简介

球虫原生动物是孢子虫纲艾美球虫属的单细胞寄生虫。

可使动物患球虫病 ( 这是动物的一种肠病 )，对大规模家

禽饲养业具有重大的经济影响。主要症状是出血性腹泻，

可导致死亡，尤其是针对幼小和免疫缺陷的母鸡。球虫

病是一种高度传染性的疾病，接触感染动物的排泄物即

可传染，集中饲养时的潮湿和温暖的环境对球虫病有利。

因此，所有饲养的动物可在短短几天内全部感染球虫病。

抗球虫药是具有抗原虫作用的药物，用于防治球虫，并

且，在大部分情况下，在规定的浓度、规定的时间内，

这些药物是允许作为家禽的饲料添加剂使用的。根据欧

盟的 1831/2003/EC 号法规 1，共有 11 种抗球虫药获得许可：

癸氧喹酯、地克珠利、常山酮、拉沙里菌素、马杜霉素、

莫能菌素、甲基盐霉素、尼卡巴嗪、氯苯胍、沙利霉素、

和塞杜霉素。大部分抗球虫药都是由链霉菌属天然产生

的，属于聚醚类抗生素。尼卡巴嗪是 4,4- 二硝基苯脲和 4,6-

二甲基 -2- 羟基嘧啶的的等分子复合体 ( 各 55 个分子 )，

后者可被快速排泄，因此，尼卡巴嗪的残留分析是基于 4,4-

二硝基本脲的。

根据欧洲议会的法规 (EC) No. 1831/2003 和欧盟理事会 1 以

及理事会指令 70/524/EEC2，可以在蛋鸡的外延生长期 ( 自

简单去除基质后，检测鸡蛋中的 11 种痕量抗原虫药

Customer Application Note 116Patrick Kämpfer1, Daniel Kull1, Otmar Deflorin1, Michael Heidorn2, and Markus M. Martin2

1Kantonales Laboratorium Bern, Bern, Switzerland; 2Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany

出生起 16 周 ) 使用抗球虫药。但鸡蛋用于人类消费时则

不可使用，只有拉沙里菌素例外，该药物允许的最大残

留量为每公斤湿重含 150 µg 药物 ( 见 37/2010/EC 法规 3)。

虽然欧盟禁止使用抗球虫药，但鸡蛋中还是经常发现这

些药物残留。除了非法使用之外，生产过程中的携带污

染或饲养过程中的交叉污染，均有可能使不含药物的饲

料被药物污染。

鸡蛋中不可避免会由于携带污染而出现抗球虫药物残留，

124/2009/EC4 法规规定了这些药物的最大残留限量。由于

抗球虫药被广泛使用，且具有多样性，所以需要有一种

合适的方法用于检测由于使用不当或交叉污染引起的药

物残留限量。现有的大部分 HPLC 方法可以成功地检测鸡

蛋中的一种或几种抗球虫药，而只有极少数的方法可进

行多残留检测。虽然所有方法都使用 LC-MS/MS 进行分析，

但没有一个方法可以在一次运行过程中，对欧盟法规所

禁止的所有抗球虫药进行定量。5–8

Trace Level Determination of Eleven Antiprotozoal Agents in Eggs after Simple Matrix Clean-UpPatrick Kämpfer1, Daniel Kull1, Otmar Deflorin1, Michael Heidorn2, and Markus M. Martin21Kantonales Laboratorium Bern, Bern, Switzerland; 2Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany

Cu

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11

6

(16 weeks from birth), unless these eggs are intended for human consumption; except for lasalocid with a maxi-mum residue limit of 150 µg per kilogram wet weight of chicken eggs as described in Regulation 37/2010/EC.3 Although coccidiostats have been banned by the European Union, residues are frequently found in chicken eggs. In addition to illegal use, contamination of supposedly drug-free feed can be caused by carry-over from produc-tion or accidental cross-contamination during feeding.

Maximum residue limits of coccidiostats in chicken eggs, resulting from unavoidable carry-over, are listed by Regulation 124/2009/EC.4 With the extensive use and diversity of coccidiostats, a suitable method must be available for detecting limits of residue occuring from improper use or cross-contamination. Most of the current HPLC methods succeed in the determination of one or more coccidiostats in eggs, with only a handful of multi-residue methods known. While all methods use LC-MS/MS as the analytical tool, none of these methods allow quantification of all of the coccidiostats of concern by the European legislation in a single analytical run.5–8

Key WordsAutomated On-Line SPE, LC-MS/MS, Food analysis, Coccidiostats, Polyether Ionophores, SolEx HRP, Acclaim PA2 Column

GoalDetermination of eleven coccidiostats in chicken eggs at trace level as listed by the European legislation after simple matrix clean-up and automated on-line SPE.

K a n t o n a l e s l a b o r a t o r i u m b e r n

IntroductionCoccidian protozoa are unicellular parasites of the genius Eimeria in the class Sporozea. They have a significant economic impact on high-volume commercial poultry farming by causing coccidiosis, a disease of the intestinal tract of animals. The primary symptom is bloody diarrhea which can lead to death, especially for young and immunodeficient hens. Coccidiosis is highly contagious through contact with infected feces and supported by the humid and warm conditions of intensive farming. Hence, coccidiosis is able to affect the entire breeding stock within a few days.

