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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels auf die
ruminalen Fermentationsparameter von Maispflanzen sowie die
Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in vitro
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Birgit Eva Meibaum
Pforzheim
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves
Physiologisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Martin Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 26. April 2013
Diese Studie wurde als Teilprojekt des Kooperationsprojekts „Klimafolgenforschung
in Niedersachsen (KLIFF)“ durch das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft
und Kultur gefördert.
Für meine Familie
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
MEIBAUM, B., S. RIEDE, B. SCHRÖDER, R. MANDERSCHEID, H.-J. WEIGEL u. G. BREVES (2012): Elevated CO2 and drought stress effects on the chemical composition of maize plants, their ruminal fermentation and microbial diversity in vitro. Archives of Animal Nutrition 66, 473-489
V
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... XI
Tabellenverzeichnis ................................................................................................. XIII
1 Einleitung ........................................................................................................ 1
1.1 Veränderung der Umweltbedingungen durch den Klimawandel ..................... 1
1.2 Auswirkungen von erhöhter [CO2] und Trockenstress auf den
Pflanzenstoffwechsel ...................................................................................... 2
1.2.1 Unterschiede zwischen C3- und C4-Photosynthese ........................................ 3
1.2.2 Auswirkungen auf Leistungsparameter von Pflanzen ..................................... 6
1.3 Mais als Futtermittel für Rinder ....................................................................... 8
1.4 Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit ....................................................... 11
2 Material und Methoden ................................................................................. 13
2.1 Pflanzenmaterial ........................................................................................... 13
2.2 Rumen-Simulationstechnik ........................................................................... 16
2.3 Versuchsdesign ............................................................................................ 20
2.3.1 Versuchsvorbereitungen ............................................................................... 20
2.3.2 Versuchsbeginn ............................................................................................ 21
2.3.3 Probenentnahme V1 ..................................................................................... 22
2.3.4 Probenentnahme V2 ..................................................................................... 24
2.3.5 Analysen ....................................................................................................... 25
2.4 Statistische Auswertung ................................................................................ 29
2.5 Single-strand-conformation-polymorphism-Analyse...................................... 30
2.5.1 Aufbereitung der Proben ............................................................................... 31
2.5.2 Isolierung der genomischen DNA der ruminalen Mikroflora .......................... 31
2.5.3 Photometrische Quantifizierung der isolierten gDNA .................................... 33
2.5.4 Agarose-Gelelektrophorese .......................................................................... 33
2.5.5 Polymerase-Kettenreaktion ........................................................................... 33
VI Inhaltsverzeichnis
2.5.6 Aufreinigung und photometrische Quantifizierung der nested PCR-
Produkte ....................................................................................................... 36
2.5.7 Einzelstrangverdau und Aufreinigung ........................................................... 36
2.5.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................. 37
2.5.9 Silbernitrat-Färbung ...................................................................................... 38
2.6 Statistische Auswertung der SSCP-Profile ................................................... 39
3 Ergebnisse .................................................................................................... 41
3.1 Pflanzenmaterial ........................................................................................... 41
3.1.1 Simulierung der Klimabedingungen .............................................................. 41
3.1.2 Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der vier Maisvarianten ........... 41
3.2 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 1 ......................................................... 43
3.2.1 pH-Werte ...................................................................................................... 43
3.2.2 Redoxpotentiale ............................................................................................ 45
3.2.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile ................................. 47
3.2.4 Produktionsraten und Konzentrationen der Fermentationsgase ................... 53
3.2.5 NH3-N-Konzentrationen ................................................................................ 56
3.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz ................................................. 57
3.2.7 Anzahl der Protozoa ..................................................................................... 58
3.3 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 2 ......................................................... 59
3.3.1 pH-Werte ...................................................................................................... 59
3.3.2 Redoxpotentiale ............................................................................................ 60
3.3.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile ................................. 61
3.4 Darstellung und Analyse der SSCP-Profile ................................................... 67
3.4.1 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V1 ..................................................... 67
3.4.2 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V2 ..................................................... 72
4 Diskussion .................................................................................................... 77
4.1 FACE-Methode und Pflanzenmaterial ........................................................... 77
4.2 Beurteilung der RUSITEC-Versuche ............................................................. 81
4.2.1 pH-Werte ...................................................................................................... 81
4.2.2 Redoxpotentiale ............................................................................................ 81
4.2.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA ........................................... 82
Inhaltsverzeichnis VII
4.2.4 Fermentationsgase ....................................................................................... 84
4.2.5 NH3-N-Konzentrationen ................................................................................ 85
4.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz ................................................. 86
4.2.7 Anzahl der Protozoa ..................................................................................... 87
4.2.8 Abschließende Beurteilung der RUSITEC-Versuche .................................... 88
4.3 Effekte der Klimaveränderungen .................................................................. 89
4.3.1 pH-Werte ...................................................................................................... 89
4.3.2 Redoxpotentiale ............................................................................................ 90
4.3.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA ........................................... 91
4.3.4 Fermentationsgase ....................................................................................... 92
4.3.5 NH3-N-Konzentrationen ................................................................................ 92
4.3.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz ................................................. 94
4.3.7 Anzahl der Protozoa ..................................................................................... 96
4.4 Beurteilung der Ergebnisse der SSCP-Analyse ............................................ 97
4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick ................................................................. 99
5 Zusammenfassung ..................................................................................... 101
6 Summary .................................................................................................... 103
7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 105
8 Anhang ....................................................................................................... 121
8.1 Verwendete Lösungen ................................................................................ 121
8.2 Eingesetzte Chemikalien ............................................................................ 124
8.3 Rohdaten der RUSITEC-Versuche ............................................................. 126
8.3.1 Rohdaten in V1 ........................................................................................... 126
8.3.2 Rohdaten in V2 ........................................................................................... 134
9 Danksagung ................................................................................................ 139
VIII
Abkürzungsverzeichnis
In dieser Arbeit wurden neben den allgemein üblichen Abkürzungen folgende
spezielle Kurzformen verwendet:
[CO2] Kohlenstoffdioxidkonzentration in der Atmosphäre
A 380 ppm CO2
ad auffüllen bis
ADF Acid detergent fibre; saure Detergentien-Fasern
ADL Acid detergent lignin; saures Detergentien-Lignin
ANOVA Analysis of variance; Varianzanalyse
APS Ammoniumperoxodisulfat
Aqua bidest. Aqua bidestillata; zweifach destilliertes Wasser
Aqua dest. Aqua destillata; destilliertes Wasser
AT Annealingtemperatur
ATP Adinosintriphosphat
B 550 ppm CO2
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
C 380 ppm CO2 + Trockenstress
ca. circa
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
D 550 ppm CO2 + Trockenstress
DNA Desoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
dsDNA Double-stranded DNA; Doppelstrang-DNA
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
et al. et alii
FACE Free air carbon dioxide enrichment; Freiluft-CO2-Anreicherung
fw forward
g Erdbeschleunigung
gDNA genomische DNA
hPa Hektopascal
KLIFF Klimafolgenforschung
Abkürzungsverzeichnis IX
LSD Least significant difference
LWC Leaf water content; Wassergehalt der Blätter
Mio. Millionen
MW Mittelwert
n Stichprobenumfang
NDF Neutral detergent fibre; neutrale Detergentien-Fasern
NfE stickstoff-freie Extraktionsstoffe
NH3-N Ammoniak-Stickstoff
n-m MDS nicht-metrische multidimensionale Skalierung
NPGS Neopentylglycolsuccinat
NPN Nicht-Protein-Stickstoff
ns nicht signifikant
oS organische Substanz
p Irrtumswahrscheinlichkeit
p.a. pro analysi
PAA Polyacrylamid
PAST Paleontological Statistics
PCR Polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion
PEPC Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
PERMANOVA Permutational multivariate analysis of variance
Ph phosphorylierender reverse Primer
ppm Parts per million
PVC Polyvinylchlorid
Ra Rohasche
Rfa Rohfaser
Rfe Rohfett
RNase Ribonuklease
Rp Rohprotein
RuBisCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase
RubP Ribulose-1,5-bisphosphat
RUSITEC Rumen simulation technique; Rumen-Simulationstechnik
rv reverse
SCFA Short chain fatty acids; kurzkettige Fettsäuren
SDS Sodium dodecyl sulfate; Natriumdodecylsulfat
SEM Standard error of the mean; Standardfehler des Mittelwerts
X Abkürzungsverzeichnis
SSCP Single strand conformation polymorphism; Einzelstrang-Konformationspolymorphismus
ssDNA Single-stranded DNA; Einzelstrang-DNA
SWC Soil water content; Wassergehalt des Bodens
TAE Tris-Acetat-EDTA
TBE Tris-Borat-EDTA
TCD Thermal conductivity detector; Wärmeleitdetektor
TE Tris-EDTA
TEMED N,N,N’,N‘-Tetramethylethylendiamin
TEN Tris-EDTA-NaCl
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TS Trockensubstanz
U Enzymaktivität
uS ursprüngliche Substanz
UPGMA Unweighted pair group method using arithmetic averages
V1 Versuch 1
V2 Versuch 2
V-Faktor Verdünnungsfaktor
WUE Water use efficiency; Wassernutzungseffizienz
Z Zentrifugation
XI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Vergleich der Blattanatomie von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)
Abbildung 1.2: Vergleich der CO2-Fixierungsmechanismen von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach HATCH (1987)
Abbildung 1.3: Vergleich der Photosyntheseraten von C3- und C4-Pflanzen in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration in der Atmosphäre; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)
Abbildung 2.1: Schema des FACE-Versuchsaufbaus mit den Versuchsabschnitten ohne CO2-Behandlung (linker, durchgezogener Kreis) und mit CO2-Anreicherung (rechter, gestrichelter Kreis) jeweils zur Hälfte mit und ohne Trockenstressinduktion durch die Überdachung
Abbildung 2.2: 1 RUSITEC-Anlage 2 Vergrößerung eines eingebauten Fermenters (A) mit Innengefäß (B)
Abbildung 2.3: Verteilung der Substrate und Anordnung der Fermenter für V1 und V2
Abbildung 3.1: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.2: Verlauf der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.3: Verlauf der SCFA-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.4: Verlauf der Produktionsraten von Acetat (a), Propionat (b), Butyrat (c) und Isovalerat (d) in mmol • Tag
-1 (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier
Maisvarianten
Abbildung 3.5: Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b), Butyrat (c) und Isovalerat (d) in Prozent der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.6: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.7: Verlauf der Produktion der Fermentationsgase insgesamt [ml • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.8: Verlauf der Anteile von CO2 (a) und CH4 (b) an der Fermentationsgas-produktion [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.9: Verlauf der NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.10: Verlauf der Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.11: Anzahl der Protozoa [103 • ml
-1] an Tag 1, Tag 7 und Tag 14 verglichen mit
der Nativprobe (MW ± SEM; n=3) für die vier Maisvarianten
Abbildung 3.12: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
XII Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3.13: Verlauf der Redoxpotentiale [mV] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Abbildung 3.14: Verlauf der Produktionsraten der SCFA [mmol • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Abbildung 3.15: Verlauf der Produktionen von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in mmol • Tag
-1 (MW ± SEM; n=3; (*) = p<0,1) vergleichend für die zwei
Maisvarianten
Abbildung 3.16: Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in Prozent der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Abbildung 3.17: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Abbildung 3.18: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.19: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.20: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.21: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.22: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.23: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
Abbildung 3.24:
Zwei-dimensionale nicht-metrische multidimensionale Skalierung (n-m MDS) der Abweichungsmatrizes der Clusteranalysen des Bacteria- (a) und Archaea-Profils (b) jeweils vergleichend für die Versuchstage 1 und 7
Abbildung 4.1:
Zusammenfassung der Aus- und Wechselwirkungen von Trockenstress und erhöhter [CO2] auf C4-Pflanzen. Die durchgezogenen Pfeile kennzeichnen direkte Folgen, gestrichelte Pfeile zeigen hemmende Prozesse an. Abgewandelt nach LEAKEY (2009).
Abbildung 4.2:
Der NH3-Pool in der Fermenterflüssigkeit wird gebildet durch mikrobielle Auf- (rechts) und Abbauprozesse von N-Verbindungen (links).
XIII
Tabelle 2.1: Benennung der Anbauvarianten der Maispflanzen
Tabelle 2.2: Zusammensetzung des als künstlicher Speichel eingesetzten Puffers; modifiziert nach MCDOUGALL (1948)
Tabelle 2.3: Probenentnahmeplan V1
Tabelle 2.4: Probenentnahmeplan V2
Tabelle 2.5: Messparameter der gaschromatographischen Analyse der SCFA
Tabelle 2.6: Verdünnungsfaktoren zur Bestimmung der Protozoa-Konzentration
Tabelle 2.7: Inkubationsschritte während der DNA-Isolierung
Tabelle 2.8: Phenol-Chloroform-Extraktion
Tabelle 2.9: Die Primer für die Polymerase-Kettenreaktionen der 16S rRNA-Gene
Tabelle 2.10: Ansätze für die initiale Domäne-spezifische PCR und die nested PCR
Tabelle 2.11: Programme der initialen Domäne-spezifischen PCR und der nested PCR
Tabelle 2.12: Ansatz der Reaktionslösung für den Einzelstrangverdau pro Probe
Tabelle 3.1: Gehalte der Maisvarianten an Rohnährstoffen [g • kg-1
TS; TS in g • kg-1
uS]
Tabelle 3.2: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01)
Tabelle 3.3: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
Tabelle 3.4: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der SCFA (MW ± SEM; n=3)
Tabelle 3.5: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)
Tabelle 3.6: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)
Tabelle 3.7: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)
Tabelle 3.8: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der Fermentationsgase (MW ± SEM; n=3)
Tabelle 3.9: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der CO2- und CH4-Anteile am produzierten Fermentationsgasgemisch (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
Tabelle 3.10: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der NH3-N-Konzentrationen (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)
Tabelle 3.11: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Verdaulichkeiten der organischen Substanz (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05)
Tabelle 3.12: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Anzahl der Protozoa (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
Tabellenverzeichnis
XIV Tabellenverzeichnis
Tabelle 3.13: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) während der Äquilibrierungsphase
Tabelle 3.14: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Tabelle 3.15: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der SCFA-Produktionsraten (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Tabelle 3.16: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Tabelle 3.17: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase
Tabelle 3.18: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Verhältnisse von Acetat zu Propionat (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase
Tabelle 3.19: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1
Tabelle 3.20: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1
Tabelle 3.21: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1
Tabelle 3.22: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1
Tabelle 3.23: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2
Tabelle 3.24: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2
Tabelle 8.1: Aufzählung der Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen
Tabelle 8.2: Aufzählung der eingesetzten Chemikalien
Tabelle 8.3: pH-Werte in V1
Tabelle 8.4: Redoxpotentiale [mV] in V1
Tabelle 8.5: Überläufe [ml] in V1
Tabelle 8.6: Produktionsraten der gesamten SCFA [mmol • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.7: Acetat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.8: Propionat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.9: Butyrat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.10: Isovalerat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.11: Molare Acetat-Anteile [%] in V1
Tabellenverzeichnis XV
Tabelle 8.12: Molare Propionat-Anteile [%] in V1
Tabelle 8.13: Molare Butyrat-Anteile [%] in V1
Tabelle 8.14: Molare Isovalerat-Anteile [%] in V1
Tabelle 8.15: Acetat:Propionat-Verhältnisse in V1
Tabelle 8.16: Produktionsraten der Fermentationsgase [ml • Tag-1
] in V1
Tabelle 8.17: CO2-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%] in V1
Tabelle 8.18: CH4-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%]in V1
Tabelle 8.19: Luftdruck [hPa] in V1
Tabelle 8.20: Temperatur [°C] in V1
Tabelle 8.21: NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1
] in V1
Tabelle 8.22: Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] in V1
Tabelle 8.23: Anzahl der Protozoa [103 • ml
-1] in V1
Tabelle 8.24: pH-Werte in V2
Tabelle 8.25: Redoxpotentiale [mV] in V2
Tabelle 8.26: Produktionsraten der gesamten SCFA [mmol • Tag-1
] in V2
Tabelle 8.27: Acetat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
Tabelle 8.28: Propionat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
Tabelle 8.29: Butyrat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
Tabelle 8.30: Molare Acetat-Anteile [%] in V2
Tabelle 8.31: Molare Propionat-Anteile [%] in V2
Tabelle 8.32: Molare Butyrat-Anteile [%] in V2
Tabelle 8.33: Acetat:Propionat-Verhältnisse in V2
1
1 Einleitung
1.1 Veränderung der Umweltbedingungen durch den
Klimawandel
Das Klima, welches meist durch Mittelwerte von Temperaturen,
Windgeschwindigkeiten und Niederschlagsraten als Funktion der Zeit definiert wird,
gehorcht einem dynamischen Regelkreis. So hat die Zusammensetzung der
Atmosphäre entscheidenden Einfluss auf das Klima. Die atmosphärische
Zusammensetzung wiederum wird beispielsweise durch die Sonneneinstrahlung und
von Vulkanausbrüchen beeinflusst (LE TREUT et al. 2007). Zusätzlich kam mit Beginn
der industriellen Revolution (18. Jahrhundert) ein anthropogener Einfluss auf die
Zusammensetzung der Atmosphäre und damit auf das Klima hinzu (LATIF 2006; LE
TREUT et al. 2007). Die gesteigerte Nutzung fossiler Brennstoffe zur
Energiegewinnung und die damit verbundenen Kohlendioxid (CO2)-Emissionen
führten zu einem Anstieg der CO2-Konzentration in der Atmosphäre ([CO2]) von
vorindustriellen 280 ppm bis auf 367 ppm im Jahr 1999 (PRENTICE et al. 2001).
Durch eine höhere [CO2] in der Atmosphäre wird der Treibhauseffekt verstärkt. Von
der Sonne abgegebenes kurzwelliges Licht im ultravioletten Bereich dringt durch die
Atmosphäre und trifft auf die Erdoberfläche. Dort wird ein Teil der Strahlung in
Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Oberfläche absorbiert, ein anderer Teil
reflektiert. Im Gegenzug wird Wärmestrahlung im nicht sichtbaren Infrarotbereich von
der Erdoberfläche abgegeben. Von der atmosphärischen Zusammensetzung hängt
es nun ab, wie groß der Anteil der Strahlung ist, welche die Atmosphäre wieder
verlässt. Nimmt die Konzentration der Treibhausgase wie beispielsweise
Wasserdampf, CO2 und Methan (CH4) zu, wird ein größerer Anteil der Strahlung in
der Atmosphäre reflektiert. Das reflektierte langwellige Licht führt zu einem Anstieg
der Durchschnittstemperaturen in der Atmosphäre (LE TREUT et al. 2007).
2 Einleitung
In einer Studie konnten neben signifikant sinkenden Niederschlagsraten während der
Sommermonate ebenfalls signifikant steigende Temperaturen für alle Jahreszeiten
durch die Auswertung der Daten niedersächsischer Temperatur- und
Niederschlagsmessstationen über einen Beobachtungszeitraum von 1951 bis 2005
nachgewiesen werden (HABERLANDT et al. 2010).
Um zukünftige Auswirkungen des Klimawandels vorhersagen und Strategien zur
Abwendung möglicher negativer Folgen erarbeiten zu können, wurde anhand
verschiedener Szenarien die Entwicklung der [CO2] kalkuliert. Für die Mitte des 21.
Jahrhunderts wird eine [CO2] von 550 ppm erwartet. Im Jahre 2100 könnten mehr als
1000 ppm CO2 erreicht werden (PRENTICE et al. 2001). Ebenfalls berechnet wurden
Trends für lokale Wetterphänomene wie Niederschlagsraten, Trockenperioden und
Hitzewellen. Die Ergebnisse der Szenarien für Mitteleuropa weisen auf bis zu 24%
geringere Niederschlagsraten während der Sommermonate und bereits im Frühjahr
ansteigende Evaporationsraten hin. Zusammen könnten beide Faktoren zu
geringeren Wassergehalten der Böden (soil water content; SWC) führen
(CHRISTOPHERSON u. KENNEDEY 1983; ALCAMO et al. 2007). Eine Kombination aus
ansteigenden Temperaturen und abnehmenden Niederschlägen während der
Sommermonate könnte darüber hinaus zu einem erhöhten Auftreten von extremen
Hitzewellen und ausgeprägten Trockenperioden führen (ALCAMO et al. 2007).
Die [CO2] und die Verfügbarkeit von Wasser haben großen Einfluss auf das
Wachstum und den Ertrag von Pflanzen. Wegen des Einsatzes von Nutzpflanzen als
Nahrungsmittel sowie als Futtermittel für Nutztiere ist der Einfluss des Klimawandels
auf die globale Versorgungslage mit pflanzlichen und tierischen Nahrungsmitteln
nicht zu unterschätzen.
1.2 Auswirkungen von erhöhter [CO2] und Trockenstress auf
den Pflanzenstoffwechsel
Die drei wichtigsten Nutzpflanzen weltweit sind Reis, Mais und Weizen (PINGALI
2001). Während Weizen und Reis den sogenannten C3-Pflanzen zugeordnet werden,
Einleitung 3
gehört Mais zur Gruppe der C4-Pflanzen. Unterschiede zwischen diesen
Pflanzengruppen bestehen in der Blattanatomie und im Photosynthesemechanismus.
Es wird vermutet, dass sich die C4-Photosynthese zwischen dem späten Cretaceum
(vor ca. 100 Mio. Jahren) und dem Miozän (vor ca. 5 Mio. Jahren) entwickelt hat,
während die [CO2] der Atmosphäre deutlich abfiel (LASAGA et al. 1985; SAGE 2004).
Gegenwärtig kommen C4-Pflanzen vorwiegend in trockenen Lebensräumen mit
hoher Lichteinstrahlung vor (EHLERINGER et al. 1991; GHANNOUM 2009). Aufgrund der
distinkten Photosynthesemechanismen unterscheiden sich die Auswirkungen des
Klimawandels auf verschiedene Stoffwechselparameter von C3- und C4-Pflanzen.
1.2.1 Unterschiede zwischen C3- und C4-Photosynthese
Abbildung 1.1 zeigt vergleichend den Blattquerschnitt einer C3- und einer C4-Pflanze.
Während der Dunkelreaktion der Photosynthese erfolgt die CO2-Fixierung in den
Mesophyllzellen, die in C3-Blättern ein Palisaden- und Schwammparenchym bilden.
Die Leitbündel liegen eingebettet im Schwammparenchym.
Abbildung 1.1: Vergleich der Blattanatomie von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)
Im Gegensatz zu diesem Aufbau liegen in einem C4-Blatt die Mesophyllzellen zirkulär
um sogenannte Bündelscheidenzellen angeordnet, die wiederum die Leitbündel
umgeben. Diese spezielle Struktur wird auch als Kranzanatomie bezeichnet (HATCH
1987; TAIZ u. ZEIGER 1991).
4 Einleitung
Neben der abweichenden Blattanatomie unterscheiden sich C3- und C4-Pflanzen
auch im Mechanismus der CO2-Fixierung (Abbildung 1.2). Zunächst diffundiert bei
beiden Varianten CO2 passiv durch die Spaltöffnungen (Stomata) in den
Interzellularraum und anschließend in die Mesophyllzellen.
Bei C3-Pflanzen wird das CO2 im Cytosol aller Mesophyllzellen enzymatisch mithilfe
der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) an den Akzeptor
Ribulose-1,5-bisphosphat (RubP; C5-Körper) gebunden. Der so entstehende C6-
Körper wird anschließend in die Chloroplasten transportiert, um dort in den
Citratzyklus eingeschleust zu werden. Im Zuge des Citratzyklus werden C3-Körper
gebildet, die zur Synthese von Biomasse (Kohlenhydrate und Proteine) verwendet
werden.
Abbildung 1.2: Vergleich der CO2-Fixierungsmechanismen von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach HATCH (1987)
RubP Ribulose-1,5-bisphosphat
RuBisCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase
PEP Phosphoenolpyruvat
PEPC Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
Zellwand der Bündelscheidenzellen mit Suberin-Einlagerung
Einleitung 5
Die eigentliche CO2-Fixierung bei C4-Pflanzen erfolgt im Gegensatz dazu in den
Bündelscheidenzellen. Zunächst wird CO2 in den Chloroplasten der peripher
gelegenen Mesophyllzellen vorfixiert. Die Bindung erfolgt mithilfe des Enzyms
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC), das sich durch eine hohe CO2-Affinität
auszeichnet, an den Akzeptor Phosphoenolpyruvat (C3-Körper). Der entstehende
C4-Körper, der namensgebend für diesen Photosynthesemechanismus ist, wird im
weiteren Verlauf aktiv in die Bündelscheidenzellen transportiert und dort
decarboxyliert. Der C3-Rest wandert zurück in die Mesophyllzellen, um dort erneut
CO2 zu binden (HATCH 1987). Ein Vorteil der C3-Photosynthese liegt in einer
Energieersparnis von 2 Mol ATP (Adenosintriphosphat) pro Fixierung eines Mols
CO2, da der energetische Aufwand für den aktiven Transport während des
C4-Kreislaufs eingespart werden kann (HATCH u. OSMOND 1976).
In den Bündelscheidenzellen erfolgt die CO2-Fixierung im Anschluss an die
Decarboxylierung mithilfe von RuBisCO entsprechend der C3-Photosynthese. Die
Diffusion von CO2 aus den Bündelscheidenzellen heraus wird durch die Einlagerung
von Suberin, einem aus phenolischen und aliphatischen Anteilen
zusammengesetzten Biopolymer, in die Zellwand erschwert (KOLATTUKUDY 1981). So
wird ein erhöhter CO2-Partialdruck in den Bündelscheidenzellen aufgebaut (HATCH
1987). Der aus einem erhöhten CO2-Partialdruck im Kompartiment der CO2-Fixierung
resultierende Vorteil der C4-Pflanzen besteht in einer gesteigerten
Photosyntheseeffizienz durch eine Verringerung der Photorespirationsrate (PEARCY
u. EHLERINGER 1984; HATCH 1987; GHANNOUM 2009). RuBisCO weist eine geringe
Affinität für CO2 auf und bindet ebenfalls Sauerstoff (O2) (PEARCY u. EHLERINGER
1984; HATCH 1987). Ein Einbringen von O2 in den Citratzyklus führt zur
Photorespiration, einem Vorgang, bei dem unter großem energetischem Aufwand
CO2 und Wasser entstehen (HATCH 1987). Durch die effektivere Nutzung von
RuBisCO weisen C4-Pflanzen höhere Photosyntheseraten im Vergleich zu C3-
Pflanzen auf. Dies gilt besonders bei niedrigen [CO2].
6 Einleitung
1.2.2 Auswirkungen auf Leistungsparameter von Pflanzen
Um die Auswirkungen des Klimawandels zu simulieren, wurde in den letzten Jahren
wiederholt das kammerlose Feldbegasungssystem (free air carbon dioxide
enrichment; FACE) eingesetzt. Die FACE-Methode wurde im Brookhaven National
Laboratory (Upton, New York, USA) entwickelt, wobei erstmals anstatt in
Gewächshäusern auf dem Feld wachsende Pflanzen (free air) mit einer definierten
[CO2] begast (carbon dioxide enrichment) wurden (LEWIN et al. 1994). Ein Vorteil
dieser Methode ist es, dass die Effekte ansteigender [CO2] auf Wachstum und Ertrag
von Pflanzen unter Feldbedingungen ohne artifizielle Beeinflussung anderer
Klimabedingungen wie der Windgeschwindigkeit, der Umgebungstemperatur und der
Sonneneinstrahlung untersucht werden können (FOYER et al. 1998).
