trabalho de conclusão de curso - biblioteca digital de ...€¦ · 2. introdução a cafeína é a...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E PATOLOGIA
BÁSICA
Trabalho de Conclusão de Curso
Avaliação in vitro e in vivo do efeito da cafeína no metabolismo ósseo e
atividade funcional de células osteoblásticas da medula óssea de ratas
ovariectomizadas.
Aluna: Carolina Alves Freiria de Oliveira
Orientadora: Karina Fittipaldi Bombonato Prado
RIBEIRÃO PRETO
2018
Trabalho de conclusão de curso
1
1. Resumo
A remodelação óssea garante a renovação do tecido ósseo e o armazenamento de
moléculas essenciais como o cálcio e o magnésio. O processo envolve a atuação de
proteínas, hormônios e outras substâncias capazes de ativar o funcionamento de
osteoblastos e osteoclastos. Um desequilíbrio neste processo pode causar a osteoporose,
uma doença cada vez mais frequente em uma população que atualmente tem maior
longevidade e que provoca, principalmente em mulheres com redução na carga
hormonal, a perda de densidade óssea. O fator nutricional tem influência no
desenvolvimento da osteoporose, entre eles o hábito de consumir café, muito presente
na vida do brasileiro. A cafeína encontrada nesta bebida é amplamente encontrada em
diversos outros produtos consumidos pela população e tem grande importância
econômica. Considerando isso, o projeto tem por objetivo avaliar o efeito in vitro e in
vivo da cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea em um
modelo experimental de osteoporose. Para os ensaios in vitro e in vivo, ratas da
variedade Wistar foram submetidas ao processo de ovariectomia bilateral de acordo
com protocolos experimentais bem estabelecidos na literatura. Após 60 dias do processo
cirúrgico, células da medula óssea foram coletadas do fêmur das ratas e colocadas em
garrafas com meio de cultura adequado para estas células. Após a confluência, as
células foram cultivadas em placas de 24 poços e divididas em quatro grupos
experimentais: 1) controle/C (sem indução da osteoporose e sem adição da cafeína no
meio); 2) controle/Cc (sem indução da osteoporose e com adição de cafeína ao meio); 3)
ovariectomizado/OVX (sem adição de cafeína no meio); 4) ovariectomizado/OVXc
(com adição de cafeína no meio). Após os tempos experimentais, foram analisados os
seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total,
Trabalho de conclusão de curso
2
atividade de fosfatase alcalina, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e
expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo
real. Os experimentos in vivo foram realizados após a administração diária por 30 dias
de 50 mg/kg de cafeína por meio de sonda gástrica após 30 dias de ovariectomia para os
grupos Cc e OVXc e água para os grupos C e OVX. Após a eutanásia, os fêmures foram
coletados para avaliação histológica e histomorfométrica das epífises proximais dos
fêmures. Os dados obtidos mostraram que a cafeína apresenta influência sobre a
atividade celular refletindo na qualidade de tecido ósseo femoral, não prejudicando a
formação e manutenção do tecido ósseo em uma situação de osteoporose.
2. Introdução
A cafeína é a substância psicoativa mais usada no mundo (Yang et al., 2010). De
grande importância na economia nacional, está presente no café, no chá, no chocolate e
em medicamentos contra a dor de cabeça e alergia e até mesmo em suplementos
alimentares (Hogan et al., 2002). Esta substância é usada para promover a vigília,
melhorar o humor e a cognição e produzir efeitos estimulantes (Haskell et al., 2005).
Segundo Migliardi et al. (1994), pode ser usada para tratar a apneia precoce neonatal e
como coadjuvante anestésico. Em pequenas doses pode provocar alguns efeitos
psicológicos como euforia, aumento da atenção (Lieberman et al., 1987) e em
quantidades elevadas produz náuseas, tremores, ansiedade e nervosismo (Daly et al.,
1998). Entre os produtos nutricionais, a concentração deste alcalóide natural é maior no
café, apesar de poder ser encontrado em folhas de chá e outras plantas. Segundo Cano-
Marquina et al. (2013), a quantidade de cafeína em uma xícara de café é influenciada
pelo seu método de preparação (e.g. 60 mg no café torrado, 3mg no descafeinado e até
300 mg no café expresso). A cafeína foi acusada por muito tempo de ser responsável por
Trabalho de conclusão de curso
3
causar males a saúde tais como hipertensão arterial, infarto do miocárdio, câncer,
hiperglicemia e derrame, sendo relacionada até mesmo com casos de óbito (Snel et al.,
2009) e possíveis alterações genéticas (Yang et al., 2010), fazendo com que o consumo
do café fosse até mesmo condenado.
No entanto, alguns estudos recentes revelaram que muitas vezes não há
associação entre o consumo de cafeína e essas doenças. Boekema et al. (1999) sugerem,
por exemplo, não haver associação entre ingestão de café e a formação de úlceras
estomacais. Com isso, vê-se a necessidade de estudar mais essa substância ainda não tão
explorada, apesar de seu amplo consumo.
Ao mesmo tempo, a osteoporose é uma doença cada vez mais comum na
sociedade com cerca de 300 milhões de pessoas afetadas (Merheb et al., 2014). Essa
doença se caracteriza pela desregulação do processo de remodelação óssea em que a
formação do tecido ósseo por osteoblastos é inferior à quantidade reabsorvida por
osteoclastos. A osteoporose pode ser primária ou secundária, se desencadeada por outro
tipo de doença. Uma causa recorrente é a diminuição da produção de hormônios como
estrógeno em mulheres após a menopausa. Estima-se que uma em cada seis mulheres
brancas terão fratura no osso do quadril durante a vida (Cummings et al., 1989). Tais
lesões provocadas pela perda de densidade óssea podem levar ao desconforto, dor,
redução na qualidade de vida e até mesmo aumentar o risco de morte no primeiro ano de
fratura (Le Blanc et al., 2011; Haentjens et al., 2010). O enfraquecimento do tecido
tende a ocorrer em ossos longos como o fêmur, mas em estágios mais avançados da
doença é possível que se tenha perda da densidade óssea até mesmo em ossos menores
da face como a mandíbula e as maxilas o que pode levar a perda dos órgãos dentais
(Merheb et al., 2014). Seu tratamento é feito com moduladores de receptores de
estrógeno, bifosfonatos e calcitonina, o que impede a reabsorção óssea.
