the cell sample ch09

ΜΕΡΟΣIII Δομή και λειτουργία των κυττάρων

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Οπυρήνας

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Διαλογήκαιμεταφοράπρωτεϊνών

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Βιοενεργητικήκαιμεταβολισμός

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 Οκυτταροσκελετόςκαιηκυτταρικήκίνηση

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 Ηκυτταροπλασματικήμεμβράνη

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 Κυτταρικάτοιχώματα,εξωκυτταρικόστρώμακαιαλληλεπιδράσειςτωνκυττάρων

99.1 Ο πυρηνικός φάκελος

και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα 530

9.2 Eσωτερική οργάνωση του πυρήνα 548

9.3 Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNA 555

ΜΟΡΙΑΚΗΙΑΤΡΙΚΗΑσθένειες που συνδέονται με την πυρηνική λάμινα 534

ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣΗ ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού 538

Η παρουσία πυρήνα είναι το βασικό γνώρισμα που διαφοροποιεί τα ευκαρυωτικά κύτταρα από τα προκαρυωτικά. Στεγάζοντας το γονιδίωμα του κυττάρου, ο πυρήνας χρησιμεύει τόσο ως χώρος αποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας όσο και ως κέντρο ελέγ-χου για το κύτταρο. Στον πυρήνα γίνεται η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, καθώς και η ωρίμανση του RNA, ενώ στο κυτταρόπλα-σμα λαμβάνει χώρα μόνο το τελικό στάδιο της γονιδιακής έκφρασης (η μετάφραση).

Ο διαχωρισμός του γονιδιώματος από το κυτταρόπλασμα, ο οποί-ος γίνεται με τον πυρηνικό φάκελο, επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδι-ακής έκφρασης μέσω μηχανισμών που συναντώνται αποκλειστικά στους ευκαρυώτες. Ενώ στους προκαρυώτες το mRNA μεταφρά-ζεται όσο η μεταγραφή του βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη, το mRNA των ευκαρυωτών υπόκειται σε αρκετές μορφές μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας προτού μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλα-σμα. Κατά συνέπεια, η παρουσία του πυρήνα επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μετα-μεταγραφικών μηχανισμών, όπως είναι το εναλλακτικό μάτισμα. Περιορίζοντας την πρόσβαση επιλεγμένων πρωτεϊνών στο γενετικό υλικό, ο πυρηνικός φάκε-λος προσφέρει επίσης νέες ευκαιρίες για έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής. Για παράδειγμα, η έκφραση ορισμένων ευκαρυωτικών γονιδίων ελέγχεται από τη ρυθμιζόμε-νη μεταφορά μεταγραφικών παραγόντων από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, η οποία είναι μια μορφή μεταγραφικής ρύθμισης που δε διαθέτουν οι προκαρυώτες. Ο διαχωρισμός επομένως της θέσης του γονιδιώματος από τη θέση όπου πραγματοποιείται η μετάφραση του mRNA έχει κεντρικό ρόλο στη γονιδιακή έκφραση των ευκαρυωτών.

Ο πυρήνας

9.1 Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμαΟ πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα και συγκροτεί το δομικό πλαίσιο του πυρήνα. Οι δύο μεμβράνες του πυρηνικού φακέλου δρουν ως φραγμοί που εμποδίζουν την ελεύθερη διέλευση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας να συνιστά ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα. Οι μόνοι δίαυλοι που διαπερνούν τον πυρηνικό φάκελο είναι τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, τα οποία επιτρέπουν τη ρυθμιζόμενη ανταλλαγή μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η επιλεκτική διακίνηση πρωτεϊνών και RNA μέσω των πυρηνικών πόρων αφενός καθορίζει την εσωτε-ρική σύσταση του πυρήνα και αφετέρου έχει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των ευκαρυωτών.

Η δομή του πυρηνικού φακέλουΟ πυρηνικόςφάκελος (nuclear envelope) έχει πολύπλοκη δομή. Αποτελείται από δύο πυρηνικές μεμβράνες, την πυρηνική λάμινα, η οποία τον επενδύει εσωτερικά, και τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (Εικόνα 9.1). Ο πυρήνας περιβάλλεται από ένα σύστημα δύο ομόκεντρων μεμβρανών, οι οποίες ονομάζονται εσωτερική και εξωτερική πυρηνικήμεμβράνη(nuclear membrane). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη αποτελεί συνέχεια του ενδοπλασματικού δι-κτύου (ER), με συνέπεια ο χώρος ανάμεσα στην εσωτερική και την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη να συνδέεται άμεσα με τον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου. Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη είναι λειτουργικά όμοια με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου (βλ. Κεφάλαιο 10) και φέρει ριβοσώματα στην κυτταροπλασματική της επιφάνεια, διαφέρει όμως σε μικρό βαθμό ως προς την πρωτεϊνι-κή της σύσταση, καθώς είναι πλούσια σε μεμβρανικές πρωτεΐνες που προσδένονται στον κυτταροσκελετό και δε διαθέτει τις πρωτεΐνες που προσδίδουν στο ER τη σωληνοειδή του οργάνωση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη φέρει πρωτεΐνες που συναντώνται αποκλειστικά στον πυρήνα, όπως είναι οι πρωτεΐνες που προσδέ-νονται στην πυρηνική λάμινα (οι οποίες θα συζητηθούν παρακάτω).

Η λειτουργία των πυρηνικών μεμβρανών είναι ζωτικής σημασίας, καθώς δρουν ως ένας φραγμός που διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα. Όπως και οι άλλες μεμβράνες του κυττάρου, κάθε πυρηνική μεμβράνη είναι μια φωσφολιπιδική δι-

530 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9

Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASMFigure 9.01 #0801

Εσωτερική μεμβράνη

Εξωτερική μεμβράνη

Περιπυρηνικόςχώρος

(A) (Β)

(Γ)

Αδρόενδοπλασμα-τικό δίκτυο

ΧρωματίνηΠυρηνικήλάμινα

Πυρηνίσκος

Λείοενδοπλασμα-τικό δίκτυο

Σύμπλοκοπυρηνικούπόρου

Ριβοσώματα

0,2 μm

Ενδοπλασμα-τικό δίκτυο

Εσωτερική μεμβράνη


Χρωματίνη

Σύμπλοκο πυρηνικού πόρου Εξωτερική μεμβράνη

ΕΙΚΟΝΑ 9.1 Ο πυρηνικός φάκελος. (Α) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει έναν πυρήνα. Η εσωτερική και η εξωτερική πυ-ρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (βέλη). (Β) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει τη συνέχεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με το ενδοπλασματικό δίκτυο. (Γ) Σχη-ματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη επενδύεται από την πυρηνική λάμινα, η οποία χρησιμεύει ως θέση προσάρτησης της χρωματίνης. (A, David M. Phillips/Photo Researchers, Inc. B, ευγενική προσφορά του Dr. Werner W. Franke, German Cancer Research Center, Heidelberg/Γερμανικό Κέντρο Αντικαρκινικής Έρευνας, Χαϊδελβέργη.)

531Ο ΠυρΗνΑΣ

πλοστιβάδα διαπερατή μόνο από μικρά μη πολικά μόρια (βλ. Εικόνα 2.27). Άλλα μόρια δεν μπορούν να διαπεράσουν τη διπλοστιβάδα με διάχυση. Η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώ-νονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, που είναι οι μοναδικοί δίαυλοι μέσω των οποίων μπορούν να διαπεράσουν τον πυρηνικό φάκελο μικρά πολικά μόρια και μακρομόρια (Εικόνα 9.2). Όπως θα συζητηθεί στη συνέχεια, το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου είναι μια πολύπλοκη δομή που ευθύνεται για την επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών και RNA ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

Η πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμ-βράνης επενδύεται από την πυρηνικήλάμινα(nuclear lamina), ένα ινώδες δίχτυ που παρέχει στον πυρήνα δομική στήριξη (Εικόνα 9.3).

»» Τα ερυθροκύτταρα (ή ερυθρά αιμοσφαίρια) των θηλαστικών δε διαθέτουν πυρήνα. Ο πυρήνας αποβάλλεται από το κύτταρο κατά την ανάπτυξη των ερυθροκυττάρων από τα πρόδρομά τους κύτταρα.

0,5 μm

Cooper Cell Biology, Sinauer/ASMFigure 9.02 #15

ΕΙΚΟΝΑ 9.2 Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει πυρηνικούς πόρους. Σε αυτό το παρασκεύασμα πυρηνικού φακέλου που έχει υποστεί τεμαχισμό υπό ψύξη διακρίνονται πολλοί πυρηνικοί πό-ροι (βέλη). (Don W. Fawcett/Photo Researchers, Inc.)

0,5 μm


ΕΙΚΟΝΑ 9.3 Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει την πυρηνική λάμινα. Η λάμινα είναι ένα δίκτυο ινιδίων που βρίσκεται κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και εκτείνεται στο εσωτε-ρικό του πυρήνα. (Από τη δημοσίευση των U. Aebi, J. Cohn, L. Buhle και L. Gerace, 1986. Nature 323: 560.)


Η πυρηνική λάμινα αποτελείται από ινώδεις πρωτεΐνες μοριακής μά-ζας 60 έως 80 kDa που ονομάζονται λαμίνες (lamins), καθώς και από τις πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές. Τα φυτικά κύτταρα έχουν ένα παρόμοιο ινώδες δίκτυο, το οποίο αποτελείται από πρωτεΐνες που δε συγγενεύουν με τις λαμίνες. Οι λαμίνες είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων συναντώνται στον κυτταροσκελετό (βλ. Κεφάλαιο 12). Τα κύτταρα των θηλαστικών διαθέτουν τρία γονίδια για τις λαμίνες, τα Α, Β και C, τα οποία κωδικοποιούν τουλάχιστον επτά διακριτές πρωτεΐνες. Οι λαμίνες, όπως και άλλες πρωτεΐνες των ενδιάμεσων ινιδίων, συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας δομές με υψηλότερο βαθμό οργάνωσης (Εικόνα 9.4), αν και θεωρείται ότι η σύνδεση των λαμινών διαφέρει σε έκταση και πολικότητα από αυτήν που συναντάται σε άλλα ενδιάμεσα ινίδια. Το πρώτο στάδιο σύνδεσης των λαμινών είναι η αλληλεπίδραση δύο λαμινών που οδηγεί στον σχηματισμό ενός διμερούς. Στο διμερές αυτό, οι περιοχές α-έλικας των δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη σχηματίζοντας μια δομή που ονομάζεται σπειρωμένο σπείραμα (coiled coil). Στη συνέχεια, τα διμερή λαμίνης συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας την πυρηνική λάμινα.

Η σύνδεση των λαμινών με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη διευκολύνεται από τη μετα-μεταφραστική προσθήκη λιπιδίων – συ-γκεκριμένα, από την πρενυλίωση των καρβοξυτελικών καταλοίπων κυστεΐνης (βλ. Εικόνα 8.34). Επιπλέον, οι λαμίνες προσδένονται σε ειδικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, όπως εί-ναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β, μεσολαβώντας στην

Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASMFigure 09.04 #090103/01/06

Πολυπεπτίδιο λαμίνης

Κατά σειρά σύνδεση των διμερών

Διμερές

Δομήυψηλότερης οργάνωσης

Πολυμερές

Πλευρική σύνδεση των πολυμερών

ΕΙΚΟΝΑ 9.4 Μοντέλο συναρμολόγησης των λαμινών. Τα πολυπεπτί-δια λαμίνης σχηματίζουν διμερή στα οποία οι κεντρικές περιοχές α-έλικας δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλί-γονται η μία γύρω από την άλλη. Στην περαιτέρω συναρμολόγηση μπορεί να συνεισφέρουν η κατά σειρά σύνδεση των διμερών, με την οποία σχηματίζο-νται γραμμικά πολυμερή, και η πλευ-ρική σύνδεση των πολυμερών, με την οποία σχηματίζονται δομές υψηλότε-ρης οργάνωσης.


Ασθένειεςπουσυνδέονταιμετηνπυρηνικήλάμινα

ΟιασθένειεςΤο 1966, οι Alan Emery και Fritz E. Dreifuss περιέγραψαν μια νέα μορφή μυϊκής δυστροφίας που συνδέεται με το χρωμόσωμα Χ. Κατά τα πρώτα στά-δια της ασθένειας εμφανίζεται ακαμψία στους αγκώνες, στον λαιμό και στις φτέρνες των ασθενών και συχνά υπάρ-χει αποκλεισμός αγωγής στην καρδιά. Τα συμπτώματα αυτά παρατηρούνται μέχρι την ηλικία των δέκα ετών και συ-μπεριλαμβάνουν «ακροποδητί βάδιση» λόγω ακαμψίας του αχίλλειου τένοντα στις φτέρνες και δυσκολία κάμψης των αγκώνων. Από την ηλικία των 20 ετών οι ασθενείς αναπτύσσουν καρδιακά προβλήματα και πολλές φορές κρίνεται απαραίτητη η χρήση βηματοδότη. Παρουσιάζεται σταδιακός εκφυλισμός και εξασθένηση των μυών του ώμου και του βραχίονα, καθώς και των μυών της κνήμης, κάτι που όμως συμβαίνει με αργό ρυθμό και συχνά δεν αποτελεί πρόβλημα προτού το άτομο φτάσει σε προχωρημένη ηλικία.

Σχεδόν 30 χρόνια μετά την αρχική περιγραφή της ασθένειας διαπιστώθη-κε ερευνητικά ότι η φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss οφειλόταν σε μεταλλαγές μιας άγνωστης μέχρι τότε διαμεμβρανικής πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε εμερίνη, προς τιμήν του Alan Emery. Σύντομα, αρκετές ερευνητικές ομάδες ανακά-λυψαν ότι η εμερίνη είναι μια πρωτε-ΐνη που εντοπίζεται στην εσωτερική

πυρηνική μεμβράνη και απουσιάζει από τους ασθενείς που πάσχουν από τη φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss. Το εύρημα αυτό ήταν απροσδόκητο, καθώς φαινόταν ότι μεταλλαγές μιας πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου η οποία εκφράζε-ται σε όλα τα κύτταρα προκαλούν μια ιστοειδική ασθένεια. Αν και η πρωτεΐνη απουσίαζε από όλα τα κύτταρα του σώματος των ασθενών, η παθολογία εκ-δηλωνόταν μόνο στον μυϊκό ιστό. Στη συνέχεια, άλλοι ερευνητές αποκάλυψαν ότι η ίδια μορφή δυστροφίας μπορεί να κληρονομηθεί επίσης με μη φυλοσύν-δετο τρόπο. Οι οικογένειες στις οποίες εμφανιζόταν η μη φυλοσύνδετη μορφή της μυϊκής δυστροφίας Emery-Dreifuss έφεραν μεταλλαγές στο γονίδιο LMNA, το γονίδιο που κωδικοποιεί τις πυρηνι-κές λαμίνες Α και C. Μεταλλαγές επο-μένως σε δύο διαφορετικά γονίδια –το γονίδιο μιας πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης και το γονίδιο μιας από τις κυριότερες πυρηνικές λαμίνες– προκαλούν μυϊκή δυστροφία με την ίδια κλινική εικόνα.