Coccidiostats are antiprotozoal agents preventing coccidiosis and, in most cases, are licensed for use as poultry feed additives in a prescribed concentration and during a certain time interval. According to Regulation 1831/2003/EC of the European Union1, eleven coccidio-stats are authorized for use: decoquinate, diclazuril, halofuginone, lasalocid, maduramicin, monensin, narasin, nicarbazin, robenidine, salinomycin, and semduramicin. Most coccidiostats are naturally produced by streptomy-ces and belong to the group of polyether ionophores. Nicarbazin is a fifty-fifty mixture of 4,4-dinitrocarbanilide and 4,6-dimethyl-2-hydroxypyrimidine, the latter one being excreted rapidly. Consequently, residue analyses for nicarbazin are based on 4,4-dinitrocarbanilide.

According to Regulation (EC) No. 1831/2003 of the European Parliament and of the Council of the European Union1 and Council Directive 70/524/EEC2, coccidiostats are allowed for laying hens during their epitaxial growth

关键词

自动在线固相萃取，LC-MS/MS，食品分析， 抗球虫药 , 聚醚类抗生素，

SolEx HRP，Acclaim PA2 色谱柱

目的

简单去除基质之后，使用自动化的在线固相萃取方法，检测鸡蛋中被欧盟

法规禁止的 11 种痕量水平的抗原虫药。

2

图 1. 抗球虫药的化学结构

本文叙述了一种非常可靠的、易于使用的在线固相萃取 -

高效液相色谱 - 串联质谱方法 ( 在线 SPE–UHPLC–MS/MS)，

用于检测鸡蛋中的所有 11 种抗球虫药。先将鸡蛋用酸化

的乙腈提取，然后提取液上样到在线 SPE-UHPLC 系统中，

用于自动净化和分离，然后使用电喷雾 MS/MS 进行定量

( 正离子模式和负离子模式，扫描模式 SRM)。

研究中使用 Thermo ScientificTM SolExTM HRP SPE 进行在线

固相萃取，原因是其对抗球虫药具有优异的吸附和解

吸附能力。方法摸索过程中发现，Thermo ScientificTM

AcclaimTMPolarAdvantage II (PA2) 色谱柱是最适用于分析的色

谱柱。由于抗球虫药的极性差异较大，所以需要使用 2

种方法确保所有目标分析物都被捕获并被检测到。这种

极性的差异，尤其是某些提取溶剂的高极性，使得提取

液在上样到在线 SPE 柱之前，需要进行额外的稀释。为了

定性准确，需要在单反应监测模式 (SRM) 下为每个分析物

选择两个离子进行检测。通过鸡蛋样品加标的方式进行

方法验证。

试验

使用酸化的乙腈从鸡蛋基质中提取抗球虫药。提取液使

用在线 SPE 进行净化，用液相色谱分离，然后使用三重四

级杆质谱在正离子和负离子模式下、通过 SRM 技术进行

定量。

材料和方法

仪器设备

• Thermo ScientificTM CL10 离心机 ( 或相当者，可提供

30,000g 的离心力 )

• Thermo ScientificTM SavantTM SPD2010 SpeedVacTM 浓缩仪

• Thermo ScientificTM 微孔板振荡器

• Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 双三元标准系

统 , 包括 :

– SRD-3600 溶剂架和内置脱气机

– DGP-3600BM 双三元低压梯度泵

– SRD-3200 溶剂架和内置脱气机

– HPG-3200SD 二元高压梯度泵

– WPS-3000SL 多孔板自动进样器

– TCC-3000SD 柱温箱

• Thermo ScientificTM DionexTM 阀模块，用于 HP 两位十通阀

( 或 : 用于 HP 两位六通阀的模块 )

• Thermo ScientificTM DionexTM 阀门驱动工具包 HP

• SolEX HRP, 12–14 µm, 2.1×20 mm SPE 柱 (P/N 074400)

• Acclaim PolarAdvantage II (PA2) 3 µm, 2.1×150 mm 分析型色

谱柱 (P/N 063187)

• Thermo ScientificTM DionexTM DCMSLinkTM 软件

• Thermo ScientificTM DionexTM ViperTM 在线 SPE 工具包 , RS

• Viper SST 毛细管 , 550×0.13 mm ( 用于连接右侧 DPG 和 T-

型管 )

• 2×Viper SST 毛细管 , 65×0.13 mm (not required if a pod for

two-position 6-port HP valve is used)

• T- 型管 , 内径 500 µm

• 合适长度的 Viper SST 毛细管 (0.10 mm I.D.) 或 Thermo

ScientificTM DionexTM nanoViperTM 手拧式接头 (0.075 mm i.d.)，

用于连接液相和质谱

• Thermo ScientificTM TurboFlow Cyclone-P, 50×0.5 mm 色谱柱

(P/N CH-953289)

• 三重四级杆质谱仪

Viper 手拧式接头系统连接方式

本方法中所使用的所有可弯曲的不锈钢毛细管都是预制

的，且带有 Viper 手拧式接头，可以实现零死体积的连接。

用于在线 SPE 连接的所有 Viper 接头毛细管都包含在 Viper

在线 SPE 工具包中，为了实现在线稀释，使用第三个泵对

这种传统的配置进行了扩展：

氯吡多 癸氧喹酯

地克珠利 常山酮

拉沙里菌素

马杜菌素

莫能菌素

那拉霉素

4.4- 二硝基苯脲尼卡巴嗪

沙利霉素

氯苯胍

3

图 2. 扩展的在线 SPE 设置的流路图，

(a) 用于上样 / 洗脱 (b) 用于转移 / 分析

3• FormicAcid(FA),proanalysis(Fluka/Sigma-Aldrich, P/N 56302)

