ก

รหสโครงการ SUT3-303-57-24-15

รายงานการวจย

การพฒนาและการเพมประสทธภาพนาเชอแชแขงไกพนเมองพนธเหลองหางขาว

(The improvement frozen spermatozoa of Thai indigenous chicken, Leung Hang Kao)

ไดรบทนอดหนนการวจยจาก มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

d

ข

รหสโครงการ SUT3-303-57-24-15

รายงานการวจย

การพฒนาและการเพมประสทธภาพนาเชอแชแขงไกพนเมองพนธเหลอง

หางขาว (The improvement frozen spermatozoa of Thai indigenous

chicken, Leung Hang Kao)

คณะผวจย หวหนาโครงการ

อาจารย ดร. สมร พรชนชวงศ สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตว ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผรวมวจย

1. รศ.ดร. เทวนทร วงษพระลบ 2. นายธระชย ชอไม

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ 2556-2558

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

กรกฎาคม 2560

ก

ก

กตตกรรมประกาศ

การวจยครงนไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ประจ าปงบประมาณ พ.ศ. 2556-2558 คณะผวจยขอขอบคณศนยเครองมอวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยเทคโนโลย สรนาร ทใหความอนเคราะหเครองมอและอปกรณส าหรบการวจย ขอขอบคณฟารมมหาวทยาลย เทคโนโลยสรนาร (ฟารมสตวปก) รศ.ดร.อมรรตน โมฬ หวหนาโครงการวจยไกเนอโคราช และคณธระชย ชอไม ผอ านวยการศนยวจยและบ ารงพนธสตวกบนทรบร จงหวดปราจนบร ทใหความอนเคราะหสถานท และสตวทดลอง ตลอดจนนกวชาการ และเจาหนาทประจ าศนยวจยและบ ารงพนธสตวกบนทรบรทก ๆ ทาน ทไดมสวนชวยใหการวจยครงนส าเรจลลวงไปดวยด

คณะผวจย

มถนายน 2560

ข

บทคดยอ การศกษาผลของสาร antioxidant ตอคณภาพของนาเชอทเกบรกษาแบบแชแขงในไกพนเมองพนธ

เหลองหางขาว แบงการศกษาออกเปน 2 การทดลอง ดงน 1) ผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง และ 2) ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

การทดลองท 1 ทาการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยใชสาร extender 8 ชนด (modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) ใชสารไครโอโพรเทคแทนท 3 ชนด (DMF, DMA, DMSO) ทระดบความเขมขน 6% โดยใชวธการลดอณหภมแบบองไนโตรเจนเหลว และประเมนคณภาพของนาเชอแชแขงจากอตราการเคลอนท อตราการมชวต อตราการผสมตด ความสมบรณของอะโครโซมดวยส fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) รวมกบ propidium iodide (PI) และการทางานของไมโตคอนเดรย ดวยส Rhodamine 123 รวมกบ propidium iodide (PI) จากการศกษาพบวา เมอใช 6% DMF รวมกบ EK ใหอตราการผสมตดสงสด เทากบ 42.37±1.45% (46% ของนาเชอสด) ซงใหผลสอดคลองกบผลการประเมนความสมบรณของอะโครโซมพบอสจมชวตและอะโครโซมสมบรณเทากบ 51.00±3.21% และการทางานของไมโตรคอนเดรยสมบรณเทากบ 52.00±3.79% ซงสงกวาเมอเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05)

ศกษาผลของการเสรมสารตานอนมลอสระ 3 ชนด ท 3 ระดบความเขมขน ไดแก วตามนอ ทระดบความเขมขน 1.16, 2.32 และ 3.48 mM ซสเทอนทระดบความเขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ กลตาไธโอนทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM และประเมนคณภาพของนาเชอแชแขงจากอตราการเคลอนท อตราการมชวต อตราการผสมตด และการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชน พบวา การเสรมวตามนอท ระดบความเขมขน 2.32 mM ใหอตราการผสมตดเทากบ 63.02±5.26% (65% ของนาเชอสด) ซงสงและแตกตางกวากลมทไมมการเสรมวตามนอ (P<0.05) และใหผลการเกดปรมาณของ MDA ตาเทากบ 2.68±0.04 nmol/50x106 spz. เมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) และพบวาการเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 2.32 mM สงผลใหอตราการเคลอนทรวม (68.00±3.46%), อตราการเคลอนทไปขางหนา (39.33±2.91%) และอตราการมชวตรอด (54.00±2.65%) สงทสดเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) การเสรมซสเทอนทระดบความเขมขน 5.0 mM และ กลตาไธโอนทระดบความเขมขน 0.1 mM สงผลใหประสทธภาพของนาเชอลดตาลงเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ ททาการศกษา

ค

Abstract

The present study examined the feasibility of antioxidant on frozen semen quality in native chickens (Leung Hang Kao). Two experiments were carried out: (1) investigate the effect of extenders and cryoprotectants on quality of sperm and fertility rate of native chickens (Leung Hang Kao), (2) determine the effects of antioxidant on frozen semen quality and fertility rate of native chickens (Leung Hang Kao).

The first experiment was to investigate the effects of eight extenders ( modified extenders with osmotic pressure 300, 350 and 400 mOsm kg-1, Lake’ s diluent, BPSE, IGGKP, EK and Schramm), three cryoprotectants (dimethyl acetamide-DMA, dimethyl formamide-DMF and dimethyl sulfoxide-DMSO,) at concentrations of 6% on the cryopreservation of native chicken

(Leung Hang Kao) semen. Sperm samples were frozen using a liquid nitrogen vapour in 500 μL straws and stored for seven days in a liquid nitrogen container. They were then thawed at 5 ๐

C for 5 min, and motility, viability, fertility, acrosome integrity and mitochondria function rates were assessed. The highest fertility rate of 42.37±1.45% (46% of control), acrosome integrity of 51.00±3.21% and mitochondria activity of 52.00 ± 3.79% were achieved with the combination of 6% DMF and EK as the extender. These results were higher when compared with the other treatments (P<0.05).

Three antioxidants with three concentrations of vitamin E at concentrations at 1.16, 2.32 and 3.48 mM, cysteine at 0.5, 1.0 and 5.0 mM and glutathione at 0.025, 0.05 and 0.1 mM on the cryopreservation of native chicken (Leung Hang Kao) sperm were investigated. Semen was diluted with EK as the extender, mixed with each antioxidant and 6% DMF was added. Frozen sperm was thawed, and motility, viability, fertility rates and lipid peroxidation were assessed. It was found that vitamin E at a concentration of 2.32 mM yielded a higher fertility rate of 63.02±5.26% (65% of control) and a lower MDA of 2.68± 0.04 nmol/50x106 spz. when compared with the other treatments (P<0.05) . The highest motility rate of 68.00±3.46% , progressive motility rate of 39.33±2.91%, and viability rate of 54.00±2.65% were also achieved from vitamin E at a concentration of 2.32 mM. The supplement cysteine at 5.0 mM and 0.1 mM of glutathione had a negative impact on sperm quality.

ง

สารบญ

หนา กตตกรรมประกาศ ก บทคดยอภาษาไทย ข บทคดยอภาษาองกฤษ ค สารบญ ง สารบญตาราง ฉ สารบญภาพ ซ บทท 1 บทน า 1

1.1 ความส าคญและทมาของปญหาในการท างานวจย 1 1.2 วตถประสงค 3 1.3 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 3

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ 4 2.1 อสจของสตวปก 4 2.2 วธการเกบรกษาน าเชอแชแขง 5 2.3 สภาวะการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชน 7 2.4 ผลของสาร Antioxidant ตอคณภาพของน าเชอสตวทมการเกบรกษาในแบบ 9

แชเยนและแบบแชแขง บทท 3 วธด าเนนงานวจย 14 3.1 วธการศกษา 14 3.2 การทดลองท 1 การศกษาผลของสาร extender และสาร cryoprotectant 20

ตอการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง 3.3 การทดลองท 2 ศกษาชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ท 26

เหมาะสมตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธ เหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

บทท 4 ผลการศกษา 29 4.1 ผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพน าเชอและ 29 อตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษา แบบแชแขง

จ

สารบญ (ตอ)

หนา 4.2 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอ 36 คณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว ทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

บทท 5 วจารณ สรป และขอเสนอแนะ 39 5.1 ผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพน าเชอและ 39 อตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษา แบบแชแขง

5.2 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสม 40 ตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลอง หางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

สรป และขอเสนอแนะ 43 เอกสารอางอง 44 ภาคผนวก 49 ภาคผนวก ก 49 ภาคผนวก ข 53 ประวตผวจย 59

ฉ

สารบญตาราง หนา

ตารางท 2.1 ความเขมขนของ Glutathione ในน าเชอของสตวแตละชนด 13 ตารางท 3.1 หลกเกณฑการสงเกตอตราการเคลอนทของอสจ 16 ตารางท 3.2 คา Analysis setup 17 ตารางท 3.3 สวนประกอบทางเคม (g/50ml) ของสาร extender ทใชเจอจาง 21

น าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว ตารางท 3.4 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender 23

ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMF ทระดบ ความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษาน าเชอไก พนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลอง แบบ CRD

ตารางท 3.5 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender 24 ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMA ทระดบ ความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษาน าเชอไก พนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลอง แบบ CRD

ตารางท 3.6 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender 25 ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMSO ทระดบ ความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษาน าเชอไก พนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลอง แบบ CRD

ตารางท 3.7 แผนการทดลองการศกษาผลของสาร antioxidant 3 ชนด 3 ระดบความ 28 เขมขนวตามนอ (1.16, 2.32 และ 3.48 mM) Cysteine (0.5, 1.0 และ 5.0 mM) และ Glutathione (0.025, 0.05 และ 0.1 mM) ตอคณภาพ ของน าเชอทเกบรกษาแบบแชแขงในไกพนเมองพนธเหลองหางขาวโดย วางแผนการทดลองแบบ CRD ตารางท 4.1 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMF ตอคณภาพน าเชอ 30 แชงแขงไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง

ช

สารบญตาราง (ตอ) หนา

ตารางท 4.2 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMF ตอความสมบรณ 31 ของอะโครโซมและการท างานของไมโตคอนเดรยของน าเชอแชแขง ไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท 4.3 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMA ตอคณภาพน าเชอ 32

แชแขงไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท 4.4 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMA ตอความสมบรณ 33 ของอะโครโซมและการท างานของไมโตคอนเดรยของน าเชอแชแขง ไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท 4.5 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMSO ตอคณภาพน า 34 เชอแชแขงไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท 4.6 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMSO ตอความสมบรณ 35 ของอะโครโซมและการท างานของไมโตคอนเดรยของน าเชอแชแขง ไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท 4.7 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบการใช 37 EK+ 6%DMF ตอคณภาพของน าเชอไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทม

การเกบรกษาแบบแชแขง

ซ

สารบญภาพ หนา

ภาพท 2.1 โครงสรางตวอสจของไก 4 ภาพท 2.2 การเขาท าปฏกรยาของ antioxidant ตออนมลอสระ (Free radical) 9 ภาพท 3.1 การรดน าเชอไก 15 ภาพท 3.2 สไลดส าหรบนบเมดโลหต (heamacytometer counting chamber) 16

บรเวณทนบจ านวนอสจทง 5 บรเวณ (1, 2, 3, 4 และ 5)

ภาพท 3.3 อสจมชวตมลกษณะสขาว และอสจตายจะตดสชมพแดงหรอสมวงเขม 18 เมอยอมดวยส Eosin - Nigrosin ภาพท 3.4 กระบวนการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองพนธสายเหลองหางขาวทมการเสรมสาร 27

antioxidant ลงในสาร extender กอนเขาสกระบวนการเกบรกษาน าเชอแชแขง ภาพท 4.1 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบการใช EK+ 38

6%DMF ตอปรมาณการเกด malondialdehyde (MDA) ในน าเชอไกพน เมองพนธเหลองหางขาวทมการเกบรกษาแบบแชแขง

บทท 1 บทน ำ

1.1 ควำมส ำคญและทมำของปญหำในกำรท ำงำนวจย

ไกพนเมองเปนสตวทมความส าคญในการเปนแหลงอาหารโปรตน และมความส าคญตอเศรษฐกจชมชน ซงเนอไกพนเมองถอไดวาเปนแหลงโปรตนทมรสชาตด, มเนอแนน และมไขมนนอย จงท าใหไกพนเมองมราคาสงกวาไกกระทงประมาณ 20-30% (วลลภ, 2544) นอกจากนยงไดมการจดตงชมรม สมาคมเพออนรกษและพฒนาสายพนธไกพนเมองใหเปนสายพนธไกชนอกดวย แตในชวงทผานมาไดเกดการระบาดของโรคในสตวปก ไดแก โรคนวคาสเซล, โรคไขหวดนกสายพนธ H5N1 และจากขอมลในป พ.ศ. 2557 ไดมการตรวจพบเชอไขหวดนกชนดรนแรงสายพนธ H5N2 ในฟารมเลยงไกและไกงวงทประเทศแคนาดา จงสงผลใหสตวปกตายนบหมนตว ซงกอนหนานในปเดยวกน ไดมการรายงานถงการระบาดของไขหวดนกชนดรนแรงสายพนธ H5N8 ในประเทศแถบยโรป เชน เยอรมน, องกฤษ, เนเธอรแลนด สงผลใหสตวปก เชน เปด, ไก, ไกงวง ทเลยงไวในฟารมลมตายจ านวนมาก และเปนผลใหรฐบาลของแตละประเทศตองออกมาตรการก าจดสตวปกจ านวนหลายแสนตว (สถาบนว จยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข, 2557) ถงแมไขหวดนกชนดรนแรงสายพนธดงกลาวจะยงไมแพรระบาดในประเทศไทยกตาม แตจากขอมลกมแนวโนมสงผลตออตสาหกรรมการผลตสตวปกเปนอยางมาก และสงผลตอการสญเสยพนธกรรมทดของสตวปกไป ซงจากขอมลการระบาดของไขหวดนกสายพนธ H5N1 ในประเทศไทยชวงทผานมากสงกระทบตออตสาหกรรมการเลยงสตวปกและเกษตรกรผเลยงสตวปกเปนจ านวนมากเชนกน จงท าใหรฐบาลตองออกมาตรการควบคมการระบาดของโรคไขหวดนก โดยการท าลายสตวปกทเปนพาหะซงรวมถงไกพนเมองดวยประมาณ 60,811,081 ตว (ศนยควบคมโรคไขหวดนก ส านกควบคมปองกนและบ าบดโรคสตว กรมปศสตว, 2549) ซงการท าลายไกเปนจ านวนมากน สงผลใหไกทมพนธกรรมทดลดจ านวนลง ดงนนจงควรมการศกษาการอนรกษพนธกรรมของไกพนเมองไทยอยางเรงดวน และเทคโนโลยทมบทบาทชวยในการอนรกษพนธกรรมทส าคญและมความเปนไปไดในการผลตสตวปก คอ เทคโนโลยการผสมเทยม (artificial insemination; AI) ซงในปจจบนไดมการน าเทคโนโลยการเกบรกษาน าเชอไกแบบระยะสนเขามาใชในอตสาหกรรมการผลตดวยเทคนคการผสมเทยม การเกบรกษาน าเชอและการผสมเทยมนนสามารถกระจายพนธกรรมสตวทตองการไดโดยสะดวกและเปนประโยชนในเรองการประหยดตนทนในการเลยงดพอพนธ, การควบคมโรคตดตอทางระบบสบพนธ นอกจากการเกบรกษาน าเชอไกแบบระยะสนแลว ยงมอกหนงเทคโนโลยทส าคญในการเกบรกษาพนธกรรมของสตวปกนนกคอ การเกบรกษาน าเชอแบบแชแขง ซงการเกบรกษาน าเชอแบบแชแขงนน จะตองอาศยการท างานของสาร extender และ สาร cryoprotectant เพอปองกนเซลลอสจจากความเยนทใชเหนยวน าในระหวางกระบวนการแชแขง แตจากรายงานการศกษาทผานมา พบวา การขยายพนธสตวปกโดยใชน าเชอไกแบบแช

2

แขงนนยงมการน าไปใชคอนขางนอยมาก เนองจากพบปญหาอตราการผสมตดต า (Donoghue and Wishart, 2000) เนองจากในระหวางกระบวนการลดอณหภม และการละลายน าเชอแชแขงมผลท าใหลกษณะทางกายภาพและทางเคมของเซลลเมมเบรนของตวอสจเปลยนแปลงไป ซงสงผลท าใหอตราการเคลอนท, อตราการมชวตรอด และอตราการผสมตดลดลง (Gadea et al., 2004; Satorre et al., 2007) เนองจากโครงสรางเยอหมเซลลอสจจะประกอบดวยกรดไขมนไมอมตว (unsaturated fatty acid) จ านวนมาก ซงในเยอหมเซลลอสจของไกนนจะม phospholipids ประกอบอยมากถง 66.4-70.7% ของไขมนทงหมด (Surai et al., 2001) จงท าใหมความไวตอการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซ เดชน (Lipid peroxidation; LPO) ถงแมภายในเซมนอลพลาสมาจะมสารตานอนมลอสระกตาม แตกสามารถชวยปองกนการเกดเปอรออกซเดชนไดเพยงชวคราว ฉะนนในการเกบรกษาน าเชอภายนอกรางกายในระยะเวลาทยาวนานจงไมสามารถปองกนการเกดลปดเปอรออกซเดชนไดทงในสตวปกและสตวเลยงลกดวยนม (Breque et al., 2003) ส าหรบน าเชอแบบแชแขงขนตอนหรอกระบวนการตาง ๆ มผลตอการลดปรมาณสารตานอนมลอสระ และการเพมปรมาณกลม reactive oxygen species (ROS) (Bilodeau et al., 2001) จงเกดลปดเปอรออกซเดชนเพมสงขน สงผลใหคณภาพของตวอสจของน าเชอแบบแชแขงต าลง รวมถงความสามารถในการปฏสนธต าลงดวย นอกจากน Safarinejad et al. (2010) และ Fang et al. (2002) พบวา การเกดปฏกรยาออกซเดชน ท าใหมการผลตสารอนมลอสระ (ROS) ซงจะสงผลเสยตอเยอหมเซลลของตวอสจ และท าใหกลไกหรอหนาทความสมบรณพนธของเพศผสญเสยไป โดยจะมผลท าใหอตราการเคลอนทของตวอสจลดลง เกดการยบยงการใชออกซเจนของตวอสจ DNA ของตวอสจถกท าลาย และ enzyme ทส าคญตาง ๆ ทท าหนาทในการเจาะไขของตวเมยถกท าลายจงสงผลท าใหอตราการผสมตดลดลง(Kaeoket et al., 2008) ซงในชวงทผานมาไดมรายงานการศกษาถงผลดในการเสรมสารตานอนมลอสระในน าเชอของสตวชนดตาง ๆ ตวอยางเชน มการเสรมออกซไดสกลตาไธโอน (oxidizes glutathione), โบวายเซรมอลบลมน (bovine serum albumin), ซสเทอน (cysteine) และ ไลโคปน (lycopene) ในน าเชอแพะ (Uysal and Bucak, 2007), การเสรมซสเทอนในน าเชอสกร (Kaeoket et al., 2008), การเสรมกลตาไธโอนในน าเชอกระบอ (Ansari et al., 2011), การเสรมวตามนอ (Vitamin E) ในน าเชอแกะ (Andreea and Stela, 2010) และการเสรมซสเทอน และ กลตาไธโอน ในน าเชอไกพนเมองสายพนธประดหางด า (เทวนทร และคณะ, 2555) พบวา การเสรมสารตานอนมลอสระกอนท าการเกบรกษาน าเชอจะสามารถลดการปฏกรยาออกซเดชน และมผลท าใหอตราการตายของตวอสจลดลง ซงจากขอมลทรวบรวมมา พบวา มขอมลของการน าสารตานอนมลอสระมาใชในการเพมประสทธภาพของน าเชอไกทเกบรกษาแบบแชแขงนอยมาก จงท าใหผวจยเลงเหนถงประโยชนและน ามาใชศกษาในการวจยครงน โดยใชไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวเปนตนแบบในการศกษาเพอศกษาผลของชนดและระดบการเสรมสาร antioxidant เพอเพมประสทธภาพน าเชอไกพนเมองพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง

3

1.2 วตถประสงคในกำรวจย 1.2.1 เพอศกษาชนดของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง

1.2.2 เพอศกษาชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทมผลตอคณภาพน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง 1.3 ประโยชนทคำดวำจะไดรบ

ท าใหทราบชนดของสาร extender และสาร cryoprotectant ทเหมาะสมส าหรบการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองสายพนธ เหลองหางขาวแบบแชแขง ทราบชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพน าเชอ เพอจะน าองคความรดงกลาวไปเพมประสทธภาพในการเพมผลผลตไกพนเมองตอไป อกทงยงน าไปสการใชประโยชนในหนวยงานขององคกรภาครฐทเกยวของกบการอนรกษพนธกรรมและความหลากหลายทางชวภาพในการเกบรกษาเปนคลงอสจ (sperm bank) หรอสามารถน าน าเชอไกแบบแชแขงไปใชในเชงพาณชยเพอการสงออก

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ

2.1 อสจของสตวปก (Spermatozoa) ตวอสจของไกมลกษณะคลายไสเดอน มความยาวประมาณ 100 มลลไมครอน ประกอบดวย 3 สวน

