thẠc sỸ nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein...

7/27/2019 THẠC SỸ Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc

http://slidepdf.com/reader/full/thac-sy-nghien-cuu-che-tao-vat-lieu-nano-chitosan-lam-chat 1/109

01234563789632344349343643243

!"#$

3

3

3

%&'()*+

3

3

3

$,)+!-./)"!!"

/!

,%!%)*):

3

3

3

3

;8<3=>34163?@34A3;B3

3

3

333333333

3

3

3

3

44349343643243C3DEFE3

3



0 0

123456748974345545454754354

000!"00#0$0

4

4

4

%&0'0(0)*+0

4

4

4

$0,)0+0!0-.0/)0"!0!"0

/0000!0

,0%0!0%0)*0):0

4

7;<=>?4?@A?;B45CD4EF4

G4HIB4JK4LL4MN4

4

4

E9O4PQ45274RS45T4EU4

4

4

VW345VX4YZ4[5\45674

4R]4@<=?4;_4;a?@4;b?@4

444444444

4

4

4

5545454754354c4dKNK4



0 0

1

23405670890

0

1

1

1111101111!1"#1$1%&1"'1(1)(*1

+,1-."1/1'1,11"1""11

1:;90<=>0?=@A90?=B911C1D"1"EF1GH1I,1"1""1

J11C1!1K*1+,1$L11111C1D"1"M1GHN1O"1"EFN11

PQ1R1I,11S1$1%&1"'1(1T(1)(*1

U1"VK11-"(1WX(1"#11U1"VK11$E'1YZ1"#1["(1"#1\]1

"11$(1O1"1I,1"_1-1"1V1"1$1%&1)U1$D"1

"#1CQ*1

a"b1WX(1c1d1Ge1f1["(1WX(1"#N11K1g1a"V1hL1i"CQ1

["j1k1\1lmn+om11"p1$q1"X(1"L11"1O1$1%&1"'1(1

I,1"]1"r1C1!*11

1

h1,11%]1PQ1R1C1D"1s(1I,1tu0vwx0y=@A911I,1?=90z{0

?=@A9N1,11U1("1"ON1Z1|11S1N1PQ1RN1"(1%}1"_1-"X1-"!1

1~Q1Q"1$1"'1(1"]1"r1J1*1

+,1-."1/1'1,11%1%11v0=:0x1$1"S11"L,1C1!1

1G"1"'1(1)c1U1s(1,D"11I,111XQ1c1"1C1!1Eq1"1"r1

"*1

0

0

0

0

0



CHƯƠ NG 1

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU



Tổng quan tài liệu12

CHƯƠ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về chitosan

1.1.1. Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cách

deacetyl hoá chitin. Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác

như tôm, cua. Chitosan còn có thể đượ c tìm thấy từ những loài vi sinh vật như nấm,

men.

Hình 1.1. Công thứ c cấ u t ạo chitin và chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế

nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan đượ c cấu tạo từ các mắc xích

D-glucosamine liên k ết vớ i nhau bở i liên k ết α-(1-4)-glycoside [15], [25].




1.1.2. Tính chất chitosan

9 Không độc, tính tươ ng ứng sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh học

nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến

môi tr ườ ng.

9 Cấu trúc ổn định.

9 Tan tốt trong dung dịch acid loãng (pH < 6,3) và k ết tủa ở những giá tr ị pH

cao hơ n, hóa tím trong dung dịch iod.

9 Có tính kháng khuẩn tốt.

9 Là hợ p chất cao phân tử nên tr ọng lượ ng phân tử của nó giảm dần theo thờ i

gian do phản ứng tự cắt mạch. Nhưng khi tr ọng lượ ng phân tử giảm thì hoạt

tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi.

9 Có khả năng hấ p phụ cao đối vớ i các kim loại nặng.

9 Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dươ ng cao.

9 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine có ngh ĩ a chúng vừa là alcol vừa là amine, vừa là

amide. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế

O-, dẫn xuất thế N-.

9 Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer đượ c nối vớ i nhau

bở i các liên k ết α-(1-4)-glycoside; các liên k ết này r ất dễ bị cắt đứt bở i các

chất như: acid, baz, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [15], [25].

1.1.3. Ứ ng dụng của chitosan

Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dượ c độn trong làm

cốm, tá dượ c ổn định viên nén, thuốc tr ị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợ p

chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấ p thụ lipid. Chitin

đượ c dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật.




Trong công nghiệ p thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì

hươ ng vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tươ ng, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau

quả tươ i, làm trong nướ c quả ép, giữ màu sắc và hươ ng vị tự nhiên của sản phẩm.

Trong công nghiệ p in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệ p

nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Trong nông nghiệ p, oligochitosan làm thuốc

tăng tr ưở ng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh

cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươ i cho cây nuôi cấy mô.

Trong khoa học k ỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại của

kính hiển vi, xử lý nướ c thải công nghiệ p và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein, phenol, thuốc tr ừ sâu, thuốc nhuộm…[15], [25].

1.2. Tổng quan về nano chitosan

Chitosan đượ c sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong

những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thướ c nano. Chitosan

là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, đượ c tìm thấy ở loài động

vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Vớ i nhiều tính năng như tính tươ ngthích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó tr ở thành

nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dượ c sinh học. Do đó, hạt nano chitosan tr ở thành

hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớ n [32].

Nano chitosan do có kích thướ c siêu nhỏ (từ 10 đến 1000nm) nên dễ dàng đi

qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đườ ng khác nhau như dùng ngoài

da, dùng qua đườ ng miệng, qua mũi…. Nano chitosan có diện tích và điện tích bề

mặt cực lớ n nên đượ c ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vaccine,

vectơ chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều tr ị ung thư…. Khi sử dụng nano

chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều tr ị đượ c bảo vệ bở i những hạt nano chitosan

khỏi sự phân huỷ sinh học. Do kích thướ c r ất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm

sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều tr ị [28].

Trên thế giớ i, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục

đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát




triển vectơ chitosan hướ ng đích thuốc trên những tế bào ung thư. Một số công trình

tiêu biểu là điều chế hạt chitosan composite vớ i acid polyacrylic để điều khiển và

kéo dài thờ i gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan vớ i cholesterol để dẫn

thuốc đến mắt; biến tính vớ i N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền

đườ ng mũi; tạo phức vớ i acid deoxycholic để dẫn truyền gen [11]. Ngoài ra, nano

chitosan còn đượ c nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [9], [24], ứng dụng trong thực

phẩm chức năng [5], [6]. Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ ,

điện tích bề mặt hạt nano chitosan vì đây là những đặc tính r ất quan tr ọng quyết

định hiệu quả gây nhiễm gen, gắn k ết các phân tử protein trên hạt nano [12]. Tuy

nhiên, các k ết quả đạt đượ c r ất khác nhau [10], [20], [21], [30], [31].

Ở nướ c ta, số lượ ng bài nghiên cứu về nano chitosan r ất ít. Mức độ cậ p nhật

của các nghiên cứu trong nướ c so vớ i các nghiên cứu của các nhà khoa học khác

trên thế giớ i còn thấ p, chỉ có nhóm của PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng [2] và nhóm

của TS. Tr ần Đại Lâm [3] nghiên cứu về vấn đề này. Các khảo sát này bướ c đầu

cho thấy những k ết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan làm chất mang

vaccine, thuốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa đi sâu vào khảo sát thực

nghiệm và đánh giá k ết quả tạo hạt nano chitosan, chưa đáp ứng đượ c hết những

tiềm năng to lớ n mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con

ngườ i.

1.3. Các phươ ng pháp chế tạo nano chitosan

Hiện nay có nhiều phươ ng pháp tạo nano chitosan. Phươ ng pháp đượ c sử

dụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phươ ng pháp này là quá trình chuẩn bị đơ n giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớ n, do

đó phươ ng pháp này đượ c nghiên cứu r ộng rãi trong tổng hợ p chất dẫn thuốc và

thực phẩm chức năng [28].

Những yếu tố ảnh hưở ng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thướ c hạt

và sự tích điện bề mặt là khối lượ ng phân tử và độ deacetyl hoá của chitosan. Hiệu




quả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá tr ị pK a và độ hoà tan của

thuốc. Thuốc k ết hợ p vớ i chitosan qua tươ ng tác t ĩ nh điện, liên k ết hidro, … [28].

Sự lựa chọn phươ ng pháp tổng hợ p nano chitosan còn phụ thuộc vào bản

chất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau

[11].

Bảng 1.1. Tóm t ắt phươ ng pháp đ i ều chế hạt nano chitosan làm chấ t d ẫ n các loại

thuố c, protein hoặc gen khác nhau.

Phươ ng pháp điều chế nano chitosan Thuốc/ protein/ gen

Gel ion Insulin, ricin, BSA, cyclosporine A

Phươ ng pháp giọt tụ/k ết tủa DNA/Doxorubicin

Hợ p nhất giọt nhũ tươ ng Acid gadopentetic

Mixen đảo Doxorubicin

Theo S.A. Agnihotri (2004), có 5 phươ ng pháp chủ yếu để tạo hạt nano

chitosan là: Phươ ng pháp khâu mạch nhũ tươ ng (emulsion cross-linking), phươ ng

pháp giọt tụ/k ết tủa (coacervation/precipitation), phươ ng pháp hợ p nhất giọt nhũ

tươ ng (emulsion-droplet coalescence), phươ ng pháp tạo gel ion (ionic gelation) và

phươ ng pháp mixen đảo (reverse micellar) [4].




1.3.1. Phươ ng pháp khâu mạch nhũ tươ ng

Hỗn hợ p nhũ tươ ng nướ c trong dầu (w/v) đượ c tạo ra bằng cách phân tán

dung dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng đượ c làm bền bở i chất hoạt động bề

mặt. Dung dịch nhũ tươ ng sau đó đượ c khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợ p

như glutaraldehyde. Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng vớ i nhóm

–NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan [4].

Hình 1.2. S ơ đồ t ạo hạt bằng phươ ng pháp khâu mạch nhũ t ươ ng




1.3.2. Phươ ng pháp giọt tụ/k ết tủa

Phươ ng pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung

dịch kiềm. Bở i vậy, chitosan sẽ bị k ết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiế p

xúc vớ i dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc

ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ đượ c một thiết bị nén phun vào dung dịch

kiềm để tạo hạt nano [4].

Hình 1.3. S ơ đồ t ạo hạt bằng phươ ng pháp gi ọt t ụ .




1.3.3. Phươ ng pháp hợ p nhất giọt nhũ tươ ng

Phươ ng pháp này lần đầu đượ c sử dụng vào năm 1999. Phươ ng pháp này sử

dụng nguyên tắc của cả hai phươ ng pháp: tạo nối ngang nhũ tươ ng và k ết tủa. Thay

vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, k ết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan k ết

hợ p vớ i các giọt NaOH. Một hệ nhũ tươ ng bền chứa dung dịch chitosan cùng vớ i

thuốc tạo ra trong paraffin lỏng. Đồng thờ i, một hệ nhũ tươ ng bền khác chứa dung

dịch chitosan và NaOH cũng đượ c tạo ra theo cách như trên. Khi cả hai hệ nhũ

tươ ng này đượ c tr ộn lại vớ i tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một

cách ngẫu nhiên, hợ p lại và k ết tủa thành những hạt nhỏ [4].

Hình 1.4. S ơ đồ t ạo hạt bằng phươ ng pháp hợ p nhấ t gi ọt nhũ t ươ ng.




1.3.4. Phươ ng pháp tạo gel ion

Cơ chế của phươ ng pháp này dựa trên tươ ng tác t ĩ nh điện giữa chitosan tích

điện dươ ng và một polyanion như tripolyphosphate. K ỹ thuật này có ưu điểm là giai

đoạn chuẩn bị đơ n giản và thực hiện trong môi tr ườ ng nướ c. Đầu tiên chitosan đượ c

hòa tan vào dung dịch acid acetic. Sau đó chitosan đượ c tr ộn lẫn vớ i polyanion để

tạo hạt nano chitosan dướ i điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng. Kích

thướ c và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan

và polyanion khác nhau [4].

Hình 1.5. S ơ đồ t ạo hạt bằng phươ ng pháp t ạo gel ion.

1.3.5. Phươ ng pháp mixen đảoTrong phươ ng pháp này, ngườ i ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung

môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo. Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc

đượ c thêm từ từ vớ i tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch. Pha lỏng

đượ c giữ sao cho hỗn hợ p tr ở thành pha vi nhũ trong suốt. Sau đó tác nhân tạo nối

ngang dượ c thêm vào và khuấy qua đêm. Cô quay loại dung môi. Phần còn lại phân

tán lại trong nướ c. Dung dịch muối thích hợ p đượ c thêm vào để k ết tủa chất hoạt




động bề mặt. Hỗn hợ p đượ c ly tâm. Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang

thuốc đượ c chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ . Đông cô chất lỏng thu đượ c cho

ta bột thuốc [4].

Hình 1.6. S ơ đồ t ạo hạt bằng phươ ng pháp mixen đảo.

1.4. Ứ ng dụng của hạt nano chitosan

1.4.1. Chất mang dẫn truyền thuốc

1.4.1.1. Phân loại theo con đườ ng sử dụng

Hạt nano chitosan có kích thướ c nhỏ nên nó thích hợ p cho nhiều con đườ ng

sử dụng thuốc khác nhau..

• Sử dụng bên ngoài đườ ng tiêu hóa

Các hạt nano có thể đượ c dùng trong t ĩ nh mạch bở i vì đườ ng kính của các

mao mạch máu nhỏ nhất là khoảng 4µm. Sự phân bố sinh học của các hạt nano có

thể thay đổi tùy thuộc vào kích cỡ , điện tích bề mặt và tính k ỵ nướ c của chúng. Các

hạt có bán kính lớ n hơ n 100nm sẽ bị hấ p thu nhanh chóng bở i hệ lướ i-nội mô trong

gan, lá lách, phổi và tủy xươ ng. Ngượ c lại, những hạt nhỏ hơ n có xu hướ ng có thờ i

gian luân chuyển kéo dài [28].