Trabalho de conclusão de curso
4
Existem muitos dados controversos na literatura sobre os efeitos da cafeína no
organismo. Por aumentar a excreção de cálcio pela urina, seu consumo exagerado pode
diminuir a densidade óssea e favorecer a ocorrência de fraturas por osteoporose
(Folwarczna et al., 2013). Por outro lado, estudos epidemiológicos sugerem que o
consumo de café pode contribuir para a prevenção de várias doenças crônicas como
diabetes tipo II, mal de Parkinson e cirrose hepática (Higdon et al., 2006). Além disso,
alguns estudos têm demonstrado que não se tem associação entre o consumo de café e o
risco de se ter fraturas ósseas. Folwarczna et al. (2013) mostraram que a administração
diária de 20 mg de cafeína por 4 semanas provocou aumento da densidade mineral
óssea da tíbia de ratas ovariectomizadas.
Sendo assim, é interessante a realização de novas pesquisas envolvendo os efeitos
da cafeína em células do tecido ósseo para verificar seus possíveis efeitos e aplicá-los
no tratamento e prevenção de doenças como a osteoporose.
3. Objetivos
A osteoporose é uma doença comum e preocupante na atualidade. A cafeína é
uma substância amplamente encontrada em diversos produtos existentes no mercado,
porém não muito explorada quanto ao seu potencial de atuação no tecido ósseo. Alguns
estudos apontam que ela pode alterar o metabolismo de osteoblastos, podendo amenizar
um quadro osteoporótico, dependendo da dose administrada. Dessa forma, o objetivo
desta investigação foi avaliar o efeito in vitro e in vivo da cafeína no metabolismo do
tecido ósseo femoral assim como de células osteoblásticas da medula óssea de ratas
previamente ovariectomizadas, por meio dos seguintes parâmetros:
Ensaios in vitro:
Trabalho de conclusão de curso
5
-Viabilidade celular (MTT);
-Atividade de fosfatase alcalina;
-Detecção in situ de fosfatase alcalina
- Quantidade de proteína total;
-Detecção e quantificação de nódulos mineralizados.
-Expressão de genes relacionados ao metabolismo ósseo.
Ensaios in vivo:
-Análise histológica qualitativa das epífises proximais dos fêmures de ratas
ovariectomizadas.
-Análise quantitativa da porcentagem de trabéculas ósseas nas epífises proximais dos
fêmures de ratas ovariectomizadas.
3. Material e Métodos
3.1. Animais Utilizados
Foram utilizadas ratas Wistar pesando aproximadamente 300g. Os animais foram
procedentes do Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão Preto. Eles foram
tratados com ração especial para roedores e água filtrada Ad libitum. Foram separados
em duas caixas grandes com cama de maravalha nas dimensões 41 x 34 x 16 cm, em
número de três por caixa. A temperatura do local de alojamento dos animais é mantida à
23,5-24,5 ºC, controlada por condicionador de ar quente/frio de janela, além de um
sistema de exaustão de ar. Os animais foram mantidos no Biotério da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto-USP.
3.2. Indução da osteoporose - Grupo Tratado
Trabalho de conclusão de curso
6
Os animais foram ovariectomizados bilateralmente. Primeiramente eles foram
pesados e então anestesiados com a solução anestésica de Coopazine (Xylazina) -
sedativo, analgésico e relaxante muscular; e Dopalen (Ketamina)- anestésico geral,
fornecido pela Agibrands do Brasil LTDA- Campinas, SP, Brasil, na proporção de
75mg/Kg de Ketamina e de 10mg/Kg de Xylazina, injetada por via intraperitoneal.
Também foi feita a aplicação em ambos os olhos dos animais, durante a cirurgia, de
uma gaze estéril embebida em soro fisiológico a 0,9% com o objetivo de prevenir o
ressecamento das córneas.
Após a anestesia os animais foram submetidos à tricotomia das regiões laterais.
Foi feita a assepsia dos locais a serem incisionados com álcool iodado (PVPI). Foram
realizadas incisões cutâneas bilaterais, sendo o tecido muscular divulsionado para a
exposição dos ovários e excisão dos mesmos (Kalu, 1991). Procedeu-se a sutura dos
tecidos com fio de seda 4.0 (Ethicon, Johnson & Johnson, São José dos Campos, SP,
Brasil) de modo a fechar devidamente as margens do retalho. Em seguida, cada animal
recebeu, via intramuscular, uma única dose de 24.000UI/Kg de peso de penicilina
(Pentabiotic Veterinário Pequeno Porte - Fort Dodge®, Campinas, SP, Brasil), como
pode ser visto na Figura 1. Os animais foram mantidos em número de três por caixa, por
sessenta dias e receberam ração e água “ad libitum”. Os animais operados ficaram sob
observação constante, sendo feita a limpeza de suas caixas, com troca da maravalha, três
vezes por semana. A comprovação do sucesso do procedimento de ovariectomia foi
feita pelo exame do ciclo estral e exame macroscópico dos cornos uterinos.
Duas semanas após a cirurgia, os animais foram submetidos ao exame do ciclo
estral, por meio da coleta de líquido vaginal por um período de 5 dias consecutivos.
Para o desenvolvimento desta técnica de observação foi introduzido, com o auxílio de
uma borracha de conta-gotas acoplada a uma ponteira pequena, uma dose de solução
Trabalho de conclusão de curso
7
salina (cerca de 1ml) no interior da vagina da rata. Após a introdução, a solução foi
rapidamente aspirada e seu conteúdo transferido para uma lâmina de vidro e
imediatamente observado em microscopia óptica. Este procedimento foi realizado bem
no início da manhã, por volta das 7 horas.