คอ 1) สวนหว มขนาดยาวประมาณ 12.5 มลลไมครอน ภายในประกอบดวยนวเคลยส (nucleus) ซงจะบรรจสารพนธกรรม (deoxyribonucleic acid, DNA) และโปรตนฮสโตน หรอโปรตามน และม cytoplasm อยปรมาณนอย นอกจากนยงมอะโครโซม (acrosome) ซงเปลยนแปลงมาจาก Golgi apparatus ประกอบดวย ผนงสองชน มลกษณะคลายกระสนปน เปนสวนทครอบหวอสจประมาณ 2 ใน 3 สวน ภายในบรรจเอนไซมหลายชนด เชน proacrosin, hyaluronidase, esterase และ hydrolase ซงเกยวของกบการปฏสนธ โดย hyaluronidase จะเขาไปสลายกลม cumulus cell, acrosin และ zona pellucida ของเซลลไข 2) สวน midpiece ยงประกอบไปดวยไมโตรคอนเดรย (mitochondria) ประมาณ 30 อน เรยงตวเปนเกลยวรอบ ๆ ไมโครทวบล (microtubule) เพอสรางพลงงานใหกบตวอสจ และ 3) สวนหาง ยาวประมาณ 80 มลลไมครอน จะประกอบดวยเสนใยเลก ๆ เรยงตวเปนควางตามแนวยาวไปจนถงสวนปลายหาง โดยจะถกลอมรอบดวยเสนใยอก 9 ค เพอชวยใหอสจเคลอนทไปขางหนาได โดยโครงสรางตวอสจของไกดงแสดงในภาพท 2.1

ภาพท 2.1 โครงสรางตวอสจของไก ทมา: Barrie (2007)

5

2.2 วธการเกบรกษานาเชอแชแขง การเกบรกษานาเชอแบบแชแขงในสตวปกนนจะตองอาศยการทางานของสาร extender รวมกบสาร cryoprotectant โดยสาร extender จะใชเพอเพมปรมาตรนาเชอ รกษาคณสมบตและการทางานของเซลลอสจ มบทบาทในการควบคม pH, แรงดนออสโมตก, เปนแหลงพลงงานใหกบตวอสจเพอใชในกระบวนการเมตาบอลซม และชวยยดระยะเวลาการเคลอนทและการมชวตใหกบตวอสจ โดยพบวา โซเดยมกลตาเมท (sodium glutamate) เปนสารทเปนสวนประกอบสาคญของสาร extender ในการเกบรกษานาเชอสตวปก ซงมคณสมบตในการควบคมแรงดนออสโมตก (Lake, 1960) และมคณสมบตในการยดระยะเวลาในการเคลอนทของตวอสจ (Donoghue and Wishart, 2000) โดยชนดของสาร extender ทเลอกใชนนควรมคา pH และคาออสโมลาลตใกลเคยงกบ seminal fluid ของนาเชอสตวททาการศกษา เนองจากคา pH ของสาร extender มผลตออตราเมตาบอลซมและการเคลอนทของตวอสจ ซงคา pH ทเหมาะสมในสตวปกจะอยในชวงระหวาง 6.0-8.0 (Siudzinska and Lukaszewicz, 2008) และปจจยทสาคญอกประการหนงคอ คาออสโมลาลต ซงคาออสโมลาลตทเหมาะสมสาหรบการเกบรกษานาเชอสตวปกจะอยในชวงระหวาง 250-460 mOsm kg-1 (Siudzinska and Lukaszewicz, 2008) หากอสจอยในสภาวะทมคาออสโมลาลตตาจะทาใหเซลลอสจบวม แตถาอสจอยในสภาวะทมคาออสโมลาลตสงจะทาใหเซลลอสจมการสญเสยนาและเกดภาวะเซลลเหยว (Donoghue and Wishart, 2000) สาร extender ทนยมใชอยางกวางขวางในไกและไกงวง ไดแก Lake’s diluent (Chalah, 1999), BPSE (Belsville Poultry Extender) (Sexton, 1977), IGGKP (Lukaszewicz, 2001) และ Schramm (Chalah, 1999) และทผานมาไดมการศกษาผลของสาร extender ตอการเกบรกษานาเชอในสตวปกหลายชนด โดย Laffaldano et al. (2005) ไดศกษาผลของสาร BPSE, Lake’s diluent และ IGGKP ในการเกบรกษานาเชอไกงวงทระยะเวลาการเกบ 3, 24 และ 48 ชวโมง และเกบรกษาทอณหภม 5 องศาเซลเซยส พบวา ทระยะเวลาการเกบรกษา 3 ชวโมง เมอใช BPSE, Lake’s diluent และ IGGKP ใหอตราการเคลอนท, อตราการมชวต และความสมบรณของเยอหมเซลลอสจไมแตกตางกน (P>0.05) และเมอทาการเกบรกษาในระยะเวลาทเพมขนเปน 24 และ 48 ชวโมง พบวา เมอใช BPSE ใหอตราการเคลอนท, อตราการมชวต และความสมบรณของเยอหมเซลลอสจสงกวาการใช Lake’s diluent และ IGGKP (P<0.05) สาหรบการศกษาของ Penfold et al. (2001) กพบวา สามารถใช BPSE ในการเกบรกษานาเชอเปดสายพนธ Northern pintail ไดนานถง 48 ชวโมง ซงใหอตราการเคลอนทรวม, อตราการเคลอนทไปขางหนา และอตราการผสมตดไมแตกตางจากการเกบรกษาทระยะเวลา 0 ชวโมง (P>0.05) สาหรบ Siudzinska and Lukaszewicz (2008) ไดศกษาผลของสาร Lake’s diluent, EK และ Tselutin ตอลกษณะทางกายวภาค (morphology) ของตวอสจในการเกบรกษานาเชอไก 4 สายพนธ ไดแก White Crested Black, Polish Italian Partridge, Green Legged Partridge และ Black Minorca ทระยะเวลาการเกบรกษา 3, 6 และ 24 ชวโมง โดยเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส พบวา สาร Lake’s diluted, EK และ Tselutin ทาใหเกดความผดปกตบรเวณหว midpiece ความผดปกตอน ๆ และอตราการมชวตไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (P>

6

0.05) ยกเวนความผดปกตบรเวณคอ โดยพบวา EK ทาใหเกดความผดปกตบรเวณคอนอยทสดในการเกบรกษานาเชอไกทง 4 พนธ นอกจากนเทวนทร และคณะ (2550) ไดศกษาผลของสาร Lake’s diluent, Tselutin, Schramm, BPSE และ IGGKP ในการเกบรกษานาเชอไก 3 สายพนธ (เหลองหางขาว, คละส และโรดไอสแลนดเรด) ทระยะเวลาการเกบรกษา 1, 3 และ 6 ชวโมง โดยเกบรกษาทอณหภม 41 องศาเซลเซยส พบวา เมอเกบรกษาทระยะเวลา 6 ชวโมง การใช BPSE และ IGGKP ใหอตราการเคลอนทและอตราการมชวตไมแตกตางจากกลมควบคมในการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวและคละส (P>0.05) สาหรบการเกบรกษานาเชอไกโรดไอแลนดเรด พบวา เมอใช IGGKP ใหอตราการเคลอนทและอตราการมชวตสงทสด จากการศกษาของเทวนทร และยพน (2550) ไดทาการทดสอบอตราการผสมตดของการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวและคละสรวมกน ทระยะเวลาการเกบรกษา 1 ชวโมง พบวา การใช Lake’s diluent, Tselutin, Schramm, BPSE และ IGGKP ใหอตราการผสมตดไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (P>0.05) นอกจากการเลอกใชสาร extender ในการเกบรกษานาเชอแลวนนยงตองอาศยการทางานของสาร cryoprotectant รวมดวย โดยสาร cryoprotectant เปนสารทสาคญในการเกบรกษานาเชอแบบแชแขง มหนาทชวยปองกนอนตรายแกเซลลอสจในระหวางกระบวนการแชแขงและการละลาย สาร cryoprotectant แตละชนดจะตองมระดบความเขมขน และระยะเวลา (equilibration time) ทเหมาะสม เพอทจะออกฤทธและปองกนการถกทาลายของเซลล หนาทของสาร cryoprotectant จะปองกนการเกดเกลดนาแขงภายในเซลล, ปองกนการลดขนาดของเซลล และอนตรายอนเนองมาจากความไมสมดลของเกลอแรและอเลกโทรไลท โดยสาร cryoprotectant จะชวยปรบเปลยนใหเกดความสมดลของโซเดยมระหวางภายในและภายนอกเซลลโดยการขนสงโซเดยมเขาสภายในเซลล เนองจากโซเดยมอออน มความสามารถจบกบนาได ดงนนจงเปนการขนสงนาเขาสเซลล และการแพรของสาร cryoprotectant เขาสเซลลกเปนการเขาไปแทนทนาทแพรออกจากเซลล ซงเปนผลมาจากการเปลยนแปลงของแรงดนออสโมซส อนเนองมาจากการเกดเกลดนาแขงภายนอกเซลลกอนทของเหลวภายในเซลลจะแขงตว สาร cryoprotectant สามารถชวยคงไวของคณสมบตของเยอหมเซลลและเยอหมออแกเนลสซงยงไมมการอธบายของกลไกการทางาน สาร cryoprotectant ทนามาใชในการเกบรกษานาเชอสตวปกมหลายชนด เชน glycerol, DMSO, DMA, DMF และ EG เปนตน และในอดตทผานมาไดมการศกษาผลของสาร cryoprotectant รวมกบสาร extender หลายชนดในการเกบรกษานาเชอไก ซงจากการศกษาของ Tseluntin et al. (1999) พบวา เมอใช DMA ทระดบความเขมขน 6% รวมกบ Lake’s diluent ในการเกบรกษานาเชอไกสายพนธทางการคา (type I99 roosters) โดยใชวธการลดอณหภมแบบเมดใหอตราการผสมตด (92.7±4.1%) ไมแตกตางจากการใชนาเชอสด (94.7±0.4%) ซงสอดคลองกบการศกษาของ Chalah et al. (1999) กพบวาเมอใช DMA ทระดบความเขมขน 6% รวมกบ Lake’s diluent ในการเกบรกษานาเชอไกสายพนธการคา (Shaver Starbro) ดวยวธการลดอณหภมแบบเมดใหอตราการผสมตด (88.0%) ไม

7

แตกตางจากการใชนาเชอสด (93.0%) นอกจากนการใช DMA ทระดบความเขมขน 6% ยงประสบความสาเรจในการเกบรกษานาเชอหานโดยใช EK เปนสาร extender ซงพบวา การเกบรกษานาเชอหานสายพนธ Greylag ใหอตราการผสมตดเทากบ 37.7% มผลทาใหเปอรเซนตการผสมตดสงทสดและไมแตกตางจากกลมควบคม (P>0.05) สาหรบการศกษาของ Gee et al. (1993) ในการเกบรกษานาเชอนกเหยยว (Falco sparverius) พบวา การใช DMSO ทระดบความเขมขน 6% รวมกบ BPSE ใหอตราการผสมตดสงทสด (35.29%) (P<0.05) และนอกจากนเทวนทร และยพน (2550) ไดทาการศกษาสาร extender รวมกบสาร cryoprotectant โดยใช BPSE เปนสาร extender และใช glycerol, Dimethylacetamide (DMA), Ethylene glycol (EG) และ DMSO เปนสาร cryoprotectant พบวา การใชสาร extender สตร BPSE รวมกบ 6% DMSO นนชวยใหอตราการเคลอนทของอสจสงขนเมอเทยบกบสาร cryoprotectant ชนดอน ๆ และจากการศกษาของสนทร และคณะ (2552) ไดเปรยบเทยบการใชสาร glycerol ทระดบความเขมขน 10% และ DMF ทระดบความเขมขน 6% โดยใช Sharnm เปนสาร extender ในการเกบรกษานาเชอไกพนเมองดวยวธการลดอณหภมแบบองไอไนโตรเจนเหลว พบวา เมอใช glycerol ทระดบความเขมขน 10% ใหอตราการเคลอนท (60.00±7.50%) สงกวาการใช DMF ทระดบความเขมขน 6% (42.8±4.6%) แตสาร cryoprotectant ทงสองชนดใหผลอตราการมชวตไมแตกตางกน (P>0.05) เมอนาไปทดสอบอตราการผสมตด พบวา glycerol ทระดบความเขมขน 10% ไมทาใหเกดการผสมตด (0%) สาหรบ DMF ทระดบความเขมขน 6% ใหอตราการผสมตดเทากบ 22.83±12.2% จากผลการศกษาเกยวกบสาร extender และสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเชอสตวปก พบวา การเลอกใชสารทง 2 ชนด ยงมความแปรปรวนหลากหลายในการเลอกใชสารทง 2 ชนด ซงการเลอกใชขนอยกบชนดของสตวปก และวธในการลดอณหภม นอกจากนการศกษาผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวยงมการศกษาคอนขางนอย จงไมสามารถสรปไดวาสาร extender และสาร cryoprotectant ชนดใดทเหมาะสมสาหรบการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง และจากการรวบรวมเอกสาร พบวา การเกบรกษานาเชอไกพนเมองนยมใชวธการลดอณหภมแบบองไอไนโตรเจนเหลว ดงนนควรมการศกษาเพมเตมถงความเหมาะสมในการเลอกใชสาร extender และสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวดวยวธการลดอณหภมแบบองไอไนโตรเจนเหลว 2.3 สภาวะการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชน องคประกอบของเยอหมเซลลอสจของไกจะประกอบดวยกรดไขมนไมอมตวสายยาว (Polyunsaturated fatty acid) เปนสวนประกอบหลก ซงในไกจะม phospholipids ประกอบอยในอสจมากถง 66.4-70.7% ของไขมนทงหมด (Surai et al., 2001) การทโครงสรางของเซลลอสจของไก ประกอบดวย กรดไขมนไมอมตวสายยาวเปนจานวนมากน จงไวตอการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนทจะทาใหเกดความเสยหายตอโครงสรางเซลลอสจไดสง (Breque et al., 2003) ซงเมอเซลลอสจทมชวต

8

ถกเกบอยในสภาวะทใชออกซเจน เชน ระหวางการแชเยน, แชแขง และละลายตวอสจภายหลงการแชแขง กระบวนการเหลานจะตองการออกซเจนเพอไปชวยในกระบวนการสนดาป แตอยางไรกตามผลตผลจากการสนดาปออกซเจนทมากเกนไป คอ Reactive Oxygen Species (ROS) จะเปนสาเหตทาใหโครงสรางเซลลอสจเกดความเสยหายและตายได โดย ROS คอ พวกอนมลอสระทมอเลกตรอนไมเขาค เชน superoxide radicals (O2

-), hydroxyl radicals (OH) หรอ hydrogen peroxide (H2O2) (Thuwanut, 2007) ซง ROS เปนโมเลกลหรออเลกตรอนโดดเดยวอยรอบนอกและมอายสนมากประมาณ 10-3-10-10 วนาท จงจดเปนโมเลกลทไมเสถยรและวองไวตอการเกดปฏกรยาเคม (Breque et al., 2003) ในกระบวนการแชแขงนาเชอกมการเพมปรมาณของ ROS ซงปรมาณการเพมขนของ ROS นนมความเกยวของทางสรรวทยาในการรกษาความสามารถในการปฏสนธ , กระบวนการ capacitation และ acrosome reaction ของตวอสจ โดย ROS ทมากเกนไปจะทาใหความสามารถในการเคลอนทและการปฏสนธนนลดนอยลง (Baumber et al., 2000; Bucak et al., 2008) ซงความเสยหายจากปฏกรยาเปอรออกซเดชนทเกดขนสงผลใหเกดการสญเสยการทางานของเยอหมเซลลรวมถงเกดความเสยหายของ DNA ทสวนหวของอสจดวย (Agarwal and Said, 2003) ภายใตสภาวะปกตตวอสจท DNA เกดความเสยหายนนจะไมสามารถเขาสกระบวนการปฏสนธได ทเปนเชนนเพราะวาปฏกรยาเปอรออกซเดชนทเกดขนนนไดไปเพมความเสยหายตอเยอหมเซลลอสจ ดงนนสารจาพวกกลม antioxidant จงมบทบาทในการชะลอการเกดความเสยหายดงกลาวได (ภาพท 2.2) อยางไรกตามการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนจะเปนอนตรายตออสจและสงผลเสยตอการเคลอนทของอสจ ปกตจะสามารถวดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนทเกดขนไดจากการวดระดบของ malondialdehyde (MDA) ทเปนผลผลตสดทายของการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนผานทางวธการ thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) โดย MDA ไดมาจากการทาปฏกรยาของ thiobarbituric acid (TBA) กบสารเปอรออกไซด (peroxide) และอลดไฮด (aldehyde)

9

ภาพท 2.2 การเขาทาปฏกรยาของ antioxidant ตออนมลอสระ (Free radical)

ทมา: http://www.vcharkarn.com/varticle/59646

2.4 ผลของสาร Antioxidant ตอคณภาพของนาเชอสตวทมการเกบรกษาในแบบแชเยนและแบบแชแขง สาร antioxidant หรอเรยกวาสารตานออกซเดชน หรอสารตานอนมลอสระ คอ สารททาหนาทยบยงหรอตอตานปฏกรยาออกซเดชน หรอเปนสารทสามารถขจดอนมลอสระออกจากรางกายเซลล ซงการตานออกซเดชนของรางกายหรอเซลลนนแบงออกไดเปน 2 กลม ใหญ ๆ คอ 1) กลมทปองกนการเกดสารอน ม ลอ สระ ไ ด แก เอน ไซม superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, peroxidase, cytochrome C, peroxidase, ทองแดง, สงกะส, ซลเนยม โปรตนทมทองแดงอยในโมเลกล (ceruloplasmin) และ 2) กลมททาลายปฏกรยาลกโซ ไดแก วตามนอ , เบตา-แคโรทน, วตามนซ, ubiquinone, uric acid, bilirubin, albumin, sulfhydryl groups ในกรดอะมโน cysteine ซงมอยในโปรตน เชน เนอสตว นอกจากนสาร antioxidant ยงสามารถแบงตามกลไกการยบยงไดออกเปน 3 ชนด คอ 1) Preventive antioxidant เปนสาร antioxidant ทปองกนการเกดอนมลอสระ 2) Scavenging antioxidant เปนสาร antioxidant ททาลายหรอยบยงอนมลอสระทเกดขน และ 3) Chain breaking antioxidant เปนสาร antioxidant ททาใหปฏกรยาลกโซของการเกดอนมลอสระสนสดลง ซงอนมลอสระในนาเชอนนสามารถเกดขนไดในสภาวะปกตจากกระบวนการเมตาบอลซมของออกซเจนโดยจะอยในรป ROS ซงเปนสารอนมลอสระทมคณสมบตเปนตวออกซแดนซสง ประกอบดวย ซปเปอรออกไซดแอนไอออน (superoxide anion, O2

-), ไฮโดรเจนเพอรออกไซด (hydrogen peroxide; H2O2), เพอรรอกซซลล (peroxyl radicals) และ ไฮดรอกซซลล (hydroxyl radicals; HO) โดยในสภาวะปกตนนการมสารอนมล

10

อสระในนาเชอจะสามารถพบไดในปรมาณเลกนอยเนองจากในนาเลยงเชอ (Seminal plasma) มสารตานอนมลอสระเปนองคประกอบทาใหเกดความสมดลขน ซงเปนผลดในการชวยกระตนการเกดปฏกรยา capacitation ของตวอสจ กระตนใหเกดการยดเกาะของตวอสจกบชน zona pellucida ของไข และเปนสารชวยกระตนการเกดปฏกรยา acrosome reaction อยางไรกตามเมอนานาเชอมาผานขนตอนตาง ๆ ในกระบวนการผลตนาเชอแชแขงจะทาใหปรมาณของนาเลยงเชอลดลง สงผลใหปรมาณสารตานอนมลอสระลดลงดวยเชนกน จงทาใหอนมลอสระในนาเชอเพมขน ซงกอใหเกดอนตรายกบตวอสจได ทผานมาไดมรายงานการศกษาผลของสาร antioxidant ตอคณภาพนาเชอสตว จากการศกษาของ Tabatabaei et al. (2011) ไดทาการศกษาการเสรมวตามนอตอคณภาพนาเชอในไกเนอพนธ Ross โดยทาการเสรมลงในสาร extender ทระดบความเขมขนตาง ๆ ดงน 0 (control), 0.05, 0.1, 0.2 และ 0.3 mg/ml และทาการเกบรกษานาเชอในระยะเวลาตาง ๆ กน ดงน 0, 3, 6, 10 และ 24 ชวโมง พบวา เมอทาการเกบรกษานาเชอทระยะเวลา 3 ชวโมง การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.05, 0.1, 0.2 และ 0.3 mg/ml สามารถใหอตราการเคลอนท (71.47±3.16, 73.67±1.88, 72.33±1.70 และ74.09±1.45 ตามลาดบ) ซงสงกวากลมควบคม (62.45±1.15) (P<0.05) และยงพบวา ทระยะเวลาการเกบรกษานาเชอ 3 ชวโมง การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.1, 0.2 และ 0.3 mg/ml สงผลใหอตราการมชวตของตวอสจ (91.05±2.30, 90.27±3.11 และ 92.08±2.90 ตามลาดบ) สงกวากลมควบคม (82.19±2.26) (P<0.05) และเมอเกบรกษาเปนเวลา 6 ชวโมง พบวา การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.1, 0.2 และ 0.3 mg/ml ใหอตราการเคลอนทสงขน (69.28±2.53, 71.11±2.49 และ 69.33±2.12 ตามลาดบ) เมอเทยบกบการเสรมวตามนอในระดบความเขมขน 0.05 mg/ml (61.61 ± 2.67) และกลมควบคม (49.35 ± 3.86) (P<0.05) และเมอทาการเสรมวตามนอในระดบความเขมขน 0.05, 0.1, 0.2 และ 0.3 mg/ml ใหอตราการมชวตของตวอสจสงกวากลมควบคม นอกจากนยงพบวาเมอทาการเกบรกษานาเชอเปนระยะเวลา 10 และ 24 ชวโมง พบวา การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.2 และ 0.3 mg/ml สงผลใหอตราการเคลอนทและอตราการมชวตของอสจสงกวาการเสรมวตามนอในระดบอน ๆ (P<0.05) และเมอทาการเกบรกษานาเชอเปนเวลา 3, 6 และ 24 ชวโมง พบวา การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.2 และ 0.3 mg/ml สงผลใหอสจมลกษณะผดปกตนอยทสดเมอเทยบกบการเสรมในระดบอน ๆ แตสาหรบการเกบรกษาในระเวลา 10 ชวโมงนน พบวา การเสรมวตามนอทระดบ 0.3 mg/ml สงผลใหอสจมลกษณะผดปกตนอยทสดเมอเทยบกบการเสรมในระดบอน ๆ ในการศกษาของ Funahashi and Sano (2005) ไดทาการศกษาการเสรมสาร antioxidant ใน extender ตอการเกบรกษานาเชอสกรทอณหภม 10 องศาเซลเซยส ซงการศกษานไดทาการศกษาสาร antioxidant 3 ชนดดวยกน คอ Glutathione, Cysteine และ Hypotaurine พบวา เมอมการเกบรกษานาเชอสกรเปนเวลา 7 วน extender ทเตมดวย Cysteine จะสงผลใหมอตราการมชวตของอสจสงสดเมอเทยบกบกลมควบคม (P<0.05) และหลงจากเกบรกษานาเชอสกรเปนระยะเวลา 14 วน พบวา extender ทเตมดวย Cysteine และ Glutathione สงผลใหตวอสจมอตราการมชวตรอดสงกวากลมควบคม นอกจากน Funahashi and