Các loại thuốc hứa hẹn nhất đã đượ c nghiên cứu r ộng rãi để dẫn truyền theo

cách này là những tác nhân kháng ung thư. Sau khi tiêm vào t ĩ nh mạch, nhiều hệ

thống hạt nano bao gồm nano chitosan có xu hướ ng tích lũy lại trong một số khối u

(Brasseur, 1980; Kreuter, 1994). Những hạt nano chitosan mang doxorubicin làm

chậm sự tăng tr ưở ng của khối u và nâng cao tỷ lệ sống sót của những con chuột bị

cấy khối u. Ngoài ra, những hạt nano chitosan có kích thướ c nhỏ hơ n 100nm đượ c

tạo ra cho thấy đã tránh khỏi hệ lướ i-nội mô và luân chuyển trong máu đượ c lâu

hơ n [28].

Dẫn truyền những dượ c chất kháng bệnh như là kháng khuẩn, kháng virus,kháng nấm và kháng ký sinh là một hướ ng sử dụng khác của hạt nano (Bender,

1996; Page-Clisson, 1998; Soma, 2000). Chỉ số điều tr ị của thuốc kháng nấm thấ p,

thờ i gian bán hủy của những dượ c chất kháng virus ngắn và khả năng thâm nhậ p

vào tế bào bị bệnh trong khoang nội bào của thuốc kháng sinh kém làm cho những

hạt nano tr ở thành những ứng viên dẫn truyền lý tưở ng. Những hạt nano một mặt

nâng cao hiệu quả điều tr ị, mặt khác làm giảm tác dụng phụ độc hại của thuốc. Trên

lý thuyết, nano chitosan là hệ thống chất mang hấ p dẫn cho những loại thuốc này vì

chúng có nhiều thuận lợ i như có bề mặt ưa nướ c và kích thướ c nano nhỏ hơ n

100nm. Ngoài ra, sử dụng trong cơ và dướ i da cũng có thể là hướ ng dẫn truyền khác

của hạt nano bở i vì khả năng giảm kích ứng tại điểm tiêm và bảo vệ thuốc không bị

enzyme phân hủy (Little, 1962) [28].

• Sử dụng qua đườ ng uống

Ý tưở ng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị enzyme phân hủy trong bộ máy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành những hệ thống dẫn truyền

những phân tử lớ n, protein và polynucleotide. Phươ ng pháp này đượ c nghiên cứu

r ộng rãi sau một báo cáo r ằng lượ ng đườ ng trong máu của những con chuột mắc

bệnh tiểu đườ ng giảm sau khi uống những hạt nano insulin (Damge,1990). Kích

thướ c hạt nhỏ hơ n 500nm là một yếu tố then chốt cho phép vận chuyển qua niêm

mạc ruột theo cơ chế endocytotic. Bên cạnh enzyme, màng nhầy ngăn cản sự




khuyếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấ p thụ biểu mô là chướ ng ngại

chính chống lại sự hấ p thụ thuốc protein qua thành ruột. Do đó, hoạt tính của thuốc

có thể đượ c cải thiện bằng cách kiểm soát kích thướ c hạt cùng vớ i kéo dài thờ i gian

lưu giữ thuốc trong bộ máy tiêu hóa. Trong số những hạt nano polymer, hạt nano

chitosan là chất dẫn thuốc lý tưở ng vì chúng làm tăng mức hấ p thu thuốc [28].

Khả năng cải thiện mức hấ p thu của chitosan đã đượ c nghiên cứu r ộng rãi.

Đặc tính bám dính của chitosan là do tươ ng tác giữa chitosan tích điện dươ ng và

niêm mạc tích điện âm. Điều này làm kéo dài thờ i gian tươ ng tác của thuốc và bề

mặt hấ p thụ [28].• Sử dụng qua đườ ng mắt

Các hạt nano đượ c nhận thấy là chất mang tiềm năng để dẫn truyền qua

đườ ng mắt. Nhiều thí nghiệm cho thấy hạt nano có khuynh hướ ng bám chặt vào bề

mặt biểu mô mắt. K ết quả kéo dài thờ i gian lưu giữ, tốc độ đào thải thuốc chậm hơ n

so vớ i những phươ ng pháp điều tr ị mắt truyền thống, do đó cải thiện dượ c tính của

thuốc. Vì vậy, những hạt nano đã đượ c dùng để dẫn thuốc kháng viêm, kháng dị ứng cho những mục tiêu điều tr ị viêm mắt [28].

Chitosan đã đượ c sử dụng như là chất mang dẫn thuốc điều tr ị chứng viêm

mắt bở i vì tác động thúc đẩy mức hấ p thu thuốc. Chitosan không chỉ gia tăng thờ i

gian tươ ng tác vớ i giác mạc qua tươ ng tác t ĩ nh điện giữa điện tích dươ ng của nó và

niêm mạc tích điện âm, nó còn có khả năng xuyên qua lớ p niêm mạc, nâng cao

dượ c tính của thuốc. Nhóm của Felt (1999) tìm thấy dung dịch chitosan kéo dài thờ i

gian lưu giữ thuốc kháng sinh trên giác mạc của thỏ. Những tác động tươ ng tự cũng

đượ c quan sát thấy khi sử dụng những hạt nano chitosan. Những hạt này đượ c giữ

trên giác mạc và k ết mạc của thỏ ít nhất 24 giờ . Nhóm của De Campos (2001) phát

hiện thấy sau khi sử dụng những hạt nano chitosan trên thỏ, hầu hết thuốc đượ c tìm

thấy trong những mô ngoài mắt, giác mạc và k ết mạc trong khi chỉ một lượ ng thuốc

nhỏ đượ c tìm thấy trong những mô trong mắt, mống mắt và chất dịch lỏng [28].




1.4.1.2. Phân loại theo ứ ng dụng trong điều trị bệnh

• Hoạt tính kháng ung thư

Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicin để ức chế

khối u trên chuột. K ết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicin độc lậ p thì khối u ở chuột

vẫn tăng lên 900mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giải chậm

doxorubicin trong hạt nano chitosan kích thướ c khối u giảm chỉ còn 170mm3 và

chuột vẫn sống sau 90 ngày thí nghiệm [2].

L. Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư tr ực tiế p của hạt nano

chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính

cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S 180 và hepatoma

H 22. K ết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượ ng tế bào ung thư vớ i liều uống

2,5mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0,5mg/kg là

43-53%, trong khi đó chitosan chỉ là 30% [2].

K ết quả cũng cho thấy kích thướ c hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung

thư càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá chất thuốcchống tớ i tế bào đích ung thư. Kích thướ c hạt nano khoảng 350nm. Hiệu quả chống

ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan r ất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột

A549 đồng thờ i làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư [2].

• Ứ ng dụng trong ly giải chậm thuốc

Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporine A (Cry A) bằng

cách hấ p phụ trong dung dịch chitosan và hạt nano chitosan. Lượ ng thuốc phóngthích trong thí nghiệm hấ p phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn gấ p 2,5-3 lần so vớ i

đối chứng là dung dịch Cry A. K ết quả là nồng độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm

luôn luôn cao hơ n so vớ i nhóm đối chứng và hấ p phụ trong dung dịch chitosan [2].

El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốc

cycloporine A để uống, kích thướ c hạt nano là 150nm. K ết quả cho thấy hiệu suất

mang thuốc là 94%, nồng độ cycloporine A trong máu là 2760ng/ml cao gấ p 2,5 lần




so vớ i hạt nano sodium glycholate. Hoạt tính của cyclosporine A cố định trong hạt

nano chitosan tăng 72%, gelatin nano chitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium

glycholate lại giảm tớ i 36% so vớ i đối chứng [2].

Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấ p thu insulin qua niêm

mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-nano chitosan, kích thướ c hạt nano là

150-300nm. Hiệu quả hấ p thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-nano

chitosan cao hơ n so vớ i PEG-chitosan là 30-40%. Kích thướ c hạt nano càng nhỏ,

diện tích bề mặt hạt càng lớ n và điện tích dươ ng trên bề mặt càng cao là nguyên

nhân ảnh hưở ng đến khả năng hấ p thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi. Shedaghi(2008) hạt nano trimethyl chitosan để làm vật liệu ly giải chậm insulin. K ết quả cho

thấy động học ly giải của insulin nhốt trong hạt nano trimethyl chitosan ổn định và

kéo dài hơ n [2].

Kevin (2001) sử dụng hạt nano chitosan mang thuốc doxobucin,

anthracyline[2].

Zing Zhang (2007) nghiên cứu phức hợ p nano oleyl-chitosan mang thuốcthải chậm doxorubicin trong phòng tr ị ung thư. Hiệu suất hấ p phụ thuốc là 52,6%.

Động học ly giải chậm thuốc phụ thuộc pH môi tr ườ ng đượ c ghi nhận trong hình

cho thấy lượ ng pH 7,4 tốc độ ly giải thấ p hơ n trong môi tr ườ ng acid pH 3,8 [2].

Shadeghi (2008) nghiên cứu hấ p phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, nano

dietylmethyl chitosan và nano trimethyl chitosan. K ết quả về động học ly giải chậm

insulin khá ổn định cho cả ba vật liệu hạt nano [2].

1.4.2. Chất mang dẫn truyền vaccine

Một lượ ng lớ n protein kháng nguyên và chữa bệnh đã đượ c phát hiện. Tuy

nhiên, ứng dụng chúng còn khó khăn do phươ ng pháp dẫn truyền protein thích hợ p

chưa có sẵn. Việc tạo ra những chất mang để dẫn vaccine qua những lớ p niêm mạc,

ví dụ niêm mạc ruột và mũi đã đượ c thử nghiệm. Đượ c dùng làm chất mang

vaccine, chitosan đượ c chuyển thành những dạng khác nhau: dạng viên, dạng hạt,

hạt micro và hạt nano. Các thông tin tích lũy trong những năm qua cho thấy tầm




quan tr ọng của kích thướ c và lợ i thế của hạt nano so vớ i hạt micro. Cụ thể hơ n, các

nhà nghiên cứu đã tìm thấy số lượ ng hạt nano qua biểu mô ruột nhiều hơ n số lượ ng

hạt micro. Do đó, việc điều chế những hạt nano chitosan làm chất mang dẫn truyền

vaccine đã thu hút đượ c nhiều chú ý [7].

Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan để mang vaccine

tetanus qua niêm mạc mũi. Kích thướ c hạt nano là 350nm, điện tích là +40mV, có

hiệu suất mang vaccine tetanus là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạt

nano chitosan cao gấ p lần so vớ i sử dụng kháng nguyên tetanus tự do sau 2 tuần,

tăng gấ p 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệmsử dụng hạt nano chitosan cao hơ n so vớ i đối chứng gấ p 2,5 lần và tăng lên theo

thờ i gian từ 2-24 tuần [2].

Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng nano trimethyl chitosan làm tá chất cho

một tiểu đơ n vị (subunit) của vaccine cúm H3 N2. Kích thướ c hạt nano chitosan là

800nm. Hiệu suất hấ p phụ kháng nguyên (LE) là 78%, khả năng hấ p phụ kháng

nguyên (LC) là 13% (w/w). K ết quả miễn dịch cho thấy là các chỉ số miễn dịch HI,

IgG ở thí nghiệm nano trimethyl chitosan là 103 và 105 cao hơ n so vớ i antigen trong

muối đệm phosphate là 0,8.102 và 103, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng nano

chitosan cũng cao hơ n 102 lần so vớ i tá chất là dung dịch trimethyl chitosan [2].

Những hạt nano đượ c điều chế bằng phươ ng pháp vi nhũ và phươ ng pháp tạo

nối ngang cộng hoá tr ị đều không thích hợ p cho việc sử dụng làm chất dẫn vaccine.

Trong khi đó những hạt nano chitosan tạo nối ngang vớ i TPP sử dụng làm chất dẫn

vaccine đã đượ c nghiên cứu r ộng rãi [7].

Điểm đến của vaccine có thể ảnh hưở ng đến hiệu quả hấ p thu. Các hạt nano

chitosan cho thấy là chất dẫn truyền hiệu quả cho những nhiều phân tử lớ n qua

đườ ng mũi, khí quản, miệng và niêm mạc mắt (Janes, 2001; Van der Lubben, 2001;

Takeuchi, 2001; Dyer, 2002) [7].




1.4.3. Chất mang dẫn truyền gen

Những hệ thống dẫn truyền không virus (non-virus) trong liệu pháp gen đã

đượ c đề xuất để thay thế những vectơ virus. Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng

miễn dịch từ vật chủ. Hơ n nữa, chúng định đượ c mục tiêu, dễ bảo quản và sản xuất

lượ ng lớ n. Những lợ i thế này tạo động lực cho sự phát triển của chúng. Polymer

cation đượ c nhận thấy là chất mang hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyền

gen không virus. Chất mang gen polymer nổi lên vớ i hiệu quả chuyển gen, xác định

mục tiêu điều tr ị và khả năng tươ ng thích sinh học tốt [7].

Chitosan là một vectơ không virus thích hợ p cho dẫn truyền gen. Tươ ng tácgiữa chitosan và DNA là tươ ng tác t ĩ nh điện (Roy, 1997; MacLaughlin, 1998) .

Tươ ng tác điện này mạnh đến nỗi phức chitosan-DNA không bị tách ra cho đến khi

nó vào trong tế bào. Chitosan và những dẫn xuất của chitosan tụ lại bảo vệ DNA

khỏi sự phân hủy DNase. Những hạt nano chitosan/DNA có khoảng phân bố kích

cỡ hẹ p đượ c tạo ra bở i quá trình giọt tụ. Những hạt nano chitosan/DNA có kích

thướ c từ 20-500nm nhỏ hơ n những hệ thống polymer khác nên thâm nhậ p vào tế

bào thuận lợ i hơ n qua cơ chế endocytosis và/hoặc pynocytosis, làm tăng tốc độ gây

nhiễm (Mao, 1997; Sato, 2001) [7].

Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm

ligand để có tươ ng tác tế bào cụ thể, như transferrin hoặc galactose (Mutara, 1996;

Erbacher, 1998; Park, 2001; Christopher, 2001; Gao, 2003; Kim, 2004) [7].