A literatura mostra que esta técnica é ideal para investigar as mudanças ocorridas
no ciclo reprodutivo. O período do ciclo estral das ratas dura de 4 a 5 dias. Este ciclo
pode ser dividido em quatro fases: metaestro, diestro, proestro e estro. Cada uma das
fases se caracteriza por apresentar um tipo de célula predominante que pode ser
facilmente observado nos esfregaços da vagina, assim como o nível de hormônios
sexuais presentes no animal. Na fase metaestro, observam-se leucócitos e algumas
células epiteliais anucleadas remanescentes. Nesta fase inicia-se o aumento da secreção
de estrógeno e o primeiro pico de progesterona. Na fase diestro observam-se
basicamente leucócitos e algumas células epiteliais nucleadas, sendo marcado pelo final
do primeiro pico de progesterona e baixos níveis de estrógeno. Na terceira fase,
proestro, o número de células epiteliais nucleadas aumenta enquanto os leucócitos
praticamente desaparecem, ocorrendo neste momento o pico de secreção de estrógeno e
o segundo pico de progesterona, enquanto na fase estro são visualizadas basicamente
células epiteliais queratinizadas da camada córnea e o nível de estrógeno retorna aos
valores basais (Marcondes et al., 2002).
Durante o processo de sacrifício dos animais, foi possível avaliar, também, o
efeito da ovariectomia, por meio do exame macroscópico dos cornos uterinos. Para a
realização desta análise foi necessário, antes do sacrifício dos animais, incisionar a
região abdominal para localização das respectivas estruturas. Nos animais
ovariectomizados (com deficiência de hormônio) os cornos uterinos deveriam
Trabalho de conclusão de curso
8
apresentar-se finos, atróficos e anêmicos. Estes experimentos foram realizados em
triplicata.
3.3. Grupo Controle - Sham
Os animais do grupo controle (SHAM) foram submetidos apenas ao procedimento
cirúrgico, com exposição dos ovários e seu reposicionamento dentro da cavidade
abdominal. Estes animais também receberam, via intramuscular, uma única dose de
24.000UI/Kg de peso de penicilina (Pentabiotic Veterinário Pequeno Porte - Fort
Dodge®, Campinas, SP, Brasil).
3.4. Administração in vivo da cafeína
Utilizamos a cafeína adquirida da empresa Sigma-Aldrich. Após sua solubilização
em água destilada, a cafeína foi administrada por meio de sonda gástrica, na dosagem de
50 mg/kg de peso corporal (adaptado de Reis et al, 2016) por um período de 60 dias um
mês após o procedimento de ovariectomia para os grupos OVX/CAF. Os grupos
Controle (C) e OVX receberam somente água destilada.
3.5. Sacrifício Dos Animais e Coleta de Material
As ratas foram sacrificadas após noventa dias da cirurgia por meio de anestesia
seguida de decapitação. Os anestésicos utilizados foram cloridrato de cetamina (40-80
mg/Kg) e xilazina (10 mg/kg), por via intraperitoneal. Em seguida, foi realizada a coleta
dos fêmures para a realização da avaliação histológica e cultura celular como descrito a
seguir.
3.6. Ensaios in vitro de cultura celular
Trabalho de conclusão de curso
9
3.6.1. Cultura De Células Mesenquimais da Medula Óssea De Ratas
Os experimentos com cultura de células foram realizados no Laboratório de Cultura de
Células do Departamento de Morfologia, Fisiologia e Patologia Básica da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A cultura de células
mesenquimais (CTM) obtidas da medula óssea de fêmures das ratas (n=3 para cada grupo)
foi realizada como descrito por Maniatopoulos et al., (1988). As ratas foram sacrificadas
com overdose de anestésico Ketamina (Agener União, Embu-Guaçu, São Paulo, Brasil) e
Xylazina (Dopaser – Calier, Juatuba, Minas Gerais, Brasil). Os fêmures foram retirados e
transportados até o laboratório em meio de transporte (α-MEM (Gibco) suplementado com
500 µg/mL de gentamicina (Gibco) e 3 µg/mL de fungizona (Gibco). No fluxo laminar, os
fêmures foram submetidos à anti-sepsia (clorexidina a 2,5% e álcool a 70% por 1 minuto
cada). Posteriormente, foi realizada a remoção de tecidos moles restantes nos fêmures por
meio de lâmina de bisturi intercalada com a permanência dos mesmos em meio de
transporte/lavagem por 15 minutos (três vezes). As epífises foram cortadas e a medula óssea
extraída do fêmur por meio de irrigação das diáfises com meio de cultura.
As células foram mantidas em frascos de 75 cm2 (Corning) com MTS(meio total
suplementado) contendo α-MEM (Gibco), 10% de soro fetal bovino (Gibco), dexametasona
10-7 M (Sigma), 5 g/mL ácido ascórbico (Gibco), 7mM de -glicerofosfato , 0,3 µg/mL de
fungizona (Gibco) e 50 µg/mL de gentamicina (Gibco) .
Após atingirem subconfluência, as células foram liberadas enzimaticamente dos
frascos de cultura pela adição de solução de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 1
mM (Gibco), 1,3 mg/mL de colagenase tipo II (Gibco) e tripsina a 0,25% (Gibco) e
colocadas em presença de quantidade suficiente de meio de cultura para interromper a ação
enzimática. Posterior à centrifugação a 2000 rpm por 5 min para obtenção do precipitado
Trabalho de conclusão de curso
10
celular, as células foram homogeneizadas em meio de cultura MTS e uma alíquota de 100
µL desta solução, adicionada à porção igual de corante azul de tripan 0,1% (Acros
Organics), foi utilizada para contagem celular por meio de um contador de células
automático (Countess automated cell counter tm, Invitrogen, USA). A primeira passagem
celular foi utilizada para realização dos experimentos.
As células foram cultivadas no mesmo meio de cultura descrito acima, na
concentração de 2 x 104 células por poço, em placas de cultura celular de 24 poços (n=5). As
culturas foram incubadas a 37 ºC, em atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de
carbono (CO2) e 95% de ar atmosférico. Durante o tempo de cultivo de até 21 dias, as
células foram acompanhadas por meio de observação em microscópio de luz invertido
(Axiovert 25 Zeiss) sendo os meios de cultura trocados duas vezes por semana.
As culturas celulares foram divididas em quatro grupos experimentais: : 1) controle/C (sem
indução da osteoporose e sem adição da cafeína no meio); 2) controle/Cc (sem indução da
osteoporose e com adição de 1mM de cafeína no meio); 3) ovariectomizado/Ovx (sem adição
de cafeína no meio); 4) ovariectomizado/Ovxc (com adição de 1mM cafeína no meio).
