trabajo ii pharmacogenética doctor en salud pública versión iv e 4

IDENTIFICACIÓN DEL ESTUDIANTE ID: UD10435BMN17417

LUIS ENRIQUE MEDINA MEDINA

TITLE: PHARMACOGENÉTICS

Grade / Program: PhD in PUBLIC HEALTH major: Epidemiology

School of Social and Human Studies

Murcia, Spain October of 2011

ATLANTIC INTERNATIONAL UNIVERSITY HONOLULU, HAWAII SUMMER 2011

PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in

Publics Health with major Epidemiology

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INDICE GENERAL Pág.

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………6

II. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………...7

III.- DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO………………………………………………………………….8

3.1.-Conceptos Generales y Métodos de Estudio en Farmacogenética…………………………………8

3.2.-Farmacogenética y Farmacogenómica…………………………………………………………..9

3.3.-Historia de la Farmacogenética…………………………………………………………………..9

3.3.1.- Conceptos Básicos de Genética: Polimorfismo Genético…………………………………………..11

3.3.2.- Variabilidad en la Respuesta de Medicamentos……………………………………………………..13

3.4.-Tipos de variaciones genéticas de importancia en Farmacogenética……………………………14

3.4.1.-Single Nnucleotide Polymorphisms o SNP……………………………………………………………16

3.4.2.-Inserciones/Deleciones (INDEL)……………………………………………………………………….16

3.4.3.-Variación en Número de Copias (CNV)……………………………………………………………….16

3.5.-Conceptos Importantes en Farmacogenética……………………………………………………..17

3.5.1.-el proyecto hapmap………………………………………………………………………………………17

3.5.2.-Definición de términos en farmacogenética…………………………………………………………..18

3.5.3,.-Proteínas transportadoras de fármacos………………………………………………………………19

3.5.4.-Métodos moleculares de estudio en farmacogenética……………………………………………....22

A.-Tecnología de los microarrays de ADN…………………………………………………………..20 B-Análisis de la Expresión Génica……………………………………………………………………24

C.-Analisis del Genotipo………………………………………………………………………………..30

3.6.- Clasificación de los Estudios Farmacogenéticos…………………………………………………31

3.6.1.-Estudios de Comprobación de Hipótesis………………………………………………………………32

3.6.2.-Estudios de Generación de Nuevas Hipótesis………………………………………………………...33

3.7.-Estudios Mixtos…………………………………………………………………………………….34

3.7.1.-Estudios de Generación de Nuevas Hipótesis………………………………………………………...35

3.7.2.-Proyecto del Genoma Humano : Secuenciación del genoma completo…………………………..35

3.8.-Aplicaciones Farmacogenéticas actuales……………………………………………….................35

3.8.1.-Farmacogenética del Tratamiento Antirretroviral……………………………………………………37

3.9.-Variaciones Genéticas en Proteínas tTansportadoras……………………………………….....…38

3.10.-Variaciones genéticas en enzimas metabólicas………………………………………….............39

3.10.1-Reguladores de las Proteínas Transportadoras y de las enzimas metabólicas………………….41

3.10.2.-Variaciones genéticas en la 1-glucoproteína ácida…………………………………………………41



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3.11.-Influencia de Factores Genéticos en la Respuesta Virológica e inmunológica……………...43

3.12.-Participación de Pacientes de Ensayos Clínicos en Estudios de Farmacogenética……………44

3.12.1.-Material y Método……………………………………………………………………………………45

3.12.2.-Resultados del Estudio……………………………………………………………………………47

3.13.-Farmacogenética en Oncología………………………………………………………………48

3.13.1.-Antecedentes……………………………………………………………………………….49

3.13.2.-tipos de alteraciones genéticas…………………………………………………………….50

3.14.-Farmacogenética de las Enzimas Metabolizadoras de Agentes Quimioterápicos………............51

A.-UDP-Glucuronosiltransferasa (UGT)……………………………………………………........51

B.-Tiopurina S-Metiltransferasa (TPMT)………………………………………………………..53

C.-5,10-Metilentetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)……………………………………… …..54

3.15.-Farmacogenética del tratamiento antirretroviral 2008: ¿hacia un tratamiento

personalizado?........................................................................................ ................................56

3.16.- Reacciones de Hipersensibilidad………………………………………………………………....57

3.17.-Interacciones farmacocinéticas entre metadona y antirretrovirales en pacientes infectados por

el virus de la inmunodeficiencia humana…………………………………………………….58

3.17.1.-Metadona……………………………………………………………………………………………….59

3.17.2.-¿Que son los Antirretrovirales?…………………………………………………………….............60

3.17.3.-interacción metadona-antirretrovirales……………………………………………………............61

3.17.4.-Relación de Análogos no nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa-metadona.. 64.

3.18.-Estudios farmacogenéticos: guía de evaluación para Comités Éticos de Investigación

Clínica…………………………………………………………………………………………70

3.18.1.-Fundamentos científicos y marco legal (I)…………………………………………………….70

3.19.-Farmacogenómica………………………………………………………………………………72

3.19.1.-Transcriptómica y Proteómica…………………………………………………………………...72

3.19.2.-Entorno Legislativo………………………………………………………………………………..72

3.19.3.-Normativa sobre investigación biomédica en seres humanos…………………………….........73

3.19.4.-Normativa sobre Protección de datos de carácter personal …………………………………74

3.20.- Evaluación Económica en la era de la Farmacogenética y Farmacogenómica: ¿un rayo de luz

en la oscuridad?..................................................................................... .......................................77

3.21.- Polimorfismo Genético en el Paciente Crítico. Parte II: Aplicaciones especiales de los

Polimorfismos Genéticos. Farmacogenética y terapia génica………………………………..83

3.21.1.- Genética y Coagulación………………………………………………………………………….85

3.21.2.- Neurogenética del Paciente crítico………………………………………………………………85

3.21.3.-Genética en el Síndrome de Distrés Respiratorio………………………………………………87



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3.22.-Genética en la Cirugía Cardíaca………………………………………………………………88

3.23.-Terapia Génica…………………………………………………………………………………90

3.24.- Terapia Génica en la Neumonía……………………………………………………………..90 3.25.- Terapia Génica en la Sepsis……………………………………………………………………..91

3.26.- Terapia Génica y Hemodinámica……………………………………………………………….92

3.27.-Genética y Respuesta Terapéutica……………………………………………………………….92

3.28.-Factores Determinantes, de la variabilidad entre la población en la respuesta a los fármacos.93

A.-FactoreS Genéticos……………………………………………………………………………….93

B.-Factores no Genéticos…………………………………………………………………………….93

3.29.-Terapia Personalizada de la Farmacogenética…………………………………………………94

3.30.-Reacciones de Fase II (conjugación): acetilación, glucuronización, sulfatación y

mutilación……………………………………………………………………………………………95

3.30.1.-Receptores de Fármacos……………..……………………………………………………………….96

3.30.2.-Proteínas Con Efecto Indirecto sobre la respuesta al tratamiento……………………………..96

3.30.3.-Otros Aspectos de la Farmacogenética……………………………………………………............97

3.30.4.-Proteínas transportadoras de fármacos……………………………………………………………97

3.31.- Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y aspectos éticos……..98

3.31.1.- Resecuenciación Génica……………………………………………………………………………..99

3.31.2.- Farmacogenética y bioinformática………………………………………………………………...99

3.31.3.- Farmacogenética y Aspectos Éticos………………………………………………………………100

3.32.-Análisis farmacogenético de la cinética de absorción de ciclosporina en una población

española de pacientes trasplantados cardíacos…………………………………………………102

3.33.-Estudio farmacocinético…………………………………………………………………………105

3.34.-Aspectos Éticos…………………………………………………………………………………..106

3.35.-Análisis de los Datos……………………………………………………………………………..107

3.36.-Metabolismo y Farmacogenética del Tratamiento Antihipertensivo a través de las enzimas CYP

3.36.1.-Beta-Bloqueantes………………………………………………………………………………………109

3.36.2.-Bloqueantes de los Canales de Calcio………………………………………………………………113

3.36.3.-Inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina………………………………………...113

3.36.4.-Antagonistas de los receptores de Angiotensina II………………………………………………..113

3.36.5.-Bloqueantes Alfa-Adrenérgicos……………………………………………………………………...114

3.37.- Impacto estratégico de la Medicina individualizada Implicaciones en la clínica de la

Farmacogenética………………………………………………………………………………..117

3.38.- Variabilidad en la Eficacia del tratamiento……………………………………………………118

IV.- Análisis General…………………………………………………………………………………119 4.1.-La farmacogenética y la farmacia de hospital…………………………………………………......119

4.2.-Los Farmacéuticos y la Farmacogenética…………………………………………………………..119

4.3.-Planteamiento del Problema de la Farmacogenética……………………………………………..120

4.4.-Impacto de los Efectos Adversos………………………………………………………………124



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VI.- Análisis y Discusiones……………………………………………………………………................128

6.1.-Perspectivas y Limitaciones……………………………………………………………………………...130

6.2.-Recomendaciones Sobre Estudios Genético……………………………………………………………131

VII.-Conclusiones…………………………………………………………………………………………131

VIII.-Bibliografía………………………………………………………………………………………….133



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I.-INTRODUCCIÓN

La farmacogenómica es la disciplina científica orientada al estudio de los aspectos genéticos relacionados con la variabilidad de la respuesta a los medicamentos en individuos o poblaciones EMEA/CPMP/3070/01

El genoma humano está formado por una secuencia de aproximadamente

3.000 millones de nucleótidos, situados en el 99,9% de las posiciones de idéntica manera en cualquier par de personas que se comparen. Este dato avala nuestra identidad como especie biológica independiente. La farmacogenética sólo analiza una información genética muy concreta –la relacionada con la eficacia y seguridad de los medicamentos con una finalidad muy específica: mejorar los criterios científicos para su selección y uso. Tampoco se pretende establecer el riesgo genético de padecer enfermedades, aunque en ocasiones puede revelar esta información u otras colaterales (p. ej., confirmación de paternidad, pronóstico de una enfermedad por su respuesta al tratamiento).

Entendiendo cómo un determinado polimorfismo genético afecta al

metabolismo y la acción de los medicamentos será posible predecir, para cada paciente, qué medicamento es el que ofrece mayor beneficio terapéutico y/o qué probabilidad existe de desarrollar una reacción adversa en función de su dotación genética. La farmacogenética constituye uno de los pilares de la denominada «medicina personalizada» (Marshall A, Roses AD., et al. 1997, 2000) 39-43.

Adicionalmente, la mejor caracterización de las bases genéticas y

moleculares de las enfermedades ayudará a mejorar su diagnóstico, diferenciando entre entidades con síntomas parecidos pero con distintas causas y/o mecanismos de desarrollo o progresión clínica y que, consecuentemente, son tributarias de tratamientos diferentes. Muchos de los fármacos que tienen potencial terapéutico nunca llegan a comercializarse por la presencia de reacciones adversas en algunos individuos observadas durante los ensayos clínicos. Por otra parte, existen fármacos utilizados comúnmente que sólo son efectivos en una parte de la población. Estas diferencias interindividualesreferidas a eficacia y toxicidad dependen de muchos factores como pueden ser, sexo, edad, factores ambientales y factores genéticos. En los años 50 se utiliza por primera vez el término farmacogenética para describir los estudios sobre la base genética de la farmacoterapia.

Los estudios farmacogenéticos están dirigidos a identificar variantes alélicas

de los genes involucrados en el metabolismo de los fármacos o de sus receptores.



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La farmacogenética pretende explicar la influencia de la variabilidad genética en la respuesta a los medicamentos e intenta conocer cómo un determinado polimorfismo genético puede afectar al metabolismo y a la acción de los medicamentos en cada sujeto, lo que va a permitir optimizar la respuesta terapéutica del paciente al aumentar la eficacia del medicamento administrado, reducir sus efectos adversos y mejorar el cumplimiento terapéutico.

Los estudios farmacogenéticos están sujetos, por un lado, a la normativa sobre investigación biomédica en seres humanos (de la que los ensayos con medicamentos son sólo una parte) y, por otro, a la legislación sobre protección de datos personales. Además, y aunque no tengan carácter normativo de obligado cumplimiento, existen varios documentos emitidos por organismos públicos y privados, nacionales e internacionales, sobre investigación genética.

La consecuencia práctica más directa de este nuevo paradigma podría ser la obtención de mejores resultados clínicos, con una disminución de la morbimortalidad de los pacientes y una importante reducción de la necesidad de administrar distintos y sucesivos medicamentos hasta encontrar el más eficaz y seguro para cada uno, lo que incrementará notablemente la calidad de vida de los pacientes y elevará la calidad asistencial del Sistema Nacional de Salud.

La farmacogenómica evalúa la respuesta conjunta de múltiples genes frente a

un medicamento y la influencia de las variaciones del ADN en los efectos de los fármacos. Asimismo, intenta identificar qué elementos genéticos son importantes en el desarrollo y evolución de una enfermedad y conocer cómo se alteran e interaccionan entre sí. De esta manera, se podrán definir nuevas y potenciales dianas, plantear nuevas estrategias de evaluación y desarrollo de los fármacos, así como diseñar medicamentos más específicos dirigidos a un grupo de individuos que compartan ciertas secuencias del ADN, lo que incrementará su eficacia y minimizará sus efectos adversos.

II. OBJETIVOS: 1º.-Deternminar la Relevancia clínica en farmacogenética para optimización de los tratamiento de las enfermedad en la Salud Pública. 2º.-Crear documentos de consenso accesibles sobre la aplicación clínica a nivel de consenso entre los especialistas con el fin de determinar el ahorro que podría significar para el paciente, la familia en la implementación de la medicina personalizada 3º.-Analizar el impacto epidemiológico social de las enfermedades mas relevantes. 4º.-Revisar los protocolos de feno y genotipación 5º.-Evaluar las implicaciones Clínicas en el uso de fármacos 6º.-Revisión y discusión del potencial y la eficacia de los medicamentos y su implicancia en la etiopatogenia



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7º.-.Los objetivos que se plantean en los estudios farmacogenéticos son generalmente 3:

a) identificación y caracterización de polimorfismos o de determinados genes b) correlación de los mismos con los resultados del tratamiento, c) desarrollo de tests genéticos que permitan predecir la respuesta, el

fármaco o la dosis más adecuados para un paciente concreto, en definitiva, un tratamiento ajustado a cada perfil genético individual.

Sin duda, el objetivo principal de la Farmacogenética es «optimizar el

tratamiento de las enfermedades a nivel individual», ir hacia una «terapia personalizada más segura y eficiente». La Farmacogenética puede cambiar la forma de prescribir en la práctica clínica diaria. En lugar de seguir el método actual de «ensayo y error», de manera que los pacientes prueban diferentes dosis de un mismo fármaco y/o diferentes opciones terapéuticas, la farmacogenética permite ayudar al clínico a la hora de:

A. Seleccionar a aquellos pacientes que podrían responder bien o mal a un fármaco determinado antes de que sea prescrito (con el tiempo estarán disponibles perfiles farmacogenéticos para seleccionar a aquellos pacientes que tengan una gran posibilidad de responder positivamente y a aquellos que tengan bajo riesgo de presentar efectos adversos graves). B. Seleccionar la medicación más adecuada para un determinado paciente. C. Seleccionar la dosis más adecuada de un fármaco para un determinado paciente (las pruebas de genotipado y fenotipado para predecir los requerimientos de dosis están siendo introducidas cada vez más en el desarrollo preclínico de los medicamentos y en la rutina clínica). III.- DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO 3.1.-CONCEPTOS GENERALES Y MÉTODOS DE ESTUDIO EN

FARMACOGENÉTICA

La farmacogenética, la ciencia que permite identificar las bases genéticas de las diferencias interindividuales en la respuesta a los fármacos, es un tema de gran interés. Los resultados de los diferentes tipos de estudios farmacogenéticos en diferentes campos de la medicina pueden servir para que en un futuro se pueda ofrecer una verdadera medicina personalizada. En este capítulo definimos los conceptos más relevantes de esta disciplina, así como los métodos de estudio utilizados actualmente



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Existe una gran variabilidad interindividual en la respuesta al tratamiento farmacológico. El reconocimiento de que parte de esta variabilidad es inherente a la persona ha creado la disciplina de la farmacogenética, con el objetivo de poder ofrecer en un futuro una medicina personalizada que nos aporte el máximo beneficio terapéutico con la mínima toxicidad. En este capítulo, se definen los conceptos más relevantes de esta disciplina, así como los métodos de estudio utilizados actualmente.

3.2.-FARMACOGENÉTICA Y FARMACOGENÓMICA

Estos 2 términos se usan con frecuencia intercambiados, pero tienen

diferentes connotaciones. El término «farma-cogenética» es más restrictivo y se refiere al estudio de la variación genética de ciertos genes y a su efecto en la respuesta farmacológica. El término «farmacogenómica» es mucho más amplio y se refiere al estudio de todo el espectro de genes farmacológicamente relevantes, sus variaciones genéticas, cómo estas variantes interaccionan y cómo afectan a la respuesta farmacológica (Altman RB, et al. 2002)1.

3.3.-HISTORIA DE LA FARMACOGENÉTICA

La observación de que existen diferencias individuales en la respuesta al

tratamiento farmacológico no es un concepto nuevo. A principios del siglo XX (1902-1909) el médico británico Sir Archibald Garrod desarrolló el concepto de chemical individuality para describir que ciertos individuos presentaban toxicidad con una dosis de fármaco que era inocua para la mayoría. La primera observación escrita relacionada con la Farmacogenética se remonta al año 510 a.C. cuando Pitágoras observó que la ingesta de habas producía en algunos individuos una reacción potencialmente fatal. Con el tiempo se reconoció que se trataba de una anemia hemolítica que aparecía en individuos con deficiencia en la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), siendo el primer informe de la farmacogenética moderna el publicado a principios de 1930 por Snyder sobre la incapacidad para saborear la feniltiourea que presentaba una herencia autonómica recesiva.

El concepto de «farmacogenética » se originó en los años 1950 con los 2

primeros ejemplos de cómo variaciones genéticas en genes que codifican enzimas metabólicas causan reacciones adversas graves a determinados fármacos: anemia hemolítica causada por fármacos antimaláricos debido a deficiencias de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y relajación muscular prolongada después de la administración de succinilcolina debido a deficiencias de la enzima seudocolinesterasa.



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Fue Motulsky en 1957 quien primero documentó el concepto de que los defectos heredados en el metabolismo de fármacos podían explicar las diferencias individuales en la respuesta a medicamentos16. El que primero propuso el término «farmacogenética» fue Friedrich Vogel en 1959, y en 1962 Kalow escribió la primera monografía sobre el tema Tabarés B, et al 20004 14.

El campo de la Farmacogenética fue estimulado en los años 1970 con hechos como la descripción que Robert Smith hizo en 1977 de la deficiencia en el metabolismo de la debrisoquina, cuando personalmente experimentó una importante hipotensión ortostática tras tomar el medicamento17. Actualmente se conoce que el defecto correspondiente es debido a la deficiencia de la enzima citocromo P450 2D6. O cuando Vesell et al demostraron que las vidas medias plasmáticas de muchos fármacos eran menos divergentes entre parejas de gemelos monocigotos que entre parejas de gemelos dicigotos Vesell ES, et al 1989 8. Concluyeron que la herencia multifactorial podía determinar el metabolismo farmacológico individual (herencia multigénica).

En el transcurso de los años posteriores se fueron añadiendo ejemplos de respuestas exageradas, desconocidas, o ausencia de efectividad de fármacos como manifestación de patrones hereditarios individuales.

Más recientemente, han recibido mucha atención los polimorfismos genéticos

comunes del metabolismo de fármacos clínicamente útiles y que involucran a un número considerable de pacientes. Un ejemplo en el orden farmacodinámico es el conocimiento reciente de los receptores farmacológicos, como el beta 2-adrenorreceptor, o los transportadores farmacológicos, como el MDR1, responsable del gen de resistencia a fármacos, que también están sujetos a variación genética.

Las bases genéticas moleculares de estos patrones hereditarios se han empezado a dilucidar a finales de los años 1980 con la clonación y caracterización de numerosos genes humanos incluyendo enzimas metabolizadoras de fármacos, receptores y varios sistemas de transporte. En la actualidad la Farmacogenética tiene un gran potencial y está generando grandes expectativas médicas, sociales y financieras.

La farmacogenética se encarga del estudio de la variabilidad individual de respuesta a los fármacos en función de diferencias genéticas. De esta manera, el genotipo del paciente no sólo puede determinar la evolución y el pronóstico de la enfermedad, sino que también puede influir en la respuesta al tratamiento, la capacidad de metabolizar los fármacos administrados y, en cierto modo, prever la aparición de efectos adversos (fig. 1). No existe situación alguna en medicina el la que el clínico pueda predecir la respuesta individual al tratamiento. Es evidente que muchos factores determinan la respuesta a los fármacos (edad,



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sexo, etnia, enfermedades concomitantes y disfunción de los órganos secretores). No obstante, si estas variables se estandarizan, es evidente que persiste una respuesta individual.

Se ha evidenciado en los últimos años que factores genéticos modifican de manera significativa la absorción, disposición, metabolismo y excreción de Fármacos (Kalow W, et al. 1997) 297. Uno de los objetivos más importantes de la farmacogenética es la disminución de efectos secundarios.

Cada fármaco interacciona con numerosas proteínas (transportadoras, enzimas, etc.). Un elevado número de enzimas son genéticamente variables 32.

El PG de los genes que codifican estas enzimas condiciona la aparición de 3

tipos de sujetos: normales, metabolizadores lentos (predispuestos a las reacciones adversas) y metabolizadores rápidos (sujetos que no responderán a las dosis habituales, dada la extremadamente rápida eliminación del fármaco).

La mayoría de las enzimas implicadas en el metabolimo y la eliminación de

fármacos son miembros de la familia del citocromo P-450, que incluye más de 30 isoformas (Abernethy DR, et al. 2000) 299.

El reconocimiento temprano de una respuesta adecuada al tratamiento o la probabilidad elevada de desarrollar efectos secundarios significa que puede ayudar a desarrollar estrategias terapéuticas alternativas

En 1959, el Dr.Vogel acuñó el término «farmacogenética» y el reconocimiento de esta nueva disciplina se extendió rápidamente (Meyer UA., et al. 2004) 2. 3.3.1.-CONCEPTOS BÁSICOS DE GENÉTICA: POLIMORFISMO GENÉTICO

El genoma humano está formado por una secuencia de aproximadamente 3.000 millones de nucleótidos, situados en el 99,9% de las posiciones de idéntica manera en cualquier par de personas que se comparen. Este dato avala nuestra identidad como especie biológica independiente.

No obstante, el 0,1% de variabilidad, o polimorfismo genético, también es

biológicamente importante (Kalow W., . Nebert DW., et al, 1997) 206,207 y está en la raíz de dos problemas médicos muy relevantes: la propensión dispar a padecer enfermedades y la respuesta heterogénea a los medicamentos, tanto en eficacia como en seguridad.

El estudio de los polimorfismos geneticos del citocromo P450 se ha centrado

en las isoenzimas CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 y CYP3A por ser estas las que metabolizan la mayoría de farmacos. Los individuos con determinadas variantes o alelos en los genes que codifican para estas enzimas pueden experimentar un



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descenso en la eficacia de determinados farmacos o bien un aumento de su toxicidad . De este modo se establecen tres tipos distintos de fenotipos de metabolización (metabolizadores normales, metabolizadores lentos [PM] y ultrarrapidos [UM]) asociados a distintas variaciones geneticas. Asi, los alelos mejor caracterizados para CYP2C19 son el CYP2C19*1 o tipo silvestre y los responsables del fenotipo PM que son CYP2C19*2 y CYP2C19*3.

El desarrollo de la farmacogenética para reducir esta variabilidad en la

eficacia ya está dando sus primeros frutos, pero será uno de los principales cambios de la práctica de la Medicina en los próximos 10-20 años. Una de las primeras aplicaciones farmacogenómicas aprobadas para uso clínico es trastuzumab (Herceptin®). Se trata de un anticuerpo humanizado contra el receptor HER2 en el cáncer de mama.Va dirigido sólo a los pacientes que sobreexpresan HER2 (20-35% de los sujetos con cáncer de mama). Su desarrollo clínico ha sido muy rápido y requirió menos de 1.000 pacientes de estas características:sólo fueron necesarios dos ensayos clínicos de fase III, uno en monoterapia (222 pacientes) y otro en combinación con quimioterapia (469 pacientes), y así se autorizó la comercialización para el tratamiento de los pacientes con cáncer de mama avanzado que sobreexpresa HER2. Es decir, el fármaco sólo va dirigido a la población de pacientes que tiene una alta probabilidad de obtener un beneficio del tratamiento.

De ahí que el polimorfismo genético sea uno de los temas centrales de la investigación biomédica actual (Gusella JF., Taylor JG., et al. 1986, 2001)208, 212.



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La mayor parte (90%) de la variabilidad genética humana se debe a polimorfismos de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), variaciones concretas de un solo nucleótido, en el contexto de una secuencia genética (Schork NJ., Brookes AJ., et al. 1999, 2000) 213,214.

Su identificación, mapeo y análisis funcional se consideran elementos esenciales para la farmacogenética y la farmacogenómica (Stephens JC, Syvänen AC, t et al. 1999, 2001) 215, 219. El 10% restante corresponde sobre todo a polimorfismos de longitud, de los cuales los microsatélites son su modalidad más importante Epplen C., Wren JD., et al. 1997, 2000) 220, 221.

La farmacogenética se basa en la obtención y el análisis de información genética pero, a diferencia de otras disciplinas como la terapia génica, la ingeniería genética o la clonación, no implica la modificación de la dotación genética del paciente ni la transferencia de material genético de unos seres vivos a otros. Esta consideración es esencial para evaluar correctamente las implicaciones de carácter ético, legal y social de un proyecto de investigación de tipo farmacogenético.

La farmacogenética sólo analiza una información genética muy concreta –la relacionada con la eficacia y seguridad de los medicamentos con una finalidad muy específica: mejorar los criterios científicos para su selección y uso. Tampoco se pretende establecer el riesgo genético de padecer enfermedades, aunque en ocasiones puede revelar esta información u otras colaterales (p. ej., confirmación de paternidad, pronóstico de una enfermedad por su respuesta al tratamiento).

Por ello,el perfil de respuesta al medicamento que persigue la

farmacogenética debe distinguirse de otros tipos de análisis genéticos como los encaminados a establecer el diagnóstico de una enfermedad (p. ej., fibrosis quística), el establecimiento de la condición de portador (el caso de la hemofilia A) o la susceptibilidad genética a padecer una determinada enfermedad (p. ej., el cáncer familiar o la diabetes mellitus)(Roses AD., Human Genetics Commission (HGC, et al. 2002) 226, 228.

Uno de los problemas médicos actuales es que los medicamentos no alcanzan el objetivo terapéutico deseado en muchos de los pacientes. La farmacogenética hará posible mejorar la eficacia de los tratamientos administrados, seleccionando el compuesto más eficaz y/o ajustando individualmente la posología (Spear BB, Ingelman-Sundberg M, et al. 2001) 229,

230. 3.3.2.-VARIABILIDAD EN LA RESPUESTA DE MEDICAMENTOS

Además, permitirá investigar las causas y mecanismos patogénicos de las reacciones adversas y prevenir su aparición futura con ese fármaco y,



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probablemente, con otros similares (Roses AD, Meyer UA, . Brazell C, et al. 2000, 2002) 227,231,233. La variabilidad de la respuesta a los medicamentos podría atribuirse a diferencias genéticas en tres planos (Roden DM, et al. 2002) 234:

a) los mecanismos moleculares implicados en la patogenia de la enfermedad (véase «Farmacogenómica») b) el metabolismo (absorción, distribución, metabolismo, eliminación) del medicamento en el organismo del paciente (farmacocinética)

c) la diana terapéutica sobre la que actúa el compuesto farmacológico (farmacodinámica).

Estos tres elementos pueden actuar de forma simultánea. Además, múltiples factores exógenos, como otros fármacos, la dieta, los productos tóxicos (p. ej., alcohol, tabaco, cafeína) y funcionales (edad, estado hormonal, situación funcional de diversos sistemas orgánicos), pueden influir de forma relevante sobre el tratamiento, a veces incluso más que la dotación genética, si bien su efecto está mediado por elementos controlados genéticamente.

3.4.-TIPOS DE VARIACIONES GENÉTICAS DE IMPORTANCIA EN FARMACOGENÉTICA

3.4.1.-SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS O SNP

Los single nucleotide polymorphisms o SNP (pronunciado esnips) son el tipo de variación genética más común; actualmente se estima que hay alrededor de 10 millones de SNP en el genoma humano 3. Son el resultado de la variación de un solo nucleótido (adenina [A], timina [T], citosina [C] o guanina [G]) en la secuencia de ADN entre miembros de una misma especie. Los SNP pueden clasificarse en SNP no sinónimos, cuando cambian el aminoácido que formará la proteína, y SNP sinónimos, cuando no cambian el aminoácido dentro de una proteína.

OBJETIVOS DEL ESTUDIO DE LOS POLIMORFISMOS El estudio de los polimorfismos tiene como objetivos:

1. Determinar marcadores genéticos de susceptibilidad a una enfermedad.

El análisis de polimorfismos permite determinar la predisposición de un individuo a padecer una enfermedad. Se pueden encontrar el gen o grupo de genes «candidatos» que contribuyen a padecer la enfermedad.



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2. Determinar la predisposición de un individuo a un determinado subtipo dentro de una enfermedad. Para enfermedades con clínica muy heterogénea, como la psoriasis, donde la carga genética puede ser parcialmente responsable de tal variabilidad clínica. 3. Estudiar el desarrollo de tumores y su progresión. Se ha podido comprobar cómo los polimorfismos tipo SNP intervienen en la biología tumoral. 4. Identificar dianas terapéuticas. Al igual que sucede con los análisis de expresión génica, el estudio del genotipo también contribuye a la farmacogenómica. 5. Predecir la respuesta terapéutica a un fármaco. La variabilidad en la respuesta farmacológica genéticamente determinada tiene mucho que ver con polimorfismos en genes específicos. Según diferentes estudios, algunos SNP se han relacionado con cambios en el metabolismo, proteínas transportadoras y receptores de fármacos, grado de respuesta de algunos fármacos y porcentaje de toxicidad.

De hecho, algunos SNP ya se están utilizando para predecir la respuesta clínica a los fármacos (McLeod HL y Evans WE, et al 2001) 11-14. Los individuos portadores de un determinado alelo probablemente lo son también de variantes específicas con varios marcadores de SNP. Por ello, para predecir la respuesta a un medicamento no será necesario identificar los verdaderos genes y alelos implicados, sino que sería suficiente con detectar los SNP.

En un futuro los avances tecnológicos asociados con la robótica y las reacciones múltiples reducirán significativamente el coste del análisis de varios cientos de miles de SNP por paciente en ensayos clínicos. Los patrones bioinformáticos permitirán la rápida comparación de estos patrones de SNP entre los pacientes que presenten diferencias fenotípicas en la respuesta a un fármaco, de tal manera que cuando la información de las diferencias en la respuesta farmacológica sea ostensible, los perfiles de los SNP podrán ser relacionados con los actuales chips diagnósticos, y así determinar o anticipar la respuesta a un fármaco en un paciente determinado.

Los SNP también pueden clasificarse en funcionales, cuando alteran la expresión del gen o la función de la proteína y los no funcionales cuando no tienen ningún efecto (fig. 1). Hasta ahora, los estudios farmacogenéticos se han realizado son:



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3.4.2.-INSERCIONES/DELECIONES (INDEL)

Normalmente incluyen 1-30 pb siendo las más frecuentes las que implican un solo nucleótido4. Son de gran importancia cuando se encuentran en regiones codantes porque pueden causar disrupciones de la secuencia de lectura o en el promotor porque pueden alterar la transcripción del gen (fig. 1). Un ejemplo de INDEL de importancia en farmacogenética lo encontramos con la variación del número de nucleótidos timina y adenina (TA) en el promotor del gen UDP-glucurunosil transferasa 1A1(UGT1A1) que define el alelo UGT1A1*28 y su relación con la toxicidad asociada al tratamiento con irinotecán (Ramchandani RP, et al. 2007) 5.

centrado principalmente en este tipo de variaciones genéticas

Figura 1. Tipos de variaciones genéticas de importancia en farmacogenética.

3.4.3.-VARIACIÓN EN NÚMERO DE COPIAS (CNV)



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Son vastas regiones en el código genético de un individuo determinado que están duplicadas o suprimidas. Debido a limitaciones técnicas para poder identificarlas este tipo de variaciones fue considerado de menor importancia.

Sin embargo, estudios recientes señalan su importante contribución a la

variación genética entre individuos (Ifrate AJ., Estivill X., et al 2004, 2007) 6-8. Las CNV no se limitan a regiones intrónicas o intergénicas, sino que también pueden comprender toda la secuencia de uno o varios genes (fig. 1). Ejemplos de CNV de importancia en farmacogenética son el caso de las duplicaciones/deleciones de los genes que codifican para diferentes miembros del grupo de enzimas citocromo P450 (CYP) como CYP2D6, CYP2A6 y, más recientemente, CYP2B69-

11.

3.5.-CONCEPTOS IMPORTANTES EN FARMACOGENÉTICA

Los conceptos más importantes en farmacogenética se resumen en la tabla 1. 3.5.1.-EL PROYECTO HAPMAP

El proyecto HapMap se creó en el año 2002 con el objetivo de desarrollar un mapa haplotípico del genoma humano en el que se describieran las pautas más frecuentes de variación genética en diferentes poblaciones. Para ello, se incluyó a 270 individuos de 4 grupos étnicos diferentes: 30 tríos de etnia caucásica con orígenes del norte y oeste de Europa; 30 tríos de etnia yoruba procedentes de Nigeria; 45 individuos de etnia china procedentes de Pekín, y 45 individuos de etnia japonesa procedentes de Tokio (International HapMap Consortium, 2003) 12.

Este proyecto está identificando la mayor parte de la variación genética del ser humano que, como mencionamos anteriormente, son los SNP. Es importante señalar que es la variación genética común (frecuencia alélica 5%) y no toda la variación genética la que identificamos. La importancia de este proyecto radica en que permite seleccionar el número mínimo de SNP, los llamados «tag» SNP (tSNP) (tabla 1), representativos del total de la variación genética común presente en el genoma humano. El número de tSNP necesarios para caracterizar un individuo se ha estimado entre 300.000 (caucasianos) y 1.000.000 (negros africanos); un número pequeño si lo comparamos con los 10 millones de SNP descritos (International HapMap Consortium, 2005) 13.

El proyecto HapMap se dividió en 2 fases. La fase 1, cuyos resultados se publicaron en 2005, comprendía el genotipado de alrededor de 1,3 millones de SNP(International HapMap Consortium, 2005) 13. En la fase 2, cuyos resultados se han publicado en octubre de 2007, se han genotipado 2.1 millones de SNP adicionales (International HapMap Consortium, 2007) 14. Todos los datos generados por este proyecto son de acceso



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3.5.2.-Definición de Términos en farmacogenética

a.-Haplotipo: conjunto de single nucleotide polymorphisms (SNP) de un mismo cromosoma que se encuentran siempre asociados a.-Alelo: es cada una de las formas posibles de un gen determinado. Los seres humanos posen 2 copias de cada gen, es decir, 2 alelos.

