Sistemas Quitosana-Esteroides para la liberacin controlada de agroqumicos.

Javier Prez Quiones1,*, Yamilet Coll Garcia1, Richard Szopko2, Claudia Schmidt2, Carlos Peniche Covas3.Centro de Estudios de Productos Naturales, Facultad de Quimica, Universidad de la Habana. Cuba. Email: javierp@fq.uh.cu; cybership01@fastmail.fm. Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Paderborn. Alemania. Centro de Biomateriales, Universidad de la Habana. Cuba.

Introduccin Los ltimos tres aos nos hemos enfocado en el desarrollo de sistemas de liberacin controlada basados en quitosana para agroqumicos, especficamente brasinoesteroides. Los brasinoesteroides (BS) son hormonas vegetales esteroidales con importantes funciones reguladoras en las plantas; as controlan varios procesos fisiolgicos como crecimiento y diferenciacin celular, resistencia a enfermedades y condiciones de estrs bitico y abitico (salinidad, sequia, altas temperaturas)(Altmann et al., 2006). Estas fitohormonas han sido usadas como agroqumicos promoviendo el crecimiento vegetal y la productividad de las cosechas, debido a su habilidad para promover el crecimiento y diferenciacin celular, el aumento de la biomasa, rendimiento y calidad de las semillas y modular la respuesta de la planta ante condiciones de estrs, (Alonso et al., 1995; Asami et al., 2009). Adems varios brasinoesteroides han sido usados para controlar insectos y plagas que afectan a las plantas, debido a su actividad antiecdiesteroide (Bhardwaj et al., 2007; Dinan et al., 2001). (Puedes abundar ms si quieres en la parte de brasinoesteroides). Sin embargo, estos beneficios potenciales no se expresan completamente en las plantas debido a que los brasinoesteroides son rpidamente metabolizados y en ocasiones se necesitan aplicaciones peridicas, incrementado el costo econmico de su empleo. Adems su aplicacin directa en la agricultura se dificulta por su hidrofobicidad, lo cual hace necesario preparar dispersiones coloidales con etanol, surfactantes y aditivos, presentando estabilidad 1

limitada. Por todo lo anterior, es muy importante prolongar la duracin de su accin alcanzando mayores beneficios para los cultivos. La quitosana (CS) es un polisacrido lineal catinico compuesto esencialmente de unidades de (14) glucosamina con alguna proporcin de N-acetilglucosamina. CS se presenta muy raramente en la naturaleza y se obtiene por desacetilacin extensiva de la quitina, un homopolmero de (14) N-acetil-D-glucosamina, presente en el carapacho de los crustceos y moluscos, las paredes celulares de hongos y la cutcula de los insectos (Muzzarelli, 1997). La quitosana es un polmero biocompatible, biodegradable, no txico y mucoadhesivo, lo cual la hace muy atractiva para aplicaciones en medicina y farmacia (Chandy & Charma, 1990; Minami & Shigemasa, 1995; Muzzarelli, 1985; Rinaudo, 2006). As existen numerosos artculos cientficos y patentes sobre la preparacin de microesferas, microcpsulas y nanopartculas de quitosana para la liberacin controlada de frmacos teraputicos (Acosta et al., 2003; Aminabhawi et al., 2007; Dath et al., 2006; Keshavayya et al., 2007). Tambin se ha unido qumicamente la quitosana a distintos frmacos para su liberacin sostenida a partir de microesferas y nanopartculas, debiendo destacarse los recientes estudios en la preparacin de nanopartculas autoensambladas de glicol-quitosana modificada qumicamente (unida a) por colesterol para la liberacin de protenas, genes y otros compuestos (Elena et al., 2007; Hesson et al., 2004; Jing-Mou et al., 2008; Jing-Mou et al., 2009; Rinaudo, 2006). La quitosana es lentamente degradada por la lisozima y la quitosanasa (Matsuhashi et al., 1997). La primera enzima se encuentra en los mamferos y la segunda en plantas e insectos (Jenieux, 1997). La actividad antifngica de la quitosana (Hirano & Nagao, 1989) y su habilidad para promover cambios metablicos en plantas, explican su favorable influencia en el desarrollo de diferentes cultivos, incrementando la germinacin (Fristensky et al., 1984). Recientemente la quitosana ha sido empleada como matriz para la liberacin de varios agroqumicos no esteroidales en la agricultura (Dunn et al., 1990; Shtilman et al., 2006; Shtilman &

