGGTGCAGTGGTCTACGCCGGGAGTGGCTTG

CGGGGCTACGGCGAGCT… … … 290… … … CAGCAAAGGACTA

TAACAATGGCTCTCAATAAAGAAGCGCCGGAGTTTGACATC

GACGATGACGTC 3’

Pst I

EcoR V

Alu I

Aat II

S. D.

+1

-10

- 35

rpoS promoter sequence：

Results：(rpoS)

5’GAAACGTATGTTTCAAACA3’

psrA transcription start site 位於 ATG start codon上游 33 bp的位置。

5’AGTACTGGATGAGCTGCAAGCGCCAAGCAGCAACAAAAAGT

GCCGCGCGGGCCAACTTGTCGCTTGCAGCGTGTAATGGGGCG

CTTTAAATGGCGACCGCCCGGTCACCGAGCCTTGACAGAAGC

AGGGCTGAAACGTATGTTTCAAACACCTGTTTGTCTGGCGGAA

TAATCATGGCCCAATCGGAAACCGTTGAACGCATTC 3’

S. D.

+1

-10

-35

Dra I

Sca I

Xmn I

psrA promoter sequence：

Results：(psrA)

A. His6-PsrA protein expression1) 設計 psrA primers

BamH I

reverse : 5’- GCGCAAGCTTAGCCGAAGCGCCCTGCCCC - 3’Hind III

P. putida WCS358 genome

BamH I Hind III

pQEPSRA( His6-PsrA )

3) 將 pQEPSRA transform 至 E.coli M15(pREP-4)，以 IPTG 誘導表現。

psrA gene

forward : 5’- GGAATAATCGGATCCCAATCGGAAACCG - 3’

2) PCR & Cloning

ligate至

* *

DNA mobility shift assays

4) 以 Ni2+ - column 純化 His6-PsrA。

1) Preparation of radiolabeled DNA fragments

2) 將 radiolabeled fragments (1000 cpm) 和不同量純化的 PsrA (0 ~ 500 ng)加至 20 ? L reaction mixtures，培養於室溫下 15 min 。reaction mixture 含有 1X binding buffer (10 mM HEPES [pH 7.5], 10 mM Tris [pH 7.5], 50 mM KCL, 1 mM EDTA,1 mM dithiothreitol, 10% [vol/vol] glycerol), 20 mg of bovine serum albumin (carrier protein), and 20 mg of salmon sperm DNA (nonspecific competitors)。

以 Hind III 和 Kpn I 切

下此片段

5’- AGCTT3’- *AG

GGTAC -3’C -5’

End – labeling : 以 Klenow fragment of DNA Pol. 和 [ ? ?– 32P ] dATP

Pst I – Alu I fragment of rpoS promoter ( 180 bp )

pBSKPA

5’- AATTC 3’- *AG

GGTAC -3’C -5’

以 EcoR I 和 Kpn I 切

下此片段End – labeling : 以 Klenow fragment of DNA Pol. 和 [ ? ?– 32P ] dATP

pBSKXS

Xmn I – Sca I fragment of psrA promoter ( 198 bp )

3) Run nondenaturing 6% polyacrylamide 1X TBE (89 mM Tris, 89 mM boric acid,1 mM EDTA) – 7% (wt/vol) glycerol gel。先在 4 ℃以 100 V 預跑 1 小時，分析樣品時用 150 V。

Supershift assay：在步驟 (2) 後加入 anti–PsrA antibodies 至 reaction mixture，培養於室溫下 15 min。

DNA mobility shift assaysB.

PsrA(ng) 0 50 125 250 500 250+ 50-fold amount of the same unlabeled

DNA fragment

由上可得知 PsrA濃度在 0.475 ? M以上時會專一性地與 rpoS promoter binding。

+ anti-PsrAantibodies

Results：(rpoS promoter)

1 Dalton = 1/12th the mass of a 12C atom(250 ×10-9 g) / (26300 Da×20 ×10-6 L) = 0.475 ? M

PsrA(ng) 0 50 125 250 500 250+ 50-fold amount of the same unlabeled

DNA fragment

由上可知 PsrA濃度在 0.237 ?M以上時會專一性地與 psrA promoter binding。

(+ anti-PsrAantibodies)

Results：(psrA promoter)

(125 ×10-9 g) / (26300 Da×20 ×10-6 L) = 0.237 ? M

以 Hind III 和 Kpn I

(or EcoR I 和 Pst I ) 切下此片段

5’- AGCTT3’- *AG

GGTAC -3’C -5’

End – labeling : 以 Klenow fragment of DNA Pol. 和 [ ? ?– 32P ] dATP

pBSKPA

Pst I – Alu I fragment of rpoS promoter ( 180 bp )

