trabajo de alpiste

7/21/2019 Trabajo de Alpiste

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INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIN

CIENTFICA Y TECNOLGICA, A.C.

POSGRADO EN CIENCIAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

Identificacin y caracterizacin de las propiedades biolgicas de

pptidos de alpiste: cereal empleado para el tratamiento de

diabetes e hipertensin

Tesis que presenta

Patricia Aurora Estrada Salas

Para obtener el grado de

Maestroa en Ciencias en Biologa Molecular

Director de la Tesis:

Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa

San Luis Potos, S.L.P., Julio de 2013


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iii

Crditos Institucionales

Esta tesis fue elaborada en el Laboratorio de Protemica y Biomedicina Molecularde la Divisin de Biologa Molecular del Instituto Potosino de InvestigacinCientfica y Tecnolgica, A.C., bajo la direccin de la Dra. Ana Paulina Barba de laRosa. Durante la realizacin del trabajo el autor recibi una beca acadmica delConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (No. de registro 423452) y del InstitutoPotosino de Investigacin Cientfica y Tecnolgica, A. C.


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v

Dedicatorias

A mi familia y a Julio


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Agradecimientos

A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa

A la Dra. Gabriela Margarita Montero Morn

A la Dra. Leticia Santos Martnez

A la Dra. Ma. Del Carmen Gonzlez Castillo de la Facultad de Ciencias Qumicas

de la UASLP

Al Q.F.B. Pedro P. Martnez Cuevas de la Facultad de Ciencias Qumicas de la

UASLP

Al Q.F.B. Manuel Alejandro Ramrez Lee de la Facultad de Ciencias Qumicas de

la UASLP

Al M. en C. Alberto Barrera Pacheco

A los profesores de la Divisin de Biologa Molecular

A los compaeros del laboratorio de Protemica y Biomedicina Molecular

A los amigos del IPICYT

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por la beca otorgada (423452)

Al Instituto Potosino de Investigacin Cientfica y Tecnolgica A.C.


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Contenido

Pgina

Constancia de aprobacin de la tesis ii

Crditos Institucionales iiiActa de examen iv

Dedicatorias v

Agradecimientos vi

Lista de figuras ix

Resumen x

Abstract xi

I. Introduccin y Antecedentes 1

1.1 Generalidades del alpiste (Phalaris canariensis L.) .................................................................. 11.2 Caractersticas estructurales ..................................................................................................... 1

1.3 Composicin qumica de la semilla de alpiste .......................................................................... 3

1.4 Protenas de semilla de alpiste ................................................................................................. 3

1.5 Utilidad del alpiste ..................................................................................................................... 4

1.6 Protenas de reserva ................................................................................................................. 4

1.6.1 Albminas ........................................................................................................................... 5

1.6.2 Globulinas........................................................................................................................... 5

1.6.3 Prolaminas.......................................................................................................................... 6

1.6.4 Glutelinas............................................................................................................................ 6

1.7 Pptidos bioactivos ................................................................................................................... 7

1.7.1 Pptidos con actividad opioide ........................................................................................... 7

1.7.2 Pptidos hipotensivos (inhibidores de la ECA) .................................................................. 7

1.7.3 Pptidos inmunomoduladores y antimicrobianos............................................................... 8

1.7.4 Pptidos con actividad sobre el sistema digestivo............................................................. 8

1.7.6 Pptidos con capacidad inhibitoria de la actividad de la enzima DPPIV........................... 9

1.8 Diabetes .................................................................................................................................... 9

1.8.1 Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV) ....................................................................................... 10

1.9 Hipertensin ............................................................................................................................ 14

1.9.1 Sistema renina-angiotensina-aldosterona........................................................................ 14

1.9.2 Enzima convertidora de angiotensina (ECA) ................................................................... 16

1.9.3 Bradicinina (BK) ............................................................................................................... 18

1.9.4 xido Ntrico ..................................................................................................................... 18


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II. Justificacin 20

III. Objetivo 21

IV. Materiales y Mtodos 22

4.1 Material biolgico .................................................................................................................... 22

4.2 Extraccin de protenas de reserva ........................................................................................ 224.3 Cuantificacin de protenas y electroforesis SDS-PAGE (1-DE)............................................ 22

4.4 Digestin trptica de protenas de reserva .............................................................................. 23

4.5 Simulacin de digestin gastrointestinal in vitro ..................................................................... 23

4.6 Ensayo de actividad dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV) .............................................................. 23

4.7 Ensayo de inhibicin de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) ............................. 24

4.8 Bioensayo de corazn aislado y perfundido de rata ............................................................... 24

4.9 Produccin de xido ntrico (NO) en el efluente venoso de corazones aislados.................... 25

4.9.1 Anlisis estadstico ............................................................................................................... 25

V. Resultados y Discusin 26

5.1 Extraccin y cuantificacin de protenas de reserva............................................................... 26

5.2 Perfil electrofortico de protenas de reserva de alpiste......................................................... 26

5.3 Liberacin de pptidos encriptados por digestin enzimtica in vitro..................................... 28

5.4 Ensayo in vitro de inhibicin de la actividad de la dipeptidilpeptidasa IV............................... 28

5.5 Ensayo in vitro de inhibicin de la ECA .................................................................................. 31

5.6 Evaluacin del efecto vasodilatador de los pptidos de alpiste.............................................. 31

5.7 Produccin de xido ntrico (NO) en el efluente venoso de corazones aislados.................... 36

VI. Conclusiones 38VII. Referencias 39

VIII. Anexos 47


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Lista de Figuras

Pgina

Figura 1. Descripcin de la planta de alpiste. 2

Figura 2.Estructura de la DPPIV. 12

Figura 3.Papel de la DPPIV en la inactivacin de incretinas. 13

Figura 4.Fases del sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona (SRAA). 15

Figura 5.Isoformas principales de la ECA. 17

Figura 6.Protenas de reserva de alpiste expresado en porcentaje (%). 27

Figura 7.Perfil electrofortico de protenas de reserva de alpiste. 27

Figura 8.Perfil de digestiones in vitro de las protenas totales extradas de harina de alpiste. 29

Figura 9.Actividad inhibitoria de los hidrolizados de protenas de alpiste sobre la DPPIV. 30

Figura 10.Actividad inhibitoria de los hidrolizados de protenas de alpiste sobre la ECA. 32

Figura 11.Efecto vasodilatador de pptidos de alpiste (ALP). 34

Figura 12.Porcentaje de vasodilatacin y vasoconstriccin de pptidos de alpiste (ALP). 35

Figura 13.Estimulacin de la produccin de NO por los pptidos de alpiste. 37


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x

Resumen

Identificacin y caracterizacin de las propiedades biolgicas de pptidos de

alpiste: cereal empleado para el tratamiento de diabetes e hipertensin

La diabetes as como la hipertensin y la obesidad se han incrementado

significativamente en Mxico y en el mundo. Estas enfermedades se asocian

principalmente al cambio en los hbitos nutricionales. Por tal motivo, existe gran

inters en identificar y caracterizar nuevas molculas bioactivas provenientes de

alimentos, especialmente los biopptidos obtenidos de la hidrlisis enzimtica de

protenas, son los de mayor potencial para el desarrollo de alimentos funcionales.

El alpiste (Phalaris canariensis L.) tradicionalmente se consume como tratamiento

de la diabetes e hipertensin, sin embargo, a la fecha no existen reportescientficos que identifiquen los bioactivos responsables de estas propiedades, por

lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar y evaluar los pptidos

encriptados en las protenas del alpiste. Las protenas de reserva fueron

fraccionadas en base a su solubilidad y se caracterizaron electroforticamente.