Tsatsakis, 1993). En este sentido, el empleo de sistemas quitosana/brasinoesteroides permitira combinar los positivos efectos del polisacrido como germicida, fungicida, estimulador de la germinacin y el desarrollo de las races (Bumgardner et al., 2007; Hewajulige et al., 2007) junto con los de los BS. En este contexto, primeramente estudiamos la encapsulacin directa de diosgenina (esteroide con el esqueleto bsico de los anlogos sintticos de brasinoesteroides obtenidos en el CEPN), monosteres derivados de la diosgenina (monosuccinato de diosgenina , monoitaconato de diosgenina y monomaleato de diosgenina ) y los AB DI-31 y S7 (monosuccinato de DI-31 , monoitaconato de DI-31 , monomaleato de DI-31 ; monosuccinato de S7 , monoitaconato de S7 , monomaleato de S7 ) (ver figura 1 al final) (Agero et al., 2006; Alonso et al., 1995) que presentan reportada actividad biolgica y son ampliamente empleados como estimuladores del crecimiento vegetal en varias formulaciones agroqumicas comercializadas en la isla y el exterior. Desarrollo Se emplearon varias metodologas para obtener los sistemas quitosana/esteroides, con vistas a la liberacin controlada de AB con fines agroqumicos: 1. Encapsulacin directa de los esteroides y derivados en microesferas de quitosana obtenidas por coacervacin simple-entrecruzamiento con tripolifosfato de sodio. 2. Preparacin de conjugados de quitosana-esteroides (en forma de polvo) empleando como espaciadores distintos cidos dicarboxlicos (cido succnico, cido itacnico y cido maleico) va carbodiimidas. 3. Preparacin de microesferas de quitosana conjugada a los derivados de AB. 4. Preparacin de nanopartculas de quitosana conjugada a los derivados de AB.

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1. Microesferas de quitosana encapsulando derivados de diosgenina y AB. Se obtuvieron microesferas de quitosana por coacervacin simple-entrecruzamiento en presencia de tripolifosfato sdico. Las cuales fueron cargadas con los AB (DI31 y S7) y derivados de diosgenina por inmersin en soluciones etanlicas/metanlicas de los esteroides. La extensin de la encapsulacin dependi de la naturaleza de los esteroides y del disolvente empleado (etanol o metanol), alcanzando entre un 10 50 % en peso. Las microesferas se caracterizaron por espectroscopa IR a transformada de Fourier (FTIR), microscopa ptica, microscopa electrnica de superficie (SEM), calorimetra diferencial de barrido (DSC) y espectrofotometra UV para estudiar los perfiles de liberacin controlada. Las partculas presentaron dimetros de entre 790 a 1470 m, observndose un efecto de los BS en las microesferas de CS segn los DSC. Los estudios de liberacin In-vitro, desarrollados en etanol y agua a pH 7, indicaron una dependencia de la extensin de la encapsulacin y la naturaleza de los AB. Se obtuvo una velocidad de liberacin casi constante durante las primeras 10 horas, siendo mayor la liberacin en etanol que en agua. 1.1. Materiales. Se emple quitosana (grado de desacetilacin, G.D= 85.2% determinado por RMN-1H, Mv= 2.55105), obtenida por desacetilacin extensiva de la quitina aislada del carapacho de langosta comn (Panulirus argus) en el Centro de Biomateriales de la Universidad de la Habana, Cuba. La diosgenina, AB y monosteres derivados de ellos se obtuvieron en el CEPN, de la Facultad de Quimica de la Universidad de la Habana; los dems reactivos y solventes son comerciales y se emplearon como recibidos, sin purificacin adicional. Las reacciones de conjugacin y la caracterizacin de los conjugados, microesferas y nanopartculas se desarrollaron/desarrollan en el Departamento de Qumica de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Paderborn, Alemania y la Facultad de Qumica de la Universidad de Aarhus, Dinamarca.