•Methanol(MeOH),ULC/MS(Biosolveb.v., P/N 13684102)

• SodiumChloride(NaCl),proanalysis(MerckKGaA,P/N 1.06404)

• Triethylamine(TEA),purissimum(Fluka/Sigma-Aldrich,P/N 90340)

•Water(H2O), demineralized by Kantonales Laboratorium Bern

Standards• Clopidol(Sigma-Aldrich,P/N33988)

• Decoquinate(Sigma-Aldrich,P/N33823)

• Decoquinate-d5 (Sigma-Aldrich, P/N 32552)

• Diclazuril(Sigma-Aldrich,P/N34057)

• HalofuginoneLactate(Dr.EhrenstorferGmbH, P/NXA14059300AL)

• LasalocidASodiumSalt(Fluka/Sigma-Aldrich, P/N 33339)

•Maduramicin(Sigma-Aldrich,P/N34069)

•MonensinSodiumSalt(Sigma-Aldrich,P/N46468)

• Narasin(Sigma-Aldrich,P/NN1271)

• Nicarbazin(4,4-Dinitrocarbanilide)(Sigma-Aldrich,P/N 32409)

• Nicarbazin-d8 (4,4-Dinitrocarbanilide-d8), (Witega Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, P/N OP001)

• RobenidineHydrochloride(Sigma-Aldrich,P/N33979)

• Salinomycin(Sigma-Aldrich,P/NS4526)

Preparation of StandardsStock SolutionsIn consideration of their purity, stock solutions of each standard substance are prepared with a target concentra-tion of 1 mg/mL by using the solvents as noted in Table 1.

using a third pump: The t-piece, the Viper fingertight fitting capillaries to loop through valve ports 2 and 3 as well as ports 6 and 7 of the two-position 10-port valve (Figure 2), and the Viper fingertight fitting capillary needed to connect the right pump of the DGP with the T-piece are not included in a Viper on-line SPE kit and therefore must be ordered separately. Alternatively, a two-position 6-port valve, which eliminates the need for additional shortcut fluidics, could be used.

Reagents• 2-Propanol(2-PrOH),LiChrosolv® (Merck® KGaA,

P/N 1.01040)

• AceticAcid(AA),proanalysis(MerckKGaA, P/N 1.00063)

• Acetonitrile(MeCN),ULC/MS(Biosolveb.v., P/N 01204102)

• Acetone(DMK),LiChrosolv(MerckKGaA, P/N 1.00020)

• Dimethylformamide(DMF),proanalysis(Fluka/Sigma-Aldrich®, P/N 40243)

• DimethylSulfoxide(DMSO),Uvasol® (Merck K GaA, P/N 1.02950)

• Ethanol(EtOH),LiChrosolv(MerckKGaA, P/N 1.11727)

Figure 2. Flow schemes of the advanced on-line sPe configuration for loading/washing (a) and transfer/analysis (b).

MS/M/SDetector

AnalyticalColumn

Dual Gradient Pump

T-Piece

From Left Pump From Right Pump

High PressureGradient Pump

Waste

A

SPE Cartridge

Autosampler

MS/M/SDetector

AnalyticalColumn

Dual Gradient Pump

T-Piece

From Left Pump From Right Pump

High PressureGradient Pump

Waste

SPE Cartridge

Autosampler

B

table 1. stock solutions.

Standard Substance Solvent

Nicarbazin (DNC) Dimethyl Sulfoxide

Nicarbazin-d8 (DNC) Dimethyl Sulfoxide

Clopidol Dimethylformamide

Decoquinate Methanol + 1% Triethylamine

Decoquinate-d5

Methanol + 1% Triethylamine

Diclazuril Dimethylformamide

Halofuginone Methanol

Lasalocid Methanol

Maduramicin Methanol

Monensin Methanol

Narasin Acetonitrile

Robenidine Ethanol

Salinomycin Acetonitrile

使用了 T - 型三通；Viper 接头毛细管依次通过两位十通阀

的 2、3 号口，以及 6、7 号口 ( 图 2)，连接 DGP 右泵和 T-

型三通所需的 Viper 手拧式接头毛细管不包含在 Viper 在线

SPE 工具包中，因此必须单独订购。或者，可以使用两位

六通阀，这样就不需要进行额外的流路连接。

试剂

• 异丙醇 (2-PrOH), LiChrosolv® (Merck® KGaA, P/N 1.01040)

• 乙酸 (AA)，分析纯 (Merck KGaA, P/N 1.00063)

• 乙腈 (MeCN), ULC/MS (Biosolve b.v.,

P/N 01204102)

• 丙酮 (DMK), LiChrosolv (Merck KGaA,

P/N 1.00020)

• 二甲基甲酰胺 (DMF)，分析纯 (Fluka/

Sigma-Aldrich®, P/N 40243)

• 二甲基亚砜 (DMSO), Uvasol® (Merck K GaA, P/N 1.02950)

