tinjauan pustaka

36
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Manusia senantiasa terpajan (exposed) logam berat dalam lingkungan hidupnya. Dilingkungan yang kadar logam beratnya cukup tinggi, kontaminasi dalam makanan dan air dapat menyebabkan keracunan. Logam berat tidak mengalami metabolisme, tetap berada dalam tubuh dan menyebabkan efek toksik dengan cara bergabung dengan suatu atau beberapa gugus ligan yang esensial bagi fungsi fisiologis normal. Studi Bappenas pada tahun 2009 melaporkan bahwa Indonesia menjadi negara dengan tingkat polusi udara tertinggi ketiga di dunia. Kontribusi gas buang kendaraan bermotor sebagai sumber polusi udara terbesar mencapai 60-70%, dibanding dengan industri yang hanya berkisar antara 10-15%. Sedangkan sisanya berasal dari rumah tangga, pembakaran sampah, kebakaran hutan/ladang dan lain-lain. Hal ini diakibatkan oleh laju pertumbuhan 4

Upload: satria-putra-penarosa

Post on 24-Oct-2015

37 views

Category:

Documents


3 download

DESCRIPTION

Tinjauan Pustaka madu paliasa

TRANSCRIPT

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Manusia senantiasa terpajan (exposed) logam berat dalam lingkungan

hidupnya Dilingkungan yang kadar logam beratnya cukup tinggi kontaminasi

dalam makanan dan air dapat menyebabkan keracunan

Logam berat tidak mengalami metabolisme tetap berada dalam tubuh

dan menyebabkan efek toksik dengan cara bergabung dengan suatu atau

beberapa gugus ligan yang esensial bagi fungsi fisiologis normal

Studi Bappenas pada tahun 2009 melaporkan bahwa Indonesia

menjadi negara dengan tingkat polusi udara tertinggi ketiga di dunia

Kontribusi gas buang kendaraan bermotor sebagai sumber polusi udara

terbesar mencapai 60-70 dibanding dengan industri yang hanya berkisar

antara 10-15 Sedangkan sisanya berasal dari rumah tangga pembakaran

sampah kebakaran hutanladang dan lain-lain Hal ini diakibatkan oleh laju

pertumbuhan kepemilikan kendaraan bermotor yang tinggi Sebagian besar

kendaraan bermotor itu menghasilkan emisi gas buang yang buruk baik

akibat perawatan yang kurang memadai ataupun dari penggunaan bahan

bakar dengan kualitas kurang baik (misalnya kadar timbal yang tinggi)

(tesisnya orang)

Udara yang telah tercemar timbal akan masuk ke dalam tubuh melalui

proses pernafasan Sebagian besar dari timbal yang terhirup pada saat

4

5

bernafas akan masuk ke dalam pembuluh darah paru-paru Tingkat

penyerapan itu sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel dari senyawa timbal

yang ada dan volume udara yang mampu dihirup pada saat peristiwa

bernafas berlangsung Logam timbal yang masuk ke paru-paru melalui

peristiwa pernafasan akan terserap dan berikatan dengan darah paru-paru

untuk kemudian diedarkan ke seluruh jaringan dan organ tubuh Pada

jaringan atau organ tubuh logam timbal akan terakumulasi pada tulang

Meskipun jumlah timbal yang diserap oleh tubuh hanya sedikit logam ini

ternyata menjadi sangat berbahaya Hal itu disebabkan senyawa-senyawa

timbal dapat memberikan efek racun terhadap banyak fungsi organ yang

terdapat dalam tubuh (Palar 1994)

Rambut dapat digunakan sebagai indikator pencemaran pada orang -

orang di daerah industri berdasarkan tingkat mobilitas atau lamanya interaksi

dengan pencemar loga m Pb Selanjutnya rambut secara unik juga dapat

digunakan untuk membedakan pencemaran Pb yang bersifat internal dan

eksternal (Soemirat 2002) (A2400301)

