10/08/2014

Técnicas de laboratorio de biología. Unidad 3. Evidencia del aprendizaje. La importancia del microscopioFacilitador: MARTHA ANGELICA CANO FIGUEROA

María Esther Michel Hagelsieb

Técnicas de laboratorio de biología. Unidad 3. Evidencia del aprendizaje. La importancia del microscopioFacilitador: MARTHA ANGELICA CANO FIGUEROA

La importancia del microscopio Tanto los conocimientos sobre las características morfo funcionales normales de las células que conforman los tejidos y órganos, se logran a partir de experimentos científicos que han sido el producto de muchos años de investigación. La evolución del conocimiento depende fundamentalmente del progreso tecnológico que se ha logrado en materia de diseño y construcción de instrumentos, equipos y técnicas de laboratorio. Uno de estos instrumentos es el microscopio. De igual manera, el estado actual de conocimientos es el resultado de la interacción de diversas disciplinas que encuentran un punto de convergencia en la microscopía.

El microscopio es el instrumento insigne en el estudio de los organismos a nivel celular. Los numerosos descubrimientos han hecho posible que el ser humano logre ver más allá de sus capacidades, observando tanto aquellos objetos que están muy lejanos, como también los que por su reducido tamaño, se escapan a la capacidad del ojo humano para formar una imagen de los mismos. Los hallazgos en el campo de la física y sobretodo en una de sus ramas, la óptica, que estudia la naturaleza de la luz, sus características y sus manifestaciones, han permitido comprender el comportamiento de la misma, su interacción con la materia y notablemente su rol en la formación de las imágenes (Smith, BJ, Raymer, MG 2007). El funcionamiento de muchos microscopios ha sido interpretado de una manera más efectiva al entender el proceso de la visión y la formación de las imágenes (Montalvo A 2010), estableciendo diferencias entre lo que es el objeto que se observa y la imagen que se forma a partir de él cuándo éste es iluminado. El fundamento de la microscopía es efectivamente la formación de imágenes a partir de un espécimen (Hillion, P., Quinnez, S. 1983).

Todos los seres vivos están constituidos por células, pequeños compartimientos que contienen sustancias químicas en una solución acuosa y delimitada por una membrana. Las células están compuestas a partir de moléculas, dispuestas en diferentes niveles de organización y al cooperar entre ellas conforman los organismos vivos, desde los más simples hasta los más evolucionados, como el ser humano.

Las células son muy pequeñas y complejas, éstas características dificultan observar su estructura y descubrir su organización molecular y más difícil aún, comprender el funcionamiento de sus diversos constituyentes. Lo que podamos conocer de las células dependerá de los instrumentos disponibles y adecuados para observar y analizar, tanto células individualizadas (Biología Celular) como los tejidos y órganos (Histología). Las técnicas de laboratorio son cada vez más específicas y actualizadas; de allí que para

familiarizarse con los conceptos, es necesario conocer los métodos empleados para el estudio de las células y tejidos.

Una célula animal típica, cuyo diámetro aproximado puede estar entre los 10 y 25 micrómetros (µm), es mucho más pequeña que una partícula que pueda ser observada a simple vista por el ojo humano. Se tuvo que esperar entonces a principios del siglo XIX la aparición de instrumentos ópticos, buenos microscopios fotónicos, para descubrir que los tejidos vegetales y animales estaban constituidos por agregados de células, independientes desde el punto de vista estructural, pero interrelacionadas funcionalmente.

Las células no son solamente minúsculas, también son incoloras y translúcidas en su mayoría. Dilucidar este hecho permitió el desarrollo de un surtido de técnicas colorantes que asegurarían un contraste suficiente para poder visualizar las células en toda su estructura y complejidad, y más adelante, en el siglo XX, la observación de detalles de la ultraestructura de los componentes más finos del citoplasma, gracias al empleo de la microscopía electrónica.