• 乙醇 (EtOH), LiChrosolv (Merck KGaA, P/N 1.11727)

• 甲酸 (FA), 分析纯 (Fluka/Sigma-Aldrich,

P/N 56302)

• 甲醇 (MeOH), ULC/MS (Biosolve b.v.,

P/N 13684102)

• 氯化钠 (NaCl), 分析纯 (Merck KGaA,

P/N 1.06404)

• 三乙胺 (TEA), 特级纯 (Fluka/Sigma-Aldrich,

P/N 90340)

• 水 (H2O)，不含矿物质， Kantonales Laboratorium Bern

标准品

• 氯吡多 (Sigma-Aldrich, P/N 33988)

• 癸氧喹酯 (Sigma-Aldrich, P/N 33823)

• 癸氧喹酯 -d5 (Sigma-Aldrich, P/N 32552)

• 地克珠利 (Sigma-Aldrich, P/N 34057)

• 常山酮乳酸盐 (Dr. Ehrenstorfer GmbH, P/N XA14059300AL)

• 拉沙里菌素 A 钠盐 (Fluka/Sigma-Aldrich,

P/N 33339)

• 马杜霉素 (Sigma-Aldrich, P/N 34069)

• 莫能菌素钠盐 (Sigma-Aldrich, P/N 46468)

• 那拉霉素 (Sigma-Aldrich, P/N N1271)

• 尼卡巴嗪 (4,4- 二硝基苯脲 ) (Sigma-Aldrich,

P/N 32409)

• 尼卡巴嗪 - d8 (4,4- 二硝基苯脲 - d8), (Witega Laboratorien

Berlin-Adlershof GmbH, P/N OP001)

• 盐酸氯苯胍 (Sigma-Aldrich, P/N 33979)

• 沙利霉素 (Sigma-Aldrich, P/N S4526)

标准品制备

储备液

考虑到各物质的纯度，每个标准品配制成目标浓度为

1mg/mL 的储备液，所用的溶剂见表 1。

表 1. 储备溶液

标准品 溶剂

尼卡巴嗪 (DNC) 二甲基亚砜

尼卡巴嗪 -d8 (DNC) 二甲基亚砜

氯吡多 二甲基甲酰胺

癸氧喹酯 甲醇 + 1% 三乙胺

癸氧喹酯 -d5 甲醇 + 1% 三乙胺

地克珠利 二甲基甲酰胺

常山酮 甲醇

拉沙里菌素 甲醇

马杜霉素 甲醇

莫能菌素 甲醇

那拉霉素 乙腈

氯苯胍 乙醇

沙利霉素 乙腈

4

标准溶液

制备两种溶液，一种为内标溶液 (ISTD)，一种为校正标准

溶液 (CSTD)。ISTD 溶液包含所有氘代的对照标准物质；

CSTD 溶液包含所有非氘代的目标分析物混标，并作为储

备液，用于配制所有后续的标准溶液。取适量各储备溶液，

置于 10mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到目标浓度为

10ng/µL 的标准溶液。这些标准溶液用于鸡蛋样品加标，

并用于制备各种方法质控溶液和系统适用性溶液，参加

“样品类型”和“样品制备”。

样品类型

使用标准品校正法对鸡蛋样品进行定量。除了校正标准

品之外，在每个序列中还包括多种标准品，用于确保和

监控色谱分离和质谱检测的可靠性。运行中共包括下列

样品类型 ( 见图 3 的说明 )：

校正标准品

• 空白鸡蛋基质，制备前加标一定量的目标分析物 (CSTD)

和 ISTDs

• 样品制备前加入 ISTDs 和目标分析物

• 校正标准品用于对鸡蛋中的抗球虫药定量

控制标准品

• 空白鸡蛋基质 , 制备前加标预定量的分析物 (CSTD) 和

ISTD (30 µg/kg)

• 样品制备前加入 ISTDs 和目标分析物

• 控制标准品用于方法控制和确定回收率。

基质标准品

• 空白鸡蛋基质，进行样品制备之后，加标一定量的目标

分析物 (CSTD) 和 ISTD (30 µg/kg)

• 在样品制备之后，加入 ISTDs 和目标分析物

• 基质标准品用于方法控制，确定回收率，以及确定基质

效应对 MS 信号的影响。

样品

• 鸡蛋样品

• 在样品制备之前加入 ISTDs

外标

• 纯的 ISTDs 和目标分析物 (CSTD)，配成不含基质的溶液

• 外标用于方法控制和 MS 信号稳定性 / 检测性能监测。

4 Control Standard• Blankeggmatrix,spikedwithadefinedamountofboth

target analytes (CSTD) and ISTD (30 µg/kg) before preparation

• ISTDsandtargetanalytesaddedpriortosamplepreparation

• TheControlStandardisusedformethodcontrolandrecovery rate determination

Matrix Standard• Blankeggmatrix,spikedwithadefinedamountofboth

target analytes (CSTD) and ISTD (30 µg/kg) after preparation

• ISTDsandtargetanalytesaddedaftersamplepreparation

• TheMatrixStandardisusedformethodcontrol,recovery rate, and determination of matrix effects on MS signal

Sample• Chickeneggsample

• ISTDsaddedpriortosamplepreparation

External Standard• PureISTDsandtargetanalytes(CSTD)inamatrix-free

solution

• TheExternalStandardisusedformethodcontrolandMS signal stability/detection performance monitoring

Standard SolutionsPrepare two types of solutions, an Internal Standard Solution (ISTD) and a Calibration Standard Solution (CSTD). The ISTD solution contains all deuterium-labeled reference standards; the CSTD solution consists of a mixture of all non-labeled target analytes and serves as a stock solution to prepare all further standards. Achieve the target concentration of 10 ng/µL for each standard solution by adding the appropriate volume of each stock solution into a 10 mL volumetric flask and fill with methanol. These standard solutions are used to spike the egg samples as well as to prepare the various standard types for method quality control and system suitability tests, as described in "Sample Types" and "Sample Preparation".