1.2. Preparacin de las microesferas de quitosana por coacervacin simple-entrecruzamiento con tripolifosfato de sodio. Una solucin al 2% (en peso) de quitosana en 2% (volumen) de cido actico acuoso fue goteada mediante un sistema automtico (automatic syringe dispenser con aguja 22G) en una solucin al 10% (peso/volumen) de hidrxido de sodio en metanol. El cambio de pH hace precipitar la quitosana, manteniendo la forma de la gota (microesfera). Las microesferas lavadas varias veces con agua desionizada hasta pH menor de 8 y entrecruzadas en una solucin acuosa de tripolifosfato de sodio al 1% (peso/volumen) a temperatura ambiente por una hora. Despues del entrecruzamiento, las microesferas fueron lavadas con agua desionizada como anteriormente y almacenadas en metanol o etanol respectivamente. Las microesferas fueron aadidas en soluciones etanlicas o metanlicas de los esteroides estudiados, mantenidas a 35C con agitacin magntica por 4 horas y dejadas en reposo por 12-16 horas. Posteriormente fueron filtradas y lavadas varias veces con cloroformo, acetato de etilo y metanol y secadas a presin atmosfrica por 24 horas. La concentracin de esteroide empleando etanol fue de 6 mg mL-1, (F1); mientras en solucin metanlica se empleo una concentracin de 1 mg mL-1 (F2). 1.3. Caracterizacin Los espectros de IR a FT se registraron en estado slido, por el mtodo de la pastilla de KBr. Los tamaos y distribucin de tamaos se determinaron por microscopa ptica con un microscopio ptico Nikon Eclipse E-400. La morfologa de las microesferas se estudio por microscopia electrnica de barrido (SEM) con un microscopio TESCAN 5130 SB. Las muestras fueron revestidas con Au-Pd empleando un POLARON SC 7620. Los estudios de calorimetra diferencial de barrido se desarrollaron con un Calormetro Diferencial de Barrido Perkin-Elmer Pyris 1 y analizados con el programa Pyris 1 (version 6.0.0.033). (PrezQuiones et al., 2010). 5

La estimacin de la capacidad de carga y los estudios de liberacin in vitro se desarrollaron empleando un espectrofotmetro UV Ultrospec 2100 Pro. (detalles Prez-Quiones et al., 2010). 1.4. Resultados El empleo del encapsulador automtico para preparar microesferas de quitosana por coacervacin simple permiti obtener esferas con dimetros muy regulares c.a. 1000 m. Las cuales fueron entrecruzadas por la formacin de un complejo polielectrolito con tripolifosfato de sodio para incrementar la fortaleza y estabilidad de estas partculas. El mtodo empleado para encapsular los esteroides en las microesferas de quitosana involucra condiciones suaves y no destructivas, preferidas cuando los compuestos a encapsular son sensibles a la temperatura. Los esteroides estudiados son moderadamente polares y solo ligeramente solubles en agua, pero muy solubles en alcohol. Por esta razn fueron disueltos en etanol o metanol para su encapsulacin en las partculas de CS. Los % de carga ( en peso) se reportan en la Tabla 1, estando entre un 10-50 %; siendo generalmente mejores para los esteroides disueltos en metanol, aun cuando la concentracin de esteroide en metanol es 6 veces menor. Debe destacarse el incremento notable en encapsulacin cuando la diosgenina fue funcionalizada con los cidos dicarboxlicos. Tabla 1. % esteroide (peso) en las microesferas de quitosana. Conditions F1 F2 Diosgenin MMD>MSD. Los espectros IR a FT de los conjugados diosgenina-quitosana obtenidos por reaccin en solucin/activacin por EDC se muestran en la figura 6. Se incluye el espectro de la quitosana placebo. Nuevamente son dominantes los intensos y anchos picos de la quitosana en el espectro de los conjugados, dado que es mayoritaria y son muy intensos; sin embargo se observan los picos de carbonilo de ester y de amida entre 1740-1715 cm-1. Estos picos solapan las bandas de Amida I y NH2 a 1658 y 1597 cm-1, produciendo una banda ancha entre 1700-1500 cm-1. En la figura 7 se muestran los espectros de RMN-1H de la quitosana y los conjugados quitosanadiosgenina obtenidos por carbodiimidas. Estos espectros tambin estn dominados por los intensos picos de la quitosana a: 2.10 ppm (singlete, Metilo de CH3CO-), 3.18 ppm (singlete, 1H, H-2), 3.75 ppm (singlete, 1H, H-5), 3.80 ppm (singlete,1H, H-6') y 3.95 ppm (singlete, 3H, H-6+H-4+H-3) (ver figura de quitosana con numeracin en Diapo con los espectros RMN). Si embargo, se observan las seales menos intensas de los esteroides a: 1.17-1.18 ppm (doblete, 3H, J= 10 Hz, H27), 1.34-1.40 ppm (singlete+doblete, 6H, H-21+H-19), 2.37-2.38 ppm (singlete, 1H, H-29, H-26 axial) y 5.47-5.48ppm (singlete, 1H, H-6).