El alelo que posee la secuencia de referencia y, salvo excepciones, el que encontramos con mayor frecuencia en la población general se llama alelo común. Los alelos que difieren de la secuencia de referencia se llaman alelos raros. b.-Frecuencia alélica: es una medida de la frecuencia relativa de un alelo en una población determinada c.-Genotipo: es el conjunto de alelos que posee un individuo concreto y que determinarán el fenotipo d.-Fenotipo: es la manifestación del genotipo; se refiere a cualquier característica detectable en un individuo determinado, entre otros factores, por su genotipo e.-Desequilibrio de ligamiento (DL): término que indica la asociación de SNP de manera predeterminada en el mismo cromosoma. Esto explica porque ciertas combinaciones de SNP se encuentran de manera más o menos frecuente en una población de la que cabria esperar si estos SNP se asociasen de manera aleatoria f.-Tag SNP (tSNP): se llaman así porque «marcan» otros SNP. Es un SNP representativo de una región cromosómica para la que existe un elevado nivel de desequilibrio de ligamiento. Genotipando estos SNP podemos identificar la variación genética de una región cromosómica determinada sin necesidad de genotipar todos los SNP presentes g.-Epistasis: se refiere a la interacción entre diferentes genes. El efecto de un gen determinado puede ser modificado por el efecto de otros genes no necesariamente localizados en regiones adyacentes http://www.hapmap.org. La principal aplicación de toda la información generada es aportar las herramientas necesarias para desarrollar estudios de asociación (genotipo asociado con un determinado fenotipo) que permitan la identificación



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de factores genéticos determinantes de la susceptibilidad a padecer ciertas enfermedades o del tipo de respuesta a determinados fármacos (fig. 2).

Figura 2. El proyecto HapMap. Con el genotipado de 270 individuos de 4 grupos étnicos diferentes se ha elaborado el proyecto HapMap. A) Toda la información genotípica de una región determinada se puede obtener de forma gratuita en la página web de HapMap, incluidos los tSNP que deben ser genotipados. B)

Los tSNP (SNP 1, 2 y 6) identifican otros SNP que por consecuente no necesitan ser genotipados. C) Los estudios de asociación se realizan genotipando los tSNP en una población con el fenotipo de interés. Uno de los tSNP (en este ejemplo el SNP 2) está asociado con el fenotipo lo que nos indica que el causante es él o cualquiera de los otros SNP con los que está asociado.

3.5.3.- PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE FÁRMACOS

Watson y Crick, hace algo más de 50 años, publicaron la estructura de la molécula de ADN1. Este hecho supuso un hito en la historia del conocimiento y marcó el inicio de un proceso de descubrimientos en los campos de la Biología y la Medicina. En estos años, en los laboratorios de Biología Molecular y Celular se aprendió a identificar, aislar y manejar los genes que contienen la información para las más variadas estructuras y funciones celulares. También se hicieron grandes avances en asociar alteraciones de genes con el desarrollo de enfermedades, es decir, en la comprensión de las bases moleculares de las enfermedades 2. El punto de partida de la Biomedicina en el siglo XXI es el acceso a la secuencia completa del genoma humano 3.



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El genoma es el conjunto de material genético de un organismo (contiene genes y regiones intergénicas) y está constituido por una secuencia de unos tres mil millones de nucleótidos presentes en el ADN.

Un gen es un segmento de la secuencia de ADN que codifica un producto,

habitualmente una proteína, de función bien definida y que se encuentra localizado en un cromosoma concreto. Los ácidos nucleicos son las moléculas constitutivas del ADN y ARN. La molécula de ácidos nucleicos condiciona la síntesis de proteínas; es, sencillamente, su precursor natural imprescindible.

El genoma ha sido un terreno inexplorado hasta hace pocos años. En la década de 1980 los científicos comenzaron a identificar genes cuyas variantes originaban enfermedades, pero ello requería años de trabajo «cartografiando» al detalle las regiones que contenían el gen buscado, para encontrar finalmente al responsable directo de la enfermedad. Algunos investigadores trataron de imaginar formas más sistemáticas de examinar el genoma, y en 1990 una iniciativa de los Institutos Nacionales de la Salud y el Ministerio de Energía de EE.UU. marcó el inicio del Proyecto del Genoma Humano. Este proyecto internacional liderado por EE.UU. se marcó como objetivos (Ommen GJB, et al 1999) 319: a) identificar todos los genes del ADN humano; b) determinar las secuencias de los 3 billones de pares de bases del ADN humano, y c) almacenar esta información en bases de datos.

Con anterioridad a la secuenciación del genoma humano se estimaron unos 100.000 genes, después de la secuenciación este número se redujo a 40.000 genes y actualmente después del refinamiento de la secuencia dicho número se considera alrededor de los 30.000 o menos (número bastante inferior al esperado).

Este reducido número es más aparente que real, ya que muchos genes se

expresan en diferentes formas, por lo que en lugar de hablar de un gen único, esta misma unidad transcripcional puede dar lugar a 4-5 formas distintas, y entonces tendríamos que hablar de 100.000-150.000 genes funcionales.

Además, si consideramos que el producto del gen, la proteína, sufre cambios después de su síntesis, el número de proteínas funcionales en las células puede sobrepasar el millón. El 14 de abril de 2003 se anunció, por parte del International Genome Project (http://www.genome.gov/), que se había alcanzado el último de los objetivos que era la secuenciación completa del genoma humano y en octubre de 2004 se presentaron los datos al 99% International Human Genome Sequencing, 2004 320. Todo ello nos ha permitido descubrir los siguientes hallazgos:

http://www.genome.gov/



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1. El genoma es muy semejante entre los diferentes animales. 2. La secuencia de ADN entre dos seres humanos es idéntica en el 99,9 %. La mayor parte de las diferencias se encuentran en regiones que no codifican a proteínas. Es ese 0,1 % de diversidad genética el responsable de la mayoría de las diferencias que existen entre los individuos. Sin embargo, muy pequeñas diferencias en la secuencia del ADN pueden dar lugar a grandes diferencias en la expresión génica. El mismo gen puede tener una expresión muy marcada en un individuo y ser mínimamente o ni siquiera ser expresado en otro. 3. Cada célula de nuestro organismo contiene la misma secuencia de ADN. A pesar de ello, cada gen no se expresa en cada una de las células. Algunos genes básicos se expresan en casi todas o todas las células (por ejemplo, aquellos que codifican la obtención de energía), pero otros sólo se expresan en células muy especializadas (por ejemplo, genes que codifican la síntesis de melanina sólo se expresan en los melanocitos). 4. A pesar de que los genes representan la principal función biológica del genoma, sólo comprenden una fracción pequeña de su extensión. El genoma contiene grandes desiertos. De hecho, sólo el 30 % del genoma contiene genes y la suma de todas las secuencias codificantes de proteína ocupa únicamente el 1,5% del genoma (existen genes codificantes de proteína y no codificantes). 5. Que se haya completado la secuenciación de nuestro genoma no significa que se conozca su funcionamiento. Aún se ignora la función de la mayoría de los genes. 6. En la actualidad contamos con una identificación de la secuencia del genoma humano muy próxima al 100 %, con un grado de verosimilitud superior al 99 %. Tenemos una base de datos que reúne los más de seis millones de polimorfismos de nucleótidos únicos que, probablemente, sigan aumentando.

Sin duda, la secuenciación del genoma humano es un gran logro que facilitará enormemente el desarrollo de la Biomedicina. Sin embargo, lo más difícil está todavía por hacer: encontrar la función de estos genes (genómica funcional), su asociación con las enfermedades y cómo podemos utilizarlos para prevenir o curar éstas. Éstos son los objetivos de la llamada «era post-genómica». En este sentido, se acercan cambios y nuevas posibilidades. Por todo ello, se dice que estamos saliendo de una era en la que se habla en idioma de dos letras (el 0 y 1 del lenguaje digital de los ordenadores) y entrando en otro de cuatro letras (los cuatro nucleótidos con las bases adenina [A], timina [T], guanina [G] y citosina [C] del ADN).

Estos cambios serán posibles porque al amparo del Proyecto Genoma

Humano se están desarrollando una serie de tecnologías, denominadas de alto



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rendimiento, que por primera vez nos permiten analizar el comportamiento de todos los genes (técnicas genómicas), las proteínas y su relación con los genes (técnicas proteínicas) o metabolitos (técnicas metabolómicas) de una célula o tejido en respuesta a una enfermedad o tratamiento. La ingente cantidad de datos que el uso de estas tecnologías está generando (que constituye el proceso de acumulación de información más rápido en la historia de la humanidad, terabytes) ha requerido el desarrollo de una nueva disciplina, la Bioinformática, para ser capaces de almacenarlos y explotarlos adecuadamente.

La investigación y desarrollo de esta área de la Medicina permitirá avanzar

en: a) diagnóstico molecular y pronóstico de las enfermedades; b) desarrollo de fármacos; c) terapia celular e ingeniería genética de teji-dos; d) terapia génica y vacunas génicas, y e) individualización de tratamientos (se podrá predecir quién se puede beneficiar de un medicamento y evitar su administración a quién sólo le provoque efectos secundarios indeseables (Wolff CR, Roses AD, et al 2000, 2001) 321,322. Permite identificar los genes responsables de las diferentes respuestas al tratamiento y así desarrollar una medicina personalizada. Es sobre esta área en la que se va a centrar esta Revisión).

3.5.4.-MÉTODOS MOLECULARES DE ESTUDIO EN FARMACOGENÉTICA.

A.-Tecnología de los microarrays de ADN

Desde la década de los ochenta se ha venido analizando la estructura de los genes y su expresión de manera individualizada mediante técnicas como Southern Blot y Northern Blot (hibridación de una sonda con ADN y ARN respectivamente). Con ellas se llevaba a cabo el análisis individualizado de un gen o de un grupo reducido de genes cada vez. El problema es que para encontrar asociaciones entre un gen y una enfermedad había que probar cientos o miles de posibilidades en lo que sería un proceso lento, caro, pesado y que, con frecuencia, no conducía a nada. Estudiar la expresión del genoma completo de gen en gen sería como vaciar el océano con una cucharilla. Sin embargo, las nuevas técnicas de microarrays permiten analizar miles de genes en un único experimento (NCBI)

344. En un futuro se convertirán en técnicas de rutina. En la actualidad la técnica más empleada para llevar a cabo estos estudios se realiza mediante la tecnología de los microarrays o chips de ADN (EBI-MBL)

345.

Los orígenes de la tecnología de los microarrays o chips de ADN se remonta al inicio de los años noventa3. Desde entonces su uso en investigación biomédica ha aumentado de forma espectacular en los últimos años, y abre unas enormes expectativas para el futuro. La técnica se fundamenta en la complementariedad de las dos cadenas de los ácidos nucleicos (permite detectar secuencias específicas de ARN o ADN basándose en su capacidad de combinarse específicamente a secuencias complementarias de una sonda de ADN) (PDG, CNB-CSIC)

346.



23

El microarray es un soporte al que se han unido fragmentos de genes, oligonucleótidos (fragmentos cortos de ADN), o productos procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por lo que el «encuentro» con material procedente del tejido del enfermo permite identificar, gracias a la complementariedad, aquellos genes que están presentes. Con ello se consigue la identificación de genes presentes en los tejidos normales o enfermos comparando la carga y la expresividad de cada una de las muestras.

Permite situar en los escasos centímetros cuadrados de un vidrio especial, en

posiciones definidas y concretas, hasta cientos de miles de fragmentos de ADN con una secuencia concreta (en su conjunto representan varias veces los genes del genoma). Se fabrican empleando la misma tecnología que se utiliza para elaborar los chips semiconductores, pero utilizando millones de cadenas de ADN colocadas verticalmente en un chip de cristal o silicona. Para ello se utiliza lallamada combinatorial chemistry. Se llegan a sintetizar hasta 1,3 millones de sondas de oligonucleótidos en cada array (cada oligonucleótido se coloca en un área específica del array llamada «celdilla de la sonda» o probe cell. Cada probe cell contiene cientos de miles de millones de copias de un determinado oligonucleótido).

El diseño y la fabricación de los microarrays de ADN dependen en primera instancia del ácido nucleico que posteriormentese vaya a estudiar. Para su construcción es esencial la caracterización total o parcial del genoma. La secuenciación de miles de clones procedentes de genotecas de ADN genómico y de ADNc permite identificar los distintos genes. A partir de esa información, almacenada en grandes bases de datos como GeneBank (http://www.ncbi. nih.gov) o EMBL (http://www.ebi.ac.uk), se identifican clones representativos de cada uno de los genes. El ADN presente en cada uno de ellos es amplificado mediante PCR y purificado, para ser posteriormente depositado, mediante robots de alta precisión, sobre soportes de vidrio que constituyen los chips de ADN.

Alternativamente, a partir de la secuencia de los genes o de los ADNc se

diseñan oligonucleótidos de pequeño tamaño (25-70 residuos) que específicamente hibridan con cada uno de ellos. Los oligonucleótidos son previamente sintetizados antes de inmovilizarlos sobre los soportes, o bien sintetizados in situ sobre el chip. De esta última tecnología los diferentes proveedores emplean métodos también diferentes: Affymetrix (www.affymetrix.com), la fotolitografía; Agilent (www.agilent.com), inyección de precursores fosforoamiditos; Roche (www.roche-applied-cience.com/sis/matrix array/), activación de precursores por campo eléctrico.

Los desarrollos futuros ofrecerán chips específicos de enfermedad o de

respuesta a fármacos, presumiblemente más baratos y de un manejo más sencillo que los dispositivos actuales, de tal manera que puedan universalizarse

http://www.ncbi/

http://www.roche-applied-cience.com/sis/matrix



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en los sistemas de salud tanto públicos como privados. Aunque todavía existe cierta controversia sobre la sensibilidad y especificidad de estas técnicas (Secuencias de ADN)

348, en el momento presente están empezando a ser comercializados.

Esta técnica permite analizar el comportamiento, es decir, la inducción o represión de todos los genes que se expresan en un tejido como consecuencia, por ejemplo, de una enfermedad o un tratamiento. Detecta pérdidas o ganancias cromosómicas, polimorfismos, mutaciones y cambios en los niveles de expresión de los genes. Estos resultados nos pueden permitir establecer si una persona tiene un «patrón» o «perfil» de enfermedad, es susceptible de desarrollarla, o puede responder o no a un tratamiento.

Se distinguen tres tipos de microarrays: 1. Microarrays para determinar la expresión génica: detectan secuencias específicas de ARN. 2. Microarrays para determinar el genotipo: detectan secuencias específicas de ADN. 3. Microarrays para determinar la resecuenciación.

Dado que la expresión génica, más que la propia dotación génica, y los polimorfismos existentes en ellos es lo que explica y condiciona las diferencias de los individuos en la respuesta a los tratamientos, objeto de esta revisión, nos centraremos fundamentalmente en los dos primeros tipos de estudios con microarrays. B-ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

No todos los genes de los que el individuo es portador se expresan; sólo lo hace una fracción de ellos. La expresión génica es el mecanismo por el que la información contenida en el ADN da lugar a ARN mensajero (ARNm) y, finalmente, este proceso se traduce en la síntesis de una proteína.

La expresión génica permite a la célula adaptarse y responder a los estímulos

procedentes de otras células o del ambiente. La importancia que tiene conocer cuáles son los genes «activos» es trascendental para explicar el perfil genético en cada situación. Un estudio fundamental con referencia a la determinación de la expresión génica mediante tecnología de microarrays de ADN fue llevado a cabo por Lockhart et al en 19966. En él, oligonucleótidos de ADN permitieron identificar unas pocas moléculas de ARNm por célula. En aquella época, los microarrays de ADN podían detectar la expresión génica de unos 1.000 genes. En la actualidad, los microarrays llevan sondas de todos los genes conocidos hasta la actualidad (varios miles).



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La expresión génica se estudia midiendo la cantidad de copias de ARN que produce un gen (gen activo). No detecta, por tanto, aquellos genes que, existiendo, permanecen inactivos. Los análisis de expresión génica con microarrays con frecuencia se realizan a ciegas inicialmente. Se estudia un panel amplio de genes y posteriormente se ana-lizan los resultados y su posible influencia en la enfermedad o en la respuesta terapéutica. Permiten al investigador comenzar sin una hipótesis concreta. Pueden medir la expresión génica de cada uno de los genes conocidos en el genoma humano completo, incluso de genes de los que se desconoce su función. Simplemente comparando los patrones de expresión génica (por ejemplo pacientes con psoriasis respondedores a ciclosporina y no respondedores) se pueden detectar diferencias en estos patrones. En el caso de que se demuestre una diferencia de patrones en la expresión de los genes tiene sentido iniciar una investigación dirigida.

Los microarrays para determinar la expresión génica se basan en la atracción química natural (llamada hibridación) entre el ADN (en el array) y las moléculas de ARN (en la muestra de estudio) para determinar qué secuencias de ARN se están expresando en una determinada muestra y su nivel de expresión a partir de un determinado gen (qué ARN y la cantidad de ARN que se está produciendo).

Cuando una cadena de ADN fabrica una cadena de ARN, las dos cadenas son complementarias porque los pares de bases se corresponden (A, T, G y C en la cadena de ADN, con U, A, C y G en la cadena de ARN respectivamente). Si las bases no son complementarias no se unirán el ADN y el ARN (una sola base que no se complementa es capaz de impedir que se unan las dos cadenas).

Existen dos tipos de microarrays para determinar la expresión génica. En la actualidad ambas tecnologías tienen una distribución similar en los laboratorios de investigación del mundo: 1. Microarrays de oligonucleótidos de ADN. Se inmovilizan pequeños fragmentos de ADN sintetizados químicamente (oligonucleótidos) específicos para cada genexpresado. Actualmente por su homogeneidad, reproducibilidad y robustez son los más usados. Existen varios proveedores: Affymetrix (es la principal compañía proveedora de este tipo de microarrays. Posee chips de alta densidad que con sus más de 500.000 oligonucleótidos permiten analizar

simultáneamente la expresión de másde 20.000 genes) (fig. 1), Agilenty Roche.

2. Microarrays de ADNc. Emplean sondas de ADN con aproximadamente 600-2.000 bases de longitud, en lugar de las 25, sobre una base de cristal, nitrocelulosa o nylon. Se inmovilizan fragmentos de ADNc procedentes de



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colecciones de clones (genotecas). Metodología en la técnica de microarrays de oligonucleótidos

La metodología en la técnica de microarrays de oligonucleótidos de expresión génica incluye las siguientes fases: 1. Extracción y preparación del ARN a partir de una muestra (sangre o tejido). Se obtiene el ARN total a partir de los leucocitos en las muestras de sangre y/o del tejido tras un proceso de machacado o molido (grinding) en estas últimas. 2. Amplificación y secuenciación del ARN. Con el fin de facilitar la hibridación, se realiza una amplificación (millones de copias) del ARN mediante PCR. Posteriormente se fragmentan las cadenas de ARN en millones de secciones. Además se añaden moléculas de biotina que actúan como pegamento para moléculas fluorescentes. 3. Identificación del ARN. La determinación de la expresión de los genes candidatos se realiza mediante microarrays deoligonucleótidos de alta densidad. Este microarray examina prácticamente cada gen del genoma humano Contiene más de 45.000 fragmentos (probe sets) que corresponden a 33.000 genes conocidos y 6.000 expressed sequence tags (EST), es decir, aproximadamente todo elgenoma humano. Ello permite la identificación de aquellos genes, conocidos o desconocidos previamente, que estén expresados, y también la cuantificación del nivel de expresión de cada uno de ellos.

En estos microarrays las sondas de ADN van colocadas en la superficie de una base de cristal. Cada sonda contiene generalmente tan sólo 25 bases de



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longitud que suponen una pequeña sección, pero muy representativa de un gen completo con muchísimas más bases. Si una cadena de ARN se combina con estas 25 bases, se podrá saber de qué gen concreto se trata. El microchip es tan preciso que puede detectar incluso una sola molécula de ARN específico de un gen dentro de 100.000 ARN diferentes que también puedan estar presentes en la muestra (sensibilidad de detección de aproximadamente 1:100.000).

La superficie de este microarray es como un tablero de damas de 1,25 1,25 cm. La superficie total contiene hasta 1,3 millones de cuadrículas. Cada cuadrícula (feature) mide 11 11 micrometros y contiene millones de copias de cada sonda de un mismo ADN (fig. 2). Las sondas se van apilando unas junto a otras por un mecanismo de síntesis fotolitográfica.

El proceso de identificación del ARN consta de los siguientes pasos: a) colocación del ARN en el microarray. El ARN extraído de la muestra y multiplicado se deposita en el microchip. Se deja 14-16 horas para permitir que la hibridación tenga lugar (para que se complementen las bases de ARN de la muestra y ADN de las sondas del microarray).

Cada cadena de ARN de los genes que se han expresado está nadando entre

las sondas de ADN, buscando su complemento perfecto. Aunque desgraciadamente la mayor parte de ellas no encuentra su combinación en el array, algunas sí lo hacen y quedan como adheridas a la sonda de ADN (fig. 3); b) aclarado del microarray. Posteriormente se aclara el microarray para eliminar el ARN no combinado. Por el contrario permanece el ARN hibridado a la sonda de ADN, a su vez unida a la molécula de biotina, y c) observación del ARN hibridado. Para poder ver el ARN combinado con la sonda de ADN se utiliza una molécula fluorescente que se une a la biotina. Tras un lavado, las moléculas fluorescentes no combinadas se eliminan de manera que sólo quedan las moléculas fluorescentes unidas a biotina, expresión de las cadenas de ARN unidas a las sondas de ADN. Por tanto, la detección de luz fluorescente será síntoma de hibridación y, por ello, de detección deuna secuencia específica determinada. La lectura de la fluorescencia se realiza mediante un láser escáner. La intensidad de las radiaciones informará de la cantidad relativa de cada secuencia de la muestra.

Dependiendo de la cantidad de ARN hibridado, brillará más o menos. Si un

gen está muy expresado y existen muchas moléculas de ARN, brillará mucho. Por ello, según la intensidad del brillo se puede cuantificar la cantidad de ARN. A su vez, valorando todas las cuadrículas se podrán evaluar todos



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Figura 2. Composición de un microarray de ADN.

Figura 3. Hibridación del ARN. Fuente: Daudén E. Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y

aspectos éticos, Actas Dermosifiliogr. 2007;98:3-13



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Fuente: Daudén E. Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y aspectos éticos, Actas

Dermosifiliogr. 2007;98:3-13

los varios miles de genes presentes en el array. En síntesis, conociendo la identidad de una sonda de oligonucleótido (y la de su gen correspondiente) por su localización en el microarray podremos identificar el gen expresado y por la intensidad de fluorescencia podremos determinar su nivel de expresión (fig. 4). Para poder comparar entre unas y otras muestras se construye un «mapa de calor» (heat map). Según la intensidad de la expresión, tras aplicar el láser, los features mostrarán unos u otros colores. Son representacionesgráficas que colorean la expresión génica. Solo se colorearán intensamente aquellos genes que estén muy expresados.

Estos mapas se pueden grabar, registrar y almacenar, para así poder ser valorados pasado un tiempo. La imagen obtenida de esta manera es analizada informáticamente (fig. 5). 3. Investigación de nuevos fármacos. En función del apartado anterior, el conocimiento de mecanismos patogénicos de una enfermedad permite la investigación de nuevos fármacos que tengan por diana aquellos mecanismos en los cuales interviene ese gen, pero también es útil para determinar su toxicidad, no sólo su eficacia. 4. Predicción de la respuesta terapéutica de los pacientes a los fármacos y optimización de su utilización: terapia individualizada.

Ya ha sido comentado previamente que los pacientes con una determinada enfermedad común responden de forma diferente a los mismos fármacos. Si



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comparamos la expresión génica de un paciente antes y después de recibir un fármaco, veremos las diferencias que existen.

Si comprobamos que los pacientes respondedores tienen un patrón

característico, frente a los no respondedores, podremos predecir qué pacientes se beneficiarán de un fármaco y cuáles no. De esta forma valoramos eficacia. Si realizamos lo anterior con diferentes dosificaciones de un fármaco, podremos también comprobar qué dosis son necesarias para determinados patrones de pacientes (por ejemplo aquellos con determinado patrón de expresión génica no son respondedores a la dosis habitual, pero sí lo son a dosis más altas). De esta manera podremos individualizar y ajustar la dosis necesaria. Y lo mismo podríamos decir de la toxicidad; podremos predecir qué pacientes sufrirán efectos secundarios y cuáles no. C.-ANÁLISIS DEL GENOTIPO

Aunque la mayor parte de la secuencia del genoma es homogénea, alrededor de uno de cada 100-1.500 nucleótidos es polimórfico, es decir, tiene una base en un cromosoma distinta a la de otro cromosoma. Estas diferencias, llamadas polimorfismos, tienen consecuencias sobre la expresión de la proteína o sobre su estructura lo que hace que, en la práctica, sólo los gemelos monocigóticos tengan una carga genética altamente semejante, mientras que hay diferencias muy notables entre los individuos de la especie humana.

Cada persona hereda dos copias de cada gen, una de cada uno de sus padres. Estas copias pueden ser idénticas o diferentes. El conjunto de estas diferencias heredables constituye la variación genética entre individuos. Muy pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden tener grandes efectos en la salud y la enfermedad. Un gen que funciona correctamente en una persona puede hacerlo de forma reducida o incluso no funcionar en otra. Los polimorfismos genéticos pueden ser definidos cuando existen variaciones monogénicas en la población normal con una frecuencia mayor del 1%7. Los polimorfismos pueden ser: 1. Mutaciones importantes del ADN, con repercusiones muy notables como: a) delecciones (eliminación de una o más bases o segmentos de la secuencia de ADN). Generalmente tiene una repercusión negativa importante en el gen afectado y en la proteína que es codificada por él; b) inserciones (se añade una base o una sección de bases, extras, a la secuencia de ADN). Puede tener lugar en la zona de codificación del gen o no. Generalmente tienen efectos extremadamente negativos sobre las proteínas codificadas. 2. Pequeñas mutaciones, con menor repercusión. Incluyen los polimorfismos de un único nucleótido (SNP), el tipo más frecuente de polimorfismo.



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Los SNP son variaciones, homo o heterocigotos, de un solo par de bases en la secuencia de ADN del genoma humano.

Son la forma más simple y frecuente de polimorfismos entre individuos. Constituyen una de las herramientas más poderosas para el análisis de genomas. La mayor parte de los SNP se encuentran fuera de las regiones codificadoras o promotoras de los genes. Sin embargo, tanto los que se encuentran dentro como fuera de esas zonas pueden tener influencia en la transcripción de los genes. Las características más importantes de los SNP, que hacen de ellos unos marcadores genéticos ideales en la búsqueda de genes de susceptibilidad de una enfermedad o genes que determinan la respuesta a un fármaco son: simplicidad, amplia distribución, estabilidad y alta frecuencia a lo largo del genoma (se estima que tienen una incidencia de aproximadamente un SNP por cada 1.000 pares de bases) (Shastry BS, et al 2002) 351.

Se han identificado más de 1,4 millones de SNP en la secuenciación inicial del genoma humano (con más de 60.000 de ellos en las zonas de codificación de los genes, (Sachinadandam R, et al 2001) 352, y se estima que el genoma humano contiene unos 10 millones de SNP. En la actualidad, el Consorcio SNP (grupo sin ánimo de lucro formado por compañías farmacéuticas, compañías procesadoras de información, instituciones académicas y fundaciones de investigación) ha determinado un mapa de alta densidad con varios millones de SNP (http://snp.cshl.org). Gracias a este mapa, actualmente miles de polimorfismos se pueden identificar y ordenar de forma precisa.

En el pasado, y todavía en el presente, para conseguir los objetivos de la farmacogenética se seguían, y se siguen, los pasos detallados a continuación: a) se analiza la distribución de la población para la variación en estudio utilizando una sonda válida para detectar el polimorfismo fenotípico (que afecta a 1% de la población); b) se identifica el gen responsable y sus variantes; c) se realizan estudios familiares y de gemelos para confirmar sus características genéticas (herencia dominante, recesiva, mendeliana, etc.); d) se desarrollan ensayos genéticos para las distintas variantes del ADN; e) se realiza la correlación entre el genotipo y el fenotipo, y f ) se aplica a la práctica clínica.

De hecho, la mayoría de los estudios de farmacogenética publicados están basados en correlacionar la respuesta del paciente con las variaciones en los genes involucrados en el mecanismo de acción del fármaco o de su metabolismo

con el fin de determinar el «gen candidato». Por el contrario, en la última década, los avances en la tecnología de secuenciación molecular permiten, además, una investigación sistemática para encontrar variaciones funcionales significativas en las secuencias de ADN de los genes que influyen en los efectos de diversos fármacos, para después estudiar su repercusión fenotípica. Esto se puede hacer hoy en día gracias nuevamente a los microchips de ADN para detectar SNP 8-10. No es imprescindible conocer de antemano el gen responsable,



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sino que se puede llegar a él desde el análisis de las diferencias entre respondedores y no respondedores. Se basa en la complementariedad, en la atracción de una cadena de ADN con otra cadena de ADN (y en la combinación de pares de bases:

ATCG con TAGC respectivamente). Para determinar el genotipo se emplean chips de oligonucleótidos de manera casi exclusiva. Affymetrix es también el principal proveedor, con microchips que permiten analizar miles de SNP conocidos en un único experimento (actualmente se están desarrollando microarrays de hasta 100.000 SNP). Dado que el Proyecto Genoma Humano ha permitido secuenciar gran parte del mismo, en el microarray está reflejado tal conocimiento y contiene las secuencias de ADN (secuencias cortas pero representativas de los genes del genoma), de manera que se podrá detectar el genotipo completo (incluyendo los SNP) del individuo que aporte la muestra.

Determinar el genotipo de un individuo sólo tiene que realizarse una vez para un determinado gen, porque, con excepción de raras mutaciones, no suele cambiar (a diferencia del análisis de expresión del ARN, en el que la expresión génica de los diferentes tipos celulares y, por tanto, la producción de ARN es variable) y además se puede realizar en cualquier tejido o fluido, ya que el ADN es común a todas las células del organismo. Metodología de la técnica de microarrays para la detección de polimorfismos de un único nucleótido La metodología en la técnica de microarrays para detectar SNP es similar a la descrita para la expresión génica: 1. Extracción y multiplicación del ADN a partir de una muestra (sangre o tejido). 2. Amplificación y secuenciación del ADN. Con el fin de facilitar la detección de los SNP se realiza una amplificación (millones de copias) de cada fragmento del ADN que contiene estos polimorfismos de la muestra mediante PCR. Posteriormente se secuencia el ADN. 3. Identificación del genotipo de ADN. La muestra obtenida anteriormente, con el ADN, se introduce en un microarray para la detección de SNP. La estructura del microarray es similar a la empleada en el análisis de ARN, con sondas de oligonucleótidos de ADN con 25 bases dispuestas apiladas unas con otras en cientos de miles de cuadrículas (cada cuadrícula con un solo tipo de sonda de ADN). Incluye la mayoría de los genes del genoma humano. Permite analizar miles de SNP conocidos en un único experimento. El proceso de identificación del ADN sigue las mismas fases que para el ARN:



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3.6.-CLASIFICACIÓN DE LOS ESTUDIOS FARMACOGENÉTICOS

Los estudios farmacogenéticos encargados de investigar la contribución de

los factores genéticos a la variabilidad en la respuesta y/o toxicidad a distintos fármacos pueden clasificarse en 3 grandes grupos: los estudios que pretenden comprobar hipótesis (fig. 3A), los que intentan generar nuevas hipótesis (fig. 3B) y los estudios mixtos. 3.6.1.-ESTUDIOS DE COMPROBACIÓN DE HIPÓTESIS

Este tipo de estudios farmacogenéticos se caracteriza por la investigación de los polimorfismos genéticos de genes conocidos cuyos vínculos de interacción con un fármaco concreto ya se han establecido previamente. Por esta razón se conocen también como estudios farmacogenéticos de genes candidatos (fig. 3A).

Estos estudios pretenden comprobar la hipótesis generada a partir del conocimiento previo de que los polimorfismos genéticos en los genes candidatos podrían estar asociados a una o varias de las variables de evaluación fenotípica de un fármaco. Estas variables pueden ser de tipo farmacocinético (PK), farmacodinámico (PD) o clínico.

Los vínculos de interacción entre un fármaco y un gen que avalan la plausibilidad biológica y lo definen como genes candidatos pueden ser de varios tipos. Por un lado, el fármaco puede ser sustrato del producto de un gen implicado en los procesos de su absorción, distribución, metabolismo o eliminación (vías ADME). Por otro lado, el producto de un gen puede ser la diana terapéutica sobre la que el fármaco ejerce su actividad terapéutica o una diana secundaria responsable de su toxicidad. Y, por último, el fármaco puede interaccionar con los productos de genes que se encuentran corriente abajo en las cascadas de transmisión de señales implicadas en su mecanismo de acción, o con los que forman parte de las complejas redes fisiopatológicas implicadas en la patogenia de la enfermedad que se pretende tratar.

De este modo, en función de los vínculos de interacción, podemos agrupar los genes candidatos en 3 grandes grupos: los implicados en los procesos ADME, los involucrados en el mecanismo de acción tera-péutica y tóxica del fármaco y, por último, los integrantes de las redes fisiopatológicas de la enfermedad a tratar.

Los vínculos funcionales entre un gen candidato y sus polimorfismos genéticos son otro aspecto que contribuye, aunque no de forma imprescindible, a la plausibilidad biológica de los estudios de genes candidatos. Los vínculos funcionales que definen a un polimorfismo genético como candidato serían los conocimientos preestablecidos que establecen una relación entre este polimorfismo y los niveles de transcripción (ácido ribonucleico mensajero



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[ARNm]) y/o expresión proteica y/o actividad funcional del producto del gen al que pertenece.

El estudio farmacogenético ideal sería el que investigase polimorfismos con repercusión funcional comprobada de un gen candidato. Sin embargo, no siempre se dispone de la información completa que permita definir los polimorfismos funcionales candidatos, ni de este tipo de información para todos los polimorfismos genéticos conocidos de cierto gen candidato. Ante esta ausencia de información experimental una alternativa la proporcionan las actuales herramientas bioinformáticas como FastSNP (Yuan HY., et al. 2006)15, Pupa-Suit (Conde L., et al. 2006) 16 o TAMAL (Hemminger BM., et al. 2006) 17 que proporcionan una estimación aproximada del efecto funcional putativo. Otra forma de buscar polimorfismos funcionales putativos consiste en investigar polimorfismos localizados en las regiones de los genes candidatos muy conservadas en otras especies (Carlton VE., et al 2006) 18.

Otra opción, cuando no se dispone de la información necesaria para considerar un polimorfismo como funcional probado o putativo, es la utilización de tSNP. Los tSNP ofrecen una aproximación indirecta (a través del patrón de desequilibrio de ligamiento entre los tSNP y los funcionales desconocidos) de la variabilidad genética.

Recientemente, la estrategia de resecuenciación de genes candidatos ha dado buenos resultados con la identificación de nuevos polimorfismos genéticos con repercusión funcional directamente relacionados con variables de evaluación

fenotípica, ya sean farmacocinéticas (Rotger M, et al. 2007) 19 o clínicas Topol EJ., Romeo S., et al. 2007) 20,21.

Además ha demostrado que el porcentaje de variabilidad explicada en las

variables de evaluación fenotípica aumenta a medida que aumenta el número de polimorfismos funcionales analizados.

