this is your presentation titlestart arg pro ala stop sunt codați 20 de aminoacizi prin secvențe...
TRANSCRIPT
Malbware
Varujan Pambuccian
Aceasta este o prezentare despre • Biologie sintetică • CRISPR • Malbware
și despre cum poate fi afectat genomul prin editarea genetică
Despre ADN 1
Banca de date europeană de proteine www.ebi.ac.uk/pdbe/
www.celldesigner.org
Site-uri pentru tineri
igem.org
Site-uri recomandate www.addgene.org
www.genome.gov National Human Genome Institute
Structura și organizarea ADN-ului 1.1
Câteva considerații despre ADN/ARN - Suportul
OO-
O
O-
P
C C
C
C
C
O
OO-
O
O
P
C C
C
C
C
O
OO-
O
O
P
C
...
C
C
C
C
O
OO-
O-
O
P Structura de suport a digiților
CO
H
O
H
H
O
C
C
CC
O
Legătură la digit
1'
2'3'
4'5'
Legătura la fosfat
Legătura la fosfat
Atomul de oxigen se
pierde în cazul ADN-
ului fiind înlocuit de
un hidrogen
Câteva considerații despre ADN – Structura dublă antiparalelă
5’
5’
3’
3’
...
OO-
O-
O
P
C
C
C
C
O
OO-
O
O-
P
C
OO-
O
O
P
C
OO-
O
O
P
C
C
C
C
C
O
C
C
C
C
O
...
O O-
O
O-
P
C
O O-
O
O
P
C
O O-
O
O
P
C
C
C
C
C
O
C
C
C
C
O
O O-
O-
O
P
C
C
C
C
O
Câteva considerații despre ADN/ARN - Digiții
N
N
H
N
H2
N
C
CC
C
C
N
Conector
N
N
H
N
NN
H2
O
C
CC
C
C
Conector
HN
N
H
O
O
CC
CC
Conector
HN
N
H
O
O
C
CC
Conector
N
N
H
O
N
H2
H
C
C
C
C
Conector
Adenină (A) Timină (T) Uracil (U)
Citozină (C) Guanină (G)
Câteva considerații despre ADN/ARN – Codarea proteinelor
A doua literă
U C A G
Pri
ma
lite
ră
U
UUU Phe
UCU
Ser
UAU Tyr
UGU Cys
U
A 3
-a li
teră
UUC UCC UAC UGC C
UUA Leu
UCA UAA STOP
UGA STOP A
UUG UCG UAG UGG Trp G
C
CUU
Leu
CCU
Pro
CAU His
CGU
Arg
U
CUC CCC CAC CGC C
CUA CCA CAA Gin
CGA A
CUG CCG CAG CGG G
A
AUU
Ile
ACU
Thr
AAU Asn
AGU Ser
U
AUC ACC AAC AGC C
AUA ACA AAA Lys
AGA Arg
A
AUG START ACG AAG AGG G
G
GUU
Val
GCU
Ala
GAU Asp
GGU
Gly
U
GUC GCC GAC GGC C
GUA GCA GAA Glu
GGA A
GUG GCG GAG GGG G
5’ ATGCGTCCGGCGTAG 3’
3’ TACGCAGGCCGCATC 5’
A T (ADN)
A U (ARN)
G C (ADN și ARN)
ATG CGT CCG GCG TAG (ADN )
TAC GCA GGC CGC ATC (ADN )
AUG CGU CCG GCG UAG (ARN)
Start Arg Pro Ala Stop
Sunt codați 20 de aminoacizi prin secvențe de 3 nucleotide (din 64 de posibilități codate așa)
Organizarea ADN-ului
5' 3'
Codon inițiator Codon terminator
START transcriere
STOP transcriere
Exon (Secvențe care codează
proteine)
Intron (Secvențe care nu codează proteine)
Secvență netranslatată
Secvență translatată
Structura unei gene
Structura ADN-ului uman
Geometria ADN-ului
• ADN-ul este un polimer cu lungimea de circa 2 m și o grosime de 20 Å (0,1 nm)
• Elicea dublă are circa 297 milioane de rotații complete și o rază a elicei de 1 nm
La nivelul genomului uman
1% din ADN codează proteine sau ARN 7% din ADN reglementează expresia genelor care codează proteine sau ARN
92 % din ADN are o utilitate nedescifrată încă
Codare
Expresie
Terra incognita
Mecanisme celulare de intervenție asupra ADN-ului
0.1
Enzime cu rol important în manipularea ADN-ului
Nucleaza este o enzimă capabilă să rupă permanent legăturile de fosfat la nivelul unui acid nucleic
Topoizomeraza derulează structura elicoidală și o face local planară desfăcând pentru un scurt timp și refăcând legăturile fosfatice. Rolul ei constă în detorsionarea structurii elicoidale.