3.6.2. Proliferação celular
Aos 3, 7 e 10 dias de cultura, a proliferação e viabilidade celular foram avaliadas
pelo ensaio colorimétrico MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolio]} (Sigma). Após remoção do meio de cultura, as células foram
incubadas com solução de MTT + MTS por 4 horas a 37ºC, em atmosfera umidificada
contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico. Passado esse período, o meio de cultura
foi removido dos poços e, em seguida, adicionado 1mL de solução de isopropanol ácido
(Merck, Darmstadt, Alemanha) em cada poço sob agitação por 5 minutos, para a
solubilização completa do precipitado formado. Alíquotas de 150µL foram removidas
Trabalho de conclusão de curso
11
dos poços e transferidas para uma placa de 96 poços para leitura em espectrofotômetro
(µQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA) em comprimento de onda de
570nm.
3.6.3. Conteúdo de proteína total e atividade de fosfatase alcalina (ALP)
Após 3, 7, 10 dias de cultura celular, o meio de cultura foi removido das placas e
os poços foram lavados três vezes com PBS (Gibco) aquecido a 37°C para remoção das
células não aderidas e do meio de cultura sobressalente. Em seguida, os poços foram
preenchidos com 1mL de solução de lauril sulfato de sódio 0,1% (Sigma) e deixados à
temperatura ambiente (TA) por 30 minutos antes de iniciar os ensaios:
a) Proteína total: a dosagem de proteína foi realizada seguindo o método de
Lowry (Lowry et al., 1951). Para isso, 500µL da amostra contida em cada poço da placa
de cultura foram transferidos ao respectivo tubo de ensaio, ao qual foi adicionado
500µL do reagente de Lowry (Sigma). Os tubos foram agitados vigorosamente e
deixados em T.A. por 20 minutos. Após este período, 250µL da solução de Folin &
Ciocaulteau’s phenol reagent (Sigma) foram adicionados aos tubos, que após agitação,
ficarão em TA por 30 minutos para desenvolvimento da coloração azul. Passado o
tempo, a absorbância de cada tubo foi determinada em um espectrofotômetro (Bio-Tek),
em comprimento de onda de 680nm. O conteúdo de proteína total de cada poço foi
calculado com base na construção de uma curva padrão a partir de albumina bovina
(Sigma). Os resultados foram utilizados para normalização da atividade de fosfatase
alcalina.
b) Atividade de ALP: foi determinada através da liberação de timolftaleína pela
hidrólise do substrato timolftaleína monofosfato, utilizando o kit comercial (Labtest
Trabalho de conclusão de curso
12
Diagnostica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil) e seguindo as instruções do fabricante.
Foram utilizados tubos de ensaio para os grupos testes, padrão e branco. Em todos os
tubos foram adicionados 50µL de substrato e 500µL de solução tampão; somente no
tubo padrão foram acrescentados 50µL da solução padrão. Posteriormente, todos os
tubos foram colocados em banho-maria a 37ºC, para a realização do experimento.
Foram acrescentados 50µL das amostras aos respectivos tubos testes em uma etapa
realizada em intervalo máximo de 10 minutos. Decorrido o tempo, 2mL do reagente de
cor foram adicionados a todos os tubos de ensaio e, em seguida, determinar-se-á a
absorbância em espectrofotômetro (Bio-Tek), no comprimento de onda de 590 nm. Os
dados da atividade de ALP foram normalizados pelo conteúdo de proteína total.
3.6.4. Análise de fosfatase alcalina in situ por meio de Fast Red
A análise da enzima fosfatase alcalina in situ foi realizada aos 3, 7 e 10 dias. Após
a remoção do meio de cultura, os poços foram lavados duas vezes com PBS aquecido a
37°C. Trezentos e vinte miligramas do reagente Triz (Sigma) foram dissolvidos em
20mL de água deionizada e, adicionado, 7mg do reagente Fast Red (Sigma). Foram
desprezados 2mL desta solução e acrescidos 8mg de naftol (Sigma) diluídos em 2mL
de dimetil formamida (Merck) formando a solução de trabalho. Um mililitro dessa
solução foi adicionado em cada poço. A placa foi levada à incubadora em uma
atmosfera umidificada a 37°C com 5% de CO2 por 30 minutos. Decorrido esse tempo, a
solução foi retirada dos poços e a placa foi seca à temperatura ambiente para posterior
análise qualitativa.
3.6.5. Detecção e quantificação de matriz mineralizada
Trabalho de conclusão de curso
13
A detecção de matriz mineralizada foi avaliada ao final dos 14 e 17 dias de
experimento. Após remoção do meio de cultura, os poços foram lavados três vezes com
PBS (Gibco) aquecido a 37ºC e adicionados 2mL de formalina 10% para fixação e
mantidos a 4°C por 24 horas. A formalina foi removida e os poços desidratados à T.A.
em séries crescentes de álcoois (30°, 50°, 70° e 100°) por um período de 1 hora para
cada graduação alcoólica. Após secagem, os poços foram corados com vermelho de
alizarina a 2% pH 4,2 (Sigma) por 10 minutos e as áreas de mineralização ricas em
cálcio evidenciadas pela coloração vermelha. Para quantificação da coloração segundo
método de Gregory et al. (2004), 280µL de ácido acético a 10% (Labsynth, Lab Ltda,
Diadema, SP, Brasil) foram acrescentados a cada poço e as placas deixadas sob agitação
suave por 30 minutos. A camada de células foi raspada com o auxílio de uma ponteira e
a solução transferida para tubos eppendorf de 1,5mL, aquecida a 85ºC por 10 minutos e
transferida para o gelo por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 13.000rpm por 20
minutos. Um volume de 150µL do sobrenadante foi transferido para uma placa de 96
poços (Corning) e 40µL de hidróxido de amônia a 10% (Quimibras, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil) foram adicionados. A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Bio-Tek) em
um comprimento de onda de 405nm.
3.6.6. Extração de RNA e Transcrição Reversa
Após 10 e 14 dias, foi realizada a extração do RNA total através do kit SV Total
RNA Isolation System (Promega, EUA) de acordo com as especificações do fabricante.