Ακόμη μεγαλύτερη έκπληξη προ-κάλεσε το γεγονός ότι άλλες, παράλλη-λες μελέτες συνέδεσαν διαφορετικές μεταλλαγές του γονιδίου LMNA με διαφορετικές ασθένειες: τη μερική λιποδυστροφία τύπου Dunnigan, τη διαταραχή Charcot-Marie-Tooth τύπου 2Β1 και το σύνδρομο προγηρίας Hutchinson-Gilford, μια ασθένεια που

προκαλεί πρόωρη γήρανση. Μέχρι πρότινος, οι ιατροί ταξινομούσαν τις ασθένειες αυτές σε διακριτές κατηγορί-ες, με κριτήριο τα κλινικά χαρακτηριστι-κά και τον τρόπο κληρονόμησής τους. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν εξάλλου ότι οι μεταλλαγές μιας άλλης πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβρά-νης, του υποδοχέα της λαμίνης Β, αποτελούν τη βάση της διαταραχής Pelger-Huët.

ΜοριακήκαικυτταρικήβάσηΟι περισσότεροι βιολόγοι θεώρησαν ότι οι μεταλλαγές των λαμινών θα προκαλούσαν γενικευμένα ελαττώ-ματα στην αρχιτεκτονική του πυρήνα και σοβαρά προβλήματα στα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Ωστόσο, η δομή του πυρήνα των κυττάρων των ασθενών δεν εμφανίζει παρά ελάχιστες αποκλίσεις από το φυσιολογικό. Το ερώτημα λοιπόν είναι με ποιον τρόπο οι μεταλλαγές των πυρηνικών λαμινών ή των πρωτεϊνών που προσδένονται σε αυτές προκαλούν διαφορετικές ιστοει-δικές ασθένειες. Η απάντηση δεν είναι ακόμη γνωστή, όμως δύο είναι οι επι-κρατέστερες υποθέσεις. Η πρώτη είναι η υπόθεση της «γονιδιακής έκφρασης». Σύμφωνα με αυτήν, η ενδεδειγμένη αλληλεπίδραση των δύο λαμινών, Α και C, με τον πυρηνικό φάκελο είναι απαραίτητη για την κανονική ιστοειδική έκφραση ορισμένων γονιδίων. Μετα-γραφικώς ανενεργά γονίδια εντοπίζο-

Ιντρόνιο

Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASMMM chap 0903/01/06

Έλλειμμα 150 νουκλεοτιδίωνΕξόνιο

5’

DNA

Λαμίνη A

5’3’

3’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

(B)(A)

(Α) Παιδί που πάσχει από προγηρία Hutchinson-Gilford. (B) Διάγραμμα της δομής ιντρο-νίων-εξονίων του γονιδίου LMNA και της πρωτεΐνης της λαμίνης Α. Οι σφαιρικές επικράτειες υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα και οι ραβδοειδείς επικράτειες με κίτρινο. Στο μεταλλαγμένο γονίδιο που φαίνεται στο διάγραμμα υπάρχει μια έλλειψη 150 bp (μαύρο χρώμα) στο εξόνιο 11. (Α, ευγενική προσφορά της Maggie Bartlett, NHGRI.)

Μ Ο Ρ Ι Α Κ Η Ι Α Τ Ρ Ι Κ Η


νται κατά προτίμηση στην περιφέρεια του πυρήνα, ενώ γονίδια που εκφρά-ζονται συγκεντρώνονται στο κέντρο του πυρήνα, με πρότυπο κατανομής που εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Επομένως, η βάση των παραπάνω ασθενειών θα μπορούσε να είναι μια αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση λόγω ελαττωματικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών.

Σύμφωνα με μια δεύτερη υπόθεση, την υπόθεση του «μηχανικού στρες», οι μεταλλαγές του πυρηνικού συμπλόκου λαμινών-εμερίνης θεωρείται ότι εξα-σθενούν τη δομική ακεραιότητα ενός ενιαίου κυτταροσκελετικού δικτύου. Σε όλα τα κύτταρα, η λάμινα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων είναι στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους. Σύμφωνα με την υπόθεση του «μηχανικού στρες», η λάμινα θα μπορούσε, μέσω ινιδίων που προσδένονται στο σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, να συνδέεται έμμεσα με τον κυτταροσκελετό των μυϊκών κυττάρων. Μια τέτοια ερμηνεία αρμόζει

περισσότερο στην περίπτωση των μυϊκών δυστροφιών.

ΠρόληψηκαιθεραπείαΗ ανακάλυψη ότι μεταλλαγές σε κοινά εκφραζόμενες πρωτεΐνες του συμπλέγματος της πυρηνικής λάμινας προκαλούν διαφορετικές κληρονομού-μενες ιστοειδικές ασθένειες προκάλεσε μεγάλη έκπληξη στους επιστήμονες και άλλαξε τον γενικό τρόπο θεώρησης των πυρηνικών λαμινών. Περαιτέρω ερευνητικές προσπάθειες απαιτού-νται για να κατανοηθεί κατά πόσο η κλινική εικόνα για καθεμία από αυτές τις ασθένειες βασίζεται σε μειωμένη μηχανική σταθερότητα του πυρηνικού φακέλου ή σε απορρύθμιση της γονι-διακής έκφρασης. Ωστόσο, η γνώση της μοριακής φύσης των ασθενειών απλοποιεί σημαντικά τη διάγνωσή τους και καθιστά πιθανή την εύρεση της κατάλληλης θεραπευτικής αντιμετώ-πισης. Ένα πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί η πρόσφατη ανάπτυξη ενός πειραματικού μοντέλου

ποντικιού που φέρει χρωμοσωμική απαλοιφή του γονιδίου LMNA (knock out). Συμπτώματα μυϊκής δυστροφίας Emery-Dreifuss εμφανίζονται στα ποντί-κια αυτά κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τέλος, οι ερευνητές γνωρίζουν πλέον ότι στις «λαμινοπάθειες» του πυρήνα είναι πιθανόν να συμπεριλαμβάνονται αρκετές συγγενείς ασθένειες βραδείας ανάπτυξης.

ΒιβλιογραφικέςαναφορέςDe Sandre-Giovannoli, A., M. Chaouch, S.

Kozlov, J. M. Vallat, M. Tazir, N. Kassouri, P. Szepetowski, T. Hammadouche, A. Vandenberghe, C. L. Stewart, D. Grid and N. Levy. 2002. Homozygous defects in LMNA, encoding lamin A/C nuclear-envelope proteins, cause autosomal recessive axonal neuropathy in human (Charcot-Marie-Tooth disorder type 2) and mouse. Am. J. Hum. Genet. 70: 726-736.

Gruenbaum, Y., A. Margalit, R. D. Goldman, D. K. Shumaker and K. L. Wilson. 2005. The nuclear lamina comes of age. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 21-31.

πρόσδεσή τους στον πυρηνικό φάκελο και συμβάλλοντας στην τοποθέτηση και στην οργάνωσή τους μέσα στον πυρήνα (Εικόνα 9.5). Η πυρηνική λάμινα προσδένεται επίσης στη χρωματίνη μέσω

Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASMFigure# 09.05 DMG# 090112/12/08Dragonfly Media Group

Χρωματίνη

Πρωτεΐνες πουσυνδέονται με

λαμίνες

Ριβοσώματα

LBR Εμερίνη

Λάμινα

Σύμπλοκοπυρηνικού

πόρουΕξωτερικήπυρηνικήμεμβράνη

Εσωτερική πυρηνικήμεμβράνη ΕΙΚΟΝΑ 9.5 Η πυρηνική λάμινα.

Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη πε-ριέχει αρκετές διαμεμβρανικές πρωτε-ΐνες, όπως είναι η εμερίνη και ο υπο-δοχέας της λαμίνης Β (LBR, Lamin B Receptor), που αλληλεπιδρούν με τις λαμίνες του πυρήνα. Οι λαμίνες και οι πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές αλληλεπιδρούν επίσης με τη χρωμα-τίνη.

Μ Ο Ρ Ι Α Κ Η Ι Α Τ Ρ Ι Κ Η


των ιστονών Η2Α και Η2Β, καθώς και μέσω άλλων πρωτεϊνών της χρωματίνης. Αν και η πυρηνική λάμινα προσδένεται άμεσα στο DNA, δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για το κύτταρο. Επιπρόσθετα, οι λαμίνες σχηματίζουν ένα χαλαρό δίχτυ που εκτείνεται σε ολόκληρο το εσωτερικό του πυρήνα. Είναι γνωστό ότι στις λαμίνες προσδένονται πολλές πυρηνικές πρω-τεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση του DNA, στη μεταγραφή ή στην τροποποίηση της χρωματίνης, παρόλο που η σημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων μόλις έχει αρχίσει να κατανοείται.

Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρουΤα σύμπλοκατωνπυρηνικώνπόρων (nuclear pore complexes) είναι οι μόνοι δίαυλοι που επιτρέπουν τη μεταφορά μικρών πολι-κών μορίων, ιόντων και μακρομορίων (πρωτεϊνών και RNA) ανάμε-σα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για εξαιρετικά ευμεγέθεις δομές με διάμετρο περίπου 120 nm και εκτιμώμενη μοριακή μάζα περίπου 125 εκατομμύρια Da, δηλαδή μέγεθος 30 φορές μεγαλύτερο από το μέγεθος ενός ριβοσώματος. Στα σπονδυ-λωτά, το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από περίπου 30 διαφορετικές πρωτεΐνες (που ονομάζονται νουκλεοπορίνες), οι περισσότερες από τις οποίες είναι παρούσες σε πολυάριθμα αντί-γραφα. Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου έχει θεμελιώδη ρόλο στη φυσιολογία όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, καθώς ελέγχει τη διακίνηση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλα-σμα. Τα μόρια RNA που συντίθενται στον πυρήνα θα πρέπει να εξαχθούν στο κυτταρόπλασμα, προκειμένου να λάβουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία του πυρήνα (π.χ. μεταγραφικοί παράγοντες) θα πρέπει να μεταφερθούν από το κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η σύνθεσή τους, στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, πολλές πρωτεΐνες μετακινούνται συνεχώς (shuttle) ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

Η μεταφορά μορίων μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου μπορεί να γίνει με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς, ανάλογα με το μέγεθος των μορίων (Εικόνα 9.6). Τα μικρά μόρια και μερικές πρωτεΐνες μοριακής μάζας μικρότερης των 20-40 kDa διέρχονται ελεύθερα από τον πόρο προς οποιαδήποτε από τις δύο κατευθύν-σεις: από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα ή από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα. Αυτά τα μόρια περνούν με παθητική διά-χυση από το υδατικό μέσο ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που εκτιμάται ότι έχουν διάμετρο περίπου 9 nm. Ωστόσο, οι περισσότερες πρωτεΐνες και τα περισσότερα μόρια RNA


Πρωτεΐνες

Παθητική διάχυση Ενεργός μεταφορά

Μικράμόρια

RNA

Πυρήνας

E

E

ΕΙΚΟΝΑ 9.6 Κυκλοφορία μορίων μέσω των συμπλόκων των πυρηνικών πόρων. Τα μικρά μόρια μπορούν να διέλθουν ταχύτατα, με παθητική διάχυση, από ανοικτούς διαύλους του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Αντίθετα, τα μακρομόρια (πρωτεΐνες και RNA) μεταφέρονται με έναν επι-λεκτικό μηχανισμό που απαιτεί κατα-νάλωση ενέργειας.


δεν μπορούν να περάσουν από αυτούς τους ανοικτούς διαύλους. Τα μεγαλύτερα αυτά μακρομόρια περνούν από τον κεντρικό δίαυλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που έχει διάμετρο περίπου 10-40 nm, με μια ενεργή διεργασία κατά την οποία κατάλληλες πρωτεΐνες και RNA αναγνωρίζονται και μεταφέρονται επιλεκτικά προς μία συγκεκριμένη κατεύθυνση (είτε από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα είτε από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα).

Η απεικόνιση των συμπλόκων των πυρηνικών πόρων με ηλεκτρο-νική μικροσκοπία αποκαλύπτει μια δομή με οκταπλή συμμετρία, οργανωμένη γύρω από έναν μεγάλο κεντρικό δίαυλο (Εικόνα 9.7). Ο κεντρικός αυτός δίαυλος αποτελεί την οδό μέσω της οποίας δια-σχίζουν τον πυρηνικό φάκελο οι πρωτεΐνες και τα RNA. Λεπτομερείς δομικές μελέτες, όπως η ανάλυση εικόνας βάσει υπολογιστή, έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη τρισδιάστατων δομικών μοντέλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου (Εικόνα 9.8). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από οκτώ ακτίνες διατεταγμένες γύρω από έναν κεντρικό δίαυλο. Οι οκτώ ακτίνες συνδέονται με δακτυλίους στην πυρηνική και στην κυτταροπλασματική επιφάνεια, συγκροτώντας μια δομή που βρί-σκεται αγκυροβολημένη στο εσωτερικό του πυρηνικού φακέλου σε

ΕΙΚΟΝΑ 9.7 Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει σύμπλοκα πυρηνικών πόρων. Στην κάτοψη αυτή διακρίνονται μεμονωμέ-να σύμπλοκα πυρηνικών πόρων, τα οποία αποτελούνται από οκτώ δομικές υπομονάδες που περιβάλλουν έναν κεντρικό δίαυλο. (Ευγενική προσφορά του Dr. Ron Milligan, The Scripps Research Institute.)

0,2 μm



AShortAminoAcidSequenceAbletoSpecifyNuclearLocationDaniel Kalderon, Bruce L. Roberts, William D. Richardson, and Alan E. SmithNational Institute for Medical Research, Mill Hill, LondonCell, Volume 39, 1984, pages 499-509

Ηταυτοποίησητωνσημάτωνπυρηνικούεντοπισμού

ΤοευρύτεροπλαίσιοΗ διατήρηση του πυρήνα ως διακριτού βιοχημικού διαμερίσματος απαιτεί έναν μηχανισμό διαχωρισμού μεταξύ πρωτεϊνών του πυρήνα και πρωτεϊ-νών του κυτταροπλάσματος. Μελέτες κατά τη δεκαετία του 1970 είχαν δείξει ότι μικρά μόρια διαχέονται ταχύτατα μέσω του πυρηνικού φακέλου, αλλά οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν μπορούν να διέλθουν με αυτόν τον τρόπο. Κατά συνέπεια, φαινόταν πιθανό ότι οι πυρηνικές πρωτεΐνες αναγνωρίζονται με κάποιον ειδικό τρόπο από τις θέσεις σύνθεσής τους στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος και μεταφέρονται επιλεκτικά στον πυρήνα.

Προηγούμενα πειράματα του Günter Blobel και των συνεργατών του είχαν αποδείξει ότι η στόχευση πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο γίνεται μέσω σηματοδοτικών αλληλου-χιών μικρού μήκους (βλ. Κεφάλαιο 10). Στην εργασία του 1984, ο Alan Smith και οι συνεργάτες του διεύρυναν αυτή τη θεώρηση στη στόχευση των

πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώς ταυτοποί-ησαν μια μικρή αλληλουχία αμινοξέων που λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού.