11

Sano (2005) ยงไดทาการศกษาระดบการเสรม Cysteine ตอคณภาพนาเชอสกรดวย โดยทาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 0 (control), 0.25, 0.5, 1.25, 2.50 และ 5.0 mM พบวา เมอทาการเกบรกษานาเชอสกรเปนเวลา 14 วน การเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 2.5-5.0 mM สงผลใหตวอสจมอตราการมชวตรอดสงกวาการเสรม Cysteine ในระดบอน ๆ และการศกษาของ Carolina et al. (2011) ไดทาการศกษาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขนตาง ๆ ตอการเกบรกษานาเชอสกรแบบระยะสน โดยทาการเสรม Cysteine ลงใน BTS extender ทระดบความเขมขน 0 (control), 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 และ 20.0 mM พบวา หลงจากการเกบรกษานาเชอสกรเปนเวลา 72 ชวโมงนนอตราการมชวตรอดของอสจจะตากวา 60% เมอทาการเสรมดวย Cysteine ทระดบความเขมขน 0-5.0 mM และตากวา 10% เมอทาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 10 และ 20 mM และเมอระยะเวลาการเกบรกษานาเชอสกรเพมมากขน การเสรม Cysteine ในระดบความเขมขน 20 mM จะสงผลใหความสมบรณของ plasma membrane นนมแนวโนมลดลงอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) สาหรบการศกษาของ Ansari et al. (2011) ไดทาการศกษาผลของเสรม Glutathione ในสาร extender ตอคณภาพนาเชอกระบอ โดยในการศกษานจะแบงระดบของการเสรมออกเปนระดบความเขมขนตาง ๆ ดงน 0 (control), 0.5, 1.0, 2.0 และ 3.0 mM และทาการเกบรกษานาเชอทอณหภม 5 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 5 วน จะพบวา เมอทาการเกบรกษานาเชอเปนระยะเวลา 3 วน และ 5 วน การเสรม Glutathione ทระดบความเขมขน 0.5 และ 1.0 mM จะสงผลใหอตราการเคลอนท, อตราการมชวต และความสมบรณของ plasma membrane ของอสจสงกวาการเสรม Glutathione ทระดบอน ๆ (P<0.05) และเมอเกบรกษานาเชอกระบอในระยะเวลา 3 และ 5 วน โดยมการเสรม Glutathione ทระดบความเขมขน 0.5 mM สามารถชวยเพมความสมบรณของอะโครโซมใหสงยงขน จากอดตทผานมาสาหรบในการเกบรกษานาเชอแบบแชแขงกไดมการศกษาถงผลของสาร antioxidant เพอเพมประสทธภาพของนาเชอเชนเดยวกน โดยจากการศกษาของ Asadpour et al. (2011) ไดทาการศกษาการเสรมวตามนซและวตามนอลงใน citrate-egg yolk extender (CEY) ตอคณภาพนาเชอโคแบบแชแขง โดยทาการเสรมวตามนอลงใน citrate-egg yolk extender มการเสรมทระดบความเขมขน 0 (control), 0.043 และ 0.086 mg/ml พบวา การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.043 และ 0.086 mg/ml สงผลใหอตราการเคลอนท (56.00±4.00 และ 51.00±5.00 ตามลาดบ) และอตราการมชวตรอด (66.00±2.00 และ 61.00±1.00 ตามลาดบ) ของอสจสงขนเมอเทยบกบกลมควบคม (43.00±3.00 และ 51.00±1.00 ตามลาดบ) (P<0.05) นอกจากน Andrabi et al. (2008) ไดทาการศกษาผลของการเสรมวตามนอลงใน Tris-citric acid (TCA) ตอคณภาพนาเชอกระบอหลงการละลาย โดยไดทาการเสรมวตามนอ ทระดบ 1 mg/ml พบวา การเสรมวตามนอชวยเพมอตราการเคลอนท (60.0±0.0) และความสมบรณของ plasma membrane ของอสจ (82.9±2.5) และความสมบรณของอะโครโซม (86.5±5.1) สงกวากลมควบคม (54.0±2.2, 76.9±4.5 และ 80.2±0.8 ตามลาดบ) (P<0.05) ในการศกษาของ Kaeoket et al. (2008) ไดศกษาผลของการเตมสาร antioxidant 3 ชนด ไดแก L- cysteine ทระดบความเขมขน 605.8 mg/ml,

12

glutathione ทระดบความเขมขน 307.32 mg/ml และ vitamin E ทระดบความเขมขน 86.14 mg/ml ลงใน Lactose-egg yolk extender ในการเกบรกษานาเชอสกรแชแขงทใชวธการลดอณหภมแตกตางกน พบวา สาร antioxidant ทง 3 ชนด ไมมผลตออตราการเคลอนทและอตราการมชวตรอดของตวอสจ (P>0.05) แตจากการศกษาของ Satorre et al. (2007) พบวา การเตม vitamin E ทระดบความเขมขน 0.2 mg/ml ลงใน BF5 extender ตอการเกบรกษานาเชอสกรแบบแชแขง สงผลใหอตราการเคลอนท และความสมบรณของอะโครโซมสงกวากลมควบคม (P<0.05) และการเตม vitamin E ระดบความเขมขน 0.2 mg/ml ไมมผลตออตราการมชวตรอดของอสจ (P>0.05) และการศกษาของ Andreea and Stela (2010) ไดทาการศกษาผลของการเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.43 mg/ml ตอการเกบรกษานาเชอแกะแบบแชแขง พบวา การเตมวตามนอชวยเพมอตราการเคลอนท, อตราการมชวตรอด และความสมบรณของ plasma membrane ใหเพมสงขน นอกจากศกษาการเตมวตามนอแลว ยงไดมการศกษาการเสรม cysteine ทระดบความเขมขน 10 mM พบวา การเสรม cysteine นนสามารถชวยปรบปรงใหอสจมอตราการเคลอนท, อตราการมชวตรอด และความสมบรณของ plasma membrane สงขนเชนเดยวกน จากการศกษาของ Coyan et al. (2011) ทาการศกษาการผลของการเสรม cysteine ทระดบความเขมขน 0 (control), 1, 2 และ 4 mM ในการเกบรกษานาเชอแกะแบบแชแขง พบวา การเสรม cysteine ทระดบความเขมขน 2 และ 4 mM สามารถเพมอตราการเคลอนทใหสงขนเมอเทยบกบกลมควบคม (control) (P<0.05) แตการเตม cysteine ทระดบความเขมขน 2 mM จะชวยใหความสมบรณของ plasma membrane สงกวาการเตมในระดบอน ๆ (P<0.001) สาหรบการศกษาของ Ansari et al. (2010) ซงไดทาการศกษาการเสรม L-cysteine ลงในสาร extender ตอคณภาพนาเชอโคพนธ Sahiwal กอนนานาเชอไปทาการแชแขง โดยในการศกษานไดทาการเสรม L-cysteine ทระดบความเขมขนตาง ๆ ดงน 0 (control), 0.5, 1.0 และ 2.0 mM พบวา เมอมการเสรม L-cysteine ทระดบความเขมขน 1.0 และ 2.0 mM สงผลใหอตรากรเคลอนท อตราการมชวตรอด ความสมบรณของ plasma membrane และความสมบรณของอะโครโซมของอสจสงกวาระดบอน ๆ (P<0.05) จาการศกษาของ Ursal and Bucak (2007) ไดทาการศกษาการเตมสารตานอนมลอสระตอคณภาพนาเชอแกะแบบแชแขง โดยไดมการเสรม Glutathione ทระดบความเขมขน 0 (control), 5, 10 และ 20 mM พบวา การเสรม Glutathione ทระดบความเขมขน 5 mM นนสงผลใหอตราการเคลอนท อตราการมชวตรอด และความสมบรณของ plasma membrane สงกวาการเสรม Gluthaione ในระดบอน ๆ และยงชวยปองกนการถกทาลายของ acrosome ดวย และทาการเสรม Cysteine ทระดบ 0 (control), 5, 10 และ 20 mM พบวา การเสรม Cysteine ทระดบ 10 mM จะสงผลใหอสจมอตราการเคลอนทสงกวาการเสรม Cysteine ในระดบอน ๆ แตสาหรบอตราการมชวตรอดของอสจนน การเสรม Cysteine ทระดบ 5 และ 10 mM ใหผลไมแตกตางกน จากการศกษาของเทวนทร และคณะ (2555) ไดทาการศกษาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 1, 5 และ 10 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.1, 0.5 และ 1.0 mM ตามลาดบ ในไกพนเมองสายพนธประดหางดา พบวา การเสรม cysteine มผลตออตราการ

13

ปฏสนธหรออตราของไขมเชอภายหลงการผสมเทยมดวยนาเชอแบบแชแขง โดยระดบทเหมาะสมคอ 1 mM และสาหรบการเสรม glutathione ทระดบ 0.1-1.0 mM มผลเสยตอคณภาพนาเชอไกพนเมองโดยทาใหความสามารถในการเคลอนท และความสมบรณพนธลดตาลงอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) นอกจากน Luberda (2005) ไดรวบรวมการรายงานการศกษาปรมาณของ Glutathione ในนาเชอสตวแตละชนดดงแสดงในตารางท 2.1 เพอเปนการบงบอกถงความตองการถงการนาไปใชในการเสรม Glutathione ในระดบตาง ๆ ตอการลดการเกดออกซเดชนในระหวางการเกบรกษานาเชอตอไป ตารางท 2.1 ความเขมขนของ Glutathione ในนาเชอของสตวแตละชนด

Species Glutathione References Boar 0.03 nmol/108 spz. Bull 2.93 nmol /108 spz. Dog 0.53 ± 0.11 nmol /108 spz. Luberda (2005)

Hamster 30-40 nmol / mg protein Mouse 90 nmol /108 spz. Rabbit 0.01 nmol /108 spz. Ram 0.45 ± 0.14 nmol /108 spz.

หมายเหต: spz = spermatozoa จากการศกษาผลของสาร antioxidant ตอคณภาพและความสมบรณพนธของนาเชอสตวทผานมานน พบวา การเสรม antioxidant มแนวโนมสามารถเพมคณภาพของนาเชอภายหลงการแชแขงได แตจากรายงานการศกษาขางตน จะพบวาขอมลททาการศกษาในสตวปกยงคอนขางมขอมลทนอยมาก จงทาใหเกดวตถประสงคในการศกษาถงชนด และระดบของสารตานอนมลอสระตอคณภาพและความสมบรณพนธของนาเชอไกพนเมองพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง เพอพฒนาและเพมประสทธภาพการใชประโยชนจากนาเชอไกพนเมองแบบแชแขงใหเกดประโยชนสงสด

บทท 3 วธการด าเนนงานวจย

การศกษาผลของสาร antioxidant ตอคณภาพนาเชอทเกบรกษาแบบแชแขงในไกพนเมองพนธเหลองหางขาวมการดาเนนงานวจยทงในภาคสนามและในหองปฏบตการ ในสวนของหองปฏบตการนนใชหองปฏบตการ การปรบปรงพนธสตวและสรรวทยาสตว อาคารเครองมอ 10 มหาวทยาลยเทคโนโลย สรนาร สาหรบการศกษาในภาคสนามนนใชฟารมมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร เปนสถานทในการดาเนนงานวจย โดยการศกษาครงนแบงออกเปน 2 การทดลอง ดงน

การทดลองท 1 การศกษาผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง

การทดลองท 2 การศกษาชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทมผลตอคณภาพนาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง

โดยทาการประเมนคณภาพนาเชอจากอตราการเคลอนท, อตราการมชวต, อตราการผสมตด, ความสมบรณของอะโครโซม, การทางานของไมโตคอนเดรย และประสทธภาพในการลดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนจากการวดระดบของ malondialdehyde (MDA) ดวยวธการ thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) ในตวอสจโดยมขนตอนและวธการศกษา ดงน 3.1 วธการศกษา

3.1.1 การรดน าเชอ ในการศกษาครงน ใชพอพนธไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว จากฟารมมหาวทยาลย

เทคโนโลยสรนาร อายประมาณ 7 เดอนขนไป จานวน 60 ตว โดยจะรดนาเชอสปดาหละ 2 ครง การรดนาเชอจะมผรด 2 คน คอ คนอมไกจะกระชบพอไกไวทเอวยนหางไกออกขางหนา หวไกอยดานหลงของคนอม มอหนงจะจบขาไกทง 2 ขางรวบเขาหากน โดยใชนวชและนวกลางอยระหวางขาทงสอง แลวใชมออกขางหนงลบหลงพอไกเบา ๆ จากโคนปกผานมาทหลงและโคนหาง จากนนใชนวหวแมมอและนวชบบกระตนอยางรวดเรวทโคนหาง ไกจะแสดงปฏกรยากระดกหางขน พรอมกบดนอวยวะเพศ (รปรางเปนลอนคปลายแหลมยนออกมาจากรทวาร) ซงอวยวะดงกลาวเปนทเกบนาเชอและฉดนาเชอ คนรดอกคนหนงจะใชภาชนะทสะอาดรองรบนาเชอทไหลออกมาดงแสดงในภาพท 3.1 ขอควรระวง กอนรดนาเชอจะตองทาความสะอาดบรเวณทวารดวยนากลนหรอนาสะอาด และใชกระดาษทชชซบ เพอปองกนการปนเปอนจากนา และอจจาระ ซงนาเชอทนามาทาการเกบรกษาจะตองไมปนเปอนจากสงดงกลาว และจะทาการประเมนอตราการเคลอนทของตวอสจของพอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวเปนรายตว โดยนาเชอทจะนามาศกษานนจะตองมอตราการเคลอนทของตวอสจ 75% ขนไป จากนนนานาเชอทรดไดมาผสมรวมกนกอนนาไปศกษาตอไป

15

ภาพท 3.1 การรดนาเชอไก

3.1.2 การประเมนคณภาพน าเชอ

1) การประเมนลกษณะทางกายภาพของน าเชอ ควรสงเกตทนทภายหลงจากการรด

นาเชอ โดยดส ความเขมขน และสงเจอปน เชน อจาระ ปสสาวะ และของเสยอน ๆ โดยนาเชอทจะนามา

ศกษาตองปราศจากสงปนเปอน (อจจาระ และปสสาวะ)

2) การหาความเขมขนของน าเชอ (จ านวนอสจตอหนงมลลลตร) การหาความเขมขน

ของนาเชอหาไดโดยทาการเจอจางนาเชอสดดวยนากลนในอตราสวนนาเชอตอนากลนเทากบ 1: 1,500 เทา

ขณะททาการดดนาเชอควรใชกระดาษทชชซบนาเชอสวนเกนทตดมากบ pipettes tips จากนนทาการนบ

จานวนอสจ โดยใชสไลดสาหรบนบเมดโลหต (heamacytometer counting chamber, ภาพท 3.2 ก)

ภายใตกลอง compound microscope (40X) นบจานวนอสจจากมมบน-ลาง ทง 4 มม และชองตรงกลาง

รวม 5 ชอง (ภาพท 3.2 ข) แลวนามาคานวณหาคาเฉลยจานวนอสจทนบไดตอ 1 มลลลตร ดงน

จานวนอสจ/มลลลตร = (จานวนอสจทนบไดทง 5 บรเวณ/5) × 25 × dilution rate × 104

16

(ก.) (ข.)

ภาพท 3.2 สไลดสาหรบนบเมดโลหต (heamacytometer counting chamber; ก) บรเวณทนบจานวนอสจทง 5 บรเวณ (1, 2, 3, 4 และ 5; ข)

ทมา: http://www.fisheries.go.th/cf-chan/plankton/hema/40-1-clear-400.jpg

3) ศกษาอตราการเคลอนทของอสจ

การศกษาอตราการเคลอนทของอสจมวธการศกษา 2 วธ คอ วธท 1 เปนวธการศกษาอตราการเคลอนทของตวอสจทใชในภาคสนามกอนนานาเชอมาทาการศกษา ทาไดโดยการหยดนาเกลอ 1 หยด (5 ไมโครลตร) ลงบนสไลด และหยดนาเชอ 1 ไมโครลตร จากนนใชไมจมฟนเขยนาเกลอมาแตะกบนาเชอเพยงเลกนอย แลวสงเกตการเคลอนทภายใตกลอง compound microscope (10X) โดยใหเกณฑการเคลอนทของอสจ ดดแปลงจาก Guest (1973) ดงรายละเอยดในตารางท 3.1 โดยนาเชอทจะนามาศกษาการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขงจะตองมการเคลอนทมากกวา 75% ขนไป ตารางท 3.1 หลกเกณฑการสงเกตอตราการเคลอนทของอสจ

ดดแปลงจาก: Guest (1973)

หลกเกณฑ คะแนน การเคลอนท (%) อสจทกตวเคลอนท อสจสวนใหญเคลอนท (3/4) อสจบางตวเคลอนท (2/4) อสจสวนใหญไมเคลอนท มเพยงเลกนอยทเคลอนท (1/4) อสจไมมการเคลอนท

4 3 2 1 0

100 75 50 25 0

17

วธท 2 เปนวธการศกษาอตราการเคลอนทของตวอสจทใชในหองปฏบตการ โดยใชเคร อง Computer Assisted Semen Analysis (CASA) ร น version 10 HTM-IVOS (Hamilton Thorne Biosciences, Beverly, MA, USA) สาหรบประเมนอตราการเคลอนท และลกษณะการเคลอนทของตวอสจแบบตาง ๆ ทาโดยการนานาเชอแชแขงมาเจอจางอกครงดวยสาร extender ทอตราการเจอจาง 1: 15 (Frozen semen: Extender) และใช micropipette ดดตวอยาง 5 ไมโครลตร โหลดลงบน Dual Slide Sperm Analysis ท ป ดด วย Cover Glass (Hamilton Thorne Biosciences, Beverly, MA, USA) ท วางอยบน stage ของเครอง IVOS จากนนเลอน stage เขาไปในเครอง IVOS และทาการวเคราะห โดยมการกาหนดคา Analysis setup ดงแสดงในตารางท 3.2 ตารางท 3.2 คา Analysis setup คา Analysis setup Temperature (˚C) 37.0 Apply sort 0 Frames Acquired 30 Frames rate (Hz) 60 Minimum contrast 25 Minimum Cell Size (pixels) 4 Minimum Static Contrast 15 Straightness (STR) Threshold (%) 80 VAP Cutoff (µm/sec) 5 Prog. Min VAP (µm/sec) 20 VSL Cutoff (µm/sec) 20 Cell Size (pixels) 4 Cell Intensity 50 Static Head Size 0.72-8.82 Static Head Intensity 0.14-1.84 Static Elongation 0-47 Slow Cell Motile Yes Magnification 1.92 Video Frequency 60 Bright Field No Chamber depth (µm) 20 Field Selection Mode Auto

18

4) ศกษาอตราการมชวต การศกษาอตราการมชวตใชเทคนคการยอมสดวย Eosin และ Nigrosin โดยมวธการเตรยมสยอมและขนตอนการศกษาดงน

วธการเตรยมสยอม ชง Eosin B 1 กรม, Nigrosin 5 กรม และ Sodium citrate dehydrate 1.5 กรม ใสในบกเกอร และเตมนากลน 100 มลลลตร โดยใหความรอนขณะเตรยมสาร เพราะสารจะไมละลาย เมอสารละลายเขากนดแลวนาไปกรอง จนไมมตะกอนเหลออย แลวนาสยอมทไดเกบไวในขวดสชาโดยเกบทอณหภมหอง วธการศกษาอตราการมชวตมขนตอนดงน - หยดส Eosin-Nigrosin ลงบนแผนสไลด 1 หยด (5 ไมโครลตร) แลวหยดนาเชอตวอยางขาง ๆ สยอมประมาณ 1 ไมโครลตร - ใชเขมเขยคนนาเชอกบสยอมใหเขากน จากนนใชแผนสไลดอกแผนหนงเกลยนาเชอใหกระจายบาง ๆ โดยเกลยเพยงครงเดยว

- นาแผนสไลดท smear แลว ผงใหแหงในอณหภมหอง - หยดนายาทาเลบลงบนแผนสไลด 1 หยด แลวปดดวย cover slide นาไปสองดภายใต

กลอง compound microscope กาลงขยาย 100 เทา - นบจานวนเซลลตวเปนและตวตายโดยการสมนบ 5 บรเวณ ๆ ละ 20 เซลล โดยทเซลลตวเปนจะมลกษณะสขาวไมตดสยอม สวนตวตายจะตดสยอมเปนสชมพแดงหรอสมวงเขม ดงแสดงในภาพท 3.3

ภาพท 3.3 อสจมชวตมลกษณะสขาว และอสจตายจะตดสชมพแดงหรอสมวงเขม เมอยอม ดวยส Eosin - Nigrosin (ภายใตกลอง compound microscope กาลงขยาย 100 เทา)

ตวเปน ตวตาย

19

5) การประเมนความสมบรณของอะโครโซม และการท างานของไมโตคอนเดรย - การประเมนความสมบรณของอะโครโซมโดยส fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) รวมกบ propidium iodide (PI) โดยทาการละลายนาเชอในนาเยนอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท ดดตวอยางนาเชอปรมาตร 250 ไมโครลตร เตมส FITC-PNA ปรมาตร 5 ไมโครลตร บมในทมดทอณหภมหองนาน 5 นาท หลงบมเตม propidium iodide (PI) ปรมาตร 5 ไมโครลตร จากนนทาการประเมนความสมบรณของอะโครโซม โดยใช Flow cytometer (FACSC alibur; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (ดดแปลงจาก Partyka et al., 2010)