K ết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống đều cho thấy khi

hạt nano chitosan/DNA vào trong cơ thể, chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu

và bám trên những cơ quan khác nhau. Kích cỡ hạt khác nhau thì phân bố trên

những cơ quan khác nhau (Mao, 2001; Yoo, 2005). Hàng loạt nghiên cứu trong ống

nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy chitosan là vật liệu thích hợ p để dẫn truyền

vaccine DNA và gen không virus [7].




1.4.4. Ứ ng dụng trong thự c phẩm chứ c năng

Sự phát triển những thực phẩm có hoạt tính sinh học có lợ i cho sức khỏe tạo

ra cơ hội nâng cao sức khỏe cộng đồng. K ết hợ p những chất có hoạt tính sinh học

vào trong thực phẩm như peptide, vitamine là cách thức đơ n giản để tạo ra những

thực phẩm chức năng mang lợ i những lợ i ích sinh lý và giảm thiểu những r ủi ro

bệnh tật. Tuy nhiên, hiệu quả ngăn chặn bệnh của những sản phẩm này nằm ở khả

năng bảo quản đượ c hoạt tính sinh học của những thành phần hoạt tính. Đây là một

thách thức lớ n bở i vì hầu hết các phân tử này có thờ i gian lưu giữ trong dạ dày

ngắn, tính thấm và độ tan kém trong ruột. Hơ n nữa chúng không bền trong nhữngđiều kiện chế biến thực phẩm hoặc trong bộ máy tiêu hóa (pH, enzyme, sự hiện diện

của những dưỡ ng chất khác). Những hệ thống bao giữ (encapsulation system) có thể

đượ c sử dụng để vượ t qua những giớ i hạn này. Tuy nhiên, vì đượ c dùng trong

những ứng dụng thực phẩm, những hệ thống dẫn truyền phải đượ c công nhận là an

toàn [5].

Trong số những hệ thống dẫn truyền này, hạt nano chitosan thu hút nhiều chú

ý trong những năm gần đây do khả năng bám dính vào niêm mạc và xuyên qua lớ p

niêm mạc. Kích thướ c nhỏ giúp chúng kéo dài thờ i gian lưu giữ trong bộ máy tiêu

hóa. Những công trình mớ i nhất cũng chỉ ra toàn bộ những hạt nano chitosan có thể

đượ c hấ p thu vào tế bào ngườ i [6].

Β-lactoglobulin (βlg), một loại protein chính trong sữa của động vật nhai lại,

đã đượ c dùng nhiều trong thực phẩm do có giá tr ị dinh dưỡ ng. Khả năng tạo gel,

nhũ tươ ng cho phép chúng tr ở thành nguyên liệu lý tưở ng để bao giữ các hợ p chấtcó hoạt tính sinh học. Nó còn có khả năng kháng lại sự phân rã do pepsin có trong

dạ dày [6].

Lingyun Chen (2005) điều chế những hạt nano core-shell

chitosan/β-lactoglubulin làm chất mang dưỡ ng chất. Những hạt nano chitosan đượ c

phủ lớ p protein βlg này có khả năng bảo vệ những chất dinh dưỡ ng chống lại acid

và pepsin trong dạ dày. Khi tiến vào đườ ng ruột, lớ p phủ βlg bị phân rã bở i




pancreatin, còn hạt nhân chitosan bám vào trong thành ruột, tạo thuận lợ i cho sự

hấ p thu dưỡ ng chất [6].

Như vậy hạt nano chitosan phủ βlg có hai tác dụng: lớ p vỏ bảo vệ dưỡ ng

chất trong dạ dày còn hạt nhân cải thiện thờ i gian lưu giữ dưỡ ng chất trong thành

ruột, đồng thờ i điều khiển tốc độ phóng thích chúng.

Protein thực phẩm đã đượ c điều chế thành nhiều loại chất nền ở dạng gel, hạt

micro, hạt nano đáp ứng yêu cầu cho những ứng dụng trong thực phẩm chức năng.

Khả năng kiểm soát kích cỡ hạt protein quyết định tốc độ phóng thích dưỡ ng chất

và lượ ng hấ p thu vào cơ thể. Ở dạng gel và hạt micro, những dưỡ ng chất đượ c phóng thích khỏi chất nền để hấ p thu vào thành ruột. Trong khi đó, hạt nano cải

thiện khả năng hấ p thu dưỡ ng chất bằng cách kéo dài thờ i gian lưu giữ trong thành

ruột hoặc hấ p thu tr ực tiế p bở i biểu mô ruột [5].

Hình 1.7. Hình minh họa nhữ ng cơ chế hấ p thu d ưỡ ng chấ t




1.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đượ c nghiên cứu trong nhiều tài liệu.

Theo những nghiên cứu tr ướ c, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi tr ườ ng

acid là do sự proton hóa nhóm -NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamine. Chitosan

mang điện dươ ng sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ

màng bằng cách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế

sự truyền dưỡ ng chất vào trong tế bào [24].

Hạt nano chitosan có diện tích tiế p xúc và điện tích dươ ng lớ n hơ n chitosan

thông thườ ng nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơ n nhiều lần so vớ i chitosan. L. Qi(2004) nghiên cứu chế tạo nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn. Hạt nano

chitosan đượ c chuẩn bị bằng phươ ng pháp tạo gel trong tripolyphosphate (TPP),

kích thướ c hạt 40nm [24]. Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano

chitosan trên 4 loại vi khuẩn E. coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus

cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so vớ i chitosan. Nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32μg/ml so vớ i chitosan là 8-16μg/ml

và kháng sinh doxycyline là 1/4-4μg/ml.

Bảng 1.2. Chỉ số MIC ( μ g/ml ) và MBC ( μ g/ml) của chitosan, nano chitosan

(CNP), nano chitosan nhố t Cu (CNP-Cu) và doxycycline.

Vi khuẩnChitosan CNP CNP-Cu Doxycycline

MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC

E. coli K88 8 64 1/16 1 1/32 1 1 4

E. coli ATCC

25922 8 64 1/32 2 1/32 1 2 16

S. choleraesuis

ATCC 5002016 32 1/16 2 1/32 1 4 32

S. typhimurium

ATCC 5001316 64 1/8 4 1/16 2 2 32

S. aureus ATCC

25938 32 1/8 4 1/16 2 1/4 8




Hình 1.8. Ả nh hi ể n vi nguyên t ử l ự c (AFM) của t ế bào S. choleraesuis sau khi x ử

lý vớ i nano chitosan theo thờ i gian. Chư a x ử lý (A), x ử lý 30 phút (B), x ử lý 1 gi ờ

(C), x ử lý 1,5 gi ờ (D), x ử lý 2 gi ờ (E), x ử lý 3 gi ờ (F).

Hình thái của vi khuẩn S. choleraesuis xử lý vớ i nano chitosan đượ c chụ p

bằng AFM (hình 1.8). Khi xử lý vi khuẩn vớ i lượ ng hạt nano chitosan là 64μg/ml

trong 30 phút, những tế bào này bị bao quanh bở i hạt nano. Khi xử lý đượ c 60 phút,

tế bào từ dạng hình cầu bị thoái biến thành dạng đặc bất thườ ng. Khi xử lý lâu hơ n,

những tế bào này bị phá vỡ làm thoát những thành phần bên trong, tróc màng và

thủng. Những tế bào S. choleraesuis vỡ thành mảnh sau khi xử lý đượ c 3 giờ [24].

Wen-Li Du (2009) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của những hạt

nano chitosan tripolyphosphate mang nhiều kim loại khác nhau như Ag+, Cu2+,

Zn2+, Mn2+ và Fe2+. Những vi khuẩn đượ c chọn để thử nghiệm là Escherichia coli

25922, Salmonella choleraesuis ATCC 50020 và Staphylococcus aureus 25923.

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) đượ c tiến

hành trong phòng thí nghiệm [9]. K ết quả đượ c nêu trong bảng 1.3.




Bảng 1.3. Giá tr ị MIC và MBC ứ c chế E. coli, S. choleraesuis và S. aureus

(µg/ml)

Mẫu E. coli S. choleraesuis S. aureus

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

Nano chitosan 117 187 117 187 234 281

Nano chitosan

mang Ag+ 3 6 3 6 6 12

Nano chitosan

mang Cu2+ 9 12 9 12 21 24

Nano chitosan

mang Zn2+ 18 24 18 24 36 48

Nano chitosan

mang Mn2+ 73 97 73 97 85 97

Nano chitosan

mang Fe2+ 121 195 121 195 146 195

Ag+ 4 8 4 8 8 16

Cu2+ 256 512 256 512 448 512

Zn2+ 768 1024 768 1024 768 1024

Mn2+ 1472 1536 1472 1536 1600 1664

Fe2+ 1728 1856 1728 1856 1792 1856

Chlortetracycline 1 2 1 2 2 4

Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan đặc biệt tăng khi nhốt Cu2+ và

Zn2+.



CHƯƠ NG 2

THỰ C NGHIỆM



Thực nghiệm34

CHƯƠ NG 2: THỰ C NGHIỆM

2.1. Hóa chất và dụng cụ-thiết bị

2.1.1. Hóa chất

9 Chitosan (DD 75%) của Sigma-Aldrich (Công ty Cổ Phần Xuất Nhậ p

Khẩu Y Tế DOMESCO, Đồng Tháp cung cấ p).

9 Sodium tripolyphosphate (TPP) (Na5P3O1), Trung Quốc (Công ty Cổ

Phần Xuất Nhậ p Khẩu Y Tế DOMESCO, Đồng Tháp cung cấ p).

9 NaOH 96%, Trung Quốc.

9 HCl, Trung Quốc.

9 CH3COOH, 99,5%, Trung Quốc.

9 Nướ c khử ion, Merck (Công ty Cổ Phần Xuất Nhậ p Khẩu Y Tế

DOMESCO, Đồng Tháp cung cấ p).

9 Bovine serum albumin (BSA) (Bộ Môn Sinh Hóa, Khoa Sinh học, ĐH

KHTN).

9 Thuốc thử Bradford (Bộ Môn Sinh Hóa, Khoa Sinh học, ĐH KHTN).

2.1.2. Dụng cụ

9 Pipet 5,00ml, 10,00ml.

9 Becher 100,0ml.

9 Ống đong 25,0ml.

9 Ống ly tâm 2,0ml.

9 Cuvet.

2.1.3. Thiết bị

9 Máy đo pH IQ Scientific Instruments (Bộ Môn Hóa Phân Tích, ĐH

KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).



Thực nghiệm35

9 Máy khuấy từ IKA®

RET control-visc, Đức (Phòng Hóa Lý Ứ ng Dụng,

ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series (Phòng Thí

Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy đông cô TELSTAR LYOQUEST, Tây Ban Nha (Công ty Cổ Phần

Xuất Nhậ p Khẩu Y Tế DOMESCO, Đồng Tháp).

9 Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRIFUGEN, Đức, số

vòng ly tâm 18000 vòng/phút (Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học

Phân Tử, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy lắc HEIDOLPH PROMAX 1020, Đức (Phòng Hóa Lý Ứ ng Dụng,

ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO, Nhật (Phòng Hóa Lý Ứ ng

Dụng, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy FE-SEM JSM 7401F, Nhật (Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano,

Khu Công nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí Nghiệm Tr ọng Điểm Quốc Gia

về Vật Liệu Polymer và Composit, ĐH Bách Khoa, Thành Phố Hồ Chí

Minh).

9 Máy nhiễu xạ tia X BRUKER XRD-D8 ADVANCE, Đức (Viện Khoa

Học Vật Liệu Ứ ng Dụng).

9 Máy đo phổ FT-IR BRUKER EQUINOX 55, Đức (Phòng Thí Nghiệm

Trung Tâm, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh).

9 Máy đo phổ Raman HORIBA JOBIN YVON, Nhật (Phòng Thí Nghiệm

Công Nghệ Nano, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh).



Thực nghiệm36

2.2. Nội dung nghiên cứ u

Vớ i mục tiêu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưở ng đến kích thướ c và sự phân bố

của hạt nano chitosan để thu đượ c hạt nano chitosan có kích thướ c nhỏ, đồng đều

làm chất hấ p phụ protein nhằm ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu theo sơ đồ hình 2.1.

Khuấy từ 1500 vòng/phút, 1 giờ

Dung dịch

nano chitosan

TPP

(hoặc glutaraldehyde)

Chitosan

1/ Ly tâm 17000 vòng/phút, 30 phút

2/ R ửa vớ i nướ c cất hai lần

3/ Đông cô tại -80oC; 76 giờ ; 0,001mBar

Nano chitosan

khô

Chụp ảnh FE-SEM, TEM

Ghi phổ IR, RAMAN,XRD

Chụp ảnh FE-SEM

Đo GPC

Khảo sát các yếu tố

ảnh hưở ng

Ghi phổ IR, RAMAN, XRD

Khảo sát khả năng hấp phụ protein BSA

Hình 2.1. S ơ đồ nghiên cứ u.

2.2.1. Phân tích đặc điểm của nguyên liệu chitosan

Đặc điểm của nguyên liệu chitosan đượ c khảo sát bằng nhiều phươ ng pháp

khác nhau như: phươ ng pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC để đo khối lượ ng phân tử

chitosan, phươ ng pháp chụ p ảnh FE-SEM để xác định hình dạng nguyên liệu,



Thực nghiệm38

Hình 2.3. Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRIFUGEN.

Hạt nano chitosan đượ c đông khô bằng máy đông cô TELSTAR

LYOQUEST ở nhiệt độ -80oC, áp suất 0,001mBar trong 72 giờ tại Công ty Cổ Phần

Xuất Nhậ p Khẩu Y Tế DOMESCO, Đồng Tháp. Sản phẩm bột nano chitosan thu

đượ c đượ c bảo quản ở 5o

C trong tủ lạnh.

Hình 2.4. Máy đ ông cô TELSTAR LYOQUEST.



Thực nghiệm39

Trong đề tài này, các yếu tố ảnh hưở ng đến sự phân bố kích cỡ và kích cỡ hạt

đã đượ c khảo sát nhằm tìm ra điều kiện thích hợ p nhất để tạo hạt nano chitosan như:

9 Phươ ng pháp điều chế.

9 Tỷ lệ chitosan:TPP (CS/TPP).

9 pH dung dịch.

Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

9 Kích thướ c trung bình hạt nano chitosan (nm).

9 Sự phân bố kích thướ c hạt (nm).

Hạt nano chitosan đượ c chụ p và xác định kích thướ c bằng kính hiển vi điện

tử quét phát xạ tr ườ ng FE-SEM. Sự phân bố kích thướ c hạt nano chitosan đượ c xác

định bằng cách đo kích thướ c ngẫu nhiên của các hạt nano chitosan bằng phần mềm

UTHSCSA Image Tool 3.00.

Chỉ tiêu cần đạt: kích thướ c hạt nano chitosan từ 50-500nm.

Các đặc tính hóa lý của hạt nano chitosan cũng đượ c khảo sát và đánh giá

dựa trên các phươ ng pháp phân tích hóa lý như: FT-IR, Raman, XRD, FE-SEM và

TEM.

Thử nghiệm đượ c lặ p lại nhiều lần để kiểm tra độ chính xác của thử nghiệm.

K ết quả đượ c lựa chọn và trình bày như là k ết quả đại diện.

2.2.3. Phươ ng pháp phân tích hóa lý

2.2.3.1. Phươ ng pháp đo sắc ký thẩm thấu gel GPC

Khối lượ ng phân tử của nguyên liệu chitosan đượ c đo trên máy sắc ký thẩm

thấu gel-Gel Permeation Chromatography (GPC) AGILENT 1100 Series (hình 2.5)

của Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh.



Thực nghiệm40

Hình 2.5. Máy sắc ký thẩ m thấ u gel GPC AGILENT 1100 Series.

2.2.3.2. Phươ ng pháp chụp ảnh FE-SEM

Ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ tr ườ ng - Field Emmission Scanning

Electron Microscopy (FE-SEM) của chitosan và hạt nano chitosan đượ c chụ p bằng

máy FE-SEM JSM 7401F (hình 2.6) của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Khu

Công nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh.

Hình 2.6. H ệ thố ng hi ể n vi đ i ện t ử quét phát x ạ tr ườ ng FE-SEM JSM 7401F.



Thực nghiệm41

2.2.3.3. Phươ ng pháp chụp ảnh TEM

Ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy

(TEM) của hạt nano chitosan chụ p bằng máy JEM-1400 (hình 2.7) của Phòng Thí

Nghiệm Tr ọng Điểm Quốc Gia - Vật liệu Polymer và Composit.

Hình 2.7. H ệ thố ng hi ể n vi đ i ện t ử truyền qua JEM-1400

2.2.3.4. Phươ ng pháp nhiễu xạ tia X

Mức độ tinh thể của chitosan và hạt nano chitosan đượ c đánh giá thông qua

giản đồ nhiễu xạ tia X - X-Ray Diffraction (XRD) của chúng. Giản đồ nhiễu xạ tia

X đượ c đo trong khoảng 2θ từ 4o đến 70

otrên máy nhiễu xạ tia X BRUKER XRD-

D8 ADVANCE (hình 2.8) của Viện Khoa Học Vật Liệu Ứ ng Dụng, Thành Phố Hồ

Chí Minh.



Thực nghiệm42

Hình 2.8. Máy nhi ễ u x ạ tia X Bruker XRD-D8 ADVANCE

2.2.3.5. Phươ ng pháp phổ hồng ngoại FT-IR

Phổ FT-IR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) của chitosan và nano

chitosan đượ c ghi bằng máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55 (hình 2.9) của

Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh. Để thu phổ,

một lượ ng nhỏ chất cần khảo sát đượ c tr ộn vớ i KBr và nén thành dạng viên. Phổ

FT-IR đạt đượ c trong khoảng tần số 399,255-4000,27cm-1

, độ phân giải là 4cm-1

.

Hình 2.9. Máy đ o phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55.



Thực nghiệm43

2.2.3.6. Phươ ng pháp phổ vi tán xạ Raman

Phổ Raman của chitosan và nano chitosan đượ c ghi bằng máy đo phổ Raman

HORIBA JOBIN YVON (hình 2.10) vớ i bướ c sóng kích thích 632nm trong khoảng

tần số từ 100-4000cm-1

tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Đại học Quốc gia

Thành Phố Hồ Chí Minh.

Hình 2.10. Máy đ o phổ Raman HORIBA JOBIN YVON.

2.2.4. Khảo sát khả năng hấp phụ protein trên hạt nano chitosan

2.2.4.1. Xây dự ng đườ ng chuẩn protein theo Bradford

Nguyên tắc:

Phươ ng pháp này dựa trên sự thay đổi bướ c sóng hấ p thu của thuốc nhuộm

Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợ p vớ i protein. Trong dung dịch mang tính

acid, khi chưa k ết nối vớ i protein, thuốc nhuộm có bướ c sóng hấ p thu cực đại

465nm; khi k ết hợ p vớ i protein, thuốc nhuộm hấ p thu cực đại ở bướ c sóng

595nm. Độ hấ p thu ở bướ c sóng 595nm có liên hệ một cách tr ực tiế p tớ i nồng độ

protein [1].



Thực nghiệm44

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đườ ng chuẩn vớ i

dung dịch protein chuẩn đã biết tr ướ c nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thườ ng là

bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc

nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tớ i 1 giờ [1]. Tiến hành đo độ hấ p thu

của hỗn hợ p dung dịch ở bướ c sóng 595nm bằng máy quang phổ UV-Vis-NIR-

V670, JACCO (hình 2.11) tại Phòng Hóa Lý Ứ ng Dụng, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ

Chí Minh.

Hình 2.11. Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO.

Phươ ng pháp tiến hành:

1,00ml dung dịch BSA có nồng độ lần lượ t là 0; 10; 20; 30; 40; 50μg/ml

trong nướ c cất đượ c đưa vào ống nghiệm.

Thêm 5,00ml thuốc thử Bradford, lắc đều, để 10 phút cho phản ứng xảy ra ở

nhiệt độ phòng.

Đo độ hấ p thu của dung dịch ở bướ c sóng 595nm.

Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượ ng BSA theo độ hấ p thu. Đườ ng chuẩn này

đượ c sử dụng để xác định hàm lượ ng protein trong các mẫu chưa biết.



Thực nghiệm45

)

2.2.4.2. Khảo sát khả năng hấp phụ protein trên hạt nano chitosan

Sử dụng hạt nano chitosan có khối lượ ng 0,25mg; 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg và

2,0mg cho hấ p phụ vớ i 1,0mg protein BSA ở nhiệt độ phòng trong thờ i gian 60

phút, pH khảo sát là 5,5. Tốc độ lắc 250 vòng/phút. Sau đó tiến hành ly tâm hỗn

hợ p vớ i tốc độ 17000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút. Lấy phần dịch nổi pha loãng

10 lần bằng nướ c cất r ồi đo độ hấ p thu ở bướ c sóng 595nm theo phươ ng pháp

Bradford, ghi nhận hệ số pha loãng. Vớ i mỗi tr ị số độ hấ p thu đo đượ c, dựa vào

phươ ng trình tuyến tính và đườ ng tươ ng quan tuyến tính giữa độ hấ p thu và nồng độ

protein, suy ra nồng độ protein tươ ng ứng có trong phần dịch nổi đã pha loãng.

Tổng hàm lượ ng protein trong phần dịch nổi đượ c tính theo công thức:

mg protein = a.10-3.n.V (2.1)

Vớ i a: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đườ ng chuẩn (μg/ml).

n: hệ số pha loãng.

V: thể tích phần dịch nổi (ml).

Hiệu suất hấ p phụ (loading efficiency-LE) và khả năng hấ p phụ (loading

capacity-LC) của hạt nano đượ c tính toán theo công thức sau:

(2.2

(2.3)



CHƯƠ NG 3

K ẾT QUẢ

VÀ

BIỆN LUẬN



K ết quả và biện luận47

CHƯƠ NG 3: K ẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân tích đặc điểm của nguyên liệu chitosan

K ết quả khảo sát đặc điểm của nguyên liệu chitosan (DD > 75%) đượ c đánh

giá bằng phươ ng pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC (xem phụ lục 1), phươ ng pháp

chụ p ảnh FE-SEM, phươ ng pháp đo phổ hồng ngoại FT-IR, phươ ng pháp đo phổ

Raman cho thấy như sau:

3.1.1. Phươ ng pháp phân tích GPC

Phân tử lượ ng trung bình số: =nM 162kDa .

Phân tử lượ ng trung bình khối: =wM 497kDa.

Phân tử lượ ng trung bình nhớ t: =vM 497kDa.

Chỉ số đa phân tán: ==

n

W

M

MDI 3,07 ; DI > 2.

K ết quả nhận đượ c cho thấy mẫu chitosan nguyên liệu có độ đa phân tán cao.

Phân tử lượ ng của chitosan ảnh hưở ng r ất lớ n đến kích thướ c hạt. Thông

thườ ng, phân tử lượ ng của chitosan càng lớ n thì kích thướ c hạt nano chitosan tạo

thành càng lớ n.

Nhóm của Bing Hu [13] sử dụng chitosan có phân tử lượ ng lần lượ t là 30,

50, 100, 150 và 300kDa, có cùng độ deacetyl hóa là 90% để điều chế hạt nano

chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 1.5mg/ml, tỷ lệ CS/TPP là 6:1, pH

là 4,5. Khi phân tử lượ ng chitosan tăng từ 30 đến 50kDa, kích thướ c hạt giảm từ

201,4 xuống 169,0nm. Khi phân tử lượ ng chitosan tăng từ 50kDa đến 150kDa, kích

thướ c hạt không thay đổi đáng k ể. Khi phân tử lượ ng chitosan tăng từ 150kDa đến

300kDa, kích thướ c hạt tăng nhanh từ 173,3nm đến 309,7nm.

Tươ ng tự, nhóm của Q. Gan [12] sử dụng chitosan có phân tử lượ ng thấ p,

trung bình và cao, độ deacetyl hóa lần lượ t là 86,6%; 84,7% và 82,5% để điều chế




9hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 0,05% (w/v), tỷ lệ

CS/TPP là 4:1, pH là 4,0. Kích cỡ hạt thu đượ c đối vớ i phân tử lượ ng thấ p, trung

bình và cao lần lượ t là 136,2nm; 145,3nm và 155,0nm.

Như vậy, vớ i chitosan có phân tử lượ ng là 497kDa đượ c sử dụng trong đề tài

này, ướ c tính kích thướ c hạt thu đượ c có thể khá lớ n.

3.1.2. Phươ ng pháp chụp ảnh FE-SEM

Ảnh FE-SEM (hình 3.1) của chitosan cho thấy hình dạng nguyên liệu

chitosan ban đầu là từng lớ p polymer vớ i kích thướ c hạt lớ n.

Hình 3.1. Ả nh FE-SEM của chitosan khi chư a t ạo nố i.

3.1.3. Phươ ng pháp nhiễu xạ tia X, phổ FT-IR và phổ Raman

Giản đồ nhiễu xạ tia X (phụ lục 7), phổ FT-IR (phụ lục 3) và phổ Raman

(phụ lục 5) của chitosan cũng đượ c khảo sát cho thấy phù hợ p vớ i các công trình đã

công bố tr ướ c đây [8], [23]. Các k ết quả này sẽ đượ c dùng để so sánh và đánh giákhả năng tạo nối của chitosan và TPP trong quá trình chế tạo hạt nano chitosan ở

phần trình bày sau.




3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưở ng đến kích thướ c và sự phân bố hạt nano

chitosan

3.2.1. Khảo sát sơ bộ các điều kiện chế tạo hạt nano chitosan

Vớ i mục đích tạo ra hạt nano chitosan có kích thướ c nhỏ, đồng đều, chúng

tôi đã tiến hành nhiều thí nghiệm điều chế hạt nano, cố định thờ i gian khảo sát là 1

giờ , nồng độ CS là 0,5% (w/v) để thực hiện các khảo sát sơ bộ và chọn lựa các

thông số thí nghiệm theo tiêu chuẩn sau:

9 Gel tạo thành ở dạng sệt, trong suốt, không tách lớ p;

9 Kích thướ c hạt nano nhỏ, đồng đều (qua ảnh FE-SEM);

9 Quá trình ly tâm tách hạt nano hiệu quả;

9 Quá trình tinh chế hiệu quả (Phổ FT-IR không chứa các mũi của acid

acetic còn sót lại, xem phụ lục 4);

9 Phươ ng pháp thực nghiệm đơ n giản, dễ thực hiện và có khả năng ứng

dụng vào sản xuất.

K ết quả thực nghiệm đã lựa chọn đượ c các thông số thí nghiệm thoả mãn các

yêu cầu nêu trên:

9 Nồng độ TPP hoặc glutaraldehyde là 0,25% (w/v) (vớ i nồng độ 0,5% và

1% có hiện tượ ng tách lớ p vớ i TPP và tạo bọt vớ i glutaraldehyde);

9 Chỉnh pH dung dịch chitosan bằng dung dịch NaOH 5M (tránh hiện

tượ ng pha loãng dung dịch chitosan khi chỉnh pH bằng NaOH 1M);

9 Cách thực hiện: Nhỏ từ từ TPP hoặc glutaraldehyde vào chitosan (thực

hiện ngượ c lại có hiện tượ ng tách lớ p, lợ n cợ n);

9 Khuấy từ, tốc độ khuấy mạnh 1500 vòng/phút để tránh tách lớ p;

9 Ly tâm tách toàn bộ hạt nano vớ i tốc độ 17000 vòng/phút trong 30 phút;

9 R ửa hạt bằng nướ c cất đến pH 6,5-7 để loại hoàn toàn acid acetic;




9 Đông cô làm khô hạt ở -80oC; 0,001mBar và 76 giờ ;

9 Bảo quản hạt nano chitosan ở 5ºC trong tủ lạnh.

K ết quả thí nghiệm chịu ảnh hưở ng của nhiều thông số trong suốt quá trình

tiến hành thực nghiệm. Sự sai lệch sẽ dẫn đến k ết quả không chính xác. Do vậy, các

bướ c khảo sát tiế p theo đều dựa đúng theo các thông số thí nghiệm mà quá trình

khảo sát sơ bộ bướ c đầu đạt đượ c.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưở ng của phươ ng pháp điều chế

Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưở ng của hai phươ ng

pháp điều chế khác nhau đến kích thướ c và sự phân bố hạt nano chitosan lần lượ t là

phươ ng pháp tạo nối ngang cộng hóa tr ị, sử dụng tác chất glutaraldehyde và phươ ng

pháp tạo gel ion (tạo nối ngang ion), sử dụng tác chất tripolyphosphate (TPP) vớ i

mục đích tìm ra phươ ng pháp thích hợ p tạo ra hạt nano chitosan có kích thướ c nhỏ

để tăng khả năng hấ p phụ thuốc.