Las prolaminas (37%) y glutelinas (35%) fueron las fracciones mayoritarias. El

patrn electrofortico mostr similitud con el de cereales como cebada, avena y

maz. Los pptidos encriptados (biopptidos) fueron liberados mediante digestin

trptica y empleando el mtodo de simulacin de digestin gastrointestinal in vitro.

Los pptidos menores de 10 kDa mostraron inhibicin del 43.5% sobre la actividad

de la dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV) y del 73.5% sobre la actividad de la enzima

convertidora de angiotensina (ECA). Para evaluar el efecto vasoactivo de los

biopptidos se utiliz un bioensayo de corazn aislado y perfundido de rata, en

donde se evalu la presin de perfusin como un ndice del tono vascular, y la

magnitud de la contractilidad del miocardio, de forma simultnea. Tambin se

cuantific la produccin de xido ntrico (NO) en el efluente venoso del coraznaislado. La produccin de NO de los biopptidos de alpiste fue de 12.24 M. Estos

hallazgos apoyan cientficamente el empleo del alpiste en la prevencin de

diabetes e hipertensin y el alto potencial de este cereal como alimento funcional.

Palabras claves: ECA, DPPIV, Phalaris canariensis, xido ntrico.


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xi

Abstract

Identification and characterization of the biological properties of peptides

birdseed: cereal used for the treatment of diabetes and hypertension

Diabetes, hypertension, and obesity have increased significantly in Mexico and

worldwide, diseases associated mainly to the change in diet. Therefore, there is

great interest in identifying and characterizing new bioactive molecules from food;

especially biopeptides obtained and isolated from the enzymatic hydrolysis have

the higher potential for development of functional foods. The canary grass

(Phalaris canariensisL.) is a cereal that in Mexico is used as traditional food for the

treatment of diabetes and hypertension, however, up to date there are no scientific

reports that describe the bioactive responsible for these functions. Therefore, theaim of this work was to characterize and evaluate the bio-peptides of bird seed.

The flour and grain of canary grass were purchased at the supermarket. Storage

proteins were fractionated based on their solubility and characterized

electrophoretically. Prolamins (37%) and glutelins (35%) were the main fractions.

The electrophoretic pattern showed similarity with that of cereals such as barley,

oat and maize. The peptides encrypted (bio-peptides) were released by tryptic

digestion and by the method of simulated in vitro gastrointestinal digestion.

Peptides below 10 kDa showed 43.5% inhibition of the activity of dipeptidyl-

peptidase IV (DPPIV) and 73.5% of the angiotensin converting enzyme (ACE). To

evaluate the effect vasoactive of bio-peptides a bioassay isolated perfused heart

rat was used, where the perfusion pressure was evaluated as an indication of

vascular tone, and the extent of myocardial contractility, simultaneously quantifying

the production of nitric oxide (NO) in the venous effluent of the isolated heart. NO

production with birdseed bio-peptides was 12.24 M. These findings support

scientifically the use of bird seed in the prevention of diabetes and hypertensionand the high potential of this cereal as a functional food.

Keywords: ACE, DPPIV, Phalaris canariensis, nitric oxide.


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I. Introduccin y Antecedentes

1.1 Generalidades del alpiste (Phalaris canariensis L.)

Phalaris canariensis L. comnmente llamado canaryseed, anual canarygrass,canary grass, birdseed o alpiste, pertenece a la familia Poaceae (gramnea),

subfamilia Pooideae y tribu Agrostideae. Es de la misma subfamilia del trigo

(Triticum aestivum L.), cebada (Hordeum vulgare L.), centeno(Secale cereale L.),

y avena (Avena sativa L.). El alpiste es un cereal con un ciclo de cultivo y

prcticas de produccin similares a las de otros cereales invernales, tales como el

trigo y la avena (Jingzhao et al., 2011). En la actualidad, su produccin se

concentra en las provincias del suroeste de Canad (Alberta, Saskatchewan y

Manitoba) y en menor escala en Argentina, Tailandia y Australia (Cogliatti, 2012).

Los granos de alpiste se destinan casi con exclusividad a la alimentacin de aves,

solos o en mezcla con otros cereales como mijo, girasol y lino, sin embargo, el

alpiste tiene una composicin rica en protenas que contienen aminocidos como

cistena, triptfano y fenialanina, que le confiere un amplio potencial como

alimento nutritivo (Cogliatti, 2012).

1.2 Caractersticas estructuralesEl alpiste es una planta herbcea, de alrededor de 60 -100 cm de altura, con tallos

erectos (Figura 1). Tiene vainas sin pelo, hojas planas sin pelo de 20 a 40 mm de

largo por 5 a 10 mm de ancho y panculas compactas de forma ovalada que

conservan la semilla con firmeza (Cogliatti, 2012). Presenta granos pequeos

elpticos con vainas cubiertas con pelos muy finos o tricomas silceos (Abdel-Aal et

al., 1997).


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2

Figura 1. Descripcin de la planta de alpiste. A) pancula, B) espiguilla, C) grano envaina con tricomas (Tomado de Cogliatti, 2012).


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3

1.3 Composicin qumica de la semilla de alpiste

Los principales componentes de la semilla de alpiste son almidn (60%), protena

(21%), aceite (8%) y fibras (7%) (Abdel-Aal et al., 1997). Tambin contiene

fitoqumicos, incluyendo, fitatos, fenoles y taninos (Abdel-Aal et al., 2010). El

porcentaje de fibra total en alpiste es ms bajo que en los cereales comunes. La

avena contiene de 11 a 25%, el trigo de 13 a 21%, y la cebada de 16 a 27%, este

dato sugiere que alpiste no es una buena fuente de fibra (Ward et al., 2008). De

los cidos grasos presentes en alpiste, el 55% corresponde a cido linoleco, 29%

oleco, 11% palmtico, 2.5% linolnico, y el 1% al cido esterico. El aceite es

altamente insaturado, por lo cual tiene un alto potencial para la rancidez rpida,

sin embargo, la presencia de componentes antioxidantes ayudan a retrasar este

proceso durante el almacenamiento (Abdel-Aal et al., 1997). El almidn de alpistedifiere del almidn de trigo y de maz por presentar menor contenido de amilosa

(16 a 22%) (Abdel-Aal et al., 1997), mayor viscosidad, el gel formado es

altamente estable y rgido cuando se calienta o se congela (Abdel-Aal et al., 2010).

Los grnulos de almidn de alpiste son poligonales con un tamao promedio de

1.5-3.5 o 2.5-5.0 m, el tamao pequeo y su facilidad de extraccin hacen del

alpiste un cereal til en la industria cosmtica como un ingrediente en polvo

(Abdel-Aal et al., 1997), en las industrias textil y farmacutica como espesante,

estabilizador coloidal y agente gelificante (Abdel-Aal et al., 2010).

1.4 Protenas de semilla de alpiste

Comparado con otros cereales comunes, el alpiste contiene altos niveles de

protena, alrededor del 21% (Abdel-Aal et al., 2010). Las albminas y las

globulinas de alpiste se encuentran en niveles ms bajos que en el trigo (13.1% en

alpiste vs23.6% en trigo), mientras que las prolaminas y las glutelinas son ms

abundantes en el alpiste (77.7%) que en el trigo (73.5%).