- การประเมนการทางานของไมโตคอนเดรยโดยการยอมส Rhodamine 123 รวมกบ propidium iodide (PI) โดยทาการละลายนาเชอในนาเยนอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท ดดตวอยางนาเชอปรมาตร 250 ไมโครลตร เตมส Rhodamine 123 ปรมาตร 10 ไมโครลตร บมในทมดทอณหภมหองนาน 10 นาท หลงบม เตม PI ปรมาตร 2 ไมโครลตร จากนนทาการประเมนการทางานของไมโตคอนเดรย โดยใช Flow cytometer (FACSCalibur; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (ดดแปลงจาก Partyka et al., 2010)

6) การประเมนระดบการเกดลปดเปอรออกซเดชน โดยประเมนจากปรมาณmaloaldehyde (MDA) ทเกดขน ดวยวธ Thiobarbituric acid reactive substant (TBARS)

นานาเชอแชแขงแตละทรตเมนตมาทาการละลาย (thawed) ในนา 5 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท จากนนทาการตดปลายหลอดแชแขง แลวเทนาเชอลงในหลอด Eppendorf เตรยมอสจใหไดความเขมขน 250 ลานตว หลงจากนนนาไปปนเหวยงดวยเครอง centrifuge ความเรว 1,800g จานวน 2 ครง ครงละ 3 นาท เพอทาการดดเฉพาะอสจทตกตะกอน จากนนทาการเตม ferrous sulfate ปรมาตร 250 ไมโครลตร และ sodium ascrobate ปรมาตร 250 ไมโครลตร และนาตวอยางไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาทาการเตม 15% Trichloroacetic acid ปรมาตร 1,000 ไมโครลตร และ 0.375% Thiobarbituric acid ปรมาตร 1,000 ไมโครลตร และนาไปบมทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จากนนนาทกหลอดมาทาการปนเหวยงดวยเครอง centrifuge เพอนาตะกอนออก ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ความเรว 5,000g เปนเวลา 10 นาท จากนนนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 532 nm ตามวธของ Partyka et al. (2007)

7) การศกษาอตราการผสมตด การศกษาอตราการผสมตดในการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว

แบบแชแขงเปนการศกษาในภาคสนามมวธการศกษาดงน

20

ใชแมไกสายพนธ Isa Brown จากฟารมมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร อายระหวาง 7 เดอน ถง 1 ป จานวน 170 ตว ซงจะทาการผสมเทยม 2 ครง (2 วน/ครง) นาน 1 สปดาห โดยทาการละลายนาเชอ (thawed) ในนาเยนอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท ซบหลอดใหแหงแลวตดปลายเพอถายนาเชอลงในหลอดรบนาเชอทสะอาดและแชอยในนาเยนอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส จากนนใชไซรงคบรรจนาเชอปรมาตร 0.4 มลลลตร สอดเขาชองคลอดลกประมาณ 4 เซนตเมตร และจะเรมทาการเกบไขภายหลงจากการผสมเทยม 1 วนตอเนองเปนระยะเวลา 1 สปดาห โดยจะทาการเกบไขทกวนในชวงบายและนาไขเขาฟกทก ๆ 1 สปดาห ทอณหภม 38 องศาเซลเซยส ซงถาดไขจะวางเอยงทามม 45 องศา และมการกลบไขทก ๆ 1 ชวโมง จากนนตรวจสอบการผสมตดโดยการสองไขทอายฟก 10 วน แลวนาจานวนไขทผสมตดมาคานวณหาอตราการผสมตดจากสตร ดงน อตราการผสมตด = (จานวนไขทผสมตด/จานวนไขทเขาฟก) × 100 3.2 การทดลองท 1 การศกษาผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง

มขนตอนการทดลองดงน 1. ทาการเตรยมสาร extender 8 สตร ไดแก modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake's diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Scharmm ตามสวนประกอบดงแสดงในตารางท 3.3 ทาการวดคา pH ดวยเครอง pH meter และวดคาออสโมลาลตดวยเครอง osmometer ของสาร extender นาสาร extender ทเตรยมไวใสขวดแกวปดฝาใหสนทเกบรกษาไวในตเยนอณหภม 4-5 องศาเซลเซยส 2. เตรยมสาร cryoprotectant 3 ชนด ไดแก DMF, DMA และ DMSO ทระดบความเขมขน 6% โดยใชสาร extender ทเตรยมไวในขอ 1 เปนตวทาละลาย และนาสาร cryoprotectant ทเตรยมไวใสขวดแกวปดฝาใหสนทเกบรกษาไวในตเยนอณหภม 4-5 องศาเซลเซยส 3. นานาเชอสดทมอตราการเคลอนท 75% ขนไปมาเจอจางดวยสาร extender ทมอณหภม 25 องศาเซลเซยส ทเตรยมไวในขอ 1 ในอตราสวนนาเชอสดตอสาร extender เทากบ 1: 2 (diluted milt) ผสมใหเขากนโดยการกลบหลอดไปมาอยางเบา ๆ จากนนทาการลดอณหภมนาเชอจาก 25 องศาเซลเซยส ไปทอณหภม 5 องศาเซลเซยส ใชเวลาประมาณ 1 ชวโมง 4. หลงจากนนเตมสาร cryoprotectant แตละชนด (DMF, DMA และ DMSO) ทระดบความเขมขน 6% โดยใชสดสวน 1: 3 (cryodiluent: diluted milt) ดงแผนการทดลองแสดงในตารางท 3.4-3.6

21

ตารางท 3.3 สวนประกอบทางเคม (g/50 ml) ของสาร extender ทใชเจอจางนาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว

Composition

Dilutent (g/50 ml)

MOE 300 MOE 350 MOE 400 Lake's diluent BPSE IGGKP EK Schramm

Magnesium acetate 0.0400 0.0400 0.0400 0.0584 0.0170 - - 0.0350 Sodium acetate - - - - 0.2150 - - - Potassium citrate 0.2000 0.2000 0.2000 - 0.0340 0.0700 0.0741 - Sodium glutamate 1.0000 1.0000 1.0000 1.0622 0.4884 0.7000 0.7000 1.4250 Dipotassium hydrogen phosphate

- - - - 0.8320 0.4900 - -

Potassium dihydrogen phosphate

- - - - 0.0326 - -

Fructose 0.0988 0.5324 1.0784 0.4000 - - 0.1000 - TES (N-Tris (hydroxy methyl)

1.0000 1.0000 1.0000 - 0.0976 - - - methyl-2-aminoethanesulfonic acid

หมายเหต: Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

22

ตารางท 3.3 สวนประกอบทางเคม (g/50 ml) ของสาร extender ทใชเจอจางนาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาว (ตอ)

Composition

Dilutent (g/50 ml)

MOE 300 MOE 350 MOE 400 Lake's diluent

BPSE IGGKP EK Schramm

Potassium acetate - - - 0.2960 - - - 0.2500

Polyvinylpyroridone (PVP) - - - 0.1500 - - 0.0500 -

Glucose - - - - 0.2500 0.4500 0.3500 0.2500

Sodium dihydrogen phosphate

- - - - - 0.1050 0.1050 -

Inositol - - - - - 0.4500 0.3500 0.1250

Protamine sulfate - - - - - - 0.0100 -

Anhydrous sodium hydrogen phosphate

- - - - - - 0.4900 -

Osmolarity (mOsmol/kg) 303±1.73 353±2.00 404±1.73 370±0.67 394±0.67 369±0.33 414±0.67 415±0.33

pH 7.44±0.02 7.45±0.01 7.42±0.03 7.04±0.01 7.65±0.03 7.25±0.01 7.26±0.02 6.96±0.01

หมายเหต: Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

23

ตารางท 3.4 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMF ทระดบความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเช อไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลองแบบ CRD

กลมการทดลอง

สาร extender

อตราการ เคลอนทรวม

(%)

อตราการเคลอนท ไปขางหนา

(%)

อตราการ มชวต (%)

ความสมบรณของ อะโครโซม

(%)

การท างานของ ไมโตคอนเดรย

(%)

อตราการ ผสมตด (%)

1 modified extender 300 mOsm kg-1

2 modified extender 350 mOsm kg-1

3 modified extender 400 mOsm kg-1

4 Lake’ diluent 5 BPSE 6 IGGKP 7 EK 8 Scharmm

9 นาเชอสด (กลมควบคม)

24

ตารางท 3.5 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMA ทระดบความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเช อไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลองแบบ CRD

กลมการทดลอง

สาร extender

อตราการ เคลอนทรวม

(%)

อตราการเคลอนท ไปขางหนา

(%)

อตราการ มชวต (%)

ความสมบรณของ อะโครโซม

(%)

การท างานของ ไมโตคอนเดรย

(%)

อตราการ ผสมตด (%)

1 modified extender 300 mOsm kg-1 2 modified extender 350 mOsm kg-1 3 modified extender 400 mOsm kg-1 4 Lake’ diluent 5 BPSE 6 IGGKP 7 EK 8 Scharmm

9 นาเชอสด (กลมควบคม)

25

ตารางท 3.6 แผนการทดลองการศกษาสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) รวมกบการใช DMSO ทระดบความเขมขน 6% เปนสาร cryoprotectant ตอการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยวางแผนการทดลองแบบ CRD

กลมการทดลอง

สาร extender

อตราการ เคลอนทรวม (%)

อตราการเคลอนท ไปขางหนา

(%)

อตราการ มชวต (%)

ความสมบรณของ อะโครโซม

(%)

การท างานของ ไมโตคอนเดรย

(%)

อตราการ ผสมตด (%)

1 modified extender 300 mOsm kg-1 2 modified extender 350 mOsm kg-1 3 modified extender 400 mOsm kg-1 4 Lake’ diluent 5 BPSE 6 IGGKP 7 EK 8 Scharmm

9 นาเชอสด (กลมควบคม)

26

ขนตอนและกระบวนการเกบรกษาน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขงดวยวธองไอไนโตรเจนเหลว มดงน 1. ใช micropipette ดดนาเชอปรมาตร 490 ไมโครลตร ใสหลอดแชแขง (French straw ขนาด 500 ไมโครลตร) แลวปดหลอดแชแขงโดยใชผงอด polyvinyl alcohol (PVA) ซงหลงจากการเตมสาร cryoprotectant จะเรมจบเวลาจนถงการนาหลอดนาเชอวางลงในตระแกรงทวางอยเหนอไนโตรเจนเหลว โดยใชเวลาประมาณ 15 นาท

2. การเตรยมอปกรณองไอไนโตรเจนเหลว ทาไดโดยการบรรจไนโตรเจนเหลวสง 8 เซนต เมตร ลงในกลองโฟมขนาด 28 × 38 × 29 เซ น ต เม ต ร จ าก น น น า ต ะแ ก รง ว า ง เห น อไนโตรเจนเหลวทระดบ 11 เซนตเมตร นา straws วางลงบนตะแกรงและจบเวลา โดยใชอตราการลดอณหภมทระดบเหนอไอไนโตรเจนเหลว 11 เซนตเมตร (12 นาท) และทระดบเหนอไอไนโตรเจนเหลว 3 เซนตเมตร (5 นาท) จากนนจมตระแกรงทมตวอยางนาเชอแชแขงลงในไนโตรเจนเหลว (-196 องศาเซลเซยส) และเกบตวอยางลงในถงเกบนาเชอ (-196 องศาเซลเซยส) (เทวนทร และยพน, 2550) เพอเกบรกษานาเชอ และรอการทดสอบหาอตราการเคลอนทรวม อตราการเคลอนทไปขางหนา ความสมบรณของอะโครโซม การทางานของไมโตคอนเดรย และอตราการผสมตดของนาเชอแชแขงตอไป

การวเคราะหขอมลทางสถต กอนการวเคราะหขอมลทางสถตนาขอมลอตราการเคลอนทรวม, อตราการเคลอนทไปขางหนา, อตราการมชวต, ความสมบรณของอะโครโซม, การทางานของไมโตคอนเดรย และอตราการผสมตดไป Transformed โดยใชวธ Arcsine Transformation จากนนวเคราะหคาความแปรปรวน (ANOVA) ตามแผนการทดลองแบบ CRD และวเคราะหความแตกตางคาเฉลยระหวางทรทเมนตดวยวธ Duncan’s new multiple rang test ทระดบความเชอมน 95% โดยใชโปรแกรม SPSS Version 10

3.3 การทดลองท 2 ศกษาชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง 1. การเตรยมสาร extender และสาร cryoprotectant ทใหผลอตราการผสมตดสงทสดจากการทดลองท 1 ไดแก EK และ 6%DMF และทาการเสรมชนดของสาร antioxidant ทระดบความเขมขนตาง ๆ ดงน

- วตามนอ ทระดบความเขมขน 1.16, 2.32 และ 3.48 mM (ในรป water soluble) - Cysteine ทระดบความเขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM

- Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM

27

โดยการนาสาร antioxidant แตละชนด ทระดบความเขมขนตาง ๆ ผสมลงในสาร extender (EK) จากนนใสขวดแกวปดฝาใหสนทเกบรกษาไวในตเยนอณหภม 4-5 องศาเซลเซยส โดยการทดลองนจะมกลมควบคม คอ extender ทไมมการเสรม antioxidant และนาเชอสด ดงแผนการทดลองแสดงในตารางท 3.7 ขนตอนการทดลองดงแสดงในแผนภาพ 3.4 นา straw มาละลายทอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส (5 นาท) เพอทาการประเมนอตราการเคลอนทรวม อตราการเคลอนทไปขางหนา อตราการมชวต อตราการผสมตดของนาเชอแชแขง และ ประสทธภาพในการลดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนจากการวดระดบของ malondialdehyde (MDA)

ภาพท 3.4 กระบวนการเกบรกษานาเชอไกพนเมองพนธสายเหลองหางขาวทมการเสรมสาร antioxidant ลงในสาร extender กอนเขาสกระบวนการเกบรกษานาเชอแชแขง

อตราการเคลอนทเกน 75% มา pooled รวมกน

สมบรณพนธ เจอจางนาเชอดวยสาร extender ทมการเสรมสาร antioxidant

อตราการเคลอนท นอยกวา 75%

คดทง ผสมนาเชอกบสาร cryoprotectant

equilibration time เปนเวลา 15 นาท พรอมดดตวอยางใสใน straws และปด straws

บรรจไนโตรเจนเหลวสง 8 เซนตเมตร ลงในกลองโฟมขนาด 28 × 38 × 29 เซนตเมตร

นา straws วางลงบนตะแกรง และนาตระแกรงวางเหนอไนโตเจนเหลว 11 เซนตเมตร (12 นาท) และ 3 เซนตเมตร (5 นาท)

คดเลอกไกพนเมองพนธเหลองหางขาวตวผทมลกษณะตรงตามสายพนธและสมบรณพนธสมบรณ

พนธ เกบนาเชอไกพนเมองพนธเหลองหางขาว และตรวจคณภาพ

น ำเชอ

สมบรณพนธ ตรวจการเคลอนทของอสจ

สมบรณพนธ

นา straw มาละลายทอณหภม 2-5 องศาเซลเซยส (5 นาท) เพอทาการประเมนอตราการเคลอนทรวม, อตราการเคลอนทไป

ขางหนา, อตราการมชวต, อตราการผสมตดของนาเชอแชแขง และ ประสทธภาพในการลดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนจาก

การวดระดบของ malondialdehyde (MDA)

28

ตารางท 3.7 แผนการทดลองการศกษาผลของสาร antioxidant 3 ชนด 3 ระดบความเขมขน วตามนอ (1.16, 2.32 และ 3.48 mM) Cysteine (0.5, 1.0 และ 5.0 mM) และ Glutathione (0.025, 0.05 และ 0.1 mM) ตอคณภาพของนาเชอทเกบรกษาแบบแชแขงในไกพนเมองพนธเหลอง หางขาวโดยวางแผนการทดลองแบบ CRD

กลมการ

ทดลอง antioxidant

ระดบความเขมขน (mM)

อตราการ

เคลอนทรวม (%)

อตราการเคลอนท

ไปขางหนา (%)

อตราการ มชวต (%)

อตราการผสมตด (%)

ปรมาณ MDA

(nmol/ml)

1

วตามนอ

1.16

2 2.32

3 3.48

4

Cysteine

0.5

5 1.0

6 5.0 7

Glutathione

0.025

8 0.05

9 0.1

10 นาเชอแชแขงไมเตม antioxidant (กลมควบคม)

11 นาเชอสด (กลมควบคม)

การวเคราะหขอมลทางสถต กอนการวเคราะหขอมลทางสถตนาขอมลอตราการเคลอนทรวม, อตราการเคลอนทไปขางหนา, อตราการมชวต, อตราการผสมตด และประสทธภาพในการลดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนจากการวดระดบของ malondialdehyde (MDA) ไป Transformed โดยใชวธ Arcsine Transformation จากนนวเคราะหคาความแปรปรวน (ANOVA) ตามแผนการทดลองแบบ CRD และวเคราะหความแตกตางคาเฉลยระหวางทรทเมนตดวยวธ Duncan’s new multiple rang test ทระดบความเชอมน 95% โดยใชโปรแกรม SPSS Version 10

บทท 4 ผลการศกษา

4.1 ผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

จากการศกษาผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ทมผลตอการเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชแขง โดยแบงเปน 3 กลมการทดลองยอยตามชนดของสาร cryoprotectant (DMF, DMA และ DMSO) ทระดบความเขมขน 6% รวมกบสาร extender 8 ชนด (สาร modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ 300, 350, 400 mOsm kg-1, Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และ Schramm) โดยใชวธการลดอณหภมแบบองไอไนโตรเจนเหลว และประเมนคณภาพของนาเชอแชแขงจากอตราการเคลอนท, อตราการมชวต, อตราการผสมตด, ความสมบรณของอะ โคร โซม ด วย ส fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) รวมกบ propidium iodide (PI) และการทางานของไมโตคอนเดรย ดวยส Rhodamine 123 รวมกบ propidium iodide (PI)

การใช DMF เปนสาร cryoprotectant พบวา เมอใช 6% DMF รวมกบ EK ใหอตราการผสมตดสงสด เทากบ 42.37±1.45% (46% ของนาเชอสด) ซงสอดคลองกบผลการประเมนความสมบรณของอะโครโซมพบอสจมชวตและอะโครโซมสมบรณ (PI-PNA-) (51.00±3.21%) และการทางานของไมโตรคอน เดรยสมบรณ (PI-R123+) (52.00±3.79%) สงทสดเมอเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.01) และเมอใช EK modified extender ทม คาออสโมลาลต ทระดบ 350 และ 400 mOsm kg-1, BPSE, IGGKP และ Schramm ใหผลอตราการเคลอนทรวม และอตราการเคลอนทไปขางหนาไมแตกตางกน (P>0.05) เมอใช modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบ 350 mOsm kg-1, EK และ Schramm พบวา ใหผลอตราการมชวตสงกวาทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) ดงแสดงในตารางท 4.1 และ 4.2

การใช DMA เปนสาร cryoprotectant พบวา เมอใช 6% DMA รวมกบ Lake’s diluent ใหผลอตราการผสมตดเทากบ 11.76±5.88% (10% ของนาเชอสด) ไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (P>0.05) แตเมอใช modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบ 350 mOsm kg-1 พบอตราการเคลอนทรวม (40.33±2.33%), อตราการเคลอนทไปขางหนา (21.33±1.76%) และอตราการมชวต (42.00±2.31%) สงสดเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ แตพบอสจมชวตและอะโครโซมสมบรณ (PI-PNA-) เพยง 3% และพบอสจมชวตแตอะโครโซมถกทาลาย (PI-PNA+) มากถง 52% ยงพบความสมบรณของการทางานไมโตรคอนเดรย (PI-R123+) เพยง 8% ดงแสดงในตารางท 4.3 และ 4.4 การใช DMSO เปนสาร cryoprotectant พบวา เมอใช 6% DMSO รวมกบ BPSE พบผลอตราการผสมตดเทากบ 2.08±2.08% (1% ของนาเชอสด) ซงใหอตราการผสมตดไมแตกตางจากทรทเมนตอน ๆ ทใชในการศกษา (P>0.05) แตเมอใช modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบ 350 mOsm kg-

30

1 มอตราการเคลอนทรวม (53.33±4.33%), อตราการเคลอนทไปขางหนา (17.00±1.73%) และอตราการมชวต (52.00±1.73%) สงสดเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) แตพบมอสจทมชวตและมอะโครโซมสมบรณ (PI-PNA-) เพยง 3% และมอสจมชวตแตอะโครโซมถกทาลาย (PI-PNA+) มากถง 46% และพบความสมบรณของทางานไมโตรคอนเดรย (PI-R123+) เพยง 10% ดงแสดงในตารางท 4.5 และ 4.6 ตารางท 4.1 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMF ตอคณภาพนาเชอแชแขงไกพนเมอง พนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

หมายเหต: Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1 ตวอกษรทตางกนในแตคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05)

ตวเลขในวงเลบ คอ เปอรเซนตของนาเชอสด

สาร extender อตราการ

เคลอนทรวม (%)

อตราการเคลอนทไปขางหนา

(%)

อตราการมชวตรอด

(%)

อตราการผสมตด (%)

MOE 300 29.67±1.86cd 12.67±1.45c 26.00±2.08d 1.75±1.75d

(0.64)

MOE 350 46.67±2.85b 22.33±2.40b 50.00±1.73b 2.38±2.38d (0.88)

MOE 400 37.00±2.65bc 22.67±0.88b 37.67±1.45c 5.38±0.26cd (5.81)

Lake's diluent 26.00±2.89d 12.00±1.15c 24.00±1.53d 8.77±4.64cd

(6.42)

BPSE 36.33±2.60bc 22.33±1.86b 38.00±2.08c 18.29±2.11c

(19.65)

IGGKP 44.67±5.49b 16.33±3.18bc 36.00±2.65c 14.52±1.73c

(15.58)

EK 43.67±2.33b 21.67±0.67b 51.00±0.58b 42.37±1.45b

(45.75)