ΤαπειράματαΓια τις μελέτες πυρηνικού εντοπισμού σε ζωικά κύτταρα χρησιμοποιήθη-κε ως μοντέλο μια ιική πρωτεΐνη, το αντιγόνο Τ του ιού SV40. Το αντιγόνο Τ είναι μια πρωτεΐνη 94 kDa απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA του ιού SV40 και κανονικά εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από τον ιό. Προηγούμενες μελέτες τόσο στο εργαστήριο του Alan Smith όσο και στο εργαστήριο της Janet Butel (Landford and Butel, 1984, Cell 37: 801-813) είχαν δείξει ότι μεταλλαγή του καταλοίπου Lys-128 είτε προς Thr είτε προς Asn εμπόδιζε τη συσσώρευση του αντιγόνου Τ στον πυρήνα τόσο κυττάρων πιθήκου όσο και κυττάρων τρωκτικών. Τα μεταλλαγ-μένα μόρια αντιγόνου Τ δεν μπορούσαν να μεταφερθούν στον πυρήνα, αλλά πα-

ρέμεναν στο κυτταρόπλασμα, γεγονός που υποδεικνύει ότι η Lys-128 αποτελεί τμήμα ενός σήματος πυρηνικού εντο-πισμού. Ο Smith και οι συνεργάτες του έλεγξαν αυτή την υπόθεση εφαρμόζο-ντας δύο διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις.

Καταρχήν, προσδιόρισαν την επίδραση διαφόρων ελλειμμάτων στον υποκυτταρικό εντοπισμό του αντιγό-νου Τ και έδειξαν ότι μεταλλαγμένα αντιγόνα Τ με απαλοιφή αμινοξέων είτε μεταξύ των καταλοίπων 1 και 126 είτε μεταξύ του καταλοίπου 136 και του καρβοξυτελικού άκρου συσσωρεύο-νταν κανονικά στον πυρήνα, ενώ ένα μετάλλαγμα με απαλοιφή των καταλοί-πων των αμινοξέων 127-132 παρέμενε στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, υπεύθυνη για τον πυρηνικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ φαινόταν να είναι η αλληλουχία των καταλοίπων 127-132.

Για να προσδιορίσουν αν αυτή η αλληλουχία ήταν ικανή να υπαγορεύσει τη στόχευση άλλων πρωτεϊνών στον πυ-ρήνα, οι ερευνητές κατασκεύασαν χιμαι-ρικά μόρια ενώνοντας την αλληλουχία 126-132 του αντιγόνου Τ με πρωτεΐνες που υπό κανονικές συνθήκες εντοπίζο-νταν στο κυτταρόπλασμα. Τα πειράματα αυτά απέδειξαν ότι η προσθήκη της αλληλουχίας 126-132 του αντιγόνου Τ είτε στη β-γαλακτοζιδάση είτε στην κι-νάση του πυροσταφυλικού αρκεί για να οδηγήσει σε συσσώρευση αυτών των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών στον πυρήνα (βλ. εικόνα). Επομένως, αυτή η μικρή αλληλουχία αμινοξέων του αντιγόνου Τ του ιού SV40 λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού, δηλαδή

Alan Smith

(B)(A)


Πλασμιδιακά DNA που κωδικοποιούν για χιμαιρικές πρωτεΐνες οι οποίες φέρουν αλληλουχίες του SV40 σε σύντηξη με την κινάση του πυροσταφυλικού εισήχθησαν σε κύτταρα με μικρο-ένεση. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε ο κυτταρικός εντοπισμός των υβριδικών πρωτεϊνών μέσω μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού. (Α) Η υβριδική πρωτεΐνη περιέχει ένα ακέραιο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του ιού SV40 (αλληλουχία 126-132). (Β) Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού έχει απενεργοποιηθεί με απαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων 131 και 132.

Π Ε Ι Ρ Α Μ Α - Σ Τ Α Θ Μ Ο Σ


είναι μια αλληλουχία αναγκαία και ικανή για τη στόχευση των πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα.

ΟαντίκτυποςΟ Smith και οι συνεργάτες του στην εργασία που δημοσίευσαν το 1984 διατύπωσαν την άποψη ότι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ του ιού SV40 «αντιπροσωπεύει μια πρότυπη μορφή παρόμοιων αλλη-

λουχιών που συναντώνται και σε άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες». Αυτά τα σήματα αλληλουχιών υπαγορεύουν τη στόχευση πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα και κατά συνέπεια έχουν βασικό ρόλο στον καθορισμό της βιοχημικής ταυτότητας του πυρήνα και στη διατήρηση της θεμελιώδους ορ-γάνωσης του ευκαρυωτικού κυττάρου σε διαμέρισμα πυρήνα και διαμέρισμα κυτταροπλάσματος. Τα σήματα πυρη-

νικού εντοπισμού είναι πλέον γνωστό ότι αναγνωρίζονται από κυτταροπλα-σματικούς υποδοχείς που μεταφέρουν τις πρωτεΐνες-υποστρώματά τους μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνι-κού εντοπισμού αποτέλεσε λοιπόν ένα βήμα προόδου καθοριστικής σημασίας για την κατανόηση της εισαγωγής πρω-τεϊνών στον πυρήνα.

θέσεις όπου συνενώνονται η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ινίδια πρωτεϊνών εκτείνονται τόσο από τον κυτταροπλα-σματικό όσο και από τον πυρηνικό δακτύλιο, σχηματίζοντας μια διακριτή καλαθοειδή δομή στην πλευρά του πυρήνα.

Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήναΚάθε λεπτό μεταφέρονται επιλεκτικά μεταξύ πυρήνα και κυτταρο-πλάσματος αρκετά εκατομμύρια μακρομόρια. Η βάση αυτής της επιλεκτικής κυκλοφορίας μορίων μέσω του πυρηνικού φακέλου

ΕΙΚΟΝΑ 9.8 Μοντέλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Το σύ-μπλοκο αποτελείται από ένα συγκρό-τημα οκτώ ακτίνων προσδεδεμένων σε δακτυλίους στην κυτταροπλασμα-τική και στην πυρηνική πλευρά του πυρηνικού φακέλου. Το συγκρότημα δακτυλίων-ακτίνων περιβάλλει έναν κεντρικό δίαυλο. Από τον κυτταρο-πλασματικό δακτύλιο εκτείνονται κυτταροπλασματικά ινίδια, ενώ από τον πυρηνικό δακτύλιο εκτείνονται ινίδια που σχηματίζουν τον πυρηνικό κάλαθο.

Κυτταρόπλασμα

Πυρήνας

Εσωτερικήπυρηνικήμεμβράνη

Εξωτερική πυρηνική μεμβράνη

Κυτταροπλα-σματικό ινίδιο

Κυτταροπλασμα-τικός δακτύλιος

Συγκρότημαδακτυλίων-ακτίνων

Πυρηνικόςκάλαθος

Πυρηνικόςδακτύλιος


Κεντρικός δίαυλος

539

Π Ε Ι Ρ Α Μ Α - Σ Τ Α Θ Μ Ο Σ

Ο ΠυρΗνΑΣ

έχει κατανοηθεί καλύτερα για πρωτεΐνες που εισάγονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Τέτοιου είδους πρωτεΐνες καλύπτουν όλες τις πτυχές της δομής και της λειτουργίας του γονιδιώματος και είναι, για παράδειγμα, ιστόνες, DNA πολυμεράσες, RNA πολυμερά-σες, μεταγραφικοί παράγοντες, παράγοντες ματίσματος και πολλές άλλες πρωτεΐνες. Η στόχευση αυτών των πρωτεϊνών στον πυρήνα γίνεται μέσω ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων που ονομάζονται σή-ματαπυρηνικούεντοπισμού (NLS, Nuclear Localization Signals), τα οποία αναγνωρίζονται από υποδοχείςπυρηνικήςμεταφοράς (nuclear transport receptors) και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου.

Το πρώτο σήμα πυρηνικού εντοπισμού που έχει χαρτογραφηθεί λεπτομερώς χαρακτηρίστηκε από τον Alan Smith και τους συνερ-γάτες του το 1984. Αυτοί οι ερευνητές μελέτησαν το αντιγόνο Τ του ιού SV40 (Simian Virus 40) των πιθήκων, μια πρωτεΐνη που κωδικο-ποιείται από το γονιδίωμα του ιού SV40 και προωθεί την έναρξη της αντιγραφής του ιικού DNA σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με αυτόν τον ιό (βλ. Κεφάλαιο 6). Όπως αναμενόταν, εφόσον πρόκειται για μια πρωτεΐνη αντιγραφής, η φυσική θέση εντόπισης του αντι-γόνου Τ βρέθηκε ότι είναι στον πυρήνα. Ωστόσο, η μεταλλαγή ενός και μόνο καταλοίπου λυσίνης βρέθηκε ότι εμποδίζει την εισαγωγή του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και οδηγεί σε συσσώρευσή του στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η παρατήρηση, σε συνδυασμό με άλλες με-λέτες που ακολούθησαν, οδήγησε στην ταυτοποίηση του σήματος πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ, το οποίο αντιστοιχεί στην αλληλουχία επτά αμινοξέων Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Αυτή η αλληλουχία βρέθηκε ότι (α) είναι αναγκαία για τη μεταφορά του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και (β) όταν ενσωματώνεται σε άλλες πρωτεΐνες που έχουν ως φυσική θέση εντόπισής τους το κυτταρό-πλασμα, είναι ικανή να τις κατευθύνει και να οδηγήσει σε συσσώ-ρευσή τους στον πυρήνα.

Σήματα πυρηνικού εντοπισμού έχουν πλέον ταυτοποιηθεί σε πολλές πρωτεΐνες. Ορισμένες από αυτές τις αλληλουχίες-σήματα, όπως είναι η αλληλουχία του αντιγόνου Τ, έχουν μικρή έκταση και είναι πλούσιες σε βασικά αμινοξέα (όπως λυσίνη και αργινίνη). Συχνά όμως τα αμινοξέα που σχηματίζουν το σήμα πυρηνικού εντοπι-σμού βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναι διαδοχικά μεταξύ τους. Για παράδειγμα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης (μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στη συγκρότη-ση της χρωματίνης) αποτελείται από δύο μέρη: ένα ζεύγος Lys-Arg και τέσσερα κατάλοιπα λυσίνης που ακολουθούν έπειτα από ένα

»» Η αντιγραφή πολλών ιών προϋποθέτει την είσοδό τους στον πυρήνα. Αφού μολύνουν το κύτταρο, οι ρετροϊοί, όπως ο ιός HIV, προβαίνουν σε αντίστροφη μεταγραφή του γονιδιωματικού τους RNA μέσα στο κυτταρόπλασμα, συνθέτοντας έναν προϊό DNA. Ο ιός HIV έχει αναπτύξει ειδικούς μηχανισμούς για τη μεταφορά του προϊικού αυτού DNA στον πυρήνα, όπου μπορεί να γίνει η μεταγραφή του.


μεσοδιάστημα δέκα αμινοξέων (Εικόνα 9.9). Τόσο η αλληλουχία Lys-Arg όσο και η αλληλουχία Lys-Lys-Lys-Lys είναι απαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Ωστόσο, τα δέκα αμινοξέα που μεσο-λαβούν ανάμεσα σε αυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατα-σταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς να επηρεαστεί ο πυρηνικός εντοπισμός. Αυτό το σήμα πυρηνικού εντοπισμού που αποτελείται από δύο ξεχωριστά στοιχεία αλληλουχίας χαρακτηρίζεται ως διπα-ραγοντικό (bipartite). Παρόμοια διπαραγοντικά μοτίβα φαίνεται ότι λειτουργούν ως σήματα εντοπισμού πολλών πυρηνικών πρωτεϊνών και είναι πιθανόν να συναντώνται συχνότερα απ’ ό,τι το συνεχές, απλούστερο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ. Αν και πολλά διπαραγοντικά σήματα πυρηνικού εντοπισμού αποτελούνται από αλληλουχίες βασικών αμινοξέων, οι οποίες συχνά ονομάζονται βασικά ή «κλασικά» σήματα πυρηνικού εντοπισμού, άλλα σήματα πυρηνικού εντοπισμού εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικής αλ-ληλουχίας και δομής. Μερικά από αυτά τα σήματα αποτελούνται από μοτίβα αλληλουχίας που απέχουν κατά πολύ στην πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης και η ενεργότητά τους εξαρτάται από την κα-νονική αναδίπλωση της πρωτεΐνης στην τριτοταγή της δομή.

Τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς που ονομάζονται ιμπορτίνες (importins),* επειδή μεταφέρουν πρωτεΐνες στο εσωτερικό του πυρήνα. Η διέ-

*Σ.τ.Ε.: Από την αγγλική λέξη «import», που σημαίνει «εισάγω».


LysArg ValPro LysLysLys

LysArgLys

Αντιγόνο Τ

Νουκλεοπλασμίνη

Lys LysLys

... ...

... ...

ΕΙΚΟΝΑ 9.9 Σήματα πυρηνικού εντοπισμού. Το σήμα πυρηνικού εντο-πισμού του αντιγόνου Τ αντιστοιχεί σε μια ενιαία αλληλουχία αμινοξέων. Αντίθετα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης είναι δι-παραγοντικό, καθώς αποτελείται από δύο αλληλουχίες, μία Lys-Arg και μία Lys-Lys-Lys-Lys, μεταξύ των οποίων μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα δέκα αμινοξέων.


λευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από μια πρωτεΐνη που ονομάζεται Ran. Πρόκειται για έναν από τους αρ-κετούς τύπους μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα των οποίων ρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Άλλα παραδείγματα μικρών πρωτεϊνών πρόσ δεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras (βλ. Εικόνα 8.38), αρκετοί από τους μετα-φραστικούς παράγοντες που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση (βλ. Εικόνα 8.13), οι πρωτεΐνες Arf και Rab (που θα συζητηθούν στο Κεφάλαιο 10), καθώς και οι πρωτεΐνες Rac, Rho και Cdc42 (που θα συζητηθούν στο Κεφάλαιο 15). Όσον αφορά την πρωτεΐνη Ran, τα ένζυμα που ενεργοποιούν την υδρόλυση του GTP προς GDP εντο-πίζονται στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέ-λου, ενώ τα ένζυμα που ενεργοποιούν την ανταλλαγή GDP με GTP εντοπίζονται στην πυρηνική πλευρά (Εικόνα 9.10). Κατά συνέπεια, δεν υπάρχει ισόποση κατανομή των Ran/GTP από τις δύο πλευ-ρές του πυρηνικού πόρου. Στο εσωτερικό του πυρήνα διατηρείται υψηλότερη συγκέντρωση μορίων Ran/GTP, η οποία καθορίζει την κατεύθυνση της πυρηνικής μεταφοράς των πρωτεϊνών-φορτίων που αναγνωρίζουν οι ιμπορτίνες.