3.6.2.-ESTUDIOS DE GENERACIÓN DE NUEVAS HIPÓTESIS

La secuenciación del genoma humano (Lander ES., Venter JC., et al. 2001)

22,23, la culminación de proyecto HapMap (International HapMap Consortium, 2003) 12-14 y el desarrollo de técnicas de genotipado de alto rendimiento (Fan JB., Gunderson KL., 2005/2006)24,25 han propiciado la aparición en los últimos 2 años de una nueva modalidad de estudios genéticos. Se trata de los estudios de asociación con cobertura genómica completa (Hirschhorn JN, y Wang WY et al. 2005)26,27. Son estudios en los cuales se selecciona un gran número de tSNP (entre cien mil y un millón), en función de los patrones de desequilibrio de ligamiento descritos por el proyecto HapMap, con el objetivo de ofrecer una



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cobertura de la variabilidad genómica común (5%) existente en el ser humano (fig. 3B). A diferencia de los estudios de genes candidatos, estos estudios pretenden abarcar la variabilidad presente en el genoma completo para descubrir nuevos genes candidatos o regiones genómicas candidatas generando nuevas hipótesis cuya veracidad debe ser confirmada en los estudios de replicación y cuya plausibilidad biológica ha de ser investigada.

Básicamente, su diseño consiste en elegir unos criterios fenotípicos según los cuales clasificar la población de estudio en casos (afectados por cierta enfermedad o los que reciben un fármaco) y controles (no afectados por la enfermedad o los que reciben placebo), posteriormente genotipar ambos grupos para los cien mil o un millón de tSNP y comparar las frecuencias alélicas y/o genotípicas entre ambos.

Los tSNP que resulten más o menos frecuentes en los casos respecto a los controles se definen como asociados al fenotipo investigado (a la variable de evaluación fenotípica) y consecuentemente como polimorfismos candidatos.

Su localización en genes conocidos o regiones genómicas sin genes

conocidos hasta ahora permite a su vez postular nuevos genes o regiones candidatos. Los estudios de asociación con cobertura genómica completa han ofrecido muy buenos resultados en enfermedades oftalmológicas, oncológicas, endocrinológicas, neurológicas, cardiovasculares e infecciosas (Fellay J, et al. 2007)28. No obstante, su aplicación en los estudios farmacogenéticos está todavía en sus comienzos (Kelly P, y Warren LL, et al 2006/2007)29-31.

Estos estudios requieren muestras de tamaños considerables (unos 1.000

casos y otros tantos controles) que exigen la creación de grandes consorcios de colaboración. Además, se necesita la aplicación de técnicas estadísticas de ajuste para comparaciones múltiples para controlar los falsos positivos resultantes del análisis de tan elevado número de SNP junto con técnicas de ajuste por la estratificación de la población de estudio (Balding DJ, Gibbs JR et al 2006) 32,33.

3.7.-ESTUDIOS MIXTOS

La otra modalidad de estudios farmacogenéticos de reciente aparición son los estudios mixtos. Estos estudios



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Figura 3. Tipos de estudios farmacogenéticos. Principales tipos de estudios farmacogenéticos: A) estudios de comprobación de hipótesis o de genes candidatos y B) estudios de generación de nuevas hipótesis. Para más información, véase texto.

ofrecen una aproximación indirecta (a través del patrón de desequilibrio de ligamiento entre los tSNP y los funcionales desconocidos) de la variabilidad genética.

Recientemente, la estrategia de resecuenciación de genes candidatos ha dado buenos resultados con la identificación de nuevos polimorfismos genéticos con repercusión funcional directamente relacionados con variables de evaluación

fenotípica, ya sean farmacocinéticas (Rotger M., et al. 2007) 19 o clínicas (Romeo S, y Lander ES, et al 2001/2007)

21,22.

Además ha demostrado que el porcentaje de variabilidad explicada en las

variables de evaluación fenotípica aumenta a medida que aumenta el número de polimorfismos funcionales analizados.

3.7.1.-ESTUDIOS DE GENERACIÓN DE NUEVAS HIPÓTESIS Hasta aquí se han descrito los diferentes tipos de estudios farmacogenéticos

que pretenden investigar la aportación de los factores genéticos a la variabilidad



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fenotípica de distintos fármacos. No obstante, todos ellos poseen el inconveniente de ser en mayor o menor medida una aproximación a la complejidad de la variabilidad presente en el genoma humano, ya que utilizan marcadores genéticos subrogados. Por lo tanto, la forma de estudiar los factores genéticos en su conjunto se lograría con la secuenciación en paralelo del genoma completo a nivel poblacional.

3.7.2.-PROYECTO DEL GENOMA HUMANO: SECUENCIACIÓN DEL GENOMA COMPLETO

Desde la culminación del Proyecto Genoma Humano hasta la fecha, las

técnicas de secuenciación han mejorado su rendimiento y reducido considerablemente su coste; aunque éste siga siendo prohibitivo pues ronda los 10 millones de dólares Bennett ST, Bentley DR, et al. 2005, 2006 36,37. Un objetivo teórico a medio-largo plazo de la comunidad internacional es conseguir la secuenciación de las 3 gigabases del genoma humano por 1.000 $ 38-41. Hasta que el proyecto «Genoma Humano por 1.000 $» (Hutchison CA, et al 2007) 42 sea una realidad, tendremos que seguir utilizando las técnicas de genotipado de alto rendimiento como los mejores marcadores subrogados de la variabilidad genómica. 3.8.-APLICACIONES FARMACOGENÉTICAS ACTUALES

Aunque todavía es pronto para hablar de una verdadera medicina

personalizada en la que el fármaco más adecuado para cada paciente sea determinado de manera prospectiva basándose en el perfil genético, existen algunos ejemplos de aplicaciones de la farmacogenética en la práctica clínica. Un ejemplo es el reconocimiento por parte de la Food and Drug Administration (FDA) de que el perfil genético del paciente puede determinar la aparición de efectos adversos a ciertos fármacos y, por tanto, esta información debe constar en el etiquetado del producto. Éste es el caso de los fármacos antitumorales irinotecán y 6-mercaptopurina y más recientemente, del anticoagulante warfarina y del anticomicial carbamacepina.

Irinotecán es un fármaco muy eficaz para el tratamiento del cáncer de colon, pero que presenta efectos adversos como neutropenia y diarrea grave. El responsable de estos efectos adversos es un metabolito activo del irinotecán, el SN-38, que es principalmente inactivado por la enzima UGT1A1. Un polimorfismo en el promotor de esta enzima que define el alelo UGT1A1*28 está asociado con una disminución de su actividad y con la aparición de los efectos adversos (Innocenti F, et al 2004/2006) 43,44. Basándose en estos resultados, la FDA aprobó indicar en la ficha técnica del producto que los individuos homocigotos para el alelo UGT1A1*28 tienen mayor riesgo de sufrir neutropenia y se recomienda empezar el tratamiento con una dosis menor.



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Un caso similar es el de 6-mercaptopurina y variaciones genéticas del gen tiopurina-S-metiltransferasa (TPMT). Un efecto adverso grave es la mielosupresión debida a la disminución de la actividad de la enzima TPMT.

Hay diferentes polimorfismos descritos que se asocian con disminución de la actividad 45.

La warfarina es un anticoagulante que se utiliza en la profilaxis de trombosis, accidentes cerebrovasculares e infarto de miocardio y que presenta como efecto adverso hemorragias. Polimorfismos en el gen CYP2C9 y en el gen vitamina K epóxido reductasa (VKORC1) están asociados con un riesgo aumentado de sufrir hemorragias. Por todo ello, en 2007 la FDA ha actualizado la ficha técnica del producto donde se incluye esta información farmacogenética Gage BF, et al. 2008) 46.

Recientemente, la FDA ha decidido también incluir en la ficha técnica del

fármaco anticomicial carbamacepina la recomendación de genotipificar para el HLA-B*1502 antes de iniciar el tratamiento con este fármaco, ya que este marcador genético se ha relacionado con la aparición de reacciones cutáneas de hipersensibilidad (necrosis epidermolítica tóxica o síndrome de Stevens-Johnson). Se desaconseja el tratamiento con carbamacepina en los pacientes portadores de este polimorfismo, sobre todo en los de origen asiático (CDER US-FDA 12-12-2007) 47.

Otro ejemplo de la importancia de la farmacogenética son los resultados del

estudio PREDICT-1, el primer ensayo clínico prospectivo aleatorizado y a doble ciego realizado en el campo de la farmacogenética del tratamiento antirretroviral.

Los resultados de este estudio demuestran que el cribado prospectivo con la

determinación del HLAB* 5701 da lugar a una reducción clínicamente relevante y estadísticamente significativa de las reacciones de hipersensibilidad asociadas

al tratamiento con el fármaco antirretroviral abacavir (Mallal S, Phillips E. et al

-2008) 48.

El estudio PREDICT-1 es un ejemplo de la aplicación de los conocimientos farmacogenéticos en la práctica clínica diaria para un fármaco concreto. Sin embargo, no es más que el primer paso en el largo camino hacia la implantación de la farmacogenética. Además de la realización de ensayos farmacogenéticos centrados en un único fármaco hace falta realizar ensayos que evalúen la utilidad de los tests genéticos para la selección individualizada entre las posibilidades disponibles del tratamiento. Un ejemplo es la iniciación del tratamiento antirretroviral en los pacientes no tratados previamente infectados por el VIH.



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En los últimos años se han logrado considerables avances en el campo de la farmacogenética, sin embargo, aún queda un largo camino hasta su aplicación y consolidación en la práctica clínica diaria (Swen JJ, Grossman I, Baudhuin LM, et al 2007) 49-52.

3.8.1.-FARMACOGENÉTICA DEL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Existe una gran variabilidad interindividual en la respuesta al tratamiento antirretroviral debida a la influencia de diferentes factores: ambientales, sexo del individuo, enfermedades asociadas, interacciones con otros fármacos y genéticos. Variaciones genéticas en proteínas implicadas en el transporte o el metabolismo de los fármacos antirretrovirales pueden influir en su eficacia. Los factores genéticos también pueden influir en la aparición de efectos adversos asociados al tratamiento y en la respuesta virológica e inmunológica. En esta revisión describimos los aspectos más relevantes de la farmacogenética del tratamiento antirretroviral.

Existe una gran variabilidad interindividual en la eficacia y la susceptibilidad a los efectos adversos de los fármacos. Esta variabilidad se debe a la influencia combinada de diferentes factores: ambientales, sexo del individuo, enfermedades asociadas, interacciones con otros fármacos y genéticos. La farmacogenética estudia las características genéticas del individuo y su influencia en la respuesta al tratamiento. Esto es importante en el tratamiento clínico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) debido a la necesidad de pautar un tratamiento crónico y a la elevada prevalencia de efectos adversos asociados.

Variaciones genéticas en ciertas proteínas implicadas en el transporte o el metabolismo de los fármacos antirretrovirales pueden influir en su eficacia. Los factores genéticos también pueden influir en la aparición de efectos adversos asociados al tratamiento y en la respuesta virológica e inmunológica. En esta revisión, describimos los aspectos más relevantes de la farmacogenética del tratamiento antirretroviral. 3.9.-VARIACIONES GENÉTICAS EN PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS

Existen 2 grupos principales de proteínas transportadoras: las que exportan los fármacos desde el interior celular al medio extracelular y las que facilitan la entrada de los fármacos al interior celular. Dentro del primer grupo encontramos la glucoproteína P (Pg-p) que transporta múltiples sustratos entre los que se encuentran los inhibidores de la proteasa (IP). La Pg-p, que es el producto del gen ABCB1 (MDR1), es una de las más estudiadas en cuanto a la identificación de polimorfismos genéticos. Uno de los más relevantes es el 3435 C T en el exón 26. Este polimorfismo está asociado con una alteración de la expresión de



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la proteína y la estabilidad del ARN mensajero, aunque no provoca un cambio en el aminoácido correspondiente (isoleucina) Hoffmeyer S., y Wang D., et al. 2000/2007) 54,55. Numerosos estudios realizados para establecer la relación de este polimorfismo y otros, como el del exón 21 (2677G T/A), con la farmacocinética de diferentes IP y del efavirenz han dado resultados controvertidos Colombo S, Rodríguez NS, et al 2006 56-64.

Otros transportadores, como los de la familia de las proteínas asociadas con

la resistencia a diversos fármacos (MRP), podrían también influir en la disposición de los fármacos antirretrovirales, aunque no hay datos concluyentes. Las MRP1 y MRP2 transportan una gran cantidad de aniones orgánicos, incluidos los IP12. Colombo et al 56 evaluaron la relación de diferentes polimorfismos en ABCC1 y ABCC2 (los genes que codifican para los transportadores MRP1 y MRP2, respectivamente) y los valores intracelulares de nelfinavir. Los autores concluyeron que no había ningún efecto de estos polimorfismos. Owen et al 66 demostraron un efecto del polimorfismo 260G C en ABCC1 y los valores plasmáticos de nevirapina.

Las proteínas transportadoras MRP4 y MRP5 participan en el transporte de

adefovir, tenofovir y diferentes inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de los nucleósidos (ITIAN), como azidotimidina, lamivudina, zalcitabina y estavudina (Schuetz JD, y Ray AS, et al. 1999/2005) 67,69. Numerosos polimorfismos han sido identificados en estos transportadores (Saito S, et al. 2002)70. Un estudio de Kiser et al apunta a una relación entre el polimorfismo 3463 A G en ABCC4 (gen que codifica para el transportador MRP4) y la farmacocinética de tenofovir. Los individuos heterocigotos o homocigotos para el alelo raro presentaban un aumento de la concentración plasmática e intracelular de tenofovir, así como una disminución de su aclaramiento renal (Kiser JJ., et al 2006) 70. Estos resultados necesitan confirmación debido al reducido número de pacientes estudiados (n 27).

Dentro del grupo de proteínas que facilitan la entrada de los fármacos al interior celular están los transportadores de aniones orgánicos y los de cationes orgánicos. Numerosos fármacos, entre los que se encuentran adefovir, tenofovir, y diferentes ITIAN e IP son sustratos de estos transportadores (Izzedine H., et al. 2005) 72. Se han descrito polimorfismos genéticos que afectan a la actividad de ambos transportadores (Fujita T., Kerb R., et al 2002/2005) 73,74, aunque su influencia sobre la disposición de los fármacos antirretrovirales está todavía por determinar.

3.10.-VARIACIONES GENÉTICAS EN ENZIMAS METABÓLICAS

El metabolismo de los fármacos se divide en 2 fases: la fase I, que incluye

reacciones de oxidación, reducción o hidrólisis; y la fase II, en la que tienen lugar



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reacciones de conjugación con compuestos endógenos para dotar al fármaco de mayor polaridad y facilitar su excreción del organismo.

Uno de los grupos de enzimas más importantes de la fase I es el citocromo

(CYP) P-450. Se trata de un grupo amplio y complejo de proteínas metabolizadoras que, en el ser humano, son codificadas por 57 genes divididos en 18 familias y varios seudogenes. Cinco isoenzimas del CYP (CYP3A4, CYP3A5, CYP2C19, CYP2D6 y CYP2B6) participan en el metabolismo de los fármacos antirretrovirales.

Los polimorfismos genéticos en estas enzimas pueden resultar en un fenotipo metabolizador débil o por el contrario en un fenotipo metabolizador ultrarrápido debido a un fenómeno de duplicación genética. Numerosos polimorfismos se han identificado en las isoenzimas CYP, la mayoría de ellos son raros en la población general (frecuencia alélica 1-2%) y algunos sólo se han descrito en grupos étnicos determinados (Rotger M, et al. 2006) 75.

El CYP3A4 y CYP3A5 son las isoenzimas más abundantes (constituyen el 25-40% del contenido hepático de P-450) y las que presentan el espectro más amplio, ya que metabolizan el 50% de los fármacos, incluidos la mayoría de los IP y los inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (ITINAN). Ambas enzimas son polimórficos, hay 20 alelos descritos para CYP3A4 y 11 para CYP3A5. El efecto de los polimorfismos -392A G en la región 5’ del gen CYP3A4 (CYP3A4*1B), el 6986A G en el intrón 3 (CYP3A5*3) y el 14690G A en el exón 7 (CYP3A5*6), han sido evaluados en la farmacocinética de efavirenz (Haas DW, Saitoh A, Fellay J, et al. 2002, 2004, 2005) 63,70, nelfinavir Haas DW, Saitoh A, Fellay J, 2002, 2005) 58,59,63 y saquinavir (Frohlich M, Mouly SJ, et al. 2004/2005) 76, 77.

Los resultados disponibles hasta el momento no demuestran ningún efecto

significativo de estas variantes en la farmacocinética del efavirenz y el nelfinavir. Al contrario, 2 estudios independientes han demostrado una asociación del CYP3A5*3 con una disminución de la eliminación urinaria de saquinavir (Frohlich M, Mouly SJ, et al. 2004/2005) 76,77.

Las diferencias en los valores de expresión de los CYP3A parecen más relevantes en el metabolismo de los fármacos que los polimorfismos genéticos (Eap CB, et al. 2004) 78.

Un estudio reciente de Lamba et al 26 ha demostrado una relación entre el

polimorfismo 2677G T de MDR1 con los valores de expresión de CYP3A4 en hígado e intestino.

Para el CYP2C19 hay 21 alelos descritos. Un solo estudio describe una

asociación entre el 681G A (CYP2 C19*2) y valores plasmáticos de nelfinavir.



42

Individuos heterocigoto su homocigotos para el alelo raro presentaban valores más altos de este IP en comparación con los individuos homocigotos para el alelo común. El mismo estudio también demostró una tendencia hacia una disminución de fallo virológico en individuos heterocigotos 5.

El CYP2D6 es el más polimórfico de todas las isoenzimas CYP con 59 alelos descritos. Un solo estudio ha analizado el efecto de 3 alelos no funcionales (CYP2D6*3, 2D6*4 y 2D6*6) en la farmacocinética de nelfinavir y efavirenz.

Individuos homocigotos o heterocigotos para estos polimorfismos presentaban

concentraciones plasmáticas más altas de ambos fármacos10. Estos resultados deben interpretarse con cautela, ya que esta isoenzima no es la más importante para el metabolismo de estos fármacos. CYP2B6 es una isoenzima que ha ganado importancia en los últimos años al demostrarse su participación en el metabolismo de importantes fármacos como el efavirenz.

Ha demostrado ser polimórfico (28 alelos descritos) especialmente en población de raza negra (Klein K, et al. 2005) 80 . Diferentes estudios han demostrado una asociación significativa entre el 516G T en el exón 4 (marcador del alelo CYP2B6*6) y valores plasmáticos elevados de ITINAN (efavirenz y nevirapina) (Haas DW, Tsuchiya K, Rodríguez-Novoa S, Rotger M., et al. 2004, 2005) 57, 60, 64, 75. El 983T C en el exón 7 (marcador del alelo CYP2B6*16 y *18) también se ha asociado con valores plasmáticos elevados de efavirenz 30. Las concentraciones de efavirenz extremadamente elevadas las encontramos en individuos con 2 copias de alelos no funcionales, generalmente una copia de CYP2B6*6 con otra copia de *6, *11 o *18, o nuevos alelos como *27 y *2831.

3.10.1.-REGULADORES DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS Y DE LAS ENZIMAS METABÓLICAS

La gran variabilidad interindividual en la expresión y función de las proteínas

transportadoras y las enzimas metabólicas no puede explicarse completamente por interacciones farmacológicas o polimorfismos genéticos. Todo esto indica que los reguladores de su trascripción contribuyen a estas diferencias. El receptor de pregnano X (PXR) y el receptor de androstano constitutivo (CAR) son miembros de la superfamilia de receptores nucleares que, cuando son activados por ligandos, regulan la trascripción de diferentes genes, entre ellos varias enzimas CYP y ABCB1(Chang TK, Synold TW, 2001, 2003)32-34. Los polimorfismos genéticos en PXR y CAR han sido descritos con una frecuencia alélica, muy baja en la población general (3%), excepto el 79C T (PXR*2), que es frecuente en población de raza negra (15-22%) (Bosch TM, Zhang J, et al.



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2005, 2006) 88,93 . Su efecto en la disposición de los fármacos antirretrovirales está todavía por determinar 3.10.2.-VARIACIONES GENÉTICAS EN LA 1-GLUCOPROTEÍNA ÁCIDA

La 1-glucoproteína ácida, también llamada orosomucoide, es una proteína de fase aguda que se une principalmente a los IP. Esta unión puede incidir en el efecto farmacológico ya que disminuye la fracción libre de fármaco.

Existen 2 proteínas ORM1 y ORM2. La ORM1 es polimórfica, con 3 alelos

ORM1*F1, ORM1*F2, ORM1*S descritos; ORM1*F1 y *S son bastante frecuentes mientras que *F2 es un alelo raro41,42. Colombo et al43 han evaluado la influencia de la concentración plasmática de estas proteínas y sus polimorfismos genéticos en la farmacocinética de indinavir, lopinavir y nelfinavir, y pudieron determinar que afectaban el aclaramiento aparente de indinavir y en menor medida el de lopinavir. El aclaramiento aparente de indinavir era significativamente más alto en individuos *F1*F1 que*F1*S y *S*S.

5.8.-SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A LOS EFECTOS ADVERSOS DEL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Las complicaciones del tratamiento antirretroviral en las que se ha encontrado

predisposición genética incluyen reacciones de hipersensibilidad, dislipidemias, lipodistrofia, neurotoxicidad central, hiperbilirrubinemia y pancreatitis (tabla 1). Determinados alelos del complejo mayor de histocompatibilidad están asociados con un riesgo de hipersensibilidad al abacavir y nevirapina 44-46. Tres estudios han identificado varios polimorfismos genéticos en APOE y APOC3 como marcadores de riesgo para dislipidemias (Martin AM, Tarr PE, et al. 1999, 2005)

99, 102.

Un estudio reciente de Arnedo et al. 2005 103 ha relacionado 5 genes (APOE/APOC3/APOA5/CETP/ABCA1) de un total de 12 estudiados con el riesgo de dislipidemia, y se demuestra que la predisposición genética a presentar este afecto adverso se debe al efecto combinado de varios genes.

La lipodistrofia como efecto adverso se ha asociado a un polimorfismo en el promotor de TNFa (-238G A) (Maher B., Nolan D., et al.2002, 2003) 104,105.



44

La aparición de neurotoxicidad se ha asociado principalmente al tratamiento con efavirenz, el alelo CYP2B6*6 ha demostrado ser un buen marcador tanto en la fase temprana del tratamiento Haas DW, et al. 2004 57 como en la crónica Rotger M, et al, 2005 106. La hiperbilirrubinemia es un efecto adverso asociado al tratamiento con atazanavir y en menor medida a indinavir. Un polimorfismo en el promotor del gen que codifica para UGT1A1 (alelo UGT1A1*28) causante del síndrome de Gilbert y 2 polimorfismos en SLCO1B1 (alelos SLCO1B1*1b y *5), gen que codifica para el transportador de bilirrubina OATP1B1, se han relacionado con la hiperbilirrubinemia asociada al tratamiento con atazanavir en individuos de raza blanca (Rotger M., 2005) 107. Otro polimorfismo en UGT1A1 (alelo UGT1A1*6) se ha relacionado con la hiperbilirrubinemia asociada al tratamiento con indinavir en pacientes asiáticos (Boyd MA, et al. 2006) 108.

La aparición de pancreatitis se ha asociado principalmente al tratamiento con

didanosina; un estudio ha demostrado la influencia de polimorfismos en CFTR y SPINK-1 (genes que codifican para la proteína reguladora de conducción



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transmembránica de la fibrosis quística y la proteína inhibidora de la tripsina secretora pancreática, respectivamente) y el riesgo de pancreatitis en pacientes infectados por el VIH .

3.11.-INFLUENCIA DE FACTORES GENÉTICOS EN LA RESPUESTA VIROLÓGICA E INMUNOLÓGICA

Aparte de afectar a los valores plasmáticos del fármaco, algunos polimorfismos pueden influir en la respuesta virológica e inmunológica al tratamiento antirretroviral. La presencia del polimorfismo CCR5 (Chang TK, et al 2003) 85, en el correceptor utilizado por el VIH para entrar en la célula, se ha asociado con una mejor respuesta virológica e inmunológica al tratamiento. Sin embargo, otros estudios no han encontrado ningún efecto . Diferencias en el diseño del estudio, el tamaño y la homogeneidad de la muestra y la eficacia del tratamiento dificultan la comparación de resultados entre estudios diferentes.

Tres estudios indican cierta repercusión del polimorfismo 3435C T en el gen ABCB1 en la respuesta virológica tanto en pacientes sin tratamiento previo 64. En cuanto a su relación con la respuesta inmunológica son menos consistentes probablemente debido al mayor número de variables que intervienen en su control. Únicamente el estudio de Fellay et al10 demuestra que individuos con el alelo 3435T presentan un aumento significativo de los linfocitos CD4 a los 6 meses de iniciar tratamiento. Otros estudios, en cambio, no demuestran ningún efecto de este polimorfismo, tanto en la respuesta virológica como en la inmunológica.

En el año 2005 la Food and Drug Administration estadounidense aprobó la

utilización de un test para detectar el alelo UGT1A1*28 en pacientes con cáncer de colon candidatos a recibir tratamiento con irinotecán. La aplicación de tests concretos en el tratamiento de la infección por el VIH puede también ser una realidad.

3.12.-PARTICIPACIÓN DE PACIENTES DE ENSAYOS CLÍNICOS EN ESTUDIOS DE FARMACOGENÉTICA

La farmacogenética (FG) estudia la relevancia de las variaciones genéticas de las personas en la respuesta a los fármacos.

En última instancia la FG pretende facilitar la selección de la medicación, y la dosis, para cada paciente. Es por ello que, dentro de la actividad de la investigación clínica y, más concretamente, en el desarrollo de nuevos fármacos,



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la FG ha pasado a ser, en los últimos años y en gran medida, una compañera habitual de los ensayos clínicos (EC). La obtención –y estudio– de muestras para FG (mFG) de los pacientes participantes en un determinado ensayo clínico permite, a la luz de los resultados obtenidos, llegar a discriminar si la presencia o no de un determinado polimorfismo genético (SNP) puede explicar las diferencias interindividuales en la respuesta al fármaco en investigación (Roses A., Giacomini KM., et al. 2004, 2007) 111, 113.

Su relevancia es tal, que se ha postulado que en el desarrollo de todo nuevo fármaco se deben tomar mFG 4. Como la FG plantea cuestiones no sólo medico científicas, sino también legales, sociales y éticas particulares, más allá de las que plantean los EC, han sido diversas las instituciones y grupos que han publicado guías y normas que otorgan un marco de referencia a los promotores, investigadores y evaluadores de este tipo de estudios (Nuffield Council on Bioethics, Rodríguez-Villanueva J, 2003) 115,118. Los estudios de FG son objeto de evaluación y aprobación por parte de los comités evaluadores (en España, los comités éticos de investigación clínica) que revisan los EC.

La gran mayoría de los estudios de FG se conciben y realizan como subestudios de EC. La cantidad de mFG dependerá del número de pacientes que consientan participar en el subestudio de FG. Por este motivo la intención de cualquier promotor de un subestudio de FG es obtener el mayor número de mFG. De hecho, si se consigue un porcentaje de mFG inferior a cierto umbral, variable para cada EC, el estudio de FG puede resultar por completo inútil. Por esto es de interés conocer qué factores pudieran explicar las diferencias en la obtención de mFG entre diferentes países.

Ello permitiría, en ausencia de otras características específicas de cada estudio, orientar el empleo de recursos hacia los países de más alta tasa de obtención de mFG. Asimismo, debido a que la inversión en ensayos clínicos de medicamentos en desarrollo se acompaña, con frecuencia, de subestudios de FG, es interesante saber cómo se sitúa España con respecto a otros países europeos en cuanto al porcentaje de pacientes que otorgan su mFG.

3.12.1.-MATERIAL Y MÉTODO

Para este estudio se revisó, en septiembre de 2007, la base de datos de nuestra compañía que incluye todos los EC que, realizándose en uno o más países de Europa, requieren un subestudio de FG. Esta base de datos contiene el número de pacientes incluidos en cada EC, centro y país, y el número de esos pacientes de los que se ha obtenido la mFG. Esta muestra puede obtenerse en cualquier momento de la participación del paciente en el ensayo. La base de datos contiene información de los EC en marcha (con al menos un paciente



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incluido) y de los que han finalizado hasta transcurridos 3 meses de la fecha de su conclusión.

En septiembre de 2007 la base de datos contenía información de 78 EC realizados en 30 países europeos. El número de pacientes incluidos superaba los 13.000, de los que del 74% ya se había obtenido una mFG.

Con objeto de evitar sesgos derivados de usar datos de países con una muestra reducida de pacientes, se decidió efectuar el análisis de los países que cumplían los siguientes criterios: a) estar realizando al menos 15 EC y en al menos 4 áreas terapéuticas (de este modo se asegura una muestra con una variedad mínima de especialidades médicas involucradas), y b) realizar los EC en al menos 40 centros o con un mínimo de 300 pacientes incluidos en los EC

en el momento de realizar el estudio (de este modo se asegura un número

mínimo razonable de investigadores diferentes y de casos en cada país).

Para estudiar la posible influencia sobre el porcentaje de pacientes que otorgaban su mFG, se analizaron los siguientes factores: a) los propios de los EC del presente estudio: número total de sujetos participantes en EC de cualquier área terapéutica y porcentaje de centros participantes en ensayos de oncología; b) culturales: religiosidad, religión predominante (católica, ortodoxa y protestante), y origen lingüístico de la lengua mayoritaria de cada país (origen eslavo, germánico y románico); c) sociales: años de esperanza de vida, porcentaje de población urbana y producto interior bruto en términos de paridad de poder adquisitivo, y d) políticos: países que hubieran pertenecido o no a la esfera de influencia de la URSS.

Se calcularon los estadísticos descriptivos univariantes. Para las pruebas de significación se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis, y el coeficiente de correlación rho de Spearman y su significación para el contraste de asociación de variables cuantitativas. Para el análisis de datos se utilizó el programa G-Stat 2.0.

Los ensayos incluidos en la base de datos correspondían a las 11 áreas terapéuticas en las que nuestra compañía desarrolla nuevos medicamentos. La distribución por fases de desarrollo clínico era: uno de fase 1; 50 de fase 2; 26 de fase 3, y uno de fase 4.

Cumplieron los requisitos antes mencionados 15 de los 30 países: Alemania,

Bélgica, Bulgaria, Chequia, Dinamarca, Eslovaquia, España, Francia, los Países Bajos, Hungría, Italia, Polonia, el Reino Unido, Rusia y Suecia. Estos 15 países habían reclutado a 11.057 pacientes, de los que de 8.149 se disponía de la mFG (un 74%, el mismo porcentaje que de todos los países de Europa).



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En la tabla 1 se muestran de forma anónima, exceto para el caso de España, los datos de estos 15 países. Como la oncología es una especialidad donde la investigación relacionada con la FG tiene más que en otras áreas terapéuticas, en la tabla 1 también se señala el porcentaje de centros que cada país tenía participando en EC de esta especialidad. En el anexo 1 se muestran los datos culturales y sociales de los 15 países incluidos en el análisis de este estudio.

Entre los factores culturales considerados, las diferencias entre los países agrupados según la religión mayoritaria10 no han resultado significativas (p = 0,899). No ha ocurrido lo mismo con el porcentaje de religiosidad10, que se ha asociado significativamente (rho = –0,54; p = 0,034) con el porcentaje de pacientes que otorgan la mFG. Sin embargo, este factor se ve críticamente afectado por el peso que tiene un país (Chequia), de forma que, si se excluye del análisis, el porcentaje de religiosidad ya no se asocia de forma significativa a la obtención de la mFG para los otros 14 países. Y, en fin, se observó que el origen de la lengua mayoritaria en cada país11 no influye de manera significativa (p = 0,878).

En la tabla 2 se presentan los coeficientes de Spearman y los valores de p para el resto de las variables cuantitativas analizadas: los 3 factores sociales considerados 12, el número total de pacientes incluidos en EC y el porcentaje de centros dedicados a realizar EC de oncología. Ninguna de ellas se asocia significativamente a los resultados obtenidos. Por último, el hecho de que el país haya pertenecido o no al área de influencia de la antigua Unión Soviética tampoco ha resultado significativo (p = 0,637). TABLA 1 Relación de países en orden descendente en cuanto al porcentaje de pacientes incluidos en ensayos clínicos (EC) con muestra para farmacogenética (mFG). Porcentaje de centros participantes en ensayos de oncología en cada país



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Fuente Roses A. Pharmacogenetics and drug development: the path to safer and more effective drugs. Nature Rev Genetics. 2004,5: 645-56

TABLA 2

Coeficientes rho de Spearman y su significación en relación con el porcentaje de pacientes con muestra para el estudio de farmacogenética

Fuente: participar en el estudio de FG.

3.12.2.-RESULTADOS DEL ESTUDIO Los resultados de este estudio muestran que España es un país en el que se

obtiene un porcentaje de mFG muy similar a la media europea. Entre los factores estudiados no se ha identificado ninguno que influya significativamente en los resultados obtenidos.



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Fuente:

3.13.-FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA

La farmacogenética estudia la relación entre el polimorfismo genético y la respuesta individual a los fármacos. En los últimos años se ha producido un gran avance en el conocimiento de los polimorfismos genéticos que afectan tanto a las enzimas involucradas en la activación y/o destoxificación de los agentes quimioterápicos como a determinadas dianas moleculares implicadas en el tratamiento del cáncer.

El objetivo de la farmacogenética es predecir la eficacia y la toxicidad de los

fármacos en función del perfil genético de cada paciente, lo que permitirá seleccionar el medicamento más apropiado y las dosis óptimas para cada tipo de cáncer y cada paciente concreto. Hace aproximadamente 2 años la Food and Drug Administration aprobó un test genético para la identificación de los pacientes susceptibles de presentar una elevada toxicidad por irinotecán, en quienes deberá reducirse la dosis inicial del fármaco. También se han comercializado chips genéticos para la genotipificación simultánea de 2 enzimas del citocromo P450. La farmacogenética permitirá identificar y definir poblaciones específicas de pacientes en quienes el beneficio terapéutico puede ser máximo, lo que supondrá un tratamiento más efectivo e individualizado.

En esta revisión se describen los principales polimorfismos genéticos

conocidos que pueden influir en la quimioterapia del cáncer.

La farmacogenética surgió en la década de 1950 para explicar la contribución de la herencia genética a la diferente respuesta a los medicamentos. Tras las evidencias iniciales, obtenidas en los años sesenta, de que la respuesta podría estar condicionada por variaciones determinadas genéticamente en la actividad de ciertas enzimas, en la década de 1980 se demostró la importancia del



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polimorfismo genético en el perfil farmacocinético y se empezó a dilucidar la base molecular de dichos polimorfismos, lográndose la clonación y caracterización de algunos genes polimórficos. En los años noventa comenzaron a utilizarse los métodos farmacogenéticos en clínica, aunque fundamentalmente con fines investigadores. En la actualidad numerosos ensayos clínicos han incorporado métodos farmacogenéticos con el fin de seleccionar a los pacientes que mejor pueden beneficiarse de los tratamientos farmacológicos.

La farmacogenética trata de estudiar las causas genéticas subyacentes a la diversidad de respuestas que se observan para una misma dosis de un determinado medicamento. Por ello puede entenderse como el análisis y uso de la información genética, individual o poblacional, para predecir la seguridad, toxicidad o eficacia de los medicamentos, en el contexto de la investigación y desarrollo de éstos o en la práctica clínica con el fin de mejorar su efectividad.

Se describen a continuación los principales polimorfismos genéticos conocidos que afectan tanto a las enzimas involucradas en la activación y/o destoxificación de los agentes quimioterápicos como a determinadas dianas moleculares.