Schramm 46.00±3.06b 22.00±3.06b 46.67±2.40b 20.26±2.66c

(21.74)

Control (นาเชอสด) 93.33±2.03a 38.33±2.85a 92.33±1.45a 89.03±4.44a

(100.00)

31

ตารางท 4.2 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMF ตอความสมบรณของอะโครโซมและการทางานของไมโตคอนเดรยของนาเชอแชแขงไกพนเมองพนธ เหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

extender

Acrosome integrity(%) Mitochondrial activity (%)

LIA (PI-PNA-)

LRA (PI-PNA+)

DIA (PI+PNA-)

DRA (PI+PNA+)

Mitochondria functional (PI-R123+)

Dead Sperm (PI+R123+)

MOE 300 1.33±0.88e 24.67±0.88cd 20.00±0.58bc 54.00±1.00a 12.67±1.20ef 37.33±1.20ab

MOE 350 5.67±1.76de 43.33±3.53a 15.00±1.73bc 36.00±3.61c 13.00±2.00ef 37.00±2.00ab

MOE 400 6.67±2.73d 42.33±0.33a 13.67±2.19c 37.33±1.86bc 7.67±1.45f 42.33±1.45a

Lake's diluent 13.33±2.33de 31.00±2.08bc 19.00±1.73bc 40.00±0.57bc 15.33±1.86ef 34.67±1.86b

BPSE 6.00±2.08de 26.00±3.06cd 29.00±0.58a 39.00±1.52bc 18.67±1.20e 31.33±1.20b

IGGKP 14.00±2.08d 40.33±3.38ab 23.00±3.00ab 22.67±3.84d 31.33±1.20d 18.67±1.20c

EK 51.00±3.21b 15.33±2.33d 20.67±1.20abc 3.00±0.58e 52.00±3.79b 5.33±1.45de

Schramm 23.67±1.86c 17.33±3.38d 12.67±3.48cd 46.33±3.52ab 40.33±0.88c 9.67±0.88d

Control (นาเชอสด) 91.33±0.88a 3.00±1.53e 4.67±1.45d 1.67±0.33e 90.33±1.45a 3.67±0.67e

หมายเหต: ตวอกษรทตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.01) LIA; Live with intact acrosome LRA; Live with ruptured acrosome, DIA; Dead with intact acrosome DRA; Dead with ruptured acrosome FITC-PNA; fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin R123; Rhodamine 123 PI; propidium iodide ; Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

32

ตารางท 4.3 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMA ตอคณภาพนาเชอแชแขงไกพนเมอง พนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

หมายเหต: ตวอกษรทตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) ตวเลขในวงเลบ คอ เปอรเซนตของนาเชอสด Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

สาร extender อตราการ

เคลอนทรวม (%)

อตราการเคลอนทไป

ขางหนา (%)

อตราการมชวตรอด

(%)

อตราการ ผสมตด (%)

MOE 300 25.33±3.28c 12.00±2.08de 24.00±2.31de 5.83±3.63b

(4.44)

MOE 350 40.33±2.33b 21.33±1.76b 42.00±2.31b 0.00±0.00b (0.00)

MOE 400 31.00±1.00c 17.33±1.20bc 26.00±2.08d 0.00±0.00b (0.00)

Lake's diluent 31.33±2.73c 14.33±1.33cd 32.33±1.45c 11.76±5.88b

(9.55)

BPSE 14.67±1.45d 8.67±0.67e 10.67±0.67f 6.30±3.87b

(4.82)

IGGKP 3.67±1.45e 0.00±0.00g 8.33±0.88f 5.26±5.26b

(2.17)

EK 14.67±2.03d 4.33±0.33f 19.00±2.00e 6.67±4.41b

(5.00)

Schramm 31.67±0.67c 8.67±1.45e 29.67±1.45cd 5.88±5.88b

(2.44)

Control (นาเชอสด) 93.33±2.03a 38.33±2.85a 92.33±1.45a 82.22±4.41a

(100.00)

33

ตารางท 4.4 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMA ตอความสมบรณของอะโครโซมและการทางานของไมโตคอนเดรยของนาเชอแชแขงไกพนเมองพนธ เหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

extender

Acrosome integrity (%) Mitochondrial activity (%)

LIA (PI-PNA-)

LRA (PI-PNA+)

DIA (PI+PNA-)

DRA (PI+PNA+)

Mitochondria functional (PI-R123+)

Dead Sperm (PI+R123+)

MOE 300 4.00±1.15d 32.67±2.91b 15.67±2.60c 55.67±2.33a 11.33±0.88bcd 38.67±0.88abcd

MOE 350 2.67±0.88d 51.67±2.03a 19.67±0.88bc 24.33±1.86c 8.00±0.58cd 42.00±0.58abc

MOE 400 4.33±0.67d 38.33±2.40b 14.00±2.31c 50.00±1.00ab 5.33±0.33d 44.67±0.33a

Lake's diluent 11.33±0.88c 34.00±1.53b 25.67±2.33ab 32.33±1.67c 17.33±1.45b 32.67±1.45d

BPSE 5.33±1.45d 34.00±2.52b 30.67±0.88a 30.00±1.73c 11.67±1.86bcd 38.33±1.86bcd

IGGKP 12.00±1.15bc 49.33±1.45a 25.00±1.00ab 13.67±1.76d 7.00±1.53d 43.00±1.53ab

EK 5.33±1.45d 14.33±0.88c 22.00±1.73bc 58.33±2.96a 13.67±0.88bc 36.33±0.88cd

Schramm 17.00±2.00b 22.67±2.40c 16.33±2.73c 44.00±3.21b 15.33±2.73b 34.67±2.73d

Control (นาเชอสด) 91.33±0.88a 3.00±1.53d 4.67±1.45d 1.67±0.33e 90.33±1.45a 3.67±0.67e

หมายเหต: ตวอกษรทตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.01) LIA; Live with intact acrosome LRA; Live with ruptured acrosome, DIA; Dead with intact acrosome DRA; Dead with ruptured acrosome FITC-PNA; fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin R123; Rhodamine 123 PI; propidium iodide; Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

34

ตารางท 4.5 ผลของสาร Extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMSO ตอคณภาพนาเชอแชแขงไกพนเมอง พนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

หมายเหต: ตวอกษรทตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) ตวเลขในวงเลบ คอ เปอรเซนตของนาเชอสด; Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

สาร extender

อตราการเคลอนทรวม

(%)

อตราการเคลอนทไปขางหนา

(%)

อตราการมชวตรอด

(%)

อตราการ ผสมตด (%)

MOE 300 28.67±1.20d 8.00±1.15c 22.67±1.76d

0.00±0.00b

(0.00)

MOE 350 53.33±4.33b 17.00±1.73b 52.00±1.73b

0.00±0.00b (0.00)

MOE 400 38.33±2.19c 13.67±0.67b 35.00±2.08c

0.00±0.00b (0.00)

Lake's diluent 11.67±0.33f 4.00±0.58de 12.00±1.15e 0.00±0.00b

(0.00)

BPSE 18.00±1.00e 7.33±2.03cd 24.00±2.08d 2.08±2.08b

(0.79)

IGGKP 6.33±1.67g 0.33±0.33f 10.00±1.73e 0.00±0.00b

(0.00)

EK 18.67±1.76e 5.00±1.00cd 20.33±0.88d 0.00±0.00b

(0.00)

Schramm 7.33±1.86fg 1.67±0.33e 13.67±2.33e 0.00±0.00b

(0.00)

Control (นาเชอสด) 93.33±2.03a 38.33±2.85a 92.33±1.45a 88.13±2.66a (100.00)

35

ตารางท 4.6 ผลของสาร extender 8 ชนด รวมกบ 6% DMSO ตอความสมบรณของอะโครโซมและการทางานของไมโตคอนเดรยของนาเชอแชแขงไกพนเมอง พนธเหลองหางขาวทเกบรกษาแบบแชแขง (Mean±SE)

Extender

Acrosome integrity (%) Mitochondrial activity (%)

LIA (PI-PNA-)

LRA (PI-PNA+)

DIA (PI+PNA-)

DRA (PI+PNA+)

Mitochondria function

(PI-R123+)

Dead Sperm (PI+R123+)

MOE 300 2.33±0.33c 27.33±3.53bc 29.00±2.00a 41.33±5.49c 6.33±1.86cd 43.67±1.86ab

MOE 350 3.33±1.20c 45.67±3.48a 24.67±0.88ab 26.33±3.76d 9.67±0.67bcd 40.33±0.67abc

MOE 400 2.67±0.33c 29.33±3.38b 17.00±1.53c 51.00±1.53c 6.00±2.08cd 44.00±2.08ab

Lake's diluent 1.33±0.33c 14.00±1.15de 11.00±0.58d 73.67±1.20b 5.33±0.33cd 44.67±0.33ab

BPSE 13.00±1.15b 22.00±1.73bcd 22.00±2.00bc 43.00±4.73c 14.67±1.86b 35.33±1.86c

IGGKP 1.33±0.33c 39.67±2.73a 11.33±1.45d 47.67±4.48c 12.33±1.76bc 37.67±1.76bc

EK 0.33±0.33c 17.33±0.88cde 0.67±0.33e 82.00±1.15ab 5.33±2.73cd 44.67±2.73ab

Schramm 1.00±0.58c 11.00±1.15ef 0.33±0.33e 87.67±0.33a 3.33±1.76d 46.67±1.76a

Control (นาเชอสด) 91.33±0.88a 3.00±1.53f 4.67±1.45e 1.67±0.33e 90.33±1.45a 3.67±0.67d

หมายเหต: ตวอกษรทตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.01) LIA; Live with intact acrosome LRA; Live with ruptured acrosome, DIA; Dead with intact acrosome DRA; Dead with ruptured acrosome FITC-PNA; fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin R123; Rhodamine 123 PI; propidium iodide; Modified extender (MOE) หนวย mOsm kg-1

36

4.2 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

จากการศกษาผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการ เกบรกษาแบบแชแขง พบวา การเสรมวตามนอทกระดบความเขมขนใหผลอตราการผสมตดสงทสด เมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ แตตาและแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตกบนาเชอสด (P<0.05) และใหผลการเกดปรมาณของ MDA ตาทสดเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) ยกเวนการเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 2.32 mM สงผลใหอตราการเคลอนทรวม, อตราการเคลอนทไปขางหนา และอตราการมชวตสงทสดเมอเปรยบเทยบกบทรทเมนตอน ๆ (P<0.05) นอกจากนยงพบวา การเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 5.0 mM ใหอตราการผสมตดตาทสดเพยง 38% ของนาเชอสด และใหผลการเกดปรมาณของ MDA สงทสดเทากบ 30.35±0.75 nmol/50x106 spz. ซงแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตกบทรทเมนตอน ๆ ททาการศกษา (P<0.05) ดงแสดงในตารางท 4.7 และ ภาพท 4.1

37

ตารางท 4.7 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบการใช EK+ 6%DMF ตอคณภาพของนาเชอไกพนเมองพนธเหลองหางขาวทมการเกบรกษาแบบแชแขง

สาร antioxidant

ระดบความเขมขน (ml)

อตราการเคลอนทรวม

(%)

อตราการเคลอนทไปขางหนา

(%)

อตราการมชวตรอด

(%)

อตราการผสมตด (%)

Vitamin E

1.16 53.67±1.85c 27.67±1.45c 44.33±1.20def 59.92±2.21b

(61.87)

2.32 68.00±3.46b 39.33±2.91b 54.00±2.65b 63.02±5.26b

(65.19)

3.48 45.67±1.20def 22.00±1.73efg 41.67±1.45fg 57.80±1.13b

(59.66)

Cysteine

0.5 49.67±3.48f 26.00±0.33fg 48.67±0.88cd 42.34±2.66cd

(43.68)

1.0 50.67±2.33cd 25.00±1.00cde 53.33±0.88bc 52.53±3.91bc

(54.05)

5.0 39.67±1.67cd 18.67±0.67g 43.33±1.76ef 36.56±1.93d (37.72)

Glutathione

0.025 48.67±2.40cde 26.67±0.67cd 48.67±0.88cd 42.50±3.82cd

(43.82)

0.05 41.00±1.53ef 18.67±0.33g 47.00±1.73de 40.11±3.12cd

(41.36)

0.1 43.33±2.85def 18.33±1.67g 38.00±1.15g 39.58±2.08cd (40.84)

Control (Frozen sperm without

antioxidant ) 44.33±0.67def 22.67±1.33def 47.67±1.20de 45.35±0.80cd

(46.81)

Control (Fresh sperm)

91.33±0.33a 44.33±1.45a 94.67±0.88a 95.40±2.31a (100.00)

หมายเหต: ตวอกษรทแตกตางกนในแตละคอลมนแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) ตวเลขในวงเลบ คอ เปอรเซนตของนาเชอสด

38

ภาพท 4.1 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบการใช EK+6%DMF ตอปรมาณการเกด malondialdehyde (MDA) ในนาเชอไก พนเมองพนธเหลองหางขาวทมการเกบรกษาแบบแชแขง หมายเหต: ตวอกษรทแตกตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05)

บทท 5 วจารณ สรป และขอเสนอแนะ

5.1 ผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

จากการศกษาชนดของสาร extender ทงหมด 8 ชนด ไดแก สาร modified extender ทมคาออสโมลาลตทระดบตาง ๆ (300, 350 และ 400 mOsm kg-1), Lake’s diluent, BPSE, IGGKP, EK และSchramm รวมกบสาร cryoprotectant 3 ชนด ไดแก DMF, DMA, DMSO ทระดบความเขมขน 6% โดยใชวธการลดอณหภมแบบองไอไนโตรเจนเหลว พบวา เมอใช DMF เปนสาร cryoprotectant รวมกบ EK ใหผลอตราการปฏสนธสงทสด (46%) ซงสอดคลองกบผลการประเมนความสมบรณของอะโครโซม การท างานของไมโตรคอนเดรย, อตราการเคลอนท และอตราการมชวต พบวา 6% DMF รวมกบ EK ใหเปอรเซนตการประเมนดงกลาวสงทสด ซงจากการรายงานของ Surai and Wishat (1996) ไดมการรายงานถงการศกษาชนดของสาร cryoprotectant และพบวาโดยทวไปการใช DMF และ DMA ในการเปนสาร cryoprotectant นนสงผลดตอคณภาพน าเชอสตวปกมากกวาการใช DMSO ในการเปนสาร cryoprotectant และทงนยงมปจจยมาจากคาของแรงดนออสโมตกของสาร extender โดย EK extender มคาออสโมลาลต (414±0.67 mOsm kg-1) สงกวาน าเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทท าการศกษา (340.00±0.58 mOsm kg-1) ฉะนน EK extender จงจดวามคณสมบตเปน hypertonic solution (hyper-osmotic) และจากผลการศกษาในครงนสอดคลองกบการรายงานของ Surai and Wishat (1996) ไดมการรายงานวา สวนประกอบของสาร extender ทแตกตางกนในแตละชนดมความส าคญนอยกวาคาแรงดนออสโมตกของสารละลาย โดยคาแรงดนออสโมตกของสารละลายนนควรมคณสมบตเปน hypertonic solution (hyper-osmotic) และควรมคาความเปน hyper-osmotic อยในชวงประมาณ 50-100 mOsm kg-1 เมอเปรยบเทยบกบคาออสโมตกภายใน seminal plasma ของสตวปกแตละสายพนธ และจากการรายงานของ Siudzinska and Lukaszewicz (2008) พบวา สาร extender ทมคณสมบตเปน hyper-osmotic เหมาะสมกบการเกบรกษาน าเชอไกสายพนธ Green-Legged Partridge, สายพนธ Black Minorca, สายพนธ White Crested Black Polish และสายพนธ Italian Partridge โดยจะสงผลใหมการเปลยนแปลงโครงสรางของตวอสจแบบคอโคงงอต ากวาสาร extender ทมคณสมบตเปน isosmotic และ hypo-osmotic และ Giesen and Sexton (1983) ไดมการเสนอแนะวาการใชสาร extender ทมคณสมบตเปน hyper-osmotic นนสามารถเพมอตราการมชวตของอสจไกงวงได ซงสอดคลองกบ Lukaszewicz (2002) พบวา extender สตร EK ใหผลดตอการเกบรกษาน าเชอหาน โดยคาออสโมลาลตทเหมาะสมส าหรบการเกบรกษาน าเชอสตวปกจะอยในชวงระหวาง 250-460 mOsm kg-1 (Siudzinska and Lukaszewic, 2008) นอกจากน สวนประกอบของสาร extender สตร EK มสวนประกอบของแหลงน าตาลคอนขางสงเพอใชเปนแหลงพลงงานใหแกตวอสจ ซงในสวนประกอบจะม

40

แหลงของน าตาล ไดแก glucose, fructose และ inositol อกทง extender สตร EK ยงม PVP ในสวนประกอบ ซง PVP มคณสมบตเปนสาร cryoprotectant ทออกฤทธภายนอกเซลล จงท าใหเซลลอสจไดรบการปกปองเมอเกบรกษาในสภาพทเยน

ในขณะทการใช DMA เปนสาร cryoprotectant พบวา เมอใช 6% DMA รวมกบ Lake’s diluent ใหผลอตราการผสมตดเพยง 10% ของน าเชอสด ซงต ากวา DMF รวมกบ EK ทงนอาจเนองมาจากอทธพลรวมของการท างานของสาร extender สาร cryoprotectant และวธการแชแขงน าเชอ ซงจากการรายงานของทพยสดา (2556) พบอทธพลรวมกนระหวางชนดของสาร extender กบชนดของสาร cryoprotectant ซงอทธพลเหลานจะสงผลตอคณภาพของน าเชอได ทงนอาจเนองมาจากการท างานรวมกนระหวางสาร extender และสาร cryoprotectant ตางชนดกน มผลตอการเพมแรงดนออสโมตกทแตกตางกน นอกจากนยงมการรายงานถงการใช DMA ประสบผลส าเรจในการเกบรกษาน าเชอไกดวยวธการแชแขงแบบเมด โดยการศกษาของ Tseluntin et al. (1999) พบวา เมอใช DMA ทระดบความเขมขน 6% รวมกบ Lake’s diluted ในการเกบรกษาน าเชอไกสายพนธการคา (type I 99) ดวยวธแชแขงแบบเมด สงผลใหเปอรเซนตการผสมตดสงทสดและไมแตกตางจากกลมควบคม (P>0.05) ซงสอดคลองกบการศกษาของ Chalah et al. (1999) พบวา การใช 6% DMA รวมกบ Lake’s diluents ดวยวธแชแขงแบบเมด สงผลใหอตราการผสมตดสงขนเชนเดยวกน

การใช DMSO เปนสาร cryoprotectant พบวา เมอใช 6% DMSO รวมกบ BPSE ใหอตราการผสมตดสงสดเพยง 1% ของน าเชอสด ทงนเนองมาจาก DMSO อาจเปนพษตอเซลลอสจ ซงสอดคลองกบเทวนทร และคณะ (2547) พบวา การใช ethylene glycol และ DMSO ระดบความเขมขน 2% มผลเสยตออตราการผสมตดของน าเชอภายหลงการผสมเทยม การใช DMSO โดยทวไปแลวหากแชแขงน าเชอโดยเทคนคของ Bletsville มกใช DMSO ทระดบความเขมขน 4-4.5% อยางไรกตามในการแชแขงน าเชอเปด Han et al. (2005) พบวา การใช DMSO ทระดบความเขมขน 10% ใหผลดตอคณภาพน าเชอ โดยความเขมขนของการใช DMSO นนอาจขนกบวธการในการเกบรกษาน าเชอทแตกตางกนหรอความแตกตางของชนดพนธ และสายพนธของสตว

5.2 ผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพนาเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง จาการศกษาการเสรมสาร antioxidant 3 ชนด และ 3 ระดบความเขมขน ไดแก วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.32 และ 3.48 mM Cysteine ทระดบความเขมขน 0.5, 1.0 และ5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM ในการศกษานท าการเลอกสาร extender และสาร cryoprotectant (EK + 6% DMF) ทใหอตราการผสมตดสงทสดจากการทดลองท 1 มาท าการเสรมสาร antioxidant ดงกลาว เพอเพมประสทธภาพของน าเชอแชแขงใหมประสทธภาพสงสด โดยจาก