Điều kiện tiến hành thí nghiệm đượ c trình bày ở phần 2.2.2 và giữ cố định

các thông số sau: dung dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v); pH của dung dịch

chitosan đượ c chỉnh đến 5,0; TPP hoặc glutaraldehyde có nồng độ 0,25% (w/v) và

tỷ lệ khối lượ ng CS/TPP hoặc CS/glutaraldehyde là 6:1.

Khi nhỏ từ từ TPP (glutaraldehyde) vào dung dịch chitosan trong điều kiện

khuấy từ tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ , chúng tôi nhận thấy

những dung dịch này tr ở nên sệt hơ n và màu sắc có sự thay đổi tươ ng ứng. Đối vớ i

tác chất glutaraldehyde, dung dịch có màu vàng ngà. Đối vớ i tác chất TPP, dungdịch có màu tr ắng đục. Điều này chứng tỏ đã có phản ứng xảy ra giữa chitosan và

các tác chất tạo nối.

Đối vớ i tác chất glutaraldehyde, phản ứng có thể diễn ra do những nhóm

aldehyde của glutaraldehyde hình thành liên k ết imine cộng hóa tr ị vớ i các nhóm

amine của chitosan như hình 3.2. Mặc dù một số tài liệu khẳng định môi tr ườ ng

trung tính hoặc baz là tốt nhất để phản ứng này xảy ra, nhóm của O.A.C. Monteiro




tiến hành phản ứng này trong môi tr ườ ng acid vớ i pH 3-4 và nhận thấy r ằng thờ i

gian 1 giờ là đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn [19].

Hình 3.2. Phản ứ ng t ạo nố i ngang cộng hóa tr ị gi ữ a chitosan và glutaraldehyde.

Đối vớ i tác chất TPP, do bản chất phân ly, TPP phân ly trong nướ c và phóng

thích ra ion OH-. Do đó, trong dung dịch TPP đồng thờ i tồn tại cả ion OH

– và ion

P3O105-

có thể cạnh tranh phản ứng vớ i nhóm NH3+

của chitosan. Theo tài liệu [26],

TPP có các giá tr ị pK a sau: pK 1 = 1; pK 2 = 2; pK 3 = 2,79; pK 4 = 6,47 và pK 5 = 9,24;

CS: pK a = 6,3. Vì thế, tùy thuộc vào giá tr ị pH, cơ chế tươ ng tác có thể là do sự mất

proton hoặc sự tạo nối ngang ion [16].




Hình 3.3. C ấ u trúc hóa học của sodium TPP.

Hình 3.4. C ơ chế t ươ ng tác gi ữ a CS và TPP.




Hình 3.6. Ả nh hưở ng của l ự c cắt đế n sự hình thành hạt nano.

Thứ nhất, đối vớ i các phân tử trong quá trình chuyển động bị vướ ng lại vớ i

nhau, quá trình khuấy tr ộn sẽ cắt những phân tử chitosan này thành những mảnh

phân tử ngắn hơ n. Những mảnh chitosan bị cắt này sau đó sẽ tham gia vào phản ứng

tạo gel ion vớ i những phân tử TPP. K ết quả là hạt nhỏ đượ c hình thành.

Thứ hai, đối vớ i các phân tử trong quá trình chuyển động không bị vướ ng lại

vớ i nhau, quá trình khuấy tr ộn sẽ kéo, tách những phân tử này xa nhau hơ n. Chúng

phản ứng vớ i những phân tử TPP và hình thành những hạt lớ n.

Dung dịch sau phản ứng đượ c ly tâm 17000 vòng/phút trong 30 phút thu hạt

nano chitosan. R ửa hạt nano nhiều lần bằng nướ c cất đến pH 6,5-7. Hạt nano

chitosan đượ c đông khô bằng máy đông cô TELSTAR LYOQUEST ở nhiệt độ

-80oC, áp suất 0,001mBar trong 72 giờ tại Công ty Cổ Phần Xuất Nhậ p Khẩu Y Tế

DOMESCO, Đồng Tháp. Sản phẩm bột nano chitosan đượ c bảo quản trong tủ lạnh.

Đối vớ i tác chất glutaraldehyde, bột thu đượ c có màu vàng sậm, phù hợ p vớ i

k ết quả của O.A.C. Monteiro [19]. Đối vớ i tác chất TPP, bột thu đượ c có màu tr ắng




sáng, phù hợ p vớ i k ết quả của Lifeng Qi [24], khác vớ i màu tr ắng ngà của nguyên

liệu chitosan ban đầu.

Hình 3.7. Ả nh chụ p bột nano chitosan đ i ều chế t ừ các phươ ng pháp khác nhau

(t ừ trái qua phải): phươ ng pháp t ạo gel ion vớ i TPP và phươ ng pháp t ạo nố i

ngang cộng hóa tr ị vớ i glutaraldehyde.

K ết quả bảng 3.1 và hình 3.8 cho thấy đối vớ i tác chất glutaraldehyde, hạt

nano thu đượ c có kích thướ c khá lớ n, phân bố kích thướ c từ 149,03-561,63nm (kích

thướ c trung bình là 281,62nm, bảng 3.1, hình 3.8). Đối vớ i tác chất TPP, kích thướ c

hạt nhỏ và đều hơ n, phân bố từ 36,08-94,90nm (kích thướ c trung bình là 68,89nm,

bảng 3.1, hình 3.8). Kích thướ c hạt nhỏ và phân bố khá đồng đều sẽ có tiềm năng

lớ n trong hấ p phụ protein, thuốc.




Bảng 3.1. Đặc đ i ể m hạt nano chitosan đ i ều chế t ừ các phươ ng pháp khác nhau.

STT Phươ ng pháp Phân bố kíchthướ c (nm) Kích thướ c trungbình (nm)

1 Tạo nối ngang cộng hóa tr ị 149,03-561,63 281,62

2 Tạo gel ion 36,08-94,90 68,89

Hình 3.8. Ả nh FE-SEM của hạt nano chitosan đ i ều chế t ừ các phươ ng pháp

khác nhau (t ừ trái qua phải): phươ ng pháp t ạo nố i ngang cộng hóa tr ị vớ i

glutaraldehyde, phươ ng pháp gel ion vớ i TPP.

Có thể nói đây là hai phươ ng pháp đượ c sử dụng phổ biến để tạo hạt nano.

Khi tác dụng vớ i glutaraldehyde, chuỗi chitosan đượ c tạo nối ngang hóa học hình

thành các liên k ết cộng hóa tr ị bền. Khi tác dụng vớ i vớ i một polyanion như TPP,

chitosan tạo nối ngang ion yếu hơ n chủ yếu do lực tươ ng tác t ĩ nh điện giữa chitosan

mang điện tích dươ ng và polyanion. Do tính độc hại của glutaraldehyde, chỉ phươ ng

pháp tạo gel ion đượ c ứng dụng trong dượ c phẩm [17]. Đây cũng là phươ ng pháp

đơ n giản, r ẻ tiền, hiệu quả cao và không độc hại nên đượ c lựa chọn cho các nghiên

cứu tiế p theo.




3.2.3. Khảo sát ảnh hưở ng của tỷ lệ CS/TPP

Tỷ lệ CS/TPP là một nhân tố quan tr ọng ảnh hưở ng đến kích thướ c hạt.

Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưở ng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thướ c hạt đưa ra

các k ết luận khác nhau. Theo nhóm của Gan [12], khi tỷ lệ CS/TPP càng tăng thì

kích thướ c hạt càng tăng. Kích thướ c hạt điều chế đượ c trong khoảng từ

100-250nm. Trong khi đó, nghiên cứu của Bing Hu [13], Paradimitriou [22] lại rút

ra k ết luận ngượ c lại, càng tăng tỷ lệ CS/TPP thì kích thướ c hạt càng giảm.

Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưở ng của các tỷ lệ

CS/TPP đến kích thướ c và sự phân bố hạt nano chitosan lần lượ t là 3:1, 4:1, 5:1,

6:1, 7:1 vớ i mục đích tìm ra tỷ lệ CS/TPP tạo ra hạt nano chitosan có kích thướ c

nhỏ để tăng khả năng hấ p phụ protein, thuốc.

Điều kiện tiến hành thí nghiệm đượ c trình bày ở phần 2.2.2 và giữ cố định

các thông số sau: dung dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v); pH của dung dịch

chitosan đượ c chỉnh đến 5,0; TPP có nồng độ 0,25% (w/v).

Hình 3.9. Ả nh chụ p dung d ị ch huyền phù nano chitosan đ i ều chế t ừ các t ỷ l ệ

CS/TPP khác nhau (t ừ trái qua phải): 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1.




Theo quan sát, khi nhỏ từ từ dung dịch TPP vào dung dịch chitosan, dung

dịch huyền phù nano chitosan tr ở nên càng lúc càng tr ắng đục khi tỷ lệ CS/TPP

giảm từ 7:1 đến 3:1. Sau 3 ngày bảo quản trong tủ lạnh, các dung dịch huyền phù

này bắt đầu tách lớ p (hình 3.9), chứng tỏ có sự hình thành những hạt kích thướ c lớ n.

Tuy nhiên, ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1, dung dịch không bị tách lớ p và có màu tr ắng đục

nhạt hơ n so vớ i các dung dịch khác chứng tỏ hạt tạo thành có kích thướ c nhỏ hơ n.

K ết quả khảo sát này phù hợ p vớ i khảo sát của nhóm Paraditrimiou khi thực

hiện khảo sát tỷ lệ CS/TPP từ 2:1 đến 5:1. Nhóm này thấy r ằng huyền phù nano

càng lúc càng đục hơ n khi tỷ lệ CS/TPP giảm. Thậm chí, k ết cụm xuất hiện khi tỷ lệ CS/TPP giảm xuống 1,5:1 [13], [22].




Hình 3.10. Ả nh FE-SEM hạt nano chitosan khi t ổ ng hợ p vớ i t ỷ l ệ CS/TPP là 3:1.

dtb = 219,24 nm

0

2

4

6

8

10

12

100 150 200 250 300 350

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( %

)

Hình 3.11. Phân bố kích thướ c hạt nano chitosan vớ i t ỷ l ệ CS/TPP là 3:1.

dtb = 219,24nm





dtb = 190,23 nm

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

150 170 190 210 230 240 260

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( % )


dtb = 190,23nm





dtb = 118,57 nm

0

2

4

6

8

10

12

14

60 100 140 180

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( %

)


dtb = 118,57nm





dtb = 68,89 nm

0

2

4

6

8

10

12

30 40 50 60 70 80 90 100

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( %

)


dtb = 68,89nm





dtb = 113,89 nm

0

2

4

6

8

10

12

50 70 90 110 130 150 170 190

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( % )


dtb = 113,89nm




K ết quả ảnh FE-SEM cho thấy ở tỷ lệ CS/TPP cao (6:1 và 7:1), kích thướ c

hạt nhỏ, đồng đều và phân bố khá tậ p trung. Đặc biệt, ở tỷ lệ CS/TPP cao, hạt

không có hiện tượ ng k ết dính lại như ở tỷ lệ CS/TPP thấ p (3:1, 4:1 và 5:1).

Bảng 3.2. Ả nh hưở ng của t ỷ l ệ CS/TPP đế n tính chấ t hạt nano chitosan.

Chỉ tiêu

theo dõi

Tỷ lệ CS/TPP

3:1 4:1 5:1 6:1 7:1

Phân bố

kích thướ c

(nm)

119,05-

309,75

156,98-

244,46

63,22-

178,2536,08-94,90 59,52-

170,45

Kích thướ c

trung bình

(nm)

219,24 190,23 118,57 68,89 113,89

0

50

100

150

200

250

2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7

Tỉ lệ CS/TPP

K í c h

t h ư ớ c h ạ t ( n m

)

Hình 3.20. Ả nh hưở ng của t ỷ l ệ CS/TPP đế n kích thướ c hạt.

K ết quả từ bảng 3.2 và hình 3.20 cho thấy, khi tăng tỷ lệ CS/TPP từ 3:1 đến

6:1, kích thướ c hạt giảm dần, khá phù hợ p vớ i nghiên cứu của Bing Hu [13]. Theo




Bing Hu, khả năng tạo gel của CS vớ i TPP nằm ở sự hình thành những nối ngang

nội phân tử và liên phân tử giữa các nhóm amino và các nhóm phosphate. Khi tỷ lệ

CS/TPP tăng (ngh ĩ a là hàm lượ ng TPP nhỏ), TPP có thể chi phối quá trình tạo nối

ngang liên phân tử và nội phân tử vớ i CS để tạo thành những đơ n hạt nhỏ. Khi tỷ lệ

CS/TPP giảm (ngh ĩ a là lượ ng TPP tăng tươ ng ứng), lượ ng TPP còn dư sẽ liên k ết

vớ i những đơ n hạt để tạo thành những hạt nano lớ n hơ n. Tuy nhiên, khi tỷ lệ

CS/TPP tăng từ 6:1 đến 7:1, kích thướ c hạt tăng nhẹ tr ở lại, hạt không tròn. Có lẽ ở

tỷ lệ này, lượ ng TPP quá ít, không đủ để tạo các liên k ết chặt chẽ vớ i các nhóm

amino. Ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1, hạt thu đượ c có dạng hình cầu và kích thướ c hạt nhỏ

nhất. Điều này phù hợ p vớ i dự đoán ban đầu khi quan sát đặc điểm ngoại quan của

mẫu sau quá trình điều chế.