Grundsätzlich führt eine gesteigerte [CO2] durch eine höhere CO2-Sättigung von
RuBisCO zu höheren Photosyntheseraten. Die unterschiedlichen CO2-Fixierungs-
mechanismen von C3- und C4-Pflanzen führen allerdings zu unterschiedlichen
Verläufen der Leistungssteigerung in Abhängigkeit von der [CO2] (Abbildung 1.3).
Abbildung 1.3: Vergleich der Photosyntheseraten von C3- und C4-Pflanzen in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration in der Atmosphäre; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)
Einleitung 7
Durch die CO2-Vorfixierung mithilfe der PEPC und der Steigerung der RuBisCO-
Auslastung scheint die C4-Photosynthese unter derzeitig vorherrschenden [CO2]
nahezu gesättigt zu sein. Bei einem Anstieg der [CO2] wäre die zu erwartende
Steigerung der Photosyntheserate gering (GHANNOUM et al. 2003; LEAKEY et al.
2004). Im Gegensatz dazu wird die Photosyntheserate von C3-Pflanzen bei
ansteigenden [CO2] deutlich gesteigert werden (TAIZ u. ZEIGER 1991).
Anhand von FACE-Versuchen konnte wiederholt bestätigt werden, dass eine erhöhte
[CO2] keinen signifikanten Einfluss auf Wachstum und Ertrag von C4-Pflanzen hat
(GHANNOUM et al. 2000; LEAKEY et al. 2004; LEAKEY et al. 2006). Widersprüchliche
signifikante Auswirkungen wurden durch kurzzeitiges Auftreten von Trockenstress
erklärt (GHANNOUM et al. 2000; LEAKEY et al. 2004; LEAKEY 2009; ALLEN et al. 2011).
Trockenstress ist neben der [CO2] ein weiterer abiotischer Faktor mit Wirkung auf die
Leistungsparameter von Pflanzen. Sinkt der Wassergehalt der Blätter (leaf water
content; LWC) durch Trockenstress ab, verengen sich die Öffnungen der Stomata.
Die stomatäre Leitfähigkeit, die ein Maß für die Abgaberate von Wasserdampf aus
dem Blattinneren sowie für die CO2-Aufnahmerate in das Blattinnere über die
Stomata ist, wird damit ebenfalls verringert. Geringe stomatäre Leitfähigkeiten
senken den Wasserverlust der Pflanzen auch durch verminderte Transpiration,
wodurch die Wassernutzungseffizienz (water use efficiency; WUE) gesteigert werden
kann (LEAKEY et al. 2006; ALLEN et al. 2011; MARKELZ et al. 2011). Gleichzeitig sinkt
allerdings die CO2-Aufnahmerate und damit auch die Photosyntheserate (EARL u.
DAVIS 2003). Infolge von Trockenstress nimmt die Aktivität der an der Photosynthese
beteiligten Enzyme ab (BECKER u. FOCK 1986). Zusätzlich kann eine verfrühte
Alterung der Pflanzen auftreten (GHANNOUM 2009). In den Blättern wird vermehrt
Chlorophyll abgebaut, wodurch sich die der Photosynthese zur Verfügung stehende
Fläche der grünen Blätter verringert (BECKER u. FOCK 1986; FOYER et al. 1998;
EFEOĞLU et al. 2009). Das Absorptionsvermögen von Strahlung und der
Wirkungsgrad der absorbierten für die Photosynthese nutzbaren Strahlung nehmen
ab (NESMITH u. RITCHIE 1992; EARL u. DAVIS 2003). Bei Maispflanzen kann sich
zudem die Phase der Kornfüllung verkürzen (NESMITH u. RITCHIE 1992). Die
8 Einleitung
verringerten CO2-Assimilationsraten und Chlorophyllgehalte in der Phase nach der
Anthese (Blattentwicklung) führen zu Veränderungen der chemischen
Zusammensetzung der Pflanzen. Die Gehalte an Rohprotein (Rp) und der
Zellwandbestandteile bezogen auf die Ganzpflanze steigen an. Gleichzeitig fallen der
Ansatz von Trockenmasse und der Kornertrag im Vergleich zu gut bewässerten
Pflanzen geringer aus (NESMITH u. RITCHIE 1992; ZINSELMEIER et al. 1995; EARL u.
DAVIS 2003; EFEOĞLU et al. 2009).
Eine zusätzlich erhöhte [CO2] in der Atmosphäre kann die negativen Auswirkungen
von Trockenstress abmildern. Unabhängig vom CO2-Fixierungsmechanismus bewirkt
eine erhöhte atmosphärische [CO2] ebenfalls eine Abnahme der stomatären
Leitfähigkeit (KIMBALL et al. 1993; LEAKEY et al. 2004). Gemeinsam mit geringeren
Transpirationsraten und höherer WUE kann ein höherer SWC sowie ein gesteigerter
Wassergehalt in den Blättern erreicht werden. Höhere SWC, LWC und WUE können
wiederum den Eintritt und das Ausmaß der Auswirkungen des Trockenstresses
verzögern (WARD et al. 1999; GHANNOUM et al. 2003; LEAKEY et al. 2004; ALLEN et al.
2011; MARKELZ et al. 2011).
Es wurde bereits gezeigt, dass das Klima die chemische Zusammensetzung von
Pflanzen beeinflusst. Das Klima sollte damit auch einen Effekt auf den Nähr- und
Futterwert von Pflanzen haben (WEIGEL u. MANDERSCHEID 2005; MEYER et al. 2009).
1.3 Mais als Futtermittel für Rinder
Aufgrund der Bedeutung als Nutzpflanze für die Nahrungsmittel- und Futtermittel-
produktion und als typische C4-Pflanze wurde Mais wiederholt als Modellpflanze in
Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels eingesetzt. Bis 2020 wird
damit gerechnet, dass der weltweite Bedarf für Mais den von Reis noch übersteigen
wird (PINGALI 2001). Mit steigendem Lebensstandard steigt auch in den
Entwicklungsländern die Nachfrage nach tierischen Lebensmitteln und damit nach
Mais als Futtermittel landwirtschaftlicher Nutztiere (PINGALI 2001). Der Einsatz erfolgt
Einleitung 9
in Form von Ganzpflanzensilage, Corn-Cop-Mix oder Körnermais in der Fütterung
von Rindern, Schweinen und Geflügel (MEYER et al. 2009).
Rinder gehören zur Gruppe der Wiederkäuer (Polygastrier). Sie weisen ein
dreiteiliges Vormagensystem auf, das zusammengesetzt ist aus der Haube
(Retikulum), dem Pansen (Rumen) und dem Blättermagen (Omasum). Die
Vormägen sind dem Labmagen (Abomasum) vorgeschaltet, welcher dem
einhöhligen Magen der Monogastrier (z.B. Hund, Katze, Schwein) entspricht. Die
Vormägen, von denen der Pansen bei ausgewachsenen Wiederkäuern das größte
Volumen aufweist, haben die Funktion von Gärkammern. Aus Haube und Pansen
werden grobe Partikel wiederholt über die Speiseröhre zurück in die Maulhöhle
transportiert und zerkaut (Wiederkäuen, Rumination). Diese Oberflächen-
verkleinerung unterstützt den Aufschluss des zumeist cellulose- und faserreichen
Futters durch die in den Vormägen ansässigen Mikroorganismen (CZERKAWSKI 1986).
Die Gemeinschaft der Mikroorganismen im Pansen setzt sich aus Bacteria, Archaea
und Eukarya (Pilze und Protozoa) zusammen (HUNGATE 1960; CZERKAWSKI 1986).
Mikroorganismen und Wirtstier stehen in einer symbiotischen Wechselbeziehung.
Auf der einen Seite herrschen im konstanten Milieu des Pansens (pH-Wert und
Redoxpotential) optimale Bedingungen für Wachstum und Stoffwechsel der
Mikroorganismen. Durch die Futteraufnahme des Wirtstiers wird der mikrobiellen
Flora regelmäßig frisches Substrat zur Verfügung gestellt, wobei die Besiedlung und
Zersetzung der Pflanzenfasern durch die Oberflächenverkleinerung infolge der
Rumination des Wirtstiers erleichtert wird. Auf der anderen Seite werden die
Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen vom Wirtstier als Substrat genutzt.
Mit der Nahrung aufgenommene Kohlenhydratverbindungen werden von den
Mikroorganismen zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) abgebaut (HUNGATE 1966).
Abhängig vom Substrat werden Acetat, Propionat und Butyrat in Verhältnissen
zwischen 70:15:10 und 40:40:20 gebildet. Länger- und verzweigtkettige SCFA wie
Valerat, Isobutyrat und Isovalerat treten in deutlich geringeren Konzentrationen auf
(CZERKAWSKI 1986; BERGMAN 1990). Die SCFA werden vom Wirtstier über die
Pansenwand aufgenommen und verstoffwechselt. Stickstoff(N)-Verbindungen wie
10 Einleitung
Proteine, aber auch Nicht-Protein-Stickstoff-(NPN)-Verbindungen wie Harnstoff aus
dem Pansen-Leber-Kreislauf werden von den Mikroorganismen zu Peptiden,
Aminosäuren und schließlich zu Ammoniak (NH3) abgebaut, welches im Pansen
aufgrund eines pKs-Wertes von 9,25 bei pH-Werten um 6,7 zu 95% als NH4+-Salz
vorliegt (LENG u. NOLAN 1984). Die Stoffwechselprodukte werden wiederum zur
Synthese mikrobiellen Proteins verwendet (MCDONALD 1948). Diese hochwertigen
N-Verbindungen sowie der Anteil des Rohproteins des Substrats, das nicht im
Pansen abgebaut wurde, dienen dem Wirtstier als Proteinquelle (HUNGATE 1966;
BERGMAN 1990). Während der Fermentation entstehen ebenfalls CO2 und CH4 in
einem Verhältnis von ca. 70:30 (CZERKAWSKI 1986). Die Gase sammeln sich im
dorsalen Pansensack an und bilden eine Gasblase, die über den Ruktus den Pansen
verlässt (HUNGATE 1960; CZERKAWSKI 1986). Im Gegensatz zu den SCFA und dem
mikrobiellen Protein können die während der Fermentation gebildeten Gase vom
Wirtstier nicht genutzt werden. Besonders die Abgabe von CH4 an die Umgebung
über den Ruktus ist mit energetischen Verlusten verbunden (JOHNSON u. JOHNSON
1995).
In der Fütterung von Wiederkäuern und speziell von Rindern ist Maissilage ein
Hauptbestandteil (STÄHLIN 1969; DE BOEVER 1997; KÜHN et al. 1999). Maispflanzen
wachsen schnell, der Anbau liefert einen hohen Ertrag und die hergestellten Silagen
sind reich an langsam abbaubarer Stärke und damit gut verdaulich (AKBAR et al.
2002; LECHARTIER u. PEYRAUD 2010; VÁRADYOVÁ et al. 2010). In-vivo- und In-vitro-
Studien zeigten, dass hohe Maisanteile in der Ration zu einem abnehmenden
molaren Acetat-Anteil an der SCFA-Produktion (41-45%) und daraus folgend zu
niedrigen Acetat:Propionat-Verhältnissen (1,1-1,2:1) führen (PHILLIPSON 1952;
EUSEBIO et al. 1959; FENNER et al. 1970; DE VISSER et al. 1998; RYMER u. GIVENS
2002; HILDEBRAND et al. 2010). Bei In-vitro-Inkubationen von Maissubstraten wurden
NH3-N-Konzentrationen von 5-6 mmol • l-1 und Verdaulichkeiten der organischen
Substanz (oS) von 39-54% gemessen (KLEVENHUSEN et al. 2009; HILDEBRAND et al.
2010; JALČ et al. 2010). Bei einer maisbasierten Fütterung von Rindern ergaben sich
ruminale Verdaulichkeiten der oS von 42-56% (PLASCENCIA u. ZINN 1996; OWENS et
al. 2009). Da eine Veränderung des Klimas während des Aufwuchses von
Einleitung 11
Maispflanzen deren chemische Zusammensetzung beeinflussen kann, könnten auch
die Fermentationsparameter und damit der Futterwert der hergestellten Futtermittel
(Silage) beeinflusst werden.
1.4 Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit
Der Kenntnisstand über die Folgen veränderter Klimabedingungen wie erhöhter
[CO2] und Trockenstress auf den nutritiven Wert von Maispflanzen ist trotz intensiver
Forschung lückenhaft.
In der vorliegenden Arbeit lautet daher die erste Fragestellung: Welche
Auswirkungen haben Maispflanzen, die unter erhöhter [CO2] und Trockenstress
angebaut wurden, auf die Fermentationsparameter im Pansen? Zur Bearbeitung
dieser Fragestellung wurde Mais, der in einem FACE-Versuch mit kontrollierter
Wasserversorgung angebaut worden war, mithilfe der Rumen-Simulationstechnik
(rumen simulation technique; RUSITEC) fermentiert. Diese In-vitro-Methode erlaubt
die Untersuchung der Auswirkungen der Maisvarianten auf die ruminalen
Fermentationsprozesse unter definierten Bedingungen ohne individuellen Einfluss
eines Wirtstieres. Die Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA Acetat,
Propionat, Butyrat und Isovalerat und die NH3-N-Konzentration wurden in der
Pansensimulation analysiert. Des Weiteren wurden die Produktionsraten der
Fermentationsgase CO2 und CH4 und die Verdaulichkeit der organischen Substanz
der Maisvarianten untersucht. Die Anzahl der Protozoa wurde wiederholt im Laufe
des Versuchs in Abhängigkeit des eingesetzten Substrats bestimmt.
Zusätzlich wurde eine zweite Fragestellung bearbeitet: Haben die unterschiedlichen
Maisvarianten einen Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaft im Pansen? Die
Fragestellung wurde anhand der Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-
Analyse zur Detektion qualitativer Veränderungen der Struktur der mikrobiellen
Gemeinschaft in der Fermenterflüssigkeit bearbeitet. In der vorliegenden Arbeit
wurden mit dieser Methode die Domänen der Bacteria und Archaea zu Beginn und
am Ende der Versuche untersucht.
13
2 Material und Methoden
Im Folgenden werden die angewandten Methoden und verwendeten Materialien
beschrieben. Genaue Auflistungen der verwendeten Lösungen und Chemikalien
sowie deren Bezugsquellen befinden sich im Anhang (Tabellen 8.1 und 8.2).
2.1 Pflanzenmaterial
Die Maispflanzen (Zea mays L., cv. Romario) wurden im Zuge eines
Forschungsprojekts des Instituts für Biodiversität des Johann Heinrich von Thünen-
Instituts in Braunschweig angebaut. Die Fragestellung der Studie lautete, ob
Leistungsparameter der Maispflanzen von einer erhöhten [CO2] sowie von
Trockenstress beeinflusst werden. Das für die vorliegende Arbeit untersuchte
Substrat stammt aus der finalen Ernte im September 2008. Zur Bearbeitung der oben
genannten Fragestellung wurde die FACE-Methode eingesetzt. Dieser
Versuchsaufbau wurde bereits in einer Untersuchung zum Einfluss einer erhöhten
[CO2] auf Weizen, eine typische C3-Pflanze, verwendet (WEIGEL u. MANDERSCHEID
2005) und für den Maisversuch modifiziert (Abbildung 2.1). Auf dem Versuchsfeld
wurden drei Abschnitte mit jeweils einem Durchmesser von 20 m mit je 32 vertikalen
Rohren für die CO2-Zufuhr ausgestattet. Die Länge der Rohre wurde dabei so
gewählt, dass die CO2-Versorgung der bis zu 3 m hohen Maispflanzen in jedem
Reifestadium gewährleistet war. Die CO2-Zielkonzentration lag bei 550 ppm CO2
während der Tageslichtstunden. Die Gaszuleitung wurde ab einem Blatt:Fläche-
Verhältnis von über 0,5:1 begonnen. Unterbrochen wurde die CO2-Zufuhr lediglich
bei Windstärken von über 5,5 m • s-1, um einen zu großen Gasverlust zu vermeiden.
Drei weitere Versuchsfelder wurden als CO2-Kontrolle abgesteckt.
Um den Einfluss von Trockenstress auf die Leistungsparameter der Maispflanzen
untersuchen zu können, wurden sowohl die Versuchsfelder mit CO2-Begasung als
auch die Kontrollfelder zusätzlich in bewässerte und Trockenstressabschnitte
14 Material und Methoden
unterteilt. Die Bewässerung der einen Hälfte wurde mithilfe von
Tropfbewässerungslinien gewährleistet. Im oberen 0,6 m Bodenhorizont wurde so
eine Bodenfeuchte von über 50% des maximalen für die Pflanzen verfügbaren
Bodenfeuchtegehalts erreicht.
Abbildung 2.1: Schema des FACE-Versuchsaufbaus mit den Versuchsabschnitten ohne CO2-Behandlung (linker, durchgezogener Kreis) und mit CO2-Anreicherung (rechter, gestrichelter Kreis) jeweils zur Hälfte mit und ohne Trockenstressinduktion durch die Überdachung.
PVC = Polyvinylchlorid
Zur Induktion von Trockenstress wurden über der anderen Hälfte der Versuchsfelder
Aluminiumrahmen installiert, die mit Polyvinylchlorid (PVC)-Planen bespannt werden
konnten (ERBS et al. 2010). Die Planen wurden bei wetterdienstlichen Vorhersagen
einer Niederschlagshöhe von über 10 mm am Tag aufgezogen. Mithilfe der
Dachkonstruktionen sollten Werte von 50% der für die Pflanzen maximal verfügbaren
Bodenfeuchte während der Sommermonate unterschritten werden. Die vier
Anbauvarianten der Maispflanzen sind in Tabelle 2.1 definiert.
Material und Methoden 15
Tabelle 2.1: Benennung der Anbauvarianten der Maispflanzen
Variante A 380 ppm CO2 (Kontrolle)
Variante B 550 ppm CO2
Variante C 380 ppm CO2 + Trockenstress
Variante D 550 ppm CO2 + Trockenstress
Die Ganzpflanzen wurden nach der finalen Ernte, der Abtrennung des Wurzelwerks
und grober Zerkleinerung bei -20 °C gelagert. Die Gefriertrocknung der Proben
wurde im Institut für Tierernährung des Friedrich Loeffler Instituts in Braunschweig
durchgeführt.
Repräsentative Proben der vier Maisvarianten wurden auf ihren Gehalt an
Rohnährstoffen und die Zusammensetzung der Faserfraktion untersucht. Die
Analysen wurden im Institut für Tierernährung des Friedrich Loeffler Instituts in
Braunschweig und im Futtermittelinstitut der LUFA Nord-West in Oldenburg
durchgeführt. Bestimmt wurden die Gehalte an Trockenmasse (TS) an der
ursprünglichen Substanz (uS) sowie die Anteile an Rohasche (Ra), oS, Rp, Rohfett
(Rfe), Rohfaser (Rfa), stickstoff-freien Extraktionsstoffen (NfE), neutralen
Detergentien-Fasern (NDF), sauren Detergentien-Fasern (ADF) und saurem
Detergentien-Lignin (ADL) (NAUMANN u. BASSLER 1997).
16 Material und Methoden
2.2 Rumen-Simulationstechnik
Um den Einfluss der Maisvarianten auf die ruminalen Fermentationsparameter und
die Zusammensetzung der ruminalen Mikroflora zu untersuchen, wurde die Rumen-
Simulationstechnik (RUSITEC) eingesetzt. Diese semi-kontinuierliche In-vitro-
Inkubationsmethode wurde von CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE (1977) zur
Untersuchung von Stoffwechselprozessen der ruminalen mikrobiellen Gemeinschaft
entwickelt.
Der Pansen als Gärkammer wurde bei dieser Methode durch sechs gasdichte
Fermenter (A; Plexiglas®, Röhm GmbH, D-64293 Darmstadt) ersetzt (Abbildung 2.2).
Von einem Spendertier (ausgewachsene Hinterwälder Kuh, trockenstehend) wurde
Panseninhalt entnommen, der durch Filtration durch eine Doppellage Gaze (Gazin®,
80 cm • 5 m, Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, D-56579
Rengsdorf) in eine flüssige und eine feste Phase (Partikel) aufgetrennt wurde. 80 g
der Pansenpartikel wurden in Nylonbeutel (Porengröße 150 μm, 16 cm • 7 cm,
Linker KG, D-34127 Kassel) eingewogen und in das an Deckel und Boden perforierte
Innengefäß (B) eingesetzt, um die partikelassoziierten Mikroorganismen in das In-
vitro-System zu inokulieren. Zusätzlich enthielt das Innengefäß einen Nylonbeutel mit
10 g TS des zu untersuchenden Substrats. Der Fermenter wurde mit circa 700 ml
flüssiger Pansenphase befüllt, mit der die flüssigkeitsassoziierten Mikroorganismen
dem System zugeführt wurden. Dieser Aufbau erlaubte die Darstellung der ersten
drei ruminalen Kompartimente. Das erste ruminale Kompartiment umfasste die
flüssige Phase im Fermenter. Dem zweiten Kompartiment konnte die flüssige Phase
im Innengefäß zugeordnet werden, während die Flüssigkeit in den Nylonbeuteln und
die Partikeloberfläche das dritte Kompartiment simulierten. Lediglich das vierte
Kompartiment in Pansenwandnähe konnte nicht dargestellt werden, da im
Versuchsaufbau eine Struktur zur Simulation der Resorptions- und
Sekretionsvorgänge fehlte.
Die Fermenter wurden zur Nachstellung der in vivo vorherrschenden
Körpertemperatur während der Dauer des Versuchs in einem Wasserbad (C)
Material und Methoden 17
belassen, das mithilfe eines Thermostats (D; Thermomixer®, B.Braun Melsungen AG,
D-34209 Melsungen) auf konstant 39 °C temperiert wurde.
Abbildung 2.2: 1 RUSITEC-Anlage 2 Vergrößerung eines eingebauten Fermenters (A) mit Innengefäß (B)
Die für die ruminale Verdauung wichtige Pufferfunktion des Speichels wurde durch
die kontinuierliche Zufuhr eines artifiziellen Speichels über eine Öffnung am Boden
des Fermenters ersetzt. Der täglich frisch angesetzte Puffer (modifiziert nach
MCDOUGALL (1948); Tabelle 2.2) wurde aus einem Puffergefäß (E) den Fermentern
über Tygonschläuche (F; 4,0 mm • 7,2 mm, omnilab GmbH & Co. KG, D-30989
Gehrden) mithilfe einer Mehrkanalpumpe (G; Typ B1, Ole Dich, Hvidovre, Dänemark)
zugeführt. Das tägliche Fördervolumen betrug dabei ca. 750 ml pro Tag (OEZTUERK
et al. 2005; KOCH et al. 2006; BECKER 2012). Der entstehende
Flüssigkeitsüberschuss (Überlauf) mit den Fermentationsprodukten wurde in einem
Überlaufgefäß (H; 1000 ml Erlenmeyerkolben) über 24 h gesammelt. Die Verbindung
zwischen Fermenter und Überlaufgefäß wurde über luftdichte Butylschläuche (I;
8,0 mm • 12,0 mm, YMC Europe GmbH, D-46539 Dinslaken) hergestellt. Um die
Fermentationsvorgänge im Überlauf zu stoppen, wurden die Überlaufgefäße auf Eis
in Styroporbehältern (J) gelagert. Das produzierte Fermentationsgasgemisch
18 Material und Methoden
gelangte über einen weiteren Butylschlauch von den Überlaufgefäßen in
angeschlossene Gassammelbeutel (K; Plastigas, Linde AG, D-80331 München), wo
es über 24 h gesammelt wurde.
Tabelle 2.2: Zusammensetzung des als künstlicher Speichel eingesetzten Puffers; modifiziert nach MCDOUGALL (1948)
Chemikalien mmol • l-1
NaCl 28,00
KCl 7,69
CaCl2 • 2 H2O 0,22
MgCl2 • 6 H2O 0,63
1 n HCl [ml] 0,50
NaH2PO4 • H2O 10,00
Na2HPO4 • 12 H2O 10,00
NH4Cl 5,00
NaHCO3 97,90
pH-Wert 7,4
Osmolarität [mosm • l-1] 304
Um die Pansenmotorik zu simulieren, wurde das Innengefäß über einen
Führungsstab mit einer horizontalen, von einem Elektromotor (L) auf und ab
bewegten Querstrebe verbunden. Durch diese Konstruktion wurden sowohl eine
regelmäßige Durchmischung (sechs Zyklen pro Minute) der flüssigen Phase als auch
eine gründliche Durchspülung der Nylonbeutel gewährleistet. Da das Wiederkäuen
nicht simuliert werden kann, wurde das zu untersuchende Substrat vor der Einwaage
in die Nylonbeutel manuell auf eine Partikellänge von ca. 10-15 mm zerkleinert.
Bei Vergleich der Ergebnisse aus RUSITEC-Versuchen mit Daten aus In-vivo-
Studien sollte beachtet werden, dass bei Inkubation des gleichen Substrats mittels
der RUSITEC-Methode niedrigere Acetat:Propionat-Verhältnisse, höhere NH3-N-
Konzentrationen, gesteigerte Verdaulichkeiten der Trockenmasse sowie niedrigere
Protozoa-Konzentrationen erreicht werden (MARTINEZ et al. 2010a). Als mögliche
Ursachen für die Unterschiede zwischen der Fermentation in vivo und in vitro werden
fehlende Absorptions- und Sekretionsvorgänge im RUSITEC-Aufbau (MANSFIELD et
al. 1995; GIZZI et al. 1998; MARTINEZ et al. 2010a) sowie die aufgrund des täglichen
Material und Methoden 19
Betriebs der Anlage wiederholt auftretende O2-Zufuhr in das System genannt (GIZZI
et al. 1998; MARTINEZ et al. 2010b).
Ein großer Vorteil der Rumen-Simulationstechnik ist es, dass durch einheitlichen
Betrieb der Fermenter die individuellen Einflüsse des Versuchstiers als
Varianzquellen ausgeschlossen werden können. Neben dem Habitus eines Tieres
können auch Futteraufnahme, Speichelproduktion und die ruminale Motilität einen
Effekt auf die ruminale Fermentation ausüben. Bei der Untersuchung strikt ruminaler
Abläufe wären bei In-vivo-Versuchen Tiere nötig, die sowohl mit einer Kanüle im
Pansen als auch im Dünndarm ausgestattet wurden. Auf die aufwändige Haltung und
Pflege solcher Versuchstiere kann bei Einsatz der RUSITEC-Methode verzichtet
werden. Zusätzlich unterschreitet der Substrataufwand in vitro das benötigte
Volumen eines Fütterungsversuchs deutlich. Die Bearbeitung einer Fragestellung
kann mit der RUSITEC-Methode unter kontrollierten Bedingungen erfolgen, wobei
mehrere Ansätze pro Behandlung betrieben werden können. RUSITEC-Versuche
und deren Ergebnisse sind darüber hinaus gut reproduzierbar (BECKER 2012). Des
Weiteren wurde festgestellt, dass die Ergebnisse einer Analyse der
Fermentationsmuster verschiedener Rationen mit der RUSITEC-Methode
entsprechende Daten lieferten wie ein vergleichend durchgeführter In-vivo-Versuch
(MARTINEZ et al. 2010a; MARTINEZ et al. 2010b).