La composicin deaminocidos indican que las protenas de alpiste son deficientes en lisina y

treonina (1.3 y 2.7 g/100g de protena, respectivamente) al igual que las protenas

del trigo (1.9 y 2.8 g/100g de protena, respectivamente). Sin embargo, las

protenas de alpiste son muy ricas en cistena, triptfano y fenialanina (Abdel-Aal

et al., 1997). Las concentraciones de metionina en las protenas de alpiste (1.4


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4

g/100g de protena) son iguales a las del trigo, estas concentraciones representan

solo la mitad de los niveles del estndar de la FAO (Food and Agriculture

Organization). La deficiencia de este aminocido en el alpiste es mejorado por la

presencia de altas concentraciones de cistena (3.3 g/100g de protena) (Abdel-Aal

et al., 1997).

1.5 Utilidad del alpiste

Los granos de alpiste se emplean casi exclusivamente como alimento para

pjaros, sin embargo, Newkirk et al. (2011) demuestran el potencial de alpiste

como alimento para pollos de engorda,as mismo Thacker (2003) propone que el

alpiste puede ser un alimento exitoso para cerdos en crecimiento ya que no

afectan su crecimiento o la calidad de la carne. Rowe et al., (1974) muestran que

los ratones aceptan el alpiste como alimento. Adems, Takagi y Iida (1980)

demostraron que un extracto de ter de alpiste sirvi como un potente antioxidante

en manteca de cerdo y aceite de sardina. Los principales activos antioxidantes de

este extracto identificados fueron esteres de cido cafeco con sitosterol,

gramisterol, campesterol y cicloartenol (Takagi y Iida, 1980; Tan y Shahidi, 2012).

El alpiste tambin se considera por las comunidades tradicionales de Mxico y

otros pases como planta medicinal, esta semilla se emplea para el tratamiento de

afecciones renales e hipercolesterolemia (Cogliatti, 2012), adems se hareportado que la infusin de alpiste tiene propiedades antihipertensivas (Passos et

al., 2012).

1.6 Protenas de reserva

Las protenas de las semillas estn constitudas principalmente por tres grupos: 1)

estructurales, 2) con actividad biolgica (generalmente son enzimas, lectinas, e

inhibidores de enzimas) y 3) de reserva o de almacenamiento (Mandal y Mandal,

2000). Las protenas de reserva constituyen la mayor proporcin de protenas en

semillas, estas protenas son depositadas en cuerpos protenicos durante el

desarrollo del endospermo (Fukushima, 1991), son una fuente de nitrgeno y

azufre necesario para la germinacin de la plntula (Mandal y Mandal, 2000). Las

protenas de almacenamiento representan alrededor del 50% del total de las


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protenas en granos de cereales maduros y tienen un impacto importante en la

calidad nutricional del grano para el consumo humano y ganado o en sus

propiedades funcionales importantes en el procesamiento de alimentos (Shewry et

al., 2002). Las protenas de reserva fueron clasificadas por Osborne (1909) en

base a su solubilidad como: albminas (solubles en agua), globulinas (solubles en

soluciones salinas), prolaminas (soluble en mezclas de alcohol y agua) y glutelinas

(soluble en soluciones cidas, alcalinas, o soluciones de SDS diluido).

1.6.1 Albminas

Las albminas comprenden enzimas metablicas directa o indirectamente

relacionadas a la funcin de almacenamiento del tejido cotiledn. Tambin juegan

un papel importante en la defensa de las plantas, tales como los inhibidores de

hidolasas y las lectinas. A las albminas de tipo 2S se le han atribuido un papel

como protena de reserva y como proveedoras de azufre en la germinacin

(Duranti et al., 2008). Las albminas y globulinas comprenden la fraccin

mayoritaria de las protenas de reserva de dicotiledneas (Mandal y Madal, 2000).

1.6.2 Globul inas

Las globulinas son el grupo de protenas de almacenamiento ms ampliamente

distribuidas, estn presentes no slo en plantas dicotiledneas (leguminosas) sino

tambin en plantas monocotiledneas (cereales). Pueden dividirse en dos grupos

basado en su coeficiente de sedimentacin: las globulinas 7S, tipo vicilina y las

globulinas 11S o tipo legumina. Ambos grupos muestran una variacin

considerable en su estructura, la cual resulta parcialmente del procesamiento

postraduccional (Shewry et al., 1995). Las globulinas 11S consisten de seis pares

de subunidades que interactan no covalentemente. Cada uno de estos pares de

subunidades tienen una subunidad cida de aproximadamente 40 kDa y una

subunidad bsica de aproximadamente 20 kDa, unidas por un puente disulfuro.

Las vicilinas 7S son tpicamente protenas trimricas (Argos et al., 1985) de

aproximadamente 150 a 190 kDa.


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1.6.3 Prolaminas

La mayora de las gliadinas (prolaminas) estn presentes como monmeros,

inicialmente fueron clasificadas en cuatro grupos con base a la movilidad

electrofortica y denominadas como , , y gliadinas, en orden decreciente de

movilidad; sin embargo estudios posteriores, en base a su secuencia de

aminocidos han demostrado que las , gliadinas forman un solo grupo (/).

Mtodos tales como electroforesis bidimensional cromatografa lquida de alto

rendimiento en fase reversa (RP-HPLC) permiti agruparlas en 4 tipos: 1, 2,

5, / y . Basado en el anlisis de secuencia de aminocidos, composicin de

aminocidos y peso molecular, las gliadinas (5 y 1) se caracterizan por un

alto contenido de glutamina, prolina y fenilalanina, y poco contenido de cistena,el

peso molecular de 5 y 1 es de 50 kDa y 40 kDa, respectivamente. Lasgliadinas / y tienen una menor proporcin de glutamina y prolina que las

gliadinas, y presentan superposicin de pesos moleculares de aproximadamente

28 a 35 kDa (Wieser, 2007).

1.6.4 Glutel inas

Las glutelinas ms estudiadas son las del trigo, sus grandes polmeros llamados

macropolmeros de glutelinas y su cantidad en la harina del trigo

(aproximadamente de 20-40 mg/g) dan la mayor contribucin a las propiedadesfuncionales de la masa. La fraccin de glutelinas comprende agregados de

protenas unidos por enlaces disulfuro, despus de la reduccin de los enlaces

disulfuro las subunidades resultantes de las glutelinas muestran una solubilidad en

alcoholes acuosos similar a las gliadinas (Wieser, 2007). Las glutelinas se dividen

en dos grupos, las subunidades de bajo peso molecular y las de alto peso

molecular (Espitia et al., 2008). Las subunidades de bajo peso molecular estn

relacionadas a las / y gliadinas en peso molecular y composicin deaminocidos, las subunidades de alto peso molecular pueden ser agrupadas en 2

tipos, el tipoxy el tipo y, con pesos moleculares de 83 a 88 kDa y de 67 a 74 kDa,

respectivamente (Wieser, 2007).


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1.7 Pptidos bioactivos

Los pptidos bioactivos son pptidos encriptados en las protenas que adems de

su valor nutricional (fuente de aminocidos esenciales) son capaces de ejercer

efectos biolgicos especficos. La mayora de los pptidos bioactivos son

generados espontneamente durante la digestin in vivo a partir de las protenas

que los contienen. No obstante, tambin se han obtenido nuevos pptidos

bioactivos a partir de protenas alimentarias mediante digestin enzimtica in vitro,

empleando enzimas proteolticas de origen microbiano (Martnez y Martnez,

2006). Los pptidos bioactivos pueden ejercer su accin tanto a nivel local (tracto

gastrointestinal) como sistmico (Vermeirssen et al., 2004; Rutherfurd y Moughan,

2005), ya que pueden atravesar el epitelio intestinal y llegar a tejidos perifricos a

travs de la circulacin sangunea (Teschemacher et al., 1997; Vermeirssen et al.,2008). Hasta el momento se encuentran descritos varios pptidos con diferentes

actividades biolgicas, algunos de ellos se describen a continuacin.