Em seguida, o RNA total foi quantificado em diferentes comprimentos de onda (260;
280; 230; 320 ηm) no aparelho GeneQuant 1300 (GE Healthcare, Reino Unido). A
integridade do RNA foi avaliada através de eletroforese microfluídica RNA 6000 nano
chips fornecidos pela Agilent Technologies® (Santa Clara, CA, EUA) utilizando o
Trabalho de conclusão de curso
14
aparelho Agilent 2100 Bioanalyser. Antes de iniciar o preparo do gel para a
eletroforese, todos os reagentes, que até o momento estavam armazenados em freezer,
foram mantidos por 30 minutos a temperatura ambiente. Decorrido o tempo, iniciou-se
o preparo do gel pipetando 550 µl do RNA 600 Nano Gel em uma coluna com filtro e
centrifugou-se por 10 minutos a 1.500 x g a temperatura ambiente. Uma alíquota de 65
µl foi colocada num tubo eppendorf de 0,5 ml e adicionou-se 1 µl de RNA 6000 Nano
Dye e após agitação por 10 segundos, centrifugou-se por 10 minutos a 13.000 x g a
temperatura ambiente. Em seguida, iniciou-se o preparo do RNA 6000 Nano Chip o
qual foi colocado no priming station com os ajustes corretos. Primeiramente pipetou-se
9 µl da mistura gel/dye na região G indicada no chip e com o auxílio de uma seringa
acoplada ao priming station distribuiu-se o gel por todo o chip. Em seguida, pipetou-se
9 µl das misturas nos demais pontos indicados com a letra G. Pipetou-se 1 µl do
marcador na posição indicada e 5 µl do RNA 6000 Nano Marker em cada posição
relacionada as amostras assim como na posição do marcador. Por último, 1 µl de cada
amostra (100-150 ng de RNA total) foi adicionado nos respectivos poços marcados de 1
a 12 e com a ajuda de um aparelho tipo vórtex IKA MS 3 (Manca, Hong Kong, China)
agitou-se o chip horizontalmente por 1 minuto a 2200 rpm antes da leitura. Com a ajuda
do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma e densitometria
dos géis). A caracterização de um RNA mensageiro (RNAm) de boa qualidade foi
verificada pela visualização de duas subunidades ribossômicas características nos
eucariotos (18S e 28S). Após extração do RNA total, o cDNA foi sintetizado a partir de
1µg de RNA por reação de transcrição reversa utilizando o Kit High Capacity cDNA
Reverse Transcription (Applied Biosystems, EUA), de acordo com as instruções do
fabricante. Brevemente, foram adicionados ao RNA: 2 μL de (10X) RT buffer, 0,8 μL
de (25X) dNTP mix (100mM), 2 μL (10X) RT Random Primers, 1 μL de MultiScribe
Trabalho de conclusão de curso
15
Reverse Transcriptase, 1 μL de RNase Inhibitor e 3,2 μL de água DEPC, para um
volume final de 20 μL/ reação. Em seguida, a amostra foi incubada a 25 ºC por 10
minutos, 37 ºC por 120 minutos, 85 ºC por 5 segundos, seguido pelo resfriamento a 4
ºC. Ao final da reação a amostra foi mantida em gelo e o cDNA estocado em freezer
−20°C.
3.6.7. Reação de PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas TaqMan
As reações de PCR em tempo real realizadas pelo sistema de sondas TaqMan
foram preparadas para um volume final de 10 µL por reação. Para cada reação, foi
adicionados 5 μL de TaqMan Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG (2X), 0,5
μL das sondas TaqMan para os genes de interesse (20X TaqMan Gene Expression
Assay Mix) e 11,25 ηg de cDNA. As reações consistiram em 2 minutos a 50 ºC, 10
minutos a 95 ºC, e quarenta ciclos de 15 segundos a 95 ºC e 1 minuto a 60 ºC.
Os resultados foram analisados com base no valor de Ct (cicle threshold – ou
ciclo limiar) e todas as amostras foram submetidas a reações para a detecção de RNA
mensageiro para o gene de expressão constitutiva beta-actina. Os níveis de expressão do
gene constitutivo foram utilizados para a normalização dos níveis de expressão do gene
alvo e uma amostra negativa (água) foi submetida à reação com cada sonda TaqMan
utilizada. A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas
pelo método de 2-ΔΔCT (Livak et al., 2001). Usando o método de 2-ΔΔCT, os dados foram
representados como diferença (em vezes) na expressão gênica normalizada pelo gene
constitutivo. A significância estatística das mudanças de expressão gênica foi avaliada
pelo teste Análise de Variância (One Way ANOVA) entre os grupos experimentais.
Valores de p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os resultados
Trabalho de conclusão de curso
16
representam os valores da média ± desvio padrão, da intensidade de expressão de
RNAm para o gene alvo, normalizado pela expressão de beta-actina.
3.7. Ensaios in vivo para avaliação histológica
Os fêmures coletados foram imersos em formaldeído a 4% tamponado, por 24
horas. Em seguida, os espécimes foram descalcificados em EDTA+TRIS a 0,5M, e as
soluções foram trocadas a cada dois dias. Após o período de descalcificação, que pode
variar de quinze a trinta dias, a ação do ácido foi neutralizada em uma solução de
sulfato de sódio a 5%, por vinte e quatro horas. Após esse período os fêmures foram
desidratados em séries crescentes de álcoois, diafanizados em xilol e incluídos em
parafina. Foram, então, realizados cortes longitudinais de 6 µm de espessura. Estes
cortes foram corados em hematoxilina-eosina, que permite a avaliação morfológica
qualitativa do tecido ósseo neoformado. A análise qualitativa das lâminas permitiu
avaliar o tecido ósseo nos grupos experimentais. Foi utilizado um microscópio de luz
Leica DM 4000B, acoplado a uma câmera digital de vídeo Leica EC3 para captura das
imagens as quais foram analisadas em aumentos de 20x e 40x. A análise quantitativa do
volume de tecido ósseo de cada animal foi analisada por meio do software Image J de
lâminas histológicas e os dados obtidos foram submetidos à análise estatística adequada
com significância para p<0.05.
3.8. Forma de análise dos resultados
Os dados obtidos das culturas células (n=5) foram analisados através de teste
estatístico apropriado após aplicação de testes de normalidade e homogeneidade e a
significância foi fixada em 5%.