20 Material und Methoden
2.3 Versuchsdesign
Für die Bearbeitung der Fragestellungen wurden in dieser Studie zwei Versuche
durchgeführt. In Versuch 1 (V1) enthielten jeweils drei Fermenter eine der vier
Aufwuchsvarianten der Maispflanzen (Tabelle 2.1). Die Verteilung der Varianten in
den Fermentern ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Im zweiten Versuch (V2) wurden die
beiden bewässerten Maisvarianten (A = 380 ppm CO2 und B = 550 ppm CO2)
eingesetzt. V1 wurde über eine Äquilibrierungsphase von sechs Tagen mit einer
anschließenden achttägigen Versuchsphase durchgeführt. Im Gegensatz dazu
wurden in V2 speziell die Veränderungen in den Gehalten der SCFA und deren
molaren Anteilen während der Äquilibrierungsphase untersucht.
Abbildung 2.3: Verteilung der Substrate und Anordnung der Fermenter für V1 und V2
2.3.1 Versuchsvorbereitungen
Vor Beginn beider Versuche wurden Fermenter und Innengefäße sowie alle
Butylschläuche in einer 3,7%igen Formaldehyd-Lösung (Tabelle 8.1) zur
Desinfektion für 24 h gelagert. Nach gründlicher Spülung mit destilliertem Wasser
(Aqua dest.) wurden die Bauteile in einem Trockenschrank (Modell 600, Memmert
Material und Methoden 21
GmbH & Co. KG, D-91107 Schwabach) über 24 h bei 60 °C getrocknet. Die
Dichtungsringe der Führungsstäbe wurden mit Schmiermittel (Glisseal® N, Borer
Chemie AG, Zuchwil, Schweiz) versetzt. Die Tygonschläuche zur Pufferversorgung
wurden vor jedem Versuch erneuert, um eine Verfälschung durch Ablagerungen
vorheriger Versuchsdurchgänge zu verhindern. Die Nylonbeutel wurden vor
Gebrauch autoklaviert (Varioklav, Dampfsterilisator Typ 500, H+P Labortechink
GmbH & Co. KG, D-85764 Oberschleißheim) und im Anschluss im Trockenschrank
für 24 h bei 60 °C getrocknet. Jeweils 10 g TS der Versuchssubstrate wurden pro
Nylonbeutel eingewogen, woraufhin die Nylonbeutel mit Kabelbindern verschlossen
und bis zur Verwendung im Exsikkator gelagert wurden. 12 h vor Versuchsbeginn
wurden die Fermenter in die Wasserbäder eingesetzt und mit Sicherungsstreben
arretiert, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Die Wasserbäder wurden mit Aqua
dest. gefüllt und auf 39 °C temperiert. Der Puffer (Tabelle 8.1) wurde frisch angesetzt
und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.
2.3.2 Versuchsbeginn
Nach Entnahme und Auftrennung des Panseninhalts wurden Nativproben der in
einem Wasserbad warm gehaltenen flüssigen Pansenphase zur Bestimmung der
Anzahl der Protozoa entnommen. Für jeden Fermenter wurde ein Nylonbeutel mit
80 g festem Panseninhalt befüllt und in das Innengefäß überführt. Diese Beutel
dienten zur Inokulation der partikelassoziierten ruminalen Mikroflora in das In-vitro-
System. Nach Verschluss der Innengefäße und deren Einsatz in die Fermenter
wurden letztere mit 700 ml temperiertem Pansensaft aufgefüllt. Die Fermenter
wurden nun luftdicht verschlossen, in das Wasserbad eingesetzt und dort fixiert. Im
Anschluss wurden die Tygon- und Butylschläuche angeschlossen, das Puffergefäß
gefüllt sowie Mehrkanalpumpe und Elektromotor angeschaltet. Letztlich wurde durch
Begasung der Überlaufgefäße mit Stickstoff der noch im System vorhandene O2
verdrängt.
22 Material und Methoden
2.3.3 Probenentnahme V1
Der Probenentnahmeplan ist in Tabelle 2.3 aufgeführt. Während der
Äquilibrierungsphase wurden alle Fermenter täglich aus der Anlage ausgebaut und in
einem separaten Wasserbad geöffnet. Nach Messung von pH-Wert und
Redoxpotential in der Fermenterflüssigkeit wurde an Tag 1 der Nylonbeutel mit dem
festen Panseninhalt entnommen und durch einen neuen Substratbeutel ersetzt. Der
Beutel mit Pansenpartikeln wurde 2 • 2 min in je 40 ml warmer Pufferlösung
ausgequetscht. Dieser Vorgang diente zu Ablösung und Ausschwemmung der
Mikroorganismen aus der unmittelbaren Umgebung und von der Oberfläche der
Partikel. Die entstandene Lösung wurde in das Fermentationsgefäß überführt. Der
übrige Inhalt des Nylonbeutels wurde verworfen. Vor dem erneuten Einbau des
Fermenters in die Anlage wurde das Überlaufvolumen im zugehörigen Überlaufgefäß
mithilfe eines Messzylinders bestimmt, der Inhalt anschließend verworfen. Der
angeschlossene Gassammelbeutel wurde sorgfältig ausgedrückt. Zum Abschluss
wurden die Überlaufgefäße mit Stickstoff begast.
In den folgenden Tagen wurde dieser Ablauf wiederholt, wobei jeweils der
Nylonbeutel entnommen und in warmer Pufferlösung ausgequetscht wurde, der sich
bereits 48 h im System befand. An Tag 1 wurde jeweils zusätzlich 1 ml der
Fermenterflüssigkeit zur Auszählung der Protozoa entnommen. Die Probe wurde
sofort mit 1 ml Methylgrünlösung (Tabelle 8.1) in einem lichtundurchlässigen
Eppendorfgefäß vermischt und bis zur Untersuchung dunkel gelagert. Außerdem
wurden vor Austausch der Substratbeutel 30 ml der Fermenterflüssigkeit zur Analyse
der mikrobiellen Gemeinschaft (des ersten Kompartiments) entnommen und in 50 ml
Weithalsflaschen auf Eis gelagert. Die Aufbereitung der Proben erfolgte stets am
gleichen Tag. Die Probenentnahme für die Auszählung der Protozoa wurde an Tag 7
wiederholt. Am letzten Versuchstag (Tag 14) wurden ebenfalls Proben der
Fermenterflüssigkeit zur Analyse der Protozoa-Konzentration und zur Untersuchung
der mikrobiellen Gemeinschaft entnommen.
Material und Methoden 23
Tabelle 2.3: Probenentnahmeplan V1
Parameter Äquilibrierungsphase Versuchsphase
Tage nativ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH x x x x x x x x x x x x x x
Redoxpotential x x x x x x x x x x x x x x
Überlauf x x x x x x x x x x x x x x
SCFA x x x x x x x x
NH3-N x x x x x x x x
Verdaulichkeit x x x x x x x x
Protozoa x x x x
Mikroorganismen x x
Fermentationsgas x x x x x x x x
Während der Versuchsphase wurden täglich pH-Werte und Redoxpotentiale der
Fermenterflüssigkeit gemessen. Der Beutelwechsel erfolgte entsprechend dem
Ablauf während der Äquilibrierungsphase. Der Beutelinhalt wurde allerdings nicht
verworfen, sondern zur Analyse der Verdaulichkeit der oS bei -20 °C eingefroren.
Nach Messung des Überlaufvolumens wurden Proben der Überlaufflüssigkeit zur
Konzentrationsbestimmung von SCFA (7 ml) und NH3-N (3 ml) entnommen, in
Glasfläschchen mit Gewindeverschluss abgefüllt und bei -20 °C gelagert. Die
Gassammelbeutel wurden vor Öffnung des Systems durch Ausbau der Fermenter
gasdicht verschlossen und von den Überlaufgefäßen getrennt. Die Bestimmung des
Volumens des in 24 h produzierten Fermentationsgasgemisches erfolgte unter
Verwendung eines Trommelgaszählers (Ritter Apparatebau GmbH & Co. KG, D-
44982 Bochum). Zusätzlich wurden mit Monovetten zur Blutabnahme (Venosafe®,
Typ VF-109 SP, Terumo, D-65760 Eschborn) und Kanülen (Sterican, Größe: 12,
0,7 mm • 30 mm, B.Braun Melsungen AG, D-34209 Melsungen) Proben direkt aus
den Gassammelbeuteln zur Analyse der Zusammensetzung des
Fermentationsgasgemisches entnommen. Temperatur und Luftdruck der Umgebung
wurden täglich aufgezeichnet, um die Ergebnisse der Gasuntersuchung im
Anschluss normieren zu können.
24 Material und Methoden
2.3.4 Probenentnahme V2
Die Vorbereitungen und Inokulation erfolgten in V2 entsprechend der Beschreibung
von V1. Der Probenentnahmeplan ist in Tabelle 2.4 abgebildet. In V2 wurden wie in
V1 täglich pH-Werte und Redoxpotentiale bestimmt und die Futterbeutel
ausgetauscht. Zusätzlich wurden täglich das Überlaufvolumen bestimmt und Proben
zur Analyse der SCFA-Produktionsraten und deren molare Anteile der SCFA
entnommen. An den Versuchstagen 1 und 7 erfolgte ebenfalls eine Probenentnahme
der Fermenterflüssigkeit zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft.
Tabelle 2.4: Probenentnahmeplan V2
Parameter Äquilibrierungsphase
Tage 1 2 3 4 5 6 7
pH x x x x x x x
Redoxpotential x x x x x x x
Überlauf x x x x x x x
SCFA x x x x x x x
Mikroorganismen x x
Material und Methoden 25
2.3.5 Analysen
2.3.5.1 pH-Werte
Die Messung der pH-Werte der Fermenterflüssigkeit erfolgte täglich, stets direkt nach
Eröffnung des Fermenters mithilfe eines pH-Meters (Digital-pH-Meter 646, Knick
GmbH & Co. KG, D-14163 Berlin) und einer pH-Elektrode (InLab® Routine, Mettler-
Toledo GmbH, D-35353 Gießen). Jeweils vor Beginn der Äquilibrierungs- und
Versuchsphase wurde das pH-Meter mit standardisierter Eichlösung (pH-
Pufferlösungen, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) geeicht.
2.3.5.2 Redoxpotentiale
Das Redoxpotential der flüssigen Phase im Fermenter wurde ebenfalls täglich
ermittelt. Die Messung wurde über 60 s mit einem pH-Meter (Digital-pH-Meter 646,
Knick GmbH & Co. KG, D-14163 Berlin) und einer Redox-Elektrode (InLab® Redox
Pro, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) durchgeführt.
2.3.5.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile
Die Konzentrationen von Acetat, Propionat, Butyrat und Isovalerat wurden
gaschromatographisch (Gaschromatograph 5890 Series II, Hewlett Packard, D-
71034 Böblingen) in der Überlaufflüssigkeit jedes Fermenters ermittelt. Die während
der Versuche entnommenen Proben (siehe Tabellen 2.3 und 2.4) wurden zunächst
bei 4 °C aufgetaut und anschließend für 20 min bei 4 °C mit 40.000 g zentrifugiert
(Rotor SM24, Sorvall® RC-5C, Instruments Du Pont Company, Wilmington, USA). Ein
ml des Überstands wurde mit 0,1 ml 98%iger Ameisensäure (Tabelle 8.2) versetzt.
Die angesäuerten Proben wurden nach einer 10 minütigen Inkubationszeit bei
4.000 g für 10 min erneut zentrifugiert (Minifuge 2, Heraeus-Christ, D-38835
Osterode) und anschließend 1 ml des Überstand in Rollrand-Ampullen (Agilent
26 Material und Methoden
Technologies GmbH & Co. KG, D-76337 Waldbronn) überführt. Die Ampullen
wurden im Anschluss luftdicht verschlossen (VON ENGELHARDT u. SALLMANN 1972).
Die für die Gaschromatographie verwendete Trennsäule (Länge 1,8 m;
Innendurchmesser 2 mm) wurde mit Chromosorb WAW (mesh 80/100) mit 20%
Neopentylglycolsuccinat (NPGS) und 2% ortho-Phosphorsäure (Analyt-MTC
Messtechnik GmbH, D-79379 Müllheim) von Hand gestopft. Die Messparameter der
gaschromatographischen Analyse sind in Tabelle 2.5 zusammengefasst. Nach jeder
zehnten Probe wurde ein externer Standard (Merck KGaA, D-64271 Darmstadt)
vermessen. Die Konzentration der SCFA in mmol pro Liter produzierter Überlauf
konnte so berechnet werden. Die Produktionsraten der gesamten SCFA sowie für
jede SCFA separat (mmol • Tag-1) wurden durch Miteinbeziehung des in 24 h
produzierten Überlaufvolumens (ml • Tag-1) errechnet. Abschließend wurden die
molaren Anteile der SCFA bestimmt.
Tabelle 2.5: Messparameter der gaschromatographischen Analyse der SCFA
Konditionierung 240 °C für 24 h
Ofentemperatur 130 °C
Injektionsblock 225 °C
Flammenionisationsdetektor 250 °C
Trägergas (Stickstoff) 25 ml • min-1
Wasserstoff 30 ml • min-1
synthetische Luft 420 ml • min-1
Injektionsvolumen 1 μl
Wiederholungen zwei Einspritzungen
Analysenlaufzeit ca. 9 min
2.3.5.4 Fermentationsgase
Die Untersuchung der Fermentationsgasproben wurde am Institut für
Siedlungswasserwirtschaft und Abfalltechnik (ISAH) der Leibniz Universität Hannover
durchgeführt und erfolgte gaschromatographisch (GC 2014, Shimadzu Europa
GmbH, D-47269 Duisburg). Es wurden ein Wärmeleitfähigkeitsdetektor (TCD) und
eine Glassäule (Länge; 2,1 m; Innendurchmesser 3 mm, Außendurchmesser 5 mm),
Material und Methoden 27
die mit Porapak Q (Sigma-Aldrich GmbH, 89555 Steinheim, D) gefüllt war,
verwendet. Als Trägergas diente Helium. Die Produktion von CO2 und CH4
[ml • Tag-1] wurde mithilfe ihrer prozentualen Anteile am Volumen des über 24 h
produzierten Fermentationsgasgemisches berechnet und eine Korrektur der Werte
auf normalisierte Bedingungen (0 °C und 1013 hPa) vorgenommen.
2.3.5.5 NH3-N-Konzentrationen
Die Konzentration von NH3-N [mmol • Tag-1] in der über 24 h gesammelten
Überlaufflüssigkeit wurde photometrisch mithilfe der Harnstoff/Ammoniak-Test-
Kombination (Roche Diagnostics, D-68305 Mannheim) bestimmt. Bei diesem Test
bilden Ammoniumionen mit dem zugesetzten Hypochlorit bei Anwesenheit von
Phenol einen blauen Farbstoff (Berthelot-Reaktion). Die Absorption dieses
Farbkomplexes wurde im Photometer (DU 640, Beckman Coulter GmbH, D-47807
Krefeld) bei einer Wellenlänge von 546 nm gemessen und ist proportional zu dem in
der Probe enthaltenen NH3-N.
2.3.5.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz
Die während der Versuchsphase entnommenen und eingefrorenen Beutel wurden in
einem Trockenschrank (Modell 600, Memmert GmbH & Co. KG, D-91107
Schwabach) bei 65 °C bis zur Gewichtskonstanz (ca. 48 Stunden) getrocknet. Im
Anschluss wurde eine repräsentative Probe des fermentierten Substrats in einen
Tiegel eingewogen und in einem Muffelofen (Thermo Scientific Heraeus M110,
Heraeus instruments GmbH, D-63450 Hanau) bei 600 °C über 24 Stunden verascht.
Zusätzlich wurden pro Variante je 10 g TS des unbehandelten Substrats in zwei
Nylonbeutel eingewogen und entsprechend der fermentierten Proben behandelt.
Dieses native Substrat diente als Standard. Durch Abzug des Gewichts der Ra von
der TS konnte der Anteil der oS berechnet werden. Anschließend wurde der Anteil
an verdaulicher oS als Differenz zwischen den Nativproben der jeweiligen Variante
und den fermentierten Proben bestimmt.
28 Material und Methoden
2.3.5.7 Anzahl der Protozoa
Die Quantifizierung der Protozoa in den mit Methylgrün (Tabelle 8.1) fixierten Proben
(1:2) erfolgte nach Herstellung von Verdünnungen je nach Probenentnahmetag
(Tabelle 2.6). Die verdünnten Proben wurden in die drei Kammern (jeweils 2,0 cm •
1,8 cm • 0,15 cm) einer McMaster-Zählkammer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, D-
97922 Lauda Königshofen) eingegeben. Mithilfe eines Lichtmikroskops (BH-2,
Olympus Europa Holding GmbH, D-20097 Hamburg) mit einem Okular mit
Netzmikrometer (Seitenlänge des Quadrats: 0,05 cm) wurde bei einer 160-fachen
Vergrößerung in 40 Netzmikrometer-Quadraten die Anzahl der Protozoa ausgezählt.
Die Quantifizierung erfolgte damit in einem Probenvolumen von 0,015 ml (40 • 0,05
cm • 0,05 cm • 0,15 cm). Unter Anwendung der angegebenen Formel wurde die
Anzahl der Protozoa pro ml flüssiger Pansenphase bzw. pro ml Fermenterflüssigkeit
kalkuliert.
Umrechnung zur Quantifizierung der Protozoa-Konzentration pro ml Probe
Protozoa = Protozoa40 • 1
• V-Faktor [n • ml-1] 0,015
Protozoa40
= Anzahl der in 40 Quadraten bestimmten Protozoa
0,015 = Volumen der Zählkammer
V-Faktor = Verdünnungsfaktor, siehe in Tabelle 2.4
Tabelle 2.6: Verdünnungsfaktoren zur Bestimmung der Protozoa-Konzentration
Verdünnung
Nativprobe 1:28
Probenentnahmetag 1 1:14
Probenentnahmetag 7 1:6
Probenentnahmetag 14 1:4
Material und Methoden 29
2.4 Statistische Auswertung
Die graphische Darstellung der Daten erfolgte in Form von Säulendiagrammen der
Mittelwerte (MW) der Messergebnisse der drei gleich behandelten Fermenter mit
Angabe des Standardfehlers des MWs (SEM), um einen Überblick über die Lage und
Streuung zu erhalten. Die statistische Auswertung der biochemischen Parameter
erfolgte mit IBM® SPSS® Statistics Version 19 für Windows®. Zunächst wurde die
Normalverteilung der erhobenen Daten mithilfe des Kolmogorow-Smirnow-Tests
überprüft. Anschließend wurden die Ergebnisse der Versuche unter Anwendung
eines allgemeinen linearen Modells mit Messwiederholung ausgewertet. Für V1
wurden der Einfluss der Zeit als Innersubjektfaktor sowie die Wirkung von
Trockenstress und CO2-Konzentration als Zwischensubjektfaktoren auf die
untersuchten Parameter analysiert. Die Ergebnisse von V2 wurden auf den Einfluss
von Zeit (Innersubjektfaktor) und CO2-Konzentration (Zwischensubjektfaktor)
getestet. Aufgrund der verletzten Sphärizität der Datensätze (Mauchly-Test) wurde
eine Korrektur der Freiheitsgrade (Methoden „Untergrenze“ oder „Huynh-Feldt“)
vorgenommen. Um signifikante Einflüsse der Zwischensubjektfaktoren genauer
definieren zu können, wurde ein Fisher‘s Least Significant Difference (LSD) Test zum
Vergleich der MW der einzelnen Varianten durchgeführt. Unterschiede zwischen den
verschiedenen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p≤0,05
wurden als signifikant bezeichnet (* = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001).
30 Material und Methoden
2.5 Single-strand-conformation-polymorphism-Analyse
Die Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-Analyse wurde entwickelt, um
die Zusammensetzung mikrobieller Populationen ohne aufwändige
Kultivierungsschritte qualitativ bewerten und vergleichen zu können. Die Methode
wurde ursprünglich in der Humanmedizin zur Mutationsdiagnostik eingesetzt (ORITA
et al. 1989). Dabei wurden genetische finger prints erstellt, die das Aufspüren von
Punktmutationen erlaubten. Die SSCP-Analyse wurde mittlerweile für die qualitative
Untersuchung der Zusammensetzung mikrobiologischer Populationen etabliert
(SCHMALENBERGER u. TEBBE 2003; DOHRMANN u. TEBBE 2004; BOGUHN et al. 2008).
Nach Isolierung der genomischen DNA (gDNA) werden konservierte Abschnitte der
16S rRNA-Gene spezifischer Gruppen der Mikroflora (in dieser Studie Bacteria und
Archaea) mittels der polymerase chain reaction (PCR; Polymerase-Kettenreaktion)
amplifiziert. Im Anschluss an die der Domäne spezifischen Amplifizierung wird das
PCR-Produkt als Matrize für eine weitere PCR genutzt. Das Ziel dieser nested PCR
ist es, die Spezifität der PCR-Produkte zu erhöhen sowie den enzymatischen Verdau
der Doppelstrang-DNA (dsDNA) zur Einzelstrang-DNA (ssDNA) vorzubereiten. Der
5’-Strang der dsDNA wird dafür phosphoryliert. Die im nächsten Schritt zugefügte
λ-Exonuklease bindet an den phosphorylierten DNA-Strang und baut diesen ab. Das
Produkt sind ssDNA-Fragmente einer Länge von 408 Basenpaaren (bp), die
aufgrund der spezifischen Primärstruktur individuelle Sekundärstrukturen ausbilden
(DOHRMANN u. TEBBE 2004). Aufgrund der unterschiedlichen Sekundärstrukturen
(Konformationen) der ssDNA-Stücke können diese in einem nicht-denaturierenden
Gel elektrophoretisch aufgetrennt werden. Das Ergebnis sind sogenannte
SSCP-Profile, die im Anschluss mit einer Silberfärbung sichtbar gemacht werden.
Nach Digitalisierung der fixierten SSCP-Profile ist eine computergestützte
Auswertung der Bandenmuster möglich.
Es ist zu beachten, dass die SSCP-Analyse eine rein qualitative Untersuchungs-
methode darstellt. Veränderungen in den Konzentrationen einzelner Spezies können
nicht erfasst werden (DOHRMANN u. TEBBE 2004). Zusätzlich ist es möglich, dass
Material und Methoden 31
mehrere Spezies ähnliche PCR-Produkte aufweisen oder deren ssDNA-Abschnitte
ähnliche Konformationen annehmen und damit in der SSCP-Analyse eine einzige
Bande bilden (SCHWIEGER u. TEBBE 1998; SCHMALENBERGER u. TEBBE 2003;
DOHRMANN u. TEBBE 2004; WITZIG et al. 2010). Umgekehrt kann die ssDNA einer
Spezies mehrere Konformationen zeigen und so für mehrere Banden verantwortlich
sein (DOHRMANN u. TEBBE 2004). In der vorliegenden Arbeit wurden Proben der
flüssigen Phase jedes Fermenters an den Tagen 1 und 14 von V1 sowie an den
Tagen 1 und 7 von V2 entnommen. Die Proben von V1 wurden auf den Einfluss der
Maisvarianten mit den Faktoren [CO2] und Trockenstress auf die mikrobielle
Gemeinschaft gesondert nach Entnahmetagen untersucht. Da in V2 nur zwei
Maisvarianten mit dem Faktor [CO2] verglichen wurden, konnte zusätzlich der Effekt
des Entnahmetags analysiert werden.
2.5.1 Aufbereitung der Proben
Die Proben der Fermenterflüssigkeit wurden für 20 min bei 4 °C und 27.255 g
zentrifugiert (Sorvall®, RC-5C, Rotor SS34, Instruments Du Pont Company,
Wilmington, USA). Da Archaea im Pansen eine enge räumliche Assoziation mit
Protozoa eingehen (VOGELS u. STUMM 1980), wurde von der üblichen
Vorgehensweise der Differentialzentrifugation abgesehen, um zu verhindern, dass
ein Großteil der Archaea-Fraktion bereits bei der Zentrifugation mit dem Pellet
verworfen wird (BECKER 2012). Die Pellets wurden an Tag 1 mit 5 ml, an den Tagen
7 und 14 mit 3,75 ml 0,9%iger NaCl-Lösung (Tabelle 8.1) resuspendiert. Zur
Konservierung wurde die Lösung in flüssigen Stickstoff getropft und die Proben bei
-80 °C gelagert.
2.5.2 Isolierung der genomischen DNA der ruminalen Mikroflora
Die Isolierung der genomischen DNA (gDNA) erfolgte aus 500 μl der schonend
aufgetauten Kryoproben (siehe Kapitel 2.5.1). Im Anschluss an einen
Zentrifugationsschritt (4 °C, 13.000 g, 5 min in Megafuge 1.0 R, Heraeus Instruments
32 Material und Methoden
GmbH, D-63450 Hanau) wurde das Pellet (15-45 mg) in 600 μl TEN (Tris-EDTA-
NaCl; Tabelle 8.2) resuspendiert. Es folgte der mechanische Aufschluss des
Probenmaterials unter Verwendung der bead beating Methode. In einem Ribolyser
Cell Disrupter (Hybaid GmbH, D-69111 Heidelberg) wurden die Proben unter Zusatz
von 2,5 g Ziconia/Silica-Kügelchen (0,1 mm Durchmesser, Roth GmbH & Co. KG, D-
76185 Karlsruhe) in zwei Durchgängen aufgeschlossen (6,0 m • s-1 und 4,5 m • s-1,
für je 40 s). Die Silica-Kügelchen wurden im Anschluss bei 4 °C und 13.000 g in 15
min abzentrifugiert. Es folgten mehrere Inkubationsschritte zur Spaltung von
1,4-glykosidischen Bindungen, von RNA-Stücken und Proteinen (Tabelle 2.7).
Tabelle 2.7: Inkubationsschritte während der DNA-Isolierung
Substanzen Volumen Dauer Temperatur
100 mg • ml-1 Lysozym-Lösung 50 μl 30 min 37 °C
RNase A 10 μl
Proteinase K-Lösung (20 mg • ml-1) 10 μl 1 h 37 °C
20%iger SDS-Lösung (50 °C) 15 μl
CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Lösung (50 °C) 50 μl 10 min 65 °C
4 M NaCl-Lösung 125 μl
Anschließend wurden die Proben durch Fällung von Proteinen aufgereinigt (Phenol-
Chloroform-Extraktion Tabelle 2.8). Das DNA-Pellet wurde nach Abpipettieren des
Überstandes bei Raumtemperatur getrocknet und abschließend in 15 μl TE-Puffer
(Tris-EDTA; Tabelle 8.1) resuspendiert.