1.7.1 Pptid os co n ac tivid ad o pio ideLos pptidos con actividad opioide son pptidos pequeos entre 5 y 10

aminocidos de longitud. Los ms abundantes son las -casomorfinas

denominadas as por derivar de la hidrlisis de la -casena y por su efecto

fisiolgico parecido al de la morfina. Otros pptidos aunque con menor actividadopioide son las exorfinas generadas a partir de la hidrlisis de la -casena y del

gluten del trigo (pptido GYYPT) (Vioque et al., 2000; Hartmann y Meisel, 2007).

1.7.2 Ppti do s h ipo tens ivo s (inhib ido res de la ECA)

Los pptidos Inhibidores de la ECA (ECAi) son generalmente pptidos de cadena

corta, di y tripptidos (Vioque et al., 2000), con frecuencia llevan residuos de

aminocidos polares como prolina (Hartmann y Meisel, 2007). Estos pptidos son

absorbidos fcil y rpidamente en el estmago e intestino. Pueden entrar en elsistema circulatorio e inhibir a la ECA, promoviendo una disminucin de la presin

arterial (Vioque et al., 2000). Un gran nmero de pptidos ECAi han sido aislados

de la digestin de protenas de alimentos, especialmente en leche (ejemplo, el

tripptido VPP), pescado (tripptido LRP), amaranto y carne (tripptido LKP)


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8

(Hartmann y Meisel, 2007, Silva-Snchez, et al., 2008), otros reportes mencionan

efecto inhibitorio con pptidos de maz y arroz (Vioque et al., 2000).

1.7.3 Pptid os inm unomo du lador es y an timic rob ianos

Los pptidos inmunomoduladores pueden potenciar la funcin de las clulasinmune, como la proliferacin de linfocitos, la actividad de las clulas natural killer

(NK), sntesis de anticuerpos y regulacin de citocinas. Adems podran reducir

reacciones alrgicas en trastornos alrgicos mediados por la accin de

anticuerpos IgE y potenciar la inmunidad del tracto gastrointestinal. Se han aislado

de hidrolizados trpticos de protenas de arroz (ejemplo, el pptido GYPMYPLR) y

soya (Hartmann y Meisel, 2007). Los pptidos antimicrobianos han sido

identificados en muchos hidrolizados de protenas, especialmente de la leche.

Actan contra diferentes bacterias Gram positivas y Gram negativas (Escherichia,

Helicobacter, Listeria, Salmonella y Staphylococcus), levaduras y hongos

filamentosos. La interrupcin de la permeabilidad de la membrana es parcialmente

responsable del mecanismo antibacterial (Hartmann y Meisel, 2007).

1.7.4 Ppti do s co n activ idad sobre el sis tema digestiv o

Los pptidos que ejercen sus acciones sobre el sistema digestivo mejoran la

funcin digestiva e inducen el crecimiento de la microbiota no patgena, por

ejemplo los pptidos derivados de la lactoferrina proveniente de la leche (Martnez

y Martnez, 2006). Se han aislado una serie de pptidos procedentes del gluten y

de las y casenas que actan mediante unin a receptores, como moduladores

exgenos de la motilidad intestinal, de la permeabilidad epitelial y de la liberacin

de hormonas intestinales (Martnez y Martnez, 2006). Los pptidos con actividad

sobre la absorcin de minerales previenen la precipitacin de minerales en la luz

intestinal durante la digestin, ya que son capaces de quelar (secuestrar)

minerales ayudando a mantenerlos solubles y facilitar su absorcin (Martnez y

Martnez, 2006).


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1.7.5 Ppt idos an tit rombti co s e h ipoc ol estero lmicos

Los pptidos antitrombticos son pptidos que inhiben la agregacin de plaquetas

en la sangre y la unin de la cadena del fibringeno a los receptores de

superficie de las plaquetas, algunos de estos pptidos son los derivados de lacasena (MAIPPKKNQNK y KNQNK) (hartmann y Meisel, 2007). Los pptidos

hipocolesterolmicos han sido aislados de casena y suero de leche o bien en

pptidos derivados de soya (pptido LPYPR). El mecanismo de este efecto no es

totalmente claro, un posible mecanismo podra ser debido a una reduccin de la

solubilidad del colesterol en forma de micelas, impidiendo as su absorcin

intestinal (Hartmann y Meisel, 2007).

1.7.6 Ppti do s co n cap acid ad inhib itor ia de la activi dad de la enzima

dipep tidi l p eptidasa IV (DPPIV)

Los pptidos con capacidad de inhibir la actividad de la enzima dipeptitil pepditasa

IV ayudan en el tratamiento y prevencin de la diabetes, ya que la DPPIV es una

enzima que hidroliza las incretinas, hormonas involucradas en la secrecin de

insulina. Se han reportado pptidos con esta capacidad en amaranto, trigo, soya,

frijol negro (Velarde Salcedo et al., 2013), salmn (pptido GPAQ) (Li-Chan et al.,

2012) y leche (pptido VAGTWY) (Uchida et al., 2011).

1.8 Diabetes

La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un trastorno metablico multifactorial. Se

caracteriza por hiperglicemia crnica, resistencia a los efectos biolgicos de la

insulina (resistencia a insulina IR) y a un defecto en la secrecin de insulina. Los

factores exactos que conducen al desarrollo de la DM2 no se han aclarado

plenamente (Prez, 2009). Desde el punto de vista del mecanismo fisiopatolgico,

en la DM2 se observan tres fases: a) aparicin de un estado de IR perifrica a lainsulina, generalmente asociada a valores de normoglicemia, b) una segunda fase

asociada a una IR ms marcada a nivel de tejidos perifricos (msculo, tejido

adiposo) donde existe una sobreproduccin de insulina que no alcanza a controlar

la homeostasis de glucosa (hiperglicemia postpandrial), c) una fase final, asociada

a una declinacin en el funcionamiento de las clulas beta pancreticas, donde


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10

disminuye la sntesis de la hormona (Prez, 2009). Se ha reconocido un nuevo

mecanismo involucrado en la fisiopatologa de la DM2: el dficit de produccin y/o

accin de las principales incretinas, la Glucagon like pptido-1 (GLP1) y el

Polipptido insulinotrpico glucosa dependiente (GIP). Las incretinas son

enterohormonas que estimulan la secrecin de insulina en respuesta a la ingesta

de nutrientes. Ambas presentan tambin efecto trfico sobre las clulas beta de

los islotes pancreticos. GLP-1 tiene otras acciones como son la inhibicin de la

secrecin de glucagn, enlentecimiento del vaciamiento gstrico e inhibicin del

apetito. Ambas incretinas son rpidamente hidrolizadas por la enzima DPP IV. Las

terapias actuales para el tratamiento de la diabetes se basan en frmacos como

los incretinomimticos, anlogos y los inhibidores de DPPIV, que se presentan

como una teraputica prometedora para los pacientes con DM2 (Bayon et al.,2010).

