ti Ưu hÓa quÁ tr Ình thu nh °n flavonoid tỪ cỦ cẢi tr...

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THU NHẬN FLAVONOID

TỪ CỦ CẢI TRẮNG (Raphanus sativus L.)

VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA VI SÓNG

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Pham Thi Kim Ngoc

Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng6 - năm 2017

i

THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI

Tên đề tài: Tối ưu hóa quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng Raphanus

sativus với sự hỗ trợ của vi sóng.

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Phạm Thị Kim Ngọc

Nội dung chính:

1. Tối ưu quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng trong điều kiện không xử

lý và xử lý vi sóng. Xác định các điều kiện xử lý vi sóng để phá vỡ tế bào giúp

thu nhận flavonoid tốt nhất.

2. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid thu được.

Kết quả đạt được:

1. Đã xác định được các thông số tối ưu cho quá trình xử lý vi sóng.

2. Công bố 1 bài báo trên tạp chí Thông tin khoa học công nghệ Sở Khoa học

Công nghệ tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu, số 4/2016.

Thời gian nghiên cứu: 12 tháng từ tháng 4/2016 đến tháng 3/2017.

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PHÒNG KHOA HỌC & CGCN VIỆN KỸ THUẬT VÀ KINH TẾ BIỂN

ii

LỜI CẢM ƠN

----------

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.

Phòng Khoa Học và Chuyển giao Công nghệ.

Lãnh đạo Viện Kỹ thuật và Kinh tế Biển

Và các bạn đồng nghiệp Ngành Công nghệ Thực phẩm, Viện Kỹ thuật và Kinh

tế Biển đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.

Vũng Tàu, tháng 6 năm 2017

Chủ nhiệm đề tài

iii

MỤC LỤC

Trang

Thông tin chung về đề tài ..................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii

Mục lục ................................................................................................................. iii

Danh mục hình ...................................................................................................... vi

Danh mục bảng .................................................................................................... vii

Danh mục các chữ viết tắt .................................................................................... viii

Lời mở đầu ........................................................................................................... 1

Chương 1. Tổng quan ......................................................................................... 3

1.1 Tổng quan về củ cải cải trắng ........................................................................ 3

1.1.1 Thực vật học cây cải củ ............................................................................... 3

1.1.2 Thành phần hóa học củ cải trắng ................................................................ 6

1.2.2.1 Thành phần hóa học cơ bản ..................................................................... 6

1.2.2.2 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng ................................................. 6

1.2 Hợp chất flavonoid ....................................................................................... 7

1.2.1 Khái niệm ................................................................................................... 7

1.2.2 Phân loại ..................................................................................................... 8

1.2.3 Tính chất lý hóa .......................................................................................... 8

1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid .................................................................... 9

1.2.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................... 9

1.2.4.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm ...................................... 11

1.2.4.3 Tác dụng đối với enzyme ......................................................................... 11

1.2.4.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường .................................... 11

1.2.4.5 Tác dụng đối với ung thư ......................................................................... 12

1.3 Quá trình trích ly thu nhận hợp chất flavonoid ............................................. 12

1.3.1 Quy trình chung của quá trình thu nhận flavonoid từ mẫu thực vật ......... 12

1.3.2 Phương pháp trích ly thu nhận flavonoid từ mẫu nghiên cứu ................... 13

iv

1.3.2 Nguyên lý của quá trình trích ly ................................................................ 14

1.3.4 Trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng ............................................................... 14

1.3.4.1 Khái niệm ................................................................................................. 14

1.3.4.2 Cơ chế tác dụng ........................................................................................ 14

1.3.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp ............................................................ 15

1.3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến MAE .............................................................. 15

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................... 16

1.4.1 Nghiên cứu trong nước ................................................................................ 16

1.4.2 Nghiên cứu ở nước ngoài ............................................................................ 17

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................ 19

2.1 Thời gian, địa điểm thực hiện ......................................................................... 19

2.2 Nguyên vật liệu - dụng cụ ............................................................................... 19

2.3 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 19

2.4 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 20

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng

phương pháp truyền thống ................................................................................... 20

2.4.1.1 Khảo sát loại dung môi ........................................................................... 20

2.4.1.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) ........................... 19

2.4.1.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly ........................................................................ 19

2.4.1.4 Khảo sát thời gian trích ly ....................................................................... 19

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng với sự hỗ

trợ của vi sóng ...................................................................................................... 20

2.4.2.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) ........................... 20

2.4.2.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng .................................................. 20

2.4.2.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly ......................................... 20

2.4.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng ....................... 21

2.5 Phương pháp phân tích .................................................................................. 23

2.5.1 Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu ............................................ 23

2.5.2 Xác định hàm lượng flavonoid tổng (TFC) ................................................ 23

v

2.5.3 Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS* ................................................. 23

2.6 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 26

Chương 3. Kết quả - Thảo luận ......................................................................... 27

3.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu ................................. 27

3.2 Kết quả thí nghiệm 1 ....................................................................................... 27

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi sử dụng ......................................... 27

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) .. 29

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly ...................................................... 30

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................... 31


3.3.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) ........................... 32

3.3.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng .................................................. 33

3.3.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly ......................................... 34


Kết luận – kiến nghi ........................................................................................... 41

Tài liệu tham khảo .............................................................................................. 42

Phụ lục

vi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Một số loại củ cải 4

Hình 1.2 Hoa, lá và quả của cây cải củ 5

Hình 1.3 Cây và củ cải trắng 5

Hình 1.4 Khung sườn cơ bản của flavonoid 8

Hình 1.5 Các phân nhóm chính của flavonoid 8

Hình 1.6 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxyl 10

Hình 1.7 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại 11

Hình 1.8 Quy trình thu nhận flavonoid từ thực vật 12

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 18

Hình 2.2 Đường chuẩn quercetin dùng xác định TFC 25

Hình 2.3 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS* 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi dùng trích ly 26

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng dùng trích ly 27

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độtrích ly 28

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 29

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/ lỏng khi có xử lý vi sóng 31

Hình 3.6 Ảnh hưởng của công suất sóng khi có xử lý vi sóng 32

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng khi có xử lý vi sóng 33

Hình 3.8 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung

môi và thời gian đến TFC với công suất vi sóng 300 W 36

Hình 3.9 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung

môi. công suất và thời gian xử lý vi sóng đến TFC 36

Hình 3.10 Hình chụp SEM bã củ cải sau trích ly không có vi sóng 37

Hình 3.11 Hình chụp SEM bã củ cải sau trích ly có sử dụng vi sóng 37

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của 100 g củ cải trắng Việt Nam 6

Bảng 1.2 Hiệu suất thu nhận flavonoid từ lá tía tô 16

Bảng 1.3 Hiệu quả thu nhận polyphenol từ lá Myrtus communis L. 16

Bảng 2.1Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn 23

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu củ cải trắng 25

Bảng 3.2 Các yếu tố dùng trong RSM 34

Bảng 3.3 Kế hoạch thực nghiệm và kết quả theo RSM để tối ưu TFC 34

Bảng 3.4 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy 35

viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TFC: total flavonoid content – flavonoid tổng số

LSD: Least – Significant Difference - sự khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa

ANOVA: Analysis of variance - phân tích phương sai

MAE: microwave - assisted extraction - trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng

ABTS: 2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

SEM: Scanning Electron Microscope - ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử quét

1

LỜI MƠ ĐÂU

Flavonoid là một trong 5 nhóm chính thuộc nhóm các hợp chất polyphenol, được

biết đến là một nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người,

trong đó nổi bật nhất là các chức năng chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống viêm nhiễm

và ung thư…

Trong tự nhiên, các hợp chất flavonoid tồn tại khá phổ biến, được tìm thấy trong

hầu như tất cả các loài thực vật. Đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu về

flavonoid từ các loài thực vật khác nhau, tập trung vào khảo sát thành phần hóa học,

hoạt tính sinh học của hợp chất đơn lẻ và dịch chiết, phương pháp cải thiện hiệu suất

thu nhận (sử dụng phương pháp trích ly hiện đại có các giải pháp hỗ trợ: enzyme, vi

sóng, sóng siêu âm, áp suất cao...), ứng dụng các hợp chất thu nhận được vào việc tạo

ra các sản phẩm thương mại. Các phương pháp trích ly hiện đại đều cho hiệu quả thu

nhận cao hơn, rút ngắn được thời gian trích ly, bảo toàn được hoạt tính của dịch chiết

thu được. Tuy nhiên, điều kiện trích ly tối ưu cho từng phương pháp trên mỗi đối

tượng cụ thể là không giống nhau.

Củ cải trắng tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae, là

cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế

giới. Theo các tài liệu y học ghi nhận, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, không độc,

Những nghiên cứu khoa học được công bố gần đây từ một số nước trên thế giới cho

thấy củ cải trắng có thành phần hóa học rất phong phu, trong đó có chứa các hợp chất

phenolic và flavonoid. Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau phổ biến, rẻ tiền, được

trồng và sử dụng nhiều, nhưng các nghiên cứu về thành phần, hoạt tính và ứng dụng

của loại củ này còn rất hạn chế.

Với mục đích thu nhận dịch chiết giàu flavonoid từ củ cải trắng, tôi đã thực hiện

nghiên cứu: “Tối ưu hóa quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng Raphanus sativus

L. với sự hỗ trợ của vi sóng”.

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu này, mặc dù đã rất cố gắng, song không thể

tránh được còn nhiều hạn chế, thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của Hội đồng

để đề tài được hoàn thiện hơn.

2

❖ Mục đích nghiên cứu: Xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý vi sóng

để thu nhận hợp chất giàu hoạt tính chống oxi hóa từ củ cải trắng Raphanus sativus

L.

❖ Nội dung chính:

1. Tối ưu quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng trong điều kiện không xử

lý và xử lý vi sóng. Xác định các điều kiện xử lý vi sóng để phá vỡ tế bào giúp

thu nhận flavonoid tốt nhất.

2. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid thu được.

❖ Phương pháp nghiên cứu:

Các phương pháp phân tích thông thường được dùng để xác định thành phần

hóa học của nguyên liệu củ cải trắng.

Đánh giá hiệu quả quá trình trích ly qua hàm lượng flavonoid thu nhận được.

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp tạo màu với muối nhôm

clorua.

Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá qua khả năng khử gốc tự do ABTS*.

Quá trình tối ưu được thực hiện theo mô hình Box – Wilson dạng CCC trên phần

mềm Mode 5.0.

Quan sát sự thay đổi cấu trúc bề mặt nguyên liệu trong điều kiện không xử lý và

xử lý vi sóng bằng phương pháp chụp SEM.

3

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về củ cải trắng

1.1.1 Thực vật hoc cây cải củ

Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học là Raphanus

sativus L. thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ

Brassicales, họ Brassicaceae, chi Raphanus, loài sativus [1].

Củ cải trắng còn có các tên gọi khác như white radish (Anh), Daikon (Nhật), Hua

piahs (Thái Lan), Lai fu (Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc),

Muli (Ấn Độ) [1], [2]

Nhiều tài liệu cho rằng cải củ hoang dại có nguồn gốc từ khu vực Biển Đen và

Địa Trung Hải, đã được dùng như một loại thực phẩm từ thời Ai Cập cổ đại, sau đó

được trồng ở châu Âu vào thế kỉ 16-17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20. Ở khu vực Đông

Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450

năm trước và ở Nhật Bản 1300 năm trước [3].

Chi Raphanus được chia thành 2 phân chi: Raphanis DC. và Hesperidopsis Boiss.

Phân chi Raphanis DC. có 5 loài khác nhau gồm Raphanus sativus, Raphanus

raphanistrum, Raphanus microcarpus, Raphanus rostras và Raphanus landra. Phân

chi Hesperidopsis Boiss chỉ có 1 loài là Raphanus maritimus [3].