Tabelle 2.8: Phenol-Chloroform-Extraktion
Substanzen Volumen Z Aufreinigungsschritte
Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) 780 μl 5 min Proteinfällung: DNA in oberer, wässriger Phase; ausgefallene Proteine in Interphase
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1)
780 μl 10 min
Isopropanol (100%) 500 μl 30 min Fällung der DNA
Ethanol (80%) 950 μl 5 min Waschen des DNA-Pellets
Z = Zentrifugation; erfolgte mit 13.000 g bei 4 °C
Material und Methoden 33
2.5.3 Photometrische Quantifizierung der isolierten gDNA
Zur Quantifizierung der isolierten gDNA erfolgte eine photometrische Analyse. Zu
diesem Zweck wurde die gDNA-Lösung mit autoklaviertem Aqua dest. verdünnt
(1:72). Die Extinktion der Lösung wurde mithilfe einer Quarzküvette (minimales
Füllvolumen 70 μl, Hellma GmbH & Co. KG, D-79371 Müllheim) im Photometer
(Biophotometer 6131, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) bei einer Wellenlänge von
260 nm vermessen. Anhand der Ergebnisse der photometrischen Quantifizierung
wurden Verdünnungen der gDNA mit autoklaviertem Aqua dest. mit einer
Zielkonzentration von 25 ng • μl-1 gDNA angesetzt.
2.5.4 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der Größe der isolierten gDNA-Fragmente wurde im Anschluss an
die photometrische Quantifizierung eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt.
Die Beladung des 0,8%igen Agarose-Gels (Tabelle 8.1) erfolgte mit jeweils 3 μl der
hergestellten gDNA-Lösung, die mit 2 μl loading dye (dem Marker zugehörig; Tabelle
8.2) versetzt wurde, sowie jeweils 3 μl der beiden Marker (MassRulerTM DNA Ladder
Mix und λ-Hind III; Tabelle 8.2). Die Elektrophorese wurde für 70 min bei 80 mV
durchgeführt. Das Gel wurde im Anschluss mit einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt.
Die angefärbten Banden wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht (Biometra Ti 1,
Biometra GmbH, 37079 Göttingen, D) sichtbar gemacht und deren Emission
detektiert (BioDoc IITM).
2.5.5 Polymerase-Kettenreaktion
Mithilfe der PCR wurden spezifische Abschnitte der 16S rRNA-Gene durch Einsatz
definierter Primerpaare amplifiziert. Die eingesetzten Primer (Biomers.net GmbH D-
89077 Ulm) sind mit Sequenz, Position und Annealingtemperatur in Tabelle 2.9
aufgeführt (LANE 1991; STAHL u. AMANN 1991; WEISBURG et al. 1991; GROSSKOPF et
al. 1998; SCHWIEGER u. TEBBE 1998; BOGUHN et al. 2010).
34 Material und Methoden
Material und Methoden 35
Zunächst erfolgte die Domäne-spezifische PCR mit den Primern F27 und R1492
(Bacteria) bzw. A109f und A934b (Archaea). In doppelten Ansätzen wurde jeweils 1
μl der gDNA-Lösung (25 ng • μl-1) als Matrize oder aber autoklaviertes Aqua dest. als
Negativkontrolle eingesetzt.
Tabelle 2.10: Ansätze für die initiale Domäne-spezifische PCR und die nested PCR
Ansatz pro Probe Initiale PCR „nested“ PCR
Angaben in μl
autoklaviertes Aqua dest. 20,375 41,75
10x Puffer 2,5 5
dNTP 0,5 1
forward primer 0,25 0,5
revers primer 0,25 0,5
taq Polymerase 0,125 0,25
Template 25 ng • μl-1 1 1
Gesamtvolumen 25 50
Die Ansätze der Reaktionslösungen sind in Tabelle 2.10, die gewählten Programme
des verwendeten Thermocyclers (Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) in Tabelle 2.11
aufgelistet.
Tabelle 2.11: Programme der initialen Domäne-spezifischen PCR und der nested PCR
Phase
initiale PCR nested PCR
Temperatur [°C]
Dauer [min]
Temperatur
[°C] Dauer [min]
Aufheizen des Deckels 105 - 105 -
Initiale Denaturierung 95 15 95 15
Denaturierung 94 1 30
Zyklen
94 ¾ 25
Zyklen Annealing Tabelle 2.7 1 Tabelle 2.7 ¾
Elongation 72 1 72 1
Finale Elongation 72 5 72 5
Das Ergebnis des initialen PCR-Schritts wurde mithilfe eines 1%igen Agarose-Gels
(Tabelle 8.1) überprüft, wobei abweichend von Kapitel 2.5.4 der Gene RulerTM 50 bp
DNA Ladder als Marker mit zugehörigem loading dye (Tabelle 8.2) verwendet wurde.
36 Material und Methoden
Es erfolgte zudem eine photometrische Quantifizierung des PCR-Produktes (siehe
Kapitel 2.5.3).
Im weiteren Verlauf wurde eine zweite PCR (nested PCR) durchgeführt, bei der 1 μl
des ersten PCR-Produkts (25 ng • μl-1) als Template diente. Pro Probe wurde diese
PCR in einem Dreifachansatz (Zusammensetzung der Reaktionslösung Tabelle 2.10)
durchgeführt. Es wurde zusätzlich eine Negativkontrolle mit autoklaviertem Aqua
dest. angesetzt. Der reverse Primer (Tabelle 2.9) phosphorylierte im Zuge der PCR
den 5’-Strang in Vorbereitung des enzymatischen Verdaus der dsDNA zur ssDNA.
Die Bedingungen für die nested PCR sind in Tabelle 2.11 zusammengefasst. Die drei
Reaktionslösungen einer Probe wurden im Anschluss an die PCR zusammengeführt
und entsprechend dem Ablauf der ersten PCR in einem 1%igen Agarosegel
kontrolliert.
2.5.6 Aufreinigung und photometrische Quantifizierung der nested PCR-
Produkte
Das gesamte Produkt der nested PCR einer Probe (150 μl) wurde unter Verwendung
des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) nach dem
microcentrifuge protocol aufgereinigt. Nach Zugabe von 750 μl PB-Puffer (erfolgte in
zwei Schritten) wurden die Proben zentrifugiert und in 50 μl EB-Puffer eluiert. Die
anschließende photometrische Quantifizierung der aufgereinigten Proben erfolgte in
Einmal-Küvetten (UVette®, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg). In Vorbereitung des
Einzelstrangverdaus wurden anhand der Ergebnisse der photometrischen
Bestimmung Verdünnungen der Proben hergestellt (38 ng • μl-1 in 26 μl = ca. 1000
ng DNA).
2.5.7 Einzelstrangverdau und Aufreinigung
Für den Einzelstrangverdau wurde den aufgereinigten und verdünnten Proben eine
λ-Exonuklease (Tabelle 8.2) zugesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung
Material und Methoden 37
ist Tabelle 2.12 zu entnehmen. Während der Inkubationszeit von 45 min im
Wasserbad bei 37°C erfolgte der enzymatische Abbau des phosphorylierten
5‘-Strangs der dsDNA.
Tabelle 2.12: Ansatz der Reaktionslösung für den Einzelstrangverdau pro Probe
Reagenzien Volumen [μl]
autoklaviertes Aqua dest. 9,5
10x λ-Exonuklease-Puffer 4,0
λ-Exonuklease (5000 U • ml-1) 0,5
dsDNA 26
Gesamtvolumen 40
Die ssDNA wurde entsprechend dem microcentrifuge protocol unter Verwendung des
MinElute PCR Purification Kits (Quiagen GmbH, D-40724 Hilden) aufgereinigt.
Abschließend wurden die Proben 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und in 10 μl
EB-Puffer eluiert.
2.5.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Für die Elektrophorese der ssDNA wurden zwei 0,625%ige Polyacrylamid-Gele
(PAA-Gel; Tabelle 8.1) mit Hilfe von zwei Glasplatten und 0,75 mm Spacern
(Geldicke = 0,75 mm) hergestellt. Ein Gelsandwich setzte sich aus einer kleineren
Trägerplatte (20 cm • 20 cm), die mit Bind Silane Lösung (Tabelle 8.1) zur
Verbesserung der Gelhaftung beschichtet wurde, sowie einer größeren Platte
(20 cm • 22,4 cm) zusammen, die hingegen mit PlusOne Repel Silane Lösung
(Tabelle 8.1) beschichtet wurde, um ein leichtes Ablösen des Gels von der Platte zu
ermöglichen.
Beide Gelsandwichs wurden 2 h bis zur vollständigen Polymerisation der PAA-Gele
waagerecht gelagert. Anschließend wurden sie in das DCodeTM Universal Mutation
Detection System (Bio-Rad GmbH, D-80939 München) eingebaut.
7 μl der aufgereinigten ssDNA-Proben sowie 4 μl eines Speziesstandard (zur
Verfügung gestellt von Dr. M. Witzig; Universität Hohenheim) wurden mit 8 μl SSCP-
38 Material und Methoden
loading dye (Tabelle 8.1) versetzt und vor Verwendung für 2 min bei 95 °C
denaturiert. Bis zur Beladung des Gels wurden die Proben auf Eis gelagert. Der Tank
des DCodeTM Universal Mutation Detection Systems wurde mit TBE (Tris-Borat-
EDTA; Tabelle 8.1) als Laufpuffer gefüllt. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 300 V
über 22,5 h bei einer Temperatur von 20°C.
2.5.9 Silbernitrat-Färbung
Im Anschluss an die Gelelektrophorese wurde eine Silbernitrat-Färbung der Gele zur
Sichtbarmachung und Fixierung der SSCP-Profile durchgeführt. Nach 22,5 h wurden
die PAA-Gele in 10%iger Essigsäure (Tabelle 8.1) für 30 min unter ständiger
Bewegung (Schüttler Typ 3017, GFL GmbH, D-30938 Burgwedel) inkubiert. Es
folgten drei Waschschritte mit Aqua dest. (je 5 min).
Die Färbung der PAA-Gele mit Silbernitrat-Lösung erfolgte für 30 min unter
Lichtausschluss auf dem Schüttler. Nach Abgießen der Färbelösung (Tabelle 8.1)
wurden die SSCP-Profile durch Zugabe von 600 ml einer Entwicklerlösung (Tabelle
8.1) sichtbar gemacht. Bei Erreichen der gewünschten Farbintensität wurden die
PAA-Gele 5 min in 10%iger Essigsäure fixiert. Nach Spülung mit Aqua dest. wurden
die PAA-Gele unter einem Abzug getrocknet.
Material und Methoden 39
2.6 Statistische Auswertung der SSCP-Profile
Die Analyse der SSCP-Profile wurde mit der GelCompar II Software (Applied Maths,
Sint-Martens-Latem, Belgium), der PERMANOVA Software (Permutational
multivariate analysis of variance; Version 1.6) (ANDERSON 2001; MCARDLE u.
ANDERSON 2001) sowie der PAST Software (Paleontological Statistics; Version 2.14)
(HAMMER et al. 2001) durchgeführt. Zunächst wurden die PAA-Gele zur
Digitalisierung der SSCP-Profile gescannt (ScanMaker i800, Mikrotek, D-47877
Willich). Mithilfe des rolling disk-Mechanismus wurde im nächsten Schritt der
Hintergrund der SSCP-Profile eliminiert. Die GelCompar II Software wurde dazu
genutzt, die einzelnen Spuren der PAA-Gele nach der Ähnlichkeit ihrer
Bandenmuster zu sortieren. Zu diesem Zweck wurde eine densitometrische Kurve
jeder Spur erstellt. Diese Kurven wurden anschließend unter Verwendung des
Pearson product-moment Korrelationskoeffizienten in einer Clusteranalyse
verglichen. Visualisiert wurden die Ergebnisse der Clusteranalyse in einem
Dendrogramm unter Anwendung des UPGMA (unweighted pair group method using
arithmetic averages).
Die den Dendrogrammen zugrunde liegenden Ähnlichkeitsmatrizes wurden
anschließend in Unähnlichkeitsmatrizes umgewandelt und mithilfe der PERMANOVA
Software analysiert. Unter Verwendung des Permutationstests wurden die Matrizes
auf einen Einfluss der Faktoren Trockenstress und CO2-Konzentration für die Proben
von V1 bzw. Tag und CO2-Konzentration für die Proben von V2 untersucht. Die
verschiedenen Parameter wurden mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p≤0,05
als signifikant bezeichnet (* = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001).
Für V2 erfolgte eine graphische Darstellung der Unähnlichkeitsmatrizes in Form von
Entfernungen in einer zwei-dimensionalen nicht-metrischen multidimensionalen
Skalierung (n-m MDS) mithilfe der PAST Software unter Anwendung des Gower
Ähnlichkeitskoeffizienten. Der angegebene „Stress“ wurde bei Werten von <0,15 als
Maß für eine zutreffende Wiedergabe der ursprünglichen Daten durch die n-m MDS
angesehen (KRUSKAL 1964a, b; BOGUHN et al. 2010).
41
3 Ergebnisse
Um den Erfolg des FACE-Versuchs zu überprüfen, wurde das Pflanzenmaterial auf
seinen Gehalt an Rohnährstoffen untersucht (Kapitel 3.1). V1 wurde durchgeführt,
um die Fermentationsparameter der vier Maisvarianten sowie deren Einfluss auf die
Konzentration der Protozoa in der Fermenterflüssigkeit zu vergleichen (Kapitel 3.2).
In V2 wurden speziell die Veränderungen der Produktionsraten und der molaren
Anteile der SCFA während der Äquilibrierungsphase bei Einsatz der zwei
bewässerten Maisvarianten analysiert (Kapitel 3.3). Anhand der SSCP-Analyse
wurde der Einfluss der Maisvarianten auf die mikrobielle Gemeinschaft (Archaea und
Bacteria) zu Beginn und am Ende der Versuche mithilfe von Clusteranalysen und der
Darstellung in einer n-m MDS untersucht (Kapitel 3.4).
3.1 Pflanzenmaterial
3.1.1 Simulierung der Klimabedingungen
Während 95% der Versuchsdauer wurde mithilfe des FACE-Aufbaus eine [CO2] von
550 ppm ± 10% erreicht. Die durchschnittliche [CO2] im Bereich der Kontrollfelder lag
bei 378,5 ppm. Der obere 0,6 m Bodenhorizont wies in den bewässerten Versuchs-
feldern einen Bodenwassergehalt von über 50% des maximal pflanzenverfügbaren
Bodenwassers während der gesamten Versuchsdauer auf. Mithilfe der
Dachkonstruktion (ERBS et al. 2010) konnte eine um 50% geringere Wasserzufuhr in
den Trockenstressplots erreicht werden (MANDERSCHEID et al. 2012).
3.1.2 Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der vier Maisvarianten
Die Ergebnisse der Analysen der Rohnährstoffgehalte und der Zusammensetzung
der Faserfraktion der vier Maisvarianten sind in Tabelle 3.1 aufgelistet.
42 Ergebnisse
Alle Varianten zeigten identische Werte an TS sowie an oS und Ra. Während die
bewässerten Varianten A und B ähnliche Rp-Gehalte aufwiesen (48,8 g • kg-1 TS
und 50,4 g • kg-1 TS), ergab sich für Variante C (380 ppm CO2 + Trockenstress) der
höchste Wert. Der Rp-Gehalt von Variante D (550 ppm CO2 + Trockenstress) war mit
48,5 g Rp • kg-1 TS mit den Werten der bewässerten Varianten vergleichbar. Für
Variante B (550 ppm CO2) wurde der höchste Rfe-Gehalt ermittelt. Die
Trockenstressvarianten C und D zeigten höhere Anteile von Rfa, NDF und ADF im
Vergleich zu den bewässerten Varianten, bei denen sich wiederum höhere NfE-
Werte nachweisen ließen. Die mit 550 ppm CO2 behandelten Varianten wiesen
zudem höhere ADL-Gehalte verglichen mit den 380 ppm Varianten auf, wobei die
Trockenstressvarianten jeweils höhere Werte als die bewässerten Maisvarianten
zeigten.
Tabelle 3.1: Gehalte der Maisvarianten an Rohnährstoffen [g • kg-1
TS; TS in g • kg-1
uS]
Behandlung
Bewässert Trockenstress$
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 550 ppm CO2
A B C D
TS# 354 352 397 400
oS 966 961 960 962
Ra 34,4 38,7 39,7 37,9
Rp 48,8 50,4 58,6 48,5
Rfe 26,6 31,9 17,6 20,8
Rfa 153 163 219 243
NfE 724 705 654 646
NDF 387 383 518 541
ADF 196 201 264 288
ADL 19,7 22,8 22,3 29,5
# Trockensubstanz der frischen Maispflanzen (R. Manderscheid, unveröffentlichte Daten)
$ 50% weniger verfügbares Wasser während der gesamten Versuchsperiode im Vergleich zu den bewässerten Varianten (MANDERSCHEID et al. 2012)
Ergebnisse 43
3.2 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 1
3.2.1 pH-Werte
Die Messungen in den Fermenterflüssigkeiten ergaben für alle Varianten an allen
Tagen pH-Werte zwischen 6,6 und 6,9 (Abbildung 3.1). Die statistische Auswertung
ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den pH-Werten der einzelnen
Bewässerungsvarianten (Tabelle 3.2). Bei Fermentation der Maispflanzen, die
Trockenstress ausgesetzt waren, ergaben sich höhere pH-Werte. An den Tagen 11
bis 13 stellten sich die Unterschiede zu den bewässerten Varianten als signifikant
heraus, welche in der Abbildung durch verschiedene Buchstaben dargestellt wurden.
Ein Einfluss der CO2-Varianten auf den pH-Wert konnte ebenso wie ein Zeiteffekt
ausgeschlossen werden.
Tabelle 3.2: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ** [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
44 Ergebnisse
Ab
bild
un
g: 3
.1 V
erla
uf d
er p
H-W
erte
(MW
± S
EM
; n=
3) v
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leic
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n
a
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ste
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sig
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ied
e (p
<0,0
5) d
ar
Ergebnisse 45
3.2.2 Redoxpotentiale
Die Redoxpotentiale aller Ansätze zeigten keinen Einfluss des Substrats, allerdings
einen Zeiteffekt (Tabelle 3.3). Während die Redoxpotentiale 24 h nach
Versuchsbeginn durchschnittlich für alle Varianten bei -250 mV lagen, erreichten die
Werte an Tag 4 ca. -150 mV. Bis Versuchsende bewegten sich die Redoxpotentiale
für alle Behandlungen in einem Bereich zwsichen -150 und -102 mV (Abbildung 3.2).
Tabelle 3.3: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
46 Ergebnisse
Ab
bild
un
g 3
.2: V
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uf d
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W ±
SE
M; n
=3) v
erg
leic
hen
d fü
r die
vie
r Mais
va
rian
ten
Ergebnisse 47
3.2.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile
3.1.3.1 Produktionsraten der gesamten SCFA
Während der Fermentation der Maisvarianten wurden pro Tag 27-40 mmol SCFA
produziert (Abbildung 3.3). Es ergaben sich weder zwischen den Substraten noch
zwischen den Versuchstagen signifikante Unterschiede (Tabelle 3.4).
7 8 9 10 11 12 13 140
10
20
30
40
50
A = 380 ppm CO2
B = 550 ppm CO2
C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tage
SC
FA
-Pro
du
ktio
nsra
ten
[mm
ol
Tag
-1]
Abbildung 3.3: Verlauf der SCFA-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Tabelle 3.4: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der SCFA (MW ± SEM; n=3)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
48 Ergebnisse
3.1.3.2 Produktionsraten der einzelnen SCFA
Die tägliche Acetat-Produktion belief sich an Tag 7 auf 14-18 mmol (Abbildung
3.4a). Im Verlauf des Versuchs sanken die Produktionsraten kontinuierlich ab und
lagen an Tag 14 zwischen 12 und 15 mmol • Tag-1. Dieser Zeiteffekt erwies sich als
statistisch signifikant (Tabelle 3.5). Derartige Veränderungen waren für alle
Maisvarianten im gleichen Maß zu beobachten.
Die Propionat-Produktionsraten lagen zwischen 9 und 15 mmol • Tag-1 (Abbildung
3.4b). Die statistische Analyse der Daten zeigte keinen Zeiteffekt (Tabelle 3.5). Auch
die Maisvarianten hatten keinen Einfluss auf die Propionat-Produktion.
Die Butyrat-Produktion erreichte an Tag 7 Raten von 5,6-6,1 mmol pro Tag
(Abbildung 3.4c). Im Verlauf des Versuchs sanken die täglichen Produktionsraten
signifikant ab und beliefen sich an Tag 14 auf Werte zwischen 4,7 und 6,0 mmol
Butyrat • Tag-1 (Tabelle 3.5). Ein Einfluss des Substrats konnte nicht ermittelt
werden.
Die tägliche Isovalerat-Produktion zeigte ebenfalls eine signifikante
Zeitabhängigkeit über die Versuchsdauer (Tabelle 3.5). Während an Tag 7 0,4-0,5
mmol Isovalerat in 24 h produziert wurden, zeigten sich an Tag 14 Raten von
0,5-0,7 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.4d). Auch für die Produktion von Isovalerat konnte
ein Einfluss der Maisvarianten ausgeschlossen werden.
Tabelle 3.5: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)
Acetat Propionat Butyrat Isovalerat
Intersubjekteffekt Signifikanz
Zeit *** ns * *
Zeit • Trockenstress ns ns ns ns
Zeit • [CO2] ns ns ns ns
Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns
Zwischensubjekteffekte
Trockenstress ns ns ns ns
[CO2] ns ns ns ns
Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns
Ergebnisse 49
A
bb
ild
un
g 3
.4:
Ve
rla
uf
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Pro
du
kti
on
sra
ten
vo
n A
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Tag
-1 (
MW
±
S
EM
; n
=3)
verg
leic
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d f
ür
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vie
r M
ais
vari
an
ten
50 Ergebnisse
3.1.3.3 Molare Anteile der einzelnen SCFA
Die molaren Anteile des Acetats an der SCFA-Gesamtproduktion betrugen an Tag
7 46-47% (Abbildung 3.5a). Die molaren Acetat-Anteile sanken über die
Versuchsdauer für alle Maisvarianten signifikant ab (Tabelle 3.6). An Tag 14 ergaben
die Messungen Acetat-Anteile von 43-44%. Ein signifikanter Einfluss der Substrate
konnte nicht festgestellt werden.
Die molaren Propionat-Anteile an der totalen SCFA-Produktion lagen an Tag 7 bei
34-35%. Die Anteile stiegen bei allen Maisvarianten bis zu Tag 14 signifikant auf
37-38% (Abbildung 3.5b). Es war kein Behandlungseffekt zu ermitteln (Tabelle 3.6).
Die molaren Anteile des Butyrats an der SCFA-Gesamtproduktion reichten von
13-22% (Abbildung 3.5c). Es konnte weder ein Einfluss der Maisvarianten noch ein
Zeiteffekt festgestellt werden (Tabelle 3.6).
Die molaren Isovalerat-Anteile an der gesamten SCFA-Produktion zeigten an Tag
7 Werte von 1,2-1,3% (Abbildung 3.5d). Im Verlauf des Versuchs stiegen die Werte
für Isovalerat an. An Tag 14 wurden Anteile von 1,9-2,1% erreicht. Neben dem
signifikanten Zeiteffekt konnte kein Einfluss der Maisvarianten bestimmt werden
(Tabelle 3.6).
Tabelle 3.6: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)
Acetat Propionat Butyrat Isovalerat
Intersubjekteffekt Signifikanz
Zeit *** *** ns **
Zeit • Trockenstress ns ns ns ns
Zeit • [CO2] ns ns ns ns
Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns
Zwischensubjekteffekte
Trockenstress ns ns ns ns
[CO2] ns ns ns ns
Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns
Ergebnisse 51
A
bb
ild
un
g 3
.5:
Ve
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er
mo
lare
n A
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ile v
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Aceta
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vale
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(d)
in P
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Ge
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t-
pro
du
kti
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W ±
SE
M;
n=
3)
verg
leic
hen
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ür
die
vie
r M
ais
vari
an
ten
52 Ergebnisse
3.1.3.4 Verhältnisse von Acetat zu Propionat
Für die Acetat:Propionat-Verhältnisse ergaben sich an Tag 7 Werte von 1,3-1,4:1
(Abbildung 3.6). Bis Tag 14 sanken für alle Maisvarianten die Verhältnisse von
Acetat zu Propionat auf Werte von 1,1-1,2:1 ab. Der signifikante Zeiteffekt trat
parallel zu einer Interaktion der Zeit und der Trockenstressbehandlung auf (Tabelle
3.7). So zeigten die beiden Trockenstressvarianten (C und D) von Tag 7 bis Tag 11
geringere, ab Tag 12 höhere Acetat:Propionat-Verhältnisse im Vergleich zu den
bewässerten Varianten (A und B). Ein Einfluss der CO2-Behandlung auf das
Acetat:Propionat-Verhältnis konnte ausgeschlossen werden.
7 8 9 10 11 12 13 140.0
0.5
1.0
1.5
2.0
A = 380 ppm CO2
B = 550 ppm CO2
C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tage
Aceta
t:P
rop
ion
at-
Verh
ältn
isse [
x:1
]
Abbildung 3.6: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Tabelle 3.7: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ** Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
Ergebnisse 53
3.2.4 Produktionsraten und Konzentrationen der Fermentationsgase
3.1.4.1 Produktionsraten der Fermentationsgase
Die Produktion der Fermentationsgase schwankte zwischen 217 und 412 ml • Tag-1
(Abbildung 3.7). Es konnte weder ein Einfluss der Maisvarianten noch ein Zeiteffekt
ermittelt werden (Tabelle 3.8).
7 8 9 10 11 12 13 140
100
200
300
400
500
A = 380 ppm CO2
B = 550 ppm CO2
C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tage
Pro
du
ktio
nsra
ten
der
Ferm
en
tatio
nsg
ase
[ml
Tag
-1]
Abbildung 3.7: Verlauf der Produktion der Fermentationsgase insgesamt [ml • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
Tabelle 3.8: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der Fermentationsgase (MW ± SEM; n=3)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
54 Ergebnisse
3.1.4.2 Anteile von CO2 und CH4 an der Fermentationsgasproduktion
Der CO2-Anteil an der gesamten Fermentationsgasproduktion belief sich an
Tag 7 auf 75-80% und stieg bis zu Tag 14 signifikant auf Werte von 77-82% an
(Abbildung 3.8a). Die Maisvarianten hatten keinerlei Einfluss auf die CO2-Anteile an
der Gasproduktion (Tabelle 3.9).
Der CH4-Anteil am produzierten Fermentationsgasgemisch lag an Tag 7 bei
20-25% und sank signifikant auf 18-23% an Tag 14 ab (Abbildung 3.8b). Es konnte
ebenfalls kein Einfluss der Substrate auf den CH4-Anteil der Gasproduktion ermittelt
werden (Tabelle 3.9).
Tabelle 3.9: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der CO2- und CH4-Anteile am produzierten Fermentationsgasgemisch (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
CO2 CH4
Intersubjekteffekt Signifikanz
Zeit *** ***
Zeit • Trockenstress ns ns
Zeit • [CO2] ns ns
Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns
Zwischensubjekteffekte
Trockenstress ns ns
[CO2] ns ns
Trockenstress • [CO2] ns ns
Ergebnisse 55
7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
100
Tage
CO
2-A
nte
ile [
%]
7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
100
Tage
CH
4-A
nte
ile [
%]
a
b
Abbildung 3.8: Verlauf der Anteile von CO2 (a) und CH4 (b) an der Fermentationsgas-produktion [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten
56 Ergebnisse
3.2.5 NH3-N-Konzentrationen
Die NH3-N-Konzentrationen lagen an Tag 7 zwischen 3,8 (B) und 4,7 mmol • l-1 (C)
(Abbildung 3.9). Für alle Maisvarianten sanken die Werte bis zu Tag 14 auf 3,1-4,0
mmol • l-1 ab. Die statistische Analyse ergab sowohl Effekte der
Zwischensubjektfaktoren Trockenstress und CO2-Konzentration als auch einen
Zeiteffekt (Tabelle 3.10). So lagen die NH3-N-Konzentrationen der
Trockenstressvarianten (C und D) bei jeder Messung signifikant über denen der
bewässerten Varianten (A und B). Hingegen zeigten die 380 ppm CO2 Varianten (A
und C) höhere Werte im Vergleich zu den 550 ppm CO2 Varianten (B und D).