Trabalho de conclusão de curso
17
4. Resultados
4.1. Ciclo estral das ratas
A Figura 1 mostra imagens de esfregaço vaginal 16 dias após a cirurgia. Nas ratas
controles podemos observar a predominância de leucócitos e células epiteliais nucleadas
e anucleadas, definindo a fase metaestro. Já o esfregaço de ratas ovariectomizadas
mostrou predominância de leucócitos, definindo a fase diestro, confirmando o sucesso
da ovariectomia.
Figura 1. Fotomicrografia de esfregaço vaginal, dezesseis dias após cirurgia. A e C)
Esfregaço de ratas controles em fase metaestro com leucócitos e células epiteliais
nucleadas e anucleadas. B e D) Esfregaço de ratas ovariectomizadas na fase diestro
com predominância de leucócitos.
4.2. Proliferação Celular (MTT)
O ensaio bioquímico colorimétrico que estima a proliferação celular (MTT)
apresentou resultados significantes no período de sete e dez dias. No período de 7 dias, o
grupos Cc mostrou proliferação celular significativamente maior quando comparado aos
outros grupos experimentais e o grupo OVX mostrou proliferação significativamente
Trabalho de conclusão de curso
18
maior em relação ao grupo controle. Já no período de 10 dias, podemos observar um
aumento significativo da proliferação de células no grupo OVXc quando comparado ao
controle. No período de 14 dias, todos os grupos mostraram resultados similares (Figura
3).
Figura 2. Proliferação celular de células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas após cultura
de 7, 10 e 14 dias, divididas em grupos C - Controle; Cc –Controle Cafeína; OVX - Tratado e OVXc –
Tratado Cafeína. Análise de variância (ANOVA) para 7 e 10 dias e Kruskal-Wallis para 14 dias, com
significância para p<0.05.
4.3. Quantidade de proteína total
A quantidade de proteína total aos 7 dias de cultura foi significativamente maior
no grupo OVXc quando comparado aos grupos C e Cc, assim como foi maior no grupo
Trabalho de conclusão de curso
19
OVX quando comparado ao grupo C. Já aos 10 dias, também foi observado um
aumento no grupo OVXc quando comparado ao grupo C.
Figura 3. Quantidade de proteína total de células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas após
cultura de 7, 10 e 14 dias, divididas em grupos C - Controle; Cc –Controle Cafeína; OVX - Tratado e
OVXc– Tratado Cafeína. Análise de variância (ANOVA) para 7 e 10 dias e Kruskal-Wallis para 14 dias,
com significância para p<0.05.
4.4.Detecção in situ de Fosfatase Alcalina (ALP)
A técnica de Fast Red pode ser usada como um cromogênio para coloração
imuno-histoquímica. Na presença de enzima fosfatase alcalina, o líquido produz um
produto de reação vermelho que pode ser visto usando um microscópio ou
macroscopicamente, facilitando a quantificação de nódulos formados. O procedimento
foi aplicado nas placas com os períodos de 7, 10 e 14 dias. Na Figura, pode ser
Trabalho de conclusão de curso
20
observado que a detecção in situ da ALP no grupo OVX foi maior que nos grupos C e
Cc aos 7 e 10 e 14 dias, assim como no grupo OVXc aos 7 e 10 dias. Já aos 14 dias, a
presença de ALP nos poços foi menor no grupo OVXc quando compactado ao grupo
OVX, mas maior quando comparado aos grupos C e Cc neste período.
Figura 4. Detecção in situ da atividade de fosfatase alcalina aos 7 dias, 10 e 14 dias em células
osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas divididas em grupos controle (C), controle com
cafeína (Cc), tratado(OVX), tratado com cafeína(OVXc).
4.5. Detecção e quantificação de nódulos mineralizados
Este experimento mostrou que aos 17 dias, a quantidade de nódulos mineralizados
diminui no grupo de ratas ovariectomizadas, ao passo que a administração da cafeína
aumentou a quantidade de nódulos no grupo Ovx caf, com valores similares para o
grupo controle e controle com cafeína.
Trabalho de conclusão de curso
21
Figura 5. Quantificação dos nódulos mineralizados por coloração com vermelho de alizarina aos 17 dias
em células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas divididas em grupos controle (C), controle
com cafeína (Ccaf), tratado(OVX), tratado com cafeína(OVXcaf).
4.6. Expressão gênica quantitativa
A expressão gênica quantitativa mostrou que aos 10 dias e 14 dias, a presença da
cafeína promoveu a indução dos genes OC, Runx2 e BMP4 quando comparado aos
grupos ovariectomizados que não receberam a substância. Já o gene ALP sofreu uma
repressão significativa aos 10 dias, assim como SP7 e o iBSP na presença da cafeína.
Aos 10 dias, o ALP não sofreu modificações, enquanto que no grupo OVX c o gene
SP7 foi induzido em relação ao grupo Ovx neste mesmo período.
Trabalho de conclusão de curso
22
Figura 6. Expressão gênica quantitativa de genes associados ao metabolismo ósseo em células
osteoblásticas após 10 e 14 dias de cultura de ratas ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas + cafeína
(OVX caf).
Trabalho de conclusão de curso
23
4.7. Análise histológica qualitativa e quantitativa
As lâminas histológicas do fêmur obtidas por meio de coloração com
hematoxilina-eosina e foram analisadas qualitativamente. Como podemos observar na
figura 9, as lâminas dos grupos controles apresentam o campo histológico preenchido
por trabéculas ósseas densas e bem conectadas; Já no grupo ovariectomizado nota-se um
menor volume trabecular com perda da conectividade, muito característico em situações
de osteoporose. Após a administração da cafeína, o volume trabecular parece maior e
mais conectado, similar aos grupos controles.
Figura 7. Análise histológica do fêmur das ratas do grupo controle (A), controle +cafeína (B),
ovariectomizado (C), ovariectomizado + cafeína.
A análise quantitativa foi feita com ajuda do programa Image J, onde foi possível
contar a quantidade de trabécula óssea que tínhamos em relação a quantia de osso
A B
C D
Trabalho de conclusão de curso
24
medular (Figura 10). Depois de passar pelo programa encontrou-se a porcentagem de
trabécula óssea de cada fotografia da lâmina.