Timbal (Pb timah hitam) terdapat dimana-mana dalam lingkungan

krena terdapat dialam dan digunakan dalam industri

Kira-kira 10 dari hasil tambang timbal digunakan untuk produksi Pb

tetraetil yang ditambahkan pada bensin sebanyak 1 mlL bensin sebagai

antiknock Pengurangan kadar timbal dalam besin dalam dasawarsa terakhir

menyebabkan penurunan kadar Pb dalam darah manusia Manusia terpajan

6

Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di

Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar

toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri

Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah

minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada

lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena

kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia

Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di

Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan

komponen lain yang disolder dengan Pb

Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas

Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira

40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor

melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar

kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan

meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup

berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-

kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik

mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati

Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut

Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari

jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir

7

semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb

relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma

Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi

sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak

menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih

tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara

keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa

awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini

terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan

pemeriksaan radiologis

Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi

distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam

tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis

tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan

persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat

cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat

kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol

memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan

ekskresinya dalam urin

Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb

dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi

kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan

8

didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam

rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam

darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan

Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072

ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan

oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb

Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang

sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena

Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat

disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat

menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan

lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan

parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria

terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian

dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat

gejala keracunan Pb kronis

II1 Uraian Tanaman

II11 Klasifikasi Tanaman

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

5

bernafas akan masuk ke dalam pembuluh darah paru-paru Tingkat

penyerapan itu sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel dari senyawa timbal

yang ada dan volume udara yang mampu dihirup pada saat peristiwa

bernafas berlangsung Logam timbal yang masuk ke paru-paru melalui

peristiwa pernafasan akan terserap dan berikatan dengan darah paru-paru

untuk kemudian diedarkan ke seluruh jaringan dan organ tubuh Pada

jaringan atau organ tubuh logam timbal akan terakumulasi pada tulang

Meskipun jumlah timbal yang diserap oleh tubuh hanya sedikit logam ini

ternyata menjadi sangat berbahaya Hal itu disebabkan senyawa-senyawa

timbal dapat memberikan efek racun terhadap banyak fungsi organ yang

terdapat dalam tubuh (Palar 1994)

Rambut dapat digunakan sebagai indikator pencemaran pada orang -

orang di daerah industri berdasarkan tingkat mobilitas atau lamanya interaksi

dengan pencemar loga m Pb Selanjutnya rambut secara unik juga dapat

digunakan untuk membedakan pencemaran Pb yang bersifat internal dan

eksternal (Soemirat 2002) (A2400301)