3.2.4. Khảo sát ảnh hưở ng của pH

Là một polysaccharide baz yếu, CS không tan trong dung dịch kiềm và trung

tính. Tuy vậy, khi đượ c hòa tan trong môi tr ườ ng acid, CS tan do các nhóm –NH2 ở

vị trí C-2 của đơ n vị D-glucosamine bị proton hóa. Vì thế, quá trình tạo nối ngang

ion để tạo thành hạt nano chitosan phụ thuộc vào pH, tạo cơ hội điều chỉnh những

đặc tính của hạt nano CS/TPP [13].

Trong phần này, ảnh hưở ng của pH đượ c khảo sát nhằm tìm ra pH thích hợ p

nhất để tạo hạt nano chitosan. Điều kiện tiến hành thí nghiệm đượ c trình bày ở phần

2.2.2. Tỷ lệ CS/TPP dùng trong khảo sát đượ c chọn là tỷ lệ tạo hạt nhỏ nhất trong

phần 3.2.2 là 6:1. Các giá tr ị pH đượ c khảo sát lần lượ t là 4,0; 4,5; 5,0 và 5,5.




Hình 3.21. Ả nh chụ p dung d ị ch huyền phù nano chitosan đ i ều chế ở nhữ ng đ i ều

ki ện pH khác nhau (t ừ trái qua phải): 4,0; 4,5; 5,0; 5,5.

Ảnh chụ p dung dịch huyền phù nano chitosan (hình 3.21) điều chế tại các giá

tr ị pH khác nhau cho thấy, các dung dịch huyền phù nano chitosan điều chế có màu

tr ắng đục và không tách lớ p sau 3 ngày bảo quản, chứng tỏ có sự hình thành những

hạt kích thướ c nhỏ. Khi pH càng tăng, màu của dung dịch huyền phù càng đục cho

thấy kích cỡ hạt tăng dần.




Hình 3.22. Ả nh FE-SEM hạt nano chitosan khi t ổ ng hợ p ở pH 4,0.

dtb = 48,70 nm

0

2

4

6

8

10

12

14

30 40 50 60 70 80

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( %

)

Hình 3.23. Phân bố kích thướ c hạt nano chitosan khi t ổ ng hợ p ở pH 4,0.

dtb = 48,70nm





0

2

4

6

8

10

12

40 50 60 70 80 90 100 110

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( % )


dtb = 64,42nm





dtb = 68,89 nm

0

2

4

6

8

10

12

30 40 50 60 70 80 90 100

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( %

)


dtb = 68,89nm





dtb = 156,88 nm

0

2

4

6

8

10

12

100 120 140 160 180 200 220 240 260

Kích thước (nm)

M ậ t đ ộ ( % )


dtb = 156,88nm




K ết quả ảnh FE-SEM cho thấy ở pH thấ p (4,0; 4,5; 5,0), kích thướ c hạt nhỏ,

đồng đều và phân bố khá tậ p trung. Đặc biệt, ở pH thấ p, hạt không có hiện tượ ng

k ết dính lại như ở pH cao (5,5).

Bảng 3.3. Ả nh hưở ng của pH đế n tính chấ t hạt nano chitosan.

pH 4,0 4,5 5,0 5,5

Phân bố kích

thướ c (nm)33,13-73,86 45,55-108,02 36,08-94,90 108,43-253,01

Kích thướ c trung

bình (nm)48,70 64,42 68,89 156,88

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

3.5 4 4.5 5

pH

K í c h t h ư ớ c

( n m )

5.5

Hình 3.30. Ả nh hưở ng của pH đế n kích thướ c hạt nano chitosan.

K ết quả từ bảng 3.3 và hình 3.30 cho thấy, khi tăng pH từ 4,0 đến 5,5, kích

thướ c hạt tăng dần. Kích thướ c hạt nhỏ nhất (48,70nm) thu đượ c ở điều kiện pH là

4,0 và tỷ lệ CS/TPP là 6:1. Có thể thấy r ằng pH ít ảnh hưở ng đến kích thướ c hạt

trong khoảng từ 4,0 đến 5,0. Kích thướ c hạt tăng nhẹ khi pH tăng từ 4,0 đến 4,5.

Kích thướ c hạt ổn định trong khoảng pH từ 4,5 đến 5,0. Tuy nhiên, kích thướ c hạt




tăng nhanh đột ngột trong khoảng pH từ 5,0 đến 5,5 cho thấy pH cao không thích

hợ p cho sự hình thành hạt có kích thướ c nhỏ, ngượ c vớ i khảo sát của Q.Gan [12] là

kích thướ c hạt nhỏ nhất ở pH 5,5. Điều này có thể giải thích là do ở pH 5,5; sự

proton hóa nhóm NH2 trong phân tử CS quá yếu dẫn đến điện thế hạt giảm [13] gây

ra hiện tượ ng tụ hạt (hình 3.28). K ết quả khảo sát kích thướ c hạt này phù hợ p vớ i dự

đoán ban đầu khi quan sát đặc điểm ngoại quan của mẫu sau quá trình điều chế.

Kích thướ c và hình dạng hạt nano chitosan một lần nữa đượ c đánh giá thông

qua k ết quả phân tích TEM. Mẫu đượ c chọn để khảo sát là mẫu có kích thướ c hạt

trung bình nhỏ nhất 48,70nm và khoảng phân bố kích thướ c hạt là 33,13-73,86nmdựa trên k ết quả khảo sát ảnh FE-SEM, điều chế ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1 và pH là 4,0.

Ảnh TEM (hình 3.31) cho thấy các hạt có dạng hình cầu, kích thướ c khá nhỏ,

đồng đều và phân bố khá riêng lẽ, kích thướ c hạt trung bình là 54,01nm và khoảng

phân bố kích thướ c hạt là 31,65-91,28nm. Đặc biệt, hầu hết các hạt đều có kích

thướ c từ 50-60nm. K ết quả này khá trùng hợ p vớ i k ết quả khảo sát ảnh FE-SEM.

Dạng hình c

ầu c

ủa các h

ạt nano chitosan là d

ạng có hi

ệu qu

ảnhất trong các

ứng dụng của nano chitosan, đặc biệt trong các ứng dụng hấ p phụ thuốc do bề mặt

cầu có nhiều phươ ng tiế p xúc vớ i thuốc nhất. Kích thướ c hạt nhỏ và đồng đều thích

hợ p cho quá trình dẫn truyền thuốc qua niêm mạc và đảm bảo thuốc đượ c dẫn

truyền và phóng thích vớ i tốc độ như nhau trong cơ thể.

K ết quả khảo sát này gây ra sự bất ngờ bở i vì khi sử dụng nguyên liệu

chitosan có phân tử lượ ng lớ n (479kDa), chúng tôi dự tính hạt tạo ra sẽ có kích

thướ c lớ n. Thế nhưng, trong suốt quá trình khảo sát, kích thướ c hạt chỉ dao động

trong khoảng 48,70-219,24nm. Hiện tượ ng này có thể liên quan đến hiện tượ ng cắt

mạch CS trong suốt quá trình khuấy từ hỗn hợ p CS và TPP đã đượ c trình bày trong

phần 3.3.2 (hình 3.6). Theo đó, lực cắt mạnh (ở đây chúng tôi sử dụng tốc độ khuấy

mạnh 1500 vòng/phút) có thể cung cấ p đủ năng lượ ng để bẻ gẫy phân tử CS. Các

phân tử CS có mạch càng dài sẽ càng dễ bị vướ ng mắc vào nhau và chịu ảnh hưở ng

của lực cắt này mạnh hơ n, hình thành hạt nhỏ hơ n.




Hình 3.31. Ả nh TEM của hạt nano đ i ều chế ở pH 4,0; t ỉ l ệ CS/TPP là 6:1.




3.3. Khảo sát đặc tính hóa lý của hạt nano chitosan

3.3.1. Khảo sát sự biến đổi nhóm chứ c

3.3.1.1. Khảo sát phổ hồng ngoại FT-IR

Khảo sát phổ FT-IR của CS, nano CS-TPP nhằm xác định sự biến đổi nhóm

chức khi hình thành hạt nano. Phổ FT-IR đạt đượ c trong khoảng tần số

399,255-4000,27cm-1

, độ phân giải là 4cm-1

.

Hình 3.32. Phổ IR của chitosan (a) và hạt nano CS-TPP (b).

Bảng 3.4. Nhữ ng mũi IR chính (cm-1 ) của CS và nano CS-TPP

Tín hiệu nhóm CS, υ/cm-1

Nano CS-TPP, υ/cm-1

υO-H 3423 3397

υC-H 2922 2936

υCO, amide I 1651 1645

υ N-H, amide II 1595 1541

υC3-O 1421-1154 1383-1154

υC6-O 1076 1075

υP=O - 1218




Đối vớ i phổ của CS, mũi phổ ở 3423cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm

NH2 và OH của CS. Mũi ở 1651cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm CONH2.

Mũi ở 1595cm-1 tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm NH2. Mũi ở 1076cm-1 tươ ng

ứng vớ i dao động của nhóm C-O-C.

Đối vớ i phổ của nano CS-TPP, có sự dịch chuyển mũi từ 3423cm-1

sang

3397cm-1

. Đồng thờ i có sự hiện diện của mũi 1218cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của

nhóm P=O. Mũi 1651cm-1

biến mất và hai mũi mớ i xuất hiện ở 1645cm-1

và

1541cm-1

là do liên k ết giữa nhóm ammonium và phosphoric [23]. Do vậy, có thể

k ết luận nhóm ammonium của chitosan đã tạo nối ngang vớ i TPP trong sản phẩmnano CS-TPP.

3.3.1.2. Khảo sát phổ vi tán xạ Raman

Khảo sát phổ Raman của CS, nano CS-TPP nhằm xác định sự biến đổi nhóm

chức khi hình thành hạt nano. Phổ Raman đạt đượ c trong khoảng tần số

100-4000cm-1

.




Hình 3.33. Phổ Raman của chitosan.

Hình 3.34. Phổ Raman của hạt nano CS-TPP.




Đối vớ i phổ của CS, mũi phổ ở 3365, 3304cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của

nhóm NH2 của CS. Mũi ở 2883cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm C-C, C-H.

Mũi ở 1462, 1379cm-1 tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm CH3. Mũi ở 1267cm-1

tươ ng ứng vớ i dao động của nhóm NH-C=O-CH3. Mũi ở 1112cm-1

tươ ng ứng vớ i

dao động của nhóm C-O-C [8].

Đối vớ i phổ của nano CS-TPP, mũi NH2 hoàn toàn biến mất, chứng tỏ hầu

hết NH2 của CS đều bị proton hóa và tạo nối ngang ion vớ i TPP. Các mũi còn lại

trong phổ CS đều hiện diện trong phổ nano CS-TPP. Mặc dù vậy, cườ ng độ các mũi

này yếu hơ n, không mạnh và sắc nét như trong phổ của CS. Đặc biệt, đườ ng nềndâng cao hơ n chứng tỏ sau khi tạo nối để hình thành hạt nano CS-TPP, CS bị cắt

mạch làm mức độ tinh thể giảm, dẫn đến tín hiệu mũi không còn sắc nét.

3.3.2. Khảo sát mứ c độ vô định hình

Mức độ tinh thể của nguyên liệu CS ban đầu và hạt nano CS-TPP đượ c đánh

giá thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X của chúng. Giản đồ nhiễu xạ đượ c đo trong

khoảng 2θ từ 4

o đế

n 70o.




Hình 3.35. Gi ản đồ XRD của CS và nano CS-TPP.

Giản đồ nhiễu xạ tia X của CS có hai mũi mạnh ở 2θ là 10,5o và 20,0o, phù

hợ p vớ i giản đồ nhiễu xạ của CS đượ c công bố trong các tài liệu tr ướ c [23], [24],

cho thấy mức độ tinh thể cao của CS nguyên liệu. Tuy nhiên, không có mũi nào

đượ c tìm thấy trong giản đồ nhiễu xạ của hạt nano CS-TPP sau khi điều chế. Điều

này cho thấy cấu trúc tinh thể của CS đã bị phá hủy sau khi tạo nối ngang vớ i TPP.

Sự thay đổi cấu trúc có thể do khả năng tạo nối ngang nội phân tử và liên phân tử

giữa CS và TPP, làm xáo tr ộn liên k ết mạch phân tử CS, dẫn đến giảm mức độ tinh

thể của hạt nano CS-TPP so vớ i CS ban đầu. Một số công trình nghiên cứu còn cho

thấy loại quy trình làm khô có thể ảnh hưở ng đến mức độ tinh thể của polymer.

Piron thấy r ằng quy trình đông cô làm giảm mức độ tinh thể, tạo ra cấu trúc mở

r ộng, làm tăng động học hấ p phụ kim loại [23]. Do vậy, sự phá huỷ cấu trúc

polymer có thể góp phần làm tăng khả năng hấ p phụ protein, thuốc của các hạt nano

CS-TPP.




3.4. Khảo sát khả năng hấp phụ protein trên hạt nano chitosan

Sự phát triển những hệ thống dẫn truyền những hợ p chất đại phân tử sắ p đến

đem lại thử thách mớ i cho những nhà khoa học dượ c. Peptide, protein,

oligonucleotid và gen là những hợ p chất không bền nên chúng cần đượ c bảo vệ để

không bị phân hủy trong môi tr ườ ng cơ thể. Hơ n nữa, hiệu quả của chúng thườ ng bị

giớ i hạn bở i khả năng vượ t qua những vách ngăn sinh học và tính hướ ng đích kém.

Vì vậy, tươ ng lai ứng dụng những phân tử này trong điều tr ị rõ ràng tùy thuộc r ất

lớ n vào việc thiết lậ p vật liệu dẫn truyền thích hợ p đến cơ thể [14].

Trong phần này, chúng tôi sử dụng hạt nano có kích thướ c 48,70nm, có khối

lượ ng lần lượ t là 0,25mg; 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg và 2,0mg cho hấ p phụ vớ i 1,0mg

protein mô hình BSA ở nhiệt độ phòng trong thờ i gian 60 phút. Tốc độ lắc

250 vòng/phút. Sau đó tiến hành ly tâm hỗn hợ p vớ i tốc độ 17000 vòng/phút ở 4oC,

30 phút, thu dịch nổi.