1.8.1 Dipeptid i l p eptidasa IV (DPPIV)

La DPPIV es una serina exopeptidasa perteneciente a la familia de las protenas

S9B que cortan dipptidos X-prolina, X-hidroxiprolina, X-dehidroprolina o X-alanina

al extremo N-terminal de protenas tales como, quimosinas, neuropptidos,

hormona liberadora de la hormona de crecimiento, y las hormonas GLP 1 y GLP

2. La DPPIV es una glicoprotena transmembranal del tipo II, en su dominiocitoplasmtico tiene seis aminocidos N-terminal, y en el dominio extracelular

cuenta con un segmento flexible, una regin rica en cistena, una regin

glicosilada y una regin cataltica en el C-terminal (Figura 2). Esta enzima se

expresa en la superficie membranal de muchos tipos celulares y cuyas funciones

fisiolgicas son en gran medida desconocidas (Matteucci y Giampietro, 2009). Se

sabe que tiene una funcin dual, como proteasa regulatoria y protena de unin

(Mentlein, 1999). La DPPIV est localizada en el rin, hgado, en clulasepiteliales del ducto pancretico, tambin se encuentra en fluidos corporales

relacionados en nutricin y excrecin (lumen del intestino, bilis, fluido pancretico,

orina); sin embargo, tambin est en contacto cercano con hormonas circulantes

en la sangre, ya que se encuentra en clulas epiteliales de vasos sanguneos y

adems est localizada como enzima soluble en el plasma sanguneo. Entre las


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clulas del sistema inmune, la DPPIV se expresa en linfocitos T-helper activado y

los subconjuntos de macrfagos (Mentlein, 1999). Tambin es responsable de

degradar las incretinas (GLP1 y GLP2) (Figura 3), por tanto los inhibidores de la

DPPIV incrementan el tiempo de accin de las incretinas (Mentlein, 1999; Barnett,

2006).


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Figura 2. Estruc tura d e la DPPIV.La DPPIV cuenta con un dominio citoplasmtico y un

dominio extracelular en donde se localiza la regin cataltica, la cual tiene un centrocataltico tipo serin-proteasa (Modificado de Mentlein, 1999).


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Figura 3. Papel de la DPPIV en la in act ivacin de in cret inas. Las hormonas GLP-1 yGIP son liberadas postprandialmente por las clulas L clulas K del intestino,transportadas en la sangre hacia las clulas pancreticas donde estimulan la secrecinde insulina. La DPPIV en la superficie de las clulas endoteliales o soluble en la sangre,degrada ambos pptidos del N-terminal, resultando una rpida prdida de la actividadhormona (Modificado de Mentlein, 1999).


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1.9 Hipertensin

La hipertensin arterial es una enfermedad crnica de etiologa multifactorial, cuyo

signo caracterstico es la elevacin persistente de la presin arterial (PA)

(Oropesa-Fernndez y Gallego-Fernndez, 1995), siendo esta patologa una de

las principales causas de muerte en el mundo (Fritz et al., 2011). Se estima que

existen ms de 600 millones de personas que la padecen (Rosas 2003; Lara et al.,

2004). La PA se caracteriza bsicamente por la existencia de una disfuncin

endotelial (DE), y en consecuencia un desequilibrio entre los factores relajantes

del vaso sanguneo como el xido ntrico (NO), el factor hiperpolarizante del

endotelio (EDHF) y los factores vasoconstrictores (principalmente endotelinas)

(Wagner-Grau, 2010). Tambin existe una disminucin a nivel del endotelio de la

prostaciclina-PGI2 (protena vasodepresora) y el aumento relativo del tromboxano-TXA2 intracelular (protena vasoconstrictora) (Wagner-Grau, 2010). Otro factor

fisiopatolgico considerado en la gnesis de la hipertensin arterial es el

incremento en la secrecin o la actividad inapropiada de la renina, dando como

resultado un incremento en la produccin de angiotensina II y aldosterona a travs

del sistema renina-angiotensina-aldosterona (Gamboa, 2006) el cual se describe a

continuacin.

1.9.1 Sistema renina-angio tensin a-aldo steron a

El sistema renina-angiotensina-aldosterona (Figura 4) es uno de los sistemas

principales reguladores de la presin arterial, fluido y homeostasis de los

electrlitos. El angiotensingeno es una protena globular grande (52 a 60 kDa)

que sirve como sustrato para la renina, enzima que cataliza la conversin

proteoltica de angiotensingeno al decapptido angiotensina I (ANGI). La ANGI

es a su vez es transformada por la enzima convertidora de angiotensina (ECA) al

octapptido angiotensina II (ANGII). La unin de la ANGII a sus receptores, mediala vasoconstriccin y la liberacin de aldosterona (Gamboa, 2006).


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1.9.2 Enzima con vert id ora de angio tensin a (ECA)

La dipeptidil carboxipeptidasa, denominada comnmente como ECA remueve el

dipptido C-terminal His-Leu de ANGI generando la ANGII el cual es un potente

vasoconstrictor (Figura 4). La ECA, adems inactiva la bradicinina (de accin

vasodilatadora), removiendo secuencialmente los dipptidos Phe-Arg y Ser-Pro

(Moreau et al., 2005). Por esto la ECA tiene un papel importante papel en la

homeostasis de la presin sangunea (Martnez, 1992). Estructuralmente la ECA

es una metalopeptidasa de zinc y funcionalmente una ectoenzima unida a

membrana. Existen 3 isoformas principales de la ECA: la somtica, la testicular o

germinal y la plasmtica o soluble. La ECA somtica es una glicoprotena

bilobulada de 170 kDa unida a la membrana celular y que tiene una regin

hemodimrica extracelular (Figura 5), se encuentra en vasos sanguneos, riones,corazn y cerebro, principalmente, posee dos dominios homlogos con un sitio

cataltico activo cada uno (sitio activo N-terminal y sitio activo C terminal), un

dominio de anclaje transmembrana y una cola corta de carboxilo intracelular

(Santeliz et al., 2008). La ECA testicular es una glicoprotena de 90 kDa que se

encuentra exclusivamente en las clulas germinales de los testculos, se diferencia

a la ECA somtica en que slo tiene un amino terminal en la regin extracelular y

por lo tanto tiene un sitio catalticamente activo (Figura 5). La ECA plasmtica se

piensa que deriva de la segmentacin proteoltica de la regin C-terminal de la

ECA somtica desde la membrana celular y carece del dominio transmembrana en

la porcin intracelular; por lo tanto, la ECA soluble corresponde a la regin

extracelular de la ECA somtica y contiene 2 sitios activos (Figura 5).


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Figura 5. Isoform as princ ipales de la ECA:somtica, testicular o germinal y plasmticao soluble (Modificado de Santeliz et al., 2008).