Con este propósito se realizó una búsqueda en la base de datos MEDLINE

(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/) hasta octubre de 2007 utilizando los siguientes términos: «pharmacogenetics» (MeSH) y «neoplasms» (MeSH), junto con el operador booleano AND. Se localizaron 589 artículos, de los que se seleccionaron sólo las revisiones publicadas en inglés en los últimos 5 años, de modo que finalmente se obtuvieron 227 artículos publicados en revistas con un índice de impacto superior a 1.

3.13.1.-ANTECEDENTES

Las variaciones interindividuales en la respuesta a los fármacos pueden deberse, entre otros factores, a los efectos de la edad o el sexo, a alteraciones de la función hepática y/o renal, o a interacciones medicamentosas. Sin embargo, en la actualidad está claramente establecido que muchas de estas variaciones están determinadas genéticamente.

Las primeras evidencias de la respuesta genéticamente determinada a los fármacos fueron la hemólisis observada durante el tratamiento con antimaláricos (primaquina, sulfonamidas), que se debía a un defecto enzimático en la glucosa- 6 fosfato deshidrogenasa Ayuso JL, et al. 1994 139; la prolongada relajación muscular tras el tratamiento con suxametonio en individuos con una forma inactiva de la colinesterasa Newman R, 1990 140, y el riesgo incrementado de neurotoxicidad en personas con fenotipo de acetilación lenta durante el



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tratamiento con isoniazida Broers B, et al. 1994 141. Posteriormente, en la década de 1980 se descubrió que las bases moleculares del fenotipo de metabolización lenta de la debrisoquina en el hígado de aproximadamente el 8% de la población blanca estaban asociadas a una deficiencia enzimática del citocromo P450, concretamente en el CYP2D6, enzima responsable del metabolismo de la mayoría de los fármacos (Relling MV, et al. 2007) 114.

3.13.2.-TIPOS DE ALTERACIONES GENÉTICAS

El polimorfismo genético hace referencia a la diversidad de un determinado nucleótido que se encuentra a una frecuencia superior del 1% de la población general, pudiendo dar lugar a una reducción o a un incremento en la actividad génica Drugdex Drug Evaluations 5. A diferencia de las mutaciones somáticas, estas variaciones son estables y hereditarias. Pueden darse en los intrones (secuencias de ADN que no codifican información), en los exones (secuencias que codifican información) y en las regiones promotoras (regulan el proceso de transcripción).

Las variaciones genéticas individuales más frecuentes son los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, del inglés single nucleotide polimorphism), aunque también pueden producirse deleciones/inserciones, conversiones génicas, deleciones enteras, microsatélites (secuencias repetidas en tándem que son copias múltiples de secuencias de ADN repetidas de 20-70 pb) y minisatélites (repeticiones en tándem de secuencias de 2-5 nucleótidos). Actualmente la ciencia se ha planteado el reto de determinar cuáles de estos polimorfismos tienen relevancia terapéutica.

Los SNP son diferencias de una sola base que aparecen en determinadas secuencias del ADN entre individuos de una población, y que en algunos casos provocan un cambio en un aminoácido de la proteína codificada. Suponen más del 90% de las variaciones genéticas del genoma humano. El número de SNP se ha estimado del orden de uno a 10 millones (Wolff K, AHFS, et al 1997) 144,145, de los que entre 50.000 y 250.000 están distribuidos dentro y alrededor de los genes codificantes (Reynolds JEF, et al 1999) 146. Actualmente se sabe que en el genoma humano cada gen puede presentar un SNP en uno de cada 1.000-3.000 pares de bases (Inaba T., et l 1995) 147. Algunos SNP no confieren alteraciones fenotípicas, pero son marcadores de ciertos haplotipos, por lo que son también marcadores genéticos 143.

El análisis de SNP es la forma más simple de determinar la existencia de polimorfismos del ADN. Utilizando los actuales biochips es posible analizar de forma rápida y automática la existencia de desequilibrios para SNP en muestras obtenidas de pacientes.



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Hace unos años se creó el consorcio SNP (constituido por compañías farmacéuticas y bioinformáticas con centros académicos), cuyo objetivo consiste en descubrir el mapa de los SNP existentes en el genoma humano. Puede accederse a este mapa en http://snp.cshl.org.

3.14.-FARMACOGENÉTICA DE LAS ENZIMAS METABOLIZADORAS DE

AGENTES QUIMIOTERÁPICOS

La farmacogenética permite asociar los polimorfismos genéticos con la capacidad de respuesta de un paciente a un determinado medicamento. Los agentes quimioterápicos en general presentan un estrecho margen terapéutico, por lo que la variabilidad interindividual en su metabolismo determina tanto su eficacia como su seguridad. Se describen a continuación los polimorfismos genéticos de las principales enzimas implicadas en el metabolismo de agentes quimioterápicos y sus efectos sobre la respuesta (tabla 1).

A.-UDP-GLUCURONOSILTRANSFERASA (UGT)

La UGT está implicada en el metabolismo del irinotecán. Éste se utiliza principalmente en el tratamiento del cáncer colorrectal, de pulmón y de otros tumores sólidos. Es un profármaco que se activa por la carboxilesterasa a su metabolito activo, el SN-38, el cual ejerce su actividad antitumoral mediante la inhibición de la topoisomerasa I10. Un miembro de la familia UGT, el UGT1A1, cataliza la destoxificación de SN-38 en un compuesto más polar e inactivo, el SN-38 glucurónido11 (fig. 1). La toxicidad limitante de la dosis consiste en diarrea intensa y leucopenia. Los estudios al respecto han puesto de manifiesto que dicha toxicidad está relacionada con los valores elevados de SN-3812.

http://snp.cshl.org/



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Fuente: MORÁN GONZÁLEZ D ET AL. FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA

Fig. 1. Polimorfismos UGT1A1 que pueden afectar a la toxicidad durante el tratamiento con irinotecán. Fuente: MORÁN GONZÁLEZ D ET AL. FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA

La farmacogenética del tratamiento con irinotecán se ha centrado en el

polimorfismo de la glucuronidación de SN-38 por UGT1A1, cuya expresión ha demostrado ser sumamente variable, con una variabilidad interindividual en la tasa de glucuronidación de SN-38 de más de 50 veces 13. La región promotora del gen de la UGT1A1 contiene secuencias TA repetidas. La presencia de UGT1A1*28 (7 secuencias TA repetidas) se asocia a una reducción de la expresión y de la actividad de la proteína, comparado con UGT1A1*1 (6 secuencias TA repetidas) (fig. 1). Se ha demostrado que los pacientes homocigotos para el alelo UGT1A1*28 presentan un aclaramiento de irinotecán mucho más lento que el resto de la población, por lo que tienden a presentar una toxicidad más grave tras el tratamiento con dicho fármaco14

.

En agosto de 2005 la Food and Drug Administration aprobó un test genético (Invader® UGT1A1 Molecular Assay, Third Wave Technologies Inc., Madison, WI, EE.UU.) para la identificación de los pacientes homocigotos en UGT1A1*28, en quienes dicha agencia recomienda reducir la dosis inicial de irinotecán 15. La frecuencia del alelo UGT1A1*28 es mayor en caucásicos (35%) y africanos (43%) que en asiáticos (10,1-16,8%) 16.



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B.-TIOPURINA S-METILTRANSFERASA (TPMT)

La TPMT cataliza la S-metilación de azatioprina, mercaptopurina y tioguanina. Todos estos agentes son profármacos que ejercen el efecto citotóxico a través de su metabolización en nucleótidos de tioguanina, los cuales se incorporan al ADN como análogos nucleotídicos (fig. 2). La actividad TPMT en los eritrocitos presenta grandes variaciones interindividuales; aproximadamente el 90% de los individuos Fig. 2. Vía metabólica de la mercaptopurina. TPMT: tiopurina S-metiltransferasa.

Fuente: MORÁN GONZÁLEZ D ET AL. FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA

muestra una actividad enzimática alta, el 10% intermedia y el 0,3% baja o indetectable 17,18. En los pacientes con baja actividad TPMT, los nucleótidos de tioguanina se acumulan en los eritrocitos, lo que puede provocar mielodepresión 19.

Por el contrario, los pacientes con elevada actividad TPMT son incapaces de formar cantidades suficientes de metabolitos activos tras el tratamiento con mercaptopurina.

Se han identificado 13 variantes alélicas del gen TPMT, 3 de las cuales (TPMT*2, TPMT*3A y TPMT*3C) son responsables del 95% de los casos de actividad enzimática intermedia o baja 20. El alelo mutante TPMT*2 es una



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transversión de guanina por citosina en la posición 238 (G238C), lo que da lugar a la sustitución del anillo rígido de prolina por un residuo más flexible de alanina (Ala80Pro); como consecuencia, se modifica la estructura terciaria de la proteína para dar lugar a una proteína inestable con menor actividad catalítica 21. La variante TPMT*3A contiene 2 polimorfismos de transición, uno en el exón 7 (G460A) y otro en el exón 10 (A719G), lo que provoca 2 sustituciones de aminoácidos, una en el codón 154 (Ala154Thr) y otra en el codón 240 (Tyr240Cys) 22. El alelo TPMT*3C sólo contiene una transición en el exón 10 (A719G)23. Estas últimas 2 variantes alélicas también están asociadas a una menor actividad enzimática debido a una mayor tasa de proteólisis en las proteínas mutantes 24.

La presencia de estos alelos es predictiva de fenotipo. Así, los pacientes heterocigotos presentan actividad TPMT intermedia, y los homocigotos, actividad deficiente 25. Numerosos estudios han puesto de manifiesto que los pacientes con deficiente actividad TPMT presentan un riesgo alto de desarrollar toxicidad hematopoyética grave incluso tras dosis estándar de mercaptopurina 26,27. Varios estudios han demostrado que los pacientes heterocigotos en el locus del gen TPMT tienen un riesgo intermedio de toxicidad limitante de la dosis 26,28. Por otra parte, la deficiencia de la actividad TPMT también se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar tumores secundarios entre los pacientes con leucemia linfoblástica aguda, tales como leucemia mieloide aguda inducida por inhibidores de la topoisomerasa 29 y tumores cerebrales inducidos por radiación 30

.

La frecuencia de estas variantes alélicas presentan diferencias étnicas significativas (tabla 2) 20.

C.-5,10-METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA (MTHFR)

La MTHFR participa en la regulación del folato intracelular, compuesto esencial para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la transformación de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5-tetrahidrofolato, un donante de grupos metilo necesario para la conversión de homocisteína en metionina31 (fig. 3). La deficiencia en su actividad está relacionada con enfermedades neurológicas y vasculares.

Se ha detectado un polimorfismo genético bastante frecuente que consiste en una transición de citosina a timina en el nucleótido 677 (C677T), que implica la sustitución de alanina por valina. Esta variante está asociada a una baja actividad enzimática y a valores de folato alterados 32-34. La detección de este polimorfismo puede ser útil para identificar a los pacientes con riesgo alto de presentar toxicidad durante el tratamiento con metotrexato. En este sentido, se ha observado que los pacientes homocigotos para el alelo mutante TT o los heterocigotos CT (aproximadamente el 10 y el 40% de la población, respectivamente) presentan un mayor riesgo de efectos adversos tras el tratamiento con metotrexato que los pacientes con genotipo salvaje CC35-38.



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Además, en otro estudio se observó que, durante el tratamiento adyuvante del cáncer de mama con ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo (5-FU), 5 de los 6 pacientes que presentaron toxicidad grave eran homocigotos para el alelo mutante 39.

Por otra parte, en pacientes con leucemia mieloide crónica tratados con metotrexato el genotipo TT se ha asociado con un mayor riesgo de mucositis que los genotipos CT y CC 33. Resultados similares se observaron en pacientes con leucemia aguda y cáncer de ovario 40,41. Además, en varios tipos de cáncer sólido el genotipo mutante TT también predijo toxicidad frente al raltitrexed42. Finalmente, pacientes con cáncer de mama y portadoras de alguna variante polimórfica en la MTHFR que recibieron tratamiento de combinación con metotrexato y 5-FU desarrollaron toxicidad intensa de la médula ósea 39.

Por otra parte, se ha observado que el genotipo MTHFR también influye en la respuesta del cáncer de mama y del colorrectal a la quimioterapia con 5-FU. Así, los pacientes con genotipo mutante TT respondieron mejor que los heterocigotos o con genotipo salvaje 43,44. Esto mismo se observó en pacientes con leucemia linfoblástica aguda tratados con metotrexato

FUENTE: MORÁN GONZÁLEZ D ET AL. FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA



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Fig. 3. Vías metabólicas relacionadas con la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). DHFR: dihidrofolato reductasa;

dTMP: d-timidina monofosfato; dUMP: desoxiuridina monofosfato. Fuente: MORÁN GONZÁLEZ D ET AL. FARMACOGENÉTICA EN ONCOLOGÍA

3.15.-Farmacogenética del tratamiento antirretroviral 2008: ¿hacia un tratamiento personalizado?

La amplitud de la recuperación inmunológica en los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana que reciben el mismo tratamiento antirretroviral y consiguen una supresión virológica sostenida es muy variable.

De manera similar, no todas las personas que reciben fármacos

antirretrovirales presentan efectos adversos. Existe pues una notable variabilidad interindividual en la respuesta y la toxicidad debidas al tratamiento antirretroviral. Los avances recientes en farmacogenética y farmacogenómica han permitido identificar algunos determinantes genéticos de la persona que modulan la respuesta y la toxicidad de estos fármacos, hecho que contribuye a pensar que en un futuro próximo el diseño personalizado de un tratamiento antirretroviral, de

acuerdo con la constitución genética de la persona, sea posible.

El impacto del tratamiento antirretroviral combinado en la mejora de la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es de tal magnitud que se ha llegado a proponer que los «milagros médicos» existen (Gazzard B, et al 2005) 128. Este hecho se debe al potente efecto supresor sobre la masa viral que poseen los regímenes antirretrovirales actuales y que se observa en un número significativo de pacientes que lo toman adecuadamente. En consecuencia, se produce una



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mejora cualitativa y cuantitativa sustancial del sistema inmunitario, que se traduce en un incremento de la cifra absoluta de linfocitos T CD4+ y en una recuperación de funciones perdidas. Esta mejora es a menudo de tal magnitud que permite la supresión de la profilaxis de infecciones oportunistas (Furrer H., López Bernaldo de Quirós JC, et al. 2000) 129,130.

Hemos aprendido, no obstante, que los pacientes que toman tratamiento

antirretroviral combinado de forma adecuada y que negativizan la carga viral plasmática presentan un grado de recuperación inmunitaria muy variable. En otras palabras, una buena respuesta virológica no implica necesariamente una buena recuperación inmunológica.

A esta situación se la conoce como «respuesta discordante » y sus causas no son del todo conocidas. Entre ellas se han propuesto factores virales, comorbilidad (p.ej., coinfección por el virus de la hepatitis C), tipo de régimen antirretroviral utilizado o factores genéticos de la propia persona infectada. Actualmente, además, no existe cura para la infección por el VIH; por lo tanto, el tratamiento debe mantenerse de por vida. El uso de fármacos antirretrovirales se ha asociado a diversas toxicidades que limitan su eficacia. 3.16.-REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD

Entre las toxicidades agudas y crónicas destacan, entre otras, reacciones de hipersensibilidad 4, nefropatía (Berns JS, et al 2006)132, lesión hepática (Núñez M., et al. 2006)133 y también la aparición de síndrome de redistribución grasa y de distintas alteraciones metabólicas que lo acompañan (Mallon PW., Oh J., et al. 2007) 134,135. Un hecho intrigante es que no todos aquellos pacientes que toman un fármaco antirretroviral particular presentan el efecto adverso que se ha atribuido al mismo, por lo que se postula que debe existir una predisposición individual, condicionada genéticamente, a desarrollar el efecto adverso (Cressey TR., Tarr PE., et al. 1999, 2007) 136,137.

3.17.-Interacciones farmacocinéticas entre metadona y antirretrovirales en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana

Según los datos del V Congreso Nacional sobre Sida, en España el 70% de los infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son adictos a drogas por vía parenteral (ADVP), y muchos de ellos están en tratamiento concomitante con antirretrovirales y otros fármacos (antibióticos, psicofármacos, etc.) debido a infecciones oportunistas o a problemas psicológicos derivados (Ayuso JL., et al. 1994) 139.



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Las posibles interacciones relacionadas con estas asociaciones pueden ser importantes, encontrándose unas más documentadas que otras en la bibliografía. Un grupo importante de estos pacientes son los que están en tratamiento de deshabituación con metadona, y es en este grupo donde las interacciones son menos conocidas (Newman R., et al. 1990)140.

El arsenal terapéutico del tratamiento del VIH es cada vez más amplio, y por tanto las posibles interacciones entre antirretrovirales y metadona pueden ser más frecuentes de lo esperado, constituyendo uno de los motivos de falta de adherencia al tratamiento antirretroviral o de abandono del programa de deshabituación. Dos estudios independientes entre sí observaron el mayor retraso en la aceptación del tratamiento con zidovudina en la cohorte de pacientes ADVP (Broers B, Ferrando SJ, et al. 1994, 1996) 141,142. La evolución del tratamiento antirretroviral ha pasado de la monoterapia a la monoterapia secuencial y de ésta a la terapia combinada actual. Los problemas derivados de esta combinación están siendo estudiados y documentados en la bibliografía según se van modificando las pautas o van apareciendo nuevos antirretrovirales.

Debido a los constantes problemas que comportan los efectos adversos de los antirretrovirales, se plantea realizar una revisión bibliográfica de las potenciales interacciones farmacocinéticas con el objetivo de alertar de las posibles consecuencias a los profesionales sanitarios, informar adecuadamente a los pacientes y poder establecer unas recomendaciones de modificación posológica en caso de interacción.

Se han obtenido casos comunicados de interacciones con algunos antirretrovirales, pero no hay ningún estudio bastante amplio que recopile las posibles interacciones de todos ellos con la metadona.

En los pacientes que siguen un tratamiento de deshabituación con metadona, serían necesarios estudios que valorasen íntegramente las interacciones metadona-antirretrovirales, sirviendo de guía para poder diferenciar en la práctica clínica lo que es un efecto adverso o una interacción y realizar las modificaciones oportunas. Hemos considerado toda la información relacionada con la interacción, así como las características farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos revisados.

3.17.1.-METADONA

La metadona es un agonista opiáceo indicado en el tratamiento del dolor intenso y en los programas de deshabituación a opiáceos. Las características farmacocinéticas se encuentran resumidas en la tabla 1.



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La posología habitual en la deshabituación es cada 24 h, aunque en la

desintoxicación pueden haber intervalos de 6-8 h, debiendo tenerse siempre en cuenta que la administración de metadona en intervalos menores de 24 h puede producir acumulación y toxicidad. Las dosis habituales en los programas de deshabituación a opiáceos dependen en gran medida del paciente, pudiéndose llegar a dosis elevadas en cortos espacios de tiempo. Presenta una absorción rápida, y es a las 4 h de la toma cuando se alcanza la concentración plasmática máxima (Cmáx). Concentraciones plasmáticas de 0,1 g/ml son adecuadas para la terapia de mantenimiento, pudiendo ser letales valores de 0,8 g/ml (0,02-0,45 mg/dl) (Drugdex Drug Evaluations)143. Estas cifras son orientativas, ya que la concentración plasmática alcanzada depende de la variabilidad individual.

La metadona sufre metabolización hepática mediante procesos de N-desmetilación, formándose dos metabolitos conocidos, sólo uno de los cuales es activo, el denominado EDDP (2-etilidina-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina) Reynolds JEF, et al. 1999 146. La enzima implicada en este proceso es el citocromo P450, grupo de enzimas (hemoproteínas) localizadas en la membrana del retículo endoplásmico celular, principalmente en el hígado e intestino delgado. La subfamilia CYP3A es la más abundante, representando el 30% del total en el hígado y el 70% del total en la pared intestinal. La CYP3A4, la más importante desde el punto de vista clínico, representa el 60% del total en hígado 9. Es esta isoenzima CYP3A4 la que realiza los procesos de biotransformación de la metadona Rostami-Hodjegan A, Moody DE, et al. 1997-1999) 148-150, con posible implicación también de las isoenzimas CYP2C8, 2C18, 2D65.

El denominado síndrome de abstinencia puede aparecer si la concentración plasmática de la metadona disminuye lo suficiente debido a una elevada metabolización, y en consecuencia los receptores opioides no están totalmente ocupados.

Este síndrome presenta un cuadro clínico caracterizado por insomnio, dolor generalizado, ausencia de apetito, sudación, vómitos, diarrea, dilatación pupilar, ansiedad, angustia e irritabilidad, siendo estos tres últimos los que disminuyen en intensidad a los tres o 4 días. Es importante para el clínico reconocer esta sintomatología a fin de diferenciarla de las posibles reacciones adversas (depresión respiratoria, edemas generalizados, ginecomastia, disfunción sexual, hepatotoxicidad, trastornos menstruales, náuseas, vómitos, síntomas gripales, mareos) o de las interacciones medicamentosas que se puedan producir en este tipo de pacientes.

La determinación de la duración de la acción de la metadona se podría realizar observando la contracción pupilar.



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3.17.2.-¿QUE SON LOS ANTIRRETROVIRALES?

Son un grupo de fármacos que han demostrado su efectividad en el tratamiento del VIH al disminuir el número de copias del virus y aumentar el número de CD4 de los pacientes.

Actualmente existen 15 antirretrovirales comercializados en el mundo, 14 de ellos en España, incluidos en tres grupos: los análogos de nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa (NITI), los no nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa (NNITI) y los inhibidores de la proteasa.

Sus características farmacocinéticas se encuentran resumidas en la tabla 2. Los tratamientos actuales derivan hacia la politerapia, que se denomina terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), siendo la más utilizada la triterapia14.

Estas combinaciones no se encuentran exentas de riesgos ni de efectos adversos, por lo que es importante un seguimiento del paciente Taburet AM., et al. 1996) 153. Se observa que aproximadamente el 70% de los pacientes se encuentran con triterapia, mientras que existe una tendencia a la baja de la biterapia, al mismo tiempo que aumenta la tetraterapia. Sus efectos adversos están bien documentados, existiendo una amplia variabilidad de dosificación y posología.

3.17.3.-INTERACCIÓN METADONA-ANTIRRETROVIRALES



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Las interacciones de los antirretrovirales con otros fármacos son un problema particular en los pacientes con infección por el VIH. Estos pacientes están además en tratamiento concomitante con otro tipo de fármacos susceptibles de interaccionar entre sí. Estas interacciones pueden presentar significación clínica o no, dependiendo de la gravedad con que se manifieste la interacción, por lo que se debería considerar el perfil de efectos secundarios y/o el índice terapéuticode un fármaco cuando se busca el posible significado clínico de una interacción. En ausencia de datos específicos, las características metabólicas de los fármacos pueden ser útiles en la predicción de posibles interacciones (tablas 1 y 2).

En la revisión de la farmacocinética de los antirretrovirales y de la metadona aparece el citocromo P450 y la glucuronidación como principales mecanismos de biotransformación de estos fármacos. La mayoría de estudios con citocromo P450 se han realizado in vitro, aunque in vivo pueden dar resultados completamente diferentes.

Se conoce que la metadona es sustrato y autoinhibidora de la CYP3A4, enzima que también utilizan los NNITI y los inhibidores de la proteasa. Aunque no sufre procesos de glucuronidación, tiene capacidad inhibitoria sobre ella, siendo esta vía la utilizada en la metabolización de los NITI. Así pues, la potencial interacción en ambos casos sería en el metabolismo: la inducción o inhibición de la isoenzima CYP3A4 puede provocar un síndrome de abstinencia o una toxicidad con la administración de metadona, mientras que la inducción o inhibición de la glucuronidación puede dar lugar a toxicidad o disminución de los títulos plasmáticos de los antirretrovirales afectados, respectivamente. La CYP3A4 es la isoenzima del citocromo P450 implicada mayoritariamente en el metabolismo de muchos otros fármacos, entre los que se encuentran los psicofármacos y la rifampicina (Lin-in Tseng A, et al. 1999) 156.

La metadona interacciona con numerosos medicamentos; sin embargo, debido a que los programas de deshabituación a opiáceos han demostrado su eficacia, no está contraindicada la asociación de ésta con los antirretrovirales Schlatter J,157.

Las reacciones adversas entre antirretrovirales han sido motivo de varios

estudios y publicaciones en los últimos años Barry M, Taburet AM, Carr A., et al. 1996, 1999, 2000)153,154, pero existen pocos con suficientes pacientes que incluyan la interacción antirretrovirales-metadona. Viendo la proporción de pacientes que toman concomitantemente estos fármacos, es de esperar que en el futuro aparezcan más estudios (Touzeau D., Beauverie P, 1998. 1999) 158,159.

En las tablas 3-5 se exponen las interacciones documentadas en la bibliografía y las recomendaciones a seguir en cada caso.



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Análogo de nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa-metadona. Abacavir, estavudina, zalcitabina

y zidovudina

se metabolizan principalmente por mecanismos de glucuronidación, mientras que la lamivudina sufre poca metabolización hepática, siendo ésta por mecanismos de transsulfoxidación.

La vía metabólica de la didanosina no está bien evaluada en humanos. Si bien la metadona no sufre metabolización por mecanismos de glucuronidación, se conoce su capacidad inhibitoria sobre esta vía. Con esto, cabría esperar



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teóricamente una interacción de la metadona con los NITI, esperando un aumento de las concentraciones plasmáticas de los antirretrovirales implicados, con el consiguiente riesgo de toxicidad.

Pero en realidad lo que se observa in vivo es que la lamivudina no sufre ningún tipo de interacción con la metadona, mientras que en el caso de zalcitabina no existen referencias bibliográficas de esta interacción. Abacavir produce un aumento del aclaramiento de la metadona en un 22%, previendo en teoría una disminución de los valores plasmáticos de la metadona, pero no se encuentra descrito ningún caso de interacción hasta el momento. La didanosina y estavudina no han presentado problemas de interacción con la metadona, aunque en teoría existe esta posibilidad; Rainey et al 160 hicieron referencia a la disminución de la concentración plasmática y del área bajo la curva (AUC) de ambos antirretrovirales, pudiendo presentar concentraciones plasmáticas poco eficaces que favorecen la aparición de resistencias.

Sin embargo, parece tener mayor relevancia clínica la interacción con la didanosina. La zidovudina es el NITI con más referencias encontradas en la bibliografía, debido a que fue uno de los primeros antirretrovirales comercializados.

McCance-Katz et al 161 concluyeron en su estudio que la interacción se manifestaba en un aumento del AUC de la zidovudina del 41%, en una disminución del 21% de su aclaramiento y en un aumento del 14% de su concentración máxima (Cmáx), recomendando una posible reducción de la dosis de zidovudina. Trapnell et al 162 llegaron en otro estudio a la misma conclusión, pero en este caso consideraron que la concentración plasmática de metadona para producir el 50% de inhibición de la zidovudina tenía que ser del orden de 8 g/ml. Teniendo en cuenta las reacciones adversas hematológicas que presenta la zidovudina y que éstas pueden ser agravadas por la metadona (Pacifici R., et al 1992) 163, se recomienda una disminución de la dosis de zidovudina, por ejemplo, de 300 mg/12 h a 250 mg/12 h.

3.17.4.-Relación de Análogos no nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa-metadona.

Delavirdina, efavirenz y nevirapina sufren metabolización hepática mediada por el citocromo P450, principalmente por la isoenzima CYP3A4, aunque puede haber otras isoenzimas implicadas, como en el caso de la delavirdina, que sufre también metabolización por el CYP2D6 (Voorman RL., et al. 1998) 163.

La delavirdina es substrato de la CYP3A4, de la CYP2D6 y autoinhibidora de la CYP3A4, por lo que en teoría podría producir interacciones con la metadona;



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sin embargo, no hay datos que avalen esta posible interacción. Se prevé que pueda producir un aumento de las concentraciones plasmáticas de metadona.

El efavirenz es el más nuevo del grupo, por lo que aún no existen muchos

datos sobre la posible interacción. Se conoce que es inductor, autoinductor e inhibidor del CYP3A4 y se sospecha que puede producir síndrome de abstinencia al disminuir la concentración plasmática de metadona en un 60-80% (Marzolini C., Pinzani V., et al 2000) 164,165. Según datos del laboratorio fabricante (Du Pont Pharma), ya existen casos descritos de deprivación opiácea, por lo que se recomienda un seguimiento de estos pacientes y/o valorar el aumento de la dosis diaria de metadona.

La nevirapina es el NNITI más estudiado, se conoce que es inductora,

autoinductora y sustrato del CYP3A4, siendo éste el mecanismo causante de la reducción en un 60% de la concentración plasmática de metadona, lo que provoca la aparición de un síndrome de abstinencia. La interacción se produce en los primeros días del inicio del tratamiento, siendo su capacidad inductora máxima a las dos o tres semanas de haberlo iniciado, durante el cual se recomienda un especial seguimiento del paciente. Altice et al 166 en un estudio con pacientes comprobaron dicha interacción a los 7-8 días del inicio del tratamiento con nevirapina y aumentaron la dosis de metadona de forma empírica basándose en la determinación de las concentraciones plasmáticas de ésta. En otro estudios (Otero MJ., Baño Rodrigo MD., et al. 1999, 2000) 168,169 se obtuvieron los mismos resultados. (Clarkes et al. 2000)170 comentaron que tanto la nevirapina como el efavirenz, cuando se añadieron a los regímenes de mantenimiento con metadona, redujeron el AUC de ésta en un 60%. En su estudio con 19 pacientes observaron que 17 de ellos se quejaron de pérdida de eficacia de la metadona, pero sólo fue necesario un incremento moderado de la dosis (mediana 22%) para controlar los síntomas. Inhibidores de la proteasa-metadona. En este grupo se encuentran el amprenavir, indinavir, nelfinavir, lopinavir, ritonavir y saquinavir. Todos ellos son metabolizados mayoritariamente por el citocromo P450, isoenzima CYP3A4, y actúa como sustratos e inhibidores de esta isoenzima. La clasificación de mayor a menor potencia inhibitoria es la siguiente: ritonavir > indinavir > nelfinavir > saquinavir, siendo el ritonavir el más potente inhibidor del CYP3A4 y en el que mayor significación clínica tiene su interacción con la metadona; el nelfinavir y ritonavir son además inductores de la glucuroniltransferasa (Iribarne C., et al 1998) 171. Este papel inhibidor prevé una interacción con la metadona con resultados de aumento de los valores plasmáticos de ésta; sin embargo, el comportamiento in vivo difiere de esta predicción inicial. (Beauverie et al. 1998) 159 comprobaron en un estudio con 10



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pacientes que el ritonavir y nelfinavir producen una disminución de la concentración de metadona en estado estacionario del 40-50%, mientras que el indinavir y saquinavir no demuestran esta interacción. Touzou et al20 llegaron en otro estudio a la misma conclusión. Hsyu et al 172, por su parte, expusieron que el nelfinavir reduce las concentraciones de metadona en el enantiómero negativo un 47% y en el enantiómero positivo un 39%; no obstante, no fue necesario realizar ajuste de dosis de metadona y las concentraciones de nelfinavir no se vieron afectadas.

En este estudio sólo se administró nelfinavir durante 8 días, lo que hace aconsejable ampliarlo hasta los 14 días, tiempo necesario para alcanzar la inducción del citocromo P450.

El nelfinavir aparece en estudios como inhibidor del citocromo P450, pero las experiencias dan como resultado su posible papel inductor de esta enzima. McCance-Katz et al, 2000) 173, en la descripción de un caso clínico con un paciente en tratamiento concomitante con metadona y los antirretrovirales indinavir, zalcitabina, estavudina y nelfinavir, observaron la aparición de un síndrome de abstinencia atribuido al nelfinavir, que fue contrarrestado aumentando la dosis de metadona.

Se realizó un seguimiento durante 5 días (tiempo mínimo necesario para

revertir el efecto de la inducción hepática) y se le pautó una dosis de 125 mg/día de metadona, 25 mg más de lo prescrito inicialmente. No se observaron aparentemente problemas de interacción con indinavir, estavudina y zalcitabina.



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El amprenavir junto con el lopinavir son los antirretrovirales más

recientemente comercializados de este grupo, por lo que no existen aún suficientes datos para valorar la posible interacción con la metadona; sin embargo, in vitro se ha observado que producen una disminución de sus valores plasmáticos (Product Monograf. Ziagen®1999, Decker CJ. Et al. 1998) 174,175, por lo que teóricamente serían candidatos a producir síndrome de abstinencia (Hendrix C., et al. 2000) 175.

Según los expertos, se recomienda aumentar progresivamente la dosis de

metadona cuando se administra concomitantemente con amprenavir o lopinavir, realizando una estrecha monitorización. Saquinavir no parece tener efectos significativos sobre la concentración de metadona, aunque por su efecto inhibidor sobre el CYP3A4 y debido a que no existen datos suficientes, no se puede descartar la posible interacción Beauverie P, et al 1998 159.

El indinavir, como inhibidor del CYP3A4, debería presentar teóricamente una interacción con la metadona aumentando sus valores plasmáticos. Guibert et al39, en un estudio y a la vista de los resultados, sugirieron que el AUC para la metadona podría incrementarse el doble cuando se administra con ritonavir y un 30% cuando se da con indinavir. Cantinela et al. 1999 177, en un estudio aleatorizado cruzado, ciego con dosis múltiples y de dos períodos con 12 pacientes, observaron que la interacción del indinavir con la metadona no era indicativa de que fuera clínicamente significativa, por lo que probablemente no se necesitaría un ajuste de la dosis de ninguno de los dos fármacos implicados.

El ritonavir in vitro se presenta como el más potente inhibidor del CYP3A4 de todos los inhibidores de la proteasa; además, es inductor de la glucuroniltransferasa y parece que también se encuentra implicada en su metabolización la isoenzima CYP2D641. Con estos datos se preveía un aumento de las concentraciones de metadona en un 100-200%; sin embargo in vivo se comprobó que su comportamiento era totalmente contrario, disminuyendo los valores plasmáticos de metadona en un 40% y desencadenando un síndrome de abstinencia en las primeras semanas de tratamiento (Product Monograf. Ziagen®1999, Geletko SM, Jiménez Lerma JM., et al 1999, 2001) 179,180.

En la ficha técnica del producto se advierte, dependiendo de la respuesta del paciente, que puede ser necesario un aumento de la dosis de metadona cuando se administra conjuntamente con ritonavir.

Los estudios descritos se basan en las concentraciones plasmáticas de los fármacos para detectar posibles interacciones, por lo que cabría preguntarse la utilidad potencial de la monitorización terapéutica de los antirretrovirales. Los NITI parecen ser malos candidatos debido a la dificultad y coste de medir sus



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metabolitos activos; los NNITI (efavirenz y nevirapina), son también malos candidatos debido a su larga vida intracelular y a la facilidad para prever las concentraciones, lo que hace innecesario la monitorización, mientras que los inhibidores de la proteasa, por el contrario, son excelentes candidatos para ser monitorizados como consecuencia de su farmacocinética y la relación entre concentración plasmática y efectividad (López RM., et al. 2001) 181.

Es habitual en la práctica diaria aumentar la dosis de metadona de forma

empírica cuando se presenta un síndrome de abstinencia; sin embargo, se desconoce exactamente la dosis que se necesitaría para revertir este síndrome. La bibliografía consultada sólo hace referencia a si se debería aumentar o no la dosis de metadona; este incremento de dosis tendría que ser concordante con los valores plasmáticos alcanzados antes de empezar el tratamiento antirretroviral, pero por el momento se desconoce esta información.

La implicación del CYP3A4 en las interacciones de la metadona con los

inhibidores de la proteasa y con los NNITI está suficientemente demostrada in vitro, pero in vivo se prevé en estos casos una disminución de los valores plasmáticos de metadona y la posibilidad de producir un síndrome de abstinencia.