La observación de las células permite estudiar principalmente la estructura; aunque también a partir de hallazgos en las micrografías, que son imágenes estáticas, se puede inferir sobre alguna actividad celular o proceso fisiológico. Las células no pueden sobrevivir si son separadas del organismo al cual pertenecen, por lo que ameritan condiciones especiales para poder subsistir o perpetuarse y de la simple observación se puede pasar a una intervención activa, tales como el aislamiento y cultivos celulares, técnicas estas que permiten obtener datos relacionados directamente con las actividades fisiológicas de las células y sus relaciones con el entorno.

Unidades de medida empleadas en microscopía:

Una unidad de medida es una cantidad estandarizada de una determinada magnitud física. Para determinarla se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI) también conocido como sistema métrico, que es el más ampliamente usado. Este sistema se originó a partir del antiguo sistema métrico decimal mks (metro-kilogramo-segundo), el cual fue mejorado. Fue creado en 1960 por la Conferencia General de Pesas y Medidas, celebrada en Paris (Romero D. 2007).

La longitud es una magnitud creada para medir la distancia entre dos puntos y su unidad es el metro. La palabra metro proviene de la palabra griega metrón. Se representa con la letra m.

Submúltiplos del metro:

decímetro (dm): 10-1 metros.

centímetro (cm): 10-2 metros.

milímetro (mm): 10-3 metros.

micrómetro (µm): 10-6 metros.

nanómetro (nm): 10-9 metros.

angstrom (Å): 10-10 metros.

picómetro (pm): 10-12 metros.

femtómetro o fermi (fm): 10-15 metros.

attómetro (am): 10-18

metros.-zeptómetro (zm): 10-21 metros.

-yoctómetro (ym): 10-24 metros.

Conocer las unidades de medida de longitud es relevante porque entre otras cosas, algunas de ellas se emplean en la microscopía:

Equivalencias: Relaciones entre las diferentes unidades de medida empleadas en microscopía:

1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Å Å = 0.1 nm1 Å = 0.0001µm

El tamaño de la célula está relacionado con la función que ella desempeña y es una de las variables morfológicas que con frecuencia se ve afectada cuando la célula presenta alteraciones patológicas. Por ejemplo, en tejidos cancerosos se observa la hipertrofia, que consiste en un aumento en el tamaño mas no en el número de las células que forman el tejido (29). Generalmente el tamaño es constante para cada estirpe (o tipo) celular e independiente del tamaño del individuo; una célula del riñón de un humano es del mismo tamaño que la célula equivalente del riñón de un ratón; sin embargo, el riñón humano es más grande porque posee mayor número de células.

Las dimensiones de las células y sus elementos se pueden apreciar y cuantificar tanto al microscopio fotónico como al microscopio electrónico (Fig.1)

Figura 1 Dimensiones de células

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio óptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para microfotografía). En los microscopios binoculares la observación se hace con los dos ojos y esto permite una observación más cómoda y se percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se

fabrican en diferentes tamaños incluyendo microscopios pequeños portátiles o de viaje. Dentro de los tipos de microscopios se describen:

• Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. Es el microscopio de uso más común.

• Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparación al microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 2).

Figura 2.-Microscopio invertido con el revólver y objetivos por debajo de la platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior. Tomado de Instrumental Pasteur. Microscopio Olympus.

• Microscopio estereoscópico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen estereoscópica, en tres dimensiones (3D) del espécimen. Se fundamenta en la visión binocular convencional, en la que los dos ojos observan el espécimen con ángulos levemente distintos. El microscopio estereoscópico debe ser binocular. Se utiliza para observar especímenes de gran tamaño, sin corte o preparación previa puesto que emplea luz incidente y no funciona por trans-iluminación. Es ideal para realizar microdiseccion (fig. 3).