Figura 8. A figura mostra a contagem de pontos de trabécula óssea na intersecção da grade colocada
sobre as lâminas no programa Image J .
Trabalho de conclusão de curso
25
Figura 9. Percentual de volume de tecido ósseo no fêmur de ratas controles (C), controle + cafeína (Cc),
ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas mais cafeína (OVXc).
A análise quantitativa mostrou que o grupo de ratas ovariectomizadas apresentou
uma diminuição significativa do percentual de volume ósseo no fêmur quando
comparado aos grupos controles. Entretanto, a administração de cafeína não diminuiu
significativamente o volume ósseo em uma situação de osteoporose (Figura 11).
5.Discussão
Muitos fatores como genética, etnia, nutrição e outros fatores relativos ao estilo de
vida, além da queda nos níveis de estrógeno, estão relacionados com a densidade
mineral no período pós menopausa das mulheres (Huitrón-Bravo et al., 2017). Em
conjunto, eles são capazes de regular a produção de citocinas que influenciam a
atividade dos osteoclastos e osteoblastos interferindo na formação óssea. A osteoporose
é uma doença óssea sistêmica que por si só não causa sintomas, caracterizada por uma
Trabalho de conclusão de curso
26
densidade mineral óssea diminuída e alterações da microarquitetura e da resistência
óssea que causam aumento da fragilidade óssea e, consequentemente, aumento do risco
de fraturas. Estima-se que esse problema atinge 25% das mulheres na menopausa e,
após os 65 anos, esse número sobe para 33,33%. Essas mulheres chegam a perder de 40
a 50% da massa óssea até o final da vida (Amadei et al., 2006).
A cafeína tem grande importância no cotidiano da população mundial estando
presente em diversas bebidas como café, chá, energéticos e alguns medicamentos
vendidos sem prescrição médica (Conlisk e Galuska, 2000; Bastos et al., 2014). Este
psicoestimulante tem uma variedade de respostas celulares e farmacológicas,
produzindo efeitos biológicos antioxidantes, angiogênicos, antibióticos, anti-
hipertensivos e anti-inflamatórios (Sakamoto et al., 2001; Macedo, Brentegani e
Lacerda, 2015). Devido a relevância dessa doença e desta substância se percebe uma
necessidade de maiores estudos sobre a relação entre eles. Uma vez que os resultados já
existentes na literatura mostram-se discordantes.
Os dados obtidos na proliferação celular (MTT) se mostram bem significativos.
Aos 7 dias o grupo controle cafeína apresentou maior volume. Aos 10 dias o grupo Ovx
cafeína mostrou resultados um pouco melhores que os demais. Pode-se notar com isso
que a cafeína apresentou influencia significativa no resultados de ambos os grupos.
Em relação a fosfatase alcalina, sua atividade não teve resultados expressivos aos
7 e 10 dias, apenas aos 14 dias que o grupo Ovx mostrou resultados um pouco maiores
em relação aos demais grupos. Já na detecção in situ da fosfatase alcalina tanto aos 7,
como 10 e 14 dias pode-se observar uma expressão maior dos grupos controle e
controle cafeína e aos 7 e 10 dias é notável a predominância do grupo ovariectomizado
com administração de cafeína. Com isso, se observa o efeito do psicoestimulante sobre
ao enzima e consequentemente a produção de matriz óssea. A cafeína também mostrou-
Trabalho de conclusão de curso
27
se ativa nos resultados da quantificação de proteína total em que nos períodos de 7 e 10
dias o grupo ovariectomizado com administração de cafeína apresentou números
maiores que os demais grupos.
A expressão gênica mostrou resultados interessantes no que diz respeito à
modulação dos genes associados ao metabolismo ósseo. A administração de cafeína
promoveu a indução de alguns genes como OC, Runx2 e BMP4, todos essenciais na
formação da matriz óssea e sua mineralização. Por outro lado, genes como ALP, SP7 e
iBSP sofreram repressão nas células osteoblásticas na presença desta substância. Esses
dados sugerem que a dose administrada pode interferir com a modulação gênica e que
os genes fazem parte de cascatas de sinalização onde outros genes possam estar
envolvidos e culminando com determinada característica funcional.
A análise qualitativa das laminas histológicas obtidas dos fêmures dos animais
mostrou nos dois grupos controles uma grande quantidade de trabéculas ósseas bem
conectadas e rodeadas por osteoblastos ativos e medula óssea celular. Já o grupo
ovariectomizado apresentou uma quantidade reduzida de trabéculas, que se mostraram
desconectadas. O grupo Ovx com administração de cafeína mostrou maior volume
trabecular, similar aos grupos controles. Apesar disso, na análise quantitativa das
lâminas histológicas, observamos que este aumento do trabeculado ósseo não foi
significativo quando comparado ao grupo Ovx.
6. Conclusão
Diante desses resultados e dos anteriormente obtidos nos estudos in vitro e in vivo
do efeito da cafeína, é possível notar que a substância apresenta influência sobre a
atividade celular refletindo na qualidade de tecido ósseo femoral. Apesar da influência
na atividade funcional de células osteoblásticas na indução de genes relacionados ao
Trabalho de conclusão de curso
28
metabolismo ósseo, sugere-se que a concentração de cafeína administrada não prejudica
(visto pela análise qualitativa histológica) a formação e manutenção do tecido ósseo em
uma situação de osteoporose. Mais estudos com outras concentrações são necessários
para que mais informações sejam coletadas sobre o efeito da cafeína na osteoporose.
7. Agradecimentos
Devo agradecimentos à minha orientadora, Karina Fittipaldi, por confiar em mim
mesmo sendo tão nova e sem experiência em pesquisa; ao Roger, técnico responsável
pelo laboratório, que mesmo diante de meus tropeços não desistiu de me ajudar. Aos
meus pais, que sempre me apoiaram nesta empreitada. Este trabalho foi realizado com o
apoio de FAPESP, sendo a aluna agraciada com uma bolsa de Iniciação Científica e
posterior renovação por mais 12 meses (processo 2014/19679-6).
8.Bibliografia
1. Amadei SU, Silveira VAS, Pereira AC, Carvalho VR, Rocha RF. Effect of estrogen
deficiency on bone turnover and bone repair. J. Bras. Pato. Med. Lab. 2006 42(1): 5-12.