Sample TypesQuantitationoftheeggsamplesisachievedviacalibrationstandards. In addition to the calibration standards, several types of standards are run within a sequence to ensure and monitor the performance of the separation and MS detection. The following sample types are run (see Figure 3 for clarity):

Calibrate Standard• Blankeggmatrix,spikedwithseveraldefinedamounts

of target analytes (CSTD) and ISTDs before preparation

• ISTDsandtargetanalytesaddedpriortosamplepreparation

• TheCalibrateStandardisusedforquantitationofthecoccidiostats in eggs

Blank Egg Matrix Real Egg Sample Water/ACN 1/1

+ ISTD (30 µg/kg)+ Analytes (total: 5, 10, 20, 50 µg/kg)

+ ISTD (30 µg/kg)+ Analytes (30 µg/kg)

+ ISTD (30 µg/kg) + ISTD(equivalent 30 µg/kg in sample)+ Analytes (equivalent 30 µg/kg in sample)

Extraction with Acidified Acetonitrile

• Shaking / salting out / centrifugation• Evaporation of supernatant to dryness• Redissolution• Centrifugation

+ ISTD (30 µg/kg)+ Analytes (30 µg/kg)

Calibrate Standard Control Standard Matrix Standard Sample External Standard

Figure 3. sample type and preparation overview.

图 3. 样品类型和样品制备概括

5

样品制备

外标

将适量 ISTD 和 CSTD 溶液加入到 50% 乙腈 - 水溶液中，配

成所有分析物最终浓度为 0.14 ng/µL ( 相当于鸡蛋中的浓度

为 30 µg/kg) 的溶液。

对于所有的鸡蛋样品，从每个批次中取 6 个鸡蛋的蛋清

和蛋黄，匀浆。各样品类型的配制方法不同：

校正标准品

往 50 mL PP 试管中加入 10g 匀浆空白鸡蛋 ( 不含任何抗球

虫药 )，分成 4 次加入，然后加入 20mL 乙腈，1mL 1M 醋酸，

和 30uL ISTD 溶液。使用 5, 10,20, 和 50 µg/kg 分析物对样品

进行加标。

控制标准品

往 50 mL PP 试管中加入 10g 匀浆空白鸡蛋 ( 不含任何抗球

虫药 )，然后加入 20mL乙腈，1mL 1M醋酸，和 30uL ISTD溶液，

和 30uL CSTD 溶液。

基质标准品

往 50 mL PP 试管中加入 10g 匀浆空白鸡蛋 ( 不含任何抗球

虫药 )，然后加入 20mL 乙腈，1mL 1M 醋酸。

样品

对于鸡蛋样品，往 50 mL PP 试管中加入 10g 匀浆鸡蛋，然

后加入 20mL 乙腈，1mL 1M 醋酸，和 30uLISTD 溶液。

• 所有鸡蛋制备的样品均涡旋震摇 30s，然后在微孔板振

荡器上震摇 30 分钟，震摇速率设为最高。

• 往每份样品中加入 5g 氯化钠，然后用手震摇。

• 样品在 2550g、4℃下离心 20 分钟。

• 转移 2 mL 上清至 SpeedVac 试管中。

• 在 55℃条件下，使用 SpeedVac 离心浓缩仪 ( 最大转速，

持续 60min)，将上清挥发至干。

• 使用 200 µL 50% 乙腈 - 水溶液将残渣重新溶解，然后转

移至微型管中。

• 微型管在 30000 g 、4℃下离心 10 分钟。

• 将上清液转移至 HPLC 微型管中。

使用校正标准品的检测结果，进行线性回归，得到四点

校正曲线，使用此校正曲线对抗球虫药进行定量。所有

校正标准品均进样三次。外标和控制标准品应至少进样 3

次，且这几次进样应在进样序列中均匀分布，例如，在

序列开始时、序列运行中、序列运行结束时分别进样，

用于监控保留时间的精密度和 MS 的灵敏度。

LC/MS 分析

表 2. 用于氯吡多 , 氯苯胍 , 常山酮 , 尼卡巴嗪 (DnC),

和地克珠利分析的方法 1.