Hình 3.36. Ả nh chụ p d ị ch nổ i protein sau khi thêm thuố c thử Bradford, sử d ụng

l ượ ng hạt nano chitosan khác nhau (t ừ trái qua phải): 0,5; 1,0; 1,5; 2,0mg.




Dịch nổi protein sau khi hấ p phụ trên hạt nano chitosan (hình 3.36) ở các liều

lượ ng 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg đượ c pha loãng 10 lần, thêm thuốc thử Bradford,

lắc đều tr ướ c khi tiến hành đo độ hấ p thu ở bướ c sóng 595nm. Sau khi thêm thuốc

thử, các dung dịch bắt đầu có màu xanh. Dung dịch có màu xanh càng đậm chứng

tỏ lượ ng protein còn lại càng nhiều. Ảnh chụ p cho thấy các dung dịch chuyển màu

xanh đậm dần từ trái sang phải tươ ng ứng vớ i lượ ng protein còn lại tăng dần. Ở liều

lượ ng hạt nano chitosan là 0,5mg, lượ ng protein còn lại ít nhất tươ ng ứng vớ i dung

dịch có màu nhạt nhất. Ở liều lượ ng hạt nano chitosan là 2,0mg, lượ ng protein còn

lại nhiều nhất tươ ng ứng dung dịch có màu đậm nhất. Ảnh chụ p cho phép dự đoán

hạt nano chitosan hấ p phụ protein hiệu quả ở liều lượ ng 0,5mg. Mặc dù ở liều lượ ng

0,25mg nano chitosan, dịch nổi thu đượ c có màu xanh nhưng vì thí nghiệm này

đượ c thực hiện thêm sau nên chúng tôi không thu ảnh chụ p dịch nổi.

Bảng 3.5. S ố li ệu khảo sát hi ệu suấ t hấ p phụ và khả năng hấ p phụ protein.

Liều lượ ng nano

chitosan (mg)

Hiệu suất hấp phụ

(%)

Khả năng hấp phụ

(mg/mg)

0,25 62,14 2,49

0,5 96,41 1,93

1,0 70,00 0,70

1,5 57,45 0,38

2,0 56,14 0,28




vớ i nhau cũng đượ c Zhen-Xing Tang [25] tìm thấy khi khảo sát tốc độ hấ p phụ

protein của hạt nano chitosan theo nhiệt độ và theo pH.

Khả năng hấ p phụ protein cũng giảm dần từ 2,49 xuống 0,28mg/mg khi liều

lượ ng hạt nano tăng từ 0,25mg đến 2mg.

Hiệu suất hấ p phụ và khả năng hấ p phụ protein khá cao của hạt nano

chitosan có lẽ do quá trình hấ p phụ thực hiện ở pH 5,5. Giá tr ị pH này cao hơ n giá

tr ị pI của BSA tại điểm đẳng điện là 4,7-4,9 [11] nên tại pH này BSA sẽ mang điện

tích âm. Do vậy cơ chế tươ ng tác có thể là do lực hút t ĩ nh điện giữa phân tử protein

mang điện tích âm và hạt nano chitosan mang điện tích dươ ng.

Khả năng hấ p phụ protein mô hình cao của hạt nano chitosan hứa hẹn đem

lại một vật liệu dẫn truyền thuốc, protein… mớ i, an toàn và hiệu quả hơ n.



0

1234560 70

0

0

0



0 12345678494484

0000!0"#0$0

%&%0'(0)*+,0

-.643/4.84884648434434:;4<23456784:.6=4

>[email protected]:.84L.84M64

LN84O4BPQ84BOB48P4:R4<S43T43U64V54WXY4<D84G8494J843Z4

[6\34]_-4a84b48c64de43.4f4Bg4b848Ke4]h_ij4Bg4j..8?4

1234[6a4K43UI43K:.84k4le843m845nB4BK5IVo44<D43Pn4e345n844

BC843Z45Pp8454qr<s.4tss4u4rvwx?4Wa84b48c64de43.4f4K43UI44

43843G4.K4H.486I845J643K:.84L.84M6?4YO4Bg4364Pp4By4pB4

9n4O4345J643oPn?4

[email protected];4284<D43Pn494:{4

BC84L;4e348.8K43K:.843oK8464<J84k4|J34}.?4YO4I2643;4a84Pk84

8P=4BPQ84BOB464243~45J4Y-hXX4B4A4Pp4<aK4:O345M84M64384

[6.4a84]_-?41234[6a4K43UI464<J843{48J4:.64Pp484

5{.=4BPQ84BOB43eK4V54K849n43O4U343eK48;454hXX48b8443K:.8454

vw4t9x4B.43oK84.l4.V34>w4t99x48b844hXX454zvw4t9x43~4

5J4Y-hXX454=>4B45443/4.84Ba848454>4/43;44<6UI454

>v498B345I43C49n43;44>r498B343oK844B34e348.8K4

3K:.844le8484M64b8464<D43Pn43o684L8454r84[6.4

a84]_-494v>84[6.4a84h?4444

?4@A4328484<aK4:O34F43D84.45S4H.4O4e348.8K43K:.843eK4384

384[6.4a84b48c64de43.4f4Bg4b848Ke4]h_ij4945M84M64384Pp4

<aK4:O34[6.4Bg4j..8?41234[6a4a84b48c64de43.4f4K43UI444

3843G4.K4H.43K:.84A4L4BO4HI4:.64<43eK48;48.849n4hXX?41234

[6a4Bg4]h_ij4j..84K43UI43K:.84A43eK48;48.849n4hXX?4

?4@A48846438484[6I43o84UB4B4BoK3V843o84e348.8K4

3K:.8?4J64:6U34UB4B4BoK3V84tx454q>w4<a4884UB4B4tYx4

54>q4:.64>4/4k45645Pp848.8K43K:.8454v?4

0



0 12345678494484

0

000

423464!34"#$48"43%&8'436(48&84434$)84"#$432*43+$4*,343%-84

3./4344"8464

41/4,3464634*4*+436$49448:84*;843<$436$4$=4!34

88/4$3/84

>4?84@+84-454$348436$43%/843A$4324

B4348&84$C64364"#$48D8423464*E4#*4@A484F84)64123464

$;4,43%494G348&84$C6494843<84434H(49I843%/843J4843'494

A4234#*494KL843(4KM4N)84O634P7*41Q64R4S24TUVWXKU'443432*43+$4

"#$4*,343%-8494,*4@+849/43A$43Y844

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4



0 1 23

1

45670890606705000

0

4000!1"#1$%&'1()*')1+,--./!1)11)1%1:;<=1

')>1')?1@A%1;1BCD=C1E@F;@GC;H;;=D1C%1:;<=1F;I1)JE1)&'1KE)L!1

MNOPQRSTURVWVRVXQYRSZ[Q\R]_RQY\Ra\bcR\dVRefRVXQYRQY\gR\hcR\dVR\iNRVjR

SbfQRkNlVRmnQRS\oRSp!1$qr1s*;1)&'1t=u'1%;E1vw1$x;1

,4000!1yz1t=u'1){|%!1})E1v=#1}){|%!1$%=G~1()1

}){|%1})%1+,--/!1$%);#1'=1')>1*11@;I=1E1');E1@wD1')?1

)?1)1C;1%1H%1C%1H1C=G<1)=u'L!1]_RQY\Ra\bcR\dVRmnQR!1

(C{%1s*;1)&'1)E1)&'1(1);#sv1t=u'1%;E1(1v1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0



0

0

0

0

0

0



0 12345364

0

78

98444444444484!"#$6#%&546#'#(4

)*462#)+4#&,)5(,2)+2#%4),&#65%+45)-%-4.#24'&)+4/%#54)+4

:;<=>:?4@A4,,4B7ACB7844

9D"4-244E)+&F4D4!G)-2%+'%462#)+4),&#65%+H4

1&%,&#)4-462&6#%&I#)4:;<=>:?47D4,,4JBKAD4

9DDL4M4N4O4@4!2#)+4),&#65%4+4,&)#%4-%5'%&(46&&%&C

(+#%/#64%P/%#)4)*4*$&6#)46)-#)+4*)&4%**6%#45)-O4-4

&%5%+%4==Q?;R;STUV:?;WX;WQQR:UV:?4A84,,4JCBJ4

9DL4M4N4O44)62&%414Y6&&)4A4!Y)-5#)4)*4+&*6%4

62&O%4,&#65%4+I%4-4/)&,2)5)O654,&),%&#%+4)*462#)+CN114

),&#65%+4#%-%-4*)&4O%%4-%5'%&(4==Q;R;STUV:?;WX;

WQQR:UV:?4JJ4,,4ZAC@B4

9DBG4[4414444[)4[4%4G4[44%O474!\,#/I#)4

)*4$&6#)41&/%#%&+4N)41&)-6%42#)+CN&,)5(,2)+,2#%4

),&#65%+4*)&4%5'%&(4)*4N%4#%62+4]TR=;U;;_QVT=T=;R;

;:>Q?4AZ4,,4@JADC@JA744

9DJE"4a%+4145')4Ya4"5)+)4D4!1)5(+662&-%46)55)-54,&#65%+4

+4-%5'%&(4+(+#%/+4*)&4/6&)/)5%65%+4bRV:;cT_;d:bQ:e?f;J@4444444

,,47BC8@4

9DAYg44E/&44!"4&%'%.4)*462#4-462#)+44,,56#)+4

d:VQb:;h;TRVQR=;<=>:?4JZ4,,4DK@4

9DZN4%%44Y4a42%442(4D4!ij5$&/4-4k%#64

+#-%+4)*46),,%&ll4)4,#k%4$(462#)+C#&,)5(,2)+,2#%462%5#O4&%+4

<=>:f4J4,,4D7@8CD784

9D@N44%)4i4&'52)4G4%F)4a\4g%+4G4M)I5%I4A4

!12(+6)62%/65462&6#%&I#)4)*462#)+4),&#65%+H4%5%6#&)k%#64

0 0

0



0 12345364

0

78

94954294!""#$%&%'&!%&%()*+4,,-4

+../+-4

*-4944-49441-:-42244;-<-4994=)88>4?@A49B4

54C469,594D9ED646FB94B46294

9,965494694$%"G%%H%4I.4,,-4+IE+)+-4

7J-;-:-44K-4:-4;54=777>4?A44C465LB4

629/B5995249644942AB4A4#$%$!

M!N!&O&P%&%H()Q4,,-47/)*-44

)8<-429AA9,B24;-4R2C94;-4ST994U-4V5C9B2994-4

U94=)88>4?1,994C462949,965469B4<9F949F94

D9949L4A4WP%"!&!%XW$%&YNZ(M!NZ("

O%"!&!%4Q4,,-4+IE.+-4

)[-4194[-K4\4U-[4V294K-4V2B4U-4]4-44K-4U94_-4:4

=)88)>4?R924,59662944,454Aa46294

9,9654A,4249549,4C4544

#$%$!bYP&%$!&H4).74,,-+7/.I-4

))-419,9A4-4RL94c-4;B9L4S-4c9994-4B99L4

=)88*>4?:2949,9654594d24T59A494,9A,D54

eYZ"$%bZP%H(I+4,,-4../.-4

)+\-4f4V-4]4=)88.>4?\94,4CA49g45446294

9,9654!"H"'&%HhXbYZH!&&Y%PijNihHk%&$H4)44

,,-4*+/78-44

).\-4f4V-4]4]-4K9B4:-4U494]-4V4=)88.>4?1,99494

996954964C462949,9654eYZ"$%G%H%&Y4++74

,,-4)Q7+/)I88-4

)-4l94=)88Q>4?:2494629a41,4949,,5694

bN%HH!bZP%'&!%&%4+4,,-4Q8+EQ+)-4

0 0

0



0 12345364

0

0 0

0

78

9424424442456445!"#5!4$2%$2#!4%!&6!&4

4!24$&$&!%446#55'46&%%(5)*462!%#45%4&46!&55*4*&+4

&5#%,4-././:/;<.=><?@A>:/;<.=><?4BC4$$4

DBECD4

9F4#+4GH424F4I*%&$!44!&#54$&!#%4462!%#4

#($#&!65%,4AJKL-MNOKPQRAJKL-MNOKPQ-SQ484444444444$$4D(

T4

9TU4'#V62#4D4W2!%#4X#$#&!65%Y4I41&%+4'%!4&4

Z&+4Z5"&',4O/?.[>\/?>=]./488D4$$4B8(4

97G4%#4U4_#4a4W24T4W#"!#!46!%4"&%%4%!&6!624

6!%4&%5!*44*&!4%b4#*4$5'*%$&%!'44!&$64+5#!4

62!%#(%*4!&$5'$2%$2#!4#$#&!65,4M/c:]@/=];/?d4F84

$$4CCT(CBF4

9DaW4e#+4Ua4U#+44a#+4a4a4841&$#&#!4#*4

#$$56#!44#62!%#4!4f%2+4!&#!!4g!24#!(6&V#54#*4

#!(%2&)+4$&$&!%,4M/c:]@/=];/?4F74$$48FE8F74

9D8a442#+444h24W44I554H4#62"#4C4*%$&%4W2!%#4

X#$#&!65%4&46%#54Z&+4Z5"&',4A>;</;<.?4B4$$4C8(

CT4

9Da42#+44U4e4#4G4#+444841&$#&#!4#*4

W2#&#6!&b#!44U#!&(5V54W2!%#4X#$#&!65%4#%41&!4Z5"&'4

'%!,4./O;=/>?484$$48(B4

4

4

4



0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0



0 12345364 78

900

!"#!$$%&'$"(

0

0



0 12345364 78

0

0



0 12345364

0

78

99!"#$%&'$



0 12345364

0

78

99!"