41

ผลการศกษา พบวาการเสรมวตามนอทง 3 ระดบความเขมขน (1.16, 2.32 และ 3.48 mM) ใหอตราการผสมตดสงถง 59 – 65% ของน าเชอสด และสามารถลดการปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนลงไดมากกวาการเสรม Cysteine และ Glutathione ทงนเนองมาจากวตามนอเปนวตามนทละลายไดดในไขมน และมบทบาทส าคญในการหยดสายปฏกรยาการเกดสารอนมลอสระ (Chain-breaking antioxidant) จงเกดปฏกรยาและท าหนาทไดดในบรเวณเยอหมเซลล ซงองคประกอบของเยอหมเซลลอสจของไกจะประกอบดวย กรดไขมนไมอมตวสายยาว (Polyunsaturated fatty acid) เปนสวนประกอบหลก ซงในไกจะม phospholipids ประกอบอยในอสจมากถง 66.4-70.7% ของไขมนทงหมด (Cerolini et al., 1997a; Kelso et al., 1997a; Surai et al., 2000a) การทโครงสรางของเซลลอสจของไก ประกอบดวย กรดไขมนไมอมตวสายยาวเปนจ านวนมากนจงไวตอการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนท าใหเกดความเสยหายตอโครงสรางเซลลอสจไดสง (Breque et al., 2003) ซงเมอเซลลอสจทมชวตถกเกบอยในสภาวะทใชออกซเจน เชน ระหวางการแชเยน, แชแขง และละลายตวอสจภายหลงการแชแขง กระบวนการเหลานตองการออกซเจนเพอไปชวยในกระบวนการสนดาป แตอยางไรกตามผลตผลจากการสนดาปออกซเจนทมากเกนไป คอ Reactive Oxygen Species (ROS) จะเปนสาเหตท าใหโครงสรางเซลลอสจเกดความเสยหายและตายได และในกระบวนการแชแขงน าเชอ พบวาปรมาณ ROS เพมขน นนมความเกยวของทางสรรวทยาในการรกษาความสามารถในการปฏสนธ กระบวนการ capacitation และ acrosome reaction ของตวอสจ โดย ROS ทมากเกนไป จะท าใหความสามารถในการเคลอนทและการปฏสนธนนลดนอยลง (Baumber et al., 2000; Bucak et al., 2008) ซงความเสยหายจากปฏกรยาเปอรออกซเดชนทเกดขน สงผลใหเกดการสญเสยการท างานของเยอหมเซลลรวมถงเกดความเสยหายของ DNA ทสวนหวของอสจดวย (Agarwal and Said, 2003) ภายใตสภาวะปกตตวอสจท DNA เกดความเสยหายนนจะไมสามารถเขาสกระบวนการปฏสนธได ซงวตามนอเองนนมคณสมบตหลก คอ สามารถทจะละลายไดดในไขมนจงมประสทธภาพในการปกปองเซลลอสจไดมากกวาสาร antioxidant ชนดอน ๆ ทท าการศกษา และดวยกลไกในการหยดสายปฏกรยาการเกดสารอนมลอสระของวตามนอจงชวยลดการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนของน าเชอไกไดจากกระบวนการใชออกซเจนในระหวางการท าการเกบรกษาน าเชอแบบแชแขง ซงสอดคลองกบการรายงานของ Cerolini et al. (2000) พบวา การเสรมวตามนอสามารถชวยลดการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนในการเกบรกษาน าเชอหมทอณหภม 19 องศาเซลเซยส และสอดคลองกบการศกษาของ Tabatabaei et al. (2011) พบวา การเสรมวตามนอสงผลใหอตราการเคลอนท, อตราการมชวตสงขน และสงผลใหอสจมลกษณะผดปกตต าทสดและแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตกบกลมควบคมทไมมการเสรมวตามนอในการเกบรกษาน าเชอไกเนอสายพนธ Ross (P<0.05) และการศกษาของ Asadpour et al. (2011) ไดท าการศกษาการเสรมวตามนอลงใน citrate-egg yolk extender (CEY) ตอคณภาพน าเชอโคแบบแชแขง พบวา การเสรมวตามนอทระดบความเขมขน 0.01 mM สามารถชวยเพมอตราการเคลอนท และอตราการมชวตของอสจสงขนเมอเปรยบเทยบกบกลม

42

ควบคม (P<0.05) จากการศกษาของ Andrabi et al. (2008) ไดท าการศกษาการเสรมวตามนอลงใน Tris-citric acid (TCA) ตอคณภาพน าเชอกระบอ พบวา การเสรมวตามนอชวยเพมอตราการเคลอนท และความสมบรณของ plasma membrane ของอสจสงกวาเมอเทยบกบกลมควบคม (P<0.05) และในการศกษาครงน พบวาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.1 mM สงผลเสยตอคณภาพน าเชอ ซงสอดคลองกบ Rivlin et al. (2004) รายงานวา ระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสม สามารถยบยงการเกด ROS ในกระบวนการ capacitation และ acrosome reaction ของเซลลอสจไดดกวาการเสรมสาร antioxidant ทระดบความเขมขนสงหรอต าเกน ซงระดบความเขมขนทไมเหมาะสมนจะสงผลใหมการผลต ROS ในปรมาณทสงขนและเพมความเปนพษตอเซลลอสจ แตทงนการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 1.0 mM ยงสามารถใหอตราการผสมตดสงกวา 50% ของน าเชอสด เนองมาจาก Cysteine เปนสารประเภทกรดอะมโน อกทงยงเปนสารตงตนในกระบวนการสราง Glutathione จงชวยรกษาระดบของ Glutathione ภายในเซลลและชวยปกปองเซลลจากความเสยหายภายใตการเกด oxidative stress (Meister and Anderson, 1983) โดย Cysteine จะท าหนาทเปนตวดกจบอนมลอสระ (free radical scavengers) เพอก าจด ROS ทเกดขน ชวยปกปองความเสยหายในการท างานของเซลลอสจจากกระบวนการในการเกบรกษาน าเชอทงแบบแชเยนและแชแขง (Sagara et al., 1993; Mazor et al., 1996) ซงสอดคลองกบการศกษาของ Funahashi and Sano (2005) ไดท าการศกษาการเสรม Gluthaione, Cysteine และ Hypotaurine ตอการเกบรกษาน าเชอสกรทอณหภม 10 องศาเซลเซยส พบวา เมอมการเกบรกษาน าเชอสกรเปนเวลา 7 และ 14 วน extender ทเสรม Cysteine สงผลใหอตราการมชวตของอสจสงสดเมอเทยบกบกลมควบคม (P<0.05) และพบวาเมอท าการเกบรกษาน าเชอสกรเปนเวลา 14 วน การเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 2.5-5.0 mM สงผลใหตวอสจมอตราการมชวตรอดสงกวาการเสรม Cysteine ในระดบอน ๆ นอกจากนยงพบวาการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขนสงสด 5.0 mM ใหอตราการผสมตดต าทสดเทากบ 38% ของน าเชอสด และใหผลการเกดปรมาณของ MDA สงทสด เทากบ 30.35±0.75 nmol/50x106

spermatozoa การศกษานสอดคลองกบรายงานของ Uysal and Bucak (2007) ซงศกษาเปรยบเทยบการเสรม Cysteine ทระดบ 0, 5, 10 และ20 mM ในน าเชอแพะ พบวา ในระดบ 10 mM ใหผลดทสดตอน าเชอแพะแบบแชแขง และการเสรมในปรมาณทสงเกนไปมผลตอคณภาพน าเชอ และสอดคลองกบ Kaeoket et al. (2008) ซงรายงานวา การเสรม Cysteine มผลดตอน าเชอแบบแชแขงในสกร โดยระดบทเหมาะสม คอ 5 และ 10 mM สวนการเสรมในระดบสงเกนไปเกดผลเสยเชนกน เชนเดยวกบการศกษาของ Carolina et al. (2011) ไดท าการศกษาระดบความเขมขนของการเสรม Cysteine ตอการเกบรกษาน าเชอสกร โดยท าการเสรม Cysteine ลงใน BTS extender พบวา หลงจากการเกบรกษาน าเชอสกรเปนเวลา 72 ชวโมง อตราการมชวตรอดของอสจต ากวา 10% เมอท าการเสรม Cysteine ทระดบความเขมขน 10 และ 20 mM และ ในระดบความเขมขน 20 mM จะสงผลใหความสมบรณของ plasma membrane

43

นนมแนวโนมลดลงอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) และส าหรบการเสรม Glutathione นนยงใหอตราการผสมตดต ากวา 50% ของน าเชอสด ทงนอาจเนองมาจากการลดลงของระดบ Glutathione ภายในเซลลอสจในระหวางกระบวนการเกบรกษาน าเชอ ซงมรายงาน พบวาระดบ Glutathione มปรมาณลดลงหลงจากผานกระบวนการเกบรกษาน าเชอแบบแชแขงในโค (Bilodeau et al., 2000) และหม (Gadea et al., 2004) การลดลงของ Glutathione เปนตวกระตนใหเกดปฏกรยาออกซเดชนไดเรวขน ซงปฏกรยาของกระบวนการ ROS จะมผลท าใหเกดอนตรายตอตวอสจ เชน ไมโตครอนเดรย และในสวนของสารพนธกรรม (Genomic integrity) (Lamirande et al., 1997) นอกจากนในระหวางกระบวนการของการละลายน าเชอกมการเกดปฏกรยาออกซเดชนเกดขน จงท าใหการเสรม Glutathione กอนเขาสกระบวนการแชแขงใหผลไมแตกตางกบกลมควบคมทไมมการเสรม Glutathione ซงสอดคลองกบการรายงานของเทวนทร และคณะ (2555) พบวา การเสรม glutathione ทระดบ 0.1-1.0 mM มผลเสยตอคณภาพน าเชอไกพนเมอง โดยท าใหความสามารถในการเคลอนทและ ความสมบรณพนธต าลง อยางไรกตามการเสรม Glutathione ในระดบทสงเกนไปเกดผลเสยตออสจในทกรายงาน สรป

1) จากการทดลองผลของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง พบวา การใชสาร extender สตร EK รวมกบ 6% DMF สามารถใหอตราการผสมตดสงทสดเทากบ 42% (46% ของน าเชอสด) 2) การเสรมวตามนอ สามารถชวยเพมประสทธภาพของน าเชอไกแบบแชแขงไดดกวาการเสรมสาร antioxidant ชนดอน ๆ (Cysteine และ Glutathione) อกทงยงชวยลดการเกดปฏกรยาลปดเปอรออกซเดชนไดดกวาดวย

ขอเสนอแนะ

หากตองการเสรม Glutathione เพอใชเปนสาร antioxidant นนควรจะตองมการวดระดบของ Glutathione ของน าเชอไกกอนท าการเสรม Glutathione เพอเปนการรกษาระดบของ Glutathione ใหมความเหมาะสม

เอกสารอางอง

ทพยสดา บญมาทน. (2556). การเกบรกษานาเชอไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวแบบแชเยนและ แบบแชแขง. วทยานพนธปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร. เทวนทร วงษพระลบ พรจต สอนสดา และบญญต เหลาไพบรณ . (2555). ผลของ cysteine และ glutathione ตอคณภาพนาเชอแบบแชแขงของไกพนเมองไทย. แกนเกษตร 40 ฉบบพเศษ 2: 339-342. เทวนทร วงษพระลบ วทยา ฉนธยานนท สนน เหลยงไพบลย อารยา ทองประยร ทองใบ ยะวงษา พชญรตน แสนไชยสรยา มนตชย ดวงจนดา และบญญต เหลาไพบลย (2547). การผสมเทยม ในกวางปา.การประชมสมมนาวชาการเกษตรแหงชาต สาขาสตวศาสตร/สตวบาล คณะ เกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน. เทวนทร วงษพระลบ และยพน ผาสก. (2550). ความสมบรณพนธของนาเชอแชแขงในไกพนเมอง. การ

ประช ม วชาการสตวศาสตร ค รงท 3 ภาคว ชาสตวศาสตร คณ ะ เกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน.

วลลภ คงเพมพน. (2544). ไกพนเมอง. กรงเทพมหานคร. เกษตรบค. สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข . (2557). การ เฝาระวงเชอไขหวดนกชนดรนแรงสายพนธ H5N2 และ H5N8. ฝายไวรสระบบทางเดน หายใจ กลมไวรสวทยาทางการแพทย สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข. สนทร สนาทย ธรชย ชอไม จตรงค จรยะนรวชช และศรพนธ โมราถบ. (2552). ศกษาเปรยบเทยบการ

ใช Glycerol กบ Dimethyl Sulfloxide เปนสารปองกนการสญ เสยของเซลลอสจในกระบวนการผลตนาเชอแชแขงไกพนเมอง. การสมมนาวชาการเกษตรประจ าป 2552 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน: 70-72.

สานกงานควบคม ปองกนและบาบดโรคสตว กรมปศสตว. (2549). การควบคมโรคไขหวดนกใน ประเทศไทย. โรงพมพชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย จ ากด. Agarwal, A. and Said, T. M. (2003). Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human reproduction update. 9: 331-345. Andrabi, S. M. H., Ansari, M. S., Ullah, N. and Afzal, M. (2008). Effect of non-enzymatic antioxidants in extender on post-thaw quality of buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa. Pakistan veterinary journal. 28: 24-29. Andreea, A. and Stela, Z. (2010). Role of antioxidant additives in the protection of the cryopreserved semen against free radicals. Roman Biotechnol. Lett. 15: 3-8.

45

Ansari, M. S., Rakha, B. A., Ullah, N., Andrabi, S. M. H. and Akhter, B. A. (2011). Glutathioneaddition in tris-critric egg yolk extender improves the quality of cooled buffalo (Bubalas bubalis) bull semen. Pakistan Journal zoology. 1: 49- 55. Asadpour, S. H., Hamedi, H. R., Eslami-Majd, A. and Sahrai, M. (2011). Enhanced Kerr nonlinearity in a tunnel-coupled double quantum wells. Physica E: Low- dimensional Systems and Nanostructures. 44: 464-469. Baumber, J., Ball, B. A., Gravance, C. G., Medina, V. and Davies-Morel, M. C. (2000). The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential, and membrane lipid peroxidation. Journal of Andrology. 21: 895-902. Bilodeau, J. F., Blanchette S., Gagnon C. and Sirad, M. A. (2000). Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Molecular Reproduction and Development. 55: 282-288. Breque, C., Surai, P. and Brillard, J. P. (2003). Roles of antioxidants on prolonged storage of avian spermatozoa in vivo and in vitro. Molecular Reproduction and Development. 66: 314–323. Bucak, M. N., Ates, S., Ahin, A. and Yuce, A. (2008). Effect of anti-oxidants and oxidative stress parameters on ram semen after the freeze-thawing process. Small Ruminant Research. 77: 128–134. Cerolini, S., Kelso, K. A., Noble, R. C., Speake, B. K., Pizzi, F. and Cavalchini, L. G. (1997). Relationship between spermatozoan lipid composition and fertility during aging of chickens. Biology of Reproduction. 57: 976-980. Cerolini, S., Maldjian, A., Surai, P. and Noble, R. (2000). Viability, susceptibility to peroxidation and fatty acid composition of boar semen during liquid storage. Animal Reproduction Science. 58: 99-111. Chalah, T., Seigneurin, F., Blesbois, E. and Brillard, J. P. (1999). In vitro Comparison of

Fowl Sperm Viability in Ejaculates Frozen by Three Different Techniquent Fertility in Vivo. Cryobiology. 39: 185-191.

46

Çoyan, K., Başpınar, N., Bucak, M. N. and Akalın, P. P. (2011). Effects of cysteine and ergothioneine on post-thawed Merino ram sperm and biochemical parameters. Cryobiology. 63: 1-6.

Donoghue, A. M. and Wishart, G. J. (2000). Storage of poultry semen. Animal Reproduction Science. 62: 213-232.

Fang, Y. Z., Yang, S. and Wu, G. (2002). Free Radicals, Antioxidants and Nutrition. Nutrition. 18: 872–879. Funahashi, H. and Sano, T. (2005). Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10 ºC. Theriogenology. 63: 1605-1616. Gadea, J., Sellas, E., Marco, M. A., Coy, P., Mattas, C., Romar, R. and Ruiz, S. (2004). Decrease in gluathione content in boar sperm after cryopreservation: effect of the adddition of reduced glutathione to the freezing and thawing extenders. Theriogenology. 62: 690–770. Gee, G. F., Morrell, C. A., Franson, J. C. and Pattee, O. H. (1993). Cryopreservation of

American Kestrel Semen with Dimethylsulfoxide. Journal of Raptor Research. 27: 21-25.

Giesen, A. F., and Sexton, T. J. (1983). Beltsville poultry semen extender. 9. Effect of storage temperature on turkey semen held eighteen hours. Poultry science. 62: 1305-1311.

Guest, W. C. (1973). Spermatology and sperm preservation of channel catfish, Ictalurus punctatus. M.S. thesis, Agricultural and Mechanical college, Louisiana State

University, United States of America. Han, Y., Qin, J., Chang, X., Yang, Z., Bu, D. and Du, J. (2005). Modulating effect of hydrogen sulfide on gamma-aminobutyric acid B receptor in recurrent febrile seizures in rats. Neuroscience research. 53: 216-219. Kaeoket, K., Tantiparinyakul, K., Kladkaew, W., Chanapiwat, P. and Techakumphu, M. (2008). Effect of different antioxidants on quality of cryopreserved boar semen in different breeds. Thai Journal of Agricultural Science. 41: 1-9. Kelso, B., Smith, R. V., Laughlin, R. J. and Lennox, S. D. (1997). Dissimilatory nitrate reduction in anaerobic sediments leading to river nitrite accumulation. Applied and Environmental Microbiology. 63: 4679-4685.

47

Laffaldano, N., Meluzzi, A., Manchisi, A. and Passarella, S. (2005). Improvement of stored turkey semen quality as a result of He–Ne laser irradiation. Animal reproduction science. 85: 317-325. Lake, P. E. (1960). Studies on the Dilution and Storage of Fowl Semen. Journal of Reproduction and Fertility. 1: 30-35. Lamirande, E., Jiang, H., Zini, A., Kodama, H. and Gagnon, C. (1997). Reactive oxygen species and sperm physiology. Reviews of reproduction. 2: 48-54. Luberda, Z. (2005). The role of glutathione in mammalian gametes. Reprod Biol. 5: 5- 17. Lukaszewicz, E. (2001). Effects of semen filtation and dilution rate on morphology and fertility of frozen gander spermatozoa. Theiogenology. 55: 1819-1829. Lukaszewicz, E. (2002). An effective method for freezing White Italian gander semen. Theriogenology. 58: 19-27. Mazor, G., Kidron, G. J., Vonshak, A. and Abeliovich, A. (1996). The role of cyanobacterial exopolysaccharides in structuring desert microbial crusts. FEMS Microbiology Ecology. 21: 121-130. Partyka, A., Jerysz, A. and Pokorny, P. (2007) . Lipid peroxidation in fresh and stored semen of Green-legged partridge. Veterinary Medicine. 10: 3-5. Partyka, A., Nizanski, W. and Lukaszewicz, E. (2010). Evaluation of fresh and frozen thawed fowl semen by flow cytometer. Theriogenology. 74: 1019-1027. Penfold, L. M. (2001). Characterization of northern pintail (Anas acuta) ejaculate and the effect of sperm preservation on fertility. Reproduction. 121: 267–275. Rivlin, J., Mendel, J., Rubinstein, S., Etkovitz, N. and Breitbart, H. (2004). Role of hydrogen peroxide in sperm capacitation and acrosome reaction. Biology of Reproduction. 70: 518–522. Safarinejad, M. R., Hosseini, S. Y., Dadkhah, F. and Asgari, M. A. (2010). Relationship of omega-3 and omega-6 fatty acid with semen characteristic and anti-oxidant status of seminal plasma: A comparison between fertile and infertile men. Clinical Nutrition. 29: 100-105. Sagara, J. I., Miura, K. and Bannai, S. (1993). Maintenance of neuronal glutathione by glial cells. Journal of neurochemistry. 61: 1672-1676.

48

Satorre. M. M., Breininger, E., Beconi, M. T. and Beorlegui, N. B. (2007). Alpha - Tocopherol modifies tyrosine phosphorylation and capacitation-like state of cryopreserved porcine sperm. Theriogenology. 68: 958–965. Sexton, T. J. (1977). A new poultry semen extender: 1. Effect of extension on the fertility of chicken semen. Poultry Science. 56: 1443-1446. Siudzinska, A. and Lukaszewicz, E. (2008). Effect of semen extenders and storage time on sperm morphology of four chicken Breeds. Journal of Applied Poultry Research. 17: 101-108. Surai, P. F. and Wishart, G. J. (1996). Poultry artificial insemination technology in the countries of the former USSR. World’s Poultry Science Journal. 52: 27-43. Surai, P. F., Fujihara, N. Speak, B. K, Brillard, J. P., Wishart, G. J. and Sparks, N. H. C. (2001). Polyunsaturated fatty acids, lipid peroxidation and antioxidant protection in avian semen. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 7: 1024-1050. Surai, P. F., Royle, N. J. and Sparks, N. H. (2000). Fatty acid, carotenoid and vitamin A composition of tissues of free living gulls. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 126: 387-396. Tabatabaei, S. M. and Vahidi, B. (2011). Bacterial foraging solution based fuzzy logic decision for optimal capacitor allocation in radial distribution system. Electric Power Systems Research. 81: 1045-1050. Thuwanut, P. (2007). The effect of antioxidants on motility, viability, acrosome integrity and DNA integrity of post-thaw epididymal cat spermatozoa. M.S.Thesis, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Swedish University of Agricultural Sciences, Sweden. Tseluntin, K., Seigneurin, F. and Blesbois, E. (1999). Comparison of Cryoprotectants and Methodes of Cryopreservation of Fowl Spermatozoa. Poultry Science. 78: 586– 590. Uysal, O., Bucak, M. N., Yavas, I., and Varisli, O. (2007). Effect of various antioxidants on the quality of frozen-thawed bull semen. J. Anim. Vet. Adv. 6: 1362-1366.