方法 1

色谱柱 Acclaim Polar Advantage II (PA2), 3 µm, 2.1×150 mm

SPE 小柱 SolEx HRP, 12–14 µm, 2.1×20 mm

进样体积 10 µL

温度 (TCC) 25 ℃

温度 (WPS) 20 ℃HP 2- 位 10- 通阀

时间 位置

0.0 10–1

3.0 1–2

6.0 10–1高压梯度泵 (HPG) 作为上样泵

流动相 A H2O ，含 0.1% FA

流动相 B 30% 乙腈 /30% DMK/40% 2-PrOH时间 流速 (mL/min) %A %B

0.0 0.1 100 0

0.4 0.1 100 0

0.41 0.75 100 0

3.0 0.75 100 0

3.1 0.75 0 100

3.2 0.05 0 100

6.0 0.05 0 100

6.1 0.75 0 100

12.0 0.75 0 100

12.1 0.75 100 0

15.0 0.75 100 0

15.1 0.1 100 0

23.0 0.1 100 0双三元泵 (DGP) 的左泵作为分析泵

流动相 A H O ，含 0.1% FA

流动相 B 甲醇时间 流速 (µL/min) %A %B

0.0 300 85 15

3.0 300 85 15

3.001 300 70 30

3.002 150 70 30

6.0 150 70 30

6.001 150 85 15

6.002 300 85 15

12.0 300 30 70

12.2 300 0 100

18.0 300 0 100

18.1 300 85 15

23.0 300 85 15双三元泵 (DGP) 的右泵作为稀释泵

流动相 A H2O时间 流速 (µL/min) %A

0.0 650 100

0.3 650 100

0.4 10 100

3.0 10 100

3.001 150 100

6.0 150 100

6.001 10 100

23.0 10 100

6

方法 2

色谱柱 Acclaim Polar Advantage II (PA2), 3 µm, 2.1×150 mm

SPE 小柱 SolEx HRP, 12–14 µm, 2.1×20 mm

进样体积 10 µL

温度 (TCC) 40 ℃

温度 (WPS) 20 ℃HP 2- 位 10- 通阀

时间 位置

0.0 10–1

3.0 1–2

6.0 10–1

流动相 A 水，含 0.1% FA

流动相 B 30% 乙腈 /30% DMK/40% 2-PrOH时间 流速 (mL/min) %A %B

0.0 0.1 100 0

0.5 0.1 100 0

0.51 0.75 100 0

3.0 0.75 100 0

3.1 0.75 0 100

3.2 0.05 0 100

6.0 0.05 0 100

6.1 0.75 0 100

12.0 0.75 0 100

12.1 0.75 100 0

15.0 0.75 100 0

15.1 0.05 100 0

20.7 0.05 100 0

20.8 0.1 100 0双三元泵 (DGP) 的左泵作为分析泵

流动相 A 水，含 0.1% FA2

流动相 B 甲醇时间 流速 (mL/min) %A %B

0.0 300 55 45

3.0 300 55 45

3.001 300 10 90

3.002 150 10 90

6.0 150 10 90

6.001 150 55 45

6.002 300 55 45

10.0 300 0 100

15.0 300 0 100

15.1 300 55 45

20.8 300 55 45双三元泵 (DGP) 的右泵作为稀释泵

流动相 A 水Time Flow (µL/min) %A

0.0 650 100

0.5 650 100

0.51 10 100

3.0 10 100

3.001 150 100

6.0 150 100

6.001 10 100

20.8 10 100

表 3. 用于癸氧喹酯 , 拉沙里菌素 , 马杜霉素 , 莫能菌素 ,

那拉霉素 , 和沙利霉素分析的方法 2.

表 4. 上述两种方法的 ms/ms 检测条件

分析物保留时间(min)

母离子(Q1) Mass

[m/z]