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1.9.3 Brad icinin a (BK)

La bradicinina es una cinina regulada por el sistema calicrena-cinina, este sistema

al ser activado libera cininas vasoactivas (Moreau et al., 2005). La BK es un

nonapptido de bajo peso molecular (1060.21 Da) el cual es rpidamente

metabolizado por metaloproteasas endgenas, incluyendo la ECA cininasa II,

endopeptidasa neutral (NEP o neprilisina), carboxipeptidasa N (CPN o cininasa I)

y aminopeptidasa P. El tiempo de vida media de la BK en plasma es de

aproximadamente 15 segundos y sus niveles de circulacin son relativamente

bajos (0.2-7.1 pM) (Moreau et al., 2005). La BK tiene efectos antihipertensivos,

antitrombognicos, antiproliferativos y antifibrognicos. Tambin participa en los

procesos inflamatorios mediante la activacin de clulas endoteliales para

promover la vasodilatacin y el aumento de la permeabilidad vascular,produciendo los sntomas clsicos de la inflamacin, como enrojecimiento, calor,

hinchazn y dolor. La manera en que BK media sus efectos es al interactuar con

sus receptores B1 y B2, estos receptores estn acoplados a protena G (GPCR),

que interactan a travs de la va las protenas Gq/11y Gi/oy tambin a travs de

efectores intracelulares. Por ejemplo, la BK se une al receptor B2 endotelial

permitiendo la produccin de NO, la formacin de prostaciclinas, la elevacin de

Ca2+ intracelular y la formacin de factor hiperpolarizante, que desencadena

vasodilatacin y el incremento de la permeabilidad vascular (Maurer et al., 2011).

1.9.4 xid o Ntr ic o

El endotelio, localizado en la tnica ntima de los vasos sanguneos (Cabrera,

2004), regula la funcin plaquetaria, el sistema de coagulacin, modula el tono

vascular, controla la proliferacin de las clulas musculares lisas locales y recluta

clulas sanguneas. Uno de los productos ms importantes que sintetiza el

endotelio es el xido ntrico (NO). El NO tiene una vida media ultracorta (seismilisegundos), es el principal responsable de mantener un estado de

vasodilatacin regulado (Duarte et al., 2008) su produccin en el endotelio es

inducido por sustancias vasoactivas como la BK, al activar la enzima xido ntrico

sintetasa constitutiva (eNOS) a partir de la L-arginina. La eNOS es una enzima

calcio dependiente y mantiene el equilibrio fisiolgico en los tejidos donde se libera


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(Mena y Rivern, 1999). Despus de que se forma el NO, se difunde a travs del

endotelio unindose principalmente al grupo Hemo de la guanilato ciclasa,

favoreciendo la conversin de guanosintrifosfato (GTP) a guanosinmonofosfato

(GMPc) que finalmente favorece la relajacin vascular (Duarte et al., 2008)

Adems, de la regulacin en la vasodilatacin que ocasiona el NO, tiene otro tipo

de funciones, tales como, regular la expresin de clulas musculares lisas

vasculares, evitar la adhesin leucocitaria local, y tener un efecto antiagregante

plaquetario (Duarte et al., 2008).


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II. Justificacin

Hoy en da el desarrollo y progresin de diabetes e hipertensin representan

graves problemas de salud pblica a nivel nacional, declarndose que Mxico

ocupa el primer lugar de casos de diabetes y obesidad sobre todo en nios(Danaei et al., 1980; Hermansen, 2000). Se sabe que estas enfermedades estn

relacionadas con los hbitos alimenticios (Hannah y Howard, 1994; Wang et al.,

2008) y que una dieta saludable reduce el riesgo de padecerlas (Sirtori et al.,

2009), por lo tanto, los productos nutracuticos o funcionales representan una

alternativa para mejorar el estado de salud y en consecuencia la calidad de vida

del ser humano (Afman y Muller, 2008). Los pptidos encriptados en las protenas

de los alimentos son secuencias especficas de 2 a 10 aminocidos que poseen

importantes funciones biolgicas por lo que su estudio se ha incrementado por su

importante implicacin en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la leche

es una fuente importante de biopptidos (Hartmann y Meisel, 2007), al igual que

los granos de soya, amaranto y maz (Vioque et al., 2000; Silva-Snchez et al.,

2008). El alpiste es un cereal que se emplea bsicamente para la alimentacin de

pjaros, sin embargo debido a su alta calidad nutricional, es decir, un elevado

contenido de aminocidos esenciales, han derivado en el desarrollo de variedades

libres de slice que permite el consumo en humanos. A partir de ello, se hangenerado harinas que se encuentran en los supermercados como alimentos para

tratar la diabetes e hipertensin pero no existen reportes cientficos que indiquen

cual o cules son los compuestos bioactivos presentes en este grano y que

validen su uso como promotor de la salud. Por lo tanto, la finalidad de este trabajo

fue caracterizar las protenas de reserva de alpiste, digerir las protenas para

liberar los pptidos encriptados y evaluar los efectos antidiabticos y

antihipertensivos.


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III. Objetivo

Caracterizar las protenas de reserva de alpiste (Phalaris canariensis L.), liberar

los pptidos activos empleando dos mtodos de digestin proteoltica y evaluar la

actividad inhibitoria in vitrode los pptidos sobre la enzima DPPIV y la ECA, ascomo medir el efecto vasodilatador empleando un sistema de corazn aislado.

Objetivos especficos

Establecer las condiciones para la extraccin de protenas de reserva de

alpiste.

Cuantificar las protenas de reserva de alpiste.

Obtener el perfil electrofortico de las protenas de alpiste.

Determinar las condiciones de hidrlisis de las protenas de alpiste para

liberar pptidos activos.

Caracterizar la actividad inhibitoria de los pptidos de alpiste sobre la

enzima dipeptidil peptidasa IV (DPPIV).

Caracterizar la actividad inhibitoria de los pptidos de alpiste sobre la

enzima convertidora de angiotensina (ECA).

Evaluar el efecto vasoactivo de los pptidos de alpiste mediante un sistema

de corazn aislado y perfundido de rata (sistema de perfusin Langendorff).


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IV. Materiales y Mtodos

4.1 Material biolgico

La semilla de alpiste comercial Marabu y la harina comercial mas Lait producto

sanitizado libre de fibras de silica fueron comprados en mercados locales. Mas Lait

es el producto comercial consumido para el tratamiento de hipertensin y diabetes.

La semilla de alpiste se coloc en agua en una proporcin 1:5 (p/v) toda la noche

a temperatura ambiente, el agua de remojo fue eliminada y el grano se moli y el

lquido resultante se consider como leche de alpiste. El grano de alpiste se

moli y la harina obtenida se tamiz a travs de malla 80 y se nombro harina de

alpiste. La harina de la semilla en remojo, se obtuvo poniendo la semilla en agua

1:5 (p/v) toda la noche a temperatura ambiente, posteriormente se dejo secar, semoli y se tamiz y se nombr harina de grano remojado.

4.2 Extraccin de protenas de reserva

Las protenas de reserva fueron extradas a partir de harina de las tres

presentaciones (harina de alpiste, harina de grano remojado y de la harina mas

Lait). Las protenas se fraccionaron en base a su solubilidad (Osborne, 1909). La

fraccin de albmina se obtuvo empleando agua destilada (1:10 p/v). Para la

extraccin de globulinas 7S la pastilla resultante se resuspendi en 0.1 M NaCl,0.01 M KH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7.5. La fraccin de globulinas 11S se extrajo

utilizando 0.8 M NaCl, 0.01 M KH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7.5. Las prolaminas se

obtuvieron con etanol al 70% y finalmente las glutelinas con 0.1 M NaOH. La

protena total de las harinas fue extrada empleado 7.5 M urea, 63 mM CHAPS,

2.2 M Thiourea, 22 mM clorhidrato de tris, 17.3 mM trizma base, 0.25% (v/v) triton

X-100, pH 3.1, se agit empleando vortex y se centrifug a 13,000 rpm por 10 min

y se recupero el sobrenadante. Todas las muestras se analizaron por triplicado.