7 8 9 10 11 12 13 140
1
2
3
4
5
6
A = 380 ppm CO2
B = 550 ppm CO2
C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
aab
cac
a
b
a
b
a
b
a ab
c ac
aab
c acb
a
b
a
b
cac
a
b
c
a
Tage
NH
3-N
-Ko
nzen
trati
on
en
[mm
ol
l-1]
Abbildung 3.9: Verlauf der NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten a-c: Verschiedene Buchstaben stellen signifikante Unterschiede (p<0,05) dar
Tabelle 3.10: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der NH3-N-Konzentrationen (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress *** [CO2] * Trockenstress • [CO2] ns
Ergebnisse 57
3.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz
Die Verdaulichkeiten der oS lagen zwischen 39% und 52% (Abbildung 3.10). Die
Varianzanalyse ergab einen signifikanten Einfluss der Trockenstressbehandlung
(Tabelle 3.11). Anhand des Fisher-LSD-Tests konnte an Tag 13 ein signifikanter
Unterschied zwischen Variante B zu den anderen Substraten ermittelt werden. An
Tag 14 ergaben sich für Variante B signifikant höhere Verdaulichkeiten als für
Variante D.
7 8 9 10 11 12 13 140
10
20
30
40
50
60
A = 380 ppm CO2
B = 550 ppm CO2
C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
ab
a ab
a
Tage
Verd
au
lich
keiten
der
org
an
isch
en
Su
bsta
nz [
%]
Abbildung 3.10: Verlauf der Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten a-b: Verschiedene Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p<0,05) an
Tabelle 3.11: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Verdaulichkeiten der organischen Substanz (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress * [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
58 Ergebnisse
3.2.7 Anzahl der Protozoa
Die Anzahl der Protozoa belief sich in der Nativprobe auf durchschnittlich 169 • 103
pro ml Pansensaft (Abbildung 3.11). Bereits an Tag 1 war die Protozoa-Zahl auf
45-58 • 103 pro ml Fermenterinhalt gesunken. Die Auszählung der Proben von Tag 7
ergab Protozoa-Konzentrationen von 8-11 • 103 pro ml flüssiger Fermenterphase. An
Tag 14 waren 7-14 • 103 Protozoa pro ml Fermenterinhalt nachzuweisen. Die drei-
faktorielle Varianzanalyse ergab einen signifikanten Zeiteffekt, während ein Einfluss
der Substrate auf die Anzahl der Protozoa nicht festzustellen war (Tabelle 3.12).
Abbildung 3.11: Anzahl der Protozoa [103 • ml
-1] an Tag 1, Tag 7 und Tag 14 verglichen mit
der Nativprobe (MW ± SEM; n=3) für die vier Maisvarianten
Tabelle 3.12: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Anzahl der Protozoa (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns
Ergebnisse 59
3.3 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 2
3.3.1 pH-Werte
Die Messung in der Fermenterflüssigkeit ergab während der Äquilibrierungsphase
pH-Werte zwischen 6,7 und 6,8 (Abbildung 3.12). Weder ein Einfluss der CO2-
Konzentration als Zwischensubjektfaktor noch ein Zeiteffekt konnten ermittelt werden
(Tabelle 3.13).
1 2 3 4 5 6 70
16.6
6.7
6.8
6.9
B = 550 ppm CO2A = 380 ppm CO2
Tage
pH
-Wert
e
Abbildung 3.12: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Tabelle 3.13: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) während der Äquilibrierungsphase
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte [CO2] ns
60 Ergebnisse
3.3.2 Redoxpotentiale
Die Redoxpotentiale zeigten für beide Varianten einen parallelen Verlauf, ähnlich
dem in V1 (Abbildung 3.2). An Tag 1 wurden Werte zwischen -184 und -176 mV
gemessen (Abbildung 3.13). Die Redoxpotentiale wurden im Verlauf der ersten drei
Tage kontinuierlich weniger negativ und wiesen ab Tag 4 bis zu Tag 7 Werte von
-120 bis -100 mV auf. Die statistische Analyse ergab einen signifikanten Zeiteffekt
(Tabelle 3.14). Ein Einfluss der Maisvarianten konnte ausgeschlossen werden.
1 2 3 4 5 6 7
-200
-150
-100
-50
0
A = 380 ppm CO2 B = 550 ppm CO2
Tage
Red
oxp
ote
ntiale
[m
V]
Abbildung 3.13: Verlauf der Redoxpotentiale [mV] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Tabelle 3.14: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte [CO2] ns
Ergebnisse 61
3.3.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile
3.2.3.1 Produktionsraten der gesamten SCFA
Die Produktion der SCFA belief sich an Tag 1 für die Kontrollvariante A auf
48 mmol • Tag-1 und für Variante B auf 51 mmol • Tag-1. Die Produktionsraten beider
Varianten sanken kontinuierlich ab und lagen ab Tag 4 bei 31-35 mmol • Tag-1
(Abbildung 3.14). Die statistische Auswertung ergab einen signifikanten Zeiteffekt
sowie einen Einfluss der CO2-Behandlung (Tabelle 3.15). Variante B zeigte außer an
Tag 2 im Mittel höhere Produktionsraten im Vergleich zu Variante A mit signifikanten
Unterschieden an den Tagen 4 und 5.
1 2 3 4 5 6 70
10
20
30
40
50
60
B = 550 ppm CO2A = 380 ppm CO2
ab
a b
Tage
SC
FA
-Pro
du
ktio
nsra
ten
[mm
ol T
ag
-1]
Abbildung 3.14: Verlauf der Produktionsraten der SCFA [mmol • Tag-1
] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
a-b: Verschiedene Buchstaben stehen für signifikante Unterschiede (p<0,05)
Tabelle 3.15: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der SCFA-Produktionsraten (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte [CO2] *
62 Ergebnisse
3.2.3.2 Produktionsraten der einzelnen SCFA
Die Acetat-Produktion betrug an Tag 1 für Variante A 32 mmol • Tag-1, für Variante
B 34 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15a). Die Produktionsraten sanken ab und zeigten
ab Tag 4 Werte um 13-15 mmol • Tag-1. Die statistische Analyse ergab sowohl einen
signifikanten Zeiteffekt als auch an den Tagen 4 und 5 eine Tendenz ((*) = p<0,1) zu
höheren Produktionsraten von Acetat für Variante B gegenüber Variante A (Tabelle
3.16).
Die Produktion von Propionat belief sich an Tag 1 für Variante A auf
10,7 mmol • Tag-1 und für Variante B auf 11,4 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15b). Die
Produktionsraten stiegen im Verlauf des Versuchs signifikant an und wiesen Werte
ab Tag 4 von 11,9-13,9 mmol • Tag-1 auf. Neben dem Zeiteffekt konnte kein Einfluss
des Substrats auf die Propionat-Produktion festgestellt werden (Tabelle 3.16).
Die Butyrat-Produktion lag für beide Varianten über die gesamte Versuchsdauer
bei Werten um 5,3-6,3 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15c). Bei der statistischen Analyse
konnte kein Einfluss der untersuchten Faktoren auf die Butyrat-Produktionsraten
ermittelt werden (Tabelle 3.16).
Tabelle 3.16: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Acetat Propionat Butyrat
Intersubjekteffekt Signifikanz
Zeit *** *** ns
Zeit • [CO2] ns ns ns
Zwischensubjekteffekte
[CO2] (*) ns ns
Ergebnisse 63
1 2 3 4 5 6 70
10
20
30
40
(*)
a
(*)
Tage
Aceta
t-
Pro
du
ktio
nsra
ten
[mm
ol
Tag
-1]
1 2 3 4 5 6 70
5
10
15
20
b
Tage
Pro
pio
nat-
Pro
du
ktio
nsra
ten
[mm
ol
Tag
-1]
1 2 3 4 5 6 70
2
4
6
8
10
c
Tage
Bu
tyra
t-
Pro
du
ktio
nsra
ten
[mm
ol T
ag
-1]
Abbildung 3.15: Verlauf der Produktionen von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in mmol • Tag
-1 (MW ± SEM; n=3; (*) = p<0,1) vergleichend für die zwei
Maisvarianten
64 Ergebnisse
3.2.3.3 Molare Anteile der einzelnen SCFA
Die molaren Anteile des Acetats an der gesamten SCFA-Produktion betrugen an
Tag 1 67% (Abbildung 3.16a). Im Laufe der folgenden zwei Tage sanken die Acetat-
Anteile ab und erreichten ab Tag 4 Werte von 41-43%. Die statistische Analyse
ergab keinen Einfluss der Maisvarianten, wohingegen sich ein signifikanter Zeiteffekt
ermitteln ließ (Tabelle 3.17).
Die molaren Propionat-Anteile an der produzierten SCFA-Menge beliefen sich an
Tag 1 auf 22% (Abbildung 3.16b). Der Prozentsatz von Propionat stieg im weiteren
Verlauf signifikant an und betrug ab Tag 4 38-40% (Tabelle 3.17). Es konnte kein
Einfluss der Maisvarianten festgestellt werden.
Die molaren Anteile des Butyrats an der SCFA-Produktion zeigten für beide
Varianten an Tag 1 Werte von 11% (Abbildung 3.16c). Im Verlauf der
Äquilibrierungsphase stiegen die Butyrat-Anteile auf Werte zwischen 18% und 19%
an. Auch bei den molaren Anteilen von Butyrat konnte ein Zeiteffekt ohne Einfluss
der Maisvarianten festgestellt werden (Tabelle 3.17).
Tabelle 3.17: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase
Acetat Propionat Butyrat
Intersubjekteffekt Signifikanz
Zeit *** *** ***
Zeit • [CO2] ns ns ns
Zwischensubjekteffekte
[CO2] ns ns ns
Ergebnisse 65
1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
a
Tage
Mo
lare
Aceta
t-
An
teile
[%
]
1 2 3 4 5 6 70
10
20
30
40
50
b
Tage
Mo
lare
Pro
pio
nat-
An
teile
[%
]
1 2 3 4 5 6 70
5
10
15
20
25
c
Tage
Mo
lare
Bu
tyra
t-
An
teile
[%
]
Abbildung 3.16:
Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in Prozent an der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
66 Ergebnisse
3.2.3.4 Verhältnisse von Acetat zu Propionat
An Tag 1 der Äquilibrierungsphase ergaben sich Acetat:Propionat-Verhältnisse um
3,0:1 (Abbildung 3.17). Im Laufe der nächsten drei Tage sanken die Verhältnisse für
beide Maisvarianten auf 1,0-1,1:1 ab. Die statistische Analyse ergab einen
signifikanten Zeiteffekt (Tabelle 3.18). Zwischen den Maisvarianten mit dem
Zwischensubjektfaktor CO2-Konzentration konnte kein signifikanter Unterschied
festgestellt werden.
1 2 3 4 5 6 70.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
B = 550 ppm CO2A = 380 ppm CO2
Tage
Aceta
t:P
rop
ion
at-
Verh
ältn
isse [
x:1
]
Abbildung 3.17: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten
Tabelle 3.18: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Verhältnisse von Acetat zu Propionat (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase
Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • [CO2] ns
Zwischensubjekteffekte [CO2] ns
Ergebnisse 67
3.4 Darstellung und Analyse der SSCP-Profile
In diesem Kapitel werden die erstellten SSCP-Profile mit den Ergebnissen der
Clusteranalyse vorgestellt, um mögliche Behandlungseffekte auf die mikrobielle
Diversität nachzuweisen. Für die SSCP-Profile der Proben aus V2 werden zusätzlich
zwei-dimensionale n-m MDS dargestellt, um die Ähnlichkeiten der Proben
weiterführend beurteilen zu können.
3.4.1 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V1
3.3.1.1 Bacteria-Fraktion an Entnahmetag 1
Die Clusteranalyse des SSCP-Profils der Bacteria-Domäne von Entnahmetag 1
zeigte Ähnlichkeiten von 84,0-96,6% zwischen den verschiedenen Spuren
(Abbildung 3.18). Es kam zu keiner den Behandlungen entsprechenden
Gruppenbildung. Die Permutationsanalyse der Unähnlichkeitsmatrix ergab keine
signifikanten Unterschiede (Tabelle 3.19).
68 Ergebnisse
Abbildung 3.18: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A = 380 ppm CO2 C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
B = 550 ppm CO2 D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tabelle 3.19: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1
Signifikanz
Trockenstress ns
[CO2] ns
Trockenstress • [CO2] ns
Ergebnisse 69
3.3.1.2 Archaea-Fraktion an Entnahmetag 1
Die Clusteranalyse des SSCP-Profils der Archaea-Fraktion von Tag 1 zeigte
Ähnlichkeiten von 85,0-99,4% zwischen den Spuren (Abbildung 3.19). Es ergab sich
eine Gruppenbildung, wobei die obere Gruppe vier Spuren von Trockenstress-
varianten (C und D) mit Ähnlichkeiten von 92,6-99,2% umfasst. Das untere Cluster
schließt alle übrigen Spuren mit Ähnlichkeiten von 97,4-99,4% ein. Die statistische
Auswertung zeigte keinen Einfluss der Maisvarianten auf die Profile (Tabelle 3.20).
Abbildung 3.19: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A = 380 ppm CO2 C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
B = 550 ppm CO2 D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tabelle 3.20: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1
Signifikanz
Trockenstress ns
[CO2] ns
Trockenstress • [CO2] ns
70 Ergebnisse
3.3.1.3 Bacteria-Fraktion an Entnahmetag 14
Das SSCP-Profil der Bacteria-Domäne der Proben von Entnahmetag 14 zeigte in der
Clusteranalyse eine Anordnung der Spuren in zwei Gruppen mit einer Ähnlichkeit
von 53,2% (Abbildung 3.20). Sowohl im oberen als auch im unteren Cluster wurden
Spuren aller Maisvarianten mit einer Ähnlichkeit von 63,9-97,1% bzw. 76,1-90,9%
zusammengefasst. Mit der Permutationsvarianzanalyse konnte kein Einfluss der
Behandlungen auf die SSCP-Profile festgestellt werden (Tabelle 3.21).
Abbildung 3.20: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A = 380 ppm CO2 C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
B = 550 ppm CO2 D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tabelle 3.21: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1
Signifikanz
Trockenstress ns
[CO2] ns
Trockenstress • [CO2] ns
Ergebnisse 71
3.3.1.4 Archaea-Fraktion an Entnahmetag 14
Das SSCP-Profil der Archaea-Domäne von Entnahmetag 14 zeigte in der
Clusteranalyse eine Gruppenbildung (Abbildung 3.21) mit einer Ähnlichkeit der
beiden Cluster von 82,3%. Die untere Gruppe umfasste vier Spuren der
Trockenstressvarianten (C und D) mit Ähnlichkeiten von 96,8-98,6%. Die übrigen
Spuren wurden in einem oberen Cluster zusammengefasst, die sich zu 86,5-96,8%
ähnelten. Auch hier ergab die statistische Permutationsanalyse keine signifikanten
Effekte der Maisvarianten (Tabelle 3.22).
Abbildung 3.21: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A = 380 ppm CO2 C = 380 ppm CO2 + Trockenstress
B = 550 ppm CO2 D = 550 ppm CO2 + Trockenstress
Tabelle 3.22: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1
Signifikanz
Trockenstress ns
[CO2] ns
Trockenstress • [CO2] ns
72 Ergebnisse
3.4.2 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V2
3.3.2.1 Vergleich der Bacteria-Fraktionen an den Entnahmetagen 1 und 7
Die SSCP-Profile der Bacteria-Domäne aus Proben vom Anfang und Ende der
Äquilibrierungsphase zeigten in der Clusteranalyse eine deutliche Gruppenbildung
entsprechend der Tage der Probenentnahme (Abbildung 3.22). Beide Cluster wiesen
eine Ähnlichkeit von 51,7% auf. Für die Gruppe der Spuren von Probenentnahmetag
7 (oben) ergaben sich in der Clusteranalyse Ähnlichkeiten von 82,6-95,2%. Das
Cluster mit den Spuren der Entnahmetag-1-Proben zeigte Ähnlichkeiten von 92,0-
96,8%. Trotz dieser deutlichen Sortierung der Spuren nach Probenentnahme ergab
die Permutationsanalyse keinen signifikanten Zeiteffekt (Tabelle 3.23). Die
Maisvariante hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Ähnlichkeit der Spuren-Profile.
Ergebnisse 73
Abbildung 3.22: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A1 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 1 A7 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 7
B1 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 1 B7 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 7
Tabelle 3.23: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2
Signifikanz
Entnahmetag ns
[CO2] ns
Entnahmetag • [CO2] ns
74 Ergebnisse
3.3.2.2 Vergleich der Archaea -Fraktionen an den Entnahmetagen 1 und 7
Die SSCP-Profile der Archaea-Domäne der Proben der Entnahmetage 1 und 7
ergaben in der Clusteranalyse zwei Gruppen mit einer Ähnlichkeit von 74,3%
(Abbildung 3.24). Das obere Cluster umfasste alle Spuren der Proben des siebten
Tags mit Ähnlichkeiten von 86,1-98,8% unabhängig von der Maisvariante. Die untere
Gruppe bezog alle Spuren der Proben des ersten Versuchstags ein mit Ähnlichkeiten
von 90,0-99,0%. Die Permutationsanalyse ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss
der Probeentnahmetage oder der Maisvariante auf die SSCP-Profile (Tabelle 3.24).
Abbildung 3.23: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse
A1 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 1 A7 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 7
B1 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 1 B7 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 7
Tabelle 3.24: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2
Signifikanz
Entnahmetag ns
[CO2] ns
Entnahmetag • [CO2] ns
Ergebnisse 75
3.3.2.3 Zwei-dimensionale n-m MDS der SSCP-Profile von V2
Zur Abklärung der Befunde der Clusteranalysen wurden die Unähnlichkeiten der
Spuren-Profile der Proben aus V2 in einer zwei-dimensionalen n-m MDS als
Abstände abgebildet.
In der Skalierung des SSCP-Profils der Bacteria-Domäne wiesen die Varianten von
Entnahmetag 1 eine Gruppierung mittig auf der linken Seite des Rasters auf
(Abbildung 3.24a). Die Proben von Entnahmetag 7 lagen weitläufig verteilt auf der
rechten Rasterseite.
In der Skalierung des SSCP-Profils der Archaea-Domäne lagen die Proben von
Entnahmetag 1 verstreut auf der linken Seite des Rasters (Abbildung 3.24b). Die
Proben von Entnahmetag 7 traten ebenfalls verstreut auf, allerdings auf der rechten
Rasterseite. Auch in dieser Skala war eine deutliche räumliche Trennung der
Varianten von Entnahmetag 1 zu den Varianten von Entnahmetag 7 festzustellen.
76 Ergebnisse
Abbildung 3.24: Zwei-dimensionale nicht-metrische multidimensionale Skalierung (n-m MDS) der Abweichungsmatrizes der Clusteranalysen des Bacteria- (a) und Archaea-Profils (b) jeweils vergleichend für die Versuchstage 1 und 7
77
4 Diskussion
4.1 FACE-Methode und Pflanzenmaterial
Mithilfe der FACE-Methode in Kombination mit der Dachkonstruktion nach ERBS et al.
(2010) ist es MANDERSCHEID et al. (2012) gelungen, eine erhöhte [CO2] und
Trockenstress als abiotische Stressoren im Feldversuch für die angebauten
Maispflanzen zu simulieren. In den Versuchsabschnitten mit CO2-Behandlung konnte
in 95% der Versuchsdauer die Ziel-[CO2] von 550 ppm aufrechterhalten werden. Die
Trockenstressbehandlung war ebenfalls erfolgreich. So standen den Maispflanzen in
den Trockenstressabschnitten der Versuchsfelder verglichen mit den bewässerten
Pflanzen über die Versuchsdauer eine um 50% geringere Wassermenge zur
Verfügung (MANDERSCHEID et al. 2012).
Die Analyse der Maispflanzen auf deren Gehalt an Rohnährstoffen zeigte deutliche
Unterschiede zwischen den bewässerten und den Trockenstressvarianten
unabhängig von der CO2-Behandlung. Die Trockenstressbehandlung führte zu
höheren Trockensubstanz (TS)-Gehalten in der ursprünglichen Substanz (uS;
Tabelle 3.1). Im Gegensatz dazu war der Gesamtertrag an TS der bewässerten
Varianten größer (MANDERSCHEID et al. 2012). In ihrer Studie zur Untersuchung der
physiologischen Antwort von Maispflanzen auf Trockenstress konnten EFEOǦLU et al.
(2009) signifikant geringere TS- und uS-Erträge bei Maispflanzen mit
Trockenstressbehandlung im Vergleich zur bewässerten Kontrolle feststellen.
Infolge der Behandlung mit 550 ppm CO2 unabhängig vom Bewässerungsstatus
konnten MANDERSCHEID et al. (2012) keine Steigerung des TS-Ertrags feststellen
(Tabelle 3.1). Dies deckt sich mit Ergebnissen anderer FACE-Studien, bei denen
eine alleinige Erhöhung der [CO2] ebenfalls keinen Einfluss auf den Ertrag von
Maispflanzen hatte (LEAKEY et al. 2006; MARKELZ et al. 2011).
78 Diskussion
Hingegen führte die Trockenstressbehandlung zu einem signifikant reduzierten
Kornertrag. Die Strohernte wurde im Gegensatz dazu nicht beeinflusst
(MANDERSCHEID et al. 2012). Während der Phase der Kornfüllung hemmt
Trockenstress die Translokation der Assimilate (organische N- und
Kohlenhydratverbindungen) in den Kolben (NESMITH u. RITCHIE 1992). Zusätzlich
sinkt die Photosyntheserate (GHANNOUM 2009; LEAKEY et al. 2009). Die Analyse der
Kohlenhydratfraktion der Maispflanzen spiegelt dies wider. Während die bewässerten
Maisvarianten höhere Gehalte an stickstoff-freien Extraktionsstoffen (NfE) aufwiesen,
zeigten beide Maisvarianten mit Trockenstress höhere Anteile an Rohfaser (Rfa) und
Detergentien-Fasern (NDF und ADF) an der TS (Tabelle 3.1).
Mit der Trockenstressbehandlung wurde im FACE-Versuch von MANDERSCHEID et al.
(2012) begonnen, nachdem die Anthese der Pflanzen abgeschlossen war, das heißt,
nachdem alle Blätter ausgebildet worden waren. Mit Erreichen dieses Stadiums ist
die Stickstoff (N)-Assimilation der Pflanzen nahezu abgeschlossen (MEßNER 2000). In
der Folge werden die gebildeten organischen N-Verbindungen während der Phase
der Kornfüllung remobilisiert und in den Kolben umgelagert. Im Gegensatz dazu
hängt die Kohlenhydrateinlagerung in den Kolben von der während der
Kornfüllungsphase aktuellen Photosyntheseleistung ab (MEßNER 2000). Der hohe
Rohprotein (Rp)-Gehalt der Maisvariante C verglichen mit den Werten der anderen
Varianten könnte sich dadurch erklären lassen. Infolge von Trockenstress sinkt nicht
nur die Photosyntheserate, sondern auch die Masse der zur Translokation zur
Verfügung stehenden organischen Kohlenhydratverbindungen. Die Verfügbarkeit
organischer N-Verbindungen ist hingegen nicht eingeschränkt. So steigt der
Rp-Gehalt im Kolben an. Da sich mit zunehmender Kornfüllung der Massenanteil des
Kolbens an der Gesamt-TS der Pflanze ebenfalls erhöht (CONE et al. 2008), wird der
Rp-Anteil an der TS insgesamt gesteigert.
Durch die zusätzliche CO2-Behandlung wurde dieser Trockenstresseffekt
abgeschwächt, was sich mit Ergebnissen vergleichbarer Studien deckt (LEAKEY et al.
2004; LEAKEY et al. 2009).
Diskussion 79
Eine Übersicht der Wechselwirkungen zwischen einer erhöhten [CO2] und
Trockenstress auf C4-Pflanzen ist in Abbildung 4.1 dargestellt.
Abbildung 4.1: Zusammenfassung der Aus- und Wechselwirkungen von Trockenstress und erhöhter [CO2] auf C4-Pflanzen. Die durchgezogenen Pfeile kennzeichnen direkte Folgen, gestrichelte Pfeile zeigen hemmende Prozesse an. Abgewandelt nach LEAKEY (2009).
LWC Leaf water content; Wassergehalt der Blätter
SWC Soil water content; Wassergehalt des Bodens
Eine erhöhte [CO2] führt zu einem größeren CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen.
Dieser Effekt wirkt den Folgen von Trockenstress wie abnehmender
Photosyntheserate durch sinkenden CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen als
Folge abnehmender stomatärer Leitfähigkeit entgegen. Eine weitere Wirkung der
[CO2]-Erhöhung ergibt sich aus der sinkenden stomatären Leitfähigkeit, die zu einer
geringeren Transpirationsrate und zu einem höheren Wassergehalt des Bodens
(soil water content; SWC) führt. Der höhere CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen
und der größere SWC bewirken, dass die Auswirkungen von Trockenstress wie
sinkende Photosyntheseraten und Abnahme der Blattfläche später und/oder
schwächer ausfallen (GHANNOUM 2009; LEAKEY 2009).
Das könnte auch für Maisvariante D gelten. Infolge der Trockenstressbehandlung
hätte der prozentuale Rp-Gehalt an der TS größer sein müssen verglichen mit den
Rp-Gehalten der bewässerten Varianten A und B. Dieser Trockenstresseffekt wurde
80 Diskussion
allerdings durch die zusätzliche Erhöhung der [CO2] und der dadurch resultierenden
gesteigerten Photosyntheserate und besonders durch den größeren SWC
abgemildert. So liegt der Rp-Gehalt von Variante D im Bereich der bewässerten
Varianten, bei denen sich kein Einfluss der [CO2] auf die Rp-Gehalte der Pflanzen
ergab. In einem Kooperationsprojekt wurden Maispflanzen der gleichen Ernte des
Versuchs von MANDERSCHEID et al. (2012) siliert. Die Analyse der
Rohnährstoffzusammensetzung der Maispflanzensilagen zeigte im Vergleich der
Varianten untereinander entsprechende Ergebnisse analog zu den Daten der
vorliegenden Arbeit (MEYER et al. 2009).
Schlussfolgernd ist zu erwarten, dass Maispflanzen sowie deren Silagen als Folge
von steigender [CO2] und Trockenstress höhere Anteile von Rp sowie NDF und ADF
bei niedrigeren NfE-Gehalten aufweisen werden.
Diskussion 81
4.2 Beurteilung der RUSITEC-Versuche
Auf Basis der in Kapitel 3 dargelegten Ergebnisse werden im folgenden Kapitel der
Einsatz der Rumen-Simulationstechnik als In-vitro-Untersuchungsmethode bewertet
und die erzielten Ergebnisse mit Daten aus der Literatur verglichen.