Loài Raphanus sativus lại được chia thành 5 thứ khác nhau, gồm: thứ radicular

DC. (thứ sativus Saz. củ cải Hatsuka, củ cải tròn nhỏ ở miền Bắc Trung Quốc), thứ

niger (Mill.) Pers. (thứ majorA.Voss, củ cải đen, củ cải nhỏ ở các nước phương tây),

thứ raphanistroides Makino (thứ hortensis Backer, củ cải miền bắc Trung Quốc, củ

cải miền nam Trung Quốc, củ cải Nhật Bản), thứ mougri Helm (thứ caudatus (L.)

Hooker et Anderson, củ cải có đuôi), thứ olerfer Netz. (thứ oleiformis Pers., củ cải

lấy dầu) [3].

Trong mỗi thứ lại chia ra thành nhiều giống khác nhau do nguồn gốc, sự lai hóa,

điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ gieo trồng. Nhìn chung, trong gia đình họ cải củ

có sự đa dạng về kích thước, hình dáng và màu sắc. Dựa vào yếu tố màu sắc, người

ta thường chia củ cải thành các nhóm lớn: củ cải trắng (white radish), củ cải đỏ (red

radish) và củ cải đen (black radish). Dựa vào yếu tố hình dáng, chia củ cải thành 2

4

nhóm lớn: của cải tròn và củ cải dài. Trong khi củ cải tròn, nhiều màu sắc khác nhau

phổ biến ở các nước phương Tây, củ cải dài màu trắng phổ biến ở các nước châu Á

như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam.

Cải củ là cây hàng năm, thân củ, được trồng chủ yếu để lấy củ. Củ có thể dùng ăn

sống, nấu chín hoặc ngâm muối. Ở một số quốc gia, thân và lá cũng được sử dụng

như một loại rau. Cây con của cải củ (mầm củ cải), cũng được sử dụng như một loại

rau.

Cải củ có rễ cọc phình to thành củ chứa nhiều dinh dưỡng, hình dáng, màu sắc,

kích thước phụ thuộc vào giống. Rễ củ là bộ phận chính được dùng trong thực phẩm

mà ta quen gọi là củ, củ có hình dạng khác nhau phụ thuộc vào giống, chế độ dinh

dưỡng, đất đai và điều kiện ngoại cảnh. Củ hình thành ở giai đoạn 4 - 6 lá thật tuỳ

từng giống. Củ cải trắng Việt Nam thường thon dài 15 - 30 cm, đường kính 3 - 4 cm,

màu trắng, vị cay nồng, cấu trúc giòn [1], [4].

Hình 1.1 Một số loại củ cải

Lá: có màu xanh hoặc xanh vàng tùy giống. Lá mọc ở phần đầu của củ gồm phiến

lá và cọng lá. Cọng dài hay ngắn, nhỏ hay to, không lông hay có lông tùy giống. Phiến

có thể nguyên hay xẻ thùy, rìa lá nguyên hay răng cưa tùy giống.

Hoa có dạng chùm và mọc thành cụm ở đỉnh và có màu trắng hay phớt tím, hoa

có 4 cánh hoa.

5

Quả dài hình trụ và thắt lại từng đoạn, mỏ quả dài, có màu xanh, khi chín thì vỏ

quả chuyển sang màu vàng, số hạt trong quả tuỳ theo giống, thông thường mỗi quả

có từ 3-5 hạt. Hạt hình tròn hoặc thuôn dài, đầu tiên hạt có màu xanh, khi chín hoàn

toàn thì hạt chuyển sang màu nâu [4], [5].

Hình 1.2 Hoa, lá và quả của cây cải củ

Cải củ có thể trồng quanh năm. Thời gian trồng tốt nhất là mùa xuân và đầu mùa

thu. Thời gian sinh trưởng khác nhau từ 50 đến 90 ngày tùy giống và sản phẩm mong

muốn, nhưng thường là 50 - 60 ngày vào mùa hè và 70 - 80 ngày vào mùa đông. Nhiệt

độ lý tưởng cho sự sinh trưởng là 20 - 250C. pH đất trồng tối ưu là 6,0 – 6,5. Loại cây

trồng này không chịu được điều kiện ngập nước [4,5].

Hình 1.3 Cây và củ cải trắng

6

1.1.2 Thành phần hóa hoc củ cải trắng

1.2.2.1 Thành phần hóa hoc cơ bản

Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1. Trong

củ cải trắng, protein chiếm khoảng 1,5% khối lượng củ với nhiều acid amin không

thay thế như glycine, alanine, serine, proline, valine, threonine, trans-4 hydroxy – L

– proline, leucine, isoleucine, methione, phenylalanine, arginine, acid aspartic, acid

glutamic, tryptophan, cystein, lysine, histidine, tyrosine và cystine [6], [7].

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của 100 g củ cải trắng Việt Nam

STT Thành phần Hàm lượng STT Thành phần Hàm lượng

1 Nước 92 g 8 Sắt 1,1 mg

2 Protein 1,5 g 9 Phospho 41 mg

3 Glucid 3,7 g 10 Vitamin PP 0,5 mg

4 Lipid 0,1 g 11 Vitamin B1 0,1 mg

5 Chất xơ 1,5 g 12 Vitamin B2 0,1 mg

6 Tro 1,2 g 13 Vitamin C 30 mg

7 Canxi 40 mg 14 Β-caroten 15 mcg

(nguồn: Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam)

Glucid trong củ cải trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ. Đường trong củ

cải trắng chủ yếu là glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan. Tinh bột

thay đổi tùy theo giống, chiếm từ 0,2 – 0,5%. Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5%

gồm chủ yếu là cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mô nâng đỡ và thành tế

bào của củ cải trắng, đóng vai trò tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học. Pectin

chiếm khoảng 0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu

dưới dạng calcium pectate [8], [9]. Ngoài ra, củ cải trắng còn nổi bật với hàm lượng

lipid thấp, hàm lượng vitamin và khoáng cao. Một số khoáng vi lượng cũng được tìm

thấy trong củ cải trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flour và iod với hàm

lượng tổng lên đến 18 µg/100g [8].

1.2.2.2 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy trong củ cải trắng có chứa nhiều hợp chất

thứ cấp có lợi cho sức khỏe con người.

7

Enzyme: trong củ cải trắng đã tìm thấy sự hiện diện của các enzyme invertase,

cellulase, ß-galactosidase, protease, peroxidase, catalase, sucrase, amylase, alcohol

dehydrogenase, pyruvic carboxylase [8], [10], [11], glutathione reductase [12] và

raphanin [13]. Trong số này, catalase và glutathione reductase là 2 enzyme có tác

dụng như những chất chống oxi hóa bậc 2, góp phần ngăn chặn sự tạo thành các gốc

tự do [14]. Ngoài ra, raphanin, một protease trung tính có khả năng kháng khuẩn và

kháng nấm mạnh cũng được tìm thấy trong củ cải trắng.

Acid hữu cơ: chủ yếu gồm acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid erythorbic,

acid erucic, acid gentisic, acid hydrocinnamic, acid salicylic và acid vanillic [15],

[16].

Các hợp chất phenolic: các flavonoid được tìm thấy trong củ cải trắng gồm

quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin, catechin và rutin [17], [18]. Các

acid phenolic có mặt trong củ cải trắng gồm caffeic, p-coumaric, ferulic,

hydroxycinnamic, p-hydroxybenzoic, vanillic, salicylic, acid gentisic [16], acid

syringic và phenyl pyruvic [19]. Anthocyanidin cũng được tìm thấy trong củ cải trắng

nhưng với hàm lượng nhỏ, ngoại trừ pelargonidine, delphinidin và cyanidine, là

những chất tạo màu cho củ cải đỏ, hồng hoặc tía [16].

Các hợp chất isothiocyanate: gồm 4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate

(raphasatin), 4-(methylthio) butyl isothiocyanate (erucin) [20], allyl isothiocyanate.

benzyl isothiocyanate và phenethyl isothiocyanate [12] đã được ghi nhận là có mặt

trong thành phần của củ cải trắng.

Ngoài các thành phần trên, trong củ cải trắng còn có các hợp chất tannin, alkaloid,

coumarin, gibberellin và các hợp chất có chứa lưu huỳnh.

1.2 Hợp chất flavonoid

1.2.1 Khái niệm

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau,

hoa và quả. Flavonoid có cấu truc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là gồm 2 vòng

benzen (vòng A và B) nối với nhau qua 1 dây 3 carbon (vòng pyron - vòng C).

8

Hình 1.4 Khung sườn cơ bản của flavonoid [21]

1.2.2 Phân loai

Flavonoid được chia thành ba phân nhóm chính: euflavonoid (2-

phenylbenzopyrans), isoflavonoid (3-benzopyrans) và neoflavonoid (4-

benzopyrans). Trong mỗi nhóm này các flavonoid lại được chia thành các nhóm phụ

khác nhau dựa vào sự khác biệt trong cấu tạo của vòng C [22], [23].

Hình 1.5 Các phân nhóm chính của flavonoid

(A: euflavonoid, B: iso-flavonoid, C: neo-flavonoid)

• Phân nhóm của euflavonoid gồm các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin),

flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy

flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone.

• Phân nhóm isoflavonoid gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol,

isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu.

• Neoflavon chỉ giới hạn trong một số cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman,

4-aryl-coumarin, dalbergion.

Ngoài ra. người ta còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid,

triflavonoid và flavonlignan [22].

1.2.3 Tính chất lý hóa

Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng

liên kết với đường (glycoside). Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme

9

sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Các đường thường gặp nhất là D-glucose, D-

galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [22].

Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether

dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether,

methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid. Glycoside:

tan trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch

đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng. Các flavonoid glycoside có nhóm -OH

tại vị trí C7 còn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid.

Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó

kết tinh hơn [22].

Các flavonoid thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol

có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon,

flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu.

Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin,

delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái [21], [22].

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với

pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm

có màu đặc trưng.

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho

flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại,

dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [22].

1.2.4 Giá tri sinh hoc của flavonoid

1.2.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa

Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ

trong ống nghiệm và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C,

vitamin E và carotenoids [24].

Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá

trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [25], [26].

Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá

nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một

loại đại phân tử sinh học, như các enzym. protein. DNA và lipid [24], [26]. Stress

10

oxihóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính

bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [24], [25].

Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc

điểm cấu trúc phân tử của chúng:

• Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng

thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi

hóa khử, bắt giữ các gốc tự do;

• Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên

hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự

do.

• Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như

catechol…giup làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [24], [25].

Quá trìnhchống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau:

• Khử và vô hoạt các gốc tự donhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất flavonoid

nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng cách nhường ngyên tử

hidro hoặc một electron cho gốc tự do [26].

Hình 1.6 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxyl [25]

• Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim loại vi

lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do [26].

11

Hình 1.7 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại [25]

• Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme tham gia

vào quá trình sản xuất các gốc tự do [26].

1.2.4.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật. chống viêm nhiễm

Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển

của S.aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với đường kính

vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [29]. Kết quả tương tự đối với dịch

chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P.aeruginosa, B.subtilis

và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml [40]. Quercetin làm

giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter

pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [32].

1.2.4.3 Tác dụng đối với enzyme

Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của enzyme

α-glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM [33]. Một số flavonoid cũng đã cho thấy

hoạt tính ức chế đối với enzyme xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa

xanthine và hypoxanthine thành acid uric [27].

1.2.4.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường

Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của

chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ

vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch

vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp... Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng

các flavonoid tự nó có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng

của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong

quá trình chuyển hóa đường…[27].

12

1.2.4.5 Tác dụng đối với ung thư

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid.

gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo

của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Quercetin có tác dụng ức chế

sự phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có

tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u [34]. Naringenin và kaempferol-

3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu nhận từ hoa của cây Melastoma

malabathricum L. cũng đã được tìm thấy là có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng

tế bào ung thư vu MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3 µM [35].