Cas9 este un tip particular de nuclează
Enzime cu rol important în manipularea ADN-ului
Helicaza este o enzimă capabilă să rupă legăturile de hidrogen dintre digiții din ADN
ADN
dTTP
ATP
ATP
ADP
ADP
dTTP
dTTP
dTTP
dTTP
dTTP
Echipamente de laborator și producție
1.3
Echipamente de sinteză ADN/ARN/LNA
1200-3000$ (eBay) ADN only
15000-30000$
Secvențiatoare ADN/ARN
Illumina NovaSeq 6000 – 0.98 M$
Preț/1Gb secvențiat – 7$
CRISPR 2
1987 – Secvențe repetitive descoperite la Escherichia Coli
Yoshizumi Ishino Universitatea din Osaka
5’ 3’
(1452) CGGTTTATCCCCGCTGATGCGGGGAACACCAGCGTCAGGCGTGAAATCTCACCGTCGTTGC (1512)
(1513) GGTTTATCCCTGCTGGCGCGG GGAACTCTCGGTTCAGGCGTTGCAAACCTGGCTACCGGG (1573)
(1574) CGGTTTATCCCCGCTAACGCGGGGAACTCGTAGTCCATCATTCCACCTATGTCTGAACTCC (1634)
(1635) CCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCG (1664)
CGG TTT ATC CCC GCT GG
AA CGC GGG GAA CTC
C G G T T T A
TCCCCGC
GCGGGGA
A T G C
T G G C
2005 – CRISPR
Gene CAS
Separator Secvență ADN viral
Zona CRISPR
Francisco Mojica Universitatea din Alicante, Spania
Christine Pourcel-Vergnaud Institut de Biologie Intégrative de la Cellule, Paris, Franța
2012 – Mecanismul CRISPR/Cas9
Emmanuelle Charpentier
Jennifer Doudna
Cas 9
5'
5'3'
3'5'
Pro
tosp
ace
r (2
0 n
ucl
eoti
de
)
3'
tracrRNA
crRNA
PAM
Componente moleculare utilizate în CRISPR/Cas9
• protospacer element – o secvență care conține de obicei 20 de nucleotide, complementară secvenței țintă din ADN
• crRNA (CRISPR RNA) – molecula care începe cu cele 20 de nucleotide din protospacer și se încheie cu o secvență complementară secvenței de început din tracrRNA.
• tracrRNA - (transactivating RNA) – hibridizează secvența complementară din crRNA și se leagă la Cas9
3'
5'
Protospacer (20 nucleotide)
crRNA
linker loop
tracrRNA
sgRNA
sgRNA (single guide RNA) = crRNA + linker loop + tracrRNA
Tehnologii anterioare CRISPR
Zinc finger
TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)
150x mai ieftin 10-15x mai ieftin
în funcție de Cas
Proprietate intelectuală și echipamente
2.1
13 Iunie 2013 - Proprietatea intelectuală
Nu pot fi brevetate secvențele care se găsesc în natură Pot fi brevetate secvențele sintetice
2015 - CRISPR/Cpf1 – o problemă de brevetare
Jennifer Doudna, University of
California Berkeley
Feng Zhang, Broad Institute,
Cambridge, Massachusetts
Materiale și costuri
Material Producător Costuri
Fragment de ARN Laborator specializat 10-50$
Substanțe chimice și enzime On the shelf 30-40$
Kituri ieftine
75$ 1850$
Un instrument care dezvoltă rapid baza de cunoștințe
Aplicații ale CRISPR 2.2
Aplicații în medicina umană .2.1
Aplicații CRISPR – Tratarea cancerului prin reprogramarea celulelor T
Lu You, Universitatea Sichuan Proiect derulat între August 2015 și Aprilie 2018
Editas medicine
• Amauroza congenitală Leber o Cauza cea mai frecventă pentru orbirea infantilă o Este produsă de o mutație a genei CEP290 o Editas a primit aprobare pentru teste clinice pe oameni constând
în repararea genei CEP290 utilizând o tehnologie CRISPR/Cas9
Feng Zhang, Editas
• Deține 20 de brevete în domeniul CRISPR • Dificultăți în atribuirea patentului pentru tehnologia
cheie utilizată (CRISPR/Cpf1), obținut în favoarea Broad Institute of Harvard and MIT in 2014, contestat de Jennifer Doudna, University of California, Berkeley
CRISPR Therapeutics
Emmanuelle
Charpentier
Câteva aplicații în domenii nemedicale
2.2.2
În agricultură
Tomate care ajung la maturitate cu două săptămâni mai devreme
În horticultură
University of Tsukuba, Yokohama City University, și National Agriculture and Food Research Organization
Se pot crea noi specii
Fluture alterat prin CRISPR
Porci pitici ca animale de companie (de talia unui câine mediu) - China
Biohacking – 140$ kit CRISPR
Josiah Zayner - 2016
Malbware 3
Cum poate fi adusă o specie în extincție
Din ce rezidă pericolele potențiale pentru om?
1. Tehnologia permite personalizarea precisă a țintei selectând secvențe precise din ADN care să servească pentru ghidare
2. Tehnologia permite o ajustare scalabilă adresând secvențe ADN care pot caracteriza o singură persoană, o familie, un haplogrup sau o rasă.
3. Poate utiliza vectori invizibili, de regulă vectori de tip viral care se pot răspândi epidemic
4. Poate utiliza și vectori macroscopici de la insecte la vectori alimentari.
Mulțumesc!