4.2.1 pH-Werte
Die gemessenen pH-Werte in den RUSITEC-Versuchen 1 und 2 (V1 und V2) lagen
zwischen 6,6 und 6,9. Die Werte blieben sowohl während der Äquilibrierungsphase
(V1: Abbildung 3.1 Tage 1-6; V2: Abbildung 3.12) als auch im Laufe der
Versuchsphase (V1; Abbildung 3.1 Tage 7-14) konstant. Diese Konstanz der Werte,
welche durch den Einsatz des artifiziellen Speichels mit hoher Pufferkapazität
(MCDOUGALL 1948) sichergestellt wurde, ist ein Hinweis auf beständige Verhältnisse
im System.
Für physiologische pH-Werte im Pansen wurde ein Rahmen von 6 bis 7 angegeben
(CZERKAWSKI 1986). Bei anderen RUSITEC-Versuchen wurden vergleichbare
pH-Werte von 6,8-7,0 bzw. von 6,4-6,9 erzielt (OEZTUERK et al. 2005; MARTINEZ et al.
2010a). In einem Fütterungsversuch an Rindern mit einem hohen Anteil von
Maissilage in der Ration wurden pH-Werte zwischen 6,8 und 6,9 gemessen (RICHTER
et al. 2010). Somit können die Bedingungen in den Fermentern während V1 und V2
bezogen auf die pH-Werte als physiologisch und stabil angesehen werden.
4.2.2 Redoxpotentiale
Nach Redoxpotentialen von -250 mV (V1) bzw. -180 mV (V2) am Inokulationstag
ergaben die Messungen nach vier bis fünf Tagen weniger negative Werte zwischen
-150 und -115 mV. Bis Versuchsende blieben die Werte in diesem Bereich
(Abbildungen 3.2 und 3.13). Die Veränderungen während der Äquilibrierungsphase
82 Diskussion
(V1 Tage 1-6 und V2) lassen sich durch Anpassung des Systems an
In-vitro-Bedingungen und an das neue Substrat erklären (CZERKAWSKI u.
BRECKENRIDGE 1977; CZERKAWSKI 1986; PREVOT et al. 1994). Zwar wurden die
Redoxpotentiale im Vergleich zu Versuchsbeginn positiver, lagen aber stets im
negativen Bereich, was für stabile anaerobe Verhältnisse im Fermenter spricht.
MAROUNEK et al. (1991) gaben einen physiologischen Rahmen für das Redoxpotential
im Pansen von -250 mV bis -100 mV an. In der Literatur sind allerdings auch
negativere Redoxpotentiale (-270 mV und -350 mV) als MW angegeben (HUNGATE
1960; RICHTER et al. 2010).
KOCH (2008) stellte in einem RUSITEC-Versuch mit Maissilage als Substrat Werte
und Verläufe der Redoxpotentiale fest, die mit den Ergebnissen der vorliegenden
Studie vergleichbar sind. Zusätzlich führte KOCH (2008) Messungen des
Redoxpotentials in der Pansenflüssigkeit der fistulierten Spendertiere durch, wobei
ähnliche Werte und Verläufe erreicht wurden. Die Redoxpotentiale in der
Fermenterflüssigkeit wurden daraufhin als im physiologischen Bereich liegend
eingeordnet (KOCH 2008). Da auch für die Versuche der vorliegenden Arbeit
Panseninhalt von fistulierten Rindern zur Inokulation verwendet wurde, können auch
die ermittelten Redoxpotentiale als physiologisch bewertet werden.
4.2.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA
Im Verlauf von V1 (nach abgeschlossener Äquilibrierung) wurden konstante
Produktionsraten der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) von 28-36 mmol • Tag-1
gemessen (Abbildung 3.3). Im Gegensatz dazu zeigte sich in V2 eine deutliche
Abnahme der SCFA-Gesamtproduktion von 48-51 auf 32-35 mmol • Tag-1 innerhalb
der ersten vier bis fünf Tage der Äquilibrierungsphase (Abbildung 3.14). Diese
Veränderungen wurden besonders durch die Halbierung der Acetatproduktion
(Abbildung 3.15a) hervorgerufen, woraufhin auch der molare Acetat-Anteil von 67%
auf 42% absank (Abbildung 3.16a). Hingegen wurde der molare Anteil von Propionat
größer (Abbildung 3.16b). Das führte zu einem Absinken des Acetat:Propionat-
Diskussion 83
Verhältnisses von 3,0:1 auf 1,1-1,0:1 innerhalb der ersten vier bis fünf Tage (3.17).
Auch nach abgeschlossener Äquilibrierung fiel in V1 der molare Acetat-Anteil bei
steigenden Propionat-Anteilen ab (Abbildungen 3.5a und b), sodass das
Acetat:Propionat-Verhältnis von 1,3-1,4:1 an Tag 7 stetig bis auf Werte von 1,1-1,2:1
an Tag 14 absank.
HILDEBRAND et al. (2010) untersuchte Fermentationsparameter von Maissilage mithilfe
der RUSITEC-Methode. Die Bestimmung der Produktionsrate der SCFA, des
molaren Acetat-Anteils und des Acetat:Propionat-Verhältnisses ergab Werte von
36,2 mmol • Tag-1, 41,9% bzw. 1,1:1. Damit sind die von HILDEBRAND et al. (2010)
bestimmten SCFA-Muster nahezu identisch mit den Ergebnissen der vorliegenden
Arbeit. In Fütterungsversuchen mit Schafen (PHILLIPSON 1952) und Rindern (EUSEBIO
et al. 1959) mit Einsatz reiner Maiskorn-Rationen (Maisflocken bzw. Maismehl)
ergaben sich mit 51-63% bzw. 44-45% molaren Acetat-Anteilen sowie mit
Acetat:Propionat-Verhältnissen von 1,2-1,7:1 bzw. 1,1-1,2:1 ebenfalls zu den Daten
der vorliegenden Studie vergleichbare Ergebnisse. Weitere In-vivo-Studien zeigten
den negativen Einfluss erhöhter Maisanteile an der Ration auf die molaren Acetat-
Anteile und Acetat:Propionat-Verhältnisse (FENNER et al. 1970; DE VISSER et al. 1998;
RYMER u. GIVENS 2002).
Neben dem Einfluss des Substrats zeigen Vergleichsstudien zwischen In-vivo- und
In-vitro-Ansätzen zusätzliche Effekte des RUSITEC-Systems auf die SCFA-
Produktion und die molare Verteilung der SCFA. Bei der Fermentation im RUSITEC-
Aufbau sind niedrigere Acetat:Propionat-Verhältnisse durch gesteigerte
Propionatproduktion sowie höhere molare Anteile von Propionat, Butyrat und
Isovalerat typisch (PREVOT et al. 1994; MARTINEZ et al. 2010a).
Die Veränderung des Fermentationsmusters der SCFA in dieser Studie scheint
daher durch eine Kombination aus substratspezifischen Anpassungsreaktionen und
einem Einfluss der In-vitro-Methode hervorgerufen zu werden.
84 Diskussion
4.2.4 Fermentationsgase
Das Verhältnis der bei der ruminalen Fermentation produzierten Gase an der
Gesamtproduktion ist abhängig vom inkubierten Substrat und der Zusammensetzung
der mikrobiellen Population (HUNGATE 1960; VAN NEVEL u. DEMEYER 1996).
Grundsätzlich besteht in der Gasblase im oberen Pansensack das
Fermentationsgasgemisch zu 30% aus CH4 und zu 70% aus CO2 (HUNGATE 1960).
Ergebnisse der Gasproduktion aus In-vitro-Studien sind aufgrund unterschiedlicher
In- und Output-Mengen des Substrats sowie abweichender Volumina der
Fermentationskammern nicht uneingeschränkt mit Resultaten von In-vivo-Versuchen
vergleichbar (CARRO et al. 2009; MARTINEZ et al. 2010b).
In In-vitro-Studien wurden Produktionsraten der Fermentationsgase von 300 ml bis
über 1500 ml pro Tag angegeben (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977; CARRO u.
MILLER 1999; KLEVENHUSEN et al. 2009; HILDEBRAND et al. 2010). Diese große
Variation kommt wiederum durch den Einsatz verschiedener Substrate und die
Einstellung unterschiedlicher Pufferdurchflussraten zustande. Die in V1 ermittelten
Produktionsraten der Fermentationsgase von 217-412 ml pro Tag (Abbildung 3.7)
und CH4-Anteile zwischen 17,9% und 25,7% (Abbildung 3.8b) liegen damit im
unteren Bereich der in der Literatur angegebenen Grenzen.
Der geringe CH4-Anteil könnte durch die Maisfütterung hervorgerufen worden sein.
Auch im Batch-Versuch konnte eine maiskornbasierte Fütterung und damit eine
stärkereiche Versorgung eine sinkende CH4-Produktion bei gesteigerter CO2- und
Propionatproduktion bewirken (CALLAWAY u. MARTIN 1996).
Die Anzahl der Protozoa im Medium hat ebenfalls Einfluss auf die Methanproduktion.
Die Protozoa setzen im Zuge ihres Stoffwechsels Protonen frei. Die verfügbaren
Protonen werden von anderen Mikroorganismen (z.B. Archaea) genutzt, um CH4 zu
bilden (HUNGATE 1966). Geht die Zahl der Protozoa durch den Zusatz protozoa-
hemmender Stoffe (z.B. Monensin), höheren Rohfett (Rfe)-Gehalten in der Ration
oder aufgrund von In-vitro-Bedingungen zurück, sinkt ebenfalls die CH4-Produktion
(VAN NEVEL u. DEMEYER 1996; DOHME et al. 2000; KLEVENHUSEN et al. 2009; GARCIA-
Diskussion 85
GONZALEZ et al. 2010). Zusätzlich reagieren Archaea empfindlich auf gering negative
Redoxpotentiale (HUNGATE 1966). Die im Laufe der Äquilibrierungsphase (V1:
Abbildung 3.2 Tage 1-6; V2: Abbildung 3.13) weniger negativen Redoxpotentiale
könnten daher zu niedrigeren CH4-Anteilen an der Fermentationsgasproduktion
geführt haben.
Nichtsdestotrotz kann die Gasproduktion abschließend in Bezug auf Höhe und
Zusammensetzung als physiologisch und für die Fütterung typisch bewertet werden.
4.2.5 NH3-N-Konzentrationen
Ammoniak (NH3) ist ein zentraler Metabolit des ruminalen N-Stoffwechsels
(PISULEWSKI 1981; LENG u. NOLAN 1984). Der sogenannte NH3-Pool wird gespeist
durch den mikrobiellen Abbau der zur Verfügung stehenden N-Quellen (Abbildung
4.2). Das sind erstens der im Futter enthaltene Rp-Gehalt, zweitens endogene N-
Verbindungen, die dem Pansen über den Speichel und dem Fermenter über den
Puffer zugeführt werden, und drittens mikrobielles Protein. Verringert wird der NH3-
Pool durch die Nutzung von NH3 als Baustein der mikrobiellen Proteinsynthese
(STERN u. HOOVER 1979; HOOVER u. STOKES 1991) und unter In-vivo-Bedingungen
auch durch die NH3-Resporption über die Pansenwand.
Abbildung 4.2: Der NH3-Pool in der Fermenterflüssigkeit wird gebildet durch mikrobielle Auf- (rechts) und Abbauprozesse von N-Verbindungen (links).
In vivo können für dieses Gleichgewicht zwischen Ab- und Aufbau Werte zwischen
5 und 45 mmol • l-1 erreicht werden (HUNGATE 1966). Zusätzlich abhängig ist die zu
86 Diskussion
erreichende NH3-N-Konzentration von der zur Verfügung stehenden Energie und
dem Kohlenhydratgehalt des Substrats (TILLMAN 1969; CARRO u. MILLER 1999;
BOGUHN et al. 2006).
Bei der Fermentation der Maisvarianten ergaben sich NH3-N-Konzentrationen
zwischen 3,0 und 4,7 mmol • l-1 (Abbildung 3.9). Die Untersuchungen von Proben
aus anderen RUSITEC-Versuchen mit Maissilage als alleinigem Substrat zeigten
NH3-N-Konzentrationen von 5,4-5,8 mmol • l-1 (HILDEBRAND et al. 2010; JALČ et al.
2010). Damit liegen die in diesen Versuchen erzielten Werte in einem vergleichbaren
Bereich.
4.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz
Die Verdaulichkeit der organischen Substanz (oS) der Maisvarianten betrug bei
Inkubation von 48 h im Fermenter zwischen 39% und 52% (Abbildung 3.10). Zwar
haben unter anderem die Maissorte und der Erntezeitpunkt der Maispflanzen sowie
die Zusammensetzung der Kohlenhydratfraktion und der Rfe-Gehalt einen Einfluss
auf die Verdaulichkeit des Substrats (CYMBALUK et al. 1973; DANLEY u. VETTER 1973;
JENKINS u. FOTOUHI 1990; AKBAR et al. 2002), doch wurden in verschiedenen
RUSITEC-Versuchen vergleichbare Werte erzielt. So ergaben sich bei Fermentation
von Maisstroh und -körnern bzw. Maissilage Verdaulichkeiten der oS von 53,5%
(KLEVENHUSEN et al. 2009) bzw. 39-41% (HILDEBRAND et al. 2010). In
Fütterungsversuchen, bei denen Rinder mit Rationen mit hohem Maisanteil versorgt
wurden, wurden ruminale Verdaulichkeiten der oS von 42-56% festgestellt
(PLASCENCIA u. ZINN 1996; OWENS et al. 2009). Damit sind die in diesen Versuchen
ermittelten Verdaulichkeiten der oS in Übereinstimmung mit Werten anderer In-vitro-
Untersuchungen und In-vivo-Studien bei Einsatz vergleichbarer Substrate.
Diskussion 87
4.2.7 Anzahl der Protozoa
Die Zahl der Protozoa nahm mit der Dauer des Versuchs ab. Von durchschnittlich
168 • 103 Protozoa pro ml Pansenflüssigkeit in der Nativprobe sanken die Protozoa-
Konzentrationen zunächst auf 45-58 • 103 pro ml Fermenterflüssigkeit an Tag 1 ab
und blieben bis zum Versuchsende konstant bei Werten von 7-14 • 103 Protozoa pro
ml Fermenterflüssigkeit (Abbildung 3.11).
In vivo wurden abhängig von der verfütterten Ration Protozoa-Konzentrationen von
100-900 • 103 pro ml Panseninhalt nachgewiesen (HUNGATE 1960; HUNGATE et al.
1964; MICHALOWSKI 1975; DEHORITY 1984; MICHALOWSKI et al. 1986). So liegt der
Nativwert dieser Studie im erwarteten Bereich (Abbildung 3.11 Nativ).
Die Beobachtung abnehmender Protozoa-Konzentrationen in In-vitro-
Versuchsansätzen wurde vielfach wiederholt (SLYTER et al. 1964; SLYTER u. PUTNAM
1967; CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977; CRAWFORD et al. 1980; PREVOT et al.
1994; CARRO et al. 1995; MANSFIELD et al. 1995; RYMER u. GIVENS 2002;
KLEVENHUSEN et al. 2009; MOUMEN et al. 2009; MARTINEZ et al. 2010b). Trotzdem
wurden die Schwierigkeiten bei der Etablierung hoher Protozoa-Zahlen in In-vitro-
Ansätzen bis heute nicht gelöst. Mögliche Gründe für die abnehmenden Protozoa-
Konzentrationen im RUSITEC wären zum einen längere Reproduktionszeiten der
Protozoa im Verhältnis zu Retentionszeiten der Partikel im Fermenter (CZERKAWSKI u.
BRECKENRIDGE 1977; CRAWFORD et al. 1980). Zum anderen könnten zu engmaschige
Nylonbeutel ein mechanisches Hindernis für die Protozoa darstellen, um die Partikel
zu erreichen (CARRO et al. 1995).
Wie auch von SLYTER u. PUTNAM (1967) beschrieben, verblieben die Protozoa-
Konzentrationen in der vorliegenden Studie nach einer Anpassungsphase bis
Versuchsende kontinuierlich auf einem niedrigen Niveau. Dieser steady state spricht
für konstante Bedingungen im System.
88 Diskussion
4.2.8 Abschließende Beurteilung der RUSITEC-Versuche
Die RUSITEC-Methode wurde ursprünglich entwickelt, um Prozesse der ruminalen
Fermentation in kontrollierten Bedingungen unabhängig von Futteraufnahme,
Speichelproduktion und individueller mikrobieller Gemeinschaft eines Wirtstiers
simulieren und untersuchen zu können (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977). Die
Rumen-Simulationstechnik wurde in mehreren Arbeitsgruppen erfolgreich etabliert
und für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Substrate oder einzelner
Substanzen auf die Fermentation und die mikrobielle Population eingesetzt (CARRO
u. MILLER 1999; DOHME et al. 2000; BOGUHN et al. 2008; MARTINEZ et al. 2010a;
MARTINEZ et al. 2010b). Die erfolgreiche Simulation der ruminalen Bedingungen ist
die Voraussetzung der Beurteilung der Fermentationsmuster unterschiedlicher
Substrate.
Die in der vorliegenden Studie erhobenen Fermentationsparameter wiesen nach
Anpassung während der Äquilibrierungsphase konstante Werte auf, die sowohl im
physiologischen Rahmen lagen als auch mit anderen In-vitro-Versuchen vergleichbar
waren. Auf der Grundlage der erfolgreichen Simulation der ruminalen Fermentation
kann die Interpretation der Einflüsse der Klimabehandlung der Maispflanzen auf die
Fermentationsparameter und die mikrobielle Gemeinschaft erfolgen.
Diskussion 89
4.3 Effekte der Klimaveränderungen
In diesem Kapitel werden die Auswirkungen der Klimabehandlung auf die
Untersuchungsparameter der RUSITEC-Versuche beurteilt.
4.3.1 pH-Werte
In V1 ergab die Messung der pH-Werte in der Fermenterflüssigkeit an den Tagen 11
bis 13 signifikant höhere Werte bei Inkubation der beiden Maisvarianten mit
Trockenstressbehandlung verglichen mit den Werten der bewässerten Varianten
(Abbildung 3.1). Weder in V1 noch in V2 konnte ein Einfluss der CO2-Behandlung der
inkubierten Maispflanzen auf den pH-Wert in der Fermenterflüssigkeit festgestellt
werden (Abbildungen 3.1 und 3.12).
Der pH-Wert der Pansenflüssigkeit wird unter anderem bestimmt durch die
Zusammensetzung des aufgenommenen Substrats, dessen Beschaffenheit und der
Speichelproduktion des Wirtstiers, die wiederum mit der Rumination
zusammenhängt. Die Partikelgröße des Substrats hat wiederum einen Einfluss auf
die Futteraufnahme und die Rumination (JASTER u. MURPHY 1983; KRAUSE u. COMBS
2003). Mit abnehmender Ruminationsrate sinkt auch die Speichelproduktion. Der
Speichel des Wiederkäuers fungiert als Puffer für die während des mikrobiellen
Abbaus produzierten SCFA (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977). Wird die
Pansenflüssigkeit durch herabgesetzte Ruminationsrate mit zu wenig Puffer versorgt,
sinkt der pH-Wert (MAEKAWA et al. 2002; BEAUCHEMIN et al. 2008; DEVRIES et al.
2009). Darüber hinaus führen Futtermittel mit einem hohen Anteil leicht abbaubarer
Kohlenhydrate durch deren rasche Fermentation zu SCFA zu einer Abnahme des
pH-Wertes (BALCH u. ROWLAND 1957; SUTTON 1977; ALDRICH et al. 1993).
Ein Vorteil der RUSITEC-Methode ist es, dass sowohl die Substratzufuhr, die
Substratpartikelgröße als auch die Pufferzufuhr für alle Fermenter gleich sowie über
die Versuchsdauer kontrolliert und konstant eingesetzt werden können. Somit
90 Diskussion
können diese Faktoren als Varianzquelle für signifikant unterschiedliche pH-Werte
ausgeschlossen werden. So bleiben die Zusammensetzung des Substrats und die
Konzentrationen der Fermentationsprodukte als mögliche Gründe für die
Abweichungen.
Der Gehalt leicht verdaulicher Kohlenhydrate der Maisvarianten wurde in Form der
NfE-Fraktion bestimmt. Beide Trockenstressvarianten zeigten bei der Analyse
niedrigere NfE-Gehalte im Vergleich zu den bewässerten Varianten (Tabelle 3.1).
Allerdings ergab sich in V1 weder ein signifikanter Effekt der Maisvarianten auf die
Produktionsraten der SCFA noch auf die Verteilung der molaren Anteile
(Abbildungen 3.3 bis 3.5). Damit können die signifikanten Abweichungen der pH-
Werte nicht auf diese Faktoren zurückgeführt werden. Die höheren pH-Werte der
Fermenterflüssigkeit bei Inkubation der Trockenstressvarianten könnten allerdings
durch Unterschiede in der NH3-N-Konzentration hervorgerufen worden sein, da die
Inkubation der Trockenstressvarianten der Maispflanzen zu höheren
NH3-N-Konzentrationen in der Überlaufflüssigkeit im Vergleich zu den bewässerten
Varianten führte (Abbildung 3.9; siehe Kapitel 4.3.5).
Insgesamt lagen die pH-Werte aller Fermenter in einem Bereich zwischen 6,6 und
6,9 mit geringen Abweichungen und blieben darüber hinaus über die gesamte
Versuchsdauer in einem physiologischen Bereich.
4.3.2 Redoxpotentiale
Es konnte kein Einfluss der Behandlungen der Maispflanzen auf die Redoxpotentiale
in der Fermenterflüssigkeit bei Inkubation der verschiedenen Maisvarianten
festgestellt werden (Tabellen 3.3 und 3.14). Die Werte aller Maisvarianten
veränderten sich im Zuge der Anpassung an das neue Substrat und die In-vitro-
Bedingungen über die Versuchsdauer in gleicher Weise (Abbildungen 3.2 und 3.13).
Diskussion 91
4.3.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA
In V1 konnten keine signifikanten Einflüsse der Maisvarianten auf die
Produktionsraten und die molare Verteilung der SCFA festgestellt werden
(Abbildungen 3.3 bis 3.5). In Bezug auf das Acetat:Propionat-Verhältnis zeigte sich
lediglich eine Interaktion der Versuchsdauer und der Trockenstressbehandlung
(Tabelle 3.7). In V2 ergab die Messung der SCFA-Produktion an den Tagen 4 und 5
der Äquilibrierungsphase signifikant höhere Werte bei Inkubation der 550 ppm
CO2-Variante (Abbildung 3.14). An diesen Tagen konnte ebenfalls eine tendenziell
höhere Acetat-Produktion dieser Variante ermittelt werden (Abbildung 3.15a). Weder
die Propionat- und Butyratproduktion noch die molaren Anteile der SCFA zeigten
signifikante oder tendenzielle Unterschiede bei Inkubation der beiden CO2-Varianten
während der Äquilibrierungsphase (Abbildungen 3.15 b und c, 3.16).
Die Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA im Pansen und im
Fermenter sind abhängig von der Futteraufnahme und der Verweildauer der
Substratpartikel in der Gärkammer (CRAWFORD et al. 1980; CZERKAWSKI 1986;
BERGMAN 1990). Durch die Anwendung der RUSITEC-Methode kann sowohl die
Menge als auch die Verweildauer des Substrats überprüft und gesteuert werden.
Einen großen Einfluss üben auch die Rohnährstoffgehalte des Substrats aus
(CZERKAWSKI 1986; BERGMAN 1990). Setzt sich die Ration zu einem großen Anteil
aus leicht verdaulichen Nicht-Struktur-Kohlenhydraten (z.B. Stärke, Zucker und
Pektine) zusammen, so steigt die SCFA-Produktion (ALDRICH et al. 1993). Die
Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der für diese Studie verwendeten
Maispflanzen zeigte allerdings vergleichbare Konzentrationen von NfE, Rfa, NDF und
ADF der beiden in V2 fermentierten Varianten (Tabelle 3.1; A und B). Der NfE-Gehalt
der Variante B war sogar numerisch kleiner im Vergleich zu Variante A.
Ein signifikanter Unterschied bei Fermentation der CO2-Varianten ergab sich lediglich
während der Äquilibrierungsphase. Im Laufe dieser Anpassungsperiode adaptiert
sich die mikrobielle Pansenflora an das In-vitro-System. Es ist möglich, dass diese
Adaptation unterschiedlich effizient abgelaufen ist. Während der Versuchsphase und
damit nach Abschluss der Anpassung zeigte die CO2-Behandlung der Maispflanzen
92 Diskussion
keinen Einfluss auf die Produktionsraten der SCFA. Abschließend kann festgehalten
werden, dass eine erhöhte [CO2] und Trockenstress während des Aufwuchses von
Maisvarianten deren Fermentation bezogen auf die Produktionsraten und molaren
Anteile der SCFA nicht dauerhaft beeinflusst haben.
4.3.4 Fermentationsgase
Die Fermentation der vier Maisvarianten führte weder zu signifikanten Unterschieden
in der totalen Gasproduktion noch in den Anteilen von CO2 und CH4 an der
Gesamtproduktion (Abbildungen 3.7 und 3.8). Wie bereits für die Produktionsraten
der SCFA und deren molare Anteile während der Versuchsphase konnte kein
Einfluss einer erhöhten [CO2] oder Trockenstress festgestellt werden (Tabellen 3.8
und 3.9).
4.3.5 NH3-N-Konzentrationen
Die Messung der NH3-N-Konzentrationen in den Überläufen der Fermenter ergab
Werte von 3,8-4,7 mmol • l-1 (Abbildung 3.9). Die Inkubation der Maispflanzen mit
Trockenstressbehandlung führte zu signifikant höheren NH3-N-Konzentrationen im
Vergleich zur Fermentation der bewässerten Varianten. Zusätzlich zu dem Einfluss
der Bewässerung konnte ein Einfluss der CO2-Behandlung festgestellt werden. So
konnte in jeder Bewässerungsgruppe separat eine höhere NH3-N-Konzentration bei
Inkubation der 380 ppm CO2 Varianten gemessen werden (Tabelle 3.10).
Wie bereits erläutert, ergibt sich die NH3-N-Konzentration zum einen durch den
mikrobiellen Abbau von N-Verbindungen (endogen, diätetisch, mikrobiell) und zum
anderen durch die mikrobielle Proteinsynthese in der Fermenterflüssigkeit (Abbildung
4.2). Die Zufuhr von endogenen N-Verbindungen erfolgt im RUSITEC-Aufbau über
den Puffer und betrug für alle Behandlungen entsprechend 5 mmol NH4Cl • l-1 und
kann damit als Varianzquelle ausgeschlossen werden. Alle Fermenter wurden mit
der gleichen Substratmenge bezogen auf die TS versorgt. Allerdings zeigten die
Diskussion 93
inkubierten Maispflanzen Unterschiede in der Zusammensetzung der Rohnährstoffe
(Tabelle 3.1).