4.3 Cuantificacin de protenas y electroforesis SDS-PAGE (1-DE)

Para cuantificar las protenas de reserva se utiliz el kit Pierce BCA Protein

Assay (Thermo Scientific). La concentracin de pptidos en las digestin trptica y

simulacin gastrointestinal se determin utilizando el kit Lowry-based DC protein


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Assay (Bio Rad). Se emple como estndar albmina de suero bovino (BSA). La

presencia de protenas de reserva se visualizo con el mtodo SDS-PAGE

(Laemmli, 1970).

4.4 Digestin trptica de protenas de reservaPara liberar los biopptidos de las protenas de reserva de alpiste (harina de

alpiste, harina proveniente de la semilla remojada, harina comercial, y leche de

alpiste liofilizada) se digirieron con tripsina de pncreas de cerdo, a una relacin

de enzima:sustrato 1:5 (p/p). La digestin se realiz utilizando 100 mM Tris pH 8 a

37 C por 6 h, y la reaccin se detuvo por congelacin de la muestra. Para eliminar

la tripsina, los digeridos de alpiste se ultrafiltraron empleando membranas de 10

kDa de peso molecular de corte.

4.5 Simulacin de digestin gastrointestinal in vi t ro

La simulacin gastrointestinal se logr utilizando el modelo in vitro sugerido por

Wang et al. (2008) y Velarde-Salcedo et al. (2013). La harina (1 g) se resuspendi

en 20 ml de 0.03 M NaCl, pH 2, y se calentaron a 80 C por 5 min. Se enfriaron a

temperatura ambiente, y se agreg pepsina de mucosa gstrica de cerdo en una

relacin 1:40 (p/p enzima: sustrato), las muestras se digirieron a pH y agitacin

constante por 3 h a 37 C. Despus el pH se ajust a 7.5 y se agreg una mezcla

de tripsina /pancreatina de pncreas de cerdo (1:1p/p) previamente disueltas en

0.1 N NaHCO3 a una relacin 1:5000 (p/p enzima: sustrato), y se incub a pH

constante por 3 h. La digestin se detuvo calentando las muestras a 75 C por 20

min y se dejo enfriar y se centrifug a 13000 rpm por 30 min. Para eliminar las

enzimas usadas en la digestin, los digeridos se ultrafiltraron empleando

centricones (Millipore) de 10 kDa de peso molecular de corte (MWCO).

4.6 Ensayo de actividad dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV)Para evaluar la capacidad de inhibicin de los pptidos de alpiste sobre la

actividad de la enzima DPPIV se llev a cabo el ensayo de actividad DPPIV in vitro

utilizado por Velarde-Salcedo et al. (2013), se emple el sustrato cromognico

Gly-pro-pNA a una concentracin de 500 M y 100 ng/ml de dipeptidyl peptidase

IV aislada de rin porcino y concentraciones crecientes de pptidos de alpiste de


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36/59

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4.9 Produccin de xido ntrico (NO) en el efluente venoso de corazones

aislados

La concentracin de NO como nitritos y nitratos se determin por el mtodo de

Griess (Miranda et al., 2001). Se colectaron 100 l del efluente venoso proveniente

de los corazones aislados con los tratamientos correspondientes antes

mencionados y se incubaron 37 C por 30 min, en presencia de 80 l decloruro de

vanadio (VCl3), se adicionaron de 20 l del reactivo de Griess (1% de

sulfanilamida, 0.1% de naftiletiletilendiamina en 2.5% de cido fosfrico) y se

registr la absorbancia a 540 nm, utilizando nitrato de sodio (NaNO3) como

estndar.

4.9.1 Anlisis estadsticoLos resultados se analizaron con el software Graphpad Prism 5, mediante el

anlisis de ANOVA de una va, seguidos de la prueba de Tukey, para la

comparacin estadstica entre las medias. Los resultados fueron replicados en tres

experimentos independientes. Los datos son expresados como la media el error

estndar (SE). Los resultados son considerados estadsticamente significativos

con una P< 0.05.


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V. Resultados y Discusin

5.1 Extraccin y cuantificacin de protenas de reserva

Las protenas de reserva de la harina de alpiste, harina de alpiste remojado y del

producto mas Lait fueron extradas y no se encontraron diferencias significativas

entre la composicin de las fracciones entre los tres productos analizados (Figura

6). Las albminas en semillas de alpiste representan el 16% y las globulinas 7S y

11S el 6% cada una, mientras que la fraccin mayoritaria fueron las prolaminas

(37%) y las glutelinas (35%), estos valores son similares a lo reportado por Abdel-

Al et al. (1997). A la fecha las protenas de alpiste no han sido caracterizadas

electroforticamente, por lo tanto, procedimos a obtener este perfil.

5.2 Perfil electrofortico de protenas de reserva de alpiste

En la Figura 7 se muestra el perfile electrofortico de las protenas de reserva de

alpiste. No hubo diferencias en este perfil cuando se analizaron las tres

presentaciones (Figura suplementaria 1) por lo que presentamos el perfil de la

harina de alpiste bajo condiciones desnaturalizantes. Las albminas de alpiste

mostraron bandas de 10, 15, 25 y 40 kDa, pesos moleculares similares a los

componentes de albmina de avena (14-17 kDa, 20-27 kDa y 36-47 kDa) (Klose et

al. 2012). El perfil de globulinas 7S fue similar al de albminas con la adicin deuna banda ms a 30 kDa y una banda mayor a 40 kDa. Las globulinas 11S

mostraron bandas de mayor peso molecular (40-70kDa). Las prolaminas

mostraron al menos tres bandas, de peso molecular de 15, 20 y 25 kDa. Este perfil

es parecidos a los de las prolaminas de avena (17-34 kDa), prolaminas de cebada

(15-20 kDa) y zenas (prolaminas) de maz (23- 24 kDa y de 26.5-27 kDa) (Shewry

y Tathamt, 1990; Shewry y Halford, 2002; Klose y Arendt, 2012). Las bandas

principales de glutelinas fueron de 20, 30, 40 y 50 kDa, perfil parecido al de las

glutelinas de cebada que muestran bandas de 35 kDa y de 42-46 kDa (Martnez

et al., 1997). Estos resultados sugieren que el perfil electrofortico de las protenas

de reserva de alpiste es caracterstico de los cereales de la subfamilia pooidea,

como la cebada y la avena y de cereales de la familia poaceae (gramnea) como el

maz.


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Figu ra 6. Prot enas d e reserva d e alpist e expres ado en po rcen taje (%).Se evaluarontres presentaciones de alpiste, la harina de alpiste (barra blanco) la harina de la semillaremojada en agua (barra negra) y la harina comercial mas Lait (barra gris). En cada casola barra corresponde al promedio de tres repeticiones indicando la desviacin estndar.Mismas letras significa que no existen diferencias significativas (p < 0.05) entre la mismafraccin.

Figur a 7. Perfi l elec tro fo rtic o d e pro tenas de reser va de alpi st e.Las protenas dereserva de harina de alpiste fueron extradas de acuerdo a su solubilidad: Carril 1=marcador de peso molecular, carril 2= albminas solubles en agua, Carril 3= globulinas 7Ssolubles en solucin salina 0.1 M NaCl, Carril 4= globulinas 11S solubles en 0.8 M NaCl,Carril 5= prolaminas solubles en etanol al 70%, Carril 6= glutelinas extraidas con 0.1 MNaOH, carril 7= protena total. Las protenas se separaron en geles de acrilamida al 12%bajo condiciones desnaturalizantes.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Albumina Globulina 7s Globulina 11s Prolaminas Glutelinas

Concentracindeprotena

(%)

aa

b bb

cc c

d

dd e

e

e

a


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28

5.3 Liberacin de pptidos encriptados por digestin enzimtica in vi t ro

La digestin trptica in vitro (Figuras 8A) y la simulacin gastrointestinal (Figura 8B)

de las harina de alpiste, harina de la semilla remojada, harina comercial y leche de

alpiste mostraron el mismo patrn de digestin. Se observ que a las 6 h de

digestin trptica desaparecen las bandas de mayor peso molecular quedando en

su mayora protenas de alrededor de 10 kDa (Figura 8A). Para obtener los

pptidos de bajo peso molecular, los digeridos se ultrafiltraron empleando

membranas de 10 kDa de peso molecular de corte (Figura 8C).