Por otra parte, la implicación de procesos de glucuronidación en los NITI

parece ser el mecanismo por el cual se produce la interacción de éstos con la metadona, previendo in vivo un aumento de las concentraciones plasmáticas de los antirretrovirales implicados, con el consiguiente riesgo de toxicidad. Debido a la complejidad de los tratamientos antirretrovirales actuales y a la elevada variabilidad individual, es posible esperar la existencia de interacciones de éstos con la metadona y otros fármacos.

Sería necesario incluir en el prospecto de los antirretrovirales tanto la

posibilidad de que se pueda producir este tipo de interacción como las recomendaciones a seguir.

La organización de un equipo multidisciplinario de profesionales sanitarios

que se impliquen con el paciente resolviendo sus dudas, lo guíen en el seguimiento de la terapia y lo apoyen en todos los aspectos puede suponer un aumento del cumplimiento del tratamiento (adherencia), como demostraron Selwyn et al, 1989) 183. Según el GESIDA (VIII reunión de SEIMC), la adhesión al tratamiento es ya una prioridad, por lo que, antes de iniciar la terapia conviene preparar al paciente, tratar de identificar las potenciales situaciones concomitantes que puedan dificultar una correcta adhesión y corregirlas (Moreno S, et al. 1998) 184.



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3.18.-ESTUDIOS FARMACOGENÉTICOS: GUÍA DE EVALUACIÓN PARA COMITÉS ÉTICOS DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA.

3.18.1.-Fundamentos científicos y marco legal (I)

La genética ha experimentado importantes avances durante las últimas dos décadas, y su repercusión en la práctica de la medicina aumenta a medida que lo hace también el conocimiento de nuestra dotación genética y de las reglas que rigen su funcionamiento, tanto en estados fisiológicos como patológicos Collins FS, Peltonen L, et al. 1999, 2001)186-188.

Existen dos problemas clínicos de gran relevancia en los que los determinantes genéticos individuales son claves: la propensión a padecer ciertas enfermedades (y su curso clínico) y la variabilidad entre pacientes de la respuesta a los medicamentos, tanto en eficacia como en seguridad. Por eso, en el momento actual se está incorporando la obtención y el análisis de muestras de material genético de los participantes en ensayos clínicos con medicamentos y en otros estudios clínicos y epidemiológicos para identificar a las personas o las poblaciones con mayor probabilidad de obtener eficacia y menor riesgo de sufrir reacciones adversas.

Sin embargo, la información genética obtenida, ya sea en relación directa con el problema clínico estudiado o indirectamente, también podría desvelar datos sobre los sujetos analizados y sus familiares directos, lo cual tiene una serie de implicaciones éticas, sociales y legales distintas de las de los ensayos clínicos convencionales (Knoppers BM, Wattanapitayakul S., et al. 1999, 2001) 189-192.

Actualmente se reconoce de forma casi universal el valor esencial de la dotación genética humana, tanto individual como colectiva, y el genoma humano se ha declarado patrimonio universal de la Humanidad, por lo que se aboga por la necesidad de establecer un código ético y una normativa jurídica universales que garanticen su protección y regulen su uso UNESCO (1997), Oviedo, 4 de abril de 1997 193,194. Los estudios genéticos son ya objeto de debate en la sociedad, preocupada por aspectos como la confidencialidad de los datos de salud y su eventual repercusión en el empleo, las pólizas de seguros o las relaciones familiares y sociales (Grady C, Reilly PR., et al 2001)195, 198.

Sin embargo, las posibilidades y limitaciones técnicas de la genética no son fáciles de establecer y resulta difícil prever su verdadero impacto en la sociedad. Por otra parte, el marco normativo sobre estos aspectos no está aún plenamente desarrollado y ni siquiera existen criterios universales en los que basarse para evaluar estas iniciativas científicas debido a que la sociedad es un ente heterogéneo, integrado por grupos de personas con tradiciones, creencias, códigos morales e intereses muy dispares (White MT, Scully JL, et al. 1999, 2001) 199, 200.



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Otros documentos han analizado anteriormente los principales aspectos

éticos que deben regir en cualquier proyecto de investigación con muestras genéticas humanas, pero ninguno de forma específica en el contexto de los ensayos clínicos en España (Deschènes M., NBAC., et al. 2001) 201, 202. La legislación española (Real Decreto 561/93)18 otorga a los Comités Éticos de Investigación Clínica (CEIC) la responsabilidad de evaluar los aspectos metodológicos, éticos y legales de los ensayos clínicos con medicamentos, lo que incluye estudios que contemplan la obtención de muestras e información genéticas y que plantean aspectos éticos, legales y regulatorios específicos Nebert DW, Rothstein MA, Robertson JA. Et al.2001) 203, 205, 207.

En este primer artículo se revisan las bases científicas y el marco legal en el

que se desarrollan los estudios de farmacogenética y en un artículo posterior se detallan las consideraciones a tener en cuenta al evaluar el protocolo del ensayo y la hoja de información al paciente.

3.19.-FARMACOGENÓMICA

Este término hace referencia al estudio sistemático de todo el genoma y sus productos en relación con los procesos de descubrimiento y desarrollo de medicamentos EMEA/CPMP/3070/01. Identificar qué elementos genéticos son importantes en el desarrollo y evolución de un proceso patológico, conocer cómo se alteran por diversos mecanismos y cómo interaccionan entre sí y con elementos exógenos permitirá definir potenciales dianas terapéuticas, plantear nuevas estrategias de evaluación de medicamentos y optimizar el proceso de desarrollo farmacéutico Roses AD, et al. 2000 226

Adicionalmente, la mejor caracterización de las bases genéticas y moleculares de las enfermedades ayudará a mejorar su diagnóstico, diferenciando entre entidades con síntomas parecidos pero con distintas causas y/o mecanismos de desarrollo o progresión clínica y que, consecuentemente, son tributarias de tratamientos diferentes Peltonen L, Roses AD, et al 2000 226. 3.19.2.-TRANSCRIPTÓMICA Y PROTEÓMICA

La información genética se almacena en la molécula del ADN y en ella se transmite de una generación a otra. Pero el secreto de la vida radica en la plasticidad y regulación dinámica de los sistemas de lectura de la información genética –transcripción del ADN, para la síntesis de ácido ribonucleico mensajero (ARNm), y traducción, para la de proteínas a partir del ARNm– que hacen posible que unos genes se expresen en ciertas células y otros no, y que el patrón de expresión pueda variar, cualitativa, cuantitativa y cronológicamente, en



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la misma célula, tejido u órgano en función de las necesidades y de las circunstancias ambientales, o del estado patológico en que se encuentren. Por eso, cada vez más los protocolos de estudios farmacogenéticos y farmacogenómicos incluyen también el análisis de muestras de ARNm (transcriptómica) y proteínas (proteómica). De estas disciplinas se esperan datos relevantes, complementarios a los genéticos, que contribuyan a entender mejor las diferencias interindividuales o los efectos de los medicamentos sobre el organismo . 3.19.1.-ENTORNO LEGISLATIVO

Los estudios farmacogenéticos están sujetos, por un lado, a la normativa sobre investigación biomédica en seres humanos (de la que los ensayos con medicamentos son sólo una parte) y, por otro, a la legislación sobre protección de datos personales. Además, y aunque no tengan carácter normativo de obligado cumplimiento, existen varios documentos emitidos por organismos públicos y privados, nacionales e internacionales, sobre investigación genética.

3.19.3.-Normativa sobre investigación biomédica en seres

humanos

Hasta la fecha, no existe legislación sobre investigación biomédica en general en el ámbito de la Unión Europea ni de la mayoría de sus Estados miembros salvo algunas excepciones (Ley Huriet en Francia 60). Existe, no obstante, un cuerpo de recomendaciones internacionales como la Declaración de Helsinki61 y el Convenio del Consejo de Europa para la protección de los derechos y la dignidad del ser humano con respecto a las aplicaciones de la biología y la medicina (Convenio de Oviedo de 1997) 194.

Estos documentos, que establecen principios básicos para toda investigación en seres humanos (con independencia de si incluyen o no el uso de medicamentos), gozan de un amplio reconocimiento y se recomienda su cumplimiento. Cuando se trata de investigación clínica que implica el uso experimental de medicamentos, España y otros países europeos cuentan con leyes que regulan su realización y que siguen muchas de las recomendaciones de los textos antes citados y otras particulares sobre medicamentos, como las Normas de Buena Práctica Clínicas2.

La Declaración de Helsinki establece que cualquier protocolo experimental en seres humanos, con medicamentos o no, debe enviarse para consideración, comentario, consejo y, cuando sea oportuno, aprobación, a un comité de



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evaluación ética especialmente designado e independiente del investigador, del promotor o de cualquier otro tipo de influencia indebida. También el Convenio de Oviedo del Consejo de Europa se refiere a la aprobación de las investigaciones por un cuerpo competente tras una revisión independiente sobre la pertinencia científica, importancia del objetivo y estudio multidisciplinario en el plano ético. En el caso de los estudios experimentales que se refieren a investigación con medicamentos, el Real Decreto 561/1993 sobre ensayos clínicos con medicamentos 18 constituye legalmente los CEIC en nuestro país y define sus atribuciones para evaluar este tipo de estudios. En la práctica, los CEIC también actúan como los «comités independientes» descritos en la Declaración de Helsinki para el resto de investigaciones biomédicas.

A veces esta doble atribución de los CEIC origina confusión, puesto que sólo los ensayos clínicos con medicamentos están sujetos a los preceptos legales y administrativos del Real Decreto 561/1993. Ni en el Real Decreto 561/1993 ni en ninguna otra norma legal española se incluye consideración específica alguna sobre los estudios genéticos. Algunos países de nuestro entorno (Francia, Irlanda, Suecia y Dinamarca) han desarrollado normas específicas para la inclusión de investigaciones farmacogenéticas en el contexto de la investigación clínica en aspectos tales como el consentimiento o la anonimización de las muestras

Recientemente se ha aprobado una Directiva Europea sobre ensayos clínicos

con medicamentos (Directiva 20/2001/CE), que inicia el proceso de armonización de la intervención de las distintas autoridades nacionales europeas sobre los ensayos clínicos con medicamentos. Sin embargo, esta directiva no ha incluido ningún aspecto particular sobre investigaciones genéticas, salvo la prohibición explícita de realizar ensayos de terapia génica que modifiquen la identidad genética de la línea germinal de un individuo.

Así pues, los estudios de farmacogenética están sujetos a la normativa del Real Decreto 561/1993 siempre que, por el tipo de medicamento que se administra o por el protocolo del estudio, puedan incluirse en la definición que da la norma para «ensayo clínico con medicamentos». En caso contrario, podría notificarse a la Agencia Española del Medicamento (AEM) si se considera un estudio observacional con medicamentos de acuerdo con su Circular 4/2000, o simplemente cumplir con las recomendaciones éticas internacionales aplicables a cualquier investigación con seres humanos (Declaración de Helsinki).

3.20.-NORMATIVA SOBRE PROTECCIÓN DE DATOS DE CARÁCTER PERSONA

La legislación vigente en España es la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de

diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal (LOPD)65, que



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derogóla Ley Orgánica 5/1992 sobre el Tratamiento Automatizado de los Datos de Carácter Personal (LORTAD)66. La LOPD traspone a la legislación española la Directiva Europea 95/46/CE67, que estableció en 1995 un marco legal único sobre protección de datos en toda la Unión Europea. El Reglamento de medidas de seguridad de los ficheros automatizados que contengan datos de carácter personal (Real Decreto 994/1999)68 desarrolla lo dispuesto en la LOPD.

La LOPD tiene por objeto garantizar y proteger, en lo que concierne al tratamiento de los datos personales, las libertades públicas y los derechos fundamentales de las personas físicas, y especialmente los de su honor e intimidad personal y familiar. La LOPD se aplicará a los datos de carácter personal, definidos como «cualquier información concerniente a personas físicas identificadas o identificables».

En contraposición, se entiende que son datos disociados o anonimizados

cuando no puedan asociarse a una persona identificada o identificable. La utilización de las iniciales no se considera una forma adecuada de disociar los datos, ni tampoco las secuencias numéricas que pueden ponerse en relación con un listado de datos personales que tenga otra persona u obre en otro fichero. Así, según la definición de la LOPD, los datos de los cuadernos de recogida de datos de cada sujeto de un ensayo clínico serían datos personales identificables, mientras que los asociados a muestras anonimizadas no serían datos de carácter personal, pues son datos disociados y, por tanto, no se ven afectados por lo estipulado en la LOPD.

Esta ley no contempla específicamente la protección de los datos personales que se puedan conocer como consecuencia de la investigación en seres humanos, aunque sí establece una protección especial para los datos personales que hagan referencia a la salud. Tampoco en la LOPD ni en el Reglamento de Ficheros Automatizados se mencionan consideraciones específicas para el manejo de datos de carácter genético.

En este mismo sentido, la Recomendación 5 del Comité de Ministros del Consejo de Europa, relativa a la protección de datos médicos, define la expresión «dato médico » como «todos los datos de carácter personal relativos a la salud de una persona», añadiendo que dicha expresión afecta igualmente a los datos manifiesta y estrechamente relacionados con la salud, así como las informaciones genéticas.

La Recomendación señala que la expresión «datos genéticos» se refiere a

«todos los datos, de cualquier tipo, relacionados con los caracteres hereditarios de un individuo o que, vinculados a dichos caracteres, compongan el patrimonio de un grupo de individuos emparentados». Además, se indica que este concepto también se refiere a «todos los datos que afecten a intercambios de información



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genética de un individuo o línea genética, con relación a cualquier aspecto de la salud o de una enfermedad, constituya o no un carácter identificable».

En consecuencia, cualquier dato personal de carácter genético deberá

considerarse un dato que afecta a la salud de las personas y, como tal, sujeto a las disposiciones específicas de la LOPD. El análisis pormenorizado de los artículos de la LOPD supera el objeto del presente documento. Sin embargo, varios de sus artículos se aplican directamente a las actividades de investigación clínica en seres humanos, incluidas aquellas en las que se obtienen datos genéticos:

–En el artículo 4 se establece la necesidad de adecuar la recogida de los datos a los fines legítimos para los que se obtienen, prohibiendo su uso para otros distintos, y se reconoce su caducidad una vez alcanzados los objetivos. – El artículo 5 hace referencia a la existencia de un fichero de datos personales, su finalidad y sus propietarios, así como a la obligatoriedad o no de facilitar los datos, las consecuencias de hacerlo (o no) y la posibilidad de acceder, rectificar y cancelar los datos por parte del interesado. En el caso de los ensayos clínicos, esta información debe facilitarse en la hoja de información al paciente. Un artículo reciente analiza cómo la LOPD afecta a las actividades de investigación clínica y propone un modelo para compaginar sus recomendaciones con las del Real Decreto 561/1993, incluyendo la necesidad de obtener autorización expresa del paciente para que sus datos personales sean obtenidos, procesados y almacenados.

– El artículo 7 define los tipos de datos personales considerados especialmente protegidos, entre ellos los de salud, y los motivos por los que se pueden solicitar y utilizar. – En el artículo 9 queda establecida la obligación de adoptar todas las medidas técnicas y organizativas para garantizar la máxima seguridad de los datos de carácter personal. – La necesidad de obtener autorización para la cesión de los datos de carácter personal y sólo para los fines para los que se obtuvieron aparece recogida en el artículo 11. Los datos personales de salud sólo pueden facilitarse a otras personas distintas del interesado si éste ha dado su consentimiento de forma expresa. – El artículo 12 regula el acceso y la gestión de datos por terceros. En el contexto de la investigación clínica, en muchas ocasiones los promotores contratan a otras empresas para el tratamiento completo o parcial de los datos. Una vez finalizada esta tarea, deben devolver el fichero a su responsable y destruir todas las copias en su poder.



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– En el artículo 15 se desarrollan las consideraciones sobre el derecho de acceso a la información. Este derecho se facilita, habitualmente, mediante un escrito que recoge todos los datos que se tienen del interesado, su origen y las cesiones realizadas. En el caso de ejercer el acceso a datos de salud, la información no debe ser interpretada, sólo facilitada de forma completa. En el caso de los datos genéticos, se proporcionaría el listado completo de los marcadores genéticos analizados sin incluir consideraciones sobre sus posibles implicaciones médicas. El plazo para facilitar el acceso solicitado es de un mes, a contar desde la recepción de la solicitud. La Instrucción 1/199871, de 19 de Enero, de la Agencia de Protección de Datos, relativa al ejercicio de los derechos de acceso, rectificación y cancelación, explica la forma de ejercer estos derechos y cómo deben contestar los responsables de los ficheros.

– El artículo 16 estipula los procedimientos para la rectificación y/o cancelación de los datos y sus consecuencias. Si un sujeto participante en un ensayo clínico solicitase la cancelación de sus datos personales al finalizar su participación, el responsable de los ficheros tiene la obligación legal de contestarle, en el plazo de 10 días, tenga o no los datos de ese individuo en sus ficheros. En el caso de que los tuviese, la normativa vigente limitaría la capacidad de cancelación de los datos por parte del promotor: a) según el artículo 13.5 del Real Decreto 561/1993, durante el año posterior a la finalización del ensayo se presume que los daños que afecten a la salud son consecuencia del mismo; b) en el artículo 21.4 del Real Decreto 561/1993 se establece que el promotor conservará la documentación durante el período de validez del medicamento, y c) en el artículo 21.2 del Real Decreto 561/1993 y en la Directiva 91/507/CEE72 se determina que el investigador se ocupará de que los códigos de identificación del paciente se conserven durante al menos 15 años después de concluido o interrumpido el ensayo.

En general, los ficheros que manejan los promotores de ensayos clínicos constituyen ficheros de datos de carácter personal, puesto que es posible la identificación inequívoca del individuo, aunque sólo consten sus iniciales, con el concurso del investigador responsable del paciente. En consecuencia, todas las consideraciones previas de la LOPD inciden sobre ellos.

3.20.-EVALUACIÓN ECONÓMICA EN LA ERA DE LA FARMACOGENÉTICA Y FARMACOGENÓMICA: ¿UN RAYO DE LUZ EN LA OSCURIDAD?

Desde siempre se ha sabido en medicina que cada individuo es diferente en la predisposición que presenta a desarrollar una enfermedad, la posterior evolución de ésta y la respuesta a los tratamientos administrados. Además, desde hace años se conoce que la dotación genética de cada sujeto es un factor importante a la hora de explicar esta variabilidad interindividual a padecer una



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enfermedad específica y a presentar diferentes respuestas a los medicamentos administrados (Weinshilboum R, 2003) 238.

El rápido avance del proyecto del genoma humano en los últimos tiempos y el desarrollo de tecnologías que nos permiten conocer y estudiar el genoma de la población (empleando nuevas técnicas de análisis genético, como son las micromatrices y el chip ADN), han permitido la integración de la información genética en la práctica clínica. De esta manera, se va a poder identificar a sujetos con una predisposición hereditaria a presentar ciertas enfermedades, desarrollar nuevos medicamentos basados en la información genética del paciente e individualizar y personalizar el tratamiento con medicamentos en cada paciente de acuerdo con su información genética (Oliva R, Varmus H, et al. 2001, 2002) 239,240.

Hoy se sabe que los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro ADN y en el 0,1% restante se encuentran las variantes genéticas (3 millones de nucleótidos), las cuales diferencian el código genético de una persona a otra y explican la predisposición a presentar ciertas enfermedades y a responder a los tratamientos prescritos. También se tiene constancia de que la variación genética puede modificar la eficacia y seguridad de los medicamentos cuando la mutación ocurre en proteínas que son dianas de éstos (receptores), participan en su mecanismo de transporte o son enzimas que metabolizan los fármacos. Este hecho va a motivar que cada sujeto responda de manera diferente a los medicamentos debido a su heterogeneidad genética, de tal manera que en ciertos individuos un medicamento puede que no sea eficaz, mientras que en otros puede producir efectos adversos (Evans WE., 1999) 241.

En los últimos años, con la idea de aplicar los conocimientos proporcionados por el análisis genómico de la población, han surgido con fuerza 2 nuevas disciplinas: la farmacogenética y la farmacogenómica.

La farmacogenética pretende explicar la influencia de la variabilidad genética

en la respuesta a los medicamentos e intenta conocer cómo un determinado polimorfismo genético puede afectar al metabolismo y a la acción de los medicamentos en cada sujeto, lo que va a permitir optimizar la respuesta terapéutica del paciente al aumentar la eficacia del medicamento administrado, reducir sus efectos adversos y mejorar el cumplimiento terapéutico.

En estos momentos ya se dispone de un chip genético, CYP450, que es capaz de determinar la respuesta de cada paciente a un amplio grupo de medicamentos a través del análisis del casi el 100% de los polimorfismos de los genes CYP2D6 (responsable del metabolismo de muchos antidepresivos, antipsicóticos, antiarrítmicos, analgésicos, antieméticos y otros) y CYP2C19 (responsable del metabolismo de antiepilépticos, anticoagulantes y benzodiacepinas, entre otros). De esta manera, será posible predecir en cada paciente qué medicamento (y a qué dosis) va a ofrecer un cociente



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beneficio/riesgo más favorable, lo que ayudará a mejorar los criterios de selección de los medicamentos que se puede prescribir a cada individuo. (Roses AD, 2000) 226.

La farmacogenómica evalúa la respuesta conjunta de múltiples genes frente a un medicamento y la influencia de las variaciones del ADN en los efectos de los fármacos. Asimismo, intenta identificar qué elementos genéticos son importantes en el desarrollo y evolución de una enfermedad y conocer cómo se alteran e interaccionan entre sí. De esta manera, se podrán definir nuevas y potenciales dianas, plantear nuevas estrategias de evaluación y desarrollo de los fármacos, así como diseñar medicamentos más específicos dirigidos a un grupo de individuos que compartan ciertas secuencias del ADN, lo que incrementará su eficacia y minimizará sus efectos adversos.

De alguna manera, la farmacogenómica va a facilitar el desarrollo, la

investigación y un uso más apropiado y racional de los medicamentos, ya que ayudará a predecir la respuesta a éstos en pacientes con determinadas características genéticas (Evans WE, 2003) 241.

Los estudios de farmacogenética y farmacogenómica podrían posibilitar el

empleo de la información genética y genómica para prescribir los medicamentos de una manera individualizada, según el polimorfismo genético y la existencia de dianas específicas en su enfermedad, lo que permitirá que en los próximos años se produzca un cambio drástico en la forma de enfocar la prevención y el tratamiento de las enfermedades en el ser humano, ya que será posible desarrollar medicamentos específicos para tratar distintas enfermedades en determinados subgrupos de pacientes (Shah J, 2005) 244.

La consecuencia práctica más directa de este nuevo paradigma podría ser la obtención de mejores resultados clínicos, con una disminución de la morbimortalidad de los pacientes y una importante reducción de la necesidad de administrar distintos y sucesivos medicamentos hasta encontrar el más eficaz y seguro para cada uno, lo que incrementará notablemente la calidad de vida de los pacientes y elevará la calidad asistencial del Sistema Nacional de Salud (SNS) (Haga SB, 2004) 245.

Además, la aplicación de la farmacogenética y la farmacogenómica podría reducir ciertos costes sanitarios, como son los secundarios al manejo de los efectos adversos de los medicamentos y los derivados de tener que administrar fármacos de segunda línea al no haber respuesta a los tratamientos de primera elección. Globalmente, es posible que el uso de estas disciplinas ahorre recursos sanitarios al evitar días de estancia hospitalaria y pruebas complementarias y analíticas, así como eludir la realización de intervenciones quirúrgicas y otros procedimientos, debido al incremento de la eficacia y seguridad de los medicamentos administrados como primera línea de tratamiento (Lichter JB, 1997) 246.



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Un campo que constituye un buen ejemplo de la aplicación práctica de los

resultados de estos estudios es el de la oncología, donde la identificación de nuevas dianas terapéuticas podría generar un incremento de la eficacia y seguridad de los medicamentos prescritos y donde la búsqueda de tratamientos personalizados para cada paciente (investigando alteraciones genéticas en el tumor, en el genoma circulante o en variantes genéticas del ADN de células o sangre periférica) sigue siendo una prioridad y una realidad. De hecho, en estos momentos ya hay un grupo de medicamentos (tretinoína, cetuximab, trastuzumab, imatinib, entre otros) en que la población de pacientes diana que deben ser tratados se selecciona a partir de un test de farmacogenómica predictiva según la determinación genética de una serie de polimorfismos en las biopsias tumorales (las cuales van a indicar la posible resistencia del tumor a un medicamento en concreto); de este modo puede conocerse de antemano en qué subgrupos de pacientes posiblemente será eficaz el medicamento y en cuáles no.

De esta manera el oncólogo podría ser capaz de seleccionar el medicamento más eficaz y seguro en cada paciente, pudiéndose elaborar una quimioterapia combinada «a la carta», lo que podría generar un resultado clínico más satisfactorio y evitar el uso innecesario e inadecuado de medicamentos, con lo cual se prevendría la aparición de efectos adversos y se ahorraría recursos al reducirse el número de visitas necesarias y el total de fármacos administrados (Flowers CR, 2000) 247.

Sin embargo, hay que tener claro que la farmacogenética y la

farmacogenómica van a requerir la realización de un test genético a los pacientes, lo que significa un coste adicional importante, al que debe sumarse el coste de la formación del personal que ha de realizarlo y el coste del tiempo necesario

para su adecuada interpretación. A estos gastos hay que sumar el coste de adquisición de los nuevos medicamentos elaborados sobre bases genéticas, que serán más caros que las opciones terapéuticas ya existentes en el mercado, dado el costoso proceso de desarrollo y fabricación.

Por lo tanto, en estos momentos no está claro si estos nuevos medicamentos

nacidos de la aplicación de los estudios de farmacogenética y farmacogenómica van a ser opciones terapéuticas coste-efectivas para la sociedad y el SNS, y si sus beneficios terapéuticos adicionales compensarán el coste adicional derivado de su empleo sistemático (Danzon P, 2002) 248.

Además, para complicar esta situación, cada vez es más patente la implantación, por parte de las autoridades sanitarias de los países industrializados, de medidas para contener el gasto sanitario en general y el



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farmacéutico en particular, dado que cada día es más evidente y notorio que las demandas sanitarias de la sociedad crecen a un ritmo mayor que los recursos existentes para destinar al cuidado sanitario y a financiar la factura farmacéutica.

En este contexto, está claro que los recursos serán cada vez más limitados y

escasos, por lo que es necesario priorizar su asignación a las intervenciones terapéuticas que sean más coste-efectivas y puedan maximizar la ganancia en salud para la sociedad.

Las evaluaciones económicas serán herramientas clave a la hora de tomar

decisiones acertadas y asignar eficientemente los recursos disponibles, ya que permitirán conocer qué opciones son coste-efectivas al producir beneficios terapéuticos adicionales con un consumo de recursos adicional razonables y moderado (Sacristán JA, 2004)12. En este sentido, este tipo de evaluaciones proporcionarán información que nos indique si los estudios de farmacogenética y farmacogenómica serán intervenciones eficientes para nuestra sociedad y el SNS de este país y, por lo tanto, deberían efectuarse de forma sistemática en la práctica medica asistencial.

Si aplicamos los principios de la evaluación económica al mundo de la farmacogenética y la farmacogenómica, estas nuevas tecnologías podrían ser intervenciones coste-efectivas siempre que se cumplan los siguientes requisitos (Phillips KA, Elkin EB, et al. 2004) 250,252:

–Alta prevalencia del polimorfismo genético mediante escrutinio en la población, conjuntamente con un elevado grado de penetración. –Elevada prevalencia de la enfermedad estudiada, ya que de esta manera se podrá tratar a un grupo amplio de pacientes. –Alto coste de la enfermedad diagnosticada con el test genético o del manejo de los efectos adversos de los medicamentos empleados en su tratamiento. –Estrecha relación entre la mutación genética que se va a diagnosticar y los resultados clínicos que se va a obtener (incremento de la eficacia y seguridad). –Existencia de tratamientos eficaces que puedan emplearse tras la realización de estos estudios y que produzcan mejores resultados clínicos que los tratamientos que se usan habitualmente. –Elevada sensibilidad y especificidad del test genético, que sea rápido de efectuar y tenga un coste global razonable (coste del test + visitas adicionales + consejo genético).



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–Ausencia de métodos baratos y fáciles de aplicar para monitorizar la respuesta y los efectos adversos de los tratamientos disponibles en la actualidad para tratar el trastorno diana. –Elevada morbimortalidad y/o importante repercusión en la calidad de vida de los pacientes que presentan la enfermedad en que se va a efectuar estos estudios.

Por lo tanto, parece claro que los estudios de farmacogenética y farmacogenómica sólo serán intervenciones costeefectivas en algunas combinaciones de enfermedades, medicamentos, polimorfismos genéticos y características de los tests genéticos a realizar. Este tipo de estudios podrían ser eficientes en medicamentos con un estrecho intervalo terapéutico, una alta variabilidad en la respuesta y una difícil evaluación de ésta, así como en enfermedades de elevada prevalencia y alto coste, que presentan una elevada morbimortalidad y/o afectan de manera importante a la calidad de vida de los pacientes y donde los tratamientos existentes son parcialmente eficaces y producen muchos efectos adversos, pues de este modo se podría evitar que muchos pacientes tomen medicamentos poco o nada eficaces durante años (p. ej., enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, oncología, sida, etc.) (Phillips KA, Flowers CR, 2004) 253, 254. La farmacogenética y la farmacogenómica podrían cambiar la manera de tratar las enfermedades en un futuro próximo, lo que probablemente tendría una gran repercusión social y económica. Su uso permitiría que la medicina genómica o medicina personalizada tomase fuerza en la práctica médica habitual tras la aplicación progresiva de tratamientos preventivos y curativos basados en la información genética de las personas (tabla 1) (Lunshof J, 2006) 255.

De hecho, en estos momentos su utilización se está evaluando en muchas áreas terapéuticas y es de esperar que en el futuro pueda suponer una auténtica revolución en el tratamiento farmacológico de ciertos trastornos (Wilffert B, Rangnathan P., et al. 2005) 255, 260.

Sin embargo, no está claro si su uso habitual producirá un incremento del gasto sanitario y se tratará de intervenciones coste-efectivas, lo que dificultará la toma de decisiones en estas condiciones de incertidumbre e inseguridad Ginsburg GS, 2005) 261. TABLA 1 Ejemplos de medicamentos en que puede seleccionarse a la población diana a través de tests predictivos de farmacogenómica



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En este contexto, las evaluaciones económicas ayudarán a conocer en qué

enfermedades y con qué medicamentos los estudios de farmacogenética y farmacogenómica son eficientes y, por lo tanto, habría que efectuarlos de forma sistemática para decidir el tratamiento en cada paciente. Por este motivo, los análisis económicos supondrán una ayuda importante para las autoridades sanitarias y otros órganos de decisión, y su realización será necesaria para disponer de datos de coste-efectividad, lo que ayudará de manera importante en el proceso de fijación del precio del nuevo medicamento y en la decisión de si va a financiarlo el SNS y si esta financiación será selectiva o no. Sin embargo, estas evaluaciones económicas sólo deberían efectuarse cuando previamente se haya constatado, con estudios clínicos bien diseñados y con suficiente poder estadístico, que presentan un adecuado cociente beneficio/riesgo para su aplicación en la práctica médica diaria.

Es imprescindible que se incluyan más estudios de farmacogenética y farmacogenómica en los ensayos clínicos en que se evalúan nuevos medicamentos, ya que de esta manera podremos identificar los polimorfismos genéticos de los pacientes que mejor responden, menos efectos adversos presentan y mejor relación coste-efectividad muestran. De esta forma, en el futuro se podrá seleccionar al subgrupo de pacientes candidatos a recibir el nuevo medicamento en estudio con el máximo de garantías (Trepicchio WL, et al. 2006) 262.

Las disciplinas de la farmacogenética y farmacogenómica han llegado para

quedarse y su aplicación sistemática podría ser una realidad en el futuro inmediato (Arnold HP, et al. 2006) 263. Su uso y aplicación en la práctica médica diaria podría incrementar el éxito terapéutico en muchos pacientes y, por lo tanto, es muy probable que la calidad asistencial del SNS pudiera elevarse, aunque quizá con un incremento del gasto sanitario final 27. El reto consistirá en establecer en qué enfermedades y en qué pacientes deberá realizarse este tipo de estudios, en un intento por racionalizar y priorizar la utilización de los recursos públicos destinados al cuidado sanitario, y en este cometido las evaluaciones económicas serán un rayo de luz en el oscuro proceso de la toma de decisiones.



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3.21.-POLIMORFISMO GENÉTICO EN EL PACIENTE CRÍTICO. PARTE II: APLICACIONES ESPECIALES DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS. FARMACOGENÉTICA Y TERAPIA GÉNICA

En el primer manuscrito se describieron los trabajos más importantes en relación con el polimorfismo genético en el paciente crítico respecto a la inflamación y la sepsis. En la presente Revisión se discute la importancia de los aspectos genéticos en relación con la coagulación y el síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA).

Además, se hace notar cómo la variabilidad genética individual puede influir en pacientes traumáticos y grandes cirugías, como la cirugía cardíaca, participando en fenómenos fisiopatológicos que rodean a este tipo de intervenciones.

Finalmente, se analiza el potencial papel de los genes como tratamiento: farmacogenética y terapia génica. A la luz de los datos disponibles, será posible la utilización de marcadores genéticos que ayudarán a estratificar a los pacientes por grados de riesgo y a identificar a aquellos con un peor pronóstico. Además, la identificación de las variaciones genéticas individuales que participan en enfermedades complejas ha permitido que aumente el interés por la terapia génica.

Muchos pacientes ingresados en la unidad de cuidados intensivos (UCI) han sufrido la acción de una noxa concreta, una agresión cuantificable que, además de desencadenar fenómenos inflamatorios, puede alterar la coagulación o desarrollar síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA). Éste es el caso de los pacientes politraumatizados y los sometidos a grandes cirugías (p. ej., cirugía cardíaca). En estos pacientes existen también características genéticas que determinan la respuesta y condicionan la aparición de complicaciones y, finalmente, el pronóstico.

El conocimiento que se está alcanzando de manera paulatina sobre la genética del paciente críticamente enfermo hace que comiencen a aparecer algunos estudios que apuntan la futura utilidad de la información genética en el tratamiento de nuestros pacientes. Evidentemente, son estudios preclínicos que no ofrecen datos relevantes para la práctica clínica diaria. Sin embargo, constituyen una invitación para que el médico intensivista obtenga otro punto de vista potencialmente desarrollable sobre el tratamiento del paciente crítico.

Por otro lado, la información obtenida de los estudios genéticos debe ser

utilizada con suma cautela y regulada a través de comités éticos. La posibilidad, quizás no tan lejana, de predecir la respuesta ante la enfermedad de cada sujeto puede condicionar actitudes terapéuticas y de limitación del esfuerzo terapéutico



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que deben de estar basadas en una evidencia alcanzada a través del desarrollo de este campo de conocimiento.

El objetivo de esta segunda parte del manuscrito es demostrar que los polimorfismos genéticos (PG) implicados en la coagulación son de interés para el paciente crítico. Además, se trata de demostrar cómo traumatismos específicos (p. ej., el traumatismo craneoencefálico [TCE]) pueden ser determinados por otros PG que, quizá, pueden definirse como ―específicamente neurológicos‖. El pronóstico de las grandes cirugías pueden estar determinado genéticamente.