ภาคผนวก ก วสด อปกรณ และสารเคม

1. วสดและอปกรณ

วสดและอปกรณส าหรบใชศกษาชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

1. Microtube (efpendorf) ขนาด 1.5 มลลลตร

2. Rack

3. กระดาษ label

4. ปากกา label

5. เครองชง 4 ต าแหนง

6. ชอนตกสาร

7. กระดาษชงสาร

8. เทอรโมมเตอร

9. กระดาษทชช

10. ตเยน

11. กระบอกน ากลน

12. กระตกน าแขง

13. micropipette (ขนาด 10, 100, 200 และ 1,000 ไมโครลตร)

14. small and large pipettes tips

15. หลอดทดลองพลาสตกขนาด 15 มลลลตร พรอมฝาปด

16. หลอดทดลองพลาสตกขนาด 50 มลลลตร พรอมฝาปด

17. beaker (ขนาด 250, 100, 50, 25 มลลลตร)

18. volumetric flasks ขนาด 250 มลลลตร

19. graduated cylinders ขนาด 25 มลลลตร

20. ขวดแกวขนาด 250 มลลลตร

21. glass stirring rod

22. pH meter

23. osmometer

50

24. หลอดแชแขง (french straws) ขนาด 0.5 มลลลตร

25. Forceps

26. Liquid nitrogen containers dewar 20 XT (Taylor-Wharton U.S.A.)

27. Liquid nitrogen storage with dispenser

28. กลองโฟมขนาด 28 x 38 x 29 เซนตเมตรฃ

29. ตะแกรงวางหลอดน าเช อ

30. นาฬกาจบเวลา วสดและอปกรณส าหรบใชประเมนคณภาพน าเชอ ประกอบดวย

1. กลองจลทรรศนแบบ compound microscope 2. Computer Assisted Semen Analysis (CASA) รน version 10 HTM-IVOS 3. Flow cytometer รน FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 4. 2X-CEL Dual Sides Sperm Analysis Chamber 5. 2X-CEL Cover Glass 6. Slide และ Cover slide 7. Hemacytometer 8. Counter 9. Microtube (efpendorf) ขนาด 1.5 มลลลตร 10. นาฬกาจบเวลา 11. กระดาษเชดเลนส 12. แผน DVD 13. กรรไกร 14. Cuvette แบบพลาสตก 15. เครอง spectrophotometer 16. เครอง centrifuge 17. Water bath 18. Votex mixer 19. ตะเกยงแอลกอฮอล 20. ไมขด 21. นาฬกาจบเวลา 22. กระตกน าแขง

51

23. หลอดฉดยาขนาด 1 มลลลตร 24. ไมจ มฟน 25. เขมเขย 26. กระดาษทชช 27. กรรไกร 28. ถาดไข 29. ตฟกไข 30. อปกรณสองไข

2. สารเคม สารเคมส าหรบเตรยมสาร extender ประกอบดวย

1. Water cell culture grade 2. Magnesium acetate 3. Sodium acetate 4. Potassium citrate 5. Sodium glutamate 6. Dipotassium hydrogen phosphate 7. Potassium dihydrogen phosphate 8. Fructose 9. TES (N-Tris (hydrxy methal) 10. Methyl-2-amino ethane sulfonic acid 11. Potassium acetate 12. Polyvinylpyroridone (PVP) 13. Glucose 14. Sodium dihydrogen phosphate 15. Inositol 16. Protamine sulfate 17. Anhydrous sodium hydrogen phosphate 18. Vitamin E 19. L- cysteine 20. Glutathione

52

กลมสาร cryoprotectant และสารเคมส าหรบใชศกษาการเกบ รกษาน าเชอแบบแชแขง ประกอบดวย

1. Dimethyl formamide (DMF) 2. Dimethyl acetamide (DMA) 3. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 4. ไนโตรเจนเหลว (LN2) 5. ผงอด Polyvinyl alcohol (PVA)

สารเคมส าหรบใชประเมนคณภาพน าเชอ ประกอบดวย 1. Eosin B 2. Nigrosin 3. Sodium citrate dihydrate 4. น ายาเชดเลนส 5. น ายาเคลอบเลบ 6. Immersion oil

สารเคมส าหรบเตรยมตวอยางเพอศกษาความสมบรณของอะโครโซม และการท างานของไมโตคอนเดรย ประกอบดวย

1. Fluorescein isothiocyanate conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) 2. Rhodamine 123 3. Propidium iodide (PI)

สารเคมส าหรบเตรยมตวอยางเพอศกษาระดบการเกดลปดเปอรออกซเดชนโดยการวเคราะห จากปรมาณ maloaldehyde (MDA) ทเกดขน ดวยวธ Thiobarbituric acid reactive substant (TBARS) ประกอบดวย

1. Ferrous sulfate 0.2 mM 2. Sodium ascorbate 1 mM 3. 15% Trichloroacetic acid (TCA)

4. 0.375% Thiobarbituric acid (TBA)

ภาคผนวก ข

ตารางแสดงผลการวเคราะหวาเรยนซ

1. การศกษาผลของชนดของสาร extender และสาร cryoprotectant ตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง

1.1 อตราการเคลอนท

ตารางท ข. 1 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMF ตออตราการเคลอนทรวม

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 4120.949 8 515.119 45.818 .000

Within Groups 202.370 18 11.243

Total 4323.318 26

ตารางท ข. 2 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMF ตออตราการเคลอนทไป ขางหนา

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 683.752 8 85.469 12.101 .000

Within Groups 127.135 18 7.063

Total 810.886 26

ตารางท ข. 3 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMA ตออตราการเคลอนทรวม

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 7735.711 8 966.964 108.729 .000

Within Groups 160.080 18 8.893

Total 7895.791 26

54

ตารางท ข. 4 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMA ตออตราการเคลอนทไป ขางหนา

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 2685.353 8 335.669 77.965 .000

Within Groups 77.497 18 4.305

Total 2762.850 26

ตารางท ข. 5 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMSO ตออตราการเคลอนทรวม

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 8895.084 8 1111.886 130.941 .000

Within Groups 152.846 18 8.491

Total 9047.931 26

ตารางท ข. 6 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMSO ตออตราการเคลอนทไป ขางหนา Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 2690.506 8 336.313 54.642 .000

Within Groups 110.786 18 6.155

Total 2801.293 26

1.2 อตราการมชวต

ตารางท ข. 7 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMF ตออตราการมชวต Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 4202.348 8 525.293 119.456 .000

Within Groups 79.153 18 4.397

Total 4281.501 26

55

ตารางท ข. 8 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMA ตออตราการมชวต Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 6811.759 8 851.470 186.747 .000

Within Groups 82.071 18 4.559

Total 6893.830 26

ตารางท ข. 9 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMSO ตออตราการมชวต

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 7357.536 8 919.692 166.627 .000

Within Groups 99.350 18 5.519

Total 7456.887 26

1.3 อตราการผสมตด

ตารางท ข. 10 แสดงการวเคราะหวาเรยนซผลของสาร extender รวมกบ 6% DMF ตออตราการผสมตด

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 19631.313 8 2453.914 33.061 .000

Within Groups 1632.906 22 74.223

Total 21264.219 30

ตารางท ข. 11 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMA ตออตราการผสมตด Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 19454.360 8 2431.795 19.453 .000

Within Groups 2750.126 22 125.006

Total 22204.486 30

56

ตารางท ข. 12 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของสาร extender รวมกบ 6% DMSO ตออตราการผสมตด Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 27330.307 8 3416.288 118.038 .000

Within Groups 636.733 22 28.942

Total 27967.039 30

2. การศกษาผลของชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant ทเหมาะสมตอคณภาพน าเชอและอตราการผสมตดในไกพนเมองสายพนธเหลองหางขาวทผานการเกบรกษาแบบแชแขง ตารางท ข. 13 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของการเสรมชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบ extender (EK) และ 6%DMF ตออตราการเคลอนทรวม

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 3918.983 10 391.898 69.290 .000

(Treatment)

Within Groups 124.430 22 5.656

(ความคลาดเคลอน)

Total 4043.412 32

หมายเหต: Treatment คอ วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.31 และ 3.48 mM, Cysteine ทระดบความ เขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM ตารางท ข. 14 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของการเสรมชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบ extender (EK) และ 6% DMF ตออตราการเคลอนทไปขางหนา

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 1221.855 10 122.186 51.610 .000

(Treatment)

Within Groups 52.084 22 2.367

(ความคลาดเคลอน)

Total 1273.939 32

หมายเหต: Treatment คอ วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.31 และ 3.48 mM, Cysteine ทระดบความ เขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM

57

ตารางท ข. 15 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของการเสรมชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบ extender (EK) และ 6% DMF ตออตราการมชวตรอด Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 4129.186 10 412.919 164.434 .000

(Treatment)

Within Groups 55.245 22 2.511

(ความคลาดเคลอน)

Total 4184.431 32

หมายเหต: Treatment คอ วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.31 และ 3.48 mM, Cysteine ทระดบความ เขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM ตารางท ข. 16 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของการเสรมชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant รวมกบ extender (EK) และ 6% DMF ตออตราการผสมตด

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 4363.585 10 436.358 28.368 .000

(Treatment)

Within Groups 338.405 22 15.382

(ความคลาดเคลอน)

Total 4701.989 32

หมายเหต: Treatment คอ วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.31 และ 3.48 mM, Cysteine ทระดบความ

เขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM

58

ตารางท ข. 17 แสดงการวเคราะหวาเรยนซ ผลของการเสรมชนดและระดบความเขมขนของสาร antioxidant

รวมกบ extender (EK) และ 6% DMF ตอการเกด MDA

Source Sum of squares df Mean squares F Sig

Between Groups 4862.728 4 486.273 3.630E3 .000

(Treatment)

Within Groups 27.043 10 1.229

(ความคลาดเคลอน)

Total 4889.771 14

หมายเหต: Treatment คอ วตามนอทระดบความเขมขน 1.16, 2.31 และ 3.48 mM, Cysteine ทระดบความ

เขมขน 0.5, 1.0 และ 5.0 mM และ Glutathione ทระดบความเขมขน 0.025, 0.05 และ 0.1 mM

ประวตผวจย ประวตหวหนาโครงการวจย 1. ชอ: (ภาษาไทย) อ.ดร. สมร พรชนชวงศ (ภาษาองกฤษ) Dr. Samorn Ponchunchoovong 2. เลขหมายบตรประจ าตวประชาชน: 3 9201 00947 09 0 3. ต าแหนงปจจบน: อาจารยประจ าสาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตว ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร 4. สถานทตดตอ:

สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตว ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลย สรนาร อ าเภอเมอง จ.นครราชสมา 30000 Tel: (044) 224377-8 Fax: (044) 224150

E-mail: samorn@sut.ac.th 5. ประวตการศกษา: Degree Institution Year Country B.Sc. (Biology) Prince of Songkhla University 1992 Thailand M.Sc. (Zoology) Chulalongkorn University 1995 Thailand Ph.D (Aquaculture) Asian Institute of Technology 2003 Thailand

6. สาขาวชาการทช านาญพเศษ (แตกตางจากวฒการศกษา): Cryopreservation of fish spermatozoa Aquaculture (seed production)

7. ประสบการณวจย: 7.1 งานวจยทท าส าเรจแลว งานวจยทท าส าเรจแลว และไดรบการตพมพ ดงเอกสารแนบ และอก 1 เรองอยระหวางการตพมพ (โดยเปนหวหนาโครงการ 3 เรอง)

ผลงานวจย: Selected publications Kwantong, S. and Bart, A. N. 2003. Effect of cryoprotectants, extenders and freezing rates on the fertilization rates of frozen striped catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), sperm. Aquaculture research, 34: 887-893. Kwantong, S. and Rodtong, S. 2004. Species identification of Thai rice- field crab using stereomicroscopy and scanning electron microscopy. 8th Asia- Pacific conference on electron microscopy (8APEM). June 7-14, 2004. Kanazawa, Japan. P. 83.

60

Rodtong S. and Samorn Kwantong. 2004. Scanning electron microscopy and nucleic acid technique aid the identification and diversity study of Thai rice- field crab. 8th Asia- Pacific conference on electron microscopy ( 8APEM) . June 7- 14, 2004. Kanazawa, Japan. P. 122. Kwantong, S. and Bart, A. N. 2004. Cryoperservation of striped catfish, Pangasius hypophthalmus sperm. International symposium on animal and plant production for food and environmental security. August 9- 11, 2004, Chaophya park hotel, Bangkok. Thailand. P. 105-109. Kwantong, S. and Bart, A. N. 2006. Cryopreservation of black eared catfish, Pangasius larnaudii sperm. Aquaculture research, 37: 955-957. Ponchunchoovong, S. 2006. Species identification of Thai rice- field crab in the lower north-eastern region of Thailand. Suranaree J. Sci. Technol. 13(3): 245-249. สมร พรชนชวงศ สพรรณ ขนน าเทยง สรชย ภาสดา สคนธา เลขะพนธรตน นศารตน ปณณารกษ และ นฤพล สขมาสวน. 2550. ผลของสาร extenders และสาร cryoprotectants ทมผลตออตรา การปฏสนธของน าเช อปลาสวายโดยวธการแชแขง. วารสารวจยเทคโนโลยการประมง. ปท 1 เลมท 1: 11-22. Ponchunchoovong, S. 2007. Effects of equilibration times on the fertilization rate of cryopreserved striped catfish, Pangasius hpophthalmus (Sauvage, 1878) sperm. First international conference on sustainable animal agriculture in developing countries. 27-29 September, Guandu Hotel, Kunming, China. P. 341-344. Ponchunchoovong, S. 2008. Effects of freezing rates on the cryopreservation of striped catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) sperm. Proceedings “The 13th Animal Science Congress of the Asian- Australasian Association of Animal Production Societies. September 22-26, 2008, Hanoi, Vietnam. P. 406. Kwantong, S. and Bart, A. N. 2009. Fertilization efficiency of cryopreserved sperm from striped catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage). Aquaculture Research, 40: 292-297. Dokpong, D. , S. Ponchunchoovong, U. Amsin, U. Piasoongnoen and S. Singhae. 2009. The effect of freezing Rates on the cryopreservation of Small scale mud carp, Cirrhinus microlepis Sauvage, 1878) sperm. Proceedings 2nd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries 8- 11 November, 2009. Kuala Lumpur, Malaysia. P. 268-270.

61

Ponchunchoovong, S. and S. Kannumteing. Effects of freezing rates on the cryopreservation of black ear catfish, P. larnaudii spermatozoa. Proceedings 2nd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 8-11 November, 2009. Kuala Lumpur, Malaysia. P. 271- 273. Kainin, S., S. Ponchunchoovong, U. Imsin, U. Piasoongnoen and S. Singhae. Successful hybridization of Pangasius species using cryopreserved sperm. Proceedings 2nd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 8-11 November, 2009. Kuala Lumpur, Malaysia. P. 274-275. Boonanuntanasarn, S. , K. sukoim, T. Changmunwai, S. Ponchunchoovong and Y. Manakasem. Effect of Butea superba on masculinization of Nile tilapia. Proceedings 2nd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 8-11 November, 2009. Kuala Lumpur, Malaysia. P. 250-251. Nipon, S., R. Yahsiro , S. Tunkijjanukij and S. Ponchunchoovong . 2009. Preservation of Humpback Grouper, Cromileptes altivelis ( Valenciennes, 1828) Spermatozoa. Kasetsart University Fisheries research Bulletin Vol. 33(2): May, 2009. p. 12-23. Samorn, P., Augkana, J. and Tunyaluk, R. 2010. Effect of activators solution on motility and fertilization of frozen striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus. Proceedings “ The 14th Animal Science Congress of the Asian- Australasian Association of Animal Production Societies (AAAP). August 23-27, 2010, Pingtung Taiwan, ROC P. 321. Samorn, P. , Duangchan. D. , Unnop, I. , Uraiwan, P. and Sombut, S. 2010. The effect of dilution ratios on short- term storage of Small scale mud carp, Cirrhinus microlepis ( Sauvage, 1878) sperm. Proceedings “ The 14th Animal Science Congress of the Asian- Australasian Association of Animal Production Societies (AAAP). August 23-27, 2010, Pingtung Taiwan, ROC P. 322. Ponchunchoovong, S. and Plime S. 2010. Effect of combinations of cryoprotectants and freezing rates on cryopreservation of the spermatozoa of Striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Kasetsart J. (Nat. Sci.) 44: 1153- 1161. Ponchunchoovong, S., S. Kainin, U. Imsilp, U. Piasoongnoen and S. Singsee. 2011. The

effect of freezing rates and combinations cryodiluents on the cryopreservation of Mekong catfish, Pangasius bocourti sperm. Proceedings 3rd International

62

conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 26- 29 July, 2011. Nakhon Ratchasima, Thailand. P.76.

Ponchunchoovong, S. , D. Dokpong, U. Imsilp, U. Piasoongnoen and S. Singsee. 2011 Fertilization efficiency of fresh and frozen sperm from Small scale mud carp, Cirrhinus microlepis (Sauvage, 1878). Proceedings 3rd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 26-29 July, 2011. Nakhon Ratchasima, Thailand. P.75. Boonmatun, T. , S. Ponchunchoovong, T. Chomai, T. Vongpralub and A. Molee. 2011. Effects of extender and storage time on motility of native chicken “ Luang hang kao” spermatozoa. Proceedings 3rd International conference on sustainable animal agriculture for developing countries. 26- 29 July, 2011. Nakhon Ratchasima, Thailand. P. 336. Vechklang, K. , S. Boonanuntanasarn, S. Ponchunchoovong, N. Pirarat and C. Wanapu. 2011. The potential for rice wine residual as an alternative protein source in a practical diet for Nile tilapia ( Oreochromis niloticus) at the juvenile stage. Aquaculture Nutrition. P. 1365-2095. Ponchunchoovong, S. , S. Kainin, U. Imsilp and U. Piasoongnoen. 2011. The effect of freezing procedures on the cryopreservation of Mekong catfish, Pangasius bocourti sperm. World academy of science, engineering and technology. 24-26 August, 2011. Paris, France. P.1257-1261. Thipsuda Boonmatan, Samorn Ponchunchoovong, Theerachai chormai and Thevin Vongpralub. 2013. Effect of extenders on preservation of native chicken “Luang hang kao” spermatozoa. International Conference on Engineering and Applied Science. November 2013, Osaka, Japan. P. 2033-2038. Jiraporn P. , Ponchunchoovong, S. and Payooha, K. 2013. The effects of partial replacement of fish meal by brewer's yeast on growth performance of Thai Panga. The 3rd International Fisheries Symposium, November 28- 30, Pattaya. Thailand. Kainin, S. Ponchunchoovong, S. , U. Imsilp and S. Singsee. 2014. Cryopreservation of Mekong catfish, Pangasius bocourti Sauvage, 1880 spermatozoa. Aquaculture Research, 45: 859-867.

63

Ladoktha, P., Ponchunchoovong, S. and Udomkarn, C. 2015. Effect of activators solution on motility and fertilization of frozen black shark, Labeo chrysophekadion spermatozoa. BioEvolution, 2: 62-65. Tangpakdeewijit, S., S. Ponchunchoovong and T. Vongpralub. 2015. Effect of extenders on frozen semen quality of Thai native chicken ( Lueng hang kao) . KHON KAEN AGR. J. 43 SUPPL. 2: 86-89. Jiraporn P., Ponchunchoovong, S. and Payooha, K. 2016. Partial replacement of fishmeal

by brewer’ s yeast ( Saccharomyces cerevisiae) in diets for Thai Panga ( Pangasianodon hypophthalmus × Pagasius bocourti) juveniles. Aquaculture Nutrition, 22:575-585.

Kanjana, T. and Ponchunchoovong, S. 2016. The replacement of fish meal with rice wine residual on growth performance in diets of Thai Panga ( Pangasianodon hypopthalmus × Pangasius bocourti) . The 67th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science ( EAAP 2016) . August 29- September 2. Belfast, England.

Kanjana, T. and Ponchunchoovong, S. 2016. The effect of replacement of fishmeal by rice wine residual on growth performance and intestinal morphology of Thai Panga. The 1st International conference on Tropical Animal Science and Production 2016 (TASP 2016). July 26-31, Ambaasader Bangkok, Thailand.

Phimphan, L. , Ponchunchoovong, S and Udomkarn, C. 2017. Preservation of black sharkminnow, Labeo chrysophekadion ( Bleeker, 1849) spermatozoa. Aquaculture Research, 48: 3837-3847.

7.2 งานวจยทก าลงด าเนนการ ม 3 เรอง 1. การเกบรกษาน าเช อปลากะโหโดยวธการแชแขง (เปนผหวหนาโครงการวจย รบผดชอบโครงการวจย 70%) 2. การเกบรกษาน าเช อไกพ นเมองพนธเหลองหางขาว โดยวธการแชแขง (เปนผหวหนาโครงการวจย รบผดชอบโครงการวจย 50%)

3. การพฒนาและเพมผลผลตปลาสวายโมง (Thai Panga) เพอการสงออก (เปนผหวหนาโครงการวจย รบผดชอบโครงการวจย 35%) ประวตผรวมวจย (1) 1. ชอ (ภาษาไทย) นาย ธระชย ชอไม (ภาษาองกฤษ) Mr. THEERACHAI CHORMAI

64

2. หมายเลขประจ าตวประชาชน 3-1014-00087-67-1 รหสนกวจย (วช.) 49040073 3. ต าแหนง ผอ านวยการศนยวจยและบ ารงพนธสตวกบนทรบร 4. ประวตการศกษา

ปทจบการศกษา

ระดบปรญญาตร

โท เอก

อกษรยอปรญญาและชอเตม

สาขาวชา ชอ

สถาบนการศกษา ประเทศ

2525 ปรญญาตร วท.บ.วทยาศาสตร

มหาบณฑต สตวศาสตร

มหาวทยาลย ขอนแกน

ไทย

2540 ปรญญาโท วท.ม.วทยาศาสตร

มหาบณฑต การปรบปรง

พนธสตว จฬาลงกรณ มหาวทยาลย

ไทย

5. สาขาทมความช านาญพเศษ (แตกตางจากวฒการศกษา) ระบสาขาวชา การปรบปรงพนธโคเน อ และสตวปก 6. ประวตการท างาน ป ต าแหนง หนวยงาน 2526-2541 นกวชาการสตวบาล สถานบ ารงพนธสตวปราจนบร 2542-2545 นกวชาการสตวบาล สถานวจยทดสอบพนธสตวสระแกว 2546-ปจจบน ผอ านวยการศนยวจย ศนยวจยและบ ารงพนธสตวกบนทรบร 7.ประสบการณทส าเรจแลว: ชอเรอง ปทพมพ และสถานภาพการท างานวจย เปนหวหนาโครงการวจย หรอผรวมวจย

ชอ ปทเผยแพร สถานภาพในการวจย

1. ดชนคดเลอกโครนพนธบราหมน 2539 หวหนาโครงการวจย 2. สถานภาพงานวจยโคเน อในประเทศไทย. 2539 หวหนาโครงการวจย 3. คาพารามเตอรทางพนธศาสตรของโคบราหมน 2540 หวหนาโครงการวจย 4. สถานภาพการเล ยงไกพ นเมองในหมบาน 2541 หวหนาโครงการวจย รอบสถานบ ารงพนธสตวสระแกว 5. สมรรถภาพการเจรญเตบโตและลกษณะ 2544 หวหนาโครงการวจย ซากของโคปาลกผสม พอววกระทงและ ววแดงกบแมโค บราหมนและเรดซนด 6. ผลของการใชมนส าปะหลงตอผลผล 2544 หวหนาโครงการวจย ของไกพ นเมอง ชวงอาย 0-16 สปดาห 7. สมรรถภาพการเจรญเตบโต และลกษณะซากของ 2544 หวหนาโครงการวจย โคปาลกผสม พอววกระทง และววแดง กบแมพนธ

65

บราหมนและเรดซนด 8. อตราพนธกรรมของลกษณะทส าคญทาง 2545 หวหนาโครงการวจย เศรษฐกจของโคกบนทรบรระยะแรกเกดถงอาย 1 ป 9. สมการท านายน าหนกตวโคกบนทรบรชวอายท 1 2545 ผรวมโครงการวจย 10. สมรรถภาพการเจรญเตบโตของเปดบารบาร 2 สายพนธ 2545 ผรวมโครงการวจย เมอเล ยงดวยส าปะหลงระดบตางๆ 11. การเปรยบเทยบสมรรถภาพการขน และลกษณะซาก 2546 หวหนาโครงการวจย ระหวางโคลกผสมทาเรนเทส-บราหมนและโคลกผสม ซมเมนทอล-บราหมน 12. การเล ยงโคกบนทรบรโดยใชพ นทแปลงหญาแบบจ ากด 2546 หวหนาโครงการวจย 13. การสรางฝงไกพ นเมองพนธเหลองหางขาว 2548 หวหนาโครงการวจย ลกษณะภายนอกของไกเมอถงชวอายท 1 และ 2 14. สมรรภาพการผลตไกพ นเมองทระดบโปรตนในอาหาร 2548 ผรวมโครงการวจย ตางๆกน 15. การสรางฝงไกพ นเมองจ านวน 4 พนธ 2549 ผรวมโครงการวจย (ประดหางด า, เหลองหางขาว, แดง และช) 16. ประสทธภาพการใชกลองรกษาอณหภมเปนภาชนะ 2549 ผรวมโครงการวจย ขนสงน าเช อแชเยน ส าหรบผสมเทยมไกพ นเมองในภาคสนาม 17. การสรางฝงไกพ นเมองพนธเหลองหางขาว 2550 หวหนาโครงการวจย สมรรถภาพการผลตและคาพารามเตอรทางพนธกรรม ของลกษณะน าหนกตวของไก 18. สมรรถภาพการเจรญเตบโตของโคกบนทรบรเพศผ 2550 ผรวมโครงการวจย ในระยะทดสอบ 19. สมรรรถภาพการผลตของไกพ นเมองพนธประด 2550 ผรวมโครงการวจย หางด า, พนธเหลองหางขาว, พนธแดง และพนธช. 20. อาทตย ใหญลา, เนรมต สขมณ, ธระชย ชอไม และวรวทย สรพลวฒน. 2551. การถายทอด

ลกษณะทางพนธกรรมของสแขงในไกพ นเมองไทยพนธเหลองหางขาว. การประชมวชาการมหาวทยาลยเกษตรศาสตรคร งท 46. กรงเทพฯ. น. 107-114.