Timbal (Pb timah hitam) terdapat dimana-mana dalam lingkungan

krena terdapat dialam dan digunakan dalam industri

Kira-kira 10 dari hasil tambang timbal digunakan untuk produksi Pb

tetraetil yang ditambahkan pada bensin sebanyak 1 mlL bensin sebagai

antiknock Pengurangan kadar timbal dalam besin dalam dasawarsa terakhir

menyebabkan penurunan kadar Pb dalam darah manusia Manusia terpajan

6

Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di

Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar

toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri

Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah

minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada

lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena

kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia

Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di

Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan

komponen lain yang disolder dengan Pb

Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas

Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira

40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor

melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar

kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan

meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup

berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-

kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik

mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati

Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut

Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari

jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir

7

semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb

relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma

Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi

sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak

menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih

tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara

keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa

awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini

terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan

pemeriksaan radiologis

Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi

distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam

tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis

tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan

persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat

cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat

kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol

memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan

ekskresinya dalam urin

Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb

dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi

kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan

8

didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam

rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam

darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan

Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072

ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan

oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb

Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang

sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena

Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat

disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat

menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan

lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan

parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria

terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian

dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat

gejala keracunan Pb kronis

II1 Uraian Tanaman

II11 Klasifikasi Tanaman

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

6

Pb terutama melalui makanan Jumlah Pb yang dikonsumsi orang dewasa di

Amerika Serikat rata-rata per hari 01-2mg Namun demikian sebagian besar

toksisitas nyata Pb diakibatkan oleh pajanan dilingkungan industri

Makanan dan minuman yang bersifat asam seperti tomat air buah

minuman kola air apel dan asinan dapat melarutkan Pb yang terdapat pada

lapisan mangkuk dan panci Makanan dan minuman yang terkena

kontaminasi tersebut telah menyebabkan keracunan fatal pada manusia

Timbal juga merupakan kontaminan wiski yang disuling secara gelap di

Amerika karena digunakannya radiator mobil sebagai kondensor dan

komponen lain yang disolder dengan Pb

Absorpsi Pb terutama melalui saluran cerna dan saluran napas

Ansorpsi melalui usus pada orang dewasa kira-kira 10 pad nak kira-kira

40 Ada dugaan bahwa Pb dan kalsium berkompetisi dalam transpor

melalui mukosa usus karena ada suatu hubungan timbal balik antara kadar

kalsium makanan dan absorpsi Pb Kekurangan zat besi dilaporkan

meningkatkan absorpsi Pb melalui saluran cerna Absoprsi Pb yang dihirup

berbeda-beda tergantung dari bentuk (uap atau partikel) dan kadar Pb Kira-

kira 90 partikel Pb diudara diabsorpsi melalui saluran napas Pb anorganik

mula-mula terdistribusi dijaringan lemak terutama didalam ginjal dan hati

Kemudian Pb mengalami redistribusi kedalam tulang (95) gigi dan rambut

Sejumlah kecil Pb anorganik ditimbun didalam otak sebagian besar dari

jumlah tersebut berada di substansia grisea dan ganglia basal Hampir

7

semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb

relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma

Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi

sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak

menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih

tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara

keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa

awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini

terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan

pemeriksaan radiologis

Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi

distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam

tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis

tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan

persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat

cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat

kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol

memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan

ekskresinya dalam urin

Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb

dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi

kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan

8

didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam

rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam

darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan

Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072

ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan

oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb

Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang

sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena

Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat

disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat

menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan

lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan

parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria

terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian

dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat

gejala keracunan Pb kronis

II1 Uraian Tanaman

II11 Klasifikasi Tanaman

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

7

semua Pb anorganik terikat dengan eritrosit dalam sirkulasi Bila kadar Pb

relatif tinggi dalam sirkulasi barulah ditemukan Pb dalam plasma

Akumulasi Pb dalam tulang mirip dengan akumulasi kalsium tetapi

sebagai Pb fosfat tersier garam Pb di tulang (fosfat karbonat) tidak

menyebabkan efek toksik Pada pajanan yang baru terjadi kadar Pb lebih

tinggi dalam tulang pipih daripada dalam tulang panjang meskipun secara

keseluruhan tulang panjang mengandung lebih banyak Pb Dalam masa

awal deposisi kadr Pb paling tinggi dalam epifisis tulang panjang Hal ini

terutama jelas pada tulang yang sedang tumbuh dan dapat dideteksi dengan

pemeriksaan radiologis

Faktor yang mempengaruhi distribusi kalsium juga mempengaruhi

distribusi Pb Asupan fosfat tinggi mempermudah penimbunan Pb dalam

tulang dan mengurangi kadar Pb dalam jaringan lunak Asupan kalsium dosis

tinggi tanpa peninggian asupan fosfat menyebabkan efek serupa disebabkan

persaingan dalam pengikatan fosfat antara Pb dan Kalsium Jika fosfat

cukup vitamin D mempermudah penimbunan Pb dalam tulang bila fosfat

kurang deposisi kalsium melebihi Pb Hormon paratiroid dan dihidroakisterol

memobilisasi Pb dari tulang meningkatkan kadar Pb dalam darah dan

ekskresinya dalam urin

Pada manusia ekskresi Pb melalui urin lebih penting dan kadar Pb

dalam urin berbanding langsung dengan kadarnya dalam plasma Tetapi

kebanyakan Pb berada dalam eritrosit sehingga sangat sedikit Pb ditemukan

8

didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam

rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam

darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan

Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072

ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan

oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb

Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang

sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena

Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat

disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat

menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan

lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan

parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria

terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian

dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat

gejala keracunan Pb kronis

II1 Uraian Tanaman

II11 Klasifikasi Tanaman

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

8

didalam urin Pb juga diekskresikan melalui ASI dan keringat ditimbun dalam

rambut dan kuku Pb juga dapat mencapai plasenta Waktu paruh Pb dalam

darah adalah 1-2 bulan kadar mantap dicapai dalam waktu kira-kira 6 bulan

Keracuanan timbal akut yang ditandai dengan kadar lebih dari 072

ppm dalam darah jarang terjadi Keracunan yang terjadi biasanya disebabkan

oleh masuknya senyawa Pb yang larut dalam asam atau inhalasi uap Pb

Efek astringen menimbulkan rasa haus dan rasa logam Gejala lain yang

sering timbul ialah mual muntah dengan muntahan menyerupai susu karena

Pb klorida dan sakit perut hebat Tinja warna hitam karena Pb sulfida dapat

disertai diare atau konstipasi Pb yang diserap dengan cepat dapat

menyebabkan sindrom syok yang juga disebabkan oleh kehilangan cairan

lewat saluran cerna Terhadap susunan syaraf Pb anorganik menyebabkan

parestesia nyeri dan kelemahan otot Anemia berat dan hemoglobinuria

terjadi karena hemolisis darah Dapat timbul kerusakan ginjal dan kematian

dapat terjadi dalam 1-2 hari Kalau keracunan akut teratasi umumnya terlihat

gejala keracunan Pb kronis

II1 Uraian Tanaman

II11 Klasifikasi Tanaman

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

9

Regnum Plantae

Divisio Spermatophyta

Subdivisio Angiospermae

Kelas Dicotyledoneae

Ordo Sterculiales

Famili Sterculiaceae

Genus Kleinhovia

Species Kleinhovia hospita Linn

II12 Nama Daerah

Bugis Aju Pali Makassar Paliasa Ambon Katimahar Jawa

Katimaha Sunda Tangkolo Bali Katimaha Irian Jaya Noton Lampung

Manggar Sumba Nundang Flores Kadangan Ternate Ngaru Timor

Ninak Madura Mangar

II13 Morfologi

Paliasa (Kleinhovia hospita Linn) merupakan pohon yang tingginya 5-

20 m berakar tunggang Daun bertangkai panjang berbentuk seperti jantung

dengan ukuran 45-27 x 3-24 cm pada tangkal daun bercabang sehingga

tulang menjari tepi daun rata ujung runcing permukaan licin suram serta