子离子(Q1) Mass

[m/z]离子化模式

氯吡多 10.1192.0194.0

157.0103.0

正离子模式

氯苯胍 14.0334.2336.2

155.0180.0

正离子模式

常山酮 12.1416.1416.1

138.1398.0

正离子模式

癸氧喹酯 11.7418.3418.3

372.2232.0

正离子模式

癸氧喹酯 -d5 11.7 423.3 377.3 正离子模式

拉沙里菌素 13.0613.4613.4

377.4577.5

正离子模式

莫能菌素 11.7693.5693.5

675.6461.5

正离子模式

沙利霉素 11.9773.5773.5

431.5265.4

正离子模式

那拉霉素 12.1787.5787.5

531.6431.6

正离子模式

马杜霉素 11.8934.6934.6

647.8629.7

正离子模式

尼卡巴嗪 (DNC) 15.4301.0301.0

136.9106.9

负离子模式

尼卡巴嗪 -d8 (DNC-d8) 15.4 309.0 140.9 负离子模式

地克珠利 14.6405.1407.0

334.2336.2

负离子模式

结果和讨论

扩展的在线 SPE 设置

方法开发

由三个不同的 LC 泵组成的扩展的在线 SPE 设置为极性范

围较宽的分析物和样品溶剂提供了灵活的色谱样品富集

和净化手段。允许在 SPE 步骤进行之前或之后，通过往样

品中加水的方法减弱溶剂强度 ( 图 2A)。这一稀释扩展的

不会对色谱结果产生负面影响。当极性化合物溶解于强

溶剂时 (50% 水 / 乙腈 )，由于有机样品溶剂具有强洗脱能

力，所以用水进行稀释之后，可以明显使分析物的保留

增强。由于使用在线 SPE 小柱来富集分析物并除去基质，

所以稀释步骤不会对分析色谱柱上的色谱分离产生影响。

对于非极性分析物而言，需要使用大量的有机溶剂才可

将其从 SPE 固定相上转移到分析色谱柱上，而这一扩展的

在线 SPE 设置可以对 SPE 的洗脱液 ( 转移液 ) 进行稀释 ( 图

2B)，由于样品会在分析色谱柱柱头重新聚集，因此稀释

过程不会对后续的 LC 分离产生影响，仍然可以提供出色

的色谱结果。

7

7

The same can be seen in a true on-line SPE backflush configuration. After loading and washing with 100% acidified water, the analyte transfer succeeded in two ways: polar analytes (clopidol, diclazuril halofuginone, nicarbazin (DNC), and robenidine) could be transferred to the analytical column with a mobile phase composition of 30% methanol (Figure 5A), while non-polar analytes (decoquinate, lasalocid, maduramicin, monensin, narasin, and salinomycin) needed 90% methanol to elute from the enrichment phase, but still eluted moderately late (Figure 5B). The polarity mismatch between the high amount of organic solvent needed to transfer non-polar analytes and the analytical column lead to retention loss; this can easily be corrected by diluting the transfer solvent with aqueous mobile phase by T-piece infusion behind the SPE material (Figure 2), which, due to sample refocusing effect on the analytical column head, does not compro-mise the subsequent LC separation.

Due to the heterogeneous polarities of the coccidiostats, on-line SPE method development is quite challenging. Thus, two solid phase materials were compared: a TurboFlow Cyclone-P, 50 × 0.5 mm cartridge and a SolEx HRP, 20 × 2.1 mm cartridge. To investigate enrichment and transfer behavior of the analytes, both columns were connected to the UHPLC system in the same manner as analytical separation columns and loaded with 10 µL of standard solutions at 0.75 mL/min in 0.1% aqueous formic acid. Then the solvent strength was raised to 100% methanol, the SPE column eluted in foreflush direction, and the effluent monitored by tandem-mass spectrometry. Although the majority of analytes were trapped without problems, the Cyclone-P cartridge exhibited immediate breakthrough of some highly polar analytes (Figure 4A). In contrast, the SolEx HRP cartridge showed a much more balanced retention for polar and non-polar com-pounds, eluting in two distinct fraction windows, even when a pure organic solvent was used for elution (Figure 4B).

Figure 4. Foreflush on-line sPe trapping and elution of coccidiostats on Cyclone-P (a) and solex HrP (b) cartridges.

Figure 5. backflush on-line sPe trapping and elution of polar (a) and non-polar coccidiostats (b) on solex HrP cartridges (no analytical column connected).

Retention time tR [min]

Sign

al In

tens

ity [1

05 c

ts]

08

8

20 4 6 10

2 1

0.5

1.0

1.5

[min]

06

18

20 4 8

Sign

al In

tens

ity [1

05 c

ts]

[104

cts

]

Retention time tR [min]

B

A

Load / wash

Transfer using30% methanol

Transfer using90% methanol

Load / wash

Retention time tR [min]

Sign

al In

tens

ity [1

04 c

ts]

08

10

20 4 6

Retention time tR [min]

820 4 6

Sign

al In

tens

ity [1

04 c

ts]

0

16 B

A

图 4. 使用 Cyclone-P (A) 和 SolEx HRP (B) 小柱吸附

并洗脱抗球虫药 ( 正向冲洗 )。

图 5. 使用 SolEx HRP 吸附并洗脱极性 (A) 和非极性 (B)

抗球虫药 ( 未连接分析色谱柱 )。

由于抗球虫药的极性差异很大，因此开发在线 SPE 方法

极具挑战性。因此，比较了两种固相萃取填料：TurboFlow

Cyclone-P, 50×0.5mm 小柱和 SolEx HRP, 20×2.1mm 小柱。为

了考察对分析物的富集和转移性能，两支小柱均以与分

析色谱柱相同的方式连接到 UHPLC 系统上，然后上样 10μL

标准溶液，上样流速为 0.75mL/min，流动相为 0.1% 乙酸

水溶液。然后溶剂强度升高，变为 100% 甲醇，以正向方

式冲洗 SPE 小柱，然后使用串联质谱检测洗脱液。虽然

Cyclone-P 填料可以吸附大部分分析物，但对于一些高极性

分析物，立即出现流穿的情况 ( 图 4A)。相比之下，SolEx

HRP 填料对极性和非极性化合物的保留较为平衡，即使使

用纯有机溶剂洗脱时，两类化合物也在两个不同的保留

时间窗口内被洗脱 ( 图 4B)。

在实际的在线 SPE 反冲设置中，也可观察到相同的结果。

上样，并使用 100% 酸水冲洗之后，分析物成功地以两种

方式转移到分析柱上：使用 30% 的甲醇溶液可以将极性

分析物 ( 氯吡多、地克珠利、常山酮、尼卡巴嗪 (DNC)、

和氯苯胍 ) 转移到分析柱上 ( 图 5A)，而需要使用 90% 的

甲醇溶液才可以将非极性分析物 ( 癸氧喹酯、拉沙里菌

素、马杜霉素、莫能菌素、那拉霉素、和沙利霉素 ) 从富

集相中转移到分析柱上，但洗脱时间还是要稍长一些 ( 图

5B)。用于洗脱非极性分析物的高比例的有机溶剂，以及

分析色谱柱之间的极性差异，会导致“保留丢失”的现象。

通过位于 SPE 小柱之后的 T- 型三通 ( 图 2)，可以用水将洗

脱溶剂 ( 转移溶剂 ) 稀释，从而轻易地解决了“保留丢失”