1) Preparation of radiolabeled DNA fragments

2) 將 2.5 ? g purified PsrA和 20000 cpm radiolabeled DNA fragments 加至 50 ? Lreaction mixture 混合後，培養於室溫 15 min。

5’- AATTC 3’- *AG

GGTAC -3’C -5’

以 EcoR I 和 Kpn I

(or BamH I 和 Pst I ) 切下此片段End – labeling : 以 Klenow fragment of DNA Pol. 和 [ ? ?– 32P ] dATP

pBSKXS

Xmn I – Sca I fragment of psrA promoter ( 198 bp )

3) 加入 6 ? L DNase I solution (containing 10 mM MgCL2, 5 mM CaCL2, and 1 U of DNase I )。

4) 1 min 後加入 140 ? L stop solution (192 mM sodium acetate, 32 mM EDTA, 0.14 % [wt/vol] SDS, 64 ? L of yeast tRNA)。

5) 以 200 ? L phenol – chloroform (1 : 1) 萃取 reaction mixture 中的 protein。

6) 最後以 ethanol precipitation 沈澱 DNA fragments。

DNase I protection assays*A.

B. G + A specific chemical cleavage of the Maxam–Gilbert method

?

?

--以此法將 DNA fragments 定序。

? To break the glycosidic bond betweenthe ribose and the nucleotide base, and display the base.

? Piperdine treatment catalyzes the phosphodiester bond cleavage where the modified base has been displaced.

1) 加入 4 % formic acid 於 37℃培養 1 hr。( depurination )

2) 加入 1 M piperidine於 90℃培養 30 min。( phosphodiester bond 斷裂)

3) 以 n-butanol沈澱 DNA fragments，離心收集 DNA pellet。

4) Resuspend in formamide loading dye at 1500 cpm/? L

5) Run 8 % acrylamide – 7 M urea sequencing gel

作法：

Maxam – Gilbert Sequencing

Lane 1：no PsrALane 2：375 ng PsrALane 3：G – A specific chemical

cleavage sequencing

PsrA與 rpoS promoter 結合的區域大約為 25 bp，相對 transcription start site 為 – 59 ~ - 35 的區域。此段序列含有一段 palindromic sequence。

GGGGTGCTGATTGGAAAATTTGCTTCAAACGGTAGTTTGAAT

5’CTGCAGAGCGTGCGGTAGGGGGCTGGACCTGGCCGGCCAAC

AAAGGCATTGATATCGCCGGTGATTTGGGACAGCCTGTTTTT

GCTGCGTCTGGTGGTGCAGTGGTCTACGCCGGGAGTGGCTTG

CGGGGCTACGGCGAGCT… … … 290… … … CAGCAAAGGACTA

TAACAATGGCTCTCAATAAAGAAGCGCCGGAGTTTGACATC

GACGATGACGTC 3’

Pst I

EcoR V

Alu I

Aat II

S. D.

+1

-10

- 35

rpoS promoter sequence：

TTGCTTCAAACGGTAGTTTGAATAA- 59 - 35

3’AATAAGTTTGATGGCAAACTTCGTT5’

Results：(rpoS)

Lane 1：G – A specific chemical cleavage sequencing

Lane 2：no PsrALane 3：375 ng PsrA

5’AGTACTGGATGAGCTGCAAGCGCCAAGCAGCAACAAAAAGT

GCCGCGCGGGCCAACTTGTCGCTTGCAGCGTGTAATGGGGCG

CTTTAAATGGCGACCGCCCGGTCACCGAGCCTTGACAGAAGC

AGGGCTGAAACGTATGTTTCAAACACCTGTTTGTCTGGCGGAA

TAATCATGGCCCAATCGGAAACCGTTGAACGCATTC 3’S. D.

+1

-10

-35

Dra I

Sca I

Xmn I

psrA promoter sequence：

3’CTGTTTGTCCACAAACTTTGTATGCAAAGTCGGGACGA5’

PsrA與 psrA promoter 結合的區域大約為 38 bp，相對於 transcription start site 為 +20 ~ - 18。此段序列含有兩段 palindromic sequences，且與rpoS promoter 的 palindromic sequence 有高度相似度。

AGCAGGGCTGAAACGTATGTTTCAAACACCTGTTTGTC- 18 + 20

TTGCTTCAAACGGTAGTTTGAATAA rpoS* * * * * * * * * * * * * *

- 59 - 35

G/CAAAC N2-4 GTTTG/C consensus sequence

Results：(psrA)