pangkal berlekuk Batang keras berkayu bulat dan bercabang-cabang warna

coklat sampai coklat keputihan Bunga warna merah muda berbentuk malai di

ujung batang lebar berambut halus Daun pelindung oval Tajuk berkelopak

5 bentuk lanset panjang 8-10 cm berwarna merah berambut bentuk bintan

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

10

Daun mahkota 5 yang 4 bentuk pita lebar dengan pangkal berbentuk

kantong panjang 6 mm berwarna merah dan yang ke-5 lebih pendek oval

melintang dengan tepi melipat ke dalam dimana satu sama lain saling

berdekatan dengan ujung berwarna kuning Dasar bunga memanjang

berbentuk tiang yang lebih tipis pada pangkalnya dikelilingi oleh tonjolan

dasar bunga berbentuk cawan Benang sari di ujung tiang tersusun dalam 5

berkas tiga-tiga Berkas ini berseling dengan 1 stamodium kecil berbentuk

gigi Kepala sari tertancap seperti perisai Bakal buah beruang 5 tangkai

putik 1 buah kotak bentuk buah pir melembung seperti selaput bertajuk 5

II15 Kandungan Kimia

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II16 Kegunaan Tanaman

Menurut Raflizar dkk daun paliasa mengandung saponin kardenolin

bufadienol serta antrakinon Menurut Philippine Medicinal Plants daun

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

11

paliasa mengandung skopoletin kampferol dan quercetin serta senyawa

sianogenik Secara kimia daun paliasa telah diteliti mengandung sianidin

kampferol dan kuersetin Menurut Li SG et al paliasa mengandung

triterpenoid sikloartan Sedangkan menurut hasil penelitian Taebe daun

paliasa mengandung senyawa golongan alkaloid dan flavonoid dengan

kadar flavonoid total 294 ndash 667

II2 Madu

II21 Definisi Madu

Madu adalah nektar yang dikumpulkan dari berbagai tanaman dan

diproses oleh lebah madu Lebah madu menghasilkan madu sebagai

makanan cadangan pada musim dingin dan telah dieksploitasi oleh manusia

sejak zaman dahulu

II22 Komposisi Madu

Komposisi kimia dari madu bervariasi tergantung dari tanaman

musim iklim dan keadaan geografis dari tanaman tempat lebah

mengumpulkan nektar Komposisi madu (g100 g) secara umum adalah

sebagai berikut

a Air

Kandungan rata-rata air pada madu adalah 172 tapi kadang

bervariasi berkisar 134 sampai 229

b Karbohidrat

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

12

Kurang lebih 95 dari bobot kering madu adalah gula Monosakarida

(glukosa dan fruktosa) memiliki kandungan 85-95 dari total kandungan gula

pada madu Perbandingan dari glukosa dan fruktosa pada madu sangat

bergantung dari sumber nektarnya Rata-rata perbandingan fruktosa dan

glukosa pada madu sekitar 121 Sukrosa juga terdapat pada madu (sekitar

1 dari bobot kering madu) Selain itu sebagian kecil dari kandungan gula

adalah oligosakarida

c Zat-zat Organik

Selain karbohidrat ada sejumlah besar senyawa-senyawa organic

yang terkandung pada madu asam-asam fenolat hidrokarbon dan flavonoid

telah teridentifikasi pada madu

d Asam amino dan Protein

Asam amino bebas yang terkandung dalam madu tergolong rendah

(026 ndash 5965 mg100 g madu) Prolin merupakan konstituen asam amino

yang terbesar dari madu (50-85 dari total kandungan asam amino) Selain

asam amino juga terdapat protein Kandungan protein dalam madu lebih

besar dibanding asam amino (sekitar 1686 mg 100 g madu) Namun seperti

halnya asam amino kandungan protein juga beragam Berkisar 577-567

mg100 g madu) Protein ini berasal dari lebah dan sumber nektartanaman

dengan enzim sebagai bentuk dari protein tersebut Invertase amylase dan

glukosaoksidase adalah enzim yang paling banyak ditemukan dalam madu

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

13

Terkadang juga ditemukan enzim fosfatase dan katalase namun dalam

jumlah yang lebih sedikit

e Mineral

Sejumlah mineral juga terkandung dalam madu seperti kalium

natrium kalsium magnesium tembaga besi mangan klorida sulfur fosfat

dan lain-lain Kandungan mineral pada madu umumnya kurang lebih 169

mg100g madu Namun kandungan mineral dalam madu dapat bervariasi

(berkisar 20-1030 mg100g madu)

f Vitamin

Madu mengandung vitamin dalam jumlah kecil Asam askorbatVitamin

C merupakan konstituen terbesar dari vitamin dengan konsentrasi 200

mg100g madu Vitamin-vitamin lain yang ditemukan pada madu adalah

riboflavin asam pantotenat niasin tiamin dan piridoxin dengan konsentrasi

55- 360 microg100 g madu

II23 Khasiat Madu

Penggunaan madu sebagai penyembuh luka telah digunakan oleh

masyarakat sejak zaman dahulu Seperti obat tradisional lainnya madu

semakin kurang penggunaannya ketika antibiotik ditemukan sekitar

pertengahan abad 20 Walaupun demikian meningkatnya masalah resistensi

antibiotik menimbulkan ketertarikan baru terhadap madu sebagai penyembuh

luka karena meningkatnya keefektifan penyembuhan luka yang bersifat

kronik yang tidak dapat disembuhkan oleh pengobatan-pengobatan lain

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

14

Madu menunjukkan keefektifannya yang berpotensi menjadi antibiotik yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan luka dan mencegah terjadinya infeksi

karena madu dapat membentuk pelindung yang melindungi luka dan sumber

infeksi dari luar

Setelah diteliti madu juga memiliki efek deodorant ketika digunakan

untuk penyembuhan luka Aktivitas antibakteri pada madu mencegah

timbulnya bau yang tidak sedap pada luka Madu memiliki glukosa yang

dapat dimetabolisme oleh bakteri menggantikan asam amino Asam laktat

yang dihasilkan dari metabolisme glukosa lebih baik daripada ammonia dan

sulfur yang dihasilkan dari metabolisme asam amino Madu juga memiliki

kandungan nutrisi-nutrisi yang dapat mempercepat penyembuhan luka

Selain itu Madu dapat meningkatkanmenstimulasi sistem imun

mencegah terjadinya inflamasi kronik jangka panjang dan memiliki

kandungan antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas

II3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat

tidak stabil (mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan)

Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini mencari pasangan

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

15

sekitarnya Radikal bebas sangat reaktif sehingga dapat bereaksi dengan

molekul lain seperti karbohidrat protein lemak dan DNA Untuk

mendapatkan stabilitas kimia radikal bebas tidak dapat mempertahankan

bentuk asli dalam waktu lama dan menyerang molekul stabil terdekat dan

mengambil elektron Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal

bebas juga sehingga akan memulai reaksi berantai yang akhirnya

menyebabkan kerusakan sel tersebut

Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri

(endogen) bisa pula berasal dari luar tubuh (eksogen) Radikal endogen

terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein

karbohidrat dan lemak pada mitokondria proses inflamasi atau peradangan

reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh fagosit xantin oksidase

peroksisom maupun pada kondisi iskemia Sumber dari luar tubuh terbentuk

dari asap rokok polusi lingkungan radiasi obat-obatan pestisida anestetik

limbah industi ozon serta sinar ultraviolet Beberapa contoh radikal bebas

antara lain anion superoksida (2O2 -) radikal hidroksil (OHbull) nitril oksida

(NObull) hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya Radikal bebas ini

memegang peranan esensial misalnya pada regulasi tekanan darah

pencegahan infeksi kuman dan eliminasi zat-zat asing

Radikal bebas bersifat destruktif sangat reaktif dan mampu bereaksi

dengan makromolekul sel seperti protein lipid karbohidrat atau DNA

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

16

Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu

penyakit yaitu antara lain

1Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid (PUFA)

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak Hal ini sangat merusak karena merupakan

proses berkelanjutan

2Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada

poly unsaturated fatty acid (PUFA) sehingga kecil kemungkinan dalam

terjadinya reaksi berantai yang cepat Serangan radikal bebas terhadap

protein sangat jarang kecuali bila sangat ekstensif Hal ini terjadi hanya jika

radikal tersebut mampu berakumulasi (jarang pada sel normal) atau bila

kerusakannya terfokus pada daerah tertentu dalam protein Salah satu

penyebab kerusakan terfokus adalah jika protein berikatan dengan ion logam

transisi

3Kerusakan DNA

Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab

kerusakan DNA di samping penyebab lain seperti virus bila kerusakan tidak

terlalu parah masih dapat diperbaiki oleh system perbaikan DNA Namun

bila sudah menyebabkan rantai DNA terputus di berbagai tempat kerusakan

ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel akan terganggu

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

17

Bahkan terjadi perubaha abnormal yang mengenai gen tertentu dalam tubuh

yang dapat menimbulkan penyakit kanker Kemungkinan terjadinya

kerusakan di DNA menjadi suatu reaksi berantai disebabkan oleh suatu lesi

pada susunan molekul apabila tidak dapat diatasi dan terjadi sebelum

replikasi maka akan terjadi mutasi

4Membran Sel

Komponen penyusun membran utamanya berupa asam lemak tak

jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein

Serangan radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan

interaksi oksigen pada rangkaian sehingga terbentuk lipid hidroperoksida

yang selanjutnya merusak bagian sel dimana hidroperoksida ini berada

II4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksigen

reaktif dan radikal bebas Antioksidan pada umumnya diisolasi dari sumber

alami yang tersebar di beberapa bagian tanaman Senyawa antioksidan

alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang

dapat berupa golongan flavonoid turunan asam sinamat kumarin tokoferol

dan asam-asam organik polifungsional

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase

atau SOD katalase dan glutation peroksidase) vitamin (misalnya vitamin E

C A dan B-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid albumin

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

18

bilirubin seruloplasmin dan lain-lain) Antioksidan enzimatis merupakan

system pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif Enzim-

enzim tersebut merupakan metaloenzim yang aktivitasnya sangat tergantung

pada adanya ion logam Aktivitas SOD bergantung pada logam Fe Cu Zn

dan Mn enzim katalase bergantung pada Fe (besi) dan enzim glutation

peroksidase bergantung pada Se (selenium) Antioksidan enzimatis bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru

Di samping antioksidan yang bersifat enzimatis ada juga antioksidan

non-enzimatis yang dapat berupa senyawa nutrisi maupun non-nutrisi Kedua

kelompok antioksidan non-enzimatis ini disebut juga antioksidan sekunder

karena dapat diperoleh dari asupan bahan makanan seperti vitamin C E A

dan B-karoten Glutation bilirubin albumin dan flavonoid juga termasuk

dalam kelompok ini Senyawa-senyawa itu berfungsi menangkap senyawa

oksidan serta mencegah reaksi berantai Komponen-komponen tersebut tidak

kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh

Misalnya isoflavon salah satu komponen flavonoid yang banyak terdapat

dalam kedelai dan produk olahannya Senyawa ini telah banyak dilaporkan

perannya sebagai antioksidan Masih banyak bahan pangan lain yang juga

mengandung isoflavon misalnya teh jahe daun cincau kopi rempah-

rempah dan lain-lain

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

19

Sistem antioksidan tubuh sebagai mekanisme perlindungan terhadap

serangan radikal bebas secara alami telah ada dalam tubuh kita Antioksidan

tubuh bias dikelompokkan menjadi 3 yakni

1 Antioksidan primer

Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas baru Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul

yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas sempat bereaksi

Contoh antioksidan ini adalah enzim SOD yang berfungsi sebagai

pelindung hancurnya sel-sel di dalam tubuh serta mencegah proses

peradangan karena radikal bebas Enzim SOD sebenarnya sudah ada dalam

tubuh kita Namun bekerjanya membutuhkan bantuan zat-zat gizi mineral

seperti mangan seng dan tembaga Selenium (Se) juga berperan sebagai

antioksidan Jadi jika ingin menghambat gejala dan penyakit degeneratif

mineral-mineral tersebut hendaknya tersedia cukup dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari

2 Antioksidan sekunder

Antioksidan ini berfungsi menangkap senyawa serta mencegah

terjadinya reaksi berantai Contoh antioksidan sekunder vitamin E vitamin

C beta karoten bilirubin dan albumin

3 Antioksidan tersier

Antioksidan jenis ini memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang

disebabkan radikal bebas Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

20

sel adalah metionin sulfoksidan reduktase Adanya enzim-enzim perbaikan

DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker misalnya Hasil berbagai

penelitian telah mendukung teori bahwa mengonsumsi antioksidan yang

memadai dapat mengurangi terjadinya berbagai penyakit seperti kanker

kardiovaskular katarak serta penyakit degeneratif lain

Berkaitan dengan reaksi oksidasi di dalam tubuh status antioksidan

merupakan parameter penting untuk memantau kesehatan seseorang Tubuh

manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal

bebas yang secara kontinu ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh Bila

jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh

kelebihannya akan menyerang komponen lipid protein maupun DNA

sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif

Namun demikian reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara

berikut (6)

Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru

Mengaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi

(pemutusan rantai)

Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal

II5 Pengujian-pengujian Aktivitas Antioksidan

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

21

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan

beberapa metode antara lain

1 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam

penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 22-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH) (17) Metode ini sering digunakan untuk mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa sebab hasilnya terbukti akurat

reliabel dan praktis Selain itu sederhana cepat dan memerlukan sedikit

sampel (17)

DPPH dikenal dengan nama kimia 22-difenil-1-pikrilhidrazil

(C18H12N5O6) yang mempunyai berat molekul 3493 dengan rumus struktur

sebagai berikut

Gambar 2 Rumus struktur 22 diphenyl 1 picryl hidrazyl (17)

Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti

aktivitas transfer H sekalian juga untuk penghambatan radikal bebas (22)

Senyawa DPPH adalah radikal bebas yang stabil berwarna ungu Radikal

DPPH merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil

NO2

O2N

NO2

Nbull N

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

22

dengan absorbansi kuat pada λmax 517 nm Setelah bereaksi dengan

senyawa antioksidan DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan

berubah menjadi kuning (difenil pikrilhidrazin) (17) Hasil perubahan warna

dari ungu menjadi kuning stoikiometrik dengan jumlah elektron yang

ditangkap (22) Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer

dan diplotkan terhadap konsentrasi Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH Hal

ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat

antioksidan menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk

beresonansi (17)

Gambar 3 Reaksi radikal bebas DPPH dengan antioksidan (17)

Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi

sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH akan menyebabkan

penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang

tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

23

(22) Besarnya persentase penangkapan radikal bebas dihitung dengan

rumus

Penangkapan radikal bebas =

Nilai IC50 (50 Inhibitory Concentration) ditentukan dengan analisis

probit dari data log konsentrasi dengan probit persentase penangkapan

radikal bebas (22)

2 Metode linoleat-tiosianat (18)

Dalam metode ini digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal

Radikal ini akan mengoksidasi ion fero ( dari feroklorida) menjadi ion feri

dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang

berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang

490 nm Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut

RObull

OHbull + Fe2+ Fe3+

Rbull

Radikal

Fe3+ + 6 CNS Fe (CNS)63+

Merah

Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi ion fero oleh radikal bebas (18)