Los espectros de difraccin de rayos X a ngulo ancho muestran los picos intensos y anchos caractersticos para la quitosana (baja cristalinidad) a 2 10.7 y 20.0o, mientras los monosteres de diosgenina presentaron picos intensos y estrechos entre 15 y 34o. Los conjugados quitosana esteroides no presentaron los picos intensos de la quitosana, indicando la ausencia de quitosana como fase cristalina (indica que no se encuentra la quitosana libre formando parte de una mezcla); sino picos intensos y anchos entre 18.9 y 36.5o (ver tabla 2) Tabla 2. Picos de difraccin de rayos X a ngulos diosgenina y los conjugados quitosana-diosgenina. Muestra 2 CS 10.7 20.0 MSD 17.8 20.2 24.7* 27.6 MID 21.8 24.2 MMD 7.2* 9.0* 11.0* 12.2* 18.6 19.9* 20.9* 21.3* MSD-CS 14.5* 18.9 23.1 30.3 MID-CS 23.7 24.1 26.3 28.5 MMD-CS 21.8 24.6 29.0 31.5 * corresponde a picos de baja intensidad. anchos de la quitosana, los monosteres de (grados) 30.1* 30.5 15.0 23.2* 32.0 32.7 33.1* 34.1 34.1* 15.8 24.5* 40.4* 35.3 36.5 38.2* 36.7* 16.1 27.5* 40.9* 16.8 28.1* 17.6* 28.7* -

Los espectros de absorcin UV de los conjugados quitosana-esteroides a distintos pH se muestran en la figura 8. Se puede observar que las liberaciones son muy dependientes del pH y controladas por la hidrolisis de la unin ster entre el esteroide y la quitosana. Los porciento de esteroide liberado (en peso) despus de 30 min a diferentes pH se muestran en la tabla 3. Se observa que la cantidad liberada aumenta con la acidez de la solucin para estos compuestos. El monosuccinato de diosgenina fue el compuesto liberado ms rpidamente, mientras el monoitaconato de diosgenina fue liberado lentamente. Tabla 3. % esteroide (peso) liberado a 30 oC en soluciones bfer a los 30 min. Muestra MSD-CS MID-CS MMD-CS % (pH 6.5) 8 MID>MMD; diferente de la reportada en (1), pero la misma que para los derivados de diosgenina unidos a las microesferas CS2 (Figure 11III). Sin embargo, las partculas CS2 ms pequeas, liberaron ms lentamente los esteroides. Esto puede deberse a la estructura ms compacta de las microesferas CS2, como sugiere su superficie ms lisa (figura 9). Los perfiles de liberacin de los brasinoesteroides unidos a las microesferas de quitosana se muestran en las figuras 12 y 13. Estas liberaciones tambin mostraron una cintica de orden cero, hasta las 24 horas. Nuevamente, los esteroides unidos a las partculas mas pequeas (CS2) (Figura 12II and 13II) fueron liberados mas lentamente que de las microesferas CS1 (Figure 12I and 13I). Los AB derivados del acido itacnico (MIDI31 y MIS7) fueron liberados ms rpido y casi cuantitativamente. No se pueden explicar tendencias generales en velocidad de liberacin solo en la base del contenido esteroidal, como se hizo en el caso de los esteroide libres encapsulados (1). La liberacin de los esteroides unidos a las partculas de CS es mas compleja, dado que depende de la hidrlisis de la unin esteroide-quitosana, el contenido en esteroide, el tamao y morfologa de las partculas, y la solubilidad de los esteroides en agua. Sin embargo, se logro prolongar la liberacin 15

en el tiempo de los esteroides unidos a las microesferas comparado con los esteroides libres encapsulados (1). 3.3. Conclusiones Se lograron preparar microesferas de quitosana unidas a esteroides capaces de liberar sostenidamente los mismos hasta 48 horas. Las liberaciones son dependientes del pH y la velocidad de las mismas depende de varios factores. Los sistemas obtenidos pueden ser aplicados como potenciales controladores de la liberacin sostenida de AB con fines agroqumicos.

4. Preparacin de nanopartculas de quitosana conjugada a los derivados de AB. Actualmente estamos trabajando en la preparacin de nanoparticulas de glicolquitosana conjugada con los monosteres esteroidales de la diosgenina y de los AB. Estos conjugados podrn formar micelas/nanopartculas bajo las condiciones apropiadas de grado de sustitucin y de concentracin en la solucin acuosa.

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