1.3 Quá trình trích ly thu nhận hợp chất flavonoid

1.3.1 Quy trình chung của quá trình thu nhận flavonoid từ mẫu thực vật

Hình 1.8 Quy trình thu nhận flavonoid từ thực vật

Nguyên liệu

Chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu

Trích ly

Lọc

Dịch trích

Cô giảm áp loại dung môi

Cao thô chứa

flavonoid

Tinh chế Flavonoid

Bã Dung môi

13

Mẫu thực vật dùng nghiên cứu sau khi thu gom sẽ trải qua quá trình sơ chế chuẩn

bị để có dạng mẫu phù hợp cho nghiên cứu. Quá trình sơ chế chủ yếu là rửa sạch, loại

các phần hư hỏng và tạp chất, cắt nhỏ mẫu.

Sau đó mẫu sẽ qua quá trình chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu (nếu có). Quá trình chuẩn

bị mẫu chủ yếu là tạo mẫu ở dạng tươi hay khô. Bảo quản lạnh mẫu nếu mẫu nghiên

cứu là mẫu tươi (bảo quản lạnh thường và bảo quản lạnh đông) hoặc sấy khô mẫu nếu

mẫu nghiên cứu là mẫu khô (sấy đối lưu, sấy lạnh, sấy thăng hoa). Ngoài ra, một số

quy trình còn có quá trình tiền xử lý mẫu như: chần hoặc hấp để ức chế một số enzyme

có trong mẫu, xử lý enzyme, nghiền nhỏ hoặc đồng hóa rồi đưa vào trích ly để thu

nhận flavonoid. Đây là những phương pháp xử lý mẫu khá phổ biến, đã được sử dụng

trong nhiều nghiên cứu.

Dịch sau trích ly được đem cô quay chân không loại dung môi thu cao chiết thô

chứa flavonoid. Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần

flavonoid.

1.3.2 Phương pháp trích ly thu nhận flavonoid từ mẫu nghiên cứu

Trích ly là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hoạt

tính sinh học từ thực vật, đóng vai trò vai trọng và quyết định đến kết quả và sự thành

công cuối cùng của nghiên cứu.

Quá trình trích ly có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, gồm:

• Các phương pháp truyền thống: chiết Soxhlet, ngâm dầm và ngấm kiệt.

• Các phương pháp hiện đại: trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, trích ly có

sự hỗ trợ của xung điện, trích ly có sự hỗ trợ của enzyme, trích ly có sự hỗ trợ của vi

sóng (MAE), trích ly ở áp suất cao, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn.

Mặc dù có nhiều phương pháp trích ly khác nhau, nhưng mục tiêu chung của các

phương pháp này đều là:

• Tách chất cần thu nhận ra khỏi mẫu thực vật vốn có thành phần phức tạp

• Tăng tính chọn lọc của các phương pháp phân tích

• Tăng độ nhạy của sự thử nghiệm các tác dụng sinh học của hợp chất khi nghiên

cứu trên cơ thể sống do tăng được nồng độ của chất

• Chuyển đổi các hợp chất mong muốn sang dạng phù hợp để phát hiện và tách

riêng [18].

14

1.3.3 Nguyên lý của quá trình trích ly [19]

Trích ly là quá trình hòa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên

liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung môi. Đây là quá trình truyền khối

do có sự chênh lệch nồng độ của hợp chất cần thu nhận bên trong nguyên liệu và dòng

chảy bên ngoài (dung môi). Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ

của cấu tử ở trong nguyên liệu và trong dung môi.

1.3.4 Trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE: microwave - assisted extraction)

1.3.4.1 Khái niệm [18], [20]

Vi sóng là sóng bức xạ điện từ có tần số từ 0,3 đến 300 GHz. Vi sóng dùng trong

gia đình và quy mô công nghiệp thường có tần số 2,45 GHz.

Hình 1.9 Thiết bị trích ly MAE [24]

Vi sóng được truyền đi dưới dạng sóng, do đó có thể xâm nhập vào bên trong các

vật liệu sinh học, tương tác với những phần tử phân cực bên trong vật liệu như nước

và sinh ra nhiệt. Do vậy, nó có thể làm nóng toàn bộ vật liệu cùng lúc.

1.3.4.2 Cơ chế tác dụng [18], [20]

Cơ chế tác dụng của vi sóng trong quá trình trích ly được cho là theo 3 bước như

sau:

• Do sự tương tác của vi sóng và các phân tử phân cực trong mẫu làm tăng nhiệt

độ và áp suất ở một số điểm hoạt động mạnh trong mẫu, gây ra sự phá vỡ cấu trúc tại

đó, giúp giải phóng các chất hòa tan bên trong.

15

• Từ những điểm đã bị phá vỡ dung môi sẽ xâm nhập sâu hơn vào bên trong

mẫu, kết hợp với sự tác động của vi sóng gây ra nhiều hơn sự phá vỡ các cấu trúc từ

bên trong.

• Các chất hòa tan trong mẫu sẽ được giải phóng dưới tác động của dung môi

và nhiệt độ.

1.3.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp [18], [20]

MAE có một số ưu điểm như sau: giảm thời gian trích ly, giảm lượng dung môi

sử dụng và nâng cao hiệu suất trích ly. MAE cũng có thể được so sánh với các phương

pháp trích ly hiện đại khác, ví dụ như trích ly bằng dung môi siêu tới hạn (SFE) vì ưu

điểm thiết bị đơn giản và giá thành thấp.

Tuy nhiên, nhược điểm của MAE là hiệu quả sẽ thấp nếu hợp chất cần thu nhận

hoặc dung môi sử dụng kém phân cực. Ngoài ra, khi so với SFE, nó còn có một nhược

điểm khác là cần phải có một quá trình loại dung môi để thu chất mong muốn. Đồng

thời, trong quá trình trích ly bằng MAE, sự tăng nhiệt độ cũng gây bất lợi nếu hợp

chất cần thu nhận có tính nhạy cảm với nhiệt độ cao.

1.3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến MAE

- Dung môi sử dụng: loại dung môi và nồng độ dung môi có ảnh hưởng quan

trọng đến hiệu quả thu nhận các hợp chất bằng MAE. Trong phương pháp MAE, các

dung môi có tính phân cực sẽ cho hiệu quả tốt hơn khi sử dụng các dung môi không

phân cực [26], [27].

- Các thông số kỹ thuật của quá trình xử lý vi sóng: công suất vi sóng và thời

gian xử lý vi sóng.

- Các thông số kỹ thuật của quá trình trích ly: nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nguyên

liệu: dung môi dùng trích ly.

- Đặc điểm của mẫu nguyên liệu: bao gồm độ ẩm và kích thước hạt. Độ ẩm liên

quan đến lượng nước có trong mẫu và do đó liên quan đến khả năng tương tác với vi

sóng để sinh nhiệt. Kích thước hạt cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của MAE, kích

thước phù hợp nằm trong khoảng 100 µm – 2 mm.

Zhang Yan et al. (2011) đã sử dụng MAE để thu nhận flavonoid từ râu bắp. Tác

giả đã xác định được các thông số cho quá trình trích ly MAE tối ưu như sau: dung

môi ethanol 60%, công suất vi sóng 600 W, thời gian 16 phút, tỉ lệ nguyên liệu: dung

16

môi là 1: 20. Khi đó, lượng flavonoid tổng thu được là 4,55%. Các nghiên cứu cũng

cho thấy MAE không ảnh hưởng lên hoạt tính của flavonoid và các polyphenol thu

được [28].

Ping Shao et al. (2012) và Farid Dahmoune et al. (2015) đã sử dụng MAE để thu

nhận các flavonoid tan trong nước từ lá tía tô Perilla frutescens và ly polyphenol từ

lá Myrtus communis L. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định hiệu quả của phương pháp

MAE với 1 số phương pháp khác [25], [29].

. Bảng 1.2 Hiệu suất thu nhận flavonoid từ lá tía tô [29]

Phương pháp Thời gian trích ly Dung môi Flavonoid thu được (mg/g)

Soxhlet

Soxhlet

Gia nhiệt

MAE

4 giờ

4 giờ

2 giờ x 2 lần

23 phút

Methanol

Nước

Ethanol 85%

Nước

6,73

2,69

3,15

6,07

Bảng 1.3 Hiệu quả thu nhận polyphenol từ lá Myrtus communis L. [25]

Phuon

g pháp

Thời

gian

(phút

)

Tỉ lệ

ethano

l

(%)

P.m

w

(W)

R

(ml/g

)

TPC

(mg GAE/g)

TFC

(mg

QE/g)

IC50 (µg GAE/ml)

ABTS. DPPH.

MAE

UAE

CSE

1,04

15

120

42

50

50

500

-

-

32

50

50

162,49±16,9

5

144,77±30,2

3

128,00±18,0

7

5,02±0.0

5

3,88±0.4

5

4,15±0.7

5

38,20±1,0

8

71,81±2,1

9

39,85±1,1

3

16,80±0,2

9

20,61±1,6

6

21,56±0,1

0

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về củ cải trắng

1.4.1 Các nghiên cứu nước ngoài

Năm 2010, Syed Sultan Beevi và cộng sự khảo sát thành phần các hợp chất

polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và thân cây Raphanus

sativus. Kết quả cho thấy trong lá và thân củ cải có các chất chống oxy hóa mạnh và

có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết methanol và acetone của lá R.sativus có tổng

hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77mg/g chất khô, có thể so sánh với

trà xanh và trà đen. Phân tích HPLC cho thấy sự hiện diện của catechin, acid

17

protocatechuic, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid,

myricetin, và quercetin trong dịch chiết này. Dịch chiết methanol từ lá và thân cây đã

cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion

kim loại. Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử

superoxide là 23 và 52 mg/ml, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi

khử gốc NO là 56 và 62 µg/ml tương ứng [19].

Năm 2012, Ali Ghasemzadeh và cộng sự đã nghiên cứu thành phần flavonoid

và hoạt tính chống oxi hóa của một số loài cây nhiệt đới gồm bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ,

rau dền, củ cải trắng, xả và nghệ. Flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp

của Chen et al (1998), các flavonoid thành phần được xác định bằng HPLC. Kết quả

cho thấy trong củ cải trắng có hàm lượng flavonoid tổng là 0,098 ± 0,012 mg/g chất

khô với ít nhất 5 loại flavonoid gồm quercetin, catechin, kaemferol, apigenin và rutin

với hàm lượng lần lượt là: 0,016; 0,057; 0,039; 0,014 và 0,012 mg/g chất khô [17].

Năm 2013, Safia Janiua và cộng sự cũng cho thấy trong củ cải trắng tồn tại các

hợp chất có tác dụng chữa bệnh như tanin, saponin, flavonoid, phlobatannin,

anthraquinon, carbohydrat, đường khử, steroid, phytosterol, alkaloid, amino acid,

terpenoid, cardiac glycoside và chalcone. Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của củ

cải, tác giả đã tiến hành trích ly củ cải trong các dung môi khác nhau (nước, methanol,

ethanol, ethyl acetate, ete dầu hỏa). Dịch sau trích được bổ sung vào các đĩa thạch

agar đã cấy vi khuẩn khảo sát (S.aureus, B.subtilis, M.lutes, E.aerogenes, S.typhi,

E.coli, K.pneumoniae, P.auregnosa, B.bronchiseptica). Kết quả cho thấy dịch trích

trên tất cả các dung môi đều có khả năng ức chế đối với tất cả các vi khuẩn khảo sát,

có mẫu khả năng ức chế còn cao hơn mẫu đối chứng sử dụng kháng sinh gentamycin

cùng liều lượng. Tuy nhiên, khả năng ức chế có sự khác biệt giữa các mẫu [8].