Η πρωτεΐνη Ran ρυθμίζει τη διέλευση πρωτεϊνών από τον πυρη-νικό πόρο ελέγχοντας την ενεργότητα των υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς. Η εισαγωγή πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυ-ρηνικού πόρου ξεκινά όταν μια συγκεκριμένη ιμπορτίνη προσδεθεί στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού μιας προς μεταφορά πρωτεΐνης Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASMFigure# 09.10 DMG# 090212/10/08Dragonfly Media Group

P i

Πυρήνας


Ran GAPRan

Ran GEF

GDP

GDP

GDP

ΕΙΚΟΝΑ 9.10 Κατανομή της Ran/ GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου. Η άνιση κα-τανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέ-λου διατηρείται χάρη στον εντοπι-σμό της πρωτεΐνης ενεργοποίησης της GTPάσης Ran (Ran GAP, Ran GTPase-Αctivating Protein) στο κυτταρόπλασμα και του παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουα-νίνης Ran (Ran GEF, Ran Guanine nucleotide Exchange Factor) στον πυρήνα. Στο κυτταρόπλασμα, η Ran GAΡ (η οποία προσδένεται στα κυτ-ταροπλασματικά ινίδια του συμπλό-κου του πυρηνικού πόρου) ενεργο-ποιεί την υδρόλυση του GTP που είναι προσδεδεμένο στη Ran, οδηγώντας σε μετατροπή της Ran/GTP σε Ran/GDP. Στον πυρήνα, η Ran GEF ενερ-γοποιεί την ανταλλαγή του GDP που είναι προσδεδεμένο στη Ran με GTP, οδηγώντας σε μετατροπή του Ran/GDP σε Ran/GTP. Κατά συνέπεια, το εσωτερικό του πυρήνα διατηρεί μια υψηλή συγκέντρωση Ran/GTP.


στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 9.11). Κατόπιν, αυτό το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου προσδένεται σε πρωτεΐνες των κυτταροπλα-σματικών ινιδίων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και η μετα-φορά προχωρεί με διαδοχική πρόσδεση σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου οι οποίες βρίσκονται όλο και πλησιέστερα στην πυρηνική πλευρά του συμπλόκου του πόρου. Ιδιαίτερα σημαντικές για τη διεργασία αυτή είναι ορισμένες πρωτεΐνες (νουκλεοπορίνες) που επενδύουν τον κεντρικό δίαυλο του πόρου, οι οποίες φέρουν πολλαπλές επαναλήψεις Phe-Gly και ονομάζονται πρωτεΐνες FG. Ακολούθως, στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύμπλοκο ιμπορ-τίνης/φορτίου διίσταται καθώς προσδένεται σε αυτό η Ran/GTP. Η πρόσδεση αυτή προκαλεί μια αλλαγή στη διαμόρφωση της ιμπορ-τίνης, η οποία εκτοπίζει από το σύμπλοκο την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα.

Στη συνέχεια, το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξάγεται από τον πυρήνα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και επιστρέφει Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASMFigure# 09.11 DMG# 090312/10/08Dragonfly Media Group

Πυρήνας


Ran

Ran

GDP

Πρωτεΐνη-φορτίο

NLS

Ran GAP

Ιμπορτίνη

P i

ΕΙΚΟΝΑ 9.11 Μεταφορά πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η μεταφορά μιας πρωτεΐνης μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου ξεκινά με την αναγνώριση της αλληλουχίας πυρη-νικού εντοπισμού της (NLS, Nuclear Localization Sequence) από έναν υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς (ιμπορτίνη). Το σύμπλοκο της πρω-τεΐνης-φορτίου με την ιμπορτίνη προσδένεται σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου στα κυττα-ροπλασματικά ινίδια. Στη συνέχεια, μεταφέρεται μέσω του πυρηνικού πόρου, καθώς προσδένεται διαδοχι-κά σε πρωτεΐνες που βρίσκονται όλο και βαθύτερα στο εσωτερικό του. Στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύ-μπλοκο φορτίου/ιμπορτίνης διασπά-ται λόγω της πρόσδεσης Ran/GTP στην ιμπορτίνη. Η αλλαγή διαμόρ-φωσης της ιμπορτίνης εκτοπίζει την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθε-ρώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. Το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξά-γεται και πάλι από τον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου και η πρωτεΐνη ενεργοποίησης της GTPάσης (Ran GAP) υδρολύει το GTP, που φέρει η Ran, προς GDP, προκαλώντας απε-λευθέρωση της ιμπορτίνης στο κυτ-ταρόπλασμα.


στο κυτταρόπλασμα, όπου το GTP υδρολύεται σε GDP. Με αυτόν τον τρόπο αποδεσμεύεται η ιμπορτίνη, η οποία μπορεί πλέον να προσδεθεί σε μια νέα πρωτεΐνη-φορτίο στο κυτταρόπλασμα και να συμμετάσχει σε έναν νέο κύκλο πυρηνικής μεταφοράς. Η Ran/GDP που παράγεται στο κυτταρόπλασμα μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα μέσω του δικού της μεταφορέα (που ονομάζεται NTF2), όπου και αναγεννάται η Ran/GTP.

Μερικές πρωτεΐνες παραμένουν στο εσωτερικό του πυρήνα μετά την εισαγωγή τους από το κυτταρόπλασμα, πολλές άλλες όμως παλινδρομούν συνεχώς μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες λειτουργούν ως φορείς για τη με-ταφορά άλλων μορίων, όπως μορίων RNA, ενώ άλλες συντονίζουν διάφορες λειτουργίες του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος (για παράδειγμα, ρυθμίζουν τις ενεργότητες μεταγραφικών παραγό-ντων). Η εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, οι οποίες ονομάζονται σήματαπυ-ρηνικήςεξαγωγής (nuclear export signals). Τα σήματα πυρηνικής εξαγωγής, όπως και τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού, αναγνωρίζο-νται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οι υποδοχείς των σημάτων πυρηνικής εξαγωγής, που ονομάζονται εξπορτίνες (exportins), βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Πολλές από τις εξπορτίνες, όπως και οι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς οι οποίοι είναι γνωστοί με το όνομα καρυοφερίνες (karyopherins – Πίνακας 9.1).

Οι εξπορτίνες προσδένονται στην πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη που απαιτείται τόσο για την εισαγωγή όσο και για την εξαγωγή από τον πυρήνα (Εικόνα 9.12). Ωστόσο, ενώ η πρόσδεση της Ran/GTP στις ιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλόκων μεταξύ των ιμπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, η πρόσδεσή της στις εξπορτίνες συμβάλλει στον σχηματισμό σταθερών συμπλόκων μεταξύ των εξπορτινών και των αντίστοιχων πρωτεϊνών-φορτίων. Κατά συνέπεια, η πρόσδεση της Ran/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών που περιέχουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνα σχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, στα οποία συμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP. Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλόκων στην κυτταρο-πλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, η υδρόλυση του GTP και η αποδέσμευση της Ran/GDP οδηγούν σε αποδέσμευση της

9.1 ANIMATION

Εισαγωγήκαιεξαγωγήπρωτεϊνώνμέσωτουσυμπλόκουτουπυρηνι-κούπόρου.Οι πρωτεΐνες στοχεύονται για εισαγωγή στον πυρήνα ή για εξαγω-γή από αυτόν μέσω σημάτων πυρηνι-κού εντοπισμού ή σημάτων πυρηνικής εξαγωγής αντίστοιχα. Αυτά τα σήματα

επιτρέπουν αναγνώριση των πρωτεϊ-νών από υποδοχείς οι οποίοι κατευ-

θύνουν τη μεταφορά των πρωτε-ϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου.


πρωτεΐνης-φορτίου, η οποία απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμο-ποιηθούν εκ νέου. Ο μηχανισμός ιμπορτίνης-εξπορτίνης-Ran/GTP λειτουργεί επίσης στα ανώτερα φυτά, αν και στην περίπτωση αυτή δεν έχει κατανοηθεί πλήρως.

Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήναΗ μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα είναι ένα ακόμη επίπεδο στο οποίο μπορούν να ελεγχθούν οι ενεργότητες των πυρηνικών πρω-τεϊνών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες, για παράδειγμα, είναι λειτουρ-γικοί μόνο όταν βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατά συνέπεια η ρύθμιση της εισαγωγής και της εξαγωγής των πρωτεϊνών αυτών προς και από τον πυρήνα συνιστά έναν νέο τρόπο ελέγχου της γο-νιδιακής έκφρασης. Όπως θα συζητηθεί στο Κεφάλαιο 15, η ρυθ-

ΠΙΝΑΚΑΣ 9.1 Καρυοφερίνες με γνωστά υποστρώματα

Καρυοφερίνη Υποστρώματα

Εισαγωγή Διμερές Kapα/Kapβ1 Πρωτεΐνες με σήμα πυρηνικού εντοπισμού

που περιέχει βασικά αμινοξέα (π.χ. νουκλεοπλασμίνη)

Snurportin/Kapβ1 snRNP (U1, U2, U4, U5) Ελεύθερη Kapβ1 Σύμπλοκα Cdk/κυκλίνης Kapβ2 (τρανσπορτίνη) Πρωτεΐνες πρόσδεσης mRNA,

πρωτεΐνες ριβοσώματος Διμερές ιμπορτίνης 7/Kapβ1 Ιστόνη Η1, πρωτεΐνες ριβοσώματοςΕξαγωγή Crm1 Πρωτεΐνες με σήμα πυρηνικής εξαγωγής

πλούσιο σε κατάλοιπα λευκίνης, snurportin, snRNA

CAS Kapα Εξπορτίνη t tRNA Εξπορτίνη 4 Παράγοντας επιμήκυνσης 5Α


Ran GAP

Πυρήνας


Εξπορτίνη

Εξπορτίνη

Ran


Σήμα πυρηνικήςεξαγωγής (NES)

+P i

GDP


ΕΙΚΟΝΑ 9.12 Εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα. Στον πυρήνα σχηματίζονται σύμπλοκα μεταξύ πρωτεϊνών-φορτίων που φέρουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES, Nuclear Export Signals), εξπορτινών και Ran/GTP. Μετά τη διέλευση από το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, η Ran GAP ενεργοποιεί την υδρόλυση του προσδεδεμένου GTP, οδηγώντας σε σχηματισμό Ran/GDP και απελευθέρωση της πρωτεΐνης-φορτίου και της εξπορτίνης στο κυτταρόπλασμα.


μιζόμενη εισαγωγή στον πυρήνα τόσο μεταγραφικών παραγόντων όσο και πρωτεϊνικών κινασών έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής συμπεριφοράς, καθώς παρέχει έναν μηχανισμό μέσω του οποίου σήματα που λαμβάνονται στην επιφάνεια του κυττάρου μπορούν να μεταδοθούν στον πυρήνα. Η σημασία της ρυθμιζόμενης εισαγωγής στον πυρήνα αποδεικνύεται από το ότι η αλλαγή στη συγ-γένεια της αλληλεπίδρασης δύο μόλις πρωτεϊνών του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου προς τον υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς έχει συμβάλει στoν εξελικτικό διαχωρισμό των ειδών Drosophila melanogaster και Drosophila simulans.

Σε έναν συγκεκριμένο μηχανισμό ρύθμισης, οι μεταγραφικοί πα-ράγοντες (ή άλλες πρωτεΐνες) συνδέονται με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που καλύπτουν τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού τους και οδηγούν σε παραμονή των παραγόντων αυτών στο κυτταρό-πλασμα, εφόσον τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ο μεταγρα-φικός παράγοντας NF-κΒ, ο οποίος ενεργοποιείται σε κύτταρα των θηλαστικών από πολλά διαφορετικά εξωκυτταρικά σήματα (Εικόνα 9.13). Στο κυτταρόπλασμα μη διεγερμένων κυττάρων, ο NF-κΒ σχη-ματίζει ένα ανενεργό σύμπλοκο με μια πρωτεΐνη-αναστολέα (την ΙκΒ). Η πρόσδεση της ΙκΒ καλύπτει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του NF-κΒ, εμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα. Σε διεγερ-μένα κύτταρα, η πρωτεΐνη ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείται πρωτεολυτικά μέσω της ουβικιτίνης (βλ. Εικόνα 8.43), επιτρέποντας στον NF-κΒ να εισέλθει στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει τη μετα-γραφή των γονιδίων-στόχων του.


Ιμπορτίνη

Φωσφορυλίωση καιπρωτεόλυση της IκB

Πυρήνας


Αποφωσφορυλίωση

Ιμπορτίνη

IκB Pho4NF-κB

NLSNLSP

ΕΙΚΟΝΑ 9.13 Ρύθμιση της εισαγωγής μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παρά-γοντας NF-κΒ διατηρείται στο κυττα-ρόπλασμα υπό μορφή ανενεργού συ-μπλόκου με την πρωτεΐνη ΙκΒ, η οποία καλύπτει την αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του (NLS). Όταν δεχτεί τα κατάλληλα εξωκυτταρικά σήματα, η ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικο-δομείται μέσω πρωτεόλυσης, επιτρέ-ποντας την εισαγωγή του NF-κΒ στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα διατηρείται στο κυτταρόπλασμα λόγω της φω-σφορυλίωσης ενός καταλοίπου σερί-νης που βρίσκεται κοντά στην αλλη-λουχία πυρηνικού εντοπισμού του. Η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση του καταλοίπου αυτού οδηγεί σε έκθεση του NLS και επιτρέπει μεταφορά του Pho4 στον πυρήνα.


Η εισαγωγή άλλων μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα ρυθμίζεται άμεσα μέσω της φωσφορυλίωσής τους και όχι μέσω σύν-δεσης με πρωτεΐνες-αναστολείς (βλ. Εικόνα 9.13). Για παράδειγμα, ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα φωσφορυλι-ώνεται σε ένα κατάλοιπο σερίνης που βρίσκεται δίπλα στο σήμα πυ-ρηνικού εντοπισμού του. Η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή προκαλεί αναστολή του παράγοντα Pho4, γιατί παρεμποδίζει την εισαγωγή του στον πυρήνα. υπό κατάλληλες συνθήκες, όμως, η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση αυτής της θέσης επιτρέπει τη μετατόπιση του παράγοντα Pho4 στον πυρήνα και την ενεργοποίησή του.

Μεταφορά των μορίων RNAΕνώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρό-πλασμα στον πυρήνα, τα περισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mRNA, rRNA, tRNA και miRNA αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η εξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και η εισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διερ-γασία η οποία απαιτεί αλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου. Ιμπορτίνες και εξπορτίνες της οικογένειας των καρυοφερινών (βλ. Πίνακα 9.1) είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά των περισσότερων μορίων tRNA, rRNA, miRNA και μικρών πυρηνικών RNA μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από Ran/GDP. Ωστόσο, τα μόρια mRNA εξάγονται από τον πυρήνα μέσω ενός συμπλόκου δύο πρωτεϊνών (γνωστού με το όνομα «εξαγωγέας mRNA»), από τις οποίες η μία εμφανίζει συγγένεια με τον μεταφορέα της Ran/GDP, δηλαδή τον NTF2. Αυτός ο μηχανισμός μεταφοράς των μορίων mRNA φαίνεται να είναι ανεξάρτητος της πρωτεΐνης Ran.