Figura 3.-Microscopio estereoscópico. Tomado de Kosmos Scientific de México

 • Microscopio quirúrgico: Es un microscopio que se emplea en microcirugía. Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitándole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más cuidadosamente y con menores posibilidades de lesión. Algunos modelos más sofisticados

tienen piezas automatizadas robóticas. Se utiliza principalmente en intervenciones quirúrgicas en las que se amerite una minuciosa disección, como por ejemplo del cráneo y cerebro o del globo ocular (fig. 4)

Figura 4.-Cirujano empleando microscopio quirúrgico. Tomado de Cerrón, V

 

• Microscopios fotónicos especiales: Ciertos especímenes, principalmente las células vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio común de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y no aportan datos relevantes, a pesar del poder de resolución de los objetivos empleados. Para ello se han creado microscopios con ciertas particularidades que permiten la observación de ese tipo de especímenes con un incremento muy satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:

Microscopio de campo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta.

Microscopio de fluorescencia.

Microscopio de polarización.

Microscopio de contraste de fases.

Microscopios interferenciales.

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.

Las células están constituidas a partir de sustancias químicas orgánicas e inorgánicas las cuales se organizan en diversos niveles para formar la estructura de los organoides celulares (membranas, mitocondrias, núcleo, citoesqueleto, entre otros) y permitir las funciones celulares. El poder de resolución del microscopio óptico o fotónico es de 0,2µm, y este hecho limita la observación y el estudio de la organización de los compuestos químicos celulares y los organoides. La microscopía electrónica es el único método que hace posible la toma de imágenes directas de esas estructuras a niveles supramoleculares; detalles que también son denominados con el término de ultraestructura celular. El límite o poder de resolución teórico del microscopio electrónico es de 0,2nm y esto es en parte posible gracias a un tratamiento especial al que se somete el tejido que va a ser examinado.

Desde el año 1878 se conocía que el poder de resolución del microscopio fotónico estaba limitado en parte por la longitud de onda de la luz utilizada, pudiendo ser mejorado mediante objetivos de inmersión o el empleo de luz ultravioleta (Abbe, E. 1878).

La posibilidad de lograr un mayor poder de resolución no se vislumbró hasta que se realizaron dos descubrimientos científicos que fueron decisivos.

1. El descubrimiento de las propiedades de los electrones libres, en 1924.

2. El hallazgo de la analogía entre el efecto de una resistencia magnética sobre un haz de electrones libres y el efecto de las lentes convergentes sobre un rayo de luz, en 1926.

A partir del hecho que la longitud de onda de los electrones en movimiento es menor que la longitud de onda de la luz visible, se concibió la idea que las partículas más pequeñas (como la ultra estructura celular) podrían ser observadas con un haz de electrones enfocado con lentes electromagnéticas.( Freundlich, M. 1963)

Técnicas de microscopía electrónica

El principio de la microscopía electrónica es muy similar al de la microscopia de luz y se han desarrollado dos principales técnicas:

1. Microscopía electrónica de transmisión: Se observa a través del espécimen (trans- iluminación). El espécimen se corta en láminas ultrafinas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado. Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica situada por debajo del mismo. La resolución puede ser de 0,2nm.

Semejanzas y diferencias entre la microscopía electrónica y la microscopia de luz

Semejanzas

• Diseño y funciones de sus elementos.

• En relación al sistema de iluminación: La radiación empleada incide directamente sobre la muestra en estudio. Está conformado por una fuente emisora de la radiación y un condensador que enfoca el rayo sobre el preparado histológico.

• El espécimen se coloca entre el sistema de iluminación y los objetivos o sistemas de formación de la imagen.

• En relación al sistema óptico: Las lentes acopladas producen una imagen aumentada del espécimen en estudio. Conformado por una lente objetivo que forma una imagen intermedia y la lente proyectora (ocular, en el caso del microscopio fotónico) que a su vez aumenta la imagen intermedia para formar la imagen aumentada final.

• Pueden convertir la radiación empleada en una imagen permanente (microfotografía).

