tinjauan pustaka
DESCRIPTION
Tinjauan Pustaka madu paliasaTRANSCRIPT
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Manusia senantiasa terpajan (exposed) logam berat dalam lingkungan
hidupnya Dilingkungan yang kadar logam beratnya cukup tinggi kontaminasi
dalam makanan dan air dapat menyebabkan keracunan
Logam berat tidak mengalami metabolisme tetap berada dalam tubuh
dan menyebabkan efek toksik dengan cara bergabung dengan suatu atau
beberapa gugus ligan yang esensial bagi fungsi fisiologis normal
Studi Bappenas pada tahun 2009 melaporkan bahwa Indonesia
menjadi negara dengan tingkat polusi udara tertinggi ketiga di dunia
Kontribusi gas buang kendaraan bermotor sebagai sumber polusi udara
terbesar mencapai 60-70 dibanding dengan industri yang hanya berkisar
antara 10-15 Sedangkan sisanya berasal dari rumah tangga pembakaran
sampah kebakaran hutanladang dan lain-lain Hal ini diakibatkan oleh laju
pertumbuhan kepemilikan kendaraan bermotor yang tinggi Sebagian besar
kendaraan bermotor itu menghasilkan emisi gas buang yang buruk baik
akibat perawatan yang kurang memadai ataupun dari penggunaan bahan
bakar dengan kualitas kurang baik (misalnya kadar timbal yang tinggi)
(tesisnya orang)
Udara yang telah tercemar timbal akan masuk ke dalam tubuh melalui
proses pernafasan Sebagian besar dari timbal yang terhirup pada saat
4
5
bernafas akan masuk ke dalam pembuluh darah paru-paru Tingkat
penyerapan itu sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel dari senyawa timbal
yang ada dan volume udara yang mampu dihirup pada saat peristiwa
bernafas berlangsung Logam timbal yang masuk ke paru-paru melalui
peristiwa pernafasan akan terserap dan berikatan dengan darah paru-paru
untuk kemudian diedarkan ke seluruh jaringan dan organ tubuh Pada
jaringan atau organ tubuh logam timbal akan terakumulasi pada tulang
Meskipun jumlah timbal yang diserap oleh tubuh hanya sedikit logam ini
ternyata menjadi sangat berbahaya Hal itu disebabkan senyawa-senyawa
timbal dapat memberikan efek racun terhadap banyak fungsi organ yang
terdapat dalam tubuh (Palar 1994)
Rambut dapat digunakan sebagai indikator pencemaran pada orang -
orang di daerah industri berdasarkan tingkat mobilitas atau lamanya interaksi
dengan pencemar loga m Pb Selanjutnya rambut secara unik juga dapat
digunakan untuk membedakan pencemaran Pb yang bersifat internal dan
eksternal (Soemirat 2002) (A2400301)
Timbal (Pb timah hitam) terdapat dimana-mana dalam lingkungan
krena terdapat dialam dan digunakan dalam industri
Kira-kira 10 dari hasil tambang timbal digunakan untuk produksi Pb
tetraetil yang ditambahkan pada bensin sebanyak 1 mlL bensin sebagai
antiknock Pengurangan kadar timbal dalam besin dalam dasawarsa terakhir
menyebabkan penurunan kadar Pb dalam darah manusia Manusia terpajan
6
Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di
Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar
toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri
Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah
minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada
lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena
kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia
Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di
Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan
komponen lain yang disolder dengan Pb
Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas
Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira
40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor
melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar
kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan
meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup
berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-
kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik
mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati
Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut
Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari
jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir
7
semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb
relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma
Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi
sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak
menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih
tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara
keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa
awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini
terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan
pemeriksaan radiologis
Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi
distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam
tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis
tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan
persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat
cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat
kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol
memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan
ekskresinya dalam urin
Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb
dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi
kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan
8
didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam
rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam
darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan
Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072
ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan
oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb
Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang
sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena
Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat
disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat
menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan
lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan
parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria
terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian
dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat
gejala keracunan Pb kronis
II1 Uraian Tanaman
II11 Klasifikasi Tanaman
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
5
bernafas akan masuk ke dalam pembuluh darah paru-paru Tingkat
penyerapan itu sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel dari senyawa timbal
yang ada dan volume udara yang mampu dihirup pada saat peristiwa
bernafas berlangsung Logam timbal yang masuk ke paru-paru melalui
peristiwa pernafasan akan terserap dan berikatan dengan darah paru-paru
untuk kemudian diedarkan ke seluruh jaringan dan organ tubuh Pada
jaringan atau organ tubuh logam timbal akan terakumulasi pada tulang
Meskipun jumlah timbal yang diserap oleh tubuh hanya sedikit logam ini
ternyata menjadi sangat berbahaya Hal itu disebabkan senyawa-senyawa
timbal dapat memberikan efek racun terhadap banyak fungsi organ yang
terdapat dalam tubuh (Palar 1994)
Rambut dapat digunakan sebagai indikator pencemaran pada orang -
orang di daerah industri berdasarkan tingkat mobilitas atau lamanya interaksi
dengan pencemar loga m Pb Selanjutnya rambut secara unik juga dapat
digunakan untuk membedakan pencemaran Pb yang bersifat internal dan
eksternal (Soemirat 2002) (A2400301)
Timbal (Pb timah hitam) terdapat dimana-mana dalam lingkungan
krena terdapat dialam dan digunakan dalam industri
Kira-kira 10 dari hasil tambang timbal digunakan untuk produksi Pb
tetraetil yang ditambahkan pada bensin sebanyak 1 mlL bensin sebagai
antiknock Pengurangan kadar timbal dalam besin dalam dasawarsa terakhir
menyebabkan penurunan kadar Pb dalam darah manusia Manusia terpajan
6
Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di
Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar
toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri
Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah
minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada
lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena
kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia
Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di
Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan
komponen lain yang disolder dengan Pb
Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas
Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira
40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor
melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar
kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan
meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup
berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-
kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik
mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati
Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut
Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari
jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir
7
semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb
relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma
Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi
sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak
menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih
tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara
keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa
awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini
terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan
pemeriksaan radiologis
Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi
distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam
tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis
tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan
persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat
cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat
kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol
memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan
ekskresinya dalam urin
Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb
dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi
kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan
8
didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam
rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam
darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan
Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072
ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan
oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb
Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang
sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena
Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat
disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat
menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan
lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan
parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria
terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian
dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat
gejala keracunan Pb kronis
II1 Uraian Tanaman
II11 Klasifikasi Tanaman
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
6
Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di
Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar
toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri
Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah
minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada
lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena
kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia
Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di
Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan
komponen lain yang disolder dengan Pb
Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas
Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira
40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor
melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar
kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan
meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup
berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-
kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik
mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati
Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut
Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari
jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir
7
semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb
relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma
Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi
sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak
menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih
tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara
keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa
awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini
terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan
pemeriksaan radiologis
Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi
distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam
tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis
tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan
persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat
cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat
kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol
memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan
ekskresinya dalam urin
Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb
dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi
kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan
8
didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam
rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam
darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan
Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072
ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan
oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb
Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang
sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena
Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat
disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat
menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan
lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan
parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria
terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian
dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat
gejala keracunan Pb kronis
II1 Uraian Tanaman
II11 Klasifikasi Tanaman
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
7
semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb
relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma
Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi
sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak
menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih
tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara
keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa
awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini
terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan
pemeriksaan radiologis
Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi
distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam
tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis
tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan
persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat
cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat
kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol
memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan
ekskresinya dalam urin
Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb
dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi
kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan
8
didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam
rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam
darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan
Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072
ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan
oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb
Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang
sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena
Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat
disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat
menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan
lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan
parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria
terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian
dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat
gejala keracunan Pb kronis
II1 Uraian Tanaman
II11 Klasifikasi Tanaman
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
8
didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam
rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam
darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan
Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072
ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan
oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb
Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang
sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena
Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat
disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat
menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan
lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan
parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria
terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian
dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat
gejala keracunan Pb kronis
II1 Uraian Tanaman
II11 Klasifikasi Tanaman
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
9
Regnum Plantae
Divisio Spermatophyta
Subdivisio Angiospermae
Kelas Dicotyledoneae
Ordo Sterculiales
Famili Sterculiaceae
Genus Kleinhovia
Species Kleinhovia hospita Linn
II12 Nama Daerah
Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa
Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung
Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor
Ninak Madura Mangar
II13 Morfologi
Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-
20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung
dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga
tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta
pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna
coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di
ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak
5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
10
Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk
kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval
melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling
berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang
berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan
dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5
berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk
gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai
putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5
II15 Kandungan Kimia
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II16 Kegunaan Tanaman
Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin
bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
11
paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa
sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin
kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung
triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun
paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan
kadar flavonoid total 294 ndash 667
II2 Madu
II21 Definisi Madu
Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan
diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai
makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia
sejak zaman dahulu
II22 Komposisi Madu
Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman
musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah
mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah
sebagai berikut
a Air
Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang
bervariasi berkisar 134 sampai 229
b Karbohidrat
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
12
Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida
(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula
pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat
bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan
glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar
1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula
adalah oligosakarida
c Zat-zat Organik
Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic
yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid
telah teridentifikasi pada madu
d Asam amino dan Protein
Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah
(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino
yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain
asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih
besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti
halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567
mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman
dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan
glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
13
Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam
jumlah yang lebih sedikit
e Mineral
Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium
natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat
dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169
mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi
(berkisar 20-1030 mg100g madu)
f Vitamin
Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin
C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200
mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah
riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi
55- 360 microg100 g madu
II23 Khasiat Madu
Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh
masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu
semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar
pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi
antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh
luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat
kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
14
Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang
dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi
karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber
infeksi dari luar
Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan
untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah
timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang
dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat
yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan
sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki
kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka
Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun
mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki
kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas
II3 Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat
tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)
Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan
dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
15
sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan
molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk
mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan
bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan
mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal
bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya
menyebabkan kerusakan sel tersebut
Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri
(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen
terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein
karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan
reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase
peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk
dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik
limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas
antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida
(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini
memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah
pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing
Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi
dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
16
Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu
penyakit yaitu antara lain
1Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)
yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut
dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan
proses berkelanjutan
2Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam
terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap
protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika
radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila
kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu
penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam
transisi
3Kerusakan DNA
Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab
kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak
terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun
bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan
ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
17
Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh
yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya
kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi
pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum
replikasi maka akan terjadi mutasi
4Membran Sel
Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak
jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein
Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan
interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida
yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada
II4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber
alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan
alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang
dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol
dan asam-asam organik polifungsional
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase
atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E
C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
18
bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan
system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-
enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung
pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn
dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation
peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja
dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru
Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan
non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua
kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder
karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A
dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk
dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa
oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak
kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh
Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat
dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan
perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga
mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-
rempah dan lain-lain
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
19
Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap
serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan
tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni
1 Antioksidan primer
Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa
radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul
yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi
Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai
pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses
peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam
tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral
seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai
antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif
mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang
dikonsumsi setiap hari
2 Antioksidan sekunder
Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin
C beta karoten bilirubin dan albumin
3 Antioksidan tersier
Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang
disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
20
sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan
DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai
penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang
memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker
kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain
Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan
merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh
manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal
bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila
jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh
kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA
sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif
Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara
berikut (6)
Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru
Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi
(pemutusan rantai)
Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal
II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
21
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa metode antara lain
1 Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam
penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi
kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat
reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit
sampel (17)
DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil
(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur
sebagai berikut
Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti
aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)
Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal
DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil
NO2
O2N
NO2
Nbull N
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
22
dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan
senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan
berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna
dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang
ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer
dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi
disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal
ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat
antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk
beresonansi (17)
Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)
Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi
sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan
penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang
tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
23
(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan
rumus
Penangkapan radikal bebas =
Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis
probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan
radikal bebas (22)
2 Metode linoleat-tiosianat (18)
Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal
Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri
dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang
berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang
490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut
RObull
OHbull + Fe2+ Fe3+
Rbull
Radikal
Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+
Merah
Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)
3 Metode tiosianat (21)
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
24
Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida
(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini
terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan
radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau
bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan
lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode
ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa
mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii
dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang
gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban
makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah
mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan
meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada
metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk
dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit
peroksida yang dihasilkan
II5 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
25
alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan
sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif
suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar
yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu
satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi
yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin
a Prinsip Dasar
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
26
Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu
halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke
monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter
sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas
sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel
sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada
dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan
standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas
preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang
menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan
untuk menghitung tebal lapisan tipis
b Peralatan Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi
1 Sumber Tenaga Radiasi
Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus
menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada
keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-
sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan
lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam
tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan
yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga
lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28
27
sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang
menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm
2 Monokromator
Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi
monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan
monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang
menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang
gelombang tunggal
3 Tempat Cuplikan (Kuvet)
Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel
digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-
10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika
dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas
4 Detektor atau Pencatat
Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah
tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal
listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat
Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)
KuvetMonokromator
Detektor PencatatSumber
28