Τα RNA μεταφέρονται μέσω του πυρηνικού φακέλου υπό μορ-φή συμπλόκων ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNP, Ribonucleoprotein complexes – Εικόνα 9.14). Τα ριβοσωμικά RNA συνδέονται αρχι-κά τόσο με ριβοσωμικές πρωτεΐνες όσο και με ειδικές πρωτεΐνες επεξεργασίας RNA μέσα στον πυρηνίσκο, δημιουργώντας τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες 60S και 40S. Οι υπομονάδες αυτές στη συνέχεια μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα (βλ. Εικόνα 9.31) μέσω ενός μηχανισμού στον οποίο συμμετέχει η καρυοφερίνη Crm1. Η εξαγωγή τους από τον πυρήνα επιτυγχάνεται μέσω της αναγνώρισης σημάτων πυρηνικής εξαγωγής που περιέχονται σε πρωτεΐνες του συμπλόκου κάθε ριβοσωμικής υπομονάδας. Τα μόρια pre-mRNA


και mRNA συνδέονται με ένα σύνολο τουλάχιστον 20 πρωτεϊνών κατά την επεξεργασία τους στον πυρήνα έως και τη μεταφορά τους στο κυτταρόπλασμα. Η μεταφορά αυτή επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου του εξαγωγέα mRNA, το οποίο στρατολογείται στο επεξεργασμένο mRNA. Τα μόρια tRNA και πρόδρομες μορφές των μορίων miRNA εξάγονται από τον πυρήνα άμεσα συνδεδεμένα με την εξπορτίνη t και την εξπορτίνη 5, που είναι οι αντίστοιχοι μετα-φορείς τους.

Σε αντιδιαστολή με τα μόρια mRNA, tRNA και rRNA, που ασκούν τη λειτουργία τους στο κυτταρόπλασμα, πολλά μικρά μόρια RNA (snRNA και snοRNA) λειτουργούν μέσα στον πυρήνα ως συστατι-κά του μηχανισμού επεξεργασίας RNA. Τα snRNA μεταφέρονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνες για να σχηματίσουν λειτουργικά snRNP και στη συνέχεια επαναφέρονται στον πυρήνα (Εικόνα 9.15). Στην εξαγωγή των μο-ρίων snRNA στο κυτταρόπλασμα συμμετέχουν η πρωτεΐνη Crm1 και άλλοι υποδοχείς μεταφοράς που προσδένονται στις 5΄ καλύπτρες 7-μεθυλογουανοσίνης των snRNA, ενώ για τη μεταφορά των snRNρ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ευθύνονται αλληλουχίες που φέρουν οι πρωτεΐνες snRNρ.

9.2 Eσωτερική οργάνωση του πυρήναΟ πυρήνας δεν είναι απλώς ένας σάκος όπου χρωματίνη, μόρια RNA και πυρηνικές πρωτεΐνες κινούνται ελεύθερα σε ένα υδατικό διάλυμα. Αντίθετα, ο πυρήνας διαθέτει μια εσωτερική δομή που εξασφαλίζει την οργάνωση του γενετικού υλικού και τον καταμε-ρισμό των πυρηνικών λειτουργιών. Στα ζωικά κύτταρα, ένα χαλα-ρά οργανωμένο πλέγμα πυρηνικών λαμινών εκτείνεται από την

(Β)(Α)

0,1 μm


(Γ) (Δ)

ΕΙΚΟΝΑ 9.14 Μεταφορά ενός συμπλόκου ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Τα κύτταρα των σιελογόνων αδένων των εντόμων παράγουν ευμεγέθη σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNΡ), τα οποία περιέχουν 35-40 kb RNA και έχουν συνολική μάζα περί-που 30 εκατομμύρια Da. Σε αυτή τη σειρά φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου παρουσιάζονται (Α) η πρόσδεση ενός τέτοιου RNΡ σε ένα σύμπλοκο πυρηνικού πόρου και (Β-Δ) η αποδίπλωση του RNA κατά τη μετα-φορά του στο κυτταρόπλασμα. (Από τη δημοσίευση των H. Mehlin et al., 1992. Cell 69: 605.)


πυρηνική λάμινα ως το εσωτερικό του πυρήνα. Αυτές οι λαμίνες χρησιμεύουν ως θέσεις πρόσδεσης της χρωματίνης και οργανώ-νουν άλλες πρωτεΐνες σε δομές λειτουργικών πυρηνικών σωματίων. Μέσα στον πυρήνα, η χρωματίνη είναι οργανωμένη σε μεγάλους βρόχους DNA, συγκεκριμένες περιοχές των οποίων προσδένονται στο στρώμα των λαμινών μέσω πρωτεϊνών πρόσδεσης λαμινών που βρίσκονται στη χρωματίνη. Πολλές ακόμη πυρηνικές πρωτεΐ-νες σχηματίζουν σύμπλοκα εξαρτώμενα από λαμίνες, τα οποία με τη σειρά τους σχηματίζουν πυρηνικά σωμάτια που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση του DNA, στην οργάνωση της χρωματίνης, στη γονιδιακή ρύθμιση και στη μεταγωγή σήματος. Θεωρείται ότι αυτός ο ρόλος της πυρηνικής λάμινας και των λαμινών στον καταμερισμό των λειτουργιών της επιδιόρθωσης του DNA και της μεταγραφής γονιδίων αποτελεί τη βάση πολλών διαφορετικών γενετικών ασθε-νειών που σχετίζονται με τις λαμίνες.

Χρωμοσώματα και υψηλότερη οργάνωση δομής της χρωματίνηςΗ χρωματίνη συμπυκνώνεται σε υψηλό βαθμό κατά τη μίτωση, σχηματίζοντας τα συμπαγή μεταφασικά χρωμοσώματα που κα-τανέμονται στους θυγατρικούς πυρήνες (βλ. Εικόνα 5.15). Κατά τη μεσόφαση, μέρος της χρωματίνης, η λεγόμενη ετεροχρωμα-τίνη (heterochromatin), παραμένει ιδιαίτερα συμπυκνωμένο και μεταγραφικά ανενεργό. Η υπόλοιπη χρωματίνη ή ευχρωματίνη (euchromatin) είναι αποσυμπυκνωμένη και κατανέμεται σε ολό-κληρο τον πυρήνα (Εικόνα 9.16). Τα κύτταρα περιέχουν δύο τύ-πους ετεροχρωματίνης: την ιδιοστατική ετεροχρωματίνη, η οποία

ΕΙΚΟΝΑ 9.15 Μεταφορά των snRNA μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Τα μικρά πυρηνικά RNA (snRNA) εξάγονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μέσω μιας εξπορτίνης (Crm1) που αναγνωρίζει την καλύπτρα 7-μεθυλο-γουανοσίνης του 5΄ άκρου. Στο κυτ-ταρόπλασμα, τα snRNA συνδέονται με πρωτεΐνες και σχηματίζουν snRNP, τα οποία στη συνέχεια μεταφέρονται και πάλι στον πυρήνα.

»» Τα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα περιέχουν δύο τύπους πυ ρή νων: έναν πολυπλοειδή μακροπυρήνα που περιέχει μεταγραφικώς ενεργά γονίδια και έναν ή περισσότερους διπλοειδείς, μεταγραφικώς ανενεργούς μικροπυρήνες που συμμετέχουν στη φυλετική αναπαραγωγή.


Πυρήνας


Δέσμευσηπρωτεΐνης

snRNA

snRNA

Crm1

5’ καλύπτρα m7G

snRNP

snRNP


περιέχει αλληλουχίες DNA που γενικά δε μεταγράφονται, όπως είναι οι δορυφορικές αλληλουχίες που υπάρχουν στα κεντρομερή, και τη δυνητική ετεροχρωματίνη, η οποία περιέχει αλληλουχίες που δε μεταγράφονται στο υπό εξέταση κύτταρο αλλά μεταγράφονται σε άλλους τύπους κυττάρων. Κατά συνέπεια, η ποσότητα της δυνητικής ετεροχρωματίνης ποικίλλει ανάλογα με τη μεταγραφική ενεργότητα του κυττάρου.

Αν και η μεσοφασική χρωματίνη φαίνεται να είναι ομοιόμορ-φα κατανεμημένη, στην πραγματικότητα τα χρωμοσώματα είναι διατεταγμένα με οργανωμένο τρόπο και χωρίζονται σε διακριτές λειτουργικές επικράτειες που έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Τη μη τυχαία κατανομή της χρωματίνης στον μεσοφασικό πυρήνα εισηγήθηκε για πρώτη φορά το 1885 ο Carl Rabl, ο οποίος διατύπωσε την πρόταση ότι κάθε χρωμόσωμα καταλαμβάνει μια διακριτή επικράτεια, με τα κεντρομερή και τα τελομερή να προσδένονται σε αντίθετες πλευρές του πυρηνικού φακέλου (Εικόνα 9.17). Αυτό το βασικό μοντέλο οργάνωσης της χρωματίνης επιβεβαιώθηκε σχεδόν εκατό χρόνια αργότερα (το

1 μm


ΕΙΚΟΝΑ 9.16 Ετεροχρωματίνη σε μεσοφασικούς πυρήνες. Η ευχρω-ματίνη είναι κατανεμημένη σε ολόκληρο τον πυρήνα. Η ετεροχρωματίνη υποδεικνύεται με τρίγωνα και ο πυρηνίσκος με βέλος. (Ευγενική προσφορά των Ada L. Olins και Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.)


1984) με λεπτομερείς μελέτες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων της Drosophila. Όπως διαπιστώθηκε, τα χρωμοσώματα δεν τυλίγονται τυχαία το ένα γύρω από το άλλο, αλλά κάθε χρωμόσωμα καταλαμβάνει μια διακριτή περιοχή του πυρήνα (Εικόνα 9.18). Τα χρωμοσώματα συνδέονται στενά με τον πυρηνικό φάκελο σε πολλές θέσεις. Πολλές από αυτές τις συνδέσεις οδηγούν σε καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, κάποιες άλλες όμως, όπως οι συνδέσεις με τα σύμπλοκα του πυρηνικού πόρου, προάγουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων.

Μεμονωμένα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές επικρά-τειες στους πυρήνες των κυττάρων θηλαστικών (Εικόνα 9.19). Τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εντοπίζονται στην περιφέρεια αυτών των επικρατειών, δίπλα σε «διαύλους» που χωρίζουν τα χρω-μοσώματα μεταξύ τους. Θεωρείται ότι τα νεοσυντιθέμενα μόρια RNA απελευθερώνονται μέσα σε αυτούς τους «διαύλους» και εκεί λαμβάνει χώρα η επεξεργασία του RNA. Μεγάλο μέρος της ετερο-χρωματίνης εντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα, καθώς πρω-τεΐνες που συνδέονται με την ετεροχρωματίνη προσδένονται στο πλέγμα της πυρηνικής λάμινας. Εφόσον διαφορετικοί τύποι κυττά-ρων εκφράζουν διαφορετικά γονίδια, η δυνητική ετεροχρωματίνη,

(B)(A)


ΕΙΚΟΝΑ 9.17 Οργάνωση των χρω μοσωμάτων. Αναπαραγωγή χειρό-γραφων σχεδίων χρωμοσωμάτων σε κύτταρα σαλαμάνδρας. (Α) Πλήρη χρωμοσώματα. (Β) Μόνο τα τελομε-ρή (που εντοπίζονται στην πυρηνι-κή μεμβράνη). (Από τη δημοσίευση του C. Rabl, 1885. Morphologisches Jahrbuch 10: 214.)

(A)

Κεντρομερή

Τελομερή

(B)

Cooper Cell Biology, Sinauer/ASMFigure 9.18 #302A

ΕΙΚΟΝΑ 9.18 Οργάνωση των χρωμοσωμάτων της Drosophila. (Α) Μο-ντέλο του πυρήνα, στο οποίο παρουσιάζονται με διαφορετικά χρώματα οι βραχίονες των πέντε χρωμοσωμάτων. Υποδεικνύονται oι θέσεις των τε-λομερών και των κεντρομερών. (Β) Παρουσιάζονται οι δύο βραχίονες του χρωμοσώματος 3, προκειμένου να φανεί ο τοπολογικός διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων. (Από τη δημοσίευση των D. Matdog et al., 1984. Nature 308: 414.)


καθώς και οι περιοχές των χρωμοσωμάτων που αλληλεπιδρούν με την πυρηνική λάμινα διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών κυττάρων και ιστών. Σε μερικά κύτταρα, τα κεντρομερή και τα τελομερή είναι συ-γκεντρωμένα σε αντίθετους πόλους, ενώ σε άλλα κύτταρα τα χρω-μοσώματα διατάσσονται ακτινωτά. Οι θέσεις των χρωμοσωμάτων μέσα στον πυρήνα διαφέρουν επίσης ανάλογα με τον οργανισμό και τον τύπο του ιστού. Εξάλλου, η χρωματίνη στο εσωτερικό του πυρήνα αναδιοργανώνεται κατά την κυτταρική διαφοροποίηση και σε συντονισμό με αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Αν και αυτή η δυναμική αναδιοργάνωση της χρωματίνης είναι πολύπλοκη και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, είναι γνωστό ότι βασίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην ακτίνη και στη μυοσίνη του πυρήνα – πρωτεΐνες που χαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά στον κυτταροσκελετό (βλ. Κεφάλαιο 12).

Όπως και το DNA στα μεταφασικά χρωμοσώματα (βλ. Εικόνα 5.16), η χρωματίνη των μεσοφασικών πυρήνων είναι οργανωμένη σε περιοχές βρόχων που περιέχουν περίπου 50-100 kb DNA. Ένα καλό παράδειγμα αυτής της οργάνωσης είναι τα εντόνως μεταγραφόμενα χρωμοσώματα των ωοκυττάρων των αμφιβίων, όπου οι ενεργώς μεταγραφόμενες περιοχές DNA είναι ορατές στο μικροσκόπιο ως μεγάλοι βρόχοι αποδιπλωμένης χρωματίνης (Εικόνα 9.20). Αυτές οι περιοχές φαίνεται ότι αντιστοιχούν σε διακριτές λειτουργικές μονάδες, οι οποίες ρυθμίζουν ανεξάρτητα τη γονιδιακή έκφραση (βλ. Κεφάλαιο 7).

Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήναΗ εσωτερική οργάνωση του πυρήνα καταδεικνύεται περαιτέρω από τον καταμερισμό των περισσότερων πυρηνικών διεργασιών σε συγκεκριμένες, διακριτές περιοχές του πυρήνα. Πολλά σημα-

(A)

(B)


Επικράτειεςχρωμοσωμάτων

Διαχρωμοσω-μική περιοχή

Πυρηνικόςφάκελος

Αντίγραφα του χρωμοσώματος 4

ΕΙΚΟΝΑ 9.19 Οργάνωση των χρωμοσωμάτων στον πυρήνα των θηλαστικών. (Α) Ανιχνευτές επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών του χρωμο-σώματος 4 χρησιμοποιήθηκαν για πείραμα υβριδισμού σε ένα ανθρώπινο κύτταρο. Τα δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος 4, το οποίο ταυτοποιείται με τον φθορισμό κίτρινου χρώματος, καταλαμβάνουν διακριτές επικράτει-ες μέσα στον πυρήνα. (Β) Μοντέλο οργάνωσης των χρωμοσωμάτων. Τα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους με διαχρωμοσωμικές περιοχές, όπου θεωρείται ότι λαμβάνουν χώρα η επεξεργασία και η μεταφορά του RNA. (Α, ευγενική προσφορά του Thomas Cremer, Ludwig Maximilians University, από τη δημοσίευση των A. I. Lamond και W. C. Earnshaw, 1999, Science 280: 547.)


ντικά ένζυμα και πρωτεΐνες του πυρήνα εντοπίζονται σε διακριτά υποπυρηνικά σωμάτια με σπογγοειδή δομή χαμηλής πυκνότητας, η οποία επιτρέπει την είσοδο και έξοδο μακρομορίων από τις υπόλοι-πες περιοχές του πυρήνα. Για ορισμένες από αυτές τις δομές έχουν προσδιοριστεί σήματα στόχευσης ή συγκράτησης, τα οποία όμως δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμη. Η φύση και η λειτουργία αυτών των διακριτών πυρηνικών δομών παραμένει ασαφής και η κατα-νόηση της ενδοπυρηνικής οργάνωσης συγκεκριμένων βιοχημικών διαδικασιών αποτελεί ένα πεδίο της κυτταρικής βιολογίας που δεν έχει ερευνηθεί πλήρως.

Οι πυρήνες των κυττάρων των θηλαστικών περιέχουν ομαδοποι-ημένες θέσεις (εστίες) αντιγραφής DNA στις οποίες λαμβάνει χώρα η αντιγραφή πολλαπλών μορίων DNA. Αυτές οι διακριτές θέσεις αντιγραφής του DNA προσδιορίστηκαν με πειράματα απεικόνισης του νεοσυντιθέμενου DNA στο εσωτερικό των πυρήνων έπειτα από σήμανση των κυττάρων με βρομοδεοξυουριδίνη, ένα ανάλογο θυ-μιδίνης που ενσωματώνεται στο DNA και μπορεί να ανιχνευθεί μέσω χρώσης με φθορίζοντα αντισώματα (Εικόνα 9.21). Κατά την έναρξη της σύνθεσης DNA, το DNA που μόλις είχε αντιγραφεί ανιχνεύθη-κε σε 20 περίπου εστίες που ήταν συγκεντρωμένες γύρω από τον πυρηνίσκο και συνδεδεμένες με πυρηνικές λαμίνες. Στη συνέχεια,

0,1 mm


ΕΙΚΟΝΑ 9.20 Φωτογραφία φωτονικού μικροσκοπίου που δείχνει ένα χρωμόσωμα ωοκυττάρου αμφιβίου. Φαίνονται οι αποσυμπυκνωμένοι βρόχοι ενεργώς μεταγραφόμενης χρωματίνης που εκτείνονται από έναν άξονα μη μεταγραφόμενης χρωματίνης υψηλής συμπύκνωσης. (Ευγενική προσφορά του Joseph Gall, Carnegie Institute.)


η διαδικασία της σύνθεσης του DNA επεκτάθηκε σε εκατοντάδες εστίες διάσπαρτες σε ολόκληρο τον πυρήνα. Εφόσον σε ένα δι-πλοειδές κύτταρο θηλαστικού μπορούν να είναι ενεργές ανά πάσα στιγμή περίπου 4.000 θέσεις έναρξης της αντιγραφής, καθεμία από αυτές τις εστίες αντιγραφής θα πρέπει να περιέχει πολλαπλές διχά-λες αντιγραφής του DNA. Φαίνεται επομένως ότι η αντιγραφή του DNA λαμβάνει χώρα σε μεγάλες δομές που περιέχουν πολυάριθμα σύμπλοκα αντιγραφής οργανωμένα σε διακριτά λειτουργικά σω-μάτια. Τα σωμάτια αυτά έχουν ονομαστεί εργοστάσια αντιγραφής.

Ενώ τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εμφανίζονται κατανεμη-μένα σε ολόκληρο τον πυρήνα, τα συστατικά της συσκευής ματίσμα-τος του mRNA είναι συγκεντρωμένα σε διακριτά πυρηνικά σωμάτια, που είναι γνωστά ως πυρηνικά στίγματα (nuclear speckles). Χρώσεις ανοσοφθορισμού όπου χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα που ανα-γνωρίζουν snRNP και παράγοντες ματίσματος έδειξαν ότι τα συστα-τικά της συσκευής ματίσματος RNA συγκεντρώνονται αποκλειστικά σε αυτές τις 20 έως 50 διακριτές δομές πυρηνικών στιγμάτων και δεν κατανέμονται ομοιόμορφα σε ολόκληρο τον πυρήνα (Εικόνα 9.22). Θεωρείται ότι τα πυρηνικά στίγματα είναι θέσεις αποθήκευ-σης συστατικών της συσκευής ματίσματος, τα οποία στη συνέχεια

Cooper Cell Biology, Sinauer/ASMFigure 9.21

(Α) (Β)

ΕΙΚΟΝΑ 9.21 Ομαδοποιημένες θέσεις αντιγραφής του DNA. DNA που έχει μόλις αντιγραφεί σημάνθηκε με σύντομη έκθεση των κυττάρων σε βρομοδεοξυουριδίνη, η οποία ενσωματώνεται στο DNA στη θέση της θυμιδίνης. Αυτή η αντικατάσταση επιτρέπει την ανίχνευση του νεοσυντιθέ-μενου DNA μέσω ανοσοφθορισμού μετά από χρώση με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τη βρομοδεοξυουριδίνη. Παρατηρήστε ότι το νεοσυντιθέμενο DNA συναντάται σε διακριτές εστίες που κατανέμονται σε ολόκληρο τον πυρήνα. Οι δύο φωτογραφίες δείχνουν την κατανομή στην αρχή και στο τέλος της σύνθεσης του DNA αντίστοιχα. (Από τη δημοσίευση των B. K. Kennedy et al., 2000. Genes Dev. 14: 2855.)


στρατολογούνται σε ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια κατά την επεξεργασία του pre-mRNA.

Οι πυρήνες περιέχουν επίσης αρκετούς άλλους τύπους διακριτών δομών. Εκτός από τους πυρηνίσκους (που θα συζητηθούν παρακά-τω), μεταξύ των δομών αυτών περιλαμβάνονται τα σωμάτια PML και τα σωμάτια Cajal. Τα σωμάτια PML (5-20 σε έναν τυπικό πυρήνα) ταυ-τοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως διακριτές θέσεις εντοπισμού μιας πρωτεΐνης ρύθμισης της μεταγραφής που συνδέεται με την οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML, Promyelocytic Leukemia). Τα σωμάτια PML είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη (Εικόνα 9.23) και αποτελούν θέσεις συσσώρευσης μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών τροποποίησης της χρωματίνης (όπως είναι οι απακετυλάσες των ιστονών), οι οποίες ενδέχεται να στοχεύ-ονται στα σωμάτια PML από το μικρό πολυπεπτίδιο SUMO (όπως συζητήθηκε στο Κεφάλαιο 8). Ωστόσο, η λειτουργία των σωματίων PML παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τα σωμάτια Cajal (Εικό-να 9.24) περιέχουν τη χαρακτηριστική πρωτεΐνη κοϊλίνη (coilin) και πλήθος μικρών RNP. Τα σωμάτια αυτά θεωρείται ότι λειτουργούν ως θέσεις συναρμολόγησης και επεξεργασίας των RNP.

9.3 Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNAΤο εμφανέστερο από τα πυρηνικά σωμάτια είναι ο πυρηνίσκος (βλ. Εικόνα 9.1), ο οποίος αποτελεί τη θέση μεταγραφής και επεξεργα-σίας του rRNA, καθώς και τη θέση έναρξης της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων. Όπως συζητήθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο,


ΕΙΚΟΝΑ 9.22 Εντοπισμός συστατικών της συσκευής ματίσματος. Η χρώση με αντισώματα ανοσοφθορι-σμού δείχνει ότι οι παράγοντες ματί-σματος συγκεντρώνονται σε διακριτά σωμάτια στο εσωτερικό του πυρήνα, τα οποία ονομάζονται πυρηνικά στίγ ματα. (Ευγενική προσφορά του David L. Spector, Cold Spring Harbor Laboratory.)


ΕΙΚΟΝΑ 9.23 Ένα σωμάτιο PML. Το σωμάτιο PML (βέ-λος) περιβάλλεται από χρωματίνη. (Από τη δημοσίευση των G. Dellaire, R. Nisman και D. P. Bazett-Jones, 2004. Met. Enzymol. 375: 456. Ευγενική προσφορά του D. Bazett-Jones.)


τα κύτταρα απαιτούν μεγάλο αριθμό ριβοσωμάτων σε συγκεκριμέ-νες χρονικές στιγμές ώστε να ικανοποιήσουν τις ανάγκες τους για πρωτεϊνοσύνθεση. Τα ενεργώς αυξανόμενα κύτταρα θηλαστικών, για παράδειγμα, περιέχουν 5 έως 10 εκατομμύρια ριβοσώματα, τα οποία πρέπει να συντεθούν κάθε φορά που διαιρείται το κύτταρο. Ο πυρηνίσκος είναι ένα εργοστάσιο παραγωγής ριβοσωμάτων, σχε-διασμένο για να πληροί την ανάγκη για ρυθμιζόμενη και αποδοτική παραγωγή rRNA και για συναρμολόγηση των ριβοσωμικών υπομο-νάδων. Πρόσφατα στοιχεία υποδεικνύουν ότι οι πυρηνίσκοι έχουν επίσης έναν πιο γενικό ρόλο στην τροποποίηση του RNA και ότι αρκετοί τύποι μορίων RNA κινούνται από και προς τον πυρηνίσκο σε συγκεκριμένα στάδια της επεξεργασίας τους.

Γονίδια του ριβοσωμικού RNA και οργάνωση του πυρηνίσκουΟ πυρηνίσκος(nucleolus), ο οποίος δεν περιβάλλεται από μεμ-βράνη, συνδέεται με τις χρωμοσωμικές περιοχές όπου περιέχονται τα γονίδια 5,8S, 18S και 28S rRNA. Τα ριβοσώματα των ανώτερων ευκαρυωτών περιέχουν τέσσερις τύπους RNA, τα 5S, 5,8S, 18S και 28S rRNA (βλ. Εικόνα 8.4). Τα 5,8S, 18S και 28S rRNA μεταγράφονται ως ενιαία μονάδα μέσα στον πυρηνίσκο από την RNΑ πολυμεράση Ι, η οποία παράγει ένα πρόδρομο ριβοσωμικό RNA, το 45S (Εικόνα 9.25). Το 45S pre-rRNA υπόκειται σε επεξεργασία, από την οποία προκύπτουν το 18S rRNA της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας (40S) και τα 5,8S και 28S rRNA της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονά-δας (60S). Η μεταγραφή του 5S rRNA, το οποίο επίσης συναντάται στη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, λαμβάνει χώρα εκτός του πυρη-νίσκου στους ανώτερους ευκαρυώτες και καταλύεται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ.

Προκειμένου να ανταποκριθούν στην ανάγκη για μεγάλο αριθμό μορίων rRNA, όλα τα κύτταρα περιέχουν πολυάριθμα αντίγραφα των γονιδίων rRNA. Το γονιδίωμα του ανθρώπου, για παράδειγμα,

(Β)(A)


ΕΙΚΟΝΑ 9.24 Σωμάτια Cajal στον πυρήνα. (Α) Εικόνα του πυρήνα ενός κυττάρου HeLa σε μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής. Τα βέλη υποδεικνύουν τα δύο σωμάτια Cajal. (Β) Σήμανση του ίδιου πυρήνα με ανοσοφθορισμό, χρησιμοποιώ-ντας αντισώματα που αναγνωρίζουν τις πρωτεΐνες κοϊλίνη (πράσινο) και φιμπριλλαρίνη (κόκκινο). Η φιμπριλ-λαρίνη συναντάται τόσο στις πυκνές ινώδεις ζώνες των πυρηνίσκων όσο και στα σωμάτια Cajal. Η κοϊλίνη ανιχνεύεται μόνο στα σωμάτια Cajal. (Από τη δημοσίευση του J. G. Gall, 2000. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273.)


περιέχει 200 περίπου αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί για τα 5,8S, 18S και 28S rRNA και 2.000 περίπου αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί για το 5S rRNA. Τα γονίδια των 5,8S, 18S και 28S rRNA ομαδοποιούνται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων σε πέντε διαφορετικά ανθρώπινα χρωμοσώματα (χρωμοσώματα 13, 14, 15, 21 και 22), ενώ τα γονίδια του 5S rRNA συναντώνται σε μία μόνο συστοιχία διαδοχικών επαναλήψεων στο χρωμόσωμα 1.

Η σημασία της παραγωγής ριβοσωμάτων είναι ιδιαίτερα εμφα-νής στα ωοκύτταρα, όπου τα γονίδια rRNA ενισχύονται ώστε να υποστηριχτεί η σύνθεση του μεγάλου αριθμού ριβοσωμάτων που απαιτούνται για τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των εμβρύων. Στα ωοκύτταρα του βατράχου Xenopus, τα γονίδια rRNA πολλαπλασι-άζονται δύο χιλιάδες περίπου φορές, με αποτέλεσμα να υπάρχουν ένα εκατομμύριο περίπου αντίγραφά τους ανά κύτταρο. Αυτά τα πολλαπλασιασμένα γονίδια rRNA κατανέμονται σε χιλιάδες πυρη-νίσκους (Εικόνα 9.26), οι οποίοι υποστηρίζουν τη συσσώρευση σχεδόν 1012 ριβοσωμάτων ανά ωοκύτταρο.

Από μορφολογική άποψη, ο πυρηνίσκος διακρίνεται σε τρεις περιοχές: το ινώδες κέντρο, το πυκνό ινώδες συστατικό και το κοκ-

DNA

Μεσοδιάστημαμεταγραφόμενου DNA Pre-rRNA 45S

18S 5,8S

Γονίδιο rRNA

28S 18S 5,8S 28S

Μεσοδιάστημα μημεταγραφόμενου DNA

Μεταγραφή

Γονίδιο rRNA


ΕΙΚΟΝΑ 9.26 Πυρηνίσκοι σε ωοκύτταρα αμφιβίων. Τα πολλαπλασι-ασμένα γονίδια rRNA ωοκυττάρων Xenopus συγκεντρώνονται σε πο-λυάριθμους πυρηνίσκους (σκουρό-χρωμες κηλίδες). (Από τη δημοσίευ-ση των D. D. Brown και I. B. Dawid, 1969. Science 160: 272.)