  Diferencias:   Tabla 1

Elemento Microscopio fotónico Microscopio electrónico

LENTES

De cristal o vidrio, con distancias focales fijas

 

 

Magnéticas, a partir de metales magnéticos, alambre de cobre enrollado, cuya distancia focal varía en relación con la corriente que pasa por la bobina de cobre

AUMENTO Se consigue cambiando los objetivos, rotando el revólver

El aumento del objetivo es fijo (distancia focal) mientras que la distancia focal de la lente proyectora

 varía para lograr los aumentos

PROFUNDIDAD DE CAMPO

Pequeña, por lo que se pueden ver diferentes planos de enfoque al mover el tornillo micrométrico

Mayor, por lo que se puede ver enfocado todo el espesor del corte ultrafino del espécimen

 

FUENTE DE LA RADIACIÓN

Haz de luz: fotones. Generalmente situada por debajo del espécimen (aunque hay excepciones)

Haz de electrones. Ubicada siempre en lo alto del instrumento, por encima del espécimen

ALTO VACÍO No es necesario Imprescindible, para facilitar el desplazamiento de los electrones

RESOLUCIÓN 0,2 µm 0,2nm

Tabla 1.-Comparación entre las características generales de los microscopios de luz y microscopios electrónicos.( Sjöstrand, F 1967)

 

2. Microscopía electrónica de barrido: Se observa la superficie de un espécimen sólido (epi-iluminación). Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x. Se producen imágenes muy interesantes en 3D (tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo. Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector. La señal se observa en un monitor de televisión. Los átomos del espécimen producen rayos X

que también son detectados.

La técnica microscópica se ha desarrollado con el transcurso de los años, logrando resoluciones antes insospechadas como la visualización de átomos a un aumento sorprendente. De igual manera se ha logrado intensificar el contraste mediante numerosas técnicas al estudiar células y tejidos; sin embargo, la mayoría de ellas producen alteraciones que pueden distorsionar la realidad, o peor aún, pueden ser letales para las células vivas; motivo por el cual el estudio de células muertas y fijadas se ha visto favorecido, permitiendo primordialmente el examen detallado de la morfología celular. En estas circunstancias la investigación de las funciones celulares se ha visto limitada en cierta medida, no obstante, el reto futuro es el perfeccionamiento del estudio microscópico de células vivas, a una resolución importante,

mediante aumentos y contraste suficientes y cada vez más específicos, tanto para el estudio “in vitro” como el de las células dentro del organismo; éste hecho considerado ideal ya ha sido logrado en cierta manera (Nemoto, T.2008).

Desarrollo

Intercambio de Gases en plantas

Las plantas necesitan oxígeno para realizar la respiración celular y dióxido de carbono para la fotosíntesis. La entrada de estos gases se realiza principalmente a través de los estomas.

Los estomas son estructuras que aparecen en la epidermis de la hoja. Controlan los procesos de entrada y salida de gases y la transpiración en la planta.

El círculo señala uno de los muchos estomas que forman parte de la epidermis de una hoja. Aunque se aprecia mal en la fotografía, se puede intuir que está formado por dos células llamadas células oclusivas.

Si aumentamos la imagen, podemos observar estas células con una mayor definición:

EL APARATO ESTOMATALEl aparato estomatal típico están conformado por dos células guardianas (o células oclusivas), un poro estomático formados por estas dos células; y las células subsidiarias (o accesorias) que se ubican junto a cada célula guardiana Las células guardianas de las dicotiledóneas frecuentemente tienen forma de riñón pero en gramíneas suelen ser elongadas. Los estomas están presentes en las hojas, los tallos, las flores y los frutos, pero no en la raíces aéreas. Cuando un estoma esta abierto, el poro estomático puede tener 3-12 µm de ancho y 10-30 µm o más de largo.