Se analiza también, desde el punto de vista del PG, una enfermedad clásica

en las UCI, como el SDRA. Se abordará, además, la utilidad del conocimiento genético del paciente crítico desde una doble vertiente: la farmacogenética y la terapia génica. Finalmente, se destacarán algunas consideraciones generales y limitaciones del PG en relación con nuestros pacientes. 3.21.1.-GENÉTICA Y COAGULACIÓN

Los PG que afecten a la coagulación y a la fibrinólisis pueden tener relevancia en el paciente crítico. Este concepto se analizará desde una doble vertiente: el paciente politraumatizado y la sepsis.

Inmediatamente después del traumatismo tiene lugar una elevación de las concentraciones del inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1), produciéndose un ambiente procoagulante. Menges et al1, en un estudio prospectivo, analizaron el PG consistente en la inserción/deleción (5G/4G) en la región promotora del gen del PAI-1 en pacientes politraumatizados, y su relación con el pronóstico. En este estudio observaron que las concentraciones plasmáticas del PAI-1 fueron significativamente mayores en el grupo con genotipo 4G/4G. El 84% de los pacientes homocigotos para esta mutación desarrollaron sepsis, y más de la mitad no sobrevivieron.

Estos resultados sugieren que el genotipo 4G/4G puede poseer una peor capacidad fibrinolítica que empeore la microcirculación y predisponga a la disfunción multiorgánica.

La proteína C activada (PCA) es uno de los factores principales en la regulación de la coagulación. La PCA degrada al factor V en tres segmentos. Se han descrito pacientes resistentes a la PCA cuya base molecular reside en un cambio de G por A en la posición 1691 del cromosoma 266, donde está situado el gen del factor V2. Esta mutación condiciona, a su vez, un cambio en un aminoácido (Arg506Gln), lo que determina que el factor V no pueda ser degradado en sus 3 fragmentos y mantenga, de esta manera, su actividad procoagulante. La frecuencia de estepolimorfismo puede alcanzar el 15% 268. La importancia relativa de este PG no sólo radica en la mayorpredisposición a



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presentar acontecimientos trombóticos, sino que estos pacientes podrían no responder adecuadamente si se administra PCA como tratamiento de la sepsis grave. 3.21.2.-NEUROGENÉTICA DEL PACIENTE CRÍTICO

La relación entre el TCE y el desarrollo de demencia ha permitido asociar los factores genéticos con el pronóstico del TCE. Un estudio reciente ha demostrado que el 30% de los pacientes que fallecieron en la fase aguda del TCE presentaron depósitos de Abeta-PP (AP) en el córtex cerebral, revelando diferencias significativas respecto a los fallecidos por otra causa 269. Se cree que el TCE puede estimular el depósito de proteína amiloide y facilitar un mayor deterioro neurológico. Se sabe que el alelo E4 de la apolipoproteína E constituye el mayor riesgo genético para el desarrollo de demencia tipo Alzheimer.

Partiendo de esta base, se ha estudiado el PG de esta proteína en pacientes con TCE. Nicoll et al5 demostraron que los pacientes con el alelo E4 que fallecieron a causa del TCE tuvieron depósitos de AP más frecuentemente que los pacientes sin este alelo. La frecuencia del alelo E4 en pacientes con AP fue del 0,52, mientras que en pacientes sin AP fue de 0,16 (p < 0,01). El TCE puede

considerarse un desencadenante para el depósito de esta proteína en el córtex cerebral en pacientes susceptibles portadores del alelo E4. Además, la presencia de este alelo E4 no parece relacionarse sólo con la presencia de AP. Liaquat et al 271 han medidolos volúmenes de los hematomas mediante tomografía computarizada (TC) craneal en pacientes con TCE, y han observado que los portadores del alelo E4 presentan volúmenes significativamente mayores que los portadores de otros alelos (p < 0,01). La presencia de la isoforma E4 es considerada, junto con la localización extraaxial, como un predictor independiente del volumen del hematoma.

También se han realizado estudios en relación con el pronóstico. Sorbi et al7 observaron que, en pacientes con TCE y coma prolongado después del traumatismo, la frecuencia del alelo E4 era mayor que en aquellos que recuperaron la conciencia de manera más temprana. Teasdale et al 273, en un estudio prospectivo realizado sobre 93 pacientes que sufrieron TCE, observaron que los pacientes con TCE y alelo E4 tuvieron un pronóstico significativamente más desfavorable (medido en términos de mortalidad, estado vegetativo o puntuaciones más bajas en la escala pronóstica de Glasgow) a los 6 meses del traumatismo respecto los pacientes sin este alelo (p < 0,01; tabla 1).

TABLA 1. Influencia del polimorfismo del gen ApoE en el pronóstico neurológico a los 6 meses del TCE6



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Se ha propuesto la hipótesis de que los individuos portadores del alelo E4 podrían desarrollar depósitos de AP a una edad más temprana que el resto de la población y que tendrían una mayor predisposición a fallecer a causa del TCE, motivo por el que podrían ser incluidos con más frecuencia en los estudios post mortem 9. Sin embargo, en estudios animales se ha demostrado que la AP puede sintetizarse y depositarse en pocos días 275.

Scheimeier et al 276, en un estudio prospectivo donde se analizaron la supervivencia y el pronóstico neurológico de 80 pacientes después de sufrir una parada cardiorrespiratoria, observaron que los pacientes homocigotos para el alelo E3 tuvieron porcentajes de supervivencia significativamente mayores (64 frente a 33%; p < 0, 01) y un mejor pronóstico neurológico respecto a otros genotipos, por lo que se confirió a este genotipo un efecto neuroprotector. Sin embargo, todavía no se ha confirmado este hecho en pacientes con TCE. 3.21.3.-GENÉTICA EN EL SÍNDROME DE DISTRÉS RESPIRATORIO

El paciente crítico desarrolla con mucha frecuencia una lesión pulmonar aguda que, en su máxima expresión, representa un síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA). Esta entidad es una causa importante de mortalidad en la UCI, para la cual no existe tratamiento específico.

El desarrollo del SDRA puede relacionarse con las concentraciones de citocinas en el lavado broncoalveolar (LBA). Se ha observado que los pacientes que desarrollan esta entidad presentan concentraciones de interleucina (IL) 10 significativamente menores respecto a los pacientes que sí lo desarrollan Armstrong L, et al 1997 277. De esta manera, los PG que afecten a las concentraciones de esta interleucina pueden tener relevancia clínica.

Existen, no obstante, proteínas constitutivas del surfactante pulmonar que pueden ser de interés desde el punto de vista del PG. El surfactante está compuesto por un 90% de fosfolípidos y un 10% de proteínas (SP-A, SP-B, SP-



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C, SP-D). Estas proteínas contribuyen a disminuir la tensión superficial aire-líquido para evitar el colapso alveolar. Lin et al 278 relacionaron variaciones polimórficas de la SP-B con el desarrollo de SDRA. En este estudio, la variación C/T en la posición 1580 dentro del codón 131 del gen puede determinar el desarrollo de esta entidad. La activación del sistema renina-angiotensina en la circulación y en el parénquima pulmonar podría influir en el desarrollo del SDRA. El gen de la enzima conversiva de la angiotensina (ECA) es polimórfico.

La deleción de un fragmento de 287 pb (alelo D) produce un aumento de la actividad de la ECA14. Por otro lado, los valores elevados de IL-6 se asocian con una mayor mortalidad en esta entidad. La presencia de citosina en la posición –174 del gen de la IL-6 (alelo C) se asocia con una actividad reducida del promotor y, por tanto, con unos valores plasmáticos más bajos15. Marshall et al16 analizaron la relación entre los alelos D del gen de la ECA y del alelo C del gen de la IL-6 con la susceptibilidad y el pronóstico del SDRA. La presencia del alelo D y del genotipo DD fue significativamente más frecuente en el grupo de pacientes que desarrollaron SDRA respecto a un grupo control y otro grupo en riesgo de desarrollar SDRA (p < 0,01). Además, el alelo D se asoció a una mortalidad significativamente más elevada (p < 0,02). Por otro lado, las frecuencias del alelo C y del genotipo CC fueron significativamente menores en el grupo que desarrolló SDRA (p < 0,02)

3.22.-GENÉTICA EN LA CIRUGÍA CARDÍACA

La activación, a su vez, de los sistemas celulares y humorales que ocurren en el período postoperatorio crearán un ambiente proinflamatorio o procoagulante.

En cualquier caso, los genes candidatos implicados en esta respuesta no sólo

serán los responsables de procesos inflamatorios y procoagulantes, sino que podrán influir en el metabolismo lipídico, el funcionamiento de los canales iónicos y el mantenimiento de la integridad de la membrana (Stüber F, 2002) 282.

El gen de la ECA puede presentar inserciones/deleciones en el intrón 16. Los pacientes homocigotos para la deleción en esa posición (DD) desarrollan un mayor crecimiento e hipertrofia de las cavidades izquierdas si padecen hipertensión o cardiopatía, lo que no ocurre en sujetos sanos (Kim HS, 2000) 283.

La presencia del alelo D se ha asociado, en el postoperatorio de cirugía

cardíaca, con el desarrollo de vasculopatía grave en el trasplante cardíaco (Densem CG, Pethig K, et al. 2000) 284,285.

Las variaciones genéticas en los genes que codifican los receptores de las glucoproteínas en la superficie plaquetaria puede ayudar a identificar también a



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pacientes con mayor riesgo isquémico. Mathew et al 286 son los primeros autores que han relacionado el PG de la GPIIIA con un estado procoagulante y el desarrollo de ictus después de bypass coronario

Existen pocos estudios que analicen el papel de las principales moléculas proinflamatorias en el pronóstico de la cirugía cardíaca. Martínez et al 22 analizaron los PG del factor de necrosis tumoral beta (TNF-) y de la IL-1ra en relación con la aparición del síndrome de bajo gasto tras la revascularización miocárdica con circulación extracorpórea no causado por infarto de miocardio.

Existe significativamente más riesgo de desarrollar bajo gasto en los pacientes con algún alelo G en el primer intrón del TNF-y los homocigotos A2 para el gen de la IL-1ra. La IL-6 es sintetizada en respuesta a diferentes estímulos inflamatorios. Concentraciones elevadas de esta interleucina se han asociado con el desarrollo Ridker PM, et al. 2000) 289, con la gravedad de la enfermedad coronaria Biasucci LM, 1999) 290, con una mayor inestabilidad de la placa arteriosclerótica (Biasucci LM, et al. 1996)290 y, por tanto, con un peor pronóstico. Brull et al 292 analizaron el genotipo del gen de la IL-6 en pacientes sometidos a bypass coronario y su relación con las concentraciones plasmáticas posquirúrgicas de esta citocina. Los pacientes con el PG consistente en una citosina en la posición 572 del gen presentaron valores significativamente superiores a los de otros genotipos analizados 6 h después de la intervención (tabla 2). Por otro lado, el PG E469 del ICAM-1 se ha asociado con un efecto protector de vasculopatía en el trasplante cardíaco Borozdenkova S, et al 2001 293.



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Existen otros grupos de genes candidatos sobre los cuales sólo existen

estudios preliminares. Alguno de ellos están implicados en la respuesta a las catecolaminas. Philip et al 294 han observado que el PG G894T del gen que codifica para la sintetasa de óxido nítrico se asocia a una respuesta aumentada a la fenilefrina. El polimorfismo de la ApoE se ha relacionado con la evolución de la función renal y la función neurológica después de la cirugía cardíaca (Chew ST, Tardiff BE, et al. 1997, 2002) 295,296. 3.23.-TERAPIA GÉNICA

La terapia génica constituye una nueva aproximación terapéutica consistente en transferir material genético al paciente. Este material puede ser administrado directamente a través de vectores, o indirectamente mediante la introducción de células modificadas genéticamente.

Algunos de los problemas más importantes con los que se enfrenta este tipo de terapia son la eficacia de transmisión del material genético al paciente y el mantenimiento de un nivel de expresión de duración adecuada del gen transferido

3.24.-TERAPIA GÉNICA EN LA NEUMONÍA



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El interferón gamma (IFN-y) es una de las moléculas fundamentales sobre la que gira la defensa ante multitud de patógenos respiratorios Beck JM, et al 1991

301. Algunos trabajos experimentales Koll JK, et al 1999 302 demuestran el aumento de INF- en el LBA después de la administración intratraqueal de adenovirus portadores de este gen. El incremento de esta molécula sólo se produjo localmente en el pulmón y no de forma sistémica. En este mismo estudio se ha observado que el INF-no se correlaciona con los valores pulmonares de TNF.

No obstante, los animales expuestos al adenovirus respondieron con valores 5 veces superiores de TNF al administrarles endotoxina intratraquealmente.

Además, en otro grupo de ratas a las que se expuso a Pseudomonas

aeruginosa se demostró que el aclaramiento de la bacteria fue significativamente mayor en el grupo tratado con adenovirus, probablemente en relación con un mayor reclutamiento de neutrófilos.

La IL-12 es una citocina con efectos pleiotrópicos. Se sabe que tiene importancia en la inmunidad celular contra el cáncer y las infecciones17. De manera específica, en la enfermedad pulmonar se ha relacionado con la infección por Klebsiella pneumoniae. Greenberger et al38 trataron a monos con adenovirus que contenían el gen de esta citocina antes de ser expuestos a K. pneumoniae.

Los animales tratados con adenovirus presentaron porcentajes de supervivencia superiores que los controles. A pesar de los conocidos efectos deletéreos del TNF, esta molécula participa en la defensa contra la infección pulmonar (Bonavida B., et al 1991)305.

Algunos autores (Standiford TJ, et al. 1996) 306 han demostrado que adenovirus portadores de este gen pueden ser beneficiosos en las neumonías por K. pneumoniae. Sin embargo, la aportación más importante de este estudio fue que dosis diferentes de adenovirus transgénicos portadores del gen de TNF tuvieron distintos resultados terapéuticos en cuanto a la capacidad para el aclaramiento bacteriano.

Las dosis más elevadas resultaron ser más inefectivas. La IL-17 tiene efectos

granulopoyéticos. Además, se sabe que participa en la liberación de otras citocinas proinflamatrias, como el TNF, IL-1, IL-6 e IL-1242. Se ha observado 36 en estudios experimentales que la administración intratraqueal de adenovirus recombinantes con el gen de esta citocina se traduce en un aumento de la expresión de la misma sólo en territorio pulmonar. A su vez, este mismo trabajo demuestra que esta forma de tratamiento aumenta el aclaramiento de K. pneumoniae en neumonías causadas por este microorganismo.



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3.25.-TERAPIA GÉNICA EN LA SEPSIS

Se conoce a través de modelos animales y en pacientes sépticos que el incremento de la apoptosis en órganos linfoides y las disminución del número de leucocitos en la sangre periférica se ha correlacionado con un peor pronóstico 43,44. Estudios recientes en modelos animales de sepsis han demostrado que la inhibición de la apoptosis mejora el pronóstico. En este sentido, se ha demostrado en monos con peritonitis que la hiperproducción de la proteína Bcl-2 (inhibidora de la apoptosis) mejora la supervivencia.

Oberholzer et al 45 realizaron un estudio experimental con monos, a los que inyectaron en el timo adenovirus recombinantes capaces de expresar IL-10 humana, 24 h antes de provocar una peritonitis fecaliodea.

La hiperexpresión de IL-10 en el timo incrementa la expresión de la proteína Bcl-2. In vitro, esta citocina reduce la apoptosis de las células T en parte mediada por esta proteína 46. Los animales a los que se administró el adenovirus intratímico presentaron una mortalidad significativamente menor que los tratados con adenovirus intravenoso. 3.26.-TERAPIA GÉNICA Y HEMODINÁMICA

Los defectos de la contractilidad del miocardio constituyen una enfermedad frecuente en las UCI. Los receptores betaadrenérgicos presentan un descenso significativo en el bajo gasto miocárdico. Akhter et al 313 han demostrado un aumento de la contractilidad después de la transmisión del gen humano 2-adrenérgico a través de adenovirus recombinantes en pacientes con bajo gasto. 3.27.-GENÉTICA Y RESPUESTA TERAPÉUTICA

Uno de los principales problemas al que se enfrenta la farmacología clínica es la gran variabilidad interindividual que existe en la respuesta a los medicamentos. Se ha pasado del antiguo paradigma de la homogeneidad («todos somos iguales, un fármaco se ajusta a todo tipo de pacientes») al actual de la medicina personalizada.

Está claro que diferentes pacientes responden de forma distinta a la misma medicación. Estas diferencias son mayores entre diferentes personas que en una misma persona en momentos distintos o entre gemelos homocigotos 8.

La experiencia en la práctica clínica nos revela que la administración de un mismo medicamento a diferentes pacientes a las dosis de prescripción recomendada produce respuestas distintas (eficaz en la mayoría de ellos, sin efecto en otros). Es relevante el hecho de que la gran mayoría de los tratamientos actualmente autorizados no son efectivos en todos los pacientes 9.



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Y lo mismo sucede con la toxicidad. Todos los medicamentos tienen efectos adversos potenciales que no aparecen en todos los pacientes a los cuales se les administra el fármaco. Además, los que los padecen lo hacen con diferentes intensidades. 3.28.-Factores Determinantes, de la variabilidad entre la población en la respuesta a los fármacos

Se incluyen:

A.-FACTORES GENÉTICOS

El conocimiento de que la herencia intervenía en la respuesta a fármacos vino a través del descubrimiento de reacciones farmacológicas inesperadas en individuos y en familiares. Todo ello revelaba la existencia de un patrón hereditario Meyer UA, 2000, 2002 325,326. A pesar de que el efecto de un fármaco conlleva un fenotipo complejo que depende de muchos factores, la herencia tiene una influencia importante en el efecto de un fármaco y la tolerancia de un paciente al mismo. Hoy en día se cree que la genética interviene en el 20-95% de la variabilidad en la disponibilidad de un fármaco y sus efectos Kalow W, et al 2002 327. La expresión de los genes, más que la propia dotación génica, y los polimorfismos existentes en ellos es lo que explica y condiciona las diferencias de los individuos en la respuesta a los tratamientos. B.-FACTORES NO GENÉTICOS Factores no genéticos muy variados también tienen la capacidad de condicionar la respuesta terapéutica de los individuos (tabla 1). Estos factores varían a lo largo de la vida de la persona, a diferencia de los genéticos que suelen permanecer estables. Será la combinación de unos y otros la que en definitiva marque la eficacia y la toxicidad de un fármaco en un sujeto determinado.

Durante los últimos años se han producido avances sin precedentes en nuestro conocimiento sobre la importancia de los primeros factores, los genéticos, en la determinación de la susceptibilidad personal en el grado de eficacia y tolerancia a los medicamentos, lo que ha permitido el desarrollo de una disciplina en constante progresión, la Farmacogenética.



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Si bien la Farmacogenética continua siendo una disciplina médica joven, su aplicación en la racionalización y personalización de los tratamientos es ya una realidad que se consolidará en los próximos cinco años. Su importancia creciente viene reflejada por el número de entradas que encontramos en los últimos 10 años al emplear el término pharmacogenetics mediante el sistema PubMed (30 agosto 2005) (http://www. ncbi.njm.nih.gov/entrez/query.fcgi) (fig. 1

3.29.-TERAPIA PERSONALIZADA DE LA FARMACOGENÉTICA

http://www/



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Es decir, seleccionar «el fármaco correcto, a la dosis correcta, para el

paciente indicado», determinar a priori la eficacia y tolerancia de los medicamentos para cada paciente. Todo ello permitirá evitar los retrasos en la administración de la terapia efectiva, los riesgos innecesarios de presentar reacciones adversas y los grandes gastos en tratamientos no efectivos (grandes ventajas en términos de coste-efectividad).

Y un paso más allá en el futuro de la Farmacogenética será la identificación de variaciones controladas genéticamente relacionadas con la farmacocinética y farmacodinamia, el estudio de los mecanismos moleculares causantes de estas variaciones, la evaluación de su significación clínica mediante ensayos clínicos prospectivos, el desarrollo de métodos simples de análisis del ADN y ARN para identificar individuos que puedan ser susceptibles a respuestas anormales o infrecuentes, y su integración en la práctica clínica diaria. Quizá llegue un día en que se pueda realizar en todos los pacientes un pasaporte genético que registre los genotipos relevantes, y que permita seleccionar el fármaco adecuado a su dosis óptima de acuerdo al diagnóstico del paciente, sus características y su pasaporte genético específico, estando la medicina del futurodirigida hacia la prevención y la individualización.

3.30.-REACCIONES DE FASE II (CONJUGACIÓN): ACETILACIÓN, GLUCURONIZACIÓN, SULFATACIÓN Y MUTILACIÓN

También son numerosos los ejemplos de variaciones farmacogenéticas

clínicamente relevantes en las que intervienen enzimas metabolizadoras de reacciones de tipo II Weinshilboum R, et al 2003 328. Tal es el caso de la conocida acción de la TPMT (tiopurina S-metiltransferasa) sobre la azatioprina (AZ). La AZ es un antimetabolito de la purina utilizado como inmunosupresor. Es metabolizado, en parte, por S-metilación catalizada por la enzima TPMT. La actividad de la TPMT está afectada por polimorfismo genético, teniendo el 89 % de los caucásicos una actividad elevada (HH), el 9,7 % son heterocigotos y presentan una actividad intermedia (HL), y el 0,9 % tienen una actividad muy baja de TPMT (LL).

Se han descrito al menos 100 alelos diferentes de la TPMT asociados con actividad disminuida 24. Un paciente que tenga niveles de actividad bajos o que no tenga actividad de la TPMT (LL) que reciba dosis estándar de AZ presentará concentraciones muy elevadas de su metabolito activo, bien correlacionadas con

eficacia terapéutica pero también con el riesgo de padecer mielosupresión, en ocasiones letal. Por ello, el ensayo fenotípico del nivel de actividad de la TPMT en muestras de sangre y, seguidamente, los estudios basados en el ADN han sido los primeros estudios farmacogenéticos utilizados en la práctica clínica.



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3.30.1.-RECEPTORES DE FÁRMACOS

Numerosos estudios han demostrado que variaciones genéticas pueden influir en la sensibilidad del receptor al fármaco (diana farmacológica) y, por tanto, condicionar la respuesta clínica (Evans WE, et al. 2003) 335. Se conocen al menos 25 ejemplos de variantes en la secuencia genética con un efecto directo sobre la respuesta a los fármacos.

Algunos ejemplos: el gen del receptor beta 2 adrenérgico que afecta a la

respuesta de los beta 2 agonistas, el gen de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) que afecta a los efectos renoprotectores de los inhibidores de la ECA (IECA), etc.

Es un buen ejemplo de la individualización del tratamiento en función de los

datos farmacogenéticos, recomendándose el estudio de la TPMT previo a iniciar el tratamiento con AZ. Los pacientes con genotipo de baja actividad para la TPMT tendrán que ser tratados con dosis muy reducidas si se quiere evitar la toxicidad, y en los pacientes con niveles muy altos de actividad la eficacia de la AZ estará disminuida a las dosis habituales.

Existen tablas en las que se indican, dependiendo de la actividad de TPMT,

las dosis recomendadas de AZT. El análisis del polimorfismo de la TPMT se ha convertido en la primera prueba farmacogenética clínicamente aceptada.

3.30.2.-PROTEÍNAS CON EFECTO INDIRECTO SOBRE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO

Existen polimorfismos en los genes que codifican proteínas que ni son dianas directas de fármacos ni están involucradas en su farmacocinética/farmacodinámica, pero que son capaces de producir una alteración en la respuesta al tratamiento en determinadas situaciones. Por ejemplo, diferencias hereditarias en los factores de la coagulación pueden



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predisponer a las mujeres que toman anticonceptivos orales a padecer trombosis venosa profunda o trombosis cerebral (Martinelli I, 1998) 341.

3.30.3.-OTROS ASPECTOS DE LA FARMACOGENÉTICA

La mayor parte de los rasgos farmacogenéticos que fueron identificados al principio, especialmente en cuanto a polimorfismos se refiere, involucraban a un solo gen (monogénicos) donde hay una alta correlación entre la presencia del gen afectado y la alteración.

Una de las razones por las cuales la Farmacogenética se centraba en los genes únicos es porque eran fáciles de estudiar con las técnicas genéticas clásicas y que muchos de ellos eran clínicamente importantes de hecho, algunos polimorfismos genéticos que afectan a un nucleótido único ya se han asociado con cambios sustanciales en el metabolismo o en el efecto de los medicamentos, y algunos son ahora utilizados para predecir la respuesta clínica 21. Sin embargo, la mayoría de las diferencias entre los individuos en su respuesta a los fármacos son multigénicas (por la acción combinada de numerosos genes que codifican productos muy diversos) y multifactoriales.

Esto es debido a que los efectos de los medicamentos están determinados por la interacción de varios productos genéticos que influyen en la farmacocinética y la farmacodinámica de los fármacos (la mayor parte de los fármacos son metabolizados por varias enzimas diferentes, son transportados por varios tipos de proteínas e interaccionan con una o más dianas terapéuticas).

Por otra parte, también conviene tener presente la influencia de las poblaciones en la Farmacogenética.

La investigación farmacogenética más temprana examinaba las diferencias

entre sujetos individuales, pero en su desarrollo también se ha ocupado de las diferencias genéticas entre las poblaciones (Kalow W, et al 2001) 342. Se trata de comprender que todas las variaciones farmacogenéticas estudiadas hasta hoy aparecen con diferentes frecuencias en las distintas subpoblaciones de diferentes orígenes raciales y étnicos. Incluso algunas de las mutaciones en los genes ocurren únicamente en ciertas subpoblaciones étnicas y, por tanto, marcan los orígenes y movimientos de las poblaciones en nuestro planeta. Esta diversidad étnica (geografía del gen) implica que las diferencias poblacionales y el origen étnico tienen que ser considerados en los estudios farmacogenéticos. 3.30.4.-PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE FÁRMACOS



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Existen muchas familias de proteínas transportadoras de fármacos que regulan y por tanto influyen en la absorción de fármacos, su distribución (que se acumulen más o menos en el tejido celular subcutáneo, que atraviesen o no la barrera hematoencefálica, etc.) y la excreción de los mismos y sus metabolitos (por la orina, heces, etc.).

3.31-Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y aspectos éticos

La farmacogenética es el estudio de la respuesta farmacológica del individuo

según el genotipo. Su objetivo es optimizar el tratamiento a nivel individual, ir a una terapia personalizada más segura y eficiente. En esta segunda parte de la revisión se analizan los métodos moleculares de estudio en farmacogenética que incluyen la tecnología de los microarrays o chips de ADN. Dentro de ellos destacan los microarrays para determinar la expresión génica, que detectan secuencias específicas de ARN, y los microarrays para determinar el genotipo, que detectan secuencias específicas de ADN, incluyendo los polimorfismos, especialmente los de un solo nucleótido (SNP). Se revisa la relación entre la farmacogenética, la bioinformática y sus aspectos éticos.

Figura 6. Hibridación del ADN.

a) Colocación del ADN en el microarray.



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b) Aclarado del microarray (para seleccionar el ADN hibridado). c) Observación del ADN hibridado (fig. 6).

También se utilizan moléculas fluorescentes que se unirán a la biotina, combinada, asimismo, a las sondas de ADN. La lectura de la fluorescencia y sus diferentes intensidades también se realiza con un láser escáner completando mapas de calor. Con ello se identificarán los genes y los polimorfismos que posea el paciente a través de sus muestras. Valorando todas las cuadrículas se podrán evaluar todos los varios miles de genes presentes en el array.

Conociendo la identidad de las sondas de oligonucleótidos (y la de sus genes correspondientes) por su localización en el microarray podremos identificar los genes y sus polimorfismos presentes. Basándose en el patrón de hibridación también se podrá identificar si un SNP es homo o heterocigótico.

3.31.1.-RESECUENCIACIÓN GÉNICA

Los análisis de resecuenciación génica permiten identificar el ADN de la muestra de un organismo o incluso de un virus. Es una herramienta de identificación (por ejemplo al determinar la cepa de virus en una epidemia, localizar agentes patógenos en muestras de agua o alimentos, determinar si un alimento contiene sólo ese alimento y no ha sido mezclado con otros, etc.). Son análisis bastante complicados y que se escapan del objetivo de esta revisión. 3.31.2-FARMACOGENÉTICA Y BIOINFORMÁTICA

La bioinformática es la «organización, manipulación y análisis de resultados en biología molecular y biomedicina utilizando métodos computacionales», es decir, pone orden cognitivo en la información acumulada. Aunque su origen hay que situarlo hace 30 años, es evidente que su importancia y el papel central que ahora desempeña en la investigación en biomedicina está directamente relacionado con la explosión de las técnicas de genómica. Su desarrollo se ha realizado al hilo de las necesidades generadas por la rápida evolución de las técnicas experimentales, particularmente en el caso de la genética molecular, donde la información sobre la secuencia de genes y proteínas ha requerido desde el principio la organización, almacenamiento y análisis de la información generada experimentalmente (Valencia A., 2002) 15.

En una primera aproximación, el problema al que se enfrenta la bioinformática

se relaciona con el análisis de la secuencia de ácidos nucleicos que comparten los genomas.



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Contamos en la actualidad con 31 millones de entradas en la base de datos, 45.000 millones de bases y un millón de entradas de proteínas con 310 millones de aminoácidos. Esta cantidad de datos crea problemas computacionales. Pero es que además, la biología molecular y la biomedicina generan no sólo muchos datos, sino datos muy diversos, loque plantea problemas bastante difíciles durante la generación de las correspondientes estructuras de bases de datos (métodos de almacenamiento) que deben adaptarse constantemente a los nuevos métodos.

Los dos principales centros que mantienen las bases de datos esenciales son el NCBI en EE.UU. y el EBI-EMBL en Europa, aunque muchos otros producen bases de datos focalizadas en diversos temas. Las principales bases de datos en biología molecular y biomedicina incluyen:

Por otra parte, varios sistemas públicos y privados contienen métodos para el análisis de los resultados de los microarrays de ADN, incluyendo la creación de estándares para la comparación de resultados generados por distintos laboratorios.

En el caso concreto de la farmacogenética, la aportación de la bioinformática

incluye: a) organización y almacenamiento de la información experimental generada; b) diseño de bases de datos adaptadas a la tecnología empleada en farmacogenética; c) capacidad de almacenar tanto imágenes como datos obtenidos en los estudios realizados; d) estimación de la significación estadística de los resultados; e) comparación de los patrones de expresión entre varias muestras (del mismo paciente o entre pacientes), y f ) análisis de resultados incluyendo la comparación de éstos conla información sobre funciones, enfermedades y medicamentos disponible, para predecir con una determinada fiabilidad estadística la efectividad de un medicamento y su tolerancia en un paciente determinado.

FARMACOGENÉTICA Y ASPECTOS ÉTICOS

La utilización de pruebas genéticas para diagnosticar o predecir enfermedades, para predecir la respuesta a tratamientos o valorar los posibles efectos adversos a los mismos, constituirá en un futuro no muy lejano una herramienta médica para mejorar la salud de la población a nivel individual, a partir del conocimiento de la susceptibilidad genética para padecer ciertas enfermedades o la respuesta terapéutica.

Ahora bien, la información que podría obtenerse como consecuencia de la

realización de estas pruebas genéticas plantea problemas relativos a esa misma información, a su acceso y a su utilización, pues pueden entrar en conflicto los intereses del individuo afectado con los de otras personas o entidades. Las



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inquietudes se centran en decidir quién, bajo qué circunstancias y con qué objetivos se podrán realizar pruebas genéticas tras la obtención de muestras biológicas para su realización; quién tendrá acceso a la información obtenida, a quién podrá comunicarse y en qué circunstancias, qué utilización se podrá dar a la misma y qué medidas de protección a este respecto deberían adoptarse16.

Todo ello abre un debate ético en el que, si bien se ven especialmente involucrados el diagnóstico y predicción del riesgo a padecer enfermedades (relación con los seguros de enfermedad, puestos de trabajo, etc.), también incumbe a la farmacogenómica y la farmacogenética.

Por ello, es necesaria una regulación legal que aborde estas cuestiones. El Estado español ha dado ya pasos en este sentido a través de la ratificación del Convenio del Consejo de Europa para la protección de los derechos humanos y la dignidad del ser humano con respecto a las aplicaciones de la biología y la medicina, llevado a cabo en Oviedo el 4 de abril de 1997 (BOE de 20 de octubre de 1999), y conocido como Convenio de Oviedo, que establece de forma clara que el interés y el bien del ser humano deben prevalecer sobre el solo interés de la sociedad y la ciencia. Dada la necesidad de respeto a la prevalencia de los intereses individuales y el derecho a la libertad, el proceso de realización de una prueba genética debe ajustarse a las exigencias contempladas en la Ley General de Sanidad, de 1986, entre las que se encuentra el consentimiento informado, que debe incluir información relativa a la naturaleza de los análisis, los objetivos perseguidos con la prueba y las consecuencias y posibilidades de actuación que se pueden aplicar en caso de un resultado positivo. Actualmente con el consentimiento se establece que el control de los datos obtenidos corresponde al titular. El individuo tiene derecho a decidir por sí mismo sobre la utilización de los datos con la potestad de poder acceder a los mismos, al tiempo que controla su existencia y veracidad, y autorizar su revelación. Esto consagra la prevalencia del derecho a la intimidad genética sobre cualquier otro derecho. Ninguna persona física, ni entidades públicas o privadas, deberán tener derecho a analizar la información genética de una persona sin su consentimiento. El propietario de la información genética es la persona física. Por tanto, cualquier decisión relativa a la difusión de dicha información a terceros, incluyendo los familiares genéticos, debe ser estrictamente personal 17.

La Ley Orgánica 15/1999 de Protección de Datos de Carácter Personal amplía la protección a toda clase de datos de esta índole, y no sólo a los informatizados, lo que permite su aplicación a cualquier material de origen biológico que contenga información personal identificable, y legitima la existencia de bases de datos genéticas con registros informáticos. Esto conlleva que si se establecen registros genéticos, el almacenamiento de datos debería ser voluntario y se debería garantizar la estricta confidencialidad de los mismos. Los



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responsables del sistema deben garantizar la imposibilidad de acceder a los datos genéticos y personales, su destrucción o difusión sin el consentimiento expreso de la persona titular de ellos (Moreno RF, 1994) 361.

También, tanto el Convenio del Consejo de Europa (4 de abril de 1997) sobre Derechos Humanos y Biomedicina (artículos 5, 10.1 y 12) como la Declaración Universal sobre el Genoma Humano y los Derechos Humanos (11 de noviembre de 1997) de la UNESCO (artículo 5.b), establecen que en todos los casos se recabará el consentimiento previo, libre e informado de la persona interesada, como derecho fundamental del individuo Guttmacher A, 2003 362.

En este contexto, la UNESCO promulgó en octubre de 2003 una declaración

internacional sobre protección de datos genéticos humanos, con el ánimo de evitar el uso discriminatorio de los genes que predisponen a diversos tipos de enfermedades.

Podría hacerse extensivo a su relación con la respuesta terapéutica. En

función de estas recomendaciones, en la inmensa mayoría de países europeos se están poniendo en práctica en los últimos años una serie de normativas y recomendaciones para el empleo correcto de las pruebas genéticas.

Por último, conviene tener presente que los planteamientos médicos, éticos y legales en relación con la utilización de pruebas genéticas deberán ser revisados y corregidos periódicamente a medida que avanza la ciencia y evoluciona la sociedad. La comunidad científica deberá desempeñar un papel clave en concienciar a los pacientes y, por tanto, a la opinión pública acerca del correcto uso de estas nuevas tecnologías.