2. Bastos MF, Menezes DJ, Bezerra JP et al. Impact of caffeine and/or estrogen
deficiency on trabecular bone area and healing: a study in rats. Int. J. Oral maxillofac.
Implants. 2014 29(1): 221-231.
3. Conlisk AJ, Galuska DA. Is caffeine associated with bone mineral density in young
adult women? Prev. Med. 2000 31(5): 562-568.
Trabalho de conclusão de curso
29
4. Hoar w, hickman cp 1975. Ovariectomy and the estrous cycle of the rat. In: w hoar
& c p hickman (eds.), general and comparative physiology. 2.ed. Prentice-hall, new
jersey, pp. 260-265.
5. Huitrón-Bravo G, Denova-Gutiérrez E, Talavera JO, Moran-Villota C, Tamayo
J, Omaña-Covarrubias A, Salmerón J. Levels of serum estradiol and lifestyle factors
related with bone mineral density in premenopausal Mexican women: a cross-sectional
analysis. BMC Musculoskelet Disord. 2016 Oct 19;17(1):437.
6. Kalu DN 2006. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone
miner.;(3):175-91.
7. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-delta delta c(t)) Methods. Methods. 2001 25(4): 402-408.
8. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the
Folin phenol reagent. 1951 J Biol chem.;193(1):265-75.
9. Macedo RM, Brentegani LG, Lacerda SA. Effects of cofie intake and intraperitoneal
caffeine on bone repair process-- a histológico and histometric study. Braz. Dent. J.
2015 26(2): 175-180.
10. Maniatopoulos C, Sodek J, Mekcher AH. Bone formation in vitro by stromal cells
obtained from marrow of young adults 1998 Cell tissue res.v.254,p.317-30.
11. Marcondes FK, Miguel K, Melo IL, Spadari-Bratfisch Rc. Estrous cycle influences
the response of female rats in the elevated plus-maze. 2001 Physiol behav.; 74(4-5):
435-440.
12. Reis AM, Ocarino N de M, Boeloni JN, Gomes DA, Goes AM, Ferreira Ada F,
Serakides R. Inhibition of the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
Trabalho de conclusão de curso
30
derived from the offspring of rats treated with caffeine during pregnancy and
lactation.Connect Tissue Res. 2016;57(2):131-42. doi:
10.3109/03008207.2015.1117075. Epub 2015 Dec 3.
13. Sakamoto W, Nishihira J, Fujie K, Iizuka T et al. Effect of coffee consumption on
bone metabolism. Bone. 2001 28(3): 332-336.
14. Yu SJ, Liu HC, Wang DS, Zhu GX. Proliferation and differentiation of osteoblasts
from the mandible of osteoporotic rats. Exp biol med. 2012 apr;237(4):395-40.
15. Boekema PJ, Samsom M, van Berge Henegouwen GP, Smout AJ 1999. Coffee and
gastrointestinal function: Facts and fiction. Scand J Gastroenterol Suppl.; 230: 35–39.
16. Cummings SR, Black DM, Rubin SM 1989. Lifetime risks of hip, Colles', or
vertebral fracture and coronary heart disease among white postmenopausal women.
Archives of Internal Medicine.;149(11):2445.
17. Folwarczna J, Pytlik M, Zych M, Cegieła U, Kaczmarczyk-Sedlak I, Nowińska B,
Sliwiński L 2013. Favorable effect of moderate dose caffeine on the skeletal system in
ovariectomized rats; Mol Nutr Food Res.;57(10):1772-84.
18. Gregory CA , Gunn WG , Peister A, Prockop DJ 2004. An Alizarin red-based assay
of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride
extraction. Anal Biochem.;329(1):77-84.
19. Haentjens P, Magaziner J, Colón-Emeric CS, Vanderschueren D, Milisen K,
Velkeniers B,Boonen S 2010. Meta-analysis: excess mortality after hip fracture among
older women and men. Annals of internal medicine.;152(6):380-390.
Trabalho de conclusão de curso
31
20. Haskell CF, Kennedy DO, Wesnes KA, Scholey AB 2005. Cognitive and mood
improvements of caffeine in habitual consumers and habitual non-consumers of
caffeine. Psychopharmacology (Berl).;179:813–825.
21. Hogan EH, Hornick BA, Bouchoux A 2006. Focus on Communications:
Communicating the Message: Clarifying the Controversies About Caffeine.Nutr
Today.;37(1):28-35.
22. Le Blanc ES, Hillier TA, Pedula KL, Rizzo JH, Cawthon PM, Fink HA, Cauley JA,
Bauer DC,Black DM, Cummings SR 2011. Hip fracture and increased short-term but
not long-term mortality in healthy older women. Archives of internal
medicine:archinternmed.447 v1.
23. Lieberman HR, Wurtman RJ, Emde GG, Roberts C, Coviella ILG 1987. The effects
of low doses of caffeine on human performance and mood. Psychopharmacology.;
92:308–312.
24. Merheb J , Temmerman A, Coucke W, Rasmusson L, Kübler A, Thor A, Quirynen
M 2014. Relation between Spongy Bone Density in the Maxilla and Skeletal Bone
Density. Clin Implant Dent Relat Res.
25. Migliardi JR, Armellino JJ, Friedman M, Gillings DB, Beaver WT 1994. Caffeine
as an analgesic adjuvant in tension headache. Clin Pharmacol Ther.;56:576–586
26. Snel J, Koppes LLJ , Twisk JW 2009. Sensitivity to coffee and subjective health.
Act Nerv Super Rediviva.;(51): 61–68.
Trabalho de conclusão de curso
32
27. Yang A, Palmer AA, Wit H 2010. Genetics of caffeine consumption and responses
to caffein; Psychopharmacology (Berl).; 211(3):245-57.
28. Higdon, JV, Frei B 2006. Coffee and health: a review of recent human research.Crit.
Rev. Food Sci. Nutr.;46,101–123.
29. Daly JW, Fredholm BB 1998. Caffeine--an atypical drug of dependence. Drug
Alcohol Depend. 1998 Jun-Jul;51(1-2):199-206.
30. Cano-Marquinaa A, Tarínb JJ, Canoc A 2013. The impact of coffee on
health.Maturitas.;75(1):7-21.