Si los estomas están abiertos, el área del poro respecto a la superficie total de la hoja varía entre 0,4 y 2% (Kramer & Boyer 1995). Los estomas pueden estar presentes en ambas superficies de las hojas (hojas anfiestomáticas) o sólo en una superficie, usualmente la inferior (hojas hipostomáticas). Dentro de las especies con hojas anfiestomáticas, estas pueden tener igual número de estomas en ambas caras, o mayor cantidad en el envés de la hoja. Sin embargo, hay algunas especies que poseen mayor número de estomas en el haz

La localización y tamaño de los estomas influye en la tasa de transpiración. El proceso de transpiración es conducido y regulado por los estomas. Dentro de la hoja, el agua líquida que se encuentra en la superficie de las células del mesófilo se evapora y difunde hacia los espacios intercelulares que existen en el parénquima. Si los estomas están abiertos la

El ostiolo es la abertura rodeada por las células oclusivas o estomáticas. Junto a cada célula oclusiva existe una célula anexa, que participa en la apertura y cierre de los estomas.

diferencia de presión de vapor provoca la pérdida de vapor de agua hacia la atmósfera. Las moléculas de CO2 sigue esta misma ruta pero con una dirección inversa, marcando la condición de simultaneidad del proceso de fotosíntesis y transpiración (Pearcy et al. 1989).

La transpiración y la intensidad de la respiración está en razón directa al número y abertura de los estomas y como las hojas son los principales órganos de las plantas donde se realiza la fotosíntesis, la cantidad y distribución de los estomas influyen directamente sobre la asimilación clorofílica (Ruiz et al., 1962). la disminución de la cantidad de estomas por mm2 incrementa la resistencia estomática de la planta y de esta manera evita un exceso de transpiración; sin embargo, tanto la densidad como el Indici de estomas son tan  variables que están fuertemente influenciadas por diversas condiciones estresantes como condiciones de sequía y altas concentraciones salinas además el material vegetal que se trate (Salas et al., 2001).

Materiales y Métodos

Material de laboratorio Microscopio. Estereoscópico (Figura 3) Microscopio óptico binocular (Figura 1)Escalpelo o bisturí Pinzas. 2 Portaobjetos/ 2 Cubreobjetos. Banco de tinción o Placa de Petri. Papel de filtro. Frasco Lavador.

Reactivos Glicerina al 50% en frasco cuentagotas Verde de metilo acético.

Material biológico Hojas recién cortadas de lirio, tulipán, gladiolo, cebolla o puerros (cualquier monocotiledónea) Hojas de musgo o Elodea (alga acuática).

MÉTODO a) Obervación de estomas

1. Colocar el material vegetal sobre una caja de petri debajo del microscopio estereoscópico Hacer una incisión transversal, con una cuchilla, de medio centímetro de longitud, en el tercio superior de la hoja. Con las pinzas tirar de uno de los bordes del corte rasgando en sentido longitudinal de la hoja. Se desprenderá fácilmente una fina membrana, que es la epidermis de la hoja.

2. Con el portaobjetos situado encima de la placa de Petri, añade a la muestra unas gotas de colorante verde de metilo acético y espera, más o menos 5 minutos, para que este ejerza su acción. Transcurrido los cinco minutos, elimina el colorante vertiendo agua sobre la muestra, que habrás sujetado al porta con ayuda de unas pinzas. El exceso de agua o de colorante que queda en los alrededores de la muestra se seca con un trozo de papel de filtro. 4. Añade unas 2 ó 3 gotas de glicerina al 50% y con cuidado coloca el cubreobjetos sobre el fragmento de epidermis, cuidando de que no queden burbujas de aire entre el cubre y el portaobjetos. Observa al microscopio óptico comenzando con el objetivo de menor aumento, para luego ir pasando a otros de mayor aumento.

Estomas, objetivo 4x, cámara ajustada a 0,3MPx (resolución VGA 640x480

Estomas objetivo de 10x

Estomas, objetivo 100x, cámara ajustada a 0,3MPx (resolución VGA 640x480

Imagen tomada con un microscopio confocal de un estoma de Arabidopsis thaliana mostrando dos células oclusivas cuyos contornos exhiben fluorescencia

verde y los cloroplastosen color rojo.

Imagen de un estoma abierto (arriba) y cerrado (abajo) deArabidopsis thaliana.