3.32.-Análisis farmacogenético de la cinética de absorción de ciclosporina en una población española de pacientes trasplantados cardíacos Objetivo: Determinar el papel de polimorfi smos de nucleótido único localizados en los genes MDR1, CYP3A4 y CYP3A5 sobre la cinética de absorción de ciclosporina en pacientes trasplantados cardíacos. Método: Se seleccionó una muestra de 30 pacientes adultos sometidos a un primer trasplante de corazón que habían recibido ciclosporina como tratamiento inmunosupresor. En el primer mes después del trasplante se realizó un estudio farmacocinético a cada paciente para determinar los valores del área de concentración de ciclosporina bajo la curva de 12 h, concentración de ciclosporina en estado de equilibrio, concentración de ciclosporina máxima y el tiempo en alcanzar dicha concentración. En todos los pacientes se genotipifi



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caron los polimorfi smos de nucleótido único: MDR1 3435C > T, CYP3A4-390A > G y CYP3A5 6986A > G. Resultados: Ser portador del alelo T para el polimorfi smo MDR1 3435C > T se asoció a valores mayores de área de concentración de ciclosporina bajo la curva de 12 h (p = 0,01) y de concentración de ciclosporina en estado de equilibrio (p = 0,05), en comparación con los pacientes no portadores de dicho alelo. Discusión: Nuestros resultados muestran que las diferencias genotípicas de MDR1 3435C > T podrían explicar parte de la variabilidad interindividual en la absorción de la ciclosporina en la población española de trasplantados cardíacos.

El trasplante cardíaco continúa siendo el tratamiento defi nitivo en pacientes con insufi ciencia cardíaca terminal. La ciclosporina A (CsA) es uno de los fármacos empleados con más frecuencia para evitar el rechazo en este tipo de enfermos. Su farmacocinética, al igual que la de otros inhibidores de la calcineurina, se caracteriza por presentar una biodisponibilidad oral generalmente pobre, muy variable e impredecible, y una gran variabilidad interindividual en el metabolismo de primer paso y el aclaramiento sistémico 1. Desde hace unos años se conoce que gran parte de dicha variabilidad se debe a las diferencias de actividad en la glucoproteína P-gp, CYP3A4 y CYP3A5 2. El producto del gen MDR1 (ABCB1) es la glucoproteína P-gp, perteneciente a la familia de transportadores de membrana ABC (subfamilia B). Su actividad, dependiente de ATP, consiste en hacer de bomba para una gran diversidad de sustancias tanto endógenas como exógenas, incluidos los fármacos inmunosupresores utilizados en pacientes trasplantados cardíacos, como los inhibidores de la calcineurina, sirolimus y corticosteroides, de tal modo que elimina estos fármacos del citoplasma y los envía al espacio extracelular 3.

La familia enzimática CYP está constituida por más de 50 isoenzimas causales del metabolismo oxidativo de muchos compuestos endógenos y exógenos 4. La subfamilia CYP3A, que representa la mayoría de las proteínas CYP en el hígado humano, metaboliza más del 50 % de todos los fármacos utilizados en la actualidad 5. Está constituida por las isoenzimas CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 y CYP3A 43. CYP3A4 y CYP3A5 tienen un perfi l de especifi cidad por sustratos muy similar y son, cuantitativamente, las formas más importantes de esta subfamilia. Cuando el único (SNP) de los genes MDR1, CYP3A4 y CYP3A5 podría tener en la función de las proteínas que codifi can y, por lo tanto, en la farmacocinética de la CsA. A pesar de las evidencia acumuladas en este tiempo, continúa habiendo discrepancias en la



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interpretación clínica de los resultados de dichos trabajos 6. Uno de los factores que podría explicarlas es el origen étnico tan diverso de las poblaciones en las que se han llevado a cabo los diferentes estudios. El contexto genético de cada población es un factor de confusión que introduce grandes diferencias en las frecuencias poblacionales de los alelos de estos SNP, lo que hace difícil extrapolar al contexto de la población española los resultados obtenidos en otras poblaciones genéticamente distantes de la nuestra. Dado que, hasta el momento, no hay ningún estudio de este tipo realizado en pacientes de nuestro entorno, nos propusimos en este trabajo determinar el papel de MDR1 3435C > T, CYP3A4-390A > G y CYP3A5 6986A > G en la cinética de absorción de CsA en una población española de adultos trasplantados cardíacos. Métodos Población Se incluyó en el estudio un total de 30 pacientes de origen caucásico (23 varones y 7 mujeres) que tenían una media ± desviación estándar de edad de 43 ± 14 (18-67) años cuando se sometieron a un primer trasplante cardíaco ortotópico en el Hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba).

Todos los pacientes recibieron tratamiento con CsA, junto con corticoides, micofenolato de mofetilo o azatioprina y everolimus o sirolimus, asociado o no a tratamiento inductor con basiliximab o ATG. El tratamiento con CsA se comenzó en las primeras 24 h siguientes al trasplante a dosis de 4 mg/kg/día dividida en dos tomas. Después, la dosis fue ajustada para alcanzar un rango terapéutico recomendado para la concentración predosis de CsA (C0) de 200-400 ng/ml durante el primer mes tras el trasplante. GENOTIPIFICACIÓN

La genotipifi cación de cada SNP se realizó mediante polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Se utilizó para cada reacción de PCR 300 ng de ADN genómico, 0,2 ml de Taq polimerasa 5 U/ml, 2 ml de PCR Buffer 10x sin Mg 2+, 1,6 ml de MgCl2 25 mmol, 1,6 ml de dNTPs 2 mmol (Dominion MBL, Córdoba, España) y 1 ml (15 pmol/ml) de cada cebador (Isogen Life Bioscience BV, Maarssen, Países Bajos), todo ello en un volumen final de 20 ml de H2O. En la tabla 1 se muestran las secuencias de los cebadores utilizados para cada SNP. Los productos obtenidos en cada PCR fueron sometidos a digestión con una enzima de restricción, separados mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de agarosa al 2 % y, fi nalmente, visualizados en el transiluminador ultravioleta Gel Printer Plus (Tecnología para Diagnóstico e Investigación S.A., Madrid, España).



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MDR1 3435C > T

El ADN se desnaturalizó a 94 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos consistentes cada uno de una primera fase de desnaturalización (94 °C, 35 s), otra de alineamiento (56 °C, 35 s) y fi nalmente una de elongación (72 °C, 40 s), con una extensión fi nal de 7 min a 72 °C. A continuación, 10 ml del producto obtenido de la PCR se sometieron a digestión con 10 U de la enzima de restricción MboI y 2 ml 10x Buffer R (Fermentas, Madison, Estados Unidos) en un volumen fi nal de 30 ml durante 16 h a 37 °C. Los fragmentos de digestión correspondían a los genotipos TT (390pb), CT (390pb + 230pb + 160pb) y CC (230pb + 160pb). CYP3A4-290A > G

Se desnaturalizó en ADN de la muestra a 94 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos consistentes cada uno de una primera fase de desnaturalización (94 °C, 35 s), otra de alineamiento (59 °C, 35 s) y fi nalmente una de elongación (72 °C, 40 s), con una extensión fi nal de 7 min a 72 °C. A continuación, 10 ml del producto obtenido de la PCR se sometieron a digestión con 5 U de la enzima de restricción MboII y 2 ml 10x Buffer B (Fermentas, Madison, Estados Unidos) en un volumen final de 30 ml, durante 16 h a 37 °C. Los productos obtenidos se separaron mediante electroforesis no desnaturalizante de agarosa, en este caso, al 4 %. Los fragmentos de digestión correspondían a los genotipos GG (210pb + 175pb), AG (210p b + 175 pb + 169 pb + 41pb) y AA (175pb + 169pb + 41pb). CYP3A5 6986A > G

En el diseño de los cebadores para la reacción de PCR de este SNP se realizó una serie de modifi caciones de las secuencias obtenidas con Primer3, de modo que en el oligonucleótido en Fw se cambió un nucleótido para eliminar el sitio de reconocimiento natural de SspI y en el oligonucleótido Rev se generó un sitio que originaba el corte por dicha enzima en caso de R = A. Con cada muestra, el ADN se desnaturalizó a 94 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos consistentes cada uno de una primera fase de desnaturalización (94 °C, 35 s), otra de alineamiento (52 °C, 35 s) y fi nalmente una de elongación (72 °C, 40 s), seguida de la extensión fi nal de 7 min a 72 °C. A continuación, 10 ml del producto obtenido de la PCR se sometieron a digestión con 10 U de SspI y 2 ml 10x Buffer G (Fermentas, Madison, Estados Unidos) en un volumen fi nal de 30 ml, durante 16 h a 37 °C. Los fragmentos de digestión correspondían a los genotipos AA (167pb + 50pb), AG (217pb + 167pb + 50pb) y GG (217 pb). 3.33.-Estudio farmacocinético



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A.-Extracción de muestras. La determinación de las concentraciones de CsA se realizó con muestras de sangre total, utilizando EDTA como anticoagulante. Las extracciones se realizaron una vez que el fármaco había alcanzado el estado de equilibrio estacionario (esto es, al menos, una vez pasados 3 días sin precisar ajuste de dosis). Para el cálculo de la AUC0-12 h, los tiempos de extracción fueron 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 12 h tras la dosis matutina de CsA. B.-Método de determinación. Las concentraciones de CsA en sangre se determinaron por el método de inmunoanálisis de fl uorescencia polarizada FPIA-Axsym (Abbott Diagnostics, Abbott Park, Estados Unidos). C.-Parámetros farmacocinéticos. Los parámetros farmacocinéticos, derivados por métodos no compartimentales, fueron la máxima concentración observada (Cmáx, ng/ml), el tiempo en alcanzar la máxima concentración observada (Tmáx, h) y área de concentración bajo la curva entre las 0 y 12 h de la dosis (AUC0-12, ng/h/ml), calculada por el método trapezoidal, y la concentración plasmática en el estado estacionario (Css, Tabla 1 Secuencia de los cebadores utilizados para la genotipifi cación de los polimorfi smos analizados SNP (dbSNP) Secuencias de los cebadores MDR1 3435C

ng/ml), calculada como Css = AUC0-12 h/intervalo de dosifi cación.

También se ajustaron los valores de AUC0-12 según la dosis (D, mg/kg) y el peso (kg) de cada paciente; de este modo, se obtuvieron las variables AUC0-12/D y AUC0-12/D/peso.

3.34.-ASPECTOS ÉTICOS

El estudio fue elaborado respetando los principios fundamentales establecidos en la Declaración de Helsinki (1964), el Convenio del Consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina (1997), la Declaración Universal de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos (1997), así como cumpliendo los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. El proyecto se sometió a evaluación del Comité de Ética e Investigación Clínica del Hospital Universitario Reina Sofía. Todos los pacientes recibieron



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información acerca del estudio y se les solicitó el consentimiento informado escrito antes de entrar en él.

3.35.-ANÁLISIS DE LOS DATOS

Para examinar la homogeneidad poblacional, se analizaron las frecuencias genotípicas de los diferentes SNP, frente a las frecuencias esperadas según el equilibrio de Hardy-Weinberg, mediante el test de la x 2 con la corrección de continuidad de Yates. Se utilizó el test de Shapiro-Wilk para comprobar el grado de ajuste a un modelo de distribución normal de los valores de las diferentes variables cuantitativas. Los resultados se expresan como mediana y su variabilidad se presenta, entre paréntesis, como intervalo entre el primero y el tercer cuartil. Para los contrastes de hipótesis se utilizó el test de Kruskal-Wallis. Los valores de las diferentes variables se procesaron y analizaron en el entorno de programación libre para análisis estadístico R (GNU). Se consideró estadísticamente signifi cativos los valores de p < 0,05.

Resultados

La distribución de frecuencias alélicas de los SNP genotipificados en nuestra población era concordante con el equilibrio de Hardy-Weinberg: MDR1 3435C > T (CC, 8; CT, 16; TT, 6; x 2 = 0,386; p = 0,534; D = 0,827), CYP3A4-390A > G (GG, 26; GA, 4; AA, 0; x 2 = 1,028; p = 0,310; D = 0,134) y CYP3A5 6986A > G (TT, 27; TG, 3; GG, 0; x 2 = 2,457; p = 0,116; D = 0,075).

Debido a que el tamaño muestral era pequeño, se procedió a reagrupar los genotipos de los pacientes en función de la presencia o no de uno de los dos alelos, con el fi n de ganar potencia estadística. De este modo, en la tabla 2 se muestran los resultados del análisis efectuado para encontrar diferencias en los parámetros farmacocinéticos en función de la presencia o no de los distintos alelos mayoritarios de MDR1 3435C > T, CYP3A4-390A > G y CYP3A5 6986A > G en nuestra población. Los portadores del alelo T para el polimorfismo MDR1 3435C > T presentaron valores mayores de AUC0-12 (p = 0,01) y de Css (p = 0,05), en comparación con los pacientes no portadores de dicho alelo, sin diferencias estadísticamente signifi cativas en los demás parámetros farmacocinéticos analizados.

Tabla



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DISCUSIÓN

Hasta la fecha, los estudios destinados a analizar aspectos farmacogenéticos de la CsA no han encontrado una clara relación entre los diferentes polimorfi smos de MDR1, CYP3A4 y CYP3A5 y sus parámetros farmacocinéticos 7-9. Min et al llevaron a cabo un análisis, en 14 voluntarios sanos, de los que 11 eran de origen afroamericano y 3, caucásico, del efecto de MDR1 3435C > T y CYP3A4-290A > G en la cinética de absorción de la CsA (AUC0-24 h, Tmáx, Cmáx, t1/2 y CL/F) 10.

Encontraron que los portadores del alelo A de CYP3A-290A > G presentaron mayores valores de AUC0-24 h/D y menores de CL/F. Respecto a MDR1 3435C > T, aunque la Cmáx y el AUC0-24 h en el grupo de CT y TT fue el 15 y el 22 % mayor que en el grupo CC, ninguna de estas diferencias fueron estadísticamente

significativas. Anglicheau et al 11 estudiaron en 100 pacientes de origen caucásico, trasplantados renales y en situación estable, la infl uencia de los polimorfi smos MDR1 [—129T > C, 1236C > T, 2677G > (T/A), 3435C > T] y CYP3A5 6986A > G en los valores de concentración antes de la dosis de CsA (C0), Cmáx, AUC0-4 h, AUC0-12 h, en valores absolutos y normalizados por la dosis. Tan sólo encontraron una asociación débil entre MDR1 1236C > T y los valores de Cmáx/D y AUC0-4/D, que consideraron insuficientes para la optimización de la dosis en la práctica clínica. Ninguno de los parámetros farmacocinéticos se asoció con CYP3A5 6986A > G. Mai et al 12 realizaron, en 98 pacientes trasplantados renales de origen caucásico, un análisis retrospectivo



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del efecto de diferentes haplotipos de MDR1 en la farmacocinética de CsA en situación estable. No observaron diferencias en el análisis por haplotipos en los valores de C0, de concentración de CsA tras 2 h de la dosis (C2) ni AUC0-12 h. Kuzuya et al 13 realizaron un estudio en 97 pacientes trasplantados renales de origen asiático, en los que se analizó el efecto de MDR1 [—129T > C, 1236C > (T/A), 3435C > T]. El intervalo desde el trasplante fue de 2-17 (media, 7) años. Los parámetros farmacocinéticos analizados fueron AUC0-2 h, Cmáx y Cmín. Estos autores no observaron diferencias signifi cativas entre la dosis requerida de CsA y los polimorfi smos estudiados de MDR1.

Por otro lado, hay otros trabajos que, de igual manera que el nuestro, sí encuentran relación entre algunos polimorfi smos de MDR1, CYP3A4 y CYP3A5 y los parámetros farmacocinéticos de la CsA. De este modo, el trabajo realizado por Balram et al 14 en un subgrupo de pacientes asiáticos trasplantados cardíacos demostró que los pacientes con genotipo CC presentaban un AUC0-4 h un 11 % menor que los portadores del genotipo TT. En nuestro estudio, observamos una diferencia aún mayor, ya que los portadores del genotipo TT presentaron un AUC0-12 h un 5,3 y un 38 % mayor en comparación con los portadores de los genotipos CT y CC, respectivamente. Chowbay et al 393 analizaron, en 275 voluntarios sanos y 14 pacientes trasplantados cardíacos de origen asiático, la infl uencia de MDR1 [1236C > T, 2677G > (T/A), 3435C > T] y CYP3A-290A > G en los valores de AUC0-12 h, AUC0-4 h, Cmáx y Cmín en situación estable tras el trasplante. Estos autores encontraron que los valores de AUC0-12 h, AUC0-4 h y Cmáx fueron mayores en los pacientes que presentaban el haplotipo T-T-T de MDR1. En la misma línea, Barnard et al 16 recientemente observaron que eran necesarias dosis mayores de CsA para los portadores del genotipo CC de MDR1, frente a los portadores de CT y TT, durante 3 y 12 meses después del trasplante.

A diferencia de otros autores, no pudimos observar diferencias signifi cativas en los parámetros cinéticos analizados para los SNP de los genes CYP3A4 y CYP3A5, probablemente por una insuficiente potencia estadística debido a la baja frecuencia alélica de los SNP analizados y al menor tamaño muestral de nuestro estudio.

La variabilidad genotípica asociada a la raza/etnia de las poblaciones elegidas, el tipo de trasplante, las variables seleccionadas para el análisis farmacocinético, así como el momento tras la cirugía en el que se llevó a cabo el estudio, podrían ser factores determinantes de los diferentes resultados observados. Éstos justifi carían, al menos en parte, algunas de las discrepancias en los resultados de los estudios publicados hasta la fecha. Por ejemplo, en relación con la distribución de frecuencias de los alelos de MDR1 3435C > T se han observado grandes diferencias según la raza de la población estudiada 17. Así, en la población afroamericana es mucho más predominante el alelo C que



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en la población caucásica, lo que implica que la mayoría de las personas de origen afroamericano presentan un genotipo CC, asociado a mayor expresión de P-gp; en cambio, en asiáticos hay una baja frecuencia para el alelo C. En consecuencia, estas variaciones infl uyen en los resultados de estudios sobre la biodisponibilidad de muchos fármacos, entre ellos la CsA. Por todo ello, consideramos importante realizar un estudio sobre los factores farmacogenéticos que pueden infl uir en la cinética de absorción de la CsA basado en las frecuencias genotípicas de dichos SNP en la población española 18.

En conclusión, nuestros resultados concuerdan con los datos publicados por algunos autores respecto al polimorfi smo 3435C > T de MDR1, en el sentido de que las diferencias genotípicas de dicho SNP podrían explicar parte de la variabilidad interindividual en la absorción de la CsA observada en la población de nuestro entorno.

3.36.-METABOLISMO Y FARMACOGENÉTICA DEL TRATAMIENTO ANTIHIPERTENSIVO A TRAVÉS DE LAS ENZIMAS CYP

A continuacion, se describen las caracteristicas mas significativas de los farmacos antihipertensivos que sufren metabolizacion por el citocromo P450 segun los grupos terapéuticos (tabla 3). 3.36.1.-BETA-BLOQUEANTES

Los beta-bloqueantes se prescriben como terapia antihipertensiva de primera eleccion, sin embargo la respuesta de los pacientes a este grupo de farmacos es muy variable. Su accion antihipertensiva se debe a que reducen el rendimiento cardiaco, reducen el retorno venoso y el volumen sistolico, inhiben la secrecion de renina y un descenso general de la actividad del sistema nervioso simpatico. Metabolismo. El estudio de la farmacocinetica de la mayoria de estos farmacos nos muestra que sufren un metabolismo hepatico intenso a cargo de las enzimas del citocromo P450.

Los principios activos: betaxolol, labetalol, nevibolol, timolol y metoprolol, se metabolizan a traves de la enzima CYP2D6. El labetalol, por su parte, se inactiva por conjugación 6,28. De entre todos los beta-bloqueantes, metoprolol es el que presenta mayor dependencia de la enzima CYP2D6, ya que sufre un 70-80% de su metabolismo a través de esta ruta. El carvedilol se metaboliza principalmente a traves de CYP2D6 mediante hidroxilacion; y a traves de CYP2C9 por O-metilacion. El propranolol se metaboliza en el higado principalmente por hidroxilacion y oxidacion a través del CYP2D6, y en una pequeña parte por el CYP2C19 por N des iso propilacion.



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Las enzimas del CYP3A intervienen poco en el metabolismo de este grupo de

farmacos, y lo hacen a traves del metabolismo de bisoprolol y celiprolol. El bisoprolol se elimina parcialmente inalterado por via renal (50%) y el otro 50% es metabolizado via hepática Horikiri Y, Suzuki T, et al 1998 426. Un estudio in vitro sobre el metabolismo del bisoprolol demostro que la oxidacion en sus dos formas enantiomeras, se produce a traves de las isoformas CYP2D6 y CYP3A4.

El metabolismo del bisoprolol a traves del CYP2D6 es estereoselectivo (R>S),

mientras que el metabolismo por CYP3A4 no lo es (Horikiri Y, et al 1998) 426. A diferencia de los anteriores, los siguientes betabloqueantes no se

metabolizan por el citocromo P450: atenolol (RxList, the internet drug index) 425, esmolol, sotalol y nadolol. No se han documentado interacciones farmacocineticas entre acebutolol y otros farmacos debido a variaciones inter-individuales en la actividad de las enzimas del CYP.

Esto no es extraño, porque la biotransformacion del acebutolol a su metabolito principal diacetolol se produce por la hidrolisis de su grupo butiramida

mediante N-acetilacion y no estan involucradas las enzimas CYP Horikiri Y, 1998 426

FUENTE: Horikiri Y, 1998 426



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FUENTE: Lija JJ, et al. 2005 428

El atenolol es principalmente eliminado por via renal 427.

El metabolismo del esmolol se realiza a traves de estearasas en los gobulos rojos Lija JJ, et al. 2005 428, mientras que el nadolol se excreta inalterado 35. Segun sus propiedades fisicoquimicas el sotalol es mas hidrofilico que el resto de beta-bloqueantes. Casi el 100% se encuentra disponible en plasma ya que no sufre metabolismo de primer paso y tampoco se han identificado metabolitos activos eliminandose aproximadamente el 90% del fármaco de forma inalterada en orina 431. El uso de inhibidores del CYP2D6, como antidepresivos (fluoxetina), antiarritmicos (quinidina), antirretrovirales (ritonavir) y farmacos para la ulcera peptica (cimetidina), puede aumentar la concentracion plasmatica de metoprolol en metabolizadores lentos, disminuyendo su cardioselectividad 29. En un estudio aleman se demostro que los metabolizadores lentos del CYP2D6 tratados con



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metoprolol tenian casi 5 veces mas concentracion plasmática de este farmaco y una reduccion significativa de la presión arterial media en comparacion con los metabolizadores rapidos e intermedios 37. Por otro lado, la administración conjunta de propranolol con sustratos o inhibidores del CYP2D6 y CYP2C19 provocan aumento de la concentración sanguinea de propranolol y su correspondiente toxicidad RxList, the internet drug index 434. Farmacogenética. Un estudio holandes realizado con 1.533 pacientes en tratamiento con beta-bloqueantes revelo que los portadores homozigoticos del alelo *4 del CYP2D6 (metabolizadores lentos) tenian menos presion diastolica que los pacientes con el genotipo *1/*1 Bijl MJ, et al 2009 435.

Otro estudio demostro que los alelos *3, *10 y *41 del CYP2D6 no influenciaban la aparicion de efectos adversos en pacientes hipertensos 40; al igual que en el estudio de Shin J et al. que demuestra que las reacciones adversas causadas por el tratamiento con metoprolol se encuentran mas frecuentemente en metabolizadores lentos que en los denominados metabolizadores normales (RxList, the internet drug index, Shin J, et al 2007

437. Nevibolol es transformado en varios metabolitos activos por alquilacion, hidroxilacion, oxidacion y glucuronidacion en el CYP2D6.

En los metabolizadores rapidos el 38% de este fármaco se excreta en orina y el 44% se excreta en heces; mientras que en los metabolizadores lentos el 67% se excreta en orina y el 13% lo hace en heces Scheen AJ, Wojciechowski D, et al 2008 438,439. En un estudio canadiense se observo que los genotipos metabolizadores lentos del CYP2D6 provocaban concentraciones plasmáticas mayores de nevivolol, pero no afectaba su eficacia ni su tolerabilidad Lefebvre J, et al 2007 440.

Se han observado diferencias en la concentracion plasmática de carvedilol entre los portadores de polimorfismos de metabolizacion lenta y los de metabolizacion rapida para el CYP2D6; pero no se ha visto una asociacion clara entre los genotipos en el gen CYP2C9 y la respuesta al carvedilol,5Monografia Carvedilol, 441.

La eficacia del betaxolol en pacientes hipertensos se estudio para el polimorfismo Pro34Ser (rs1065852) del gen CYP2D6.

Este cambio de aminoacido (prolina por serina) se debe a la sustitucion de

una citosina por timina en la posicion 100 del gen CYP2D6 (100C>T) y aparece tanto en el alelo *4 como en el *10 de este gen. En pacientes portadores del alelo Pro34 la terapia antihipertensiva era mas efectiva que en los portadores homocigotos del alelo Ser. Esto puede estar relacionado con un descenso en el metabolismo del fármaco en los pacientes portadores del alelo Pro34 Minushkina LO 442.



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3.36.2.-BLOQUEANTES DE LOS CANALES DE CALCIO Este grupo de farmacos provoca la inhibicion de los canales lentos del calcio en las celulas de la musculatura lisa arterial y fibras conductoras del impulso nervioso. Metabolismo. Sufren metabolizacion hepatica el amlodipino, barnidipino, benidipino, diltiazem, nifedipino, nisoldipino, felodipino, nimodipino, lercanidipino, nicardipino. La ruta metabolica por la que se produce la oxidación de las 1,4-dihidropiridinas en piridinas es catalizada por la enzima CYP3A del citocromo P450 . El nimodipino aumenta su disponibilidad con la administración conjunta de cimetidina Furuta T, et al. 1998 448. El verapamilo sufre un metabolismo hepatico importante a traves de la isoenzima CYP3A4; aunque tambien sufre un metabolismo parcial por CYP1A2 y enzimas de la familia CYP2C Furuta T, et al. 1998 449. Farmacogenética. Se ha visto que el polimorfismo A6986G indicador del alelo *3 en el gen CYP3A5 condiciona la disponibilidad serica del amlodipino y podria ser la causa de la variabilidad observada entre distintos individuos en su respuesta Garijo B,de Abajo, et al 1999 450. Sin embargo, en otro estudio en el que se evaluaron tanto el alelo*3 del CYP3A5 como varios polimorfismos en el CYP3A4 se observo que fueron los polimorfismos en este ultimo (T16090C) y no en el CYP3A5 los que se asociaron con variaciones en la presion arterial como consecuencia del tratamiento con amlodipino. En cuanto a la variación de respuesta al verapamilo un estudio americano demostró una ligera tendencia a su asociacion con alelos del CYP3A5 en pacientes negros e hispanos pero no en caucásicos 52. 3.36.3.-INIHIBIDORES DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA Este grupo de farmacos inhiben la enzima convertidora de angiotensina II, disminuyendo la resistencia vascular periférica y reduciendo la retencion de agua y sodio. Metabolismo. Dentro de este grupo encontramos que el lisinopril no sufre metabolismo hepatico por lo que se elimina inalterado en orina 364; mientras que el captopril se metaboliza a traves del enzima CYP2D6 y en el caso del enalapril lo hace a traves de CYP3A4 365. 3.36.4.-ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II



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El mecanismo de accion de estos farmacos esta basado en su bloqueo a los

receptores de angiotensina A1 inhibiendo sus efectos relacionados con la vasoconstriccion, la liberación de aldosterona y la remodelacion vascular. Metabolismo. En este grupo solo encontramos dos fármacos que sufran metabolismo hepatico a traves del citocromo P450 y son losartán e irbesartán, que utilizan como enzima de metabolizacion el CYP2C9 379. Tanto telmisartán, olmesartán y candesartán se eliminan principalmente inalterados. Candesartán sufre O-desetilacion y telmisartán 402 se metaboliza por conjugacion, pero en estas reacciones no están implicadas las enzimas del CYP450. El valdesartán se metaboliza en un 20%, pero no se han identificado las enzimas responsables del metabolismo hepatico; aunque parecen no estar implicadas las del CYP450. 3.36.5.-BLOQUEANTES ALFA-ADRENÉRGICOS

Su mecanismo de accion esta basado en el bloqueo selectivo de los receptores alfa-adrenergicos a nivel de las fibras musculares lisas de arteriolas y venas, que produce una vasodilatación arteriolar periferica.

Metabolismo. Ninguno de los farmacos pertenecientes a este grupo se metaboliza a traves del CYP450. La doxazosina ((sufre O-desmetilacion e hidroxilacion y prazosina sufre desmetilacion y conjugacion56. No se ha encontrado bibliografia para el urapidilo. Diuréticos Su accion principal se debe a su efecto diuretico. Metabolismo. La mayoria no sufren metabolismo hepático y se eliminan inalterados en orina como es el caso de la hidroclorotiazida. La torasemida se comporta como sustrato de la enzima CYP2C9 57. La piretanida parece no sufrir metabolizacion hepática 55 y en el caso de espironolactona, se sabe que sufre un amplio metabolismo hepatico pero se desconoce su ruta de metabolización 58. Farmacogenética. Un estudio de Vormfelde et al demostro, en voluntarios sanos, que el alelo *3 del CYP2C9 es un predictor independiente de la farmacodinamica de la torasemida y que la coadministracion con irbesartán incrementa significativamente la concentracion plasmatica de torasemida 407. Discusión

Las isoenzimas del CYP (P450) pertenecientes a las enzimas de fase I son mi miembros de una superfamilia de monooxigenasas responsables del



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metabolismo oxidativo de la mayoria de los farmacos antihipertensivos. De entre mas de 30 isoenzimas humanas identificadas hasta la fecha, las responsables del metabolismo de la mayoria de farmacosson el CYP2D6, CYP3A4 y la subfamilia CYP2C 415.

En la mayoria de los casos, el tratamiento antihipertensivo se implanta de

manera empirica, siguiendo un protocolo de actuacion, en el que se van modificando las dosis y el tipo de antihipertensivos hasta que se alcanzan los valores optimos de presion arterial. Basandonos en el genotipo del paciente se podria seleccionar el farmaco mas efectivo para un paciente concreto y con un mejor perfil de seguridad. De este modo se simplificarian los tratamientos y se disminuirían los costes asociados a la medicacion; a la vez que se podrian mejorar los resultados en el paciente.

Pero antes de que la farmacogenetica se pueda aplicar de manera rutinaria en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, los polimorfismos geneticos que determinan la mejor respuesta a los antihipertensivos deben ser perfectamente identificados; para lo que se requieren nuevas investigaciones en la farmacocinetica de estos farmacos.

En este sentido, la presente revision trata de aportar datos utiles para desarrollar e interpretar este tipo de estudios. La informacion sobre este tema se encuentra muy dispersa y no tenemos constancia de que una revision sobre este tema se haya realizado hasta ahora en castellano.

De los farmacos antihipertensivos revisados todos los beta-bloqueantes se

metabolizan a traves del CYP450 excepto atenolol, esmolol, acebutolol, nadolol, y sotalol.

En cuanto a los bloqueantes del calcio todos se metabolizan a traves del CYP3A4. Para el grupo de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina solo utilizan la ruta metabolica del CYP450 el enalapril y el captopril; y para los antagonistas del receptor de angiotensina II solamente el losartán e irbesartán los hacen a traves del CYP2C9, de igual modo que la torasemida.

Los farmacos antihipertensivos son principalmente metabolizados por

enzimas del citocromo P450 y dentro de ellas las isoformas 2D6, 2C9, 2C19 y 3A4 tienen un papel especialmente relevante. No hemos constatado hasta ahora evidencias solidas de que los alelos del CYP3A5 puedan influir en la variabilidad de respuesta al tratamiento antihipertensivo. Se observa que los polimorfismos CYP mas relevantes dependen de las poblaciones estudiadas y de sus grupos etnicos, siendo en España el CYP2D6*1 y *2, CYP2C9*2 y CYP2C19*2 los mas predominantes.



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No se observan diferencias llamativas en cuanto a la distribucion de polimorfismos entre Espa˜na y otros países vecinos. Estableciendo una seleccion de polimorfismos por la relativa abundancia del alelo minoritario en poblacion caucásica y por la influencia en la variabilidad inter-individual en la respuesta al tratamiento farmacologico cabria destacar los polimorfismos rs16947 y rs3892097 indicadores de los alelos *2 y *4 del CYP2D6. Aunque menos frecuentes los polimorfimos de delecion y de duplicacion del CYP2D6 son tambien relevantes dadas sus asociaciones con los fenotipos de metabolizacion lenta y ultrarrapida, respectivamente. En el CYP2C9 seria destacable la determinacion de los polimorfismos rs1799853 y rs1057910 indicadores de los alelos *2 y *3 asi como el polimorfismo rs4244285 correspondientes al alelo *2 del CYP2C19 y el rs2740574 asociado al alelo *1B del CYP3A4.

La farmacogenetica ha puesto de manifiesto las bases geneticas para la variabilidad inter-individual en la respuesta a farmacos y seguira jugando un papel principal en la implantacion de estrategias que mejoren el tratamiento antihipertensivo. No obstante, hasta el momento no existen polimorfismos geneticos que se determinen rutinariamente en la clinica por su papel predictor de respuesta a antihipertensivos.

Viendo el desarrollo tan importante que esta mostrando la farmacogenetica de otras enfermedades como las neoplasicas no seria de extrañar que en un futuro próximo la realizacion de test farmacogeneticos en la hipertensión sea una realidad en la practica asistencial. Sin embargo, el problema principal que presenta el estudio farmacogenetico de la hipertension es el considerable numero de condicionantes que influyen en el efecto del tratamiento antihipertensivo en la presion arterial. La dieta, la función renal, y diversos estilos de vida se añaden al metabolismo hepatico como responsables finales de la presion arterial.

La objetivacion de estos factores es uno de los principales problemas para el descubrimiento de polimorfismos asociados con variabilidad de respuesta. Por tanto es fundamental la constitucion de grupos multidisciplinares que controlen cada uno de estos factores a fin de poder aislar la contribución farmacogenetica de un polimorfismo. El análisis de todos estos factores hara imprescindible el empleo de herramientas bioinformaticas. El aspecto multifactorial de la presion arterial hace necesaria la realizacion de estudios con un elevado tamaño muestral para contar con potencia estadistica suficiente. Por esta razon estos trabajos han de ser multicentricos con una rigurosa recopilacion de datos clínicos de respuesta y homogeneidad en los procedimientos de trabajo. Estos requisitos no son frecuentemente tenidos en cuenta en las publicaciones que hasta ahora aparecen en la bibliografia.



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El farmaceutico debe asumir que es una pieza integrante de este equipo multidisciplinar y su condicion de experto en farmacocinetica y farmacodinamica es fundamental en los estudios farmacogeneticos en general y del tratamiento antihipertensivo en particular. 3.37.-Impacto estratégico de la Medicina individualizada Implicaciones en la clínica de la farmacogenética

Los avances en el conocimiento del genoma humano que se han producido

en los últimos años están cambiando la forma de entender la Medicina.La investigación genética encaminada a mejorar los tratamientos de los pacientes puede enfocarse desde dos perspectivas diferentes.Por un lado, la farmacogenómica se ocupa de comprender las bases genéticas de las enfermedades para descubrir nuevas formas de tratar y prevenir enfermedades que lleven al desarrollo de nuevos y mejores fármacos. Ofrece la posibilidad de desarrollar una nueva generación de medicamentos,maximizando su eficacia y seguridad, que van a tener implicaciones importantes en la atención sanitaria.Por otro lado, la farmacogenética se ocupa de correlacionar la información genética del paciente con su respuesta a los fármacos, con la finalidad de administrar a cada paciente el tratamiento más adecuado.