ΕΙΚΟΝΑ 9.25 Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Κάθε γονίδιο rRNA αποτελεί μια μονάδα μεταγραφής που περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rRNA, καθώς και μεσοδιαστήματα μεταγρα-φόμενων αλληλουχιών. Τα γονίδια rRNA οργανώνονται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους από μεσοδι-αστήματα μη μεταγραφόμενου DNA.


κιώδες συστατικό (Εικόνα 9.27). Αυτές οι διαφορετικές περιοχές θεωρείται ότι αντιπροσωπεύουν τις θέσεις όπου επιτελούνται τα διαδοχικά στάδια της μεταγραφής rRNA, της επεξεργασίας rRNA και της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων αντίστοιχα. Η τροποποίηση άλλων μικρών μορίων RNA, όπως αυτών του σωματίου αναγνώρισης σήματος (βλ. Κεφάλαιο 10), λαμβάνει χώρα σε άλλες περιοχές του πυρηνίσκου.

Έπειτα από κάθε κυτταρική διαίρεση, οι πυρηνίσκοι συνδέονται με τις χρωμοσωμικές περιοχές που περιέχουν τα γονίδια των 5,8S, 18S και 28S rRNA, οι οποίες γι’ αυτόν τον λόγο ονομάζονται περιο-χέςοργανωτήτουπυρηνίσκου(nucleolar organizing regions). Ο σχηματισμός πυρηνίσκων απαιτεί τη μεταγραφή του 45S pre-rRNA, η οποία φαίνεται να οδηγεί στη σύντηξη μικρών πρόδρομων σωμα-τίων που περιέχουν παράγοντες επεξεργασίας και άλλα συστατικά του πυρηνίσκου. Στα περισσότερα κύτταρα, πυρηνίσκοι που αρχικά είναι μεμονωμένοι συντήκονται, σχηματίζοντας έναν ενιαίο, μεγα-λύτερο πυρηνίσκο. Το μέγεθος του πυρηνίσκου εξαρτάται από τη μεταβολική δραστηριότητα του κυττάρου, δηλαδή μεγάλοι πυ-ρηνίσκοι συναντώνται σε κύτταρα με έντονη πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα. Αυτή η διακύμανση μεγέθους οφείλεται κυρίως σε διαφορές στο μέγεθος του κοκκιώδους συστατικού του πυρηνίσκου, οι οποίες αντανακλούν τα διαφορετικά επίπεδα συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων.

Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNAΚάθε περιοχή οργανωτή του πυρηνίσκου περιέχει μια συστοιχία διαδοχικά επαναλαμβανόμενων γονιδίων rRNA, τα οποία χωρίζονται

3 μm


FCDFC

G

FC

DFC

G

DFC

ΕΙΚΟΝΑ 9.27 Δομή του πυρηνίσκου. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει το ινώ-δες κέντρο (FC, Fibrillar Center), το πυκνό ινώδες συστατικό (DFC, Dense Fibrillar Component) και το κοκκιώδες συστατικό (G, Granular component) ενός πυρηνίσκου. (Ευγε-νική προσφορά του David L. Spector, Cold Spring Harbor Laboratory.)


μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Τα γο-νίδια αυτά μεταγράφονται πολύ ενεργά από την RNA πολυμεράση Ι και επομένως είναι ορατά με ευχέρεια σε ηλεκτρονική μικροσκοπία (Εικόνα 9.28). Στις φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, κα-θένα από τα γονίδια rRNA της συστοιχίας φαίνεται να περιβάλλεται από αυξανόμενες αλυσίδες RNA πυκνής διάταξης, οι οποίες σχημα-τίζουν μια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο. Η υψηλή πυκνότητα των αυξανόμενων αλυσίδων RNA αντανακλά την υψηλή πυκνότητα των μορίων RNA πολυμεράσης, τα οποία συναντώνται με μέγιστη πυκνότητα ενός περίπου μορίου πολυμεράσης ανά εκατό ζεύγη βάσεων της μήτρας DNA.

Στους ανώτερους ευκαρυώτες, το πρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το μεγάλο pre-rRNA 45S, το οποίο περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rRNA, καθώς και μεταγραφόμενες περιοχές μεσο-διαστήματος (Εικόνα 9.29). Τόσο τα 5΄ άκρα όσο και τα 3΄ άκρα των pre-rRNA περιέχουν εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφό-μενης αλληλουχίας, ενώ μεταξύ των αλληλουχιών των 18S, 5,8S και 28S rRNA υπάρχουν επίσης δύο εσωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας. Τα αρχικά βήματα επεξεργασίας


ΕΙΚΟΝΑ 9.28 Μεταγραφή γονιδίων rRNA. Φωτογραφία ηλεκτρο-νικού μικροσκοπίου που δείχνει τη χρωματίνη του πυρηνίσκου. Φαίνο-νται τρία γονίδια rRNA χωρισμένα μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Κάθε γονίδιο rRNA περιβάλλεται από μια συστοι-χία αυξανόμενων αλυσίδων RNA, σχηματίζοντας μια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο. (Ευγενική προσφορά του O. L. Miller, Jr.)

ΕΙΚΟΝΑ 9.29 Επεξεργασία του prerRNA. Το μετάγραφο 45S pre-rRNA των ανώτερων ευκαρυωτών περιέχει εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας (ETS, External Transcribed Spacers) στα δύο άκρα του και εσωτερικά μεσο-διαστήματα μεταγραφόμενης αλλη-λουχίας (ΙTS, Internal Transcribed Spacers) ανάμεσα στις αλληλουχίες των 18S, 5,8S και 28S rRNA. Το pre-rRNA υπόκειται σε επεξεργασία μέσω μιας σειράς τομών, από τις οποίες πα-ράγονται τα ώριμα rRNA.


Pre-rRNA

Ώριμα rRNA

18SETS ETS5,8S 28S

18S 5,8S 28S

ITS

5’ 3’


του μεταγράφου περιλαμβάνουν τομές στο εξωτερικό μεσοδιάστη-μα μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 5΄ άκρου του pre-rRNA και απομάκρυνση του εξωτερικού μεσοδιαστήματος μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 3΄ άκρου. Ακολουθούν επιπλέον τομές, που οδη-γούν στον σχηματισμό των ώριμων μορίων rRNA. Η επεξεργασία του rRNA ακολουθεί παρόμοιο πρότυπο σε όλους τους ευκαρυώτες, αν και μπορεί να υπάρχουν διαφορές ως προς τη σειρά ή τον αριθμό των τομών.

Εκτός από τομές, η επεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει σε σημαντικό βαθμό τροποποίηση βάσεων, η οποία προκύπτει τόσο από την προσθήκη μεθυλομάδων σε συγκεκριμένες βάσεις και κατάλοιπα ριβόζης όσο και από τη μετατροπή ουριδίνης σε ψευ-δοουριδίνη (βλ. Εικόνα 7.44). Στα ζωικά κύτταρα, η επεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει μεθυλίωση εκατό περίπου καταλοίπων ριβόζης και δέκα αζωτούχων βάσεων, καθώς και σχηματισμό εκατό περίπου ψευδοουριδινών. Οι περισσότερες από αυτές τις τροποποι-ήσεις συμβαίνουν κατά τη διάρκεια ή λίγο μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης του pre-rRNA, αν και ορισμένες από αυτές λαμβάνουν χώρα σε μετέπειτα στάδια της επεξεργασίας του pre-rRNA.

Η επεξεργασία του pre-rRNA προϋποθέτει τη δράση τόσο πρωτε-ϊνών όσο και μορίων RNA που εδράζονται στον πυρηνίσκο. Στο Κε-φάλαιο 7 συζητήθηκε η συμμετοχή μικρών πυρηνικών RNA (snRNA) στο μάτισμα του pre-mRNA. Οι πυρηνίσκοι περιέχουν πάνω από 300 πρωτεΐνες και πολλά (περίπου 200) μικράπυρηνισκικάRNA(snoRNA, small nucleolar RNA), τα οποία συμμετέχουν στην επεξερ-γασία του pre-rRNA. Τα snoRNA, όπως και τα snRNA του σωματίου ματίσματος, σχηματίζουν σύμπλοκα με πρωτεΐνες, δίνοντας snoRNP. Κάθε snoRNP αποτελείται από ένα μόριο snoRNA συνδεδεμένο με οκτώ έως δέκα πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, τα snoRNP συγκεντρώνο-νται πάνω στο pre-rRNA και σχηματίζουν σύμπλοκα επεξεργασίας κατά τρόπο ανάλογο με τον σχηματισμό των σωματίων ματίσματος στο pre-mRNA.

Ορισμένα από τα snoRNA είναι υπεύθυνα για τις τομές του pre-rRNA, απ’ όπου προκύπτουν προϊόντα 18S, 5,8S και 28S. Για παρά-δειγμα, το snoRNA U3, το οποίο συναντάται σε 200.000 περίπου αντίγραφα ανά κύτταρο και είναι αυτό που υπάρχει σε μεγαλύτερη αφθονία στον πυρηνίσκο, απαιτείται για την τομή του pre-rRNA στα 5΄ εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας. Ομοίως, το snoRNA U8 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψουν τα 5,8S και 28S rRNA, ενώ το snoRNA U22 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψει το 18S rRNA.


Τα περισσότερα snoRNA ωστόσο συμμετέχουν στη σύνθεση rRNA ως RNA-οδηγοί που κατευθύνουν τις ειδικές τροποποιήσεις βάσεων του pre-rRNA, όπως είναι η μεθυλίωση συγκεκριμένων καταλοί-πων ριβόζης και ο σχηματισμός ψευδοουριδινών (Εικόνα 9.30). Τα περισσότερα snoRNA περιέχουν αλληλουχίες μικρού μήκους, 15 περίπου νουκλεοτιδίων, συμπληρωματικές προς τις αλληλουχίες των 18S ή 28S rRNA, οι οποίες μάλιστα περιλαμβάνουν τις θέσεις τροποποίησης βάσεων στο rRNA. Σχηματίζοντας ομόλογα ζεύγη βάσεων με τις συγκεκριμένες περιοχές του pre-rRNA, τα snoRNA λειτουργούν ως RNA-οδηγοί που καθοδηγούν τα ένζυμα της μεθυ-λίωσης της ριβόζης ή της ψευδοουριδυλίωσης στις σωστές θέσεις του μορίου pre-rRNA. Η τροποποίηση βάσεων είναι απαραίτητη και σε άλλους τύπους RNA εκτός του rRNA. Ένα σχετικό παράδειγμα είναι το σωμάτιο αναγνώρισης σήματος RNA (βλ. Κεφάλαιο 10). Ο εντοπισμός των snoRNP στον πυρηνίσκο θεωρείται ότι αποτελεί τη βάση του γενικότερου ρόλου που έχει ο πυρηνίσκος στις διεργασίες τροποποίησης RNA.

Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτωνΟ σχηματισμός των ριβοσωμάτων περιλαμβάνει τη συναρμολόγηση του πρόδρομου ριβοσωμικού RNA τόσο με ριβοσωμικές πρωτεΐνες όσο και με το 5S rRNA (Εικόνα 9.31). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταγράφονται έξω από τον πυρηνίσκο, από την RNA πολυμεράση ΙΙ, παράγοντας μόρια mRNA που μετα-φράζονται στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος. Στη συνέχεια, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρηνίσκο, όπου συναρμολογούνται μαζί με τα rRNA για να σχηματίσουν προριβοσωμικά σωμάτια. Αν και τα γονίδια του 5S rRNA μεταγράφονται επίσης έξω από τον πυρηνίσκο, σε αυτή την περίπτωση από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ, τα 5S rRNA μεταφέρονται και αυτά στο εσωτερικό του πυρηνίσκου, όπου σχηματίζουν προ-ριβοσωμικά σωμάτια.

Η σύνδεση ριβοσωμικών πρωτεϊνών με το rRNA ξεκινά ενώ η σύνθεση του pre-rRNA βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη και περισσότερες από τις μισές ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκο με το

pre-rRNA

pre-rRNA

snoRNA

CH3

snoRNP

5’

5’

3’

3’


ΕΙΚΟΝΑ 9.30 Ο ρόλος των snoRNA στην τροποποίηση των βάσεων του prerRNA. Τα snoRNA περιέχουν μικρές αλληλουχίες συμπληρωματικές με rRNA. Το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ snoRNA και pre-rRNA οδηγεί σε στόχευση των ενζύμων που καταλύουν τη χημική τροποποίηση αζωτούχων βάσεων (π.χ. μεθυλίωση) στις κατάλληλες θέσεις του pre-rRNA.


pre-rRNA πριν αρχίσει η τομή του. Οι υπόλοιπες ριβοσωμικές πρω-τεΐνες καθώς και το 5S rRNA ενσωματώνονται στα προριβοσωμικά σωμάτια προοδευτικά κατά την τομή του pre-rRNA. Από τα αρχικά στάδια συναρμολόγησης του ριβοσώματος, η επεξεργασία των δύο νεοσχηματιζόμενων ριβοσωμικών υπομονάδων ακολουθεί διαφορετική πορεία. Η επεξεργασία της μικρότερης υπομονάδας (40S), που περιέχει μόνο το 18S rRNA, είναι απλούστερη και περι-λαμβάνει μόνο τέσσερις ενδονουκλεολυτικές τομές. Στους ανώτε-ρους ευκαρυώτες, η επεξεργασία αυτή ολοκληρώνεται μέσα στον πυρήνα, ενώ στον σακχαρομύκητα η τελική τομή που οδηγεί στον σχηματισμό του ώριμου 18S rRNA συμβαίνει μετά την εξαγωγή της υπομονάδας 40S στο κυτταροδιάλυμα. Η επεξεργασία της μεγαλύ-τερης υπομονάδας (60S), που περιέχει τα 28S, 5,8S και 5S rRNA, πε-ριλαμβάνει εκτενείς νουκλεολυτικές τομές και ολοκληρώνεται μέσα στον πυρηνίσκο. Κατά συνέπεια, τα περισσότερα προριβοσωμικά σωμάτια στον πυρηνίσκο αντιστοιχούν σε πρόδρομα σύμπλοκα της μεγάλης υπομονάδας (60S). Τα τελικά στάδια ωρίμανσης των ριβοσωμικών υπομονάδων ολοκληρώνονται μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίων στο κυτταρόπλασμα και οδηγούν στον σχηματισμό των ενεργών υπομονάδων 40S και 60S των ευκαρυω-τικών ριβοσωμάτων.


Πυρήνας


Ριβοσωμικέςπρωτεΐνες

rDNA

Pre-rRNA5S rRNA

5S5,8S

28S

Pre-18S

18S

Υπομονάδα 40SΥπομονάδα 60S


Προριβοσωμικάσωμάτια

5S5,8S

28S

ΕΙΚΟΝΑ 9.31 Συναρμολόγ ηση του ριβοσώματος. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εισάγονται από το κυττα-ρόπλασμα στον πυρηνίσκο και αρ-χίζουν να συναρμολογούνται πάνω στο pre-rRNA πριν ακόμη αρχίσει η επεξεργασία του. Κατά την επεξεργα-σία του pre-rRNA συναρμολογούνται επιπλέον ριβοσωμικές πρωτεΐνες και το 5S rRNA (το οποίο συντίθεται σε άλλη περιοχή του πυρήνα), ώστε να σχηματιστούν προριβοσωμικά σω-μάτια. Τα τελικά στάδια ωρίμανσης λαμβάνουν χώρα μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίων στο κυτταρόπλασμα και οδηγούν στον σχηματισμό των ριβοσωμικών υπο-μονάδων 40S και 60S.


ΟπυρηνικόςφάκελοςκαιηκυκλοφορίαμορίωνανάμεσαστονπυρήνακαιτοκυτταρόπλασμαΗ δομή του πυρηνικού φακέλου: Ο πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιε-χόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα, διατηρώντας τον πυρήνα ως ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα που στεγάζει το γενετικό υλικό και λειτουργεί ως θέση μεταγραφής και επεξεργασίας του RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ο πυρηνικός φάκελος αποτελείται από την εσωτερική και την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, οι οποίες ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πό-ρων, και από την πυρηνική λάμινα, που υποστηρίζει την πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης.

Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου: Τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων είναι μεγάλες δομές που παρέχουν τις μοναδικές διόδους για τη διακίνηση μορίων μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μικρά μόρια διαχέονται ελεύθερα μέσω ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Μακρομόρια μεταφέρονται επιλεκτικά με μια διαδικασία που απαιτεί δαπάνη ενέργειας.

Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήνα: Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για εισαγωγή στον πυρήνα περιέχουν σήματα πυρηνικού εντοπισμού τα οποία αναγνωρίζονται από υποδοχείς που κατευθύνουν τη μεταφορά αυτών των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πό-ρου. Οι πρωτεΐνες που παλινδρομούν μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος περιέχουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής τα οποία υπαγορεύουν τη μεταφορά τους από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, για τη μετακίνηση μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου απαιτείται η μικρή πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη πρόσδεσης GTP η οποία καθορίζει και την κατεύθυνση της μεταφοράς.

Βλ. Αnimation 9.1

Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα: Η ενεργότητα ορισμένων πρωτεϊνών, όπως των μεταγραφικών παραγόντων, ελέγχεται μέσω ρύθμισης της εισαγωγής και της εξαγωγής τους από και προς τον πυρήνα.

Μεταφορά των μορίων RNA: Τα RNA μεταφέρονται μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου υπό μορφή ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων. Τα αγγελιαφόρα RNA, τα ριβοσωμικά RNA και τα μεταφορικά RNA εξάγονται από τον πυρήνα ώστε να λάβουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση. Αρκετές κατηγορίες μικρών πυρηνικών RNA μεταφέρονται από τον πυρήνα στο κυτ-ταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνες σχηματίζοντας RNP, και στη συνέχεια επαναφέρονται στον πυρήνα.

ΕσωτερικήοργάνωσητουπυρήναΧρωμοσώματα και υψηλότερη οργάνωση δομής της χρωματίνης: Ο με-σοφασικός πυρήνας περιέχει ετεροχρωματίνη, η οποία είναι μεταγραφικά ανενεργή και ιδιαίτερα συμπυκνωμένη, καθώς και ευχρωματίνη, η οποία είναι αποσυμπυκνωμένη. Τα μεσοφασικά χρωμοσώματα διευθετούνται με οργανωμένο τρόπο στο εσωτερικό του πυρήνα και χωρίζονται σε μεγάλες επικράτειες βρόχων που λειτουργούν ως ανεξάρτητες μονάδες.

πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope), πυρηνική μεμβράνη (nuclear membrane), πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), λαμίνη (lamin)

σύμπλοκο πυρηνικού πόρου (nuclear pore complex)

σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS, Nuclear Localization Signal), υποδο-χέας πυρηνικής μεταφοράς (nuclear transport receptor), ιμπορτίνη (importin), Ran, σήμα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signal), εξπορτίνη (exportin), καρυοφερίνη (karyopherin)

ετεροχρωματίνη (eterochromatin), ευχρωματίνη (euchromatin)

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙΟΡΟΙ


Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήνα: Μερικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα μέσα στον πυρήνα, όπως η αντιγραφή του DNA και ο μεταβολισμός του mRNA, μπορεί να εντοπίζονται σε διακριτές υποπυρηνικές δομές.

ΟπυρηνίσκοςκαιηεπεξεργασίατουrRNAΓονίδια του ριβοσωμικού RNA και οργάνωση του πυρηνίσκου: Ο πυρηνίσκος συνδέεται με τα γονίδια που κωδικοποιούν για ριβοσωμικά RNA. Αποτελεί τη θέση της μεταγραφής rRNA, της επεξεργασίας rRNA, της συναρμολόγη-σης των ριβοσωμάτων και της τροποποίησης αρκετών μικρών μορίων RNA.

Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNA: Το πρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το pre-rRNA 45S, από την επεξεργασία του οποίου προ-κύπτουν τα 18S, 5,8S και 28S rRNA. Η επεξεργασία του pre-rRNA και άλλων μικρών RNA επιτυγχάνεται μέσω μικρών πυρηνισκικών RNA (snoRNA).

Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων: Οι υπομονάδες των ριβοσωμάτων συ-ναρμολογούνται μέσα στον πυρηνίσκο από rRNA και ριβοσωμικές πρωτεΐνες.

πυρηνίσκος (nucleolus), περιοχή οργανωτή του πυρηνίσκου (nucleolar organizing region)

μικρό πυρηνισκικό RNA (snoRNA, small nucleolar RNA)

1. Διαχωρίζοντας τη θέση της μετα-γραφής από τη θέση της μετάφρασης, ο πυρηνικός φάκελος δίνει στους ευ-καρυώτες τη δυνατότητα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης μέσω διαδικασιών που δε συναντώνται στους προκαρυ-ώτες. Ποιοι είναι αυτοί οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που συναντώνται αποκλει-στικά στους ευκαρυώτες;

2. Ποιους ρόλους διαδραματίζουν οι λαμίνες στη δομή και στη λειτουργία του πυρήνα;

3. Έστω ότι ενίετε σε ένα ωάριο βατρά-χου δύο σφαιρικές πρωτεΐνες. Η μία έχει μοριακή μάζα 15 kDa, η άλλη 100 kDa και καμία από τις δύο δε φέρει σήμα πυρηνικού εντοπισμού. Θα εισέλθει κάποια από αυτές στον πυρήνα;

4. Τι καθορίζει την κατευθυντικότητα της εισαγωγής στον πυρήνα;

5. Περιγράψτε πώς μπορεί να ρυθμι-στεί η ενεργότητα ενός μεταγραφικού παράγοντα στο επίπεδο της εισαγωγής του στον πυρήνα.

6. Έστω ότι μελετάτε έναν μεταγραφι-κό παράγοντα που ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλίωσης καταλοίπων σερίνης και γνωρίζετε ότι η φωσφορυλίωση αυτή απενεργοποιεί το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του. Πώς θα επηρέαζε τον υποκυτταρικό εντοπισμό του μεταγρα-φικού παράγοντα και την έκφραση του γονιδίου-στόχου του η αντικατάστα-ση αυτών των καταλοίπων σερίνης με αλανίνη;

7. Πώς θα μπορούσε να επηρεάσει την υποκυτταρική κατανομή μιας πρωτεΐνης η οποία κανονικά παλινδρομεί μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος μια με-ταλλαγή που απενεργοποιεί το σήμα πυρηνικής εξαγωγής της;

8. Η αντιγραφή του DNA φαίνεται ότι λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες θέσεις ή εργοστάσια αντιγραφής. Πώς θα μπο-ρούσατε να εντοπίσετε αυτές τις θέσεις σε κύτταρα θηλαστικών σε καλλιέργεια;

9. Πώς έδειξαν ο Smith και οι συνερ-γάτες του ότι η αλληλουχία αμινοξέων 126-132 του αντιγόνου Τ επαρκεί για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης αυτής στον πυρήνα;

10. Ποια είναι η σημασία των πυρηνι-κών στιγμάτων;

11. Ποια είναι η λειτουργία των snoRNA;

12. Ποια επίδραση θα είχε η χορήγηση RNAi έναντι της ανθρώπινης εξπορτί-νης t σε καλλιέργεια ανθρώπινων ινο-βλαστών;

Ερωτήσεις

ΠΕΡΙΛΗΨΗΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙΟΡΟΙ


ΟπυρηνικόςφάκελοςκαιηκυκλοφορίαμορίωνανάμεσαστονπυρήνακαιτοκυτταρόπλασμαAlber, F., S. Dokudovskaya, L. M. Veenhoff,

W. Zhang, J. Kipper, D. Devos, A. Supra-pto, O. Karni-Schmidt, R. Williams, B. T. Chait, A. Sali and M. P. Rout. 2007. The molecular architecture of the nuclear pore complex. Nature 450: 695-701. [P]

Beck, M., V. Lucic, F. Forster, W. Baumeis-ter and O. Medalia. 2007. Snapshots of nuclear pore complexes in action captured by cryo-electron tomography. Nature 449: 611-615. [P]

Chook, Y. M. and G. Blobel. 1999. Struc-ture of the nuclear transport complex karyopherin-ß2-Ran•GppNHp. Nature 399: 230–237. [P]

Crisp, M. and B. Burke. 2008. The nuclear envelope as an integrator of nuclear and cytoplasmic architecture. FEBS Lett. 582: 2023-2032. [R]

Cronshaw, J. M., A. N. Krutchinsky, W. Zhang, B. T. Chait and M. J. Matunis. 2002. Prote omic analysis of the mamma-lian nuclear pore complex. J. Cell Biol. 158: 915–927. [P]

Goldman, R. D., Y. Gruenbaum, R. D. Moir, D. K. Shumaker and T. P. Spann. 2002. Nuclear lamins: Building blocks of nuclear architecture. Genes Dev. 16: 533–547. [R]

Gruenbaum, Y., A. Margalit, R. D. Goldman, D. K. Shumaker and K. L. Wilson. 2005. The nuclear lamina comes of age. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 21–31. [R]

King, M. C., C. P. Lusk and G. Blobel. 2006. Karyopherin-mediated import of integral inner nuclear membrane proteins. Nature 442: 1003-1007. [P]

Kohler, A. and E. Hurt. 2007. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 761-773. [R]

Meier, I. 2007. Composition of the plant nuclear envelope: theme and variations. J. Exp. Bot. 58: 27-34. [R]

Mosammaparast, N. and L. F. Pemberton. 2004. Karyopherins: From nuclear-trans-port mediators to nuclear-function regu-lators. Trends Cell Biol. 14: 547–556. [R]

Polesello, C. and F. Payre. 2004. Small is beautiful: What flies tell us about ERM

protein function in development. Trends Cell Biol. 14: 294–302. [R]

Presgraves, D. C., L. Balagopalan, S. M. Abmayr and H. A. Orr. 2003. Adaptive evolution drives divergence of a hybrid inviability gene between two species of Drosophila. Nature 423: 715–719. [P]

Quimby, B. B. and M. Dasso. 2003. The small GTPase Ran: Interpreting the signs. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 338–344. [R]

Stewart, M. 2007. Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 195-208. [R]

Tran, E. J. and S. R. Wente. 2006. Dynamic nuclear pore complexes: life on the edge. Cell 125: 1041-1053. [R]

Vetter, I. R., A. Arndt, U. Kutay, D. Gorlich and A. Wittinghofer. 1999. Structural view of the Ran-importin β interaction at 2.3 Å resolution. Cell 67: 635–646. [P]

Weis, K. 2003. Regulating access to the genome: Nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112: 441–451. [R]

ΕσωτερικήοργάνωσητουπυρήναBernardi, R. and P. P. Pandolfi. 2007. Struc-

ture, dynamics and functions of promy-elocytic leukaemia nuclear bodies. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 1006-1016. [R]

Branco, M. R. and A. Pombo. 2007. Chromo-some organization: new facts, new mod-els. Trends Cell Biol. 17: 127-134. [R]

Gall, J. G. 2000. Cajal bodies: The first 100 years. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273–300. [R]

Grosshans, H., K. Deinert, E. Hurt and G. Simos. 2001. Biogenesis of the signal rec-ognition particle (SRP) involves import of SRP proteins into the nucleolus, assembly with the SRP-RNA, and Xpo1p-mediated export. J. Cell Biol. 153: 745–762. [P]

Johnson, A. W., E. Lund and J. Dahlberg. 2002. Nuclear export of ribosomal sub-units. Trends Biochem. Sci. 27: 580–585. [R]

Kennedy, B. K., D. A. Barbie, M. Classon, N. Dyson and E. Harlow. 2000. Nuclear organization of DNA replication in pri-

mary mammalian cells. Genes Dev. 14: 2855–2868. [P]

Lanctôt, C., T. Cheutin, M. Cremer, G. Ca-valli and T. Cremer. 2007. Dynamic ge-nome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions. Nature Rev. Genet. 8: 104-115. [R]

Misteli, T., J. F. Caceres and D. L. Spector. 1997. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature 387: 523–527. [P]

Sexton, T., H. Schober, P. Fraser and S. M. Gasser. 2007. Gene regulation through nuclear organization. Nature Struct. Mol. Biol. 14: 1049-1055. [R]

Taddei, A., H. G. Van, F. Hediger, V. Kalck, F. Cubizolles, H. Schober and S. M. Gas-ser. 2006. Nuclear pore association confers optimal expression levels for an inducible yeast gene. Nature 441: 774-778. [P]

Takahashi, Y., V. Lallemand-Breitenbach, J. Zhu and T. H. de Thé. 2004. PML nuclear bodies and apoptosis. Oncogene 23: 2819–2824. [R]

Trinkle-Mulcahy, L. and A. I. Lamond. 2008. Nuclear functions in space and time: Gene expression in a dynamic, constrained en-vironment. FEBS Lett. 582: 1960-1970. [R]

Vartiainen, M. K. 2008. Nuclear actin dy-namics–From form to function. FEBS Lett. 582:2033-2040. [R]

ΟπυρηνίσκοςκαιηεπεξεργασίατουrRNAGranneman, S. and S. J. Baserga. 2004. Ribo-

some biogenesis: Of knobs and RNA pro-cessing. Exp. Cell Res. 296: 43–50. [R]

Kiss, T. 2002. Small nucleolar RNAs: An abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. Cell 109: 145–148. [R]

Miller, O. L., Jr. and B. Beatty. 1969. Visual-i zation of nucleolar genes. Science 164: 955–957. [P]

Nazar, R. N. 2004. Ribosomal RNA process-ing and ribosome biogenesis in eukary-otes. IUBMB Life 56: 457–465. [R]

Olson, M. O., K. Hingorani and A. Szebeni. 2002. Conventional and nonconventional

Βιβλιογραφικές αναφορές


roles of the nucleolus. Int. Rev. Cytol. 219: 199–266. [R]

Thiry, M. and D. L. Lafontaine. 2005. Birth of a nucleolus: The evolution of nucleo-

lar compartments. Trends Cell Biol. 15: 194–199. [R]

Zemp, I. and U. Kutay. 2007. Nuclear export and cytoplasmic maturation of ribosomal subunits. FEBS Lett. 581:2783-2793. [R]


the cell sample ch09

Documents