Năm 2014, K. Agarwal, R. Varma đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả

năng khử gốc tự do của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước

của phần củ có khả năng kháng oxi hóa ở mức 58,38% với nồng độ 200µg/ml, giá trị

IC50 là 166,79 µg/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có sự tồn tại của

alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [30].

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước:

18

Năm 2008, Trần Thị Hồng đã tiến hành nghiên cứu phương pháp sử dụng

enzyme peroxidase (POD) tách chiết từ củ cải trắng để xác định hàm lượng thủy ngân

trong nước ô nhiễm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein trong củ cải là

0,1269 mg/g; Enzyme POD hoạt động mạnh nhất tại giá trị pH = 6,5; Ion Hg2+ ảnh

hưởng đến hoạt tính của POD, enzyme hoàn toàn mất hoạt tính tại giá trị nồng độ 5

mg/l Hg2+. Đây là hướng nghiên cứu thân thiện với môi trường, có giá trị thực tiễn

cao với phạm vi áp dụng rộng rãi [31].

Năm 2011, đề tài “Tinh chế peroxydase từ củ cải trắng và ứng dụng trong xét

nghiệm ethanol” của Nguyễn Anh Thủy cũng được đưa ra. Dịch củ cải với hoạt tính

peroxidase ban đầu 29 U/ml được tinh chế 190 lần sử dụng các phương pháp kết tủa

bằng (NH4)2SO4, sắc ký trao đổi ion và lọc gel. Enzyme thu nhận được có hoạt tính

810 U/ml, hoạt tính riêng 3237 U/mg protein, kích thước phân tử 43 KDa theo SDS-

PAGE. Peroxidase từ củ cải trắng được thử nghiệm ứng dụng trong xét nghiệm

ethanol dựa trên hệ alcohol oxidase – peroxidase kết hợp với phản ứng tạo màu sử

dụng cơ chất 3,3’, 5’5’–tetramethylbenzidine. Phương pháp enzyme cho phép phát

hiện ethanol ở mức 25ppm. Tương quan tuyến tính được xác định trong dải nồng độ

ethanol từ 50 ppm tới 500 ppm [32].

➢ Theo tổng quan tình hình các nghiên cứu của tác giả cho thấy thế giới đã

có nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của củ cải trắng. Qua đó cho thấy,

dịch chiết từ củ cải trắng có các giá trị sinh học quan trọng, có hoạt tính chống oxi

hóa cao, khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều loài vi khuẩn và nấm bệnh,

tiềm năng ứng dụng rất lớn. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về củ cải trắng còn rất

hạn chế. Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài này.

19

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, đia điểm thực hiện

Thời gian: từ tháng 4/2016 đến tháng 2/2017.

Địa điểm: Viện Kỹ thuật và Kinh tế biển, trường ĐH Bà Rịa Vũng Tàu. Một

phần nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm.

trường ĐH Công nghiệp TP.HCM.

2.2 Nguyên vật liệu - dụng cụ

2.2.1 Nguyên liệu

Củ cải trắng: củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc

huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.

Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt lát dày 0,5 cm, rồi cắt thành sợi,

chần qua nước nóng 800C trong 3 phút, để ráo, sấy ở 600C trong 24 giờ đến độ ẩm

khoảng 8%, sau đó xay nhỏ (0,5 – 1 mm) và bảo quản trong bao PE , tránh ánh sáng ở -

200C.

2.2.2 Hóa chất

Aluminium chloride (AlCl3)

Sodium carbonate (Na2CO3)

Kali acetat (CH3COOK)

ABTS, K2S2O8, Trolox – Sigma.

2.2.3 Trang thiết bi

Máy quang phổ UV-vis

Máy lọc chân không

Máy đo pH

Tủ sấy

Lò vi sóng

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.

2.3 Nội dung nghiên cứu

20

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

2.7 Bố trí thí nghiệm

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng

phương pháp truyền thống

2.4.1.1 Khảo sát loại dung môi

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 7 loại dung môi ethanol 70, ethanol 90, ethanol 90 +

1% HCl, metanol, ethylacetate, cloroform và nước.

➢ Yếu tố cố định:

Tỉ lệ rắn/ lỏng: 1/20 (g/ml)

Nhiệt độ: 50oC

Thời gian: 4 giờ

Bột củ cải trắng

Phân tích thành phần hóa hoc

Trích ly bằng phương pháp

truyền thống

- Loại dung môi

- Tỉ lệ dung môi và nguyên liệu

- Nhiệt độ

- Thời gian

Trích ly với sự hỗ trợ của vi

sóng đồng thời

- Tỉ lệ dung môi và nguyên liệu

- Công suất sóng

- Thời gian xử lý vi sóng

So sánh hiệu quả của 2 phương pháp

- Lượng flavonoid thu được

- Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết flavonoid

- Cấu trúc bề mặt của mẫu thông qua kết quả chụp SEM

Tối ưu quá trình trích ly

21

Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh)

➢ Chỉ tiêu theo dõi:

Hàm lượng flavonoid

Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS*

Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.

2.4.1.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng)

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml)


Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1

Nhiệt độ: 50oC







2.4.1.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 40, 45, 50, 55 và 60oC



Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2







2.4.1.4 Khảo sát thời gian trích ly

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 2, 3, 4 và 5 giờ



22

Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2

Nhiệt độ: từ kết quả mục 2.4.1.3






2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng với sự

hỗ trợ của vi sóng

2.4.2.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng)

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml)



Thời gian: 5 phút

Công suất sóng: 450 W





2.4.2.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 80, 150, 300, 450, 700 và 900 W



Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1

Thời gian: 5 phut





2.4.2.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly

➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 3, 5, 7 và 9 phút

23



Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1

Công suất sóng: từ kết quả mục 2.4.2.2





2.4.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng

Các thí nghiệm đơn yếu tố cho từng phương pháp được tiến hành nhằm sơ bộ xác

định các điểm tại tâm. Quá trình tối ưu các thông số của quá trình trích ly được thực

hiện bằng phương pháp quy hoạch thực ngiệm theo mô hình Box-Wilson dạng CCC.

2.5 Phương pháp phân tích

2.5.1 Xác đinh thành phần hóa hoc của nguyên liệu

Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.

Các chỉ tiêu đường tổng, protein tổng, béo, tro tổng và xơ thô được gởi mẫu

phân tích tại Trung tâm sắc kí Hải Đăng, 79 Trương Định, quận 1, TP.HCM.

2.5.2 Xác đinh hàm lượng flavonoid tổng (TFC) [39]

Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang

và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung

dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở

bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu.

➢ Xây dựng đường chuẩn quercetin:

Pha dung dịch quercetin 100 ppm trong dung dịch ethanol 80%.

Từ dung dịch quercetin 100 ppm, tiếp tục pha ra thành các dung dịch có nồng

độ 75; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 ppm.

Ứng với mỗi nồng độ dung dịch đã được pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống

nghiệm sau đó thêm vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml CH3COOK

1M; 2,8 ml nước cất.

Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo màu ở 415nm, mẫu trắng

thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất.

24

Hình 2.2 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC

➢ Xác định TFC trong mẫu:

Lấy 0,5 ml dịch chiết củ cải, làm tương tự các bước xây dựng đường chuẩn.

TFC trong mẫu được tính như sau:

3. ..10

aV nTFC

m

(mg quercetin/g)

Trong đó: a: hàm lượng quercetin xác định từ đường chuẩn (ppm)

V: tổng thể tích dịch chiết (ml)

n: hệ số pha loãng

m: khối lượng mẫu (g)

2.5.3 Xác đinh khả năng khử gốc tự do ABTS* [40]

Xác định hoạt tính chống oxi hóa là phương pháp dựa trên khả năng làm giảm

độ hấp thu của gốc tự do cation ABTS* bởi các hoạt chất có hoạt tính chống oxi

hóa ở bước sóng 734 nm. Cường độ màu của ABTS* tỉ lệ nghịch với nồng độ các

chất chống oxi hóa và thời gian phản ứng. Dựa vào đường chuẩn trolox với thuốc

thử sẽ tính được hoạt tính chống oxi hóa của mẫu phân tích.

ABTS được pha trong nước cất đến nồng độ 7 mM (dung dịch A).

K2S2O8 pha trong nước cất đến 2,45 mM (dung dịch B).

Gốc tự do cation ABTS* được tạo ra bằng phản ứng giữa dung dịch A và B theo

tỉ lệ 1:1 về thể tích, phản ứng diễn ra trong bóng tối từ 12 - 16 giờ ở nhiệt độ

phòng (dung dịch stock).

y = 0,009xR = 0,994

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 2 4 6 8 10 12

OD

41

5

Quercetin (ppm)

25

Pha loãng dung dịch stock bằng nước cất để đạt độ hấp thu 0,7 ± 0,02 A ở 734

nm (dung dịch C). Dung dịch C được chuẩn bị mới cho từng phép thử.

➢ Xây dựng đường chuẩn trolox:

Pha dung dịch trolox 1000 µM sau đó pha loãng ra thành các nồng độ 100, 200,

300, 400, 500 và 600 µM.

Bảng 2.1 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn

Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

6

Nồng độ trolox (µM) 0 100 200 300 400 500 600

Tổng thể tích (ml)

3,04

3,04

3,04

3,04

3,04

3,04

3,04

Dung dịch C (ml)

3

Thể tích trolox (ml)

0,04

0,04

0,04

0,04

0,04

0,04

0,04

Lắc đều và ủ nhiệt độ phòng trong 6 phút, trong bóng tối

Đo độ hấp thu ở bước sóng 734 nm

Hình 2.3 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS*

Đối với mẫu thí nghiệm: hút 3 ml dung dịch C cho vào ống nghiệm sau đó hút

0,04 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 6 phút trong bóng

tối, lắc đều và đo độ hấp thu ở 734 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 3

y = 18,78xR = 0,994

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Độ

giả

m đ

ộ h

ấp

th

u (

%)

Nồng độ trolox (micro mol)

26

ml dung dịch C bằng 3 ml nước cất.

Phần trăm độ giảm độ hấp thu của mẫu thử (%) tính bằng công thức:

% 1sample

control

AOD

A

Trong đó:

Asample: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (có dung dịch C)

Acontrol: độ hấp thu của ABTS* không có pha mẫu (thay 0,04 ml mẫu bằng nước

cất)

2.8 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nhiệm đều được lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong báo cáo là

trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn.

Sử dụng phần mềm Staraphic Centurion XI để xử lý ANOVA và phân tích sự

khác biệt về mặt thống kê thông qua LSD.

Phần mềm Modde 5.0 để bố trí thí nghiệm tối ưu và xử lí số liệu tối ưu hóa.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

27

3.1 Kết quả phân tích thành phần hóa hoc của nguyên liệu

Các thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu củ cải trắng đã được xác định.

kết quả ghi nhận trong bảng 3.1.

Hàm lượng chất khô trong củ chỉ chiếm 4,6 % nhưng hơn một nữa trong số đó là

đường (56,5% chất khô). Thành phần chiếm tỉ lệ lớn thứ 2 là protein với mức 11,2%.

Ngoài ra, củ cải trắng cũng là một loại củ có nhiều khoáng nhưng rất ít chất béo. Với

những đặc điểm này, giải thích lý do tại sao trong đời sống thường nhật. các bà nội

trợ ưa chuộng việc sử dụng củ cải trắng trong quá trình nấu nước dùng cho các món

ăn tạo vị ngọt tự nhiên, thanh mát.

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu củ cải trắng

STT

Chỉ tiêu

Đơnvi

Kếtquả

1

Đường tổng

%

56,5

2

Lipid

%

0,58

3

Protein

%

11,2

4

Tro tổng

%

8,25

5

Xơ thô

%

15,34

6

Độ ẩm

%

8,13

3.2 Kết quả TN 1: khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng

phương pháp truyền thống

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi sử dụng

Flavonoid là một nhóm chất lớn gồm rất nhiều các chất khác nhau có các tính

chất không giống nhau. Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm

hydroxyl và các nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một dung

môi đặc trưng để trích ly flavonoid ra khỏi mẫu thực vật.

Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxyl -OCH3 và ít nhóm hydroxyl-OH, có

tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít phân cực như: benzen, cloroform, etyl

acetat, đôi khi tan một phần trong n-hexan. Flavonoid mang nhiều nhóm hydroxyl,

có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt trong dung môi có tính phân cực như aceton,

28

ethanol, methanol, butanol, nước…Các flavonoid glycoside, anthocyanidin không tan

trong dietyl ate nhưng tan trong nước nóng, ethanol nóng.

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi dùng trích ly đến đến TFC và ABTS*

của dịch chiết

Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chung tôi đã khảo sát ảnh hưởng của các loại

dung môi khác nhau đến hiệu quả quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng.

Các dung môi được khảo sát gồm: ethanol 700, ethanol 900, ethanol 900 + HCl,

metanol, ethylacetate, cloroform và nước. Các điều kiện khác của quá trình trích ly

được mô tả trong 2.4.1.1. Kết quả thí nghiệm được ghi nhận trên hình 3.1 thể hiện sự

ảnh hưởng rõ rệt của loại dung môi dùng trích ly đến hàm lượng flavonoid thu nhận

được.

Các dung môi etanol và metanol được biết đến như là các dung môi đa năng, tính

phân cực cao có khả năng hòa tan hầu hết các hợp chất có trong mẫu, nên khả năng

lôi kéo flavonoid ra khỏi mẫu cũng cao hơn các dung môi ethyl acetate, nước và

chloroform. Dung môi etanol có pha 1% acid HCl cho hiệu quả cao nhất trong nhóm

4 dung môi cho hiệu quả cao gồm metanol, etanol 700, etanol 900 và etanol 900 + HCl

vì khi có acid, các flavonoid glycoside sẽ phân hủy, giải phóng gốc đường, trả lại

phần aglycon, nên TFC tăng lên. Tuy nhiên, cần chu ý rằng sự thay đổi về cấu truc

này có thể gây ra những ảnh hưởng trên hoạt tính của flavonoid. Điều này giải thích

sự thay đổi về hoạt tính khử gốc tự do ABTS* của dịch chiết ứng với các loại dung

1.168

3.884

2.838

5.068

0.17

4.784

1.135

13.87 14.89

16.13

17.68

17.49

18.35

8.31

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Loai dung môi

TFC ABTS

29

môi khác nhau. Trong đó, mẫu chiết bằng dung môi etanol 70 dù hàm lượng flavonoid

tổng xấp xỉ bằng với mẫu dùng etanol 90+HCl nhưng hoạt tính cao hơn có ý nghĩa

và cao hơn tất cả các mẫu còn lại. Các nghiên cứu đã công bố cho thấy trong củ cải

chứa các flavonoid tan trong etanol như quercetin, rutin, luteolin, apigenin nên kết

quả nghiên cứu là phù hợp với các công bố trước đó. Từ kết quả này, chung tôi chọn

dung môi etanol 700 là dung môi dùng trích ly cho các phần nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng)

Với dung môi là etanol 700 đã chọn được, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của

yếu tố tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (hay gọi ngắn gọn là tỉ lệ rắn/lỏng) với các mức

1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận trong hình 3.2.

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng dùng trích ly đến đến TFC và ABTS*

của dịch chiết

Bản chất của quá trình trích ly là quá quá trình khuếch tán, trong đó động lực của

quá trình là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử trong mẫu và trong dung môi. Trong

quá trình trích ly rắn lỏng, lượng dung môi sử dụng quyết định lượng chất thu nhận

được. Khi tỉ lệ này thấp, lượng dung môi sẽ không đủ để hòa tan hết flavonoid có

trong mẫu, trạng thái cân bằng sẽ nhanh chóng đạt đến. Khi thêm dung môi, nồng độ

cấu tử chất hòa tan trong dung môi giảm xuống, quá trình khuếch tán sẽ tiếp tục cho

đến khi đạt trạng thái cân bằng mới ở giá trị cao hơn. Tuy nhiên, cần chú ý sự tăng tỉ

lệ này không tỉ lệ thuận với lượng cấu tử thu được vì đến một luc nào đó, lượng cấu

2.917

3.761

4.967 5.06915.2117.11

19.01

19.12

0

5

10

15

20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1:10 1:20 1:30 1:40

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Tỉ lệ rắn: lỏng (g/ml)

TFC ABTS

30

tử cần thu nhận trong mẫu sẽ hết, cho dù tiếp tục tăng lượng dung môi sử dụng thi

cấu tử sẽ không thể tăng tiếp nữa.

Thực tế nghiên cứu cho thấy khi tăng tỉ lệ rắn/lỏng lên từ 1:10 đến 1:30 (g/ml).

lượng TFC thu được tăng lên đáng kể, nhưng khi tiếp tục tăng lên 1:40 (g/ml). TFC

tăng nhưng không có sự khác biệt khi xử lý thống kê. Tương tự, khi ghi nhận trên

hoạt tính khử gốc tự do ABTS* của dịch chiết thu nhận được. Từ đó, tôi chọn tỉ lệ

rắn lỏng 1/30 (g/ml) là tỉ lệ phù hợp nhất cho việc trích ly flavonoid từ củ cải trắng

bằng dung môi etanol 700.

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly

Trạng thái cân bằng và tốc độ truyền khối (hệ số khuếch tán) của quá trình trích

ly rắn lỏng chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Theo lý thuyết, khi nhiệt độ tăng, sự thấm

và hòa tan của dung môi tăng, độ nhớt giảm, vì thế làm tăng hiệu quả và tốc độ trích

ly. Mặt khác, nhiệt độ cao có thể làm giảm các rào cản tế bào do suy yếu thành và

màng tế bào, kết quả làm dung môi dễ dàng tiếp xúc với các hoạt chất, làm tăng khả

năng trích ly.

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến đến TFC và ABTS* của dịch chiết

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thu nhận flavonoid

từ củ cải trắng được thể hiện ở Hình 3.3. Hàm lượng flavonoid thu được từ củ cải

trắng tăng khi nhiệt độ dung môi tăng từ 40 đến 600C. Kết quả tương tự cũng được

ghi nhận về ảnh hưởng nhiệt độ cho trích ly polyphenol từ chè xanh vụn của Vũ Hồng

Sơn và Hà Duyên Tư (2009).

3.8964.342

5.259 5.277 5.25914.59

17.55 19.64 19.68

19.52

0

5

10

15

20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

40 45 50 55 60

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Nhiệt độ (oC)

TFC ABTS

31

Hàm lượng tổng flavonoid TFC ở 40, 45, 50 và 60oC là cao nhất và cũng không

có sự khác biệt với nhau về mặt thống kê. Khả năng khử gốc tự do ABTS ở 50oCthì

cao nhất và có sự khác biệt hoàn toàn so với các mức khảo sát khác. Vì vậy nhiệt độ

trích ly ở 50oC được lựa chọn là thông số phù hợp nhất ở thí nghiệm này để thu nhận

dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ củ cải trắng.

Nhiệt độ tăng đến một mức nhất định có thể sẽ làm phân hủy những hợp chất sinh

học mà chúng ta mong muốn. Ngoài ra, xuất hiện sự giảm hoạt tính của các hợp chất

này bởi các phản ứng thủy phân và phản ứng oxy hóa khử nội bào. Hơn nữa, chỉ có

một số hợp chất phenolic nhất định như các họ flavonoid (chủ yếu là anthocyanin và

các dẫn xuất flavan-3-ol) có khả năng chịu nhiệt, nên việc khảo sát khoảng nhiệt độ

trích ly rất quan trọng để đảm bảo được hoạt tính của hợp chất chống oxy hóa chúng

ta cần trích ly. Điều quan trọng nhất, vì chúng sử dụng dung môi cồn: nước để chiết

mà cồn là hợp chất dễ bay hơi nên với nhiệt độ trích ly quá cao sẽ làm thay đổi tỉ lệ

cồn: nước dẫn đến sai số.

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly

Tương tự như nhiệt độ, trong quá trình trích ly thì thời gian cũng ảnh hưởng đáng

kể đến việc thu nhận dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ củ cải trắng.

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến đến TFC và ABTS* của dịch chiết

Hàm lượng tổng flavonoid TFC ở 3 giờ là cao nhất và không có sự khác biệt với

nhau về mặt thống kê. Khả năng khử gốc tự do ABTS ở các mức khảo sát 3 và 3,5

5.017

5.889

6.874 6.903 6.91114.1416.22

20.06 19.76

19.83

0

5

10

15

20

3

4

5

6

7

8

9

10

2 2.5 3 3.5 4

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Thời gian (giờ)

TFC ABTS

32

giờ là cao nhất và không có sự khác biệt với nhau về mặt thống kê. Vì vậy, thời gian

trích ly ở 3 giờ được lựa chọn là thông số phù hợp nhất ở thí nghiệm này để thu nhận

dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ củ cải trắng.

Thời gian trích ly quá ngắn sẽ không đảm bảo được hiệu suất tách chiết các hợp

chất chống oxy hóa. Tuy nhiên, nếu thời gian trích ly quá dài sẽ làm tăng khả năng

phân huỷ và oxy hóa các hợp chất đó bởi sự tiếp xúc với các yếu tố môi trường như

nhiệt độ, ánh sáng và oxy. Mặt khác, thời gian trích ly quá dài cũng làm tăng sự mất

mát của dung môi và không có tính kinh tế.

➢ Kết luận: điều kiện trích ly thích hợp được xác đinh là: nồng độ cồn trong

dung môi 75%, ty lệ mẫu/dung môi 1/30 (g/ml), nhiệt độ 50oC, thời gian 3 giờ.

3.3 Kết quả TN 2: khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng

phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng

Vi sóng là một loại sóng bức xạ điện từ, có thể xâm nhập vào bên trong các vật

liệu sinh học, tương tác với những phần tử phân cực bên trong vật liệu,làm tăng nhiệt

độ và áp suất bên trong mẫu, gây ra sự phá vỡ cấu trúc cục bộ, từ đó giup cho quá

trình trích ly đạt hiệu quả tốt hơn.

Đã có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của vi sóng đối với quá trình trích ly các hợp

chất tự nhiên. Kết quả nhìn chung cho thấy vi sóng giúp cho quá trình trích ly nhanh

chóng và hiệu quả hơn. Trong đó, các yếu tố chính của quá trình trích ly có xử lý vi

sóng đã được nghiên cứu bao gồm: đặc điểm của nguyên liệu (độ ẩm, kích thước, loại

nguyên liệu), dung môi (loại dung môi, nồng độ của dung môi), đặc điểm quá trình

xử lý sóng (công suất và thời gian) và đặc điểm quá trình trích ly.

Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành khảo sát 3 yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến

quá trình xử lý vi sóng gồm: tỉ lệ nguyên liệu và dung môi, công suất vi sóng sử dụng

và thời gian xử lý vi sóng.

3.3.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng)

Bốn mức tỉ lệ nguyên liệu và dung môi 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml) đã được

khảo sát tương tự như trong trường hợp không sử dụng vi sóng. Thời gian xử lý vi

sóng và công suất sóng được cố định ở mức 5 phut và 450 W. Kết quả thí nghiệm

được ghi nhận trên hình 3.5.

33

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/ lỏng đến TFC và ABTS* của

dịch chiết khi có xử lý vi sóng

Kết quả thực nghiệm cho thấy khi sử dụng vi sóng để hỗ trợ quá trình trích ly,

lượng flavonoid thu được tăng khi tăng tỉ lệ rắn/ lỏng từ 1/10 (g/ml) lên 1/20 (g/ml).

sau đó lượng này không tăng thêm nhiều mặc dù tăng tỉ lệ rắn/ lỏng sử dụng lên 1/30

và 1/40 (g/ml). Tương tự, hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do

ABTS* cũng tăng theo lượng flavonoid thu được, đạt cao nhất ở tỉ lệ 1/20 (g/ml) và

sau đó không tăng thêm khi tiếp tục tăng tỉ lệ dung môi sử dụng.

