The SDS-PAGE

制作人：李菡

农业生物学实验教学中心

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果分析 五、注意事项

一、实验目的

学习 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。

掌握 SDS-PAGE 的操作技术。

二、实验原理

SDS 的性质与作用聚丙烯酰胺凝胶的性质

SDS 的性质与作用

十二烷基磺酸钠 (SDS)

Sodium dodecyl sulphate

CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+

Protein StrandProtein Strand

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SDS MoleculesSDS Molecules

DenatureDenature

SDS 的性质与作用

蛋白质变性 0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇蛋白质变与 SDS 分子按比例结合 1 ： 1.4

SDS

SDS 的性质与作用

聚丙烯酰胺凝胶性质 聚丙烯酰胺凝胶 (PAG) 是由丙烯酰胺（ Acr ）和甲叉双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。

聚丙烯酰胺凝胶 (PAG) 具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续 pH 梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶性质

X Y Z+ SDS

PAGE SDS-PAGEX Y Z- +-

结果受分子量大小和电荷的影响 结果只与分子量大小有关

-

+

PAGE 和 SDS-PAGE 的比较

三、实验步骤

制备分离胶制备浓缩胶电泳及染色凝胶板剥离与染色

分离胶(10%.5ml)

H2O 1.4ml

30%Acr 1.7ml

Buffer 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl

1.8ml

10%SDS 0.05ml

10%Ap 0.05ml

TEMED 5µl

配制分离胶溶液制备分离胶

凝胶配制过程要迅速 , 催化剂 TEMED 要在注胶前再加入。注胶过程要一次性完成 ,避免产生气泡。

加入分离胶溶加入分离胶溶液 液 pH 8.8pH 8.8

封水或饱和封水或饱和正丁醇溶液正丁醇溶液

出现明显界面时，分离胶凝聚完成（ ３０ min~ １ h ）

倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干

制备分离胶

封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

浓缩胶(5%.3ml)

H2O 0.7ml

30%Acr 1.5ml

Buffer 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl

0.75ml

10%SDS 0.03ml

10%Ap 0.03ml

TEMED 4µl

配制浓缩胶溶液制备浓缩胶

分离胶分离胶

pH 8.8pH 8.8

加入浓缩胶溶液 pH 8.6

制备浓缩胶样梳需一次平稳插入 , 梳口处不得有气泡 , 梳底需水平。

插入样品梳

加入电极缓冲加入电极缓冲液液 pH 8.3pH 8.3

浓缩胶浓缩胶

pH 8.6pH 8.6

通电通电

分离胶分离胶

pH 8.8pH 8.8

加入样品加入样品

上样及电泳

开始电流恒定在开始电流恒定在 10mA10mA ，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为 20mA20mA ，，溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约 5mm5mm 时，停止电泳。时，停止电泳。

凝胶板剥离与染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 .

影响电泳速度的外界因素 1. 电场强度 2. 溶液的 pH 值 3. 溶液的离子强度 4. 电渗现象 5. 温度的影响 6. 支持物的影响

四、结果分析

标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

= µ°°×ÑùÆ·¾à¼ÓÑù¶ËǨÒƾàÀ루 cm£©

äå·ÓÀ¶Çø ø ÖÐÐľà¼ÓÑù¶Ë¾àÀ루 cm£© Ïà ¶ÔǨÒÆÂÊ

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。

凝胶成像分析系统

将胶片放入该系统，软件分析，得出未知蛋白分子量。

精氨酸激酶的纯化结果

五、注意事项 1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。

2. 过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外， 10%过硫酸铵必须现用现配， 4℃冰箱贮存不超过 48小时。

3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。

4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加 1—2cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别是夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在 4℃冰箱中电泳。