5.4 Ensayo in vi t ro de inhibicin de la actividad de la dipeptidilpeptidasa IV

Los pptidos de alpiste obtenidos por simulacin gastrointestinal presentaron un

efecto inhibitorio dosis-dependiente sobre la actividad de la DPPIV, alcanzando un

porcentaje de inhibicin del 43.4%. El comportamiento fue similar entre las 4

presentaciones de alpiste (Figura 9). Las muestras sin digerir presentaron un

efecto casi nulo de de inhibicin (9.3%), los digeridos trpticos (Figura

suplementaria 2) obtuvieron un porcentaje de inhibicin menor que el de los

digeridos por simulacin gastrointestinal (23%), lo cual de acuerdo con

Vermeirssen et al., (2004) se obtienen pptidos con una mayor capacidad

inhibitoria cuando son hidrolizados por la combinacin de pepsina, tripsina,

quimiotripsina y pancreatina. Estos resultados nos dieron la pauta para utilizar en

los siguientes ensayos los pptidos obtenidos por simulacin gastrointestinal. El

control positivo de inhibicin Diprotin A (Ile-pro-Ile) tuvo un IC50de 2 g/ml, este

valor fue similar a valores reportados en la literatura (Rituparna et al., 2011;

Sudhanshu et al., 2012).


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Figu ra 8. Perfi l de dig estio nes in v itro de las pro tenas t otales extradas d e harin a dealpiste. A) Digestin con tripsina, B) Digestin con el mtodo de simulacingastrointestinal. Carril 1=marcador de peso molecular, carril 2=protena nativa, carriles 3 a10=digestiones a 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 h. C) Perfil de pptidos obtenidos despus de 5h por el mtodo de simulacin gastrointestinal y ultrafiltrados en centricones de 10 kDa de

peso molecular de corte. Carril 1= marcador de peso molecular, Carriles 2-5=ultrafiltradosde los digeridos de: harina de alpiste, harina de la semilla remojada, harina comercial

mas Lait y leche de alpiste, respectivamente.

kDa

50

30

25

20

10

15

40

kDa

50

30

2520

10

15

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A B

50

37

25

20

15

10

1 2 3 4 5

C

kDa


41/59

30

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100

Concentracin de pptidos (g/ml)

%A

ctivi

dadDPPIV

Figura 9. Actividad inhib i tor ia de los hidro l izados de p rotenas d e alpiste sob re laact ividad de la DPPIV. Las protenas de alpiste fueron digeridas mediante simulacingastrointestinal y los fragmentos menores de 10 kDa fueron obtenidos por ultrafiltracin.Se midi el porcentaje de actividad de DPPIV en presencia de concentraciones crecientesde los hidrolizados de las 4 presentaciones de alpiste: leche de alpiste ( ), harina de

alpiste ( ), harina de semilla remojada ( ), harina comercial ( ). Control negativose emplearon las protenas de alpiste sin digerir ( ) y como control positivo deinhibicin se emple el Diprotin A ( ). Los valores estn expresados como la media detres repeticiones la desviacin estndar.


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5.5 Ensayo in vi t ro de inhibicin de la ECA

Para evaluar la posible capacidad antihipertensiva de los hidrolizados de protenas

de alpiste se evalu la actividad inhibitoria de la ECA usando concentraciones de 0a 600 g/ml de los digeridos obtenidos por simulacin gastrointestinal. La mayor

inhibicin alcanzada fue del 73.5% (Figura 10), porcentaje similar al reportado con

los hidrolizados de suero de leche bovina (Pihlanto et al., 1998). El IC50 de los

hidrolizados de alpiste fue de 332 g/ml, valor parecido al de los hidrolizados de

garbanzo, lenteja (Barbana y Boye, 2010), soya (Tsai et al., 2006) gliadinas de

trigo (Motoi y Kodama, 2003), gluten de trigo (Kodera y Nio, 2006) y msculo de

sardina (Vercruysse et al., 2005). Las 4 presentaciones de alpiste tuvieron la

misma tendencia de inhibicin. Las muestras sin digerir slo alcanzaron una

inhibicin de 10.7 % a la concentracin ms alta. El captopril (CAPT), empleado

como control positivo, mostr un valor IC50de 4.074 g/ml, valor semejante a los

valores reportados en la literatura para este compuesto (Hayes et al., 2007).

5.6 Evaluacin del efecto vasodilatador de los pptidos de alpiste (Sistema

de perfusin de Langendorff)

El efecto vasodilatador de los pptidos de alpiste se evalu utilizando la tcnica de

corazn aislado y perfundido de rata o de Langendorff, en donde se pueden

obtener parmetros tales como la presin de perfusin (PP) como un ndice del

tono vascular (vasodilatacin/vasoconstriccin), as como la presin ventricular

izquierda como ndice de la contractilidad cardiaca.


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0 100 200 300 400 500 600 700

0

20

40

60

80

100

Concentracin de pptidos (g/ml)

%A

ctividadEC

A

Figura 10. Actividad in hibi to r ia de los hidro l izados de p rotenas d e alpiste sob re laact ividad d e la ECA. Las protenas de alpiste fueron digeridas mediante simulacingastrointestinal y los fragmentos menores de 10 kDa fueron obtenidos por ultrafiltracin.Se midi el porcentaje de inhibicin de concentraciones crecientes de los hidrolizados delas 4 presentaciones de alpiste: leche de alpiste ( ), harina de alpiste ( ), harina desemilla remojada ( ), harina comercial ( ). Control negativo se emplearon las

protenas de alpiste sin digerir ( ).Los valores estn expresados como la media de tresrepeticiones la desviacin estndar.


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Figu ra 11. Efecto v asod ilatado r de pptid os de alp iste (AL P).Imagen representativade 3 experimentos independientes. A) Efecto inducido por los pptidos ALP enconcentraciones crecientes y empleando la bradicidinina (BK) control positivo. B) Efectoinducido por los controles negativos angiotensina I (ANG I) y angiotensina II (ANGII) y elefecto del captopril (CAPT) en presencia de ANGI. C) Efecto de pptidos de ALP en

presencia de ANGI.


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Figura 12. Porcentaje de vasodi latacin y vasoconstr iccin ejercida por losppt id os de alp is te (A LP).A) porcentaje de vasodilatacin de pptidos de alpiste (0.01,0.1, 1 g/ml) y de los controles positivos captopril (CAPT, 50M) y bradicidinina (BK, 10

M). B) Porcentaje de vasoconstriccin de CAPT en presencia de ANGI, los pptidos deALP en presencia de ANGI y de los controles negativos (ANGI y ANGII). Los resultadosson representativos de tres experimentos independientes. Los valores estn expresadoscomo la media el error estndar, los asteriscos muestran diferencias significativas a P

trabajo de alpiste

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