So với khi sử dụng trích ly truyền thống, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng giup

làm giảm lượng dung môi sử dụng từ 30 ml/1g mẫu xuống còn 20 ml/1g mẫu, trong

khi đó lượng TFC tăng lên 9,316 mg/g so với mức 4,784 mg/g khi không có vi

sóng.Tương tự, trên khả năng khử gốc tự do ABTS*, tăng 1,73 lần (31,679 mg

TEAC/g so với 18,35 mg TEAC/g).

Khi sử dụng vi sóng, dưới tác động của sóng, cấu truc của vật liệu bị phá vỡ do

sự tăng cục bộ nhiệt độ và áp suất từ tác động nén và kéo, giup giải phóng các cấu tử

bên trong tế bào tốt hơn.

3.3.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng

Một trong các đặc trưng rất quan trọng của vi sóng là công suất của sóng. Trong

nghiên cứu này, tôi đã sử dụng 5 mức công suất vi sóng khác nhau gồm 80, 150, 300,

450, 700 và 900W để hỗ trợ cho quá trình trích ly, thời gian xử lý vi sóng là 5 phut,

tỉ lệ dung môi sử dụng là 20 ml ethanol 700/1g mẫu nhằm tìm được công suất phù

hợp cho hiệu quả thu nhận được lượng flavonoid cao nhất mà vẫn duy trì được hoạt

7.964

9.316 9.44 9.462

26.29

31.68 31.96

31.64

20

25

30

35

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1.10 1.20 1.30 1.40

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Tỉ lệ rắn/ lỏng (g/ml)

TFC ABTS

34

tính của dịch chiết. Kết quả khảo sát trình bày trên hình 3.6.

Hình 3.6 Ảnh hưởng của công suất sóng đến TFC và ABTS* của


Khi tăng công suất vi sóng sử dụng từ mức 80 W lên 150 W và 300 W, lượng

flavonoid thu được tăng theo công suất sóng sử dụng, tương ứng với mức tăng 22,7

% trên TFC (9,861 so với 7,748 mg quercetin/g) và 23,26% (31,90 so với 25,88 mg

TEAC/g) trên hoạt tính chống oxi hóa. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng lên 450 W và 700

W, lượng flavonoid thu được không thay đổi nhưng hoạt tính chống oxi hóa có

khuynh hướng giảm và giảm mạnh ở mức công suất 700 W. Điều này 1 phần là do

khi sử dụng công suất sóng cao, kèm theo nhiệt độ mẫu tăng mạnh, có thể gây ra sự

biến đổi một số cấu phần dẫn đến cản trở quá trình trích ly. Mặt khác, các hợp chất

chống oxi hóa là các chất nhạy cảm với nhiệt độ cao,khi công suất sóng cao, nhiệt độ

tăng làm hoạt tính dịch chiết bị ảnh hưởng. Từ đó, tôi thấy rằng sử dụng mức công

suất 300 W là phù hợp cho quá trình trích ly flavonoid trên củ cải trắng.

3.3.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly

Song song với công suất vi sóng sử dụng, thời gian xử lý vi sóng cũng là một

thông số đặc trưng quan trọng không kém. Trong nghiên cứu này, tôi khảo sát 4

khoảng thời gian khác nhau thay đổi từ 3 đến 9 phut, mức công suất vi sóng 300 W,

tỉ lệ dung môi sử dụng là 20 ml ethanol 700/1g mẫu. Theo dõi kết quả thu được trên

hình 3.7.

7.7488.217

9.861 9.8269.452

25.8826.36

31.90

29.36

25.48

20

25

30

35

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

9

9.5

10

80 150 300 450 700

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Công suất sóng (W)

TFC ABTS

35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến TFC và ABTS* của


Khi tăng thời gian sử dụng vi sóng từ 3 phút lên 5 phút, lượng flavonoid thu được

tăng theo thời gian, kèm theo đó hoạt tính chống oxi hóa cũng tăng lên. Tuy nhiên,

khi tiếp tục tăng lên 7 và 9 phút, lượng flavonoid thu được không thay đổi nhưng hoạt

tính chống oxi hóa có khuynh hướng giảm mạnh do khi sử dụng vi sóng thời gian dài,

nhiệt độ mẫu tăng mạnh, gây ra sự biến đổi và tổn thất các cấu tử có hoạt tính. Từ đó,

tôi thấy rằng thời gian xử lý vi sóng 5 phut là phù hợp cho quá trình trích ly flavonoid

trên củ cải trắng.

3.4 Kết quả TN 3: Tối ưu quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng

phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng theo phương pháp bề mặt đáp ứng

SRM

Quá trình trích ly có vi sóng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố tỉ lệ dung môi và

nguyên liệu, công suất vi sóng và thời gian xử lý vi sóng. Các yếu tố khi kết hợp với

nhau lại có tác động ít hay nhiều theo từng mức độ khác nhau, do vậy phải tiến hành

quá trình tối ưu hóa nhằm tìm ra điều kiện tối ưu khi có sự tương tác của các yếu tố.

Các thí nghiệm trong mục 3.2 chỉ khảo sát đơn biến theo các hàm mục tiêu khác nhau.

Trong phạm vi cho phép (về thời gian), chung tôi tiến hành thực nghiệm tối ưu các

thông số xử lý vi sóng đến hàm mục tiêu là lượng flavonoid tổng trong dịch chiết củ

cải trắng và theo hướng hàm mục tiêu đạt cực đại. Chung tôi chọn ra 3 yếu tố khảo

sát của quá trình tối ưu như sau:

8.865

10.218 10.142 10.065

31.2732.96

31.73

31.18

25

30

35

5

6

7

8

9

10

11

3 5 7 9

AB

TS

(m

g T

rolo

x/g

)

TF

C (

mg

Qu

er/g

)

Thời gian (phút)

TFC ABTS

36

Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (g/ml): X1.

Thời gian xử lý vi sóng (phút): X2 .

Công suất vi sóng sử dụng (W): X3.

Hàm mục tiêu Y là lượng flavonoid tổng trong dịch chiết (mg Quercetin/g).

Từ kết quả của các thí nghiệm trước, chung tôi chọn được giá trị tại tâm (mức cơ

sở) và các mức trên và dưới ở bảng 3.2.

Bảng 3.2 Các yếu tố dùng trong RSM

Mức dưới

(-1)

Mức cơ

sở (0)

Mức trên

(1)

Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (g/ml) X1 1/15 1/20 1/25

Thời gian xử lý vi sóng (phút) X2 4 5 6

Công suất vi sóng sử dụng (W) X3 150 300 450

Bảng 3.3 Kế hoạch thực nghiệm và kết quả theo RSM để tối ưu TFC

STT Tỉ lệ Thời

gian

Công

suất Tỉ lệ

Thời

gian

Công

suất TFC

1 -1 -1 -1 15 4 150 9,687

2 1 -1 -1 25 4 150 8,974

3 -1 1 -1 15 6 150 8,984

4 1 1 -1 25 6 150 10,436

5 -1 -1 1 15 4 450 9,140

6 1 -1 1 25 4 450 9,972

7 -1 1 1 15 6 450 9,611

8 1 1 1 25 6 450 10,829

9 -1,682 0 0 11,59 5 300 8,619

10 1,682 0 0 28,41 5 300 10,618

11 0 -1,682 0 20 3,318 300 8,813

12 0 1,682 0 20 6,682 300 10,623

13 0 0 -1,682 20 5 47,7 10,733

14 0 0 1,682 20 5 552,3 10,753

15 0 0 0 20 5 300 12,616

16 0 0 0 20 5 300 12,973

17 0 0 0 20 5 300 13,505

Mô hình toàn phương bậc 2 đã được xác định bằng phương pháp hồi quy đa biến

thu được như sau:

37

Y = 13,0404 + 0,4504X1 + 0,3757X2– 1,2376X12–1,2024X2

2– 0,8401X32

Bảng 3.4 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy

TFC DF SS MS F p SD

(variance)

Total 17 1874,83 110,284

Constant 1 1840,51 1840,51

Total

Corrected 16 34,3201 2,145 1,46458

Regression 9 32,9014 3,65572 18,0386 0 1,91199

Residual 7 1,41862 0,20266 0,450178

Lack of Fit 5 1,01836 0,203672 1,01768 0,563 0,4513

(Model Error)

Pure Error 2 0,400265 0,200132 0,447362

(Replicate

Error)

N = 17 Q2 = 0,73 Cond. no. = 4,9932

DF = 7 R2 = 0,959 Y-miss = 0

R2 Adj. = 0,906 RSD = 0,4502

Kiểm tra khả năng giải thích số liệu và dự đoán của mô hình dựa vào các hệ số

R2 và Q2, một mô hình hồi quy tốt và có khả năng dự đoán chính xác từ số liệu thực

nghiệm khi Q2 >0,5 và R2 >0,8 và |R2– Q2| nằm trong khoảng 0,2 đến 0,3 [41]. Từ

bảng 3.4 ta được R2 = 0,959 và Q2 = 0,73 thỏa mãn điều kiện vừa nêu. Vì vậy phương

trình hồi quy tương thích với số liệu thực nghiệm thu thập được.

Tiến hành tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5, chúng tôi thu được kết quả như

sau: TFC thu nhận được là 13,1207 mg/g tại điều kiện tối ưu là: tỉ lệ nguyên liệu:

dung môi là 1:21 (g/ml), thời gian 5,2 phut, công suất 300 W. Mô hình bề mặt đáp

ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng flavonoid tổng thu

được trong dịch trích ly được mô phỏng trên hình 3.8 và 3.9.

Chung tôi tiến hành thực hiện thí nghiệm kiểm tra theo các thông số tối ưu hóa

thì thu nhận được TFC thực nghiệm là: 13,0115 mg/g, kết quả này sai số không quá

5% so với dự đoán của mô hình.

38

Hình 3.8 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên

liệu/dung môi và thời gian đến TFC với công suất vi sóng 300 W

Hình 3.9 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên

liệu/dung môi, công suất và thời gian xử lý vi sóng đến TFC

Để làm rõ hơn kết quả thu nhận được, bã sau khi trích ly có và không có sự hỗ

trợ của vi sóng được gửi đến Trung tâm công nghệ cao TP.HCM chụp SEM.

Kết quả chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử quét SEM mẫu bã củ cải trắng sau khi

trích ly bằng ethanol 70o trong trường hợp: không có vi sóng (hình 3.10) và có vi sóng

39

(hình 3.11). Các hình này cho thấy cấu trúc của bã củ cải sau khi trích ly có sự thay

đổi qua các hình ảnh chụp ở kích thước 10 μm.

Hình 3.10 Hình chụp SEM bã củ cải sau trích ly không có vi sóng

Hình 3.11 Hình chụp SEM bã củ cải sau trích ly có sử dụng vi sóng

Khi so sánh hai hình 3.10 và 3.11 cho thấy bã sau khi trích ly có sự hỗ trợ của vi

sóng có cấu truc bề mặt với nhiều khoảng trống, đường gấp khuc, kích thước bã giảm

40

đi đáng kể. Sự thay đổi cấu truc bề mặt của mẫu bã khi trích ly có vi sóng khá rõ nét,

thể hiện các nguyên liệu bị phá vỡ một phần, các sợi khít hơn. Điều này cho thấy vi

sóng đã có tác dụng hỗ trợ cho việc xử lý mẫu nên tăng hiệu quả trích ly. Các kết quả

này góp phần rõ nét vào việc minh chứng rằng khi trích ly có vi sóng thì hàm lượng

các hợp chất trích y được thực tế cao hơn đáng kể và là hợp lý theo các quy luật đã

được khoa học chứng minh.