0 12345364

0

78

9999



0 12345364

0

78

99



0 12345364

0

77

898988



0 12345364

0

788

9!"#$



0 12345364

0

787

9!"#99



0 12345364 789

!"##$#

%&'%()*&&"*

+,0-./000:0;<=>?@0>?=0A<BC=<0

DE4FGH4IJKL4MNOKL462PQK4RSTUVWKX462YKL4UZW4UW[K42\K24MT4M]42R4U2P46_46a64

IPKL4Ib624RSTUVWK46c4KdKL4M]45eK45NfU45\48g478g498g4h8g4i8g4j8kLlm54nP4o2W4Mp4U2qm4

U2Pr64U2s4tSIuTSI4v4wNx64ncKL4jyjKmz4{[U4|P}4MNf64US~K24w\H4USTKL4w}KL4nPz4

00;<=>?@00 0;0>0

84 84

784 8X8h9h4

984 8X84

h84 8X8yiy4

i84 8X78y74

j84 8X7ij4

4

xW4o[U4|P}4USqK4\4ns4I3KL462NKL4US~K24W6STnTuU4uuW6V4F6V549884Fa64

MbK24MNOKL4UNKL4|PK4UPH[K4UK246c4R2NKL4US~K245\4

4444444444444444444444444444444448X889y4444444444444444444444444444444444444

xW44444KdKL4M]4RSTUVWK46c4USTKL4IPKL4Ib624kLlm54

4444M]42R4U2P4

4nr4UNKL4|PK4

9

448Xyi7z412NKL4US~K24K\H4MNf64ns4I3KL4ME4UK24KdKL4

M]4RSTUVWK4USTKL4IPKL4Ib624o2W4wW[U4M]42R4U2Pz4

0



0 12345364 789

0

00

00

0

0000

!"0#0$%00

%0

&'0$0()0

0*+0

0()0

(0!"0#00

8,-.4 8,8.9/4 7,/4 8,4

8,.84 8,88.-4 7,/4 8,8./4

7,884 8,89.4 7.,884 8,8884

7,.84 8,874 -7,-4 8,9-..4

-,884 8,84 -7,/4 8,94

4

4424:64;<=24;>?645>?=@4ABCDE=46F4DBC=@4G<624=H,4D4DI=24;>?642J4

KLD42LA4A234M5CG=@4ENN6E=6OPQRS4TU42V4=W=@42LA4A234M5CG=@46A6DOPQXS4

6Y42ZD4==C4D2EC46[=@4D2\64K]4

4

4

4

44

_4H=@45>?=@4ABCDE=4a47b@c44

44444444d2e45>?=@42ZD4==C462DCK=45f=45>?D45U48,-.b@g48,.8b@g47,88b@g4

7,.8b@4TU4-,88b@c4

4

4



0 12345364

0

789

000

00

0000

!0

"#0$000

%0

8&'94 ('&7)4 '&)*4

8&94 *(&)74 7&*+4

7&84 ,8&884 8&,84

7&94 9,&)94 8&+-4

'&84 9(&7)4 8&'-4

4

4



0 0 0

0

1

0

23405340

00000000000000000000006789

1

!66"6#

$%&'(

)

*+1,6-.'6/'1 )

116989:;<891

111=:7>?8:;<891

116@9=::;<891A

11AB9CD9?8:;<891A

16989989;:;<891

1AEFGH9FEFI:J;989;:;<89 1

1A1KGH9FEFLMNJ9O:GH91P

1AKGH9FEFQ::DRLI::?81#

1AAKGH9FEFSF9=:Q:9O:GH91(

1AKGH9FEF:J;TU;9V

1AKGH9FEFNWT9XY;V

1B9CD9?8J:989;:;<891

11=:N89CZ9:7[9:\1

111KM9U;J:T;;9XG]9<CD91

11KM9U;J:T;_9CD9:7;9X:7ab9

1=:N89CZ9:7[989T



0 0 0

0

1

234353678966666333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333361

2343436666868686633333333333333333333333333333333333333333333333333361!

2343"36#$6%86&8'6&86333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333365(

7#)*+,61-6.#/76+,#633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333654

13236#68966686:633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333654

1323236#689633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333654

1323136;6633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333654

1323536.86:63333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333654

13136+<668=663333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333365>

1313236?8@6%86AB6AC6D6=6EF68G63333333333333333333333333333333333333333365>

1313136.H68I668G6333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333365

1313536?8JK68'68@6%8686EL6333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333365M

131353236?8JK68'6A6GN6&L686896E6,?7633333333333333333333333333333333333365M

131353136?8JK68'686O86PQRQ63333333333333333333333333333333333333333333333333333364(

131353536?8JK68'686O86.Q63333333333333333333333333333333333333333333333333333333333642

131353436?8JK68'68S6T$66U6333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333642

131353"36?8JK68'68H68V6$6P.W6 33333333333333333333333333333333333333333333333641

131353>36?8JK68'68H66'6T$6W63333333333333333333333333333333333333333333333333645

1313436X8O6G'6&8O66896866=68$668G633333333333333333333645

131343236U@66AJY686686Z[63333333333333333333333333333333645

131343136X8O6G'6&8O66896866=68$668G6333333333333364"

7#)*+,65-6X\.6]_6a6Z+6bc+63333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333364

53236?8@6%86AB6AC6D6=6EF68G633333333333333333333333333333333333333333333333364

5323236?8JK68'68@6%86,?7633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333364

0



0 0 0

0

1

2345067809400

!"#$%!%&$'(!)*+!!'%#

,!-.%/%!/!$

&,:;'<=(:;'<!>$!%&$-$%!%&$?@<-

$%!%&$,?@A<=(*%BC!C!'/DE

DF.G=(H!!"IJKLMNOPKQJKLRMNSTUSVWOVK=(QJKUWTSWVKX;'<

D

DY!Z#$%!%&$!"[!!!$\

D]!>$_'a;@@"b!)#$%!%&$1

DD]!>$c"b!)#$%!%&$d

D1?efg!b!

A

<!>$a=($%aA@@d1

D\a,'%&&))h=(i)h.%/jE

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0



0 0 0

0

1

23450678059450450

0

!

!"#$%&'()#(*(+,-.)#/

"#$%&'()#(*(

"#$%&'()#(*((.)#

1"#$%&'()#(*(!

:"#$%&'()#(*(-;$<!

/-=#>(?)@!

ABCDEFGHIJKL>&MNOPQRSTUVTWXYW+;EZ

[\);EZGHK];EZ(G_K];EZ\GK]

;EZ]1\GK];EZ!\GaK];EZ\GIK

!"#$%D:

!!J*C$(bc"dbe-GHK]-*C+CfbgH

h

iaj

ekG_K/

!J*CC,-lmbnai"Ho!iajjbpamjibIlqam

!J*C$jao"jHiorscla"j

!1J*Ct+Zu-qvHqboamj"e

!:wxB$wEyz(*;e)\Iak"aJ{"J/I

!/wxB$wEeC|y{aJk

!J*C};~_e+e~ikHnHma!

!J*C$(Ijkbi_ilgaiaclbms~11!

!J*C$(i-sib_H{s_bmrnsm

!J*Cy(lnknkmbikn:/]{Hs

AIak"aJL+)x

0



0 0 0

0

1

23456789865464664644646566654665!888886"#

6

2345678786$%6&6565'6(6)6*86888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886"9

6

2345678+86$,65-6.,46/66$66*868888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886"9 6

2345678"86646566456566464464665464565646:;6

6546646446465%<;665466464464686888888888888888886"7

6

2345678186=4565.>46(6?6@6-46?65345654565644868888888888888888888888888888888886"+

6

2345678A86=4565B<66446546C65-6D6/6<5.,46<5/<6E5/6456D6

/66<56<5.,46<5/<66646F6*66<5.,46<5/<664644646

566F65!8688888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886""

6

2345678G86=456HIJI6(656446546C65-6D6/6<5.,46<5/<6E5/6

456D6/66<56<5.,46<5/<664644646566F65!K6

<5.,46<5/<6646F6*86888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886"1

6

2345678L86=4565B<646565!C46<5M6446546C65-6D6/6N66

$O*6E5/6456D6/66<567#K+#K6"#K61#K6A#8688888888888888888888888888888888888886"A

6

2345678#P86=456HIJI656446546E56Q465R<6F6N66$O*667#8686"L

6

2345678##865S466ET565.F6566446546F6N66$O*667#868888888888886"L

6

2345678#986=456HIJI656446546E56Q465R<6F6N66$O*66+#86861P

6

2345678#7865S466ET565.F656446546F6N66$O*66+#86888888888888861P

6

2345678#+86=456HIJI656446546E56Q465R<6F6N66$O*66"#86861#

6

2345678#"865S466ET565.F656446546F6N66$O*66"#86888888888888861#

6

2345678#186=456HIJI656446546E56Q465R<6F6N66$O*661#868619

6

2345678#A865S466ET565.F656446546F6N66$O*661#868888888888888619

6

2345678#G86=456HIJI656446546E56Q465R<6F6N66$O*66A#868617

6

2345678#L865S466ET565.F656446546F6N66$O*66A#868888888888888617

6

23456789P86=4565.>46(6N66$O*6-46ET565.F6586888888888888888888888888888888888861+

6

23456789#86=4565B<646565!C46<5M6446546C65-6>64546C6

E46<26E5/6456D6/66<56+KP;6+K";6"KP;6"K"868888888888888888888888888888888888888888888611

6

0



0 0 0

0

1

234567899845665644654656465662686888888888888888888888888861

6

23456789786!5"46#$6%565&'6564465465646566268688888888888888861

6

2345678986456656446546564656626(868888888888888888888888886) 6

23456789(86!5"46#$6%565&'6564465465646566626(86888888888888886)

6

2345678986456656446546564656626(868888888888888888888888886*

6

23456789186!5"46#$6%565&'6564465465646566626(86888888888888886*

6

23456789)86456656446546564656626((8688888888888888888888888861

6

23456789*86!5"46#$6%565&'65644654656465666626((86888888888888861

6

234566787864565&46+626,-46%565&'65644654868888888888888888888888888861. 6

23456787.86456/6+656446,65-6626666/!!66.86888888888888617

6

23456787986!56:;6+6546<=6>656446/!!6<#=868888888888888888888888888888888888861

6

23456787786!56;?46+6548688888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888861

6

2345678786!56;?46+656446/!!86888888888888888888888888888888888888888888888888888888888861

6

23456787(86@A46,B6C;D6+66>6446/!!86888888888888888888888888888888888888888888888888861)

6

23456787864565E6FG5646HI466565J?65$65K6LHFMHF6K6FE46

&46564465465N6456<O6HN6P65A=6(6.6.(69?8688888888888861*

6

2345678718626Q65Q65E6HI46645R466&46564465465N6

4586888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886).

6

S

S

S

S

S

S

S

0



0 0 0

0

1

2345067850859000

!!"#$%&'()*

+,+#,%(-%

..(

.,.!/

$/(//(!/*

-%(

/-%(/

,(,/$(!!"#

:;'<%=!>?@A$*

BCD %B/C/,E!F!G$$?

-H:F%*

IE.I(E/.!/$/!,JKL!M!N%$(*

O.O/$.//

OO/$

+. %+//(./G$:;K!%M

P!"%*

C.%C!-./G$:Q!HP!"%*

EIE(!(I((

B B/(!!"#:;'

%R<%/*

BEEB(!!/

SDS//!T%?/S*

0



0 0 0

0

1

2304560

78989!"#$

8%&'()88*+,+%-./88,9((9"8/8

)88*9(8-8/:(;<=

"8!*((>+?@A(BC;9#)88A<"

#DE8%&F

7'(<E/E9E+%-"8/89(;#>8CC

9+'(G*((>FH:('9)88(;E99+'

8"(8'(89/%-FI8;8%J8/:

('#(/:('+%&8(;89/:(;(K*+?*

#(+'(G#L/9FI(8(;E9E/E9+%-

J(@/#>8(()+%&8(9/MGA

NEOEF7'(8"(+%-9P#Q89>9

%./8<+8'?"EE98*;8

8FI8;8*;8/:('9<8

+'("RF

78<8ASTN#>8/:(;!(SA.

%9E/EE98ENS8!#>8>*E9

E/E#DAEOE!8+%&8(FH#@%D

8<9!/8A(9J+%(;++S8(A8

*((>+'(GF

7'()8U898"('#@V+*@'?<

+A98+?@(C8(+G*((>8A

M8E8Q#A.E<FI(#(>+<

+%-#(F

WX8Y(+'9(KI<Z78"(<K*(

9E"8/88/:('(;[PYA

/8(+'(+J8>(+%-<!#@%D

0



0 0 0

0

0

12

3456738977979777573757275756756756757

98579!"#7$%"7&'7(9)7*73+,"73%576%7-5675897+567%7.57/"77

7&%"75975+77:;77<=73>"7-775?567+567%7.57/"7

@75+7<A<=775#7

B?567"7C975C97C573+,"7"7D77(975E79567F"757973.G7

HIJ)7%73>"73D7569C5797"5#7

HIJ)7%7"%"7'97!7)57+K5673'57&/"7+@"77F7.57-!77557

"5#7

HIJ)7%73>"73D777"L77557"5#7

HIJ)7%7&)75M5677757"L77557"5#7

57"N567"L73877*773897&57)57O977)57P7557"57

@76%75773D7"7D7F"7575?56756C57"97'77577@7567

567557"577"7579!"767Q575.567"7"7&R7"E5673456#7



0 1 23

1

45670890606705000

0

4000!1"#1$%&'1()*')1+,--./!1)11)1%1:;<=1

')>1')?1@A%1;1BCD=C1E@F;@GC;H;;=D1C%1:;<=1F;I1)JE1)&'1KE)L!1

MNOPQRSTURVWVRVXQYRSZ[Q\R]_RQY\Ra\bcR\dVRefRVXQYRQY\gR\hcR\dVR\iNRVjR

SbfQRkNlVRmnQRS\oRSp!1$qr1s*;1)&'1t=u'1%;E1vw1$x;1

,4000!1yz1t=u'1){|%!1})E1v=#1}){|%!1$%=G~1()1

}){|%1})%1+,--/!1$%);#1'=1')>1*11@;I=1E1');E1@wD1')?1

)?1)1C;1%1H%1C%1H1C=G<1)=u'L!1]_RQY\Ra\bcR\dVRmnQR!1

(C{%1s*;1)&'1)E1)&'1(1);#sv1t=u'1%;E1(1v1

0

0

0

0

0

0

thẠc sỸ nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein...

Documents