Imagen de un estoma abierto (arriba) y cerrado (abajo) deArabidopsis thaliana.con microscopio de luz invertida

La microscopía evolucionará para permitir el estudio y comprensión, no sólo de nuevos aspectos de la morfología a una escala nanométrica, sino también para obtener nuevos datos al observar la célula viva, en plena actividad y desarrollo de sus funciones vitales; así como su comportamiento y respuestas ante diversas modificaciones de su medio y su relación con las células vecinas.

Bibliografía

KEARNS EV & SM ASSMANN. 1993. The Guard Cell-Environment Connection. Plant Physiology 102: 711-715.

PEARCY RW, ED SCHULZE & R ZIMMERMANN. 1989. Measurement of transpiration and leaf conductance: 137- 153. En RW Pearcy, J Ehleringer, HA Mooney & PW Rundel (eds.). Plant Physiological Ecology: Field

methods and instrumentation. Chapman and Hall, New York.

Montalvo A (2010) Microscopia.

Smith, BJ, Raymer, MG (2007). Funciones de onda de fotones, paquete de ondas de cuantización de la luz, y la teoría de la coherencia. New Journal of Physics, 9, 414, 1-37.

Hillion, P., Quinnez, S. (1983). Principio de Huygens-Fresnel en la teoría spinor de la luz. J. Opt., (14), 143-160.

Instituto 26.-Nacional de Estándares y Tecnología - "NIST". Laboratorio de Física. El Sistema Internacional de Unidades. Recuperado en Noviembre 24, 2007, de la World Wide Web: http://physics.nist.gov/Pubs/SP330/contents.html

Romero D. Sistema Internacional. Mundo de Eric Weisstein de Física. Recuperado en Noviembre 24, 2007, de la World Wide Web: http://scienceworld.wolfram.com/physics/SI.html

Enciclopedia Microsoft ® Encarta® Online 2007 Recuperado en Agosto 2 del 2014, de la World Wide Web: http://es.encarta.msn.com © 1997-2007 Microsoft

Robbins, S. (1975). Patología Estructural y Funcional. Madrid: Editora Importécnica SA

Cerrón, V. Recupera do en Agosto 4 2014, de la World Wide Web: http://vladimircerron.com/index.html

Leica Microsystems. Recuperado Agosto 3 de 2014, de la World Wide Web: http://www.leica-microsystems.com/Surgical_Microscopes

La Ciencia y el Centro de Recursos Educativos. Charleton Colegio. Recuperado en Agosto 2 del 2014, de la World Wide Web: http://serc.carleton.edu/images/research_education/geochemsheets/techniques/UWSEM. jpg

Nemoto, T. Sección de Procesamiento de la Información (microscopía de dos fotones).Centro para el experimento cerebro. Instituto Nacional de ciencias fisiológicas. Japón. Recuperado en Agosto 2, de la World Wide Web: http://www.nips.ac.jp/eng/outline/res/brain-exp.html.

Sjöstrand, F. (1967). Microscopía Electrónica de células y tejidos. Vol. 1, instrumentos y técnicas. Nueva York: Academic Press Inc.

Abbe, E. (1878). Muere optischen Hilfsmittel der Mikroskopie. Brunswick: Vieweg.

Freundlich, M. (1963). Origen del microscopio electrónico. Ciencia, Nueva Serie, 142 (3589) 185-188.

Instrumental Pasteur. Microscopio Olympus. Recuperado en Agosto 2014, de la World Wide Web: http://www.instrumentalpasteur.com.ar/index.php?secmode=3&srcmode=7&texto=&marc a = 129 y rubro = -1 y Producto = 4776 y pagina = 1 & idpresupuesto = -1.

Kosmos Scientific de México. Recuperado en Julio 2014, de la World Wide Web: http://www.kosmos.com.mx/fprod/micros/k5420w.jpg

Cerrón, V. Recuperado en Julio 2014, de la World Wide Web: http://vladimircerron.com/index.html