41

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Sau quá trình khảo sát sử dụng vi sóng hỗ trợ quá trình trích ly thu nhận dịch

chiết giàu flavonoid từ bột củ cải trắng (Raphanus sativus L.), chung tôi đã thu được

các kết quả như sau:

➢ Điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly không có vi sóng là:

• Dung môi ethanol 70o

• Tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/30 g/ml

• Nhiệt độ: 50oC

• Thời gian: 3 giờ

➢ Điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly có vi sóng là:

• Dung môi ethanol 70o

• Tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/21 g/ml

• Công suất vi sóng: 300 W

• Thời gian xử lý vi sóng: 5,2 phút

➢ Phương trình hồi quy thu được:

Y = 13,0404 + 0,4504X1 + 0,3757X2 – 1,2376X12– 1,2024X2

2 – 0,8401X32

➢ TFC thu được khi không có vi sóng là 10,218 mg/g, trong điều kiện tối ưu có vi

sóng là 13,0115 mg/g, tăng 28,41%.

4.2. Kiến nghi

Nghiên cứu sử dụng thêm các các phương pháp trích ly khác như: sử dụng các

loại enzyme hoặc dùng sóng siêu âm, hoặc kết hợp để quá trình trích ly thu nhận dịch

chiết đạt hiệu quả cao hơn nữa.

Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết thu được.

Ngoài ra, định danh một số hợp chất khác trong củ cải trắng để đánh giá khả năng

dược liệu của dịch chiết.

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Morgan. W. and D. Midmore, Daikon in Australia. Rural industries research

and development corporation. Publication No. 03/091. Project No. UCQ -10a,

2003.

2. Lim. T.K., Edible medicinal and non-medicinal plant. Vol. 9: Modified stems.

roots. bulbs. 2015: Springer.

3. Kole. C., Genome mapping and molecular breeding in plants. Vol. 5:

Vegetable. 2007. New york: Springer Berlin Heidelberg

4. Cúc. T.T.T., Giáo trình trồng rau. 2007: Nhà xuất bản Nông nghiệp.

5. Sở Nông nghiệp & triển Nông thôn Lâm Đồng,Quy trình kỹ thuật trồng cải

củ. Ban hành kèm theo quyết định số 1251/QĐ-SNN. ngày 13/12/2012 của Sở

Nông nghiệp và PTNT Lâm Đồng V/v Ban hành tạm thời quy trình canh tác

một số cây trồng trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng.

6. Katsuzaki. H.. et al., Chemistry and antioxidative activity of hot water extract

of Japanese radish (daikon).Biofactor. 2004. 21: p. 211-214.

7. Nhu P.H.Q., Minh N.P. and Dao D.T.A., Hydrolyzation of Raphanus sativus

L. White hot radish starch to receive active elements and nutritional

components. Internationa Journal of Engineering Research & Technology

2014. 3(1): p. 2041-2049.

8. Singh. P. and J. singh, Medicinal and therapeutic utilities of Raphanus sativus.

Internationa Journal of plant. animal and environmental sciences. 2013. 3(2):

p. 103-105.

9. Jahan. M.G.S.. et al., Correlation between â-amylase activity and starch

content in different cultivars of radish (Raphanus sativus L.). Biotechnology.

2014. 9(7): p. 298-302.

10. Jahan. M.G.S.. et al., Screening of some enzyme and nutrients in radish

(Raphanus sativus L.) root. Philiip. J. Anim. Sci.. 2011. 37: p. 89-100.

43

11. Hồng T.T. và cộng sự, Nghiên cưu phương phap sư dung enzyme peroxidase

tach chiết tư củ cải trăng đê xac định hàm lương thủy ngân trong nươc ô

nhiêm. Tạp chí Khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên & Công

nghệ. 2008. 24: p. 23-27.

12. Shin. T.. et al., Biological activity of various radish species. Orient Pharm Exp

Med 2015. 15: p. 105-111.

13. El-sayed. S.T., Purification and characterization of Raphanin. a neutral

protease. from raphanus sativus leaves. Pakistan journal of Biological

sciences. 2001. 4(5): p. 564-568.

14. Hà. L.T.N. và Thư.V.T., Stress oxi hóa và chất chống oxi hóa tự nhiên. Tạp

chí Khoa học và Phát triển 2003.7(5): p. 667 - 677.

15. Strack. D.. et al., Tissue distribution of phenylpropanoid metabolism in

cotyledons of Raphanus sativus L. Planta. 1985. 164(507-511).

16. Gutierrez. R.M.P. and R.L. Perez, Raphanus sativus (Radish): their chemistry

and biology. The Scientific Word journal. 2004. 4: p. 811-837.

17. Ghasemzadeh. A.. et al., Flavonoid compounds and their antioxidant activity

in extract of some tropical plants. Journal of Medicinal Plants Research 2012.

6(13): p. 2639-2643.

18. Lugasi. A. and J. Hovari, Flavonoid aglycons in foods of plant origin. I.

Vegetables. Acta Aliment.. 2000. 29: p. 345-352.

19. Beevia S.S., Mangamooria N.P. and GowdaB.B., Polyphenolics profile and

antioxidant properties of Raphanus sativus L. Natural product Res. 2012.

26(6): p. 557-563.

20. Consolacion Y. Ragasaet al., Isothiocyanates. sterol and triglycerides from

Raphanus sativus. Der Pharmacia Lettre. 2015. 17(2): p. 293-296.

21.Phụng. N.K.P., Phương phap cô lập hơp chất hữu cơ. 2007: NXB ĐH quốc gia

Tp.HCM.

22. Thu. N.V.và Hùng.T., Dươc liệu học. 2011. Nhà xuất bản Y học. Bộ Y tế.

44

23. Grotewold E., The Science of Flavonoids. 2006. New York: Springer Science

Business Media. Inc.

24. Dai J. and R.J. Mumper, Plant Phenolics: Extraction. Analysis and Their

Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules 2010.15: p. 7313-7352.

25. Gulcin, Antioxidant activity of food constituents: an overview. Arch Toxicol.

2012. 86: p. 345–391.

26. Hà. L.T.N.và Thư.V.T., Stress oxi hóa và các chất chống oxi hóa tự nhiên. tạp

chí Khoa học và Phát triển 2013. 2009. 7(5): p. 667-677.

27. J.B.Harborne and C.A.Williams, Review: Advances in flavonoid research

since 1992. Phytochemistry. 2000. 55: p. 481 -504.

28. Trung. B.H.vàMai. N.T.T., Nghiên cưu mối quan hệ giữa hoạt tính ưc chế gốc

tự do NO vơi cấu trúc của các hoạt chất cô lập tư hoa cúc trăng. Tạp chí khoa

học và công nghệ. 2009. 12(10): p. 48-56.

29. Viên Đ.T.H., Nghiên cưu khảo sát hoạt chất flavonoid trong quả mơ Prunus

armeniaca (họ Rosaceae). Tạp chí Khoa học và công nghệ. 2007. 45(2): p. 49-

53.

30. K. Agarwal, R. Varma (2014), Radical scavenging ability and biochemical

screening of a common Asian vegetable- Raphanus sativus L., Int. J. Pharm.

Sci. Res., vol. 27, no. 1, pp. 127-137.

31. Trần Thị Hồng, Trần Hoàng Thanh, Nguyễn Thị Hà Giang (2008), Nghiên cưu

phương phap sư dung enzyme peroxidase tách chiết tư củ cải trăng đê xác

định hàm lương thủy ngân trong nươc ô nhiêm, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,

vol. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24, pp. 23-27.

32. Nguyễn Anh Thủy, Dương Anh Tuấn, Vũ Nguyên Thành (2011), Tinh chế

peroxide tư củ cải trăng Raphanus sativus Var hortensis và ưng dung trong

xét nghiệm ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học, 113-118.

45

33. Tuấn H.V., Nghiên cưu tách chiết và xac định một số hoạt tính sinh học của

dịch chiết flavonoid tư cây diếp cá (Hoyttuynia cordata Thunberg) thu hái tại

Hà Nội. Tạp chí Sinh học. 2013. 35(3S): p. 183-187.

34. Özçelik B.. et al., Antimicrobial Activity of Flavonoids against Extended-

Spectrum β-Lactamase (ESβL)-Producing Klebsiella pneumonia. Tropical

Journal of Pharmaceutical Research. 2008. 7(4): p. 1151-1157.

35. Segovia R.G. et al., Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid

peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig.

J. Gastroenterol 2008. 43: p. 441-447.

36. Nishioka T. et al., Baicalein - an α-glucosidase inhibitor from Scutellaria

baicalemis II. Journal of Natural Products. 1998. 61: p. 1413-1415.

37. Angst. E. et al., The flavonoid quercetin inhibits pancreatic cancer growth in

vitro and in vivo. Pancreas. 2013. 42(2): p. 223-229.

38. Susanti D. et al., Antioxidant and cytotoxic flavonoids from the flowers of

Melastoma malabathricum L. Food Chemistry. 2007. 103: p. 710-716.

39. Chang C.c. et al., Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two

Complementary Colorimetric Methods. Journal of Food and Drug Analysis.

2002. 10(3): p. 178-182.

40. Re R. et al., Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation

decolorization assay. Free radical biology and medicine. 1999. 26: p.1231 -

1237.

41. Gabrielsson J. et al., Multivariate methods in pharmaceutical applications.

Journal of chemometrics. 2002. 16(3): p.141 – 160.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584998003153

