TRABAJO PRÁCTICO N° 2TRABAJO PRÁCTICO N° 2•MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO• SIEMBRA Y TRANSPLANTESIEMBRA Y TRANSPLANTE

Lic.Soria Josè

MEDIOS DE CULTIVO.

• Definición: es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para el desarrollo y la supervivencia del microorganismo.

• CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.

• Los cultivos pueden ser:• a) puros o axénicos• b) mixtos

Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento

microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono

Un solo tipo de microorganismo

Varios tipos de microorganismo

Clasificación de Microorganismo según su fuente de energía y fuente de carbono

Composición de los medios de cultivos

• 1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementosb) Micro elementos o trazasc) Factores de crecimiento

• 2. Agua

• 3. Agentes solidificantés:

1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos

Fuente de Carbono

Fuente de nitrógeno

CO2 para autótrofos,

azúcares para heterotrofos

“Se necesita el carbono para la construcción de muchas moléculas necesarias para la célula”

“El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared”

NO3-, NH3 ó N2. (autótrofos)

Aminoácidos y proteínas

1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos

Azufre

calcio, magnesio y potasio

sodio

Producir aminoácidos (cisteína y metionina) y diferentes coenzimas

SO42-, tiosulfato o sulfuro

Fuente de: Se adiciona como: La célula lo utiliza para:

Fósforo Fosfatos de sódio o potasio

Funciona como BufferPara producción de ATP, fosfolipidos y Ac Nucleicos

sales inorgánicas Co factores de enzimas

Na ClEstabiliza la

presión osmótica

1. Elementos energéticos y constitutivosb) Micro elementos o trazas

Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura de las enzimas, vitaminas, transportadores de electrones como citocromos. Son contaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios de cultivo.

Frecuentemente esenciales:

Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn

Inhibidores del crecimiento:

Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

1. Elementos energéticos y constitutivosb) Factores de Crecimiento

Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula

Si la secuencia de producción enzimática, de un determinado componente.(Por ej: Histidina) esta interrumpida por alguna alteración, este componente no

podrá sintetizarse por la célula y se convertirá en un factor de crecimiento.

Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, como las del complejo B algunos aminoácidos ,purinas y pirimidinas

2. Agua

•El agua representa el 80-90% del peso total de una célula

•Es fundamental para la realización de todos los procesos metabólicos

•Funciones enzimáticas, solvatación de materiales orgánicos e inorgánicos, y donación de electrones para organismos fotosintéticos

En los medios de cultivo se usa agua destilada,

libre de iones como Ca2+ y Mg2+

3. Agentes solidificantésCuando se agregan a un medio de cultivo permiten aislar colonias bacterianas. El mas utilizado es el Agar. Su uso es opcional

Placa de petri

Se adiciona el medio de cultivo con agar fundido

El agar se enfríay se solidifica

Permite aislarColonias bacterianas

El AgarEl Agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato.

Se usa sin problemas en medios de cultivo porque las bacterias NO lo digieren.

Sus características:Sus características:

-Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.

- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre.

-No es tóxico para las bacterias

-Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!!

- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.

Condiciones Físicas de un medio de cultivo

Temperatura

Presencia de oxígeno

a) aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer.

b) anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico.

c) anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en condiciones aerobias como en condiciones anaerobias

d) microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2.

e) anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 y si son expuestos al O2 no mueren.

mesófilos: 35-37°Cpsicrófilos: 15-20°Ctermófilos: 50-60°C

presión osmótica

Humedad:

luz:

pH:

la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl

es importante para los microorganismos fotosintéticos

Los microorganismos necesitan un ambiente húmedo para su desarrollo

la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOCLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su origenPor su origen

químicamente definidos o sintéticos

naturales o complejos

Su composición química se conoce con exactitud, cada

componente es de alta pureza analítica y realiza un aporte específico ej: medios para

autotrofos

Se preparan a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal

de composición química no rigurosamente constante: leche,

suero, macerado de maíz,etcEj: medios para quimioheterotrofos

Ej. Medio Definido para fototrofos:

CO2 ……………………….. (fuente de C)NaNO3 …………………… (fuente de N)Na2SO4 ……………………. (fuente de S y Na)KH2PO4 ……………………. (fuente de P y K)Trazas ……………………… variasH2O ………………………… (indispensable para toda función celular)

Conjunto de sales, Especificas Para un

determinado tipo de

microorganismo

Ej- agar nutritivo (para bacterias quimioorganotrofas)

Peptona de carne ………….. 0.5 gExtracto de carne ………….. 0.3 gNaCl ………………………… 0.5 gAgar ……………………… 1.5 – 2 gAgua destilada ……………. 100 ml

Aditivos que no tienen una Composición nutritiva definida

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOCLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su ConsistenciaPor su Consistencia

Líquidos sólidos semisólidos o blandos

No contienen solidificante

y no permiten el aislamiento

de colonias

incluye agar al 0.3%

Incluyen agar en concentraciones

de 1.5 a 2%

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOCLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su ComposiciónPor su Composición

Comunes Enriquecidos

incluyen una fórmula nutritiva básica que

permite el crecimiento de microorganismos

poco exigentes.

Tienen una alta calidad nutritiva por el agregado de componentes muy

ricos como leche, sangre, huevo, líquido, etc. Se utilizan en el cultivo de

bacterias exigentes

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOCLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su función:Por su función:

Medios de enriquecimiento:

son medios líquidoslíquidos que favorecen

la multiplicación de un determinado microorganismo.

Medios selectivos Medios diferenciales

son medios sólidossólidos que favorecen

la multiplicación de un determinado microorganismo.

permiten discriminar entre diferentes tipos de bacterias

basándose en características metabólicas particulares

de cada uno.

PARTE B: SIEMBRAS Y REPIQUES

Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo.

Medio de cultivoMuestras

Trasplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro.

¿Con qué se siembra?¿Con qué se siembra?

Ansas en anillo y un ansa recta

Siembra en placa con medio solido

Crecimiento deColonias bacterianas

Espátula de Drigalski

¿Con qué se siembra?¿Con qué se siembra?

Siembra

Crecimiento deColonias bacterianas

Micropipeta o Pipeta pasteur

Micropipeta Pipeta pasteur

Técnica aséptica para siembras y repiques

A- se esteriliza el ansa a la llama

B- se sostiene el ansa con el índice. Luego con el meñique .se destapa el tubo de muestra .

La "Técnica aséptica" Técnica aséptica" tiene un doble objetivo:

a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos y

b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador

E- se flamea el tubo, paraEvitar su contaminación

F- se tapa con el dedo meñique

C. Se flamea la boca para evitar Contaminación

D- se sumerge el ansa para tomarUn inoculo del tubo