Aus In-vivo-Studien ist bekannt, dass die NH3-N-Konzentration in der
Pansenflüssigkeit besonders von der Menge des mit dem Futter aufgenommenen Rp
und dessen Abbaubarkeit abhängt (HUME et al. 1970; LENG u. NOLAN 1984). Für
Maisvariante C ergab sich der höchste Rp-Gehalt in der Messung der Rohnährstoffe
der Maispflanzen (Tabelle 3.1). Entsprechend erzielte die Fermentation dieser
Variante während der gesamten Versuchsdauer die höchste NH3-N-Konzentration
(Abbildung 3.9). Der Rp-Gehalt der Variante D war hingegen vergleichbar mit denen
der bewässerten Varianten A und B, obwohl sich bei Inkubation dieser Variante
ausgenommen an Tag 14 stets die zweithöchste NH3-N-Konzentration im Überlauf
ergab. Sowohl die Rp-Gehalte als auch die NH3-N-Konzentrationen der beiden
bewässerten Varianten waren vergleichbar, ausgenommen der Tage 13 und 14, an
denen Variante B eine signifikant geringere NH3-N-Konzentration zeigte
(Tabellen 3.1, 3.10 und Abbildung 3.9). Die signifikant abweichenden
NH3-N-Konzentrationen in den Überlaufflüssigkeiten können also nicht ausschließlich
mit unterschiedlichen Rp-Gehalten der fermentierten Maispflanzen erklärt werden.
Ein möglicher Faktor könnte die Abbaubarkeit des Rp der Maispflanzen gewesen
sein, die in der vorliegenden Arbeit allerdings nicht untersucht wurde. Es ist jedoch
ein negativer Zusammenhang zwischen dem Rfe-Gehalt im Substrat und der
Abbaubarrate der Proteinquellen aus Fütterungsversuchen mit Schafen und Rindern
bekannt (JENKINS u. FOTOUHI 1990; DOREAU et al. 1991). Auch in der vorliegenden
Arbeit zeigten die bewässerten Maisvarianten höhere Rfe-Gehalte in der TS und
erzielten bei Inkubation geringere NH3-N-Kozentrationen in der Überlaufflüssigkeit
verglichen mit den Trockenstressvarianten (Tabelle 3.1 und Abbildung 3.9). So
könnte eine höhere Abbaubarkeit der Rp der Trockenstressvarianten im Vergleich zu
den bewässerten Varianten angenommen werden.
Die mikrobielle Proteinsynthese als weiterer Einflussfaktor ist nicht nur vom Input an
N-Verbindungen abhängig, sondern auch von den zur Verfügung stehenden
Energiequellen (STERN u. HOOVER 1979; HOOVER u. STOKES 1991). Mithilfe einer
94 Diskussion
kontinuierlichen In-vitro-Methode ermittelten SATTER u. SLYTER (1974) für die
Inkubation maisbasierter Rationen eine maximale Effektivität der mikrobiellen
Proteinsynthese bei NH3-N-Konzentrationen zwischen 3 bis 5 mmol • l-1. In den
Versuchen zur vorliegenden Arbeit wurden dem System über den Puffer
kontinuierlich 5 mmol NH4Cl • l-1 zugeführt. Dass in allen Überlaufflüssigkeiten
NH3-N-Konzentrationen unter diesen 5 mmol • l-1 gemessen wurden, spricht für eine
genügende Energiezufuhr und zusätzlich für eine ausgeprägte mikrobielle
Proteinsynthese.
Die Abbaubarkeit der oS und der NDF sowie der Gehalt von leicht verdaulichen
Kohlenhydraten haben dementsprechend Einfluss auf die Effektivität der mikrobiellen
Proteinsynthese (STERN u. HOOVER 1979) und damit auf die NH3-N-Konzentration im
Überlauf. Über die mikrobielle Proteinsynthese und die Abbaubarkeit der
NDF-Fraktion liegen keine Werte vor. Die Verdaulichkeit der oS war allerdings
ausgenommen der Tage 7 und 8 größer für die bewässerten Varianten (Abbildung
3.10). Es ist möglich, dass durch eine größere Verdaulichkeit der oS der
bewässerten Varianten mehr Energie zur mikrobiellen Proteinsynthese zur
Verfügung stand. Das könnte zu einer gesteigerten mikrobiellen Proteinsynthese und
damit geringeren NH3-N-Kozentrationen in den Ansätzen der bewässerten Varianten
im Vergleich zur Inkubation der Trockenstressvarianten geführt haben.
Die Ursache der signifikant höheren NH3-N-Konzentrationen der Trockenstress-
sowie der 550 ppm CO2 Varianten konnte mit den zur Verfügung stehenden Daten
nicht abschließend geklärt werden.
4.3.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz
Die Analyse der Verdaulichkeit der oS der vier Maispflanzen zeigte ausgenommen
an den Tagen 7 und 8 höhere Werte für die bewässerten im Vergleich zu den
Trockenstressvarianten (Abbildung 3.10). An Tag 12 war die Verdaulichkeit der
Variante B signifikant größer als die der anderen Varianten. Für Variante B konnte
auch an Tag 13 die höchste Verdaulichkeit festgestellt werden, die allerdings nur im
Diskussion 95
Vergleich zum Wert von Variante D signifikant größer war (Abbildung 3.10).
Insgesamt ergab die drei-faktorielle Varianzanalyse einen signifikanten Einfluss der
Trockenstressbehandlung auf die Verdaulichkeit der oS der Maispflanzen
(Tabelle 3.11).
In einem Kooperationsprojekt wurden die von MANDERSCHEID et al. (2012)
angebauten Maispflanzen siliert und auf die In-Sacco-Abbaubarkeit der TS
untersucht (MEYER et al. 2009). Die Silagen der bewässerten Varianten zeigten
signifikant höhere In-Sacco-Abbaubarkeiten der TS im Vergleich zu den Silagen der
Trockenstressvarianten (MEYER et al. 2009). Dieses Ergebnis konnte in einer
weiteren Studie zur In-vitro-Verdaulichkeit von Maissilage reproduziert werden
(SIMSEK et al. 2011). Im Gegensatz dazu hatte die CO2-Behandlung der
Maispflanzen keinen Einfluss auf die Verdaulichkeit der oS, was ebenfalls für
Sudangras, ein C4-Gras, gezeigt werden konnte (AKIN et al. 1994; MEYER et al.
2009).
Die Verdaulichkeit der oS eines Substrats wird bestimmt durch dessen
Zusammensetzung an Rohnährstoffen und Detergentien-Fasern sowie durch dessen
Beschaffenheit. So hat die Partikelgröße eines Futtermittels einen Einfluss auf die
Futteraufnahme, die Ruminationsrate und die Verweildauer der Partikel im Fermenter
(CAMPLING u. FREER 1962; JASTER u. MURPHY 1983; MARTZ u. BELYEA 1986). Da
diese Faktoren im RUSITEC-System kontrolliert und einheitlich simuliert wurden,
haben der Rohnährstoffgehalt und die Zusammensetzung der Faserfraktion des
inkubierten Substrats eine größere Bedeutung in Bezug auf die Verdaulichkeit der
oS.
Die bewässerten Maispflanzen wiesen einen höheren Anteil leicht verdaulicher
Kohlenhydrate (NfE) im Vergleich zu den Trockenstressvarianten auf (Tabelle 3.1).
Die höhere Verdaulichkeit der oS dieser Varianten könnte damit einhergehen
(Abbildung 3.10). Neben der Größe des NfE-Anteils an der TS könnte allerdings
auch eine unterschiedliche Abbaubarkeit der Faserfraktion (Rfa, NDF, ADF), welche
nicht gemessen wurde, signifikante Unterschiede hervorgerufen haben. Des
Weiteren besteht eine negative Korrelation zwischen dem Lignin-Gehalt eines
96 Diskussion
Substrats und dessen ruminaler Verdaulichkeit (CYMBALUK et al. 1973; IDSO u. IDSO
2001). Die Untersuchung der für diese Arbeit verwendeten Maispflanzen auf ihren
Gehalt an ADL ergab für Variante D den höchsten Wert, während die drei anderen
Varianten vergleichbare ADL-Gehalte aufwiesen. Die signifikant geringeren
Verdaulichkeiten der oS der Trockenstressvarianten können damit nicht allein auf die
ADL-Gehalte der inkubierten Maispflanzen zurückgeführt werden.
GHANNOUM (2009) beschrieb eine abnehmende ruminale Verdaulichkeit von
Pflanzenmaterial als Folge von Trockenstress und vorzeitiger Alterung. Der zugrunde
liegende Mechanismus ist noch nicht bestimmt worden. Im Vergleich zu den
bewässerten Pflanzen zeigten die Pflanzen in den Trockenstressbereichen im
Feldversuch eine verfrühte Alterung und gerollte Blätter (MANDERSCHEID et al. 2012).
In Kombination führten die Veränderungen der Maispflanzen, hervorgerufen durch
Trockenstress unabhängig von der CO2-Behandlung, die sowohl den Habitus der
Pflanzen als auch deren Zusammensetzung an Rohnährstoffen betraf, zu einer
Abnahme der Verdaulichkeit der oS.
4.3.7 Anzahl der Protozoa
Die Protozoa-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit blieb nach der
Äquilibrierungsphase für alle Varianten konstant und zeigte keinen Einfluss der
Inkubation der mit CO2 und Trockenstress behandelten Maispflanzen (Abbildung
3.11 und Tabelle 3.12).
Diskussion 97
4.4 Beurteilung der Ergebnisse der SSCP-Analyse
Die SSCP-Analyse der Proben der Fermenterflüssigkeit wurde durchgeführt, um den
Einfluss der inkubierten Maisvarianten auf die mikrobielle Gemeinschaft zu
untersuchen. Die verwendeten Maispflanzen zeigten als Folge der Behandlung mit
erhöhter [CO2] und Trockenstress unterschiedliche Gehalte an Rohnährstoffen und
Detergentien-Faser-Fraktionen. In verschiedenen In-vitro-Ansätzen konnten mithilfe
der SSCP-Analyse qualitative Veränderungen der mikrobiellen Diversität durch
Fermentation unterschiedlicher Substrate erfolgreich nachgewiesen werden (BOGUHN
et al. 2008; RANILLA et al. 2009).
Die für die vorliegende Arbeit generierten Profile der Bacteria- und Archaea-
Domänen aus den Proben der Fermenterflüssigkeit zeigten homogene Muster
(Abbildungen 3.18 bis 3.21). Es konnten makroskopisch keine Banden identifiziert
werden, die entweder in einzelnen Spuren fehlen oder zusätzlich auftauchen. Mithilfe
der densitometrischen Untersuchung der SSCP-Profile war es dennoch möglich, eine
Clusteranalyse durchzuführen. Allerdings ergaben weder die Clusteranalysen noch
die statistische Auswertung der Ähnlichkeitsmatrizes einen signifikanten Einfluss der
Maisvarianten auf die SSCP-Profile und damit auf die mikrobielle Diversität (Tabellen
3.19 bis 3.22).
Bei den SSCP-Profilen des zweiten Versuchs kam es bei dem direkten Vergleich der
Spuren der Proben eines Fermenters der Tage 1 und 7 zu einer deutlichen
Clusterbildung entsprechend der Entnahmetage (Abbildungen 3.22 und 3.23).
Statistisch ließ sich dieser Effekt jedoch nicht bestätigen (Tabellen 3.23 und 3.24).
Die nicht-metrische zweidimensionale Skalierung der Ähnlichkeitsmatrizes zeigte
ebenfalls eine deutliche räumliche Trennung zwischen den Proben der
verschiedenen Entnahmetage. Jedoch war die Streuung der Proben insbesondere
des 7. Entnahmetags untereinander zum Teil größer als der Abstand zu den Proben
des ersten Entnahmetags (Abbildung 3.24a und b).
98 Diskussion
Die mikrobielle Gemeinschaft zeigte vergleichbar zu Ergebnissen anderer In-vitro-
Versuche eine Anpassung an die In-vitro-Bedingungen sowie an das neue Substrat
während der Äquilibrierungsphase (BRYANT u. BURKEY 1953; PREVOT et al. 1994;
BOGUHN et al. 2012). Die Adaptation erfolgte für alle Fermenter unabhängig von der
inkubierten Maisvariante.
Es ist möglich, dass Einflüsse des inkubierten Substrats auf die mikrobielle
Gemeinschaft mit der gewählten Methode nicht feststellbar waren. Quantitative
Veränderungen können mit der SSCP-Analyse nicht erfasst werden (DOHRMANN u.
TEBBE 2004). Zusätzlich kann die Interpretation einzelner Banden irreführend sein.
So können sich hinter einer Bande mehrere Spezies verbergen sowie der
ssDNA-Abschnitt einer Spezies mehrere Konformationen annehmen und so im
PAA-Gel mehrere Banden hervorrufen (SCHWIEGER u. TEBBE 1998; SCHMALENBERGER
u. TEBBE 2003; DOHRMANN u. TEBBE 2004; WITZIG et al. 2010). Zur Erhöhung der
Spezifität der ssDNA-Abschnitte wurde eine nested PCR eingesetzt (siehe Kapitel
2.5.6). Dabei wurden PCR-Produkte der 16S rRNA-Gene von über 400 bp
amplifiziert, die aufgrund ihrer Länge von DOHRMANN u. TEBBE (2004) als ausreichend
genaue Marker für die strukturelle Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft
bewertet wurden. Die Auflösung des PAA-Gels stellt eine weitere Limitierung der
Erfassung qualitativer Unterschiede der mikrobiellen Diversität dar (LOISEL et al.
2006).
Die gesammelten Daten lassen die Interpretation zu, dass die Veränderungen in der
Zusammensetzung der Maispflanzen aufgrund einer erhöhten [CO2] und
Trockenstress durch die dynamische Anpassungsfähigkeit der mikrobiellen
Gemeinschaft keinen dauerhaften Einfluss auf die ruminale mikrobielle Diversität
haben werden.
99
4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick
Eine erhöhte [CO2] und Trockenstress während der Aufwuchsphase von
Maispflanzen führte zu unterschiedlichen TS-, Gesamt- und Kornerträgen
(MANDERSCHEID et al. 2012) sowie zu veränderten Gehalten des Rp und der
Detergentien-Fasern der Pflanzen. Die Effekte durch Trockenstress waren dabei
ausgeprägter im Vergleich zu den Auswirkungen einer erhöhten [CO2].
Die Inkubation der vier unter verschiedenen klimatischen Bedingungen
aufgezogenen Maisvarianten zeigte lediglich geringe Auswirkungen auf die
Fermentationsparameter im In-vitro-Modell. Auf die Zusammensetzung der
mikrobiellen Gemeinschaft konnte kein gerichteter Einfluss festgestellt werden.
Signifikante Effekte der Maisvarianten auf die NH3-N-Konzentration und die
Verdaulichkeit der oS in vitro weisen allerdings auf einen Einfluss einer erhöhten
[CO2] und insbesondere von Trockenstress auf den Futterwert der Pflanzen hin. In
einem Kooperationsprojekt wurde Pflanzenmaterial der gleichen Ernte
(MANDERSCHEID et al. 2012) zunächst siliert und anschließend in einem
Fütterungsversuch eingesetzt (MEYER et al. 2009). Ein Vergleich der Ergebnisse des
Kooperationsprojektes mit den Daten der vorliegenden Arbeit lässt darauf schließen,
dass die Einflüsse von Trockenstress auf die Verdaulichkeit von Maispflanzen auch
nach Silierung bestehen bleiben. MANDERSCHEID et al. (2012) stellten bei
Trockenstressbehandlung eine verfrühte Alterung der Maispflanzen fest. GHANNOUM
(2009) beschrieb einen Zusammenhang einer verfrühten Alterung von C4-Pflanzen
durch Trockenstress und einer Abnahme der Verdaulichkeit, die auch in dieser Arbeit
nachvollziehbar war. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt weiterhin unklar.
Eine Überprüfung der mikrobiellen Proteinsyntheseraten sowie der Verdaulichkeiten
der Fraktionen Rp, NDF und ADF des Pflanzenmaterials sollte die Interpretation und
die Abschätzung der Auswirkungen des Klimawandels auf die ruminalen
Fermentationsparameter erleichtern.
100 Schlussfolgerungen und Ausblick
Aufgrund ihres hohen Adaptationsvermögens scheint die mikrobielle Gemeinschaft
die Anpassung an Pflanzenmaterial, das durch erhöhte [CO2] oder Trockenstress
während der Aufwuchsphase beeinflusst wurde, ohne signifikante Einschränkungen
der Fermentationsvorgänge vollziehen zu können. Eine Bestimmung quantitativer
Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaft könnte darüber hinaus Aufschluss
über diese Adaptationsvorgänge liefern.
101
5 Zusammenfassung
Birgit Eva Meibaum
Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels auf die ruminalen Fermentationsparameter von Maispflanzen sowie die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in vitro.
Im Zuge des Klimawandels werden zukünftig die Kohlendioxid-Konzentration in der
Atmosphäre ([CO2]) ansteigen und die Trockenperioden während der
Sommermonate zunehmen. Die Auswirkungen dieser Klimaänderungen auf den
Stoffwechsel von Nutzpflanzen werden intensiv untersucht. Für die bedeutende Nutz-
und C4-Pflanze Mais wurden Veränderungen in Photosyntheseleistung sowie
Trockensubstanz (TS)-, Korn- und Gesamtertrag festgestellt, die zu unterschied-
lichen Zusammensetzungen der Pflanzen bezogen auf die Rohnährstoffe und
Detergentien-Fasern an der TS führen.
Mithilfe der Rumen-Simulationstechnik (RUSITEC) wurde in dieser Arbeit der
Einfluss von Maispflanzen (Zea mays L., cv. Romario), die während der
Aufwuchsphase einer erhöhten [CO2] (550 ppm CO2) und Trockenstress ausgesetzt
waren, auf die ruminalen Fermentationsparameter und die Zusammensetzung der
mikrobiellen Gemeinschaft in vitro untersucht. Es standen vier definierte
Maisvarianten zur Verfügung, die pro Variante in drei RUSITEC-Fermentern inkubiert
wurden: (A) 380 ppm CO2; (B) 550 ppm CO2; (C) 380 ppm CO2 + Trockenstress; (D)
550 ppm CO2 + Trockenstress. In einem zweiten Versuch wurden speziell die
Veränderungen der Produktionsraten und der molaren Anteile der kurzkettigen
Fettsäuren (SCFA) während der Äquilibrierungsphase bei Inkubation der beiden
bewässerten Varianten (A und B) untersucht.
Es wurden charakteristische Ergebnisse für die In-vitro-Inkubation maisbasierter
Substrate festgestellt: Sinkende molare Acetatanteile, steigende molare Propionat-,
Butyrat- und Isovalerat-Anteile sowie sinkende Protozoa-Konzentrationen
insbesondere während der Äquilibrierungsphase.
102 Zusammenfassung
Allerdings konnten auch Einflüsse der Maisvarianten gezeigt werden. Die Inkubation
der 550 ppm CO2 Varianten (B und D) ergab im Vergleich zu den 380 ppm CO2
Varianten (A und C) höhere Ammoniak (NH3)-N-Konzentrationen (p<0,05). Die
Fermentation der Trockenstressvarianten (C und D) führte zu höheren pH-Werten
(p<0,01) und NH3-N-Konzentrationen (p<0,001) sowie zu geringeren
Verdaulichkeiten der oS (p<0,05). Während der Äquilibrierungsphase konnten an
zwei Tagen höhere SCFA- (p<0,05) und tendenziell höhere Acetat-Produktionsraten
(p<0,1) der Variante B im Vergleich zu Variante A festgestellt werden. Im Gegensatz
dazu konnte während der Versuchsphase kein Effekt der Maisvarianten auf die
Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA, die Redoxpotentiale, die
Produktion oder die Anteile der Fermentationsgase sowie die Anzahl der Protozoa
gezeigt werden. Ferner ergab die Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-
Analyse keinen signifikanten Einfluss der Maisvarianten auf die Zusammensetzung
der mikrobiellen Gemeinschaft.
Die Inkubation der vier unter verschiedenen klimatischen Bedingungen
aufgezogenen Maispflanzen zeigte lediglich geringe Auswirkungen auf die
Fermentationsparameter im In-vitro-Modell. Ein Grund dafür könnte das große
Adaptationsvermögen der ruminalen mikrobiellen Gemeinschaft sein. Allerdings
könnten die signifikanten Einflüsse auf die NH3-N-Konzentration und die
Verdaulichkeit der oS in vitro auf einen veränderten Futterwert der Maisvarianten
hinweisen.
Schlagwörter: Klimawandel, C4-Pflanzen, RUSITEC, SSCP
103
6 Summary
Birgit Eva Meibaum
Study on the impact of climate changes on rumen fermentation parameters of maize plants and the microbial diversity in vitro.
In response to climate changes CO2-concentrations in the atmosphere ([CO2]) will
rise and drought stress during summer months will increase. The influence of climate
changes on crop plant metabolism is studied intensively. For maize, an important
C4-plant and agricultural crop, changes in photosynthesis rate and dry matter (DM),
kernel and total yield were observed, resulting in different crude nutrient and
detergent fibre concentrations in relation to DM.
In this study the influence of maize plants growing under elevated [CO2] (550 ppm)
and drought stress on rumen fermentation patterns, and microbial diversity in vitro
was analyzed applying the rumen simulation technique (RUSITEC). Four defined
maize variants were available to incubate in three RUSITEC-fermenters,
respectively: (A) 380 ppm CO2; (B) 550 ppm CO2; (C) 380 ppm CO2 + drought stress;
(D) 550 ppm CO2 + drought stress. In a second experiment only the well-watered
variants (A and B) were used to analyze the particular changes in production rates
and molar percentages of short chain fatty acids (SCFA) during the initial
equilibration period of the in-vitro-system.
Typical results for in vitro incubation of maize based substrates were determined, as
decreased molar percentage of acetate, increased molar percentages of propionate,
butyrate, and iso-valerate, as well as decreased concentration of protozoa in the
course of equilibration period.
Nevertheless, significant influences of maize variants have been detected. Incubation
of 550 ppm CO2 variants (B and D) resulted in higher ammonia
(NH3)-N concentrations (p<0.05) in comparison to 380 ppm CO2 variants (A and C).
Fermentation of drought-stressed variants (C and D) entailed increased pH values
104 Summary
(p<0.01) and NH3-N concentrations (p<0.001) along with decreased digestibilities of
organic matter (p<0.05). On two days during equilibration period variant B showed
higher SCFA (p<0.05) and a tendency to increased acetate production rates (p<0.1)
compared to variant A. In contrast, there was no effect of maize variants determined
on redox potentials, productions rates and molar percentages of SCFA, productions
rates and composition of fermentations gases, and concentration of protozoa during
the experimental period. Furthermore, the single strand conformation polymorphism
(SSCP)-analysis showed no significant influence of maize variants on microbial
diversity.
The incubation of maize variants grown under different climatic conditions showed
only minor influence on fermentation patterns in vitro. The reason for these findings
might have been the pronounced adaptation capability of the rumen microbial
community. Though, the significant effect on NH3-N concentration and digestibility of
organic matter in vitro might suggest an alteration in nutritional value of maize plants.
Keywords: climate change, C4-plant, RUSITEC, SSCP
105
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121
8 Anhang
8.1 Verwendete Lösungen
Tabelle 8.1: Aufzählung der Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen
Lösungen Zusammensetzung
0,9%ige NaCl-Lösung
Natriumchlorid 9 g
0,8%iges Agarose-Gel
Agarose 0,8 g ad 100 ml 1x TAE-Puffer Lösen unter Aufkochen
1%iges Agarose-Gel
Agarose 1 g ad 100 ml 1x TAE-Puffer Lösen unter Aufkochen
APS-Lösung (40%)
Ammoniumperoxodisulfat 0,4 g ad 1000 μl Aqua bidest.
Bind Silane Lösung
Ethanol (96%) 5 ml Essigsäure (96%) 50 μl PlusOne Bind Silane 50 μl
Bromphenolblau-Lösung (2,5%)
Bromphenolblau 0,05 g ad 2000 μl autoklaviertes Aqua bidest.
CTAB-Lösung (10%)
Cetyltrimethylammoniumbromid 20 g Natriumchlorid (4 M) 35 ml (0,7 M) ad 200 ml Aqua bidest. 5 h verrühren, autoklavieren
Entwicklerlösung
Natriumcarbonat-Dehydrat 33,75 g ad 550 ml Aqua bidest. Formaldehyd (37%) 1,2 ml Natriumthiosulfat (0,2%) 0,6 ml ad 600 ml Aqua bidest.
122 Anhang
Essigsäure (10%)
Essigsäure (96%) 52 ml ad 500 ml Aqua bidest.
Ethanol (80%)
Ethanol (99,8%) 40 ml ad 50 ml Aqua bidest.
Ethidiumbromid-Lösung
Ethidiumbromid (0,5%) 5 Tropfen in 500 ml 1x TAE-Puffer
Lysozym-Lösung (100 mg ml-1)
Lysozym 100 mg ad 1000 μl Aqua bidest.
Methylgrün-Lösung
Methylgrün 0,6 g Natriumchlorid 8 g Formaldehyd (37,7%) 92,8 ml ad 1000 ml Aqua bidest.
NaCl (4 M)
Natriumchlorid 58,44 g ad 250 ml autoklaviertes Aqua bidest.
Na2EDTA-Lösung (0,5 M)
Titriplex III EDTA 37,22 g NaOH-Plätzchen 4 g ad 200 ml Aqua bidest. pH-Wert auf 8,0 einstellen
Natriumthiosulfat (0,2%)
Natriumthiosulfat 0,2 g ad 100 ml Aqua bidest.
Polyacrylamid (PAA)-Gel (0,625%ig)
MDE®-Gel Solution 7,8 ml 10x TBE 2,5 ml Aqua dest. 14,7 ml TEMED 10 μl APS (40%) 25 μl
Proteinase K-Lösung (20 mg ml-1)
Proteinase K 20 mg ad 1000 μl autoklaviertes Aqua bidest.
SDS-Lösung
Natriumdodecylsulfat 20 g ad 100 ml Aqua bidest.
Silbernitrat-Lösung
Silbernitrat 0,5 g Formaldehyd (37%) 0,75 ml ad 500 ml Aqua bidest.
Anhang 123
SSCP-Ladepuffer
Formamid 950 μl NaOH (1 M) 10 μl Bromphenolblau (2,5%) 10 μl
TAE-Puffer (50x)
Trizma® Base 242 g Eisessig 57,1 ml Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 100 ml ad 1000 ml autoklaviertes Aqua bidest.
TAE-Puffer (1x)
TAE-Puffer (50x) 1:50 mit autoklaviertem Aqua bidest. verdünnt
TBE-Puffer (10x)
Trizma® Base 108 g (0,89 M) Borsäure 55 ml (0,89 M) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 40 ml ad 1000 ml autoklaviertes Aqua bidest.
TBE-Puffer (1x)
TBE-Puffer (10x) 1:10 mit autoklaviertem Aqua bidest. verdünnt
TE-Puffer
Tris-HCl (1 M bei pH 8,0) 1 ml (10 mM) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 0,2 ml (1 mM) ad 100 ml autoklaviertes Aqua bidest.
TEN-Puffer (2x)
Tris-HCl (1 M bei pH 8,0) 2,5 ml (10 mM) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 5 ml (10 mM) NaCl (4 M) 9,375 ml (150 mM) ad 250 ml autoklaviertes Aqua bidest.