21. อาทตย ใหญลา, เนรมต สขมณ, ธระชย ชอไม และวรวทย สรพลวฒน. 2551. การถายทอดลกษณะทางพนธกรรมของสขนในไกพ นเมองไทยพนธเหลองหางขาว. วารวารวทยาศาสตรเกษตร. กรงเทพฯ. (อยระหวางรอตพมพ).

66

ปจจบนก าลงด าเนนการวจย 1. โครงการยอยท 4. การเล ยงโคกบนทรบรของกรมปศสตวภายใตการเล ยงของเกษตรกร

4.1 สมรรถภาพการผลตโคกบนทรบรในสภาพฟารมเกษตรกรเครอขาย (2550- 2554) (เลขทะเบยนวจย (50)(1)-(50:4.1)-0206-006) 4.2 ผลตอบแทนทางเศรษฐกจและสงคม ของการผลตโคกบนทรบรของเกษตรกร

ฟารมเครอขาย (2550-2554) 2. โครงการทดสอบสมรรถภาพโคเน อกรมปศสตวและเกษตรกรฟารมเครอขาย (51(1)- 0206-003) 2.3 การทดสอบสมรรถภาพโคพนธกบนทรบรของกรมปศสตวและเกษตรกรฟารม เครอขาย (เลขทะเบยนวจย 51(1)-(51.3)- 0206-003) ปจจบนด าเนนโครงการวจยส นสดลงแลว

1. โครงการสรางฝงไกพ นเมองพนธเหลองหางขาว” (2546-2550) ประวตผรวมวจย (2) 1. ชอ – นามสกล (ภาษาไทย) : นายเทวนทร วงษพระลบ

(ภาษาองกฤษ) : Mr. Thevin Vongpralub 2. เลขหมายประจ าตวประชาชน : 3 – 4007 – 00805 – 33 - 9 3. ต าแหนงปจจบน : รองศาสตราจารย ระดบ 9 4. หนวยงานสงกด: ภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน 40002

โทรสาร 043 – 202362 E-mail: vthevi@kku.ac.th 5. ประวตการศกษา:

ปทจบ การศกษา

ระดบ ปรญญา

อกษรยอ ปรญญาและ

ชอเตม สาขาวชา วชาเอก ชอสถาบน ประเทศ

2522 ปรญญาตร วท.บ.

(วทยาศาสตรบณฑต) เกษตรศาสตร สตวศาสตร

มหาวทยาลย ขอนแกน

ไทย

2530 ปรญญาโท วท.ม.

(วทยาศาสตรมหาบณฑต) เกษตรศาสตร สตวบาล

มหาวทยาลย เกษตรศาสตร

ไทย

2538 ปรญญาเอก Dr. Sc. Agr.

Doctor in Agriculture Animal Science

Animal Reproduction

Kyushu Tokai

ญปน

6. ประสบการณทเกยวของกบงานวจยทงภายในและภายนอกประเทศ 6.1 ชอแผนงานวจยในฐานะผอ านวยการ: การเกบรกษาเช อพนธในโคพ นเมองโดยวธการแชแขง (ส นสดปงบประมาณ 2550) 6.2 ชอโครงการวจยในฐานะหวหนาโครงการ : การแชแขงตวออนโคพ นเมองทผานการคดเพศ (ส นสดปงบประมาณ 2550)

67

6.3 งานวจยทท าเสรจ : ชอผลงานวจย ปทพมพ และสถานภาพในการวจย เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา, วระ ภาคอทย, พรชย ลอวลย, ฉลอง วชราภากร และ วษณ วเชยรสรรค. 2534. การศกษาถาวรภาพในการเล ยงโคนมของเกษตรกรรายยอยในภาค ตะวนออกเฉยงเหนอ รายงานการวจยเสนอตอสถาบนวจยและพฒนา มหาวทยาลยขอนแกน (หวหนาโครงการ) เทวนทร วงษพระลบ และ มนตชย ดวงจนดา. 2538. อทธพลของจ านวนเซลลกรานโลซาตอการพฒนา ตวออนของหนขาวเมอเพาะเล ยงรวมกนในหลอดทดลอง. แกนเกษตร 23:37-43. (หวหนา โครงการ) เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา, บญตา ธรรมบตร และ มานตย สนธไชย. 2539. อทธพลของน ายาเจอจางและรปแบบภาชนะทใชขนสงในสภาพสนามตอคณภาพน าเช อสกร. แกนเกษตร 24(2):81-89. เทวนทร วงษพระลบ, บญญต เหลาไพบลย, พชญรตน แสนไชยสรยา, ปยศกด สวรรณ, ประมร เมอง พรม และ พทกษ เผาผา. 2542. การศกษาเบ องตนในการเกบรกษาคณภาพน าเช อแบบแชแขง ในโคพ นเมอง. วารสารวจย มข. 4:22-28. เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา, อดศกด สงขแกว และ กฤตพล สมมาตย. 2542. การศกษาเบ องตนในการเกบรกษาน าเช อกวางซกาแบบแชแขง. วารสารสตวปาเมองไทย. 7:9- 12. เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา, อดศกด สงขแกว และ บญตา ธรรมบตร. 2543. การ เกบรกษาน าเช อและตวออนสกรพ นเมองโดยวธแชแขง. รายงานการว จยโครงการวจยจาก ทนอดหนนการวจย ประเภทอดหนนทวไป ปงบประมาณ 2541. มหาวทยาลยขอนแกน. สจนต สมารกษ, เทวนทร วงษพระลบ, ยพา หาญบญทรง และ พรวทย เช อวงษบญ. 2543. การเลอก เพศตวออนโคนมดวยเทคนคการเพมขยายยน. รายงานการวจยโครงการวจยจากทนอดหนน การวจย ประเภทอดหนนทวไป ปงบประมาณ 2541. มหาวทยาลยขอนแกน. เทวนทร วงษพระลบ, วทยา ฉนชยานนท, พชญรตน แสนไชยสรยา, อดศกด สงขแกว, สนน เหลยง ไพบลย, บญญต เหลาไพบลย, พรชย ลอวลย และ อารยา ทองประยร. 2544. ความยาวของ เสนรอบวงอณฑะและคณลกษณะน าเช อกวางปาในฤดกาลทแตกตางกน. วารสารวจย มข. 6:25-33. สจตรา อาจรยะวฒนกล, เทวนทร วงษพระลบ, บญญต เหลาไพบลย และ พชญรตน แสนไชยสรยา. 2544. ผลของระดบเบตาแคโรทนในอาหารตอคณภาพน าเช อไกพ นเมอง. วารสารสตว แพทยศาสตร มข. 11:1-11. เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา, พทกษ เผาผา, อดศกด สงขแกว, มงกร วงษศร และ มานตย สนธไชย. 2545. การเกบรกษาน าเช อและคพภะโคพ นเมองไทยโดยวธแชแขง. รายงาน

68

การวจย. โครงการวจยจากทนอดหนนการวจย ประเภทอดหนนทวไป ปงบประมาณ 2542. มหาวทยาลยขอนแกน. เทวนทร วงษพระลบ, พชญรตน แสนไชยสรยา,บญญต เหลาไพบลย และบญตา ธรรมบตร. 2546. ผล ของระบบโรงเรอนตอสมรรถภาพทางการสบพนธของสกรพอพนธ.แกนเกษตร.31:110-118. เทวนทร วงษพระลบ, วทยา ฉนธยานนท, สนน เหลยงไพบลย, อารยา ทองประยร, ทองใบ ยะวงษา, พชญรตน แสนไชยสรยา, มนตชย ดวงจนดา และบญญต เหลาไพบลย. 2547. การผสมเทยม ในกวางปา.การประชมสมมนาวชาการเกษตรแหงชาต สาขาสตวศาสตร/สตวบาล คณะ เกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน. พชญรตน แสนไชยสรยา,วทยา ฉนธยานนท,เทวนทร วงษพระลบ,สนน เหลยงไพบลย,ยพน ผาสข และ อารยา ทองประยร. 2547. การควบคมการเปนสดในกวางปาโดยใชฮอรโมนโพรสตาแกรนดน เอฟ-2 –แอลฟา.การประชมสมมนา วชาการเกษตรแหงชาต สาขาสตวศาสตร/สตวบาล คณะ เกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน. สจตรา อาจรยะวฒนกล, เทวนทร วงษพระลบ, วศาส ศรสรยะ, พชญรตน แสนไชยสรยา และ สมฤทธ แสนบว. 2547. ผลของการเสรมออกซโตซนในน าเช อเจอจางตออตราการผสมตดและจ านวน ลกตอครอกในสกร.สกรสาสน 30: 67-74. เทวนทร วงษพระลบ, พรวทย เช อวงษบญ และพชญรตน แสนไชยสรยา. 2548. ผลของการเล ยงเซลล เยอบทอน าไขโครวมกบตวออนตอการมชวตรอดของตวออนสกรพ นเมองทผานการแชแขง แบบ vitrification. แกนเกษตร33(3): (รอการตพมพเผยแพร) เทวนทร วงษพระลบ วทยา ฉนชยานนท สนน เหลยงไพบลย อารยา ทองประยร ทองใบ ยะวงษา พชญรตน แสนไชยสรยา มนตชย ดวงจนดา และ บญญต เหลาไพบลย. 2549. การผสมเทยม กวางปาโดยก าหนดเวลาภายใตการควบคมการเปนสด. การประชมสมมนาวชาการสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 405 – 412. ธญญา คงนวลอนทร เทวนทร วงษพระลบ และ บญญต เหลาไพบลย. 2549. อทธพลของอณหภมน า ดมตอสมรรถภาพทางการผลตของไกไขในชวงฤดรอน. 2549. การประชมสมมนาวชาการสตว ศาสตร คร งท 2 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 506 – 517. พงศเทพ พลแสง และ เทวนทร วงษพระลบ. 2549 ผลการนวดปมกระสนภายหลงการผสมเทยมตอ อตราการผสมตดในแมโค. การประชมสมมนาวชาการสตวศาสตร คร งท 2 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 426 – 433. สมยศ เปส เทวนทร วงษพระลบ และ พชญรตน แสนไชยสรยา. 2549. การใชมนส าปะหลงในสตร อาหารพ นฐานปลายขาวตอสมรรถนะการผลตและคณภาพซากของสกรรนและขน. การ ประชมสมมนาวชาการสตวศาสตร คร งท 2 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 336 – 346.

69

สนนาฎ พลแสง และ เทวนทร วงษพระลบ. 2549. ผลของการเปดแถบบนทกเสยงแมสกรตอพฤตกรรม และสมรรถภาพทางการผลตของลกสกรหยานม. การประชมสมมนาวชาการสตวศาสตร คร งท 2 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 413 – 425. สนทร ทองด และ เทวนทร วงษพระลบ. 2549. การเหนยวน าการเปนสดในแมโคนมดวยเทคนคการฉด ฮอรโมนโปรสตาแกลนดน เอฟ ท อลฟา ทางโยน. การประชมสมมนาวชาการสตวศาสตร คร ง ท 2 คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน หนา 582 – 590. เดนพงษ สาฆอง เทวนทร วงษพระลบ และ สหส นชนารถ. 2550. การพฒนาของฟอลเคลในแมกระบอ ป ล ก . ป ร ะ ช ม ว ช า ก า ร ส ต ว แ พ ทย ศาสต ร ค ร ง ท 8. คณะ ส ต ว แ พ ทย ศาสต ร มหาวทยาลยขอนแกน. หนา 64-66. เทวนทร วงษพระลบ บญญต เหลาไพบลย พชรตน แสนไชยสรยา สจ กณหาเรยง และ ยพน ผาสข. 2550. การศกษาผลการผสมตดจากการผสมเทยมโดยน าเช อไกพ นเมอง. ประชมวชาการสตว ศาสตร คร งท 3. ภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน รวมกบ กรม ปศสตว และสมาคมสตวบาลแหงประเทศไทย. หนา 180-187. เทวนทร วงษพระลบ บญญต เหลาไพบลย พชรตน แสนไชยสรยา สจ กณหาเรยง และ ศราวธ ศรงาม. 2550. ผลของชนดน าเช อเจอจาง และชนด cryoprotectant ตอคณภาพน าเช อไกพ นเมองท เกบรกษา. ประชมวชาการสตวศาสตร คร งท 3. ภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน รวมกบ กรมปศสตว และสมาคมสตวบาลแหงประเทศไทย. หนา 188- 195. เทวนทร วงษพระลบ ยพน ผาสก บญญต เหลาไพบลย จฬานย นวมจต และ พรจต สอนสดา. 2550. ผลของชนดน ายาเจอจางตอคณภาพน าเช อไก. ประชมวชาการสตวศาสตร คร งท 3. ภาควชา สตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน รวมกบ กรมปศสตว และสมาคมสตว บาลแหงประเทศไทย. หนา 196-203. ชโลธร อมพร และ เทวนทร วงษพระลบ. 2551. ระดบฮอรโมน FSH ทมผลตอการตอบสนองการตกไข และคณภาพตวออนในโคพ นเมองไทย. การประชมวชาการสตวศาสตรคร งท 4 ภาควชาสตว ศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกนรวมกบกรมปศสตว และสมาคมสตวบาล แหงประเทศไทย. หนา 144-147. ด ารงรกษ รกวงษฤทธ เทวนทร วงษพระลบ และยพน ผาสข. 2551. ผลของการตดแบงและวธแชแขง ตอคณภาพตวออนโคนม. การประชมวชาการคร งท 46 มหาวทยาลยเกษตรศาสตร สาขาสตว และสาขาสตวแพทย. หนา 91-98. เทวนทร วงษพระลบ และ ยพน ผาสข. 2551. ความสมบรณพนธของน าเช อแชแขงในไกพ นเมอง. การ ประ ชมว ช าก าร สตวศาสตร ค ร ง ท 4 ภาคว ช า สต วศาสตร คณะ เกษตรศาสตร

70

มหาวทยาลยขอนแกนรวมกบกรมปศสตว และสมาคมสตวบาลแหงประเทศไทย. หนา 127- 130. Simaraks, S. and T. Vongpralub. 1987. Artificial Insemination in Chinese Geese. Thai J. Agric. Sci. 20:65-75. Vongpralub, T and F. Koyanagi. 1994. Effect of oxytocin on sperm molityty and invitro fertilization in the mouse. Animal Science and Technology (Japan) 65:695-700. Vongpralub, T. and F. Koyanagi. 1994. Effects of oxytocin and granulosa all co-culture on the development of mouse one-cell stagee embryos. J. Mann. Ova. Res. Worapol Aengwanich, Udom Chuachan, Yupin Phasuk, Thevin Vongpralab, Parwadee Pakdee, Suporn Katavetin and Suchint Simaraks. 2003. Effect of Ascobic Acid on Respiratory rate, Body Temperature, Heterophil: Lymphocyte Ratio and Microscopic Lession Score in Lung, Liver, Kidney, Cardiac Muscle and Spleen in Broilers under Heat Stress. Thai Journal Agriculture Science.36(2):207-218. Worapol Aengwanich, Pornchai Sridama, Yupin Phasuk, Thevin Vongpralab, Parwadee Pakdee, Suporn Katavetin and Suchint Simaraks. 2003. Effect of Ascobic Acid on Cell mediated, humoral immune response and phathophysiology of white blood cell in broilers under heat stress. Songklanakarin Journal Science Technology.23(3): 297 – 305. W. Aengwanich, P. Sridama, Y. Phasuk, T. Vongpralup, P. Pakdee, S. Katawatin and S. Simaraks. 2003. Effects of ascorbic acid on cell mediated, humoral immune response and pathophysiology of white blood cell in broilers under heat stress. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 25(3): 297-305. W. Aengwanich, U. Chuachan, Y. Phasuk, T. Vongpralup, P. Pakdee, S. Katawatin and S. Simaraks. 2003. Effects of ascorbic acid on respiratory rate, body temperature, heterophil: lymphocyte ratio and microscopic lesion score in lung, liver, kidney, cardiac muscle and spleen in broilers under chronic heat stress. Thai Journal Agricultural Science. 36(2): 207-218. W. Aengwanich, Y. Phasuk, T. Vongpralup, P. Pakdee, S. Katawatin and S. Simaraks. 2003. Physiological adaptation and effects of ascorbic acid on adaptation in broilers under heat stress. Thai Journal Agricultural Science. 36(3): 225-232. Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2004. Effects of synchronizing the rate of degradation rate of dietary energy and nitrogen release on

71

digestibility, rumen fermentation and average daily gain in Brahman beef cattle. In : The 11th AAAP Animal Science Congress – 2004, The Asian-Australasian Association of Animal Production Societies. Kuala Lumpur, Malaysia. 2, 364-366. Jumpawadee, S., K. Sommart, T. Vongpralab and V. Pattarajinda. 2005. Estimating rumen undegradable protein with In situ nylon bug and In vitro enzymatic techniqul in tropical concentrate feedstuffs. Walailuk J. Sci and Tech. 2(1):23-33. Sangkaew, A. , P. Saengsriraong, P. Suwantada and S. Sringam. 2005. Effect of dimethylsulfoxide ( DMSO) on cryopreserved Thai cock semen. The 12th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction, Chaingmai, 2 – 4 August 2005. Abstracts. Sringams, S. , A. Sangkaew, B. Laopiboon, M. Duangjinda and T. Vongpralab. 2005. Comparison of different diluents on semen quality of Thai native cook. The 12th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction, Chaingmai, 2 – 4 August 2005. Abstracts. Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2006. Effects of Synchronizing the rate of Dietary Energy and Nitrogen Release on Ruminal Fermentation, Microbial Protein Synthesis, Blood Urea Nitrogen and Nutrient Digestibility in Beef Cattle. Asian-Australasian Journal of Animal Science. 19(2): 181- 188. Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2006. Effects of synchronizing the rate of degradation of dietary energy and nitrogen release on growth performance in Brahman cattle. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 28(1): 59-70. ประชมวชาการนานาชาต: Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2004. Effects of synchronizing degradation rate of dietary energy and nitrogen release on growth performance, microbial protein synthesis and blood urea nitrogen in beef cattle. In: The 11th AAAP Animal Science Congress – 2004, The Asian-Australasian Association of Animal Production Societies. Kuala Lumpur, Malaysia. 3, 364-366. Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2004. Effects of synchronizing the rate of degradation of dietary energy and nitrogen release on

72

growth performance in Brahman beef cattle. In Proceeding The agricultural Annual conference 2004, Khon kaen University, Khon Kaen, Thailand. Chumpawadee, S., K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2005. Nutritional evaluation of crop residues and selected roughages for ruminant using in vitro gas production technique. In: Proceeding Integrating Livestock-crop systems to meet the challenges of globalization. Vol. 2. P53. AHAT/BSAS International Conference. Thailand. Chumpawadee, S. , K. Sommart, T. Vongpralup and V. Pattarajida. 2005. Ruminal undegradable protein of tropical feed stuffs using nylon bag and enzymatic techniques. In Proceeding The Agricultural Annual conference 2005, Khon kaen University, Khon Kaen, Thailand. Sangkaew, A. , P. Saengsriraong, P. Suwantada and S. Sringam. 2005. Effect of dimethylsulfoxide (DMSO) on cryopreserved Thai cock semen. The 12th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction, Chaingmai, Thailand. Sringams, S., A. Sangkaew, B. Laopiloon, M. Duangjinda and T. Vongpralup. 2005. Comparison of different diluents on semen quality of Thai native cock. The 12th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction, Chaingmai, Thailand. T. Vongpralup and W. Chinchiyanonda. 2005. Effect of serum source on bovine embryo development in vitro. The 12th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction, Chaingmai, Thailand. 6.4 งานวจยทก าลงท า :

การปรบปรงพนธไกพ นเมองไทยประดหางด าและชดวยดชนการคดเลอก (ปงบประมาณ 2550 – 2553) แหลงทนจาก สกว. (ผรวมวจย)