3 Metode tiosianat (21)

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

24

Metode ini menggunakan 22-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorida

(AAPH) sebagai inisiator pembentukan radikal Penguraian senyawa ini

terjadi dengan bantuan pemanasan menghasilkan molekul nitrogen dan

radikal karbon yang dapat bergabung menghasilkan produk yang stabil atau

bereaksi dengan molekul oksigen menghasilkan radikal peroksil sedangkan

lemak yang dioksidasi menghasilkan produk primer peroksida Dalam metode

ini bilangan peroksida dinyatakan sebagai kemampuan senyawa

mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ selanjutnya Fe3+ yang terbentuk bereaksii

dengan ion CNS menghasilkan warna merah yang memberikan panjang

gelombang maksimum 500 nm Makin lama waktu inkubasi nilai absorban

makin meningkat yang berarti bahwa asam linoleat dalam sampel telah

mengalami oksidasi Meningkatnya intensitas warna merah menunjukkan

meningkatnya bilangan peroksida Kemampuan aktivitas antioksidan pada

metode tiosianat dilihat dari rendahnya nilai absorbsi yang terbentuk

dibandingkan konsentrasi Makin rendah absorbansi berarti makin sedikit

peroksida yang dihasilkan

II5 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi reflektansi dan absorbansi dari cuplikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

25

alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer Spektrometer menghasilkan

sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya

secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan direfleksikan atau

diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dalam aspek kuantitatif

suatu berkas radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar

yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Intensitas atau

kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu

satuan luas penampang perdetik Serapan dapat terjadi jika fotonradiasi

yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang

dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga

Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer yang

digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak

Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh

senyawa yang ditentukan sinar yang digunakan adalah sinar yang

semonokromatis mungkin

a Prinsip Dasar

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

26

Sinar yang diemisikan dari sumber (lampu Deuterium D2 atau lampu

halogen WI) direfleksikan melalui cermin M1 dan diproyeksikan ke

monokromator Berkas sinar keluar melawati monokromator menuju filter

sinar F berkas sinar direfleksikan melalui cermin M2 dan terbagi ke berkas

sampel dan blangko oleh setengah cermin M3 Setelah keluar melewati sel

sampel dan blangko kedua berkas dideteksi oleh photodiode (PD) Pada

dasarnya prinsip dari alat spektrometer adalah membandingkan cuplikan dan

standar dalam hal ini standar yang digunakan adalah substrat gelas

preparat Dari penelitian akan diperoleh grafik hasil spektrofotometer yang

menunjukkan hubungan transmitansi dan panjang gelombang (λ) digunakan

untuk menghitung tebal lapisan tipis

b Peralatan Spektrofotometer

Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi

1 Sumber Tenaga Radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus

menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada

keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang diamati Sumber-

sumber radiasi UV yang kebanyak digunakan adalah lampu hidrogen dan

lampu deuterium Terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam

tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan

yang rendah dengan panajng gelombang 180-350 nm dan digunakan juga

lapu xenon tetapi lampu xenon tidak sestabil lampu hidrogen Selain itu

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

27

sumber radiasi yang biasa digunakan adalah filamen tungsten yang

menghasilkan radiasi kontinyu dalam daerah antara 350-900 nm

2 Monokromator

Dalam spektrofotometer radiasi polikromatik diubah menjadi

monokromatik Ada dua jenis alat yang digunakan yaitu penyaring dan

monokromator Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang

menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif atau panjang

gelombang tunggal

3 Tempat Cuplikan (Kuvet)

Larutan ditempatkan dalam sel atau kuvet Untuk daerah visibel

digunakan gelas biasa atau quartz Sel untuk larutan mempunyai panjang 1-

10 cm Sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air atau jika

dikehendaki dapat dicuci dengan detergen atau asam nitrat panas

4 Detektor atau Pencatat

Detektor penyerap tenaga foton yang mengenai cuplikan dan merubah

tenaga tersebut untuk diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik

atau perubahan-perubahan panas Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat

Gambar 6 Diagram sederhana spektrofotometer (20)

KuvetMonokromator

Detektor PencatatSumber

28

28