Tris-HCl (1 M)
Trizma® Base 24,22 g HCl (32%) 8 ml ad 200 ml Aqua bidest. pH-Wert auf 8,0 einstellen
124 Anhang
8.2 Eingesetzte Chemikalien
Tabelle 8.2: Aufzählung der eingesetzten Chemikalien
Produkt Hersteller
100 bp DNA Ladder New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt
Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Ameisensäure (98-100%; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Ammoniumacetat Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
Ammoniumchlorid (NH4Cl; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
APS (Ammoniumperoxodisulfat ≥ 98%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Borsäure Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
Bromphenolblau (Natriumsalz, reinst) Serva GmbH, D-69115 Heidelberg
CaCl2 • 2 H2O (Calciumchlorid-Dihydrat; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
dNTPs (pH 7,0) Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Eisessig (100%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Essigsäure (96%) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Ethanol (≥ 99,8%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Ethidiumbromid (0,5%) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
Formaldehyd (37,7%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
Formaldehyd (37%) zur Desinfektion AppliChem GmbH, D-64291 Darmstadt
Formamid Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Glycerol (99%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
HCl (konzentrierte Salzsäure, 32%, reinst) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
HotStarTaq DNA Polymerase (5 U • μl-1) Quiagen GmbH, D-40724 Hilden
Isopropanol Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
KCl (Kaliumchlorid; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
λ-Exonuklease (5000 U ml-1) New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt
λ-Exonuklease-Puffer (10x) New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt
Anhang 125
λ-Hind III Marker Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Lysozym Serva-Aldrich, D-69115 Heidelberg
MassRulerTM DNA Ladder Mix Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
MDE®-Gel Solution Biozym, D-31840 Hessisch Oldendorf
Methylgrün Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
MgCl2 • 6 H2O (Magnesiumchlorid-Hexahydrat, p.a.)
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
MinElute PCR Purification Kit Quiagen GmbH, D-40724 Hilden
NaCl (p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Na2HPO4 • 12 H2O (Dinatriumhydrogen-phosphat-Dodecahydrat, kristallin, reinst)
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
NaH2PO4 • H2O (Natriumdihydrogen-phosphat-Monohydrat, p.a.)
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat, p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
NaOH (Natriumhydroxid, 1 M) AppliChem GmbH, D-64291 Darmstadt
NaOH-Plätzchen Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
Natriumthiosulfat (Na2S2O3 • 5 H2O, 99,5%, p.a.)
Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
PCR-Puffer (10x) Quiagen GmbH, D-40724 Hilden
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
PlusOne Bind Silane Amersham Biosciences GmbH, D-79111 Freiburg
PlusOne Repel Silane Amersham Biosciences GmbH, D-79111 Freiburg
Proteinase K Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
QIAquick PCR Purification Kit Quiagen GmbH, D-40724 Hilden
RNase A (10 mg • ml-1) Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
SDS (Natriumdodecylsulfat) Serva GmbH, D-69115 Heidelberg
Silbernitrat Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe
TEMED (N,N,N’,N‘- Tetramethylethylen-diamin)
Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
Titriplex III EDTA (Dinatriumsalz-Dihydrat, p.a.)
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Trizma® Base (99,9%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim
126 Anhang
8.3 Rohdaten der RUSITEC-Versuche
8.3.1 Rohdaten in V1
Tabelle 8.3: pH-Werte in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Äqu
ilibri
eru
ng
1 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,8
2 6,8 6,7 6,7 6,6 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7 6,8 6,9
3 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8
4 6,7 6,6 6,8 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,7 6,8 6,7
5 6,7 6,6 6,8 6,6 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7
6 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7
Vers
uchsphase
7 6,7 6,7 6,7 6,6 6,8 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7
8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,7 6,7
9 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,7 6,7
10 6,8 6,6 6,7 6,8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8
11 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,8
12 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7
13 6,8 6,7 6,7 6,7 6,6 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7
14 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8
Anhang 127
Tabelle 8.4: Redoxpotentiale [mV] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Äqu
ilibri
eru
ng
1 -244 -256 -253 -229 -244 -258 -249 -256 -255 -245 -254 -262
2 -212 -213 -217 -180 -218 -225 -208 -213 -222 -209 -198 -232
3 -153 -178 -184 -140 -173 -176 -177 -186 -190 -167 -167 -181
4 -139 -153 -169 -128 -146 -155 -146 -167 -162 -140 -145 -162
5 -134 -151 -157 -125 -152 -149 -139 -162 -156 -127 -147 -151
6 -133 -143 -138 -124 -142 -143 -143 -150 -152 -128 -135 -141
Vers
uchsphase
7 -130 -127 -121 -119 -130 -126 -140 -133 -145 -121 -124 -136
8 -110 -118 -132 -104 -126 -135 -128 -133 -130 -122 -125 -141
9 -118 -113 -127 -109 -129 -122 -141 -123 -126 -124 -120 -134
10 -115 -114 -123 -112 -119 -115 -123 -123 -120 -118 -113 -130
11 -112 -118 -123 -108 -117 -109 -121 -121 -115 -111 -112 -117
12 -101 -99 -110 -86 -102 -100 -116 -104 -109 -99 -88 -105
13 -102 -104 -109 -88 -103 -133 -126 -114 -113 -103 -97 -107
14 -109 -121 -114 -95 -111 -102 -106 -117 -111 -106 -99 -104
Tabelle 8.5: Überläufe [ml] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 630 690 720 580 660 690 755 710 780 700 710 630
8 630 650 680 650 650 650 750 710 770 690 675 570
9 650 680 680 575 650 650 660 690 760 710 680 590
10 650 640 550 640 650 625 620 690 750 620 690 610
11 640 675 600 570 660 650 690 710 770 630 675 620
12 640 650 600 590 650 640 660 700 730 655 660 590
13 670 680 620 590 625 630 680 710 760 670 705 590
14 610 630 620 600 610 640 670 670 660 590 675 610
128 Anhang
Tabelle 8.6: Produktionsraten der gesamten SCFA [mmol • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 29,9 33,5 34,5 34,2 28,6 36,5 31,5 36,3 40,2 29,7 31,0 32,6
8 29,8 31,0 32,8 38,1 29,9 32,6 33,9 32,8 39,5 29,8 29,0 29,1
9 29,7 34,6 33,4 30,2 30,4 31,3 28,1 33,0 35,8 30,0 30,5 30,8
10 28,0 33,7 31,7 30,1 32,9 33,0 28,9 34,4 35,3 26,5 31,6 31,2
11 30,8 34,2 33,7 26,8 34,2 35,2 29,8 34,3 35,6 28,4 29,7 30,0
12 30,2 32,3 31,5 31,4 33,8 32,7 28,2 32,2 33,3 31,4 27,6 29,2
13 29,6 33,4 31,7 30,1 34,6 33,4 28,6 32,3 32,6 31,1 30,4 28,3
14 28,9 27,7 31,9 29,1 33,7 34,6 29,8 32,6 30,3 27,6 27,6 28,8
Tabelle 8.7: Acetat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 13,9 15,5 15,8 15,5 13,7 17,1 14,9 16,9 18,3 13,9 14,7 14,7
8 14,0 14,0 15,3 17,5 14,6 14,8 15,6 15,4 17,8 13,7 13,7 13,3
9 14,2 16,0 15,2 14,2 15,1 14,1 12,8 15,4 16,5 14,1 14,5 14,4
10 13,0 16,6 14,3 13,9 16,1 14,4 12,6 16,1 15,8 12,4 14,9 14,4
11 14,6 16,5 14,7 11,7 16,1 15,6 13,5 16,0 15,8 13,5 14,0 13,6
12 13,9 14,6 13,2 13,1 15,5 14,3 12,5 15,2 14,5 14,5 12,6 12,9
13 13,4 14,2 13,0 13,0 15,7 14,0 12,7 15,4 13,8 14,1 13,5 12,7
14 12,7 12,2 13,1 12,5 15,0 14,0 13,4 15,0 12,2 12,3 12,0 12,9
Tabelle 8.8: Propionat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 10,1 11,5 12,0 11,3 10,0 12,2 11,0 12,7 14,7 10,5 10,6 11,2
8 10,1 11,0 11,6 12,9 10,1 11,1 11,8 11,5 14,4 10,9 9,9 9,8
9 9,74 12,5 11,9 10,2 9,80 10,7 9,42 11,5 12,7 10,7 10,3 10,4
10 8,96 11,3 11,2 10,1 10,9 11,6 9,60 11,9 12,7 9,59 10,6 10,4
11 10,1 11,9 11,7 9,05 12,0 12,2 9,92 12,1 13,1 10,5 10,1 10,3
12 10,7 11,4 11,0 11,0 12,6 11,6 9,49 11,2 12,2 11,7 9,6 10,6
13 10,7 12,7 11,5 10,5 13,0 12,2 9,81 11,4 11,8 11,8 10,8 10,4
14 11,3 10,3 12,1 10,2 12,6 13,3 10,7 12,0 11,6 11,0 10,0 10,2
Anhang 129
Tabelle 8.9: Butyrat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 5,9 6,2 6,3 6,9 4,4 6,7 5,2 6,3 6,8 5,3 5,3 6,3
8 5,7 5,5 5,6 7,3 4,7 6,4 5,9 5,5 6,7 5,2 4,9 5,7
9 5,8 5,6 5,8 5,4 5,1 6,1 5,4 5,6 6,2 5,2 5,2 5,8
10 6,1 5,3 5,6 5,6 5,5 6,5 6,2 5,8 6,2 4,5 5,6 6,1
11 6,1 5,4 6,7 5,7 5,5 6,9 6,0 5,6 6,2 4,4 5,1 5,6
12 5,6 5,7 6,6 6,8 5,1 6,3 5,8 5,3 6,1 4,8 4,9 5,3
13 5,0 5,7 6,6 6,1 5,2 6,6 5,5 4,9 6,3 4,6 5,4 4,9
14 4,4 4,5 6,3 5,9 5,5 6,6 5,2 5,1 5,9 3,9 5,0 5,1
Tabelle 8.10: Isovalerat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 -- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 -- 0,5 0,4
8 -- 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -- 0,5 0,3
9 -- 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,5 -- 0,5 0,3
10 -- 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 -- 0,5 0,3
11 -- 0,6 0,7 0,4 0,6 0,6 0,3 0,6 0,6 -- 0,5 0,4
12 -- 0,6 0,7 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5 0,4
13 0,4 0,6 0,6 0,5 0,6 0,6 0,5 0,6 0,7 0,5 0,6 0,4
14 0,5 0,7 0,6 0,5 0,7 0,7 0,6 0,6 0,7 0,6 0,6 0,5
-- unter Nachweisgrenze (0,3 mmol • l-1
)
Tabelle 8.11: Molare Acetat-Anteile [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 46,6 46,2 45,9 45,3 48,0 46,8 47,1 46,4 45,4 46,8 47,2 45,1
8 46,9 45,2 46,5 45,9 48,7 45,2 46,0 46,9 45,2 46,0 47,3 45,7
9 47,8 46,2 45,5 46,9 49,6 45,0 45,6 46,7 46,0 46,9 47,5 46,6
10 46,4 49,2 44,9 46,1 48,9 43,6 43,6 46,8 44,9 46,9 47,2 46,1
11 47,3 48,1 43,6 43,5 47,1 44,2 45,3 46,7 44,3 47,4 47,1 45,5
12 46,0 45,0 41,9 41,6 45,8 43,8 44,2 47,2 43,4 46,1 45,7 44,2
13 45,3 42,6 41,1 43,1 45,4 41,8 44,5 47,7 42,4 45,4 44,6 44,6
14 44,1 44,1 40,9 42,9 44,5 40,5 44,8 45,9 40,3 44,4 43,5 44,9
130 Anhang
Tabelle 8.12: Molare Propionat-Anteile [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 33,7 34,3 34,7 33,2 35,2 33,4 34,9 34,9 36,5 35,2 34,3 34,5
8 33,8 35,5 35,2 33,8 33,7 33,9 34,9 35,0 36,6 36,5 34,3 33,8
9 32,8 36,0 35,7 33,8 32,2 34,3 33,6 34,9 35,4 35,8 34,0 33,6
10 31,9 33,5 35,5 33,4 32,9 35,2 33,2 34,8 36,0 36,2 33,6 33,4
11 32,8 34,6 34,6 33,7 35,2 34,5 33,3 35,3 36,7 36,9 34,0 34,5
12 35,4 35,3 34,9 35,0 37,2 35,4 33,6 34,8 36,5 37,1 34,7 36,1
13 36,2 38,1 36,3 35,0 37,7 36,4 34,4 35,2 36,3 38,1 35,6 36,6
14 39,1 37,2 37,8 35,0 37,5 38,5 35,7 36,7 38,1 39,7 36,2 35,6
Tabelle 8.13: Molare Butyrat-Anteile [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 19,7 13,2 18,2 20,2 15,4 18,4 16,6 17,4 16,8 17,9 17,0 19,2
8 19,3 15,3 17,1 19,0 15,8 19,5 17,5 16,6 17,1 17,5 16,8 19,5
9 19,4 14,7 17,3 18,0 16,7 19,6 19,3 16,9 17,3 17,4 17,0 18,7
10 21,7 16,3 17,8 18,7 16,6 19,6 21,4 17,0 17,5 16,9 17,7 19,4
11 19,8 16,1 19,9 21,2 16,1 19,6 20,3 16,4 17,3 15,7 17,3 18,7
12 18,6 15,9 21,0 21,7 15,2 19,3 20,5 16,4 18,3 15,4 17,7 18,3
13 17,0 15,7 20,8 20,3 15,2 19,8 19,3 15,3 19,3 14,8 17,9 17,2
14 15,1 19,7 19,6 20,4 16,2 19,1 17,4 15,5 19,3 14,0 17,9 17,9
Tabelle 8.14: Molare Isovalerat-Anteile [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 -- 1,1 1,2 1,3 1,5 1,3 1,4 1,3 1,3 -- 1,5 1,2
8 -- 1,5 1,1 1,3 1,8 1,4 1,6 1,4 1,2 -- 1,6 1,0
9 -- 1,5 1,4 1,3 1,5 1,1 1,6 1,5 1,3 -- 1,6 1,0
10 -- 1,5 1,9 1,8 1,5 1,6 1,8 1,5 1,6 -- 1,5 1,1
11 -- 1,4 1,9 1,7 1,7 1,6 1,1 1,7 1,8 -- 1,7 1,3
12 -- 2,0 2,3 1,6 1,8 1,5 1,6 1,6 1,8 1,5 1,9 1,4
13 1,5 2,2 1,8 1,6 1,8 1,9 1,8 1,8 2,0 1,7 2,0 1,5
14 1,8 2,5 1,7 1,7 1,9 1,9 2,1 1,9 2,4 2,0 2,3 1,7
-- unter Nachweisgrenze (0,3 mmol • l-1
)
Anhang 131
Tabelle 8.15: Acetat:Propionat-Verhältnisse in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1
8 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1
9 1,5:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,5:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1
10 1,5:1 1,5:1 1,3:1 1,4:1 1,5:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1
11 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1
12 1,3:1 1,3:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,2:1
13 1,3:1 1,1:1 1,1:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,2:1
14 1,1:1 1,2:1 1,1:1 1,2:1 1,2:1 1,1:1 1,3:1 1,3:1 1,1:1 1,1:1 1,2:1 1,3:1
Tabelle 8.16: Produktionsraten der Fermentationsgase [ml • Tag-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 203 427 354 199 137 331 366 212 116 333 321 356
8 255 395 281 311 348 326 452 208 352 291 240 345
9 288 497 317 342 416 384 296 307 232 162 310 372
10 311 442 322 287 421 232 394 277 322 140 329 349
11 247 460 332 431 434 373 305 159 311 120 256 357
12 441 422 292 396 433 337 334 222 304 159 242 327
13 211 361 278 394 467 190 332 264 280 94 277 281
14 247 309 285 352 362 159 382 127 146 189 257 297
Tabelle 8.17: CO2-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 80,6 78,2 73,6 79,2 80,4 80,3 79,2 74,1 71,2 76,6 73,2 77,4
8 79,6 79,2 73,3 79,3 79,1 80,0 78,6 73,1 71,7 78,5 72,6 78,1
9 77,7 78,0 73,4 79,3 77,4 80,8 78,8 73,8 70,3 77,9 72,5 78,3
10 79,9 77,5 74,4 79,9 77,7 81,0 80,4 74,1 72,3 79,7 72,4 78,4
11 79,9 77,8 73,8 80,4 78,2 80,3 79,2 73,2 72,2 79,3 73,6 78,7
12 80,2 79,7 75,8 80,6 79,8 81,3 80,8 73,9 72,6 80,2 75,0 80,6
13 81,4 81,4 77,0 80,8 79,7 81,9 81,0 74,4 73,4 81,1 74,4 79,6
14 84,3 80,6 76,8 82,0 79,7 84,4 81,5 75,3 75,5 82,8 76,2 81,3
132 Anhang
Tabelle 8.18: CH4-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%]in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 19,4 21,8 26,4 20,8 19,7 19,7 20,8 25,9 28,8 23,4 26,8 22,6
8 20,5 20,8 26,7 20,7 20,9 20,0 21,4 26,9 28,3 21,5 27,5 21,9
9 22,3 22,0 26,7 20,7 22,6 19,2 21,2 26,2 29,8 22,1 27,5 21,7
10 20,1 22,5 25,7 20,2 22,3 19,0 19,6 25,9 27,7 20,3 27,6 21,6
11 20,1 22,2 26,2 19,6 21,8 19,8 20,8 26,8 27,8 20,7 26,4 21,3
12 19,8 20,3 24,3 19,4 20,2 18,7 19,2 26,2 27,4 19,8 25,0 19,4
13 18,6 18,7 23,0 19,2 20,3 18,1 19,0 25,6 26,6 18,9 25,7 20,4
14 15,7 19,5 23,2 18,0 20,3 15,6 18,5 24,7 24,5 17,2 23,8 18,7
Tabelle 8.19: Luftdruck [hPa] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033
8 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033
9 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031
10 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034
11 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037
12 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037
13 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033
14 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015
Tabelle 8.20: Temperatur [°C] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
8 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0
9 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
10 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0
11 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
12 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
13 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
14 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5
Anhang 133
Tabelle 8.21: NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1
] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 3,9 4,4 4,2 3,5 3,8 4,0 4,5 5,0 4,5 4,0 4,5 4,4
8 3,6 3,9 4,2 3,6 3,6 4,2 4,4 4,9 4,1 4,0 4,3 4,5
9 3,8 3,4 4,0 3,9 3,4 4,0 4,8 4,6 4,4 4,1 4,2 4,6
10 3,8 3,5 3,9 4,1 3,4 3,5 4,5 4,2 4,3 3,9 4,1 4,8
11 2,9 3,7 4,0 3,6 3,4 3,4 4,4 4,5 4,1 3,6 4,4 4,5
12 3,4 3,9 4,1 3,4 3,0 3,4 4,5 3,9 4,1 3,5 4,3 3,9
13 3,8 3,4 3,5 3,2 2,7 3,1 4,3 4,3 4,0 3,6 3,9 3,9
14 3,6 3,8 3,4 3,2 2,9 3,2 4,0 4,2 3,9 3,5 3,6 3,6
Tabelle 8.22: Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Phase Tag A E I B F J C G K D H L
Vers
uchsphase
7 43,5 50,3 53,4 48,1 42,7 47,2 46,9 48,7 51,6 47,4 45,8 47,3
8 43,9 47,7 46,0 49,9 42,2 49,3 47,5 44,3 49,2 45,9 44,6 46,7
9 50,9 49,6 50,1 53,8 51,3 49,8 49,7 48,0 52,2 51,7 47,2 47,1
10 38,6 58,3 50,2 38,8 50,3 47,0 45,5 47,3 42,4 41,2 50,7 43,1
11 49,2 52,3 53,7 42,7 49,4 55,9 49,6 45,0 46,4 45,8 47,7 45,9
12 49,6 49,6 47,2 52,8 52,2 49,4 43,2 45,0 51,9 51,5 39,7 42,2
13 44,2 45,1 47,0 48,1 49,1 48,6 44,9 43,2 43,7 43,5 44,6 43,2
14 38,1 51,4 49,2 45,4 47,8 47,3 42,6 39,8 43,8 41,2 35,9 39,4
Tabelle 8.23: Anzahl der Protozoa [103 • ml
-1] in V1
380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress
550 ppm CO2 + Trockenstress
Tag A E I B F J C G K D H L
nativ 187 183 138
1 68,7 60,7 44,8 62,2 60,3 45,1 62,8 39,2 31,7 56,3 47,0 30,8
7 7,7 8,7 9,1 8,8 6,8 10,7 9,9 16,2 6,9 7,3 9,7 11,3
14 4,4 11,4 9,5 5,2 3,9 11,1 11,3 21,7 11,1 3,6 8,4 9,7
134 Anhang
8.3.2 Rohdaten in V2
Tabelle 8.24: pH-Werte in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F Ä
qu
ilibri
eru
ng
1 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7
2 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7
3 6,8 6,8 6,8 6,8 6,7 6,7
4 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8
5 6,8 6,8 6,8 6,9 6,8 6,7
6 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8
7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8
Tabelle 8.25: Redoxpotentiale [mV] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 -177 -189 -186 -171 -174 -183
2 -150 -159 -151 -138 -159 -152
3 -128 -128 -130 -113 -117 -123
4 -108 -113 -121 -91 -103 -107
5 -112 -105 -113 -115 -116 -108
6 -113 -101 -101 -107 -119 -99
7 -122 -120 -115 -111 -127 -122
Tabelle 8.26: Produktionsraten der gesamten SCFA [mmol • Tag-1
] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 47,9 46,2 51,1 50,6 54,4 48,8
2 36,9 38,6 38,1 36,9 35,3 36,6
3 33,2 35,4 34,0 35,1 36,5 34,4
4 30,3 33,5 32,5 35,9 35,2 35,1
5 31,5 31,9 32,2 34,8 33,9 32,7
6 32,6 28,2 31,7 31,4 32,4 33,4
7 32,9 29,8 29,8 30,8 33,6 34,1
Anhang 135
Tabelle 8.27: Acetat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 31,9 30,9 34,3 33,8 36,6 32,6
2 20,3 21,2 20,6 21,1 20,5 20,0
3 15,8 17,4 16,7 17,2 17,1 16,2
4 12,7 14,8 13,3 15,7 15,5 14,6
5 13,0 13,5 13,1 14,5 14,3 13,4
6 14,0 12,1 12,7 13,3 13,4 13,8
7 14,5 12,9 12,3 13,1 14,2 14,2
Tabelle 8.28: Propionat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 10,7 10,3 11,3 11,4 12,1 10,8
2 10,6 10,9 11,3 10,3 9,7 10,3
3 11,4 12,0 11,6 12,0 13,9 11,8
4 11,6 12,6 14,0 13,9 14,3 13,4
5 12,3 12,3 13,4 13,8 13,8 12,9
6 12,6 10,9 13,1 12,5 13,4 13,4
7 12,4 11,6 11,9 12,2 13,6 13,8
Tabelle 8.29: Butyrat-Produktionsraten [mmol • Tag-1
] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 5,4 5,0 5,5 5,4 5,6 5,4
2 6,0 6,5 6,2 5,6 5,1 6,3
3 6,1 6,1 5,8 5,9 5,5 6,4
4 6,0 6,1 5,2 6,4 5,5 7,1
5 6,2 6,1 5,8 6,5 5,8 6,5
6 6,1 5,3 5,9 5,6 5,6 6,2
7 6,1 5,3 5,7 5,5 5,7 6,2
136 Anhang
Tabelle 8.30: Molare Acetat-Anteile [%] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 66,5 66,8 67,2 66,7 67,4 66,9
2 54,9 55,1 54,0 57,1 58,1 54,8
3 47,4 49,2 49,0 48,9 46,9 47,1
4 42,0 44,3 40,8 43,7 43,9 41,5
5 41,2 42,3 40,5 41,6 42,2 40,8
6 42,8 42,8 40,2 42,2 41,5 41,2
7 43,9 43,3 41,1 42,5 42,4 41,6
Tabelle 8.31: Molare Propionat-Anteile [%] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 22,2 22,3 22,1 22,6 22,3 22,1
2 28,8 28,2 29,8 27,9 27,3 28,0
3 34,4 33,8 34,0 34,2 38,1 34,2
4 38,3 37,6 43,1 38,6 40,5 38,2
5 39,0 38,6 41,6 39,7 40,8 39,4
6 38,5 38,4 41,2 39,9 41,3 40,2
7 37,6 38,8 39,8 39,7 40,6 40,3
Tabelle 8.32: Molare Butyrat-Anteile [%] in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 11,3 10,9 10,7 10,7 10,3 11,0
2 16,3 16,7 16,2 15,1 14,5 17,2
3 18,2 17,1 17,0 16,8 15,0 18,7
4 19,7 18,1 16,1 17,7 15,6 20,3
5 19,8 19,0 17,9 18,7 17,0 19,8
6 18,7 18,8 18,6 17,8 17,2 18,6
7 18,5 17,9 19,1 17,8 17,0 18,1
Anhang 137
Tabelle 8.33: Acetat:Propionat-Verhältnisse in V2
380 ppm CO2 550 ppm CO2
Phase Tag A C E B D F
Äqu
ilibri
eru
ng
1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1
2 1,9:1 2,0:1 1,8:1 2,0:1 2,1:1 2,0:1
3 1,4:1 1,5:1 1,4:1 1,4:1 1,2:1 1,4:1
4 1,1:1 1,2:1 0,9:1 1,1:1 1,1:1 1,1:1
5 1,1:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1 1,0:1 1,0:1
6 1,1:1 1,1:1 1,0:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1
7 1,2:1 1,1:1 1,0:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1
139
9 Danksagung
Zum Gelingen dieser Arbeit haben viele Personen beigetragen, denen ich an dieser Stelle meinen Dank ausdrücken möchte:
Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die Überlassung des interessanten Themas, die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Betreuung dieser Arbeit.
Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder für die Unterstützung bei Vorbereitung und Präsentation von Postern und Vorträgen.
Frau Dr. Susanne Riede für die Einarbeitung in die RUSITEC- und SSCP-Thematik sowie die engagierte Betreuung und das jederzeit offene Ohr.
Frau Dr. Mirja Wilkens und Frau Imke Cohrs für die Einweisung in SPSS.
Herrn Dr. Remy Manderscheid vom Institut für Biodiversität des vTIs in Braunschweig für die Bereitstellung des Pflanzenmaterials und die enge Zusammenarbeit an dem Artikel.
Marion Burmester, Kerstin Kiri, Marion Loh und Sandra Finke für ungezählte Liter Puffer und die große Unterstützung bei der Probenanalyse sowie Klaus Grunert und Dirk Voigtländer für ihre Hilfsbereitschaft während der RUSITEC-Versuche.
Yvonne Armbrecht und Michael Rohde für Rat und Tat im Stall und den Kaffee.
Den besten Kollegen der Welt für die hervorragende Arbeits- und Pausenatmosphäre. Vielen Dank an Susi, Steffi und Hannah für das Korrekturlesen und meiner Büromitbewohnerin Imke für die schöne Zeit auch in Bautzen. Ich wünsche Euch alles Gute.
Meiner Tante Christa für das sorgfältige Korrigieren der Arbeit.
Meinem Bruder Dr. Martin Rehberg für seine Unterstützung und die vielen Soforthilfen während der Entstehung des Manuskripts trotz stressiger Zeiten und weiter Entfernung.
Meinen Eltern für den Rückhalt, die wiederholten Versicherungen, dass mir der Himmel nicht auf den Kopf fallen wird, und die nicht abreißende Versorgung mit Suppe.
Meinem Jörn!