Reporter gene fusion assays (psrA promoter)

psrA lexA

Xmn I Sca IP. putida WCS358 genome

198 bp

Xmn I Sca I

2) 再以 BamH I 和 Kpn I 將片段從pBluescript KS 切下，接至 pMP220

(promoter probe vector) 的 Bgl II 和Kpn I 位置。

1) 以片段 上所標示的 enzyme 接至pBluescript KS 的相對切位。

C. 在不同時間測定 ? – galactosidase activity。

B. 將 E.coli中的構築好的 plasmids 以triparental mating 送至 P. putida WCS358 或 P.putida MT17 (psrA::Tn5 knockout mutant) 表現。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Time (hr)

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

?-g

alac

tosi

dase

acti

vity

(Mill

er u

nit)

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

OD

600

nm

P. putida WCS358 growth curve

P. pu

tida

MT1

7(pPP

SR22

1)

P. putida WCS358(pPPSR221)

P. putida MT17(pPPSR221)(pMKP25)

P. putida WCS358(pMP220)

A. 構築 pPPSR221

Results：已證實具有 promoter activity

?觀察 psrA promoter-lacZ fusion 在wild-type(WCS358) 和 psrA::Tn5 knockout mutant (MT17) 不同生長期的表現

? PsrA專一性地與 rpoS promoter - 59 ~ - 35 區域和 psrA promoter + 20 ~ - 18 區域結合，且此二區域含有高相似度的 parlindromic sequences。

Conclusion

?在 P.aeruginosa PAO1 genome ，發現 18 個與 PsrA – binding region consensussequence (G/CAAAC N2-4 GTTTG/C) 相同的序列，其中有 11 個位於 putative open reading frames (ORFs)；另外 7 個位於 putative promoter region，亦即位於translation initiation codon上游的 intergenic region。

PsrA binding site

? PsrA與 psrA promoter 結合的區域含有兩個 parlindromic sequences，因此推測PsrA可能會以不同強度的結合來造成不同程度的 repression。

Position in PAO1 genome Putative promoter

CAAAC GCCT GTTTGGAAAC CG GTTTC

GAAAC CG GTTTCCAAAC ACTT GTTTGGAAAC CAGC GTTTCCAAAC TTCC GTTTGGAAAC CG GTTTC

C/GAAAC N2-4 GTTTG/C

564778-5647912487773-2487784

2488926-24889373367686-33676994029672-40296854059323-40593365572071-5572082

PA0506PA2258-PA2259

(ptxR-ptxS)PA2260PA3006 (psrA)PA3595PA3622 (rpoS)PA4963

?一序列位於 rpoS promoter；另一序列位於 psrA promoter，因此推測在 P.aeruginosa，PsrA的功能與結合區域可能和在 P. putida相同。

AGCAGGGCTGAAACGTATGTTTCAAACACCTGTTTGTC+ 20- 18

concensus sequence

?由 psrA promoter–lacZ fusions 在 wild–type 和 psrA::Tn5 knockout mutant 不同生長期的表現，推測在 late log phase 有一 activator 活化 psrA的表現。

?根據以上實驗，提出 PsrA調控 rpoS和 psrA promoters 的模式。

Conclusion (2)

EarlyLog

Late logStationary

在 early phase 和 log phase 時，PsrA負調控 psrA的表現，到了late log phase和 stationary phase，此抑制漸緩，rpoS受 PsrA的活化，因而誘導所需基因的表現。

?經由 HPLC 與 Progel-TSK G3000SWXL gel filtration column (7.8 mm by 30 cm;Supelco) 測定 PsrA的分子量，顯示 PsrA為 homodimer。

?作者已證實在 P. aeruginosa，PsrA活化 rpoS的表現，且與 P. putida的 PsrA有 90 % 的相似性。

在 420 nm 有吸光值

( o-nitrophenyl-? -D-galactoside )

(黃色 )

? -galactosidase activity assays*

Miller units = 1000 ×OD420 / (T ×V ×OD600)

OD420 = the absorbance at 420 nm of the reacton mixtureOD600 = the absorbance at 600 nm of the bacterial cultureT = time of the reaction in minutes, V = volume of the culture (mL) used in the assay

(Taq I)

(Alu I)

pBluescript KS*

pRPO-TE

pRPO-TT

pRPO-XX

pRPO-PT

pRPO-PA

pRPO-PE

pRPO-ET

Triparental mating*

× ×Tra+

E.coli(pRK2013)Helper

帶有 mobilizable plasmid

E.Coli DH5?Donor

帶有構築好的 plasmid

P.putida WCS358recipient

DNase I protection assays*

Maxam – Gilbert sequencing reactions

Protein binding

Chemical or enzymatic cleavage