La farmacogenética es una disciplina científica orientada al estudio de los aspectos genéticos relacionados con la variabilidad de la respuesta a los medicamentos en individuos o poblaciones.

Su objetivo es conseguir una medicina individualizada,es decir,administrar el fármaco más eficaz con el menor riesgo de efectos adversos y a la dosis adecuada desde el primer momento. De aquí se deduce que tiene una aplicación clínica directa. La farmacogenética posiblemente no va a revolucionar la práctica médica en el futuro inmediato, pero sí a medio plazo: en unos 10 a 20 años el desarrollo y la comercialización de fármacos con una prueba diagnóstica asociada será una práctica habitual con la que conseguiremos individualizar los tratamientos

Existe una gran variabilidad en la respuesta a los fármacos.Habitualmente,

cuando a un paciente se le diagnostica una enfermedad se le prescribe el tratamiento de primera elección, y en la mayor parte de los casos se consigue el efecto terapéutico deseado.No obstante,existe un número importante de pacientes que no responde al tratamiento o que presenta reacciones adversas. Esta variabilidad en la respuesta depende de un gran número de factores,como el diagnóstico (un diagnóstico más correcto conseguirá una mejor respuesta porque se administrará un tratamiento más específico), la dosis (con una dosis más alta se puede conseguir mayor eficacia,pero también existe un mayor riesgo de efectos adversos), las interacciones medicamentosas,otros factores médicos



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o ambientales (como la dieta o el tabaco), y unos factores idiosincrásicos que dependen de la dotación genética de cada paciente.Esta última parte de la variabilidad que se mantiene estable durante toda la vida es la que estudia la farmacogenética.

El tratamiento farmacológico hoy en día se basa en el método de ensayo- error: a cada paciente se le prescribe un fármaco indicado para la patología que presenta (normalmente el fármaco de primera elección) y de acuerdo a la respuesta o la toxicidad se cambia por otro, hasta que se da con el medicamento más adecuado para ese paciente.Todo este proceso puede llevar bastante tiempo, a parte del sufrimiento por la falta de eficacia y la toxicidad que presente el paciente. Con la Medicina individualizada se pretende que el tratamientofarmacológico vaya dirigido a cada paciente concreto. Así, después de diagnosticar a un paciente, se le realizarán una serie de biomarcadores genéticos o de otro tipo que nos ayuden a predecir con qué tratamiento se va a conseguir una buena eficacia sin efectos adversos. Del mismo modo se administrará el fármaco más eficaz y seguro desde la primera vez, con lo que evitaremos mucho sufrimiento a los pacientes y reduciremos los gastos en medicamentos inútiles. 3.38.-VARIABILIDAD EN LA EFICACIA DEL TRATAMIENTO Para que se autorice la comercomercialización de un fármaco se debe demostrar que es eficaz y seguro.

No obstante, esto no significa que el fármaco sea eficaz en el 100% de los pacientes. De hecho, si analizamos los resultados de eficacia de fármacos comercializados para diferentes patologías podemos observar que entre el 20 y el 75% de los pacientes presentan fracaso terapéutico (tabla 1), lo que conduce al derroche de unos costes innecesarios (no es lógico tratar a pacientes que no van a responder a un fármaco) y una mala calidad asistencial.Por lo tanto,es necesario desarrollar marcadores u otro tipo de pruebas que nos ayuden a predecir qué pacientes van a presentar una buena respuesta, de tal modo que sólo administraremos el fármaco a la población optimizada para la eficacia.

IV.- ANÁLISIS GENERAL 4.1.-La farmacogenética y la farmacia de hospital

Esto está contribuyendo a una presión creciente sobre los profesionales sanitarios, por parte de la sociedad, para la aplicación práctica de una serie de desarrollos científicos no siempre avalados por un nivel de evidencia suficiente.



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La bruma que afecta a la traslación de avances genéticos a la práctica asistencial dificulta aún más si cabe la labor de los profesionales de la salud

4.2.-LOS FARMACÉUTICOS Y LA FARMACOGENÉTICA Los farmacéuticos de hospital conocemos bien la dificultad de clarificar el

beneficio real de un fármaco, digamos de síntesis convencional, los intereses que dificultan, y no en poca medida, esta clarificación y estamos preparados para elaborar los informes profesionales pertinentes que posicionan a un medicamento determinado en su lógica y real situación dentro de la terapéutica.

4.3.-PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE LA FARMACOGENÉTICA ¿Qué ocurre con los denominados medicamentos biológicos?

¿Sabemos evaluarlos con el mismo rigor científico? Y no solo eso, ¿estamos preparados para cribar la información sobre la aplicación de un fármaco convencional si en la misma mediante condicionantes genéticos?

En estos primeros años del siglo XXI se está produciendo un cambio

conceptual en el abordaje del tratamiento farmacoterapéutico de las enfermedades. Este cambio no solo obedece a los avances científicos, sino también al desarrollo de los sistemas de comunicación (web 2.0) que de una forma rápida diseminan ideas en la población general, no siempre de una

manera fiable y no siempre seleccionando el binomio tipo de información-tipo

de población que la recepciona.

Si diferenciamos de una manera simplista los genes, como farmacocinéticos y farmacodinámicos, podemos ir dando respuesta a estas cuestiones. Los genes farmacocinéticos serían aquellos destinados a codificar las proteínas involucradas en el proceso ADME (absorción, distribución, metabolismo y eliminación). Algunos de ellos son viejos conocidos nuestros, como las distintas isoformas del citocromo P450, y estamos acostumbrados a considerarlos cuando valoramos la existencia de interacciones en el proceso de validación de la farmacoterapia. Otros, como los que implican a transportadores, están siendo cada vez más conocidos y entendemos la manera de valorar adecuadamente su

aportación al resultado de la terapia. Probablemente, somos los profesionales sanitarios mejor capacitados en la actualidad para discriminar acerca de la información que acompaña a los fármacos afectados por este tipo de genes farmacocinéticos. ¿Por qué? La respuesta es clara. Nuestra formación extensa e intensa en farmacocinética, superior a la de otros compañros sanitarios, nos capacita para ello. No es arriesgado afirmar que la mayoría de nosotros hemos sonreído al leer no pocos artículos «científicos» en los que se insta a emplear una determinada



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prueba genética como única posibilidad de «individualizar» el tratamiento de un paciente. Sabemos bien que la farmacocinética clínica es la herramienta idónea para la individualización posológica real y que las pruebas de un biomarcador genómico a este nivel, solo nos permiten discriminar de forma grosera sobre la capacidad metabólica media para cada uno de los polimorfismos posibles.

La hipertension arterial (HTA) es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular y un poderoso indicador de riesgo de mortalidad (American Pharmacists Association, 2005) 397.

El control de la HTA en España ha evolucionado positivamente en los ultimos

años, el porcentaje de control optimo de presion arterial (PA) en los hipertensos tratados farmacológicamente no suele superar el 30%. Asimismo, se han observado porcentajes de control inferiores a los deseados en estudios europeos y americanos Lifton RP, et al 2001398. En el tratamiento farmacológico de la HTA existe pues una gran diferencia entre los beneficios esperados y los resultados conseguidos Parody Rua E, et al 2005 399.

Es importante destacar el papel de la citocromo P450 en el metabolismo de muchos fármacos, un ejemplo de ellos son los Los farmacos antihipertensivos son metabolizados principalmente por enzimas de la familia del citocromo P450 (CYP450). La respuesta al tratamiento antihipertensivo cuya base genetica esta empezando a conocerse esta sujeta a diferencias interindividuales en los pacientes. Sin embargo debemos añadir que el estudio de polimorfismos en los genes del citocromo P450 puede contribuir a una terapia individualizada en el tratamiento antihipertensivo.

Esta falta de control de la PA puede tener distintas causas y una de ellas seria la variabilidad inter-individual en la respuesta a las terapias farmacologicas antihipertensivas, ben funcion de los distintos fenotipos metabolizadores que presentan los pacientes hipertensos (Materson BJ, 2007) 400.

La metabolizacion de farmacos como los antihipertensivos se produce

principalmente en el higado a traves de dos tipos de reacciones: las de fase I y las de fase II. Para que los sistemas enzimaticos de metabolizacion del higado puedan actuar sobre farmacos lipofilos es necesario aumentar su polaridad a traves de las reacciones de fase I. Estas reacciones suelen ser oxidaciones, reducciones o hidrolisis que introducen en la estructura un grupo reactivo que lo convierte en quimicamente mas polar. Las reacciones de fase II suelen actuar sobre el grupo reactivo introducido en la fase I mediante la conjugacion de este con moleculas tales como el acido glucuronico, el glutation o aminoacidos.

Las isoenzimas del citocromo P450 estan agrupadas en distintas familias y

tienen como funcion la de catalizar, en los microsomas hepaticos, reacciones de



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fase I de un numero importante de farmacos con estructuras químicas muy diferentes Mathews CK, et al 2002 401.

Este tipo de polimorfismos son muy frecuentes en el genoma humano. Por

esta razon existe una serie de estrategias para la identificación de aquellos SNP con implicaciones farmacogeneticas. En primer lugar estudiar aquellos SNP que esten presentes en genes que codifican para proteinas que participen en el metabolismo o sean diana de los farmacos objetos de estudio. Una vez identificados los genes de estudio se suelen seleccionar aquellos polimorfismos cuyo cambio en la secuencia de ADN comporta un cambio de aminoácido en la enzima.

En este sentido, aquellos SNP en region codificante que conlleven cambios

en la carga del aminoácido son especialmente interesantes. Sin embargo, siempre hay que tener en cuenta la frecuencia en nuestra poblacion de ese SNP en concreto; pues si se trata de un SNP cuyo alelo menos frecuente es muy poco comun en nuestra población de estudio (< 1%) tendra pocas repercusiones como prueba farmacogenetica rutinaria a menos que el efecto de ese alelo poco comun tenga efectos muy llamativos en cuanto a respuesta o a la aparicion de serios efectos adversos. Las bases de datos de SNP americana7 o europea8 accesibles gratuitamente en la Red proporcionan la informacion necesaria para orientarnos sobre la frecuencia de cada uno de los alelos de un SNP por grupos etnicos. Sin embargo, siempre es aconsejable definir la frecuencia de un SNP en un grupo control representativo de nuestra poblacion de estudio.

No hay que olvidar que algunos SNP, a pesar de no afectar a regiones

codificantes del gen, pueden tener efectos en la estabilidad de ARN mensajero o en el proceso de splicingo proceso de corte y empalme en el cual las secuencias

intronicas son eliminadas durante la maduracion de estamolecula.

Por ultimo es importante señalar que los genes que codifican para las diferentes familias enzimaticas del CYP450, presentan frecuentemente distintos alelos. Cada uno de estos alelos puede estar definido por varios SNP de los cuales al menos uno es capaz de definir ese alelo. La determinación de ese SNP por tecnicas de genotipificado se ve facilitad o por la identificacion de numero de referencia o rs. En la tabla 1 se representan los SNP definitorios de alelo mas relevantes para cada uno de los genes CYP450 con su numero rs. Este numero identifica inequívocamente este SNP y permite obtener, de las bases de datos citadas anteriormente, la secuencia que lo flanquea como paso previo necesario para el dise˜no de cebadores y sondas para su determinacion. Es recomendable asegurarse de que la misma secuencia obtenida no se encuentra en otras regiones del genoma como ocurre en el caso de los pseudogenes y quela secuencia complementaria a los cebadores no contiene polimorfismos.



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Una vez realizadas las tecnicas de genotipificado se debe comprobar que las frecuencias encontradas para los distintos genotipos estan en consonancia con el equilibrio de Hardy-Weinberg, que establece que la composicion genética de una poblacion permanece en equilibrio mientras no actue la seleccion natural ni ningun otro factor y no se produzca ninguna mutacion.

Otro ejemplo que se podría utilizar en la clínica es el de los inhibidores de la bomba de protones como omeprazol,uno de los grupos de fármacos más prescritos en el sistema sanitario. Se metabolizan en el hígado por la enzima CYP2C19,que presenta polimorfismo genético, de tal forma que los portadores de alelos CYP2C19*2 y *3 presentan muy baja actividad enzimática. Así, hay pacientes que son metabolizadores lentos (portadores de dos alelos mutados): 1-7% en raza caucásica, 14-25% en orientales y 60% en negros africanos.

Estos fármacos se utilizan asociados a antibiótico para erradicar el Helicobacter pylori en pacientes con úlcera péptica. Los metabolizadores lentos consiguen una erradicación y curación de la úlcera del 100%, frente a sólo un 60-80% en metabolizadotes intermedios y un 30-60% en metabolizadores rápidos o normales.

Para demostrar la utilidad de la Medicina individualizada en la práctica clínica

habitual Furuta et al realizaron un ensayo clínico aleatorizado en el que se incluyeron 300 pacientes con infección por H. pylori que se asignaron a recibir el tratamiento estándar (lansoprazol, claritromicina y amoxicilina) o tratamiento con los mismos fármacos pero individualizando la dosis de acuerdo a dos biomarcadores (el polimofismo de CYP2C19 y la resistencia del microorganismo a claritromicina).

Se demostró claramente que la Medicina individualizada consigue mejorar la eficacia,ya que la tasa de erradicación aumentó de 70 a 96%. Este estudio se ha realizado en población oriental, pero los resultados deberían ser similares en nuestro medio,y las dos pruebas están ya disponibles, aunque su precio todavía

puede ser un poco elevado para realizarlas rutinariamente.

De todos modos, el buscar marcadores predictores de eficacia no es tan fácil como en los casos anteriores. Podemos ver como ejemplo la predicción de respuesta a clozapina, un antipsicótico que es eficaz en el 40-60% de los pacientes que no responden a otros antipsicóticos, pero presenta un alto riesgo de producir agranulocitosis, por lo que se debe hacer un control hematológico semanal. Sería necesario disponer de marcadores de respuesta para evitar exponer a un riesgo innecesario a los pacientes que no van a responder.

Con este objetivo, Arranz et al realizaron un estudio en el que se analizaban 19 polimorfismos genéticos en 200 esquizofrénicos tratados con clozapina. La

mejor capacidad de predicción se encontró con una combinación de 6



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polimorfismos de receptores de serotonina e histamina y del transportador de serotonina.

Aun así, el valor predictivo positivo era sólo de 76% y el valor predictivo

negativo de 82%, lo que nos da una idea de la dificultad de predicción de respuesta, ya que en el mecanismo de acción de los fármacos están implicadas múltiples proteínas. Por este motivo resulta obligado analizar un gran número de polimorfismos de diferentes genes, lo que conlleva una enorme dificultad para interpretar los resultados.

Tabla 2. Ejemplos de fármacos para los que se puede determinar la población de pacientes diana mediante pruebas

farmacogenéticas predictivas

En la tabla 2 aparecen algunos ejemplos de fármacos para los que es posible determinar la población de pacientes con buena respuesta gracias a marcadores genéticos. La mayoría de estos ejemplos son de enfermedades oncológicas, campo en el que la farmacogenética está más desarrollada.

4.4.-IMPACTO DE LOS EFECTOS ADVERSOS

En el ámbito de la seguridad de los medicamentos los datos son más preocupantes. En España se ha calculado que cerca del 4% de los ingresos se deben a efectos adversos. En el Reino Unido las cifras son similares: uno de cada 15 ingresos hospitalarios se debe a efectos adversos.

En Estados Unidos cada año mueren 106.000 pacientes y 2,2 millones sufren algún tipo de lesión. De aquí podemos deducir la importante repercusión sanitaria y económica que tienen los efectos adversos. Además, los problemas de seguridad obligan a la retirada de un número importante de fármacos del mercado,que pueden ser eficaces en algunos pacientes; podemos recordar ejemplos como grepafloxacino, trovafloxacino, mibefradilo, ebrotidina, terfenadina, cisaprida, cerivastatina, etc.



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Si somos capaces de encontrar marcadores de riesgo de toxicidad evitaríamos tratar a los pacientes de riesgo, de tal modo que sólo se administraría el fármaco a la poblaciónoptimizada para la seguridad. Combinando marcadores de eficacia y seguridad seleccionaríamos sólo la población que va a responder bien, sin riesgo de efectos adversos.Ya hay algunos ejemplos de marcadores de seguridad que se están utilizando en la clínica.

Un ejemplo muy claro es del polimorfismo HLA-B*5701 como predictor de

hipersensibilidad a abacavir, un fármaco utilizado para el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, que en el 7% de los pacientes produce hipersensibilidad, y si el tratamiento no se interrumpe puede ser muy grave.

Para demostrar la utilidad de este marcador en la práctica clínica se realizó un ensayo clínico controlado,aleatorizado y doble ciego, en 1.956 pacientes que iban a recibir abacavir (estudio PREDICT-1). Se asignaron aleatoriamente al grupo de prueba farmacogenética (genotipar para HLAB* 5701 y si es positivo no tratar con abacavir) o al grupo control (tratar con abacavir de acuerdo a la práctica clínica habitual sin genotipar previamente).

Se demostró claramente que la realización de una prueba farmacogenética

prospectiva consigue reducir la incidencia de hipersensibilidad a abacavir tanto diagnosticada clínicamente (de 7,8% en el grupo control a 3,4%) como confirmada inmunológicamente con una prueba cutánea (de 2,7% a 0%). El valor predictivo negativo de esta prueba es muy alto (95,5% para el diagnóstico clínico y 100% para el diagnóstico inmunológico), lo que significa que si un paciente no es portador de HLAB* 5701 su probabilidad de tener una reacción alérgica a abacavir es muy baja. Por este motivo, las autoridades sanitarias han actualizado la ficha técnica de este fármaco para recomendar la realización de esta prueba antes de empezar el tratamiento con abacavir,y así se está haciendo en la mayoría de los hospitales españoles y de otros países europeos.

Otro ejemplo que también se está aplicando en la práctica clínica diaria en muchos centros es el de tiopurina metiltransferasa (TPMT), una enzima que metaboliza azatioprina, 6-mercaptopurina y tioguanina,fármacos que se utilizan en el tratamiento de leucemias, o como inmunosupresores en enfermedades reumáticas,enfermedad inflamatoria intestinal, trasplantes u otras enfermedades autoinmunes.Esta enzima presenta polimorfismo genético, de tal forma que un 90% de los pacientes son homocigotos normales y deben recibir dosis plenas del fármaco, un 10% son heterocigotos (la actividad enzimática está disminuida a la mitad) en los que se debe reducir la dosis a un 50%,y un 0,3% son homocigotos para la mutación (no tiene actividad enzimática), que tienen un alto riesgo de toxicidad hematológica grave, por lo que estos fármacos estarían contraindicados o la dosis se debería reducir a un 10%.



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Es práctica habitual en muchos centros medir la actividad de TPMT antes de empezar el tratamiento con estos fármacos.Esta práctica tiene las ventajas de que permite empezar el tratamiento con las dosis adecuadas, con lo que se reduce el tiempo hasta la respuesta, minimiza el número de pacientes que desarrollan mielotoxicidad (se evita un caso por cada 20 pacientes tratados durante 6 meses) y, además, se ha demostrado que es coste-efectiva.No obstante, se deben seguir haciendo controles analíticos periódicos, porque la actividad de TPMT no es la única responsable de la toxicidad.

Otro ejemplo que se podría utilizar en la clínica es del citocromo P450, un grupo de enzimas hepáticas que se encarga de eliminar la mayoría de los fármacos.Las enzimas de este grupo con un polimorfismo genético más claro son CYP2D6 (metaboliza antidepresivos, neurolépticos, bloqueadores beta, antiarrítmicos, codeína, dextrometorfán y otros), CYP2C9 (metaboliza warfarina, glibenclamida, tolbutamida, AINE, fenitoína, losartán, celecoxib) y CYP2C19 (metaboliza omeprazol, citalopram, diazepam, imipramina, propranolol y fenitoína). Los pacientes que tienen mutados los dos alelos son metabolizadores lentos o pobres, y suelen tener una mayor eficacia y una mayor toxicidad, con la

excepción de la codeína, para la que los metabolizadotes lentos presentan una falta de eficacia porque no se puede metabolizar a morfina.

El CYP2D6 metaboliza más de 100 fármacos utilizados principalmente para enfermedades psiquiátricas,neurológicas y cardiovasculares. Se han descrito más de 50 alelos diferentes, y de acuerdo al polimorfismo genético y la capacidad metabólica asociada los pacientes se pueden clasificar en:metabolizadotes lentos (tienen los dos alelos mutados y suponen el 6-8% en raza blanca, el 1% en japoneses y el 15% en nigerianos), intermedios (heterocigotos, sólo tienen un alelo mutado), rápidos (homocigotos, los dos alelos son normales) y ultrarrápidos (presentan una gran actividad enzimática porque poseen varias copias de los alelos activos y suponen el 1,5% en Escandinavia, el 7-8% en España y el 20% en Etiopía).

Actualmente existen hospitales, principalmente en Escandinavia,donde se genotipa el CYP2D6 como ayuda para elegir la dosis individual en enfermedades psiquiátricas: a los pacientes metabolizadores lentos se les administra alrededor del 50% de la dosis habitual y a los ultra-rápidos una dosis dos o tres veces superior a la habitual. En la literatura se han publicado dos casos clínicos que nos demuestran la utilidad que puede tener la farmacogenética para evitar riesgos con medicamentos.

El primero es un caso de intoxicación por opiáceos en un paciente tratado con

codeína publicado en New England Journal of Medicine en el año 2004.Se trataba de un paciente de 62 años con leucemia linfocítica crónica que presentaba un cuadro de astenia, fiebre,disnea y tos de tres días de evolución,



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que fue diagnosticado de neumonía bilateral y se trató con ceftriaxona, claritromicina y voriconazol.

Además, recibió tratamiento con codeína 25 mg/8 horas para la tos. A los 4

días presentó un cuadro de depresión respiratoria diagnosticado de intoxicación por opiáceos y que revirtió con naloxona.El metabolismo de la codeína se produce en un 80% por la enzima CYP3A4,que da lugar a metabolitos inactivos, y en un 10% por CYP2D6,que produce morfina,que es la responsable de la acción terapéutica.

En este caso se produjo una sobredosis por opiáceos porque toda la codeína

se transformó en morfina, dado que el paciente era metabolizador ultra-rápido para CYP2D6, y el CYP3A4 estaba inhibido por claritromicina y voriconazol que estaba recibiendo el paciente.

*Los porcentajes son para pacientes afectados de raza blanca, excepto para HLA-B*1502 que son pacientes asiáticos. Adaptada

de Ingelman-Sundber (2008).

Tabla 3. Ejemplos de biomarcadores farmacogenéticos como predictores de reacciones adversas

El otro caso es parecido, pero con un desenlace fatal: la muerte de un bebé por prescripción de codeína a la madre, que se publicó en Lancet el año 2006. Después del parto la madre recibió tratamiento con paracetamol-codeína durante dos semanas para aliviar el dolor de la episiotomía. La dosis inicial fue la habitual (1.000 mg de paracetamol y 60 mg de codeína de liberación retardada cada 12 horas) pero, como presentó somnolencia y estreñimiento, a partir del tercer día se redujo a la mitad (500-30 mg cada 12 horas). El recién nacido sano estaba siendo amamantado, y el día 7 presentó dificultad para mamar y estaba aletargado,el día 12 tenía la piel gris y había dejado de mamar y el día 13 murió,detectándose en la autopsia niveles altos de morfina en sangre. La explicación es que la madre era metabolizadora ultrarrápida para CYP2D6 y el



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recién nacido era metabolizador normal, pero los neonatos no tienen capacidad parametabolizar la morfina.Si se hubiesen conocido estas características esta muerte se podría haber evitado. En la tabla 3 se pueden ver algualgunos ejemplos de biomarcadores farmaco- genéticos que nos puede ayudar a evitar reacciones adversas graves. Desgraciadamente no siempre es tan fácil la predicción de la respuesta.En la mayor parte de los casos se va a requerir el análisis de un gran número de genes para encontrar una capacidad predictiva útil en la clínica diaria. VI.- DISCUSIONES

La amplitud de la recuperación inmunológica en los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana que reciben el mismo tratamiento antirretroviral y consiguen una supresión virológica sostenida es muy variable.

Desde 2005 nuestra compañía dispone de una base de datos de FG donde se incluye, por país y EC, a todos los pacientes participantes en cada ensayo y cuántos de éstos han otorgado su mFG a una determinada fecha. En los últimos 3 años se ha observado un incremento sostenido del porcentaje de pacientes que otorgan su mFG: en el mundo (56 países), este porcentaje ha sido del 61, el 65 y el 70% para los años 2005, 2006 y 2007 (septiembre), respectivamente.

Éste es el primer estudio, hasta donde sabemos, que informa del porcentaje

de pacientes participantes en EC que otorgan su mFG en España y en otros 14 países europeos.

Este estudio muestra que en España este porcentaje es similar a la media de

los países de Europa: el 73 frente al 74%. Las diferencias máximas con respecto a España la presentan 2 países que obtienen casi un 22% más de mFG (el 89%, A en tabla 1) y menos de casi el 22% (un 58%, N en tabla 1).

Se ha señalado que la FG puede producir cierta preocupación con respecto a

la posible pérdida de confidencialidad Issa AM., et al 2002 13 de unos datos estrechamente relacionados con la privacidad e intimidad de las personas. El que 3 de cada 4 participantes en ensayos clínicos en Europa (y en España) otorguen su mFG, sugiere que tal preocupación no está muy extendida, posiblemente porque los pacientes tienen confianza en que los hallazgos derivados de su participación en el estudio se mantendrán bajo estricta confidencialidad.

Las diferencias entre países no han resultado estadísticamente significativas

en relación con ninguno de los factores estudiados, excepto, si acaso, el del



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porcentaje de religiosidad. El hecho de que no se hayan encontrado diferencias estadísticamente significativas en grupos de países con marcadas diferencias, tanto desde las perspectivas sociopolítica y cultural como de los propios sistemas de salud, y que se haya obtenido un notable promedio en la obtención de mFG a escala europea (74%), induce a pensar que, una vez que el paciente ha tomado la decisión de participar en el EC, no le plantea mayores problemas participar también en el de FG.

En este sentido, y de los escasos datos disponibles se desprende que la

actitud de los médicos y pacientes es positiva hacia la FG14. Ahora bien, téngase en cuenta que en el desarrollo de nuevos fármacos los subestudios de FG no tienen una aplicación directa sobre el paciente que otorga su mFG, a diferencia del estudio antes mencionado (Rogausch A., et al. 2006) 14, donde a los pacientes se les preguntaba sobre la realización de una prueba de FG relevante para la toma de decisiones sobre su propio cuidado. El altruismo, repetidamente descrito (Cassileth BR., Lee SJ., et al, 1982 123,126 como motivación para que los pacientes participen en los EC, bien pudiera ser una razón de peso para aceptar.

Las variaciones interindividuales en la respuesta a los fármacos pueden deberse, entre otros factores, a los efectos de la edad o el sexo, a alteraciones de la función hepática y/o renal, o a interacciones medicamentosas. Sin embargo, en la actualidad está claramente establecido que muchas de estas variaciones están determinadas genéticamente. Las primeras evidencias de la respuesta genéticamente determinada a los fármacos fueron la hemólisis observada durante el tratamiento con antimaláricos (primaquina, sulfonamidas), que se debía a un defecto enzimático en la glucosa- 6 fosfato deshidrogenasa Ayuso JL, et al. 1994 139

Según los datos del V Congreso Nacional sobre Sida, en España el 70% de

los infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son adictos a drogas por vía parenteral (ADVP), y muchos de ellos están en tratamiento concomitante con antirretrovirales y otros fármacos (antibióticos, psicofármacos, etc.) debido a infecciones oportunistas o a problemas psicológicos derivados (Ayuso JL., et al. 1994) 139.

Entre las toxicidades agudas y crónicas destacan, entre otras, reacciones de hipersensibilidad 4, nefropatía (Berns JS, et al 2006)132, lesión hepática (Núñez M., et al. 2006)133 y también la aparición de síndrome de redistribución grasa y de distintas alteraciones metabólicas que lo acompañan (Mallon PW., Oh J., et al. 2007) 134,135.

La farmacogenética es la ciencia que estudia las variaciones interindividuales en la respuesta y la toxicidad debida a fármacos gobernadas por variaciones en la composición genética de las personas, es decir, cómo las características genéticas de la persona influyen en los efectos favorables y adversos de un



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determinado tratamiento. En la revisión de la farmacocinética de los antirretrovirales y de la metadona aparece el citocromo P450 y la glucuronidación como principales mecanismos de biotransformación de estos fármacos. La mayoría de estudios con citocromo P450 se han realizado in vitro, aunque in vivo pueden dar resultados completamente diferentes.

Hasta la fecha no hay descritos suficientes estudios farmacocinéticos y

farmacodinámicos que nos ayuden a predecir o evaluar las posibles interacciones de los antirretrovirales con otros fármacos, pudiendo así optimizar los tratamientos y reducir la toxicidad o los efectos de la interacción. La mayoría de las interacciones descritas son más el resultado de casos aislados que de amplios estudios de seguimiento y, teniendo en cuenta que la mayoría de estas interacciones sólo se han comprobado in vitro, sería conveniente plantearse la realización de estudios con un número mayor de sujetos y en un mayor espacio de tiempo.

Las recomendaciones a seguir en cada caso particular tendrán que ser

valoradas por el profesional sanitario. Es preciso puntualizar que sólo existen casos comunicados de este tipo de interacción in vivo con el efavirenz, nevirapina, amprenavir, nelfinavir, ritonavir y zidovudina. Con el indinavir y saquinavir parece no existir esta fuerte interacción con la metadona, por lo que podrían ser los más seguros en este tipo de pacientes. Cuando se tenga que aumentar la dosis de metadona, se recomienda hacerlo de forma progresiva hasta la estabilización del paciente.

6.1.-PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES

Aunque todavía se encuentra en un estadio muy temprano, la genética aplicada al paciente crítico transformará nuestra práctica clínica diaria en un futuro próximo. Las variaciones individuales que permiten una respuesta diferenciada ante una agresión se encuentran determinadas por el orden y la intensidad de la síntesis de mediadores de la inflamación y moléculas que permiten la comunicación inter e intracelular, todo ello condicionado por la activación de los genes implicados en la respuesta celular a la agresión.

El desarrollo de la biotecnología adecuada para identificar variaciones en el genoma que resulten determinantes está favoreciendo una perspectiva de trabajo donde será posible reconocer, por ejemplo, a aquellos pacientes con riesgo de desarrollar sepsis grave una vez diagnosticada una infección. También permitirá el desarrollo de nuevos biomarcadores que pueden ser utilizados para identificar a pacientes en los que se pueden aplicar terapéuticas específicas o que presentan un perfil de respuesta mejor o peor a los fármacos disponibles. Además, pronto será posible conocer, en un determinado momento y según un estímulo, cómo es la respuesta celular al estrés, utilizando la técnica basada en los ―microarrays‖, que permite analizar en un instante el estado funcional de



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miles de genes. Esta técnica también permite medir el tipo de ARN expresado en diferentes tejidos 48. No obstante, existen algunas limitaciones que es necesario tener presentes, y que describimos a continuación.

6.2.-RECOMENDACIONES SOBRE ESTUDIOS GENÉTICOS

Por el momento, no existe ninguna legislación de rango europeo ni nacional que regule específicamente los aspectos relacionados con la genética en el ámbito de la biomedicina. No obstante, existen múltiples recomendaciones, declaraciones y códigos emitidos por distintas organizaciones sobre los aspectos éticos y sociales relativos a la información genética (UNESCO-1997, Convenio relativo a los derechos humanos y la biomedicina). (Oviedo, 4 de abril de 1997, Genetic Interest Group, 2001, National Bioethics Advisory Commission (NBAC-2001) Spear BB, et al. 2002. 193, 194, 229

En todos estos documentos se recogen comentarios y consideraciones sobre los conflictos éticos, legales, sociales y económicos asociados a diversas modalidades de investigación genética, tanto en el campo de la biomedicina como en otros (p. ej., aplicaciones industriales, modificación de organismos). Si bien se han tenido en cuenta algunas de las reflexiones en ellos contenidas, su análisis pormenorizado supera los objetivos concretos de este trabajo. VII.-CONCLUSIONES

A.-La individualización del tratamiento es necesaria para mejorar la eficacia y la seguridad de los fármacos, y será uno de los principales cambios en la práctica de la Medicina en los próximos 10-20 años. La farmacogenética es el camino hacia la Medicina individualizada, y ya está llegando lentamente a la clínica para ayudar a seleccionar el fármaco más adecuado, a la dosis más adecuada para cada paciente concreto. Como en la mayoría de los casos el efecto de los fármacos es poligénico se debe seguir investigando para buscar los biomarcadores adecuados y demostrar su utilidad en la práctica clínica diaria. B.-El número de estudios farmacogenéticos está aumentado rápidamente 68 y se plantea la cuestión de si estamos preparados para aplicar los resultados a la práctica clínica. Actualmente, la mayoría de estudios se ha centrado en el efecto de polimorfismos en un solo gen. Sin embargo la respuesta farmacológica es más compleja con la participación de múltiples genes relacionados entre ellos y con factores no genéticos. El principal objetivo del proyecto HapMap fue crear una base de datos de las variaciones genéticas existentes en el genoma humano 69. Una vez que se conozca un número elevado de polimorfismos en múltiples genes y su frecuencia en diferentes grupos étnicos, podrán utilizarse para relacionar la ―huella genética‖ de cada individuo con su perfil de respuesta al tratamiento más probable. Todavía queda trabajo por hacer, y la aplicación



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sistemática de los tests genéticos al tratamiento de la infección por el VIH en un futuro próximo parece poco probable. Sin embargo, tests farmacogenéticos concretos para situaciones clínicas determinadas son una realidad. C.- La farmacogenética permite asociar los polimorfismos genéticos con la capacidad de respuesta de un paciente a un determinado medicamento. Los agentes quimioterápicos en general presentan un estrecho margen terapéutico, por lo que la variabilidad interindividual en su metabolismo determina tanto su eficacia como su seguridad. D.- Con respecto a la terapia antirretroviral se concluye que existe pues una notable variabilidad interindividual en la respuesta y la toxicidad debidas al tratamiento antirretroviral E.- Las Interacciones farmacocinéticas entre medicamentos antirretrovirales en pacientes HIV, con otros fármacos como metadona son los mas frecuentemente usados F.- El desarrollo de la farmacogenética para reducir esta variabilidad en la eficacia ya está dando sus primeros frutos, pero será uno de los principales cambios de la práctica de la Medicina en los próximos 10-20 años. G.- La utilidad de la Medicina individualizada en la práctica clínica es habitual y avisora mucho futuro. H.- Se ha demostrado claramente que la Medicina individualizada consigue mejorar la eficacia, ya que la tasa de erradicación aumentó de 70 a 96%. I.- Hasta la fecha no hay descritos suficientes estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos que nos ayuden a predecir o evaluar las posibles interacciones de los antirretrovirales con otros fármacos, pudiendo así optimizar los tratamientos y reducir la toxicidad o los efectos de la interacción.

J.-La mayoría de las interacciones descritas son más el resultado de casos aislados que de amplios estudios de seguimiento y, teniendo en cuenta que la mayoría de estas interacciones sólo se han comprobado in vitro, sería conveniente plantearse la realización de estudios con un número mayor de sujetos y en un mayor espacio de tiempo.

K.- La genética aplicada al paciente crítico es un área de conocimiento con

entidad propia que se encuentra al inicio de su camino, pero que progresa a gran velocidad.



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