46

PHỤ LỤC

1. Phụ lục 1: kết quả thí nghiệm 1

1.1. Khảo sát loại dung môi

1.1.1 Xac định TFC

NT Kl mẫu (g) Ẩm (%) CK (g) V (ml) HSPL OD

Ehyl acetate

1 8.644 0.9136 20 10 0.069

1 8.644 0.9136 20 10 0.032

1 8.644 0.9136 20 10 0.043

Metanol

1 8.644 0.9136 20 10 0.154

1 8.644 0.9136 20 250 0.007

1 8.644 0.9136 20 250 0.006

Ethanol 90

1 8.644 0.9136 20 250 0.005

1 8.644 0.9136 20 250 0.005

1 8.644 0.9136 20 250 0.004

Ethanol 90 +

1% HCl

1 8.644 0.9136 20 250 0.008

1 8.644 0.9136 20 250 0.009

1 8.644 0.9136 20 250 0.008

Chloroform

1 8.644 0.9136 20 10 0.012

1 8.644 0.9136 20 10 0.005

47

1 8.644 0.9136 20 10 0.004

Ethanol 70

2.01 10.997 1.7890 100 20 0.039

2.1 10.997 1.8691 100 20 0.047

2.01 10.997 1.7890 100 20 0.044

Nước

1 8.644 0.9136 20 10 0.047

1 8.644 0.9136 20 10 0.054

1 8.644 0.9136 20 10 0.039

1.1.2 Xac định ABTS

NT Kl mẫu (g) Ẩm (%) CK (g) V (ml) HSPL OD Ac

Ehyl acetate

2.09 10.997 1.8602 100 1004 0.154 0.216

2.01 10.997 1.7890 100 1004 0.153 0.216

2.09 10.997 1.8602 100 1004 0.156 0.216

Metanol

2.07 10.997 1.8424 100 1004 0.147 0.216

2.09 10.997 1.8602 100 1004 0.149 0.216

2.07 10.997 1.8424 100 1004 0.142 0.216

Ethanol 90

2.03 10.997 1.8068 100 1004 0.147 0.216

2.01 10.997 1.7890 100 1004 0.123 0.216

2.06 10.997 1.8335 100 1004 0.126 0.216

Ethanol 90 +

1% HCl

2.01 10.997 1.7890 100 1004 0.134 0.216

2.1 10.997 1.8691 100 1004 0.140 0.216

2.01 10.997 1.7890 100 1004 0.122 0.216

Chloroform

2.12 10.997 1.8869 100 1004 0.134 0.216

2 10.997 1.7801 100 1004 0.140 0.216

2.06 10.997 1.8335 100 1004 0.122 0.216

Ethanol 70

2.12 10.997 1.8869 100 1004 0.120 0.216

2 10.997 1.7801 100 1004 0.120 0.216

2.06 10.997 1.8335 100 1004 0.124 0.216

Nước

1.04 10.9972 0.9256 100 304 0.176 0.216

1.04 10.9972 0.9256 100 304 0.175 0.216

1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.174 0.216

1.2. Khảo sát tỉ lệ rắn: lỏng



1.10 1.03 10.9972 0.9167 100 40 0.008

1.10 1.11 10.9972 0.9879 100 40 0.008

1.10 1.04 10.9972 0.9256 100 40 0.007

1.20 1.12 10.9972 0.9968 100 40 0.012

48

1.20 1.04 10.9972 0.9256 100 40 0.011

1.20 1.02 10.9972 0.9078 100 40 0.012

1.30 1.09 10.9972 0.9701 100 40 0.011

1.30 1.02 10.9972 0.9078 100 40 0.012

1.30 1.01 10.9972 0.8989 100 40 0.012

1.40 1.00 10.9972 0.8900 100 40 0.012

1.40 1.08 10.9972 0.9612 100 40 0.011

1.40 1.04 10.9972 0.9256 100 40 0.011



1.10 1.03 10.9972 0.9167 100 304 0.178 0.216

1.10 1.11 10.9972 0.9879 100 304 0.173 0.216

1.10 1.04 10.9972 0.9256 100 304 0.177 0.216

1.20 1.12 10.9972 0.9968 100 304 0.174 0.216

1.20 1.04 10.9972 0.9256 100 304 0.170 0.216

1.20 1.02 10.9972 0.9078 100 304 0.177 0.216

1.30 1.09 10.9972 0.9701 100 304 0.176 0.216

1.30 1.02 10.9972 0.9078 100 304 0.175 0.216

1.30 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.176 0.216

1.40 1.00 10.9972 0.8900 100 304 0.175 0.216

1.40 1.08 10.9972 0.9612 100 304 0.175 0.216

1.40 1.04 10.9972 0.9256 100 304 0.177 0.216

1.3. Khảo sát nhiệt độ trích ly



40 1.03 10.9972 0.9167 100 40 0.011

40 1.05 10.9972 0.9345 100 40 0.012

40 1.05 10.9972 0.9345 100 40 0.010

45 1 10.9972 0.8900 100 40 0.012

45 1.01 10.9972 0.8989 100 40 0.012

45 1 10.9972 0.8900 100 40 0.011

50 1 10.9972 0.8900 100 40 0.012

50 1 10.9972 0.8900 100 40 0.011

50 1 10.9972 0.8900 100 40 0.012

55 1 10.9972 0.8900 100 40 0.013

55 1 10.9972 0.8900 100 40 0.012

55 1 10.9972 0.8900 100 40 0.009

49

60 1 10.9972 0.8900 100 40 0.012

60 1 10.9972 0.8900 100 40 0.010

60 1 10.9972 0.8900 100 40 0.011

1.3.2 Xác định ABTS


40 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.185 0.216

40 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.171 0.216

40 1 10.9972 0.8900 100 304 0.184 0.216

45 1.03 10.9972 0.9167 100 304 0.177 0.216

45 1 10.9972 0.8900 100 304 0.177 0.216

45 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.179 0.216

50 1.02 10.9972 0.9078 100 304 0.173 0.216

50 1 10.9972 0.8900 100 304 0.172 0.216

50 1.02 10.9972 0.9078 100 304 0.175 0.216

55 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.177 0.216

55 1.01 10.9972 0.8989 100 304 0.176 0.216

55 1.07 10.9972 0.9523 100 304 0.178 0.216

60 1.13 10.9972 1.0057 100 304 0.172 0.216

60 1.19 10.9972 1.0591 100 304 0.174 0.216

60 1.05 10.9972 0.9345 100 304 0.171 0.216

1.4. Khảo sát thời gian trích ly



2 1.02 10.997 0.9078 100 40 0.009

2 1.01 10.997 0.8989 100 40 0.009

2 1.02 10.997 0.9078 100 40 0.009

2.5 1.09 10.997 0.9701 100 40 0.009

2.5 1.02 10.997 0.9078 100 40 0.009

2.5 1.01 10.997 0.8989 100 40 0.009

3 1.01 10.997 0.8989 100 40 0.009

3 1.03 10.997 0.9167 100 40 0.009

3 1.01 10.997 0.8989 100 40 0.009

3.5 1.03 10.997 0.9167 100 40 0.009

3.5 1 10.997 0.8900 100 40 0.009

3.5 1.01 10.997 0.8989 100 40 0.009

4 1.05 10.997 0.9345 100 40 0.009

4 1.04 10.997 0.9256 100 40 0.009

50

4 1.07 10.997 0.9523 100 40 0.009

1.4.2 Xác định ABTS


2 1.02 10.997 0.9078 100 1004 0.203 0.216

2 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.2 0.216

2 1.02 10.997 0.9078 100 1004 0.202 0.216

2.5 1.09 10.997 0.9701 100 1004 0.207 0.216

2.5 1.02 10.997 0.9078 100 1004 0.208 0.216

2.5 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.204 0.216

3 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.205 0.216

3 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.198 0.216

3 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.199 0.216

3.5 1.03 10.997 0.9167 100 1004 0.209 0.216

3.5 1 10.997 0.8900 100 1004 0.221 0.216

3.5 1.01 10.997 0.8989 100 1004 0.203 0.216

4 1.05 10.997 0.9345 100 1004 0.21 0.216

4 1.04 10.997 0.9256 100 1004 0.19 0.216

4 1.07 10.997 0.9523 100 1004 0.208 0.216

2. Phụ lục 2: kết quả thí nghiệm 2

2.1. Khảo sát tỉ lệ rắn: lỏng



1.10 1 10.997 0.8900 100 40 0.016

1.10 1 10.997 0.8900 100 40 0.017

1.10 1 10.997 0.8900 100 40 0.013

1.20 1 10.997 0.8900 100 40 0.019

1.20 1 10.997 0.8900 100 40 0.018

1.20 1 10.997 0.8900 100 40 0.019

1.30 1 10.997 0.8900 100 40 0.019

1.30 1 10.997 0.8900 100 40 0.018

1.30 1 10.997 0.8900 100 40 0.018

1.40 1 10.997 0.8900 100 40 0.017

1.40 1 10.997 0.8900 100 40 0.018

1.40 1 10.997 0.8900 100 40 0.019



51

1.10 1 10.997 0.8900 100 1004 0.186 0.223

1.10 1 10.997 0.8900 100 1004 0.175 0.223

1.10 1 10.997 0.8900 100 1004 0.179 0.223

1.20 1 10.997 0.8900 100 1004 0.183 0.223

1.20 1 10.997 0.8900 100 1004 0.173 0.223

1.20 1 10.997 0.8900 100 1004 0.183 0.223

1.30 1 10.997 0.8900 100 1004 0.177 0.223

1.30 1 10.997 0.8900 100 1004 0.178 0.223

1.30 1 10.997 0.8900 100 1004 0.183 0.223

1.40 1 10.997 0.8900 100 1004 0.174 0.223

1.40 1 10.997 0.8900 100 1004 0.176 0.223

1.40 1 10.997 0.8900 100 1004 0.178 0.223

2.2. Khảo sát công suất vi sóng


NT

Kl mẫu

(g) Ẩm (%) CK (g) V (ml) HSPL OD

80 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

80 4 10.997 3.5601 250 100 0.012

80 4 10.997 3.5601 250 100 0.01

150 4 10.997 3.5601 250 100 0.014

150 4 10.997 3.5601 250 100 0.011

150 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

300 4 10.997 3.5601 250 100 0.015

300 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

300 4 10.997 3.5601 250 100 0.014

450 4 10.997 3.5601 250 100 0.014

450 4 10.997 3.5601 250 100 0.014

450 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

700 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

700 4 10.997 3.5601 250 100 0.013

700 4 10.997 3.5601 250 100 0.012



80 4 10.997 3.5601 250 2510 0.179 0.202

80 4 10.997 3.5601 250 2510 0.181 0.202

80 4 10.997 3.5601 250 2510 0.181 0.204

150 4 10.997 3.5601 250 2510 0.182 0.209

150 4 10.997 3.5601 250 2510 0.179 0.202

52

150 4 10.997 3.5601 250 2510 0.173 0.202

300 4 10.997 3.5601 250 2510 0.176 0.202

300 4 10.997 3.5601 250 2510 0.174 0.204

300 4 10.997 3.5601 250 2510 0.178 0.204

450 4 10.997 3.5601 250 2510 0.169 0.204

450 4 10.997 3.5601 250 2510 0.179 0.202

450 4 10.997 3.5601 250 2510 0.178 0.202

700 4 10.997 3.5601 250 2510 0.177 0.202

700 4 10.997 3.5601 250 2510 0.172 0.202

700 4 10.997 3.5601 250 2510 0.176 0.202

2.3. Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng



3 1 10.997 0.8900 100 40 0.018

3 1 10.997 0.8900 100 40 0.017

3 1 10.997 0.8900 100 40 0.017

5 1 10.997 0.8900 100 40 0.019

5 1 10.997 0.8900 100 40 0.02

5 1 10.997 0.8900 100 40 0.023

7 1 10.997 0.8900 100 40 0.02

7 1 10.997 0.8900 100 40 0.021

7 1 10.997 0.8900 100 40 0.022

9 1 10.997 0.8900 100 40 0.023

9 1 10.997 0.8900 100 40 0.025

9 1 10.997 0.8900 100 40 0.023



3 1 10.997 0.8900 100 304 0.584 0.714

3 1 10.997 0.8900 100 304 0.542 0.714

3 1 10.997 0.8900 100 304 0.565 0.714

5 1 10.997 0.8900 100 304 0.558 0.714

5 1 10.997 0.8900 100 304 0.563 0.714

5 1 10.997 0.8900 100 304 0.561 0.714

7 1 10.997 0.8900 100 304 0.559 0.714

7 1 10.997 0.8900 100 304 0.565 0.714

7 1 10.997 0.8900 100 304 0.556 0.714

9 1 10.997 0.8900 100 304 0.553 0.716

9 1 10.997 0.8900 100 304 0.558 0.716

53

9 1 10.997 0.8900 100 304 0.562 0.716

3. Phụ lục 3: kết quả thí nghiệm tối ưu

NT Kl mẫu (g) Ẩm (%) CK (g) V (ml) OD Ac TFC

1 20 95.4 0.9200 20 0.545 0.700 9.687

2 20 95.4 0.9200 20 0.564 0.700 8.974

3 20 95.4 0.9200 20 0.559 0.700 8.984

4 20 95.4 0.9200 20 0.542 0.700 10.436

5 20 95.4 0.9200 20 0.547 0.702 9.140

6 20 95.4 0.9200 20 0.539 0.702 9.972

7 20 95.4 0.9200 20 0.538 0.702 9.611

8 20 95.4 0.9200 20 0.514 0.702 10.829

9 20 95.4 0.9200 20 0.559 0.712 8.619

10 20 95.4 0.9200 20 0.524 0.712 10.618

11 20 95.4 0.9200 20 0.555 0.712 8.813

12 20 95.4 0.9200 20 0.526 0.706 10.623

13 20 95.4 0.9200 20 0.524 0.706 10.733

14 20 95.4 0.9200 20 0.519 0.706 10.753

15 20.02 95.4 0.9209 20 0.499 0.718 12.616

16 20 95.4 0.9200 20 0.498 0.718 12.973

17 20.1 95.4 0.9246 20 0.471 0.718 13.505

ti Ưu hÓa quÁ tr Ình thu nh °n flavonoid tỪ cỦ cẢi tr...

Documents