的问题。由于样品会在分析色谱柱柱头重新聚集，因此

稀释过程不会对后续的 LC 分离产生影响。

8

结果是两次不同的进样可以在相同的在线 SPE-UHPLC-MS/

MS 系统中无缝运行，从而对所有目标抗球虫药进行定量。

所有样品均使用 50% 水 / 乙腈进行溶解，然后上样到 SPE

小柱上，上样时间为 3min；使用 0.1% 甲酸 - 水溶液稀释

样品溶剂，确保即使上样溶剂的溶剂强度较高的情况下，

目标物在 SPE 上也有保留。方法 1 吸附极性的抗球虫药，

然后使用 DGP-3600 双三元泵的左泵输送 30% 甲醇溶液将

这些极性的抗球虫药从固相萃取柱上洗脱下来 ( 图 2)，然

后通过位于 SPE 小柱之后的 T 型三通，用水稀释流动相 ( 洗

脱液 )，使最终的流动相中的甲醇浓度为 15%，然后到达

分析柱。然后，使用 15% 至 70% 的甲醇梯度将这些分析

物分离，分析时间为 6 分钟。方法 2 吸附非极性的抗球虫

药，用 90% 甲醇溶液将这些抗球虫药从固相萃取柱上洗

脱下来，同样，通过位于分析柱之前的 T 型三通，将流

动相用水稀释，使流动相的最终甲醇含量为 45%，然后到

达分析柱。流动相梯度为 45% 至 100% 的甲醇，分析时间

为 4分钟。由于两种分析方法使用相同的流动相和固定相，

因此可以轻易地实现连续运行。

在分析实验室中，固相萃取方法是样品制备过程中的一

种成熟方法。在线 SPE 的主要目的是为了减少样品的制备

时间，从而降低实验室成本并提高通量。如果使用手动

的离线 SPE 方法制备样品 ( 鸡蛋中的抗球虫药 )，通常情

况下，处理 10 个样品需要大约 6 个小时，而在线 SPE 方

法处理相同数量的样品，仅需要 3 小时。但是，本文所

述的在线 SPE方法除了能够提高通量之外，还有若干优点，

包括具有更好的重现性，缩短暴露于有毒化学试剂的时

间，显著提高数据的可靠性。图 6 比较了使用传统的离

线 SPE 方法 (A) 和在线 SPE 方法 (B) 时，鸡蛋中的莫能菌素

的 SRM 检测图。在线 SPE 方法的噪声水平较离线方法降

低了 4 倍，因此可以显著提高灵敏度。

8

The UHPLC separation was achieved using the Acclaim PolarAdvantage II column, which showed baseline resolution for all analytes of interest (Figure 7).

As a result, two different injections that seamlessly ran on the same on-line SPE-UHPLC-MS/MS system were required to quantify all coccidiostats of interest. All samples were dissolved in 50% water/acetonitrile and loaded onto the SPE cartridge for 3 min; diluting this sample solvent plug with 0.1% aqueous formic acid ensured retention on the SPE material despite the consid-erably high solvent strength of the sample plug. Method 1 trapped the polar coccidiostats and transferred them from the SPE cartridge via the left pump of the DGP-3600 dual gradient pump using a mobile phase with 30% methanol (Figure 2). Water was added to this mobile phase after the SPE cartridge via the T-piece, resulting in a final content of 15% methanol in the mobile phase before it entered the analytical column. Then, a solvent strength gradient from 15% up to 70% methanol was used to separate the analytes within 6 min. Method 2 trapped non-polar coccidiostats and transferred them from the SPE cartridge using 90% methanol. Again, water was added to this mobile phase via the T-piece in front of the analytical column, resulting in a total of 45% methanol in the mobile phase for the separation. The mobile phase gradient ran from 45% to 100% methanol within 4 min. As both methods used the same mobile and stationary phases for analytical separation, they can easily run consecutively.

In analytical laboratories, solid phase extraction is an established method used for the preparation of samples. The main objective of on-line SPE is to decrease sample preparation time, which results in decreased labor costs and increased throughput. Sample preparation for coccidiostats in eggs by manual off-line SPE typically needs a working effort of about six hours for 10 samples, while on-line SPE only requires three hours for the same number of samples. However, the advantage of this on-line SPE approach, next to throughput increase, is better repeatability and minimized exposure to hazardous chemicals, as well as a significant improvement in data quality. Figure 6 compares the SRM traces of a monensin analysis from eggs using traditional off-line (A) and on-line SPE (B). On-line SPE leads to a more than four-fold decrease in noise amplitude and thus, a signifi-cant increase in sensitivity.

Figure 6. srm trace (693.5 675.6) of a uHPlC-ms/ms analysis of 5 ppb monensin standard in egg after sample preparation by off-line (a) and on-line sPe (b).

10 20

Monensin

Noise level = 200

20100

Monensin

Sign

al In

tens

ity [1

03 c

ts]

0

4

Sign

al In

tens

ity [1

03 c

ts]

0

3.5

Noise level ≤ 50

Retention time tR [min]

Retention time tR [min]

B

A

图 6. 离线 SPE 方法 (A) 和在线 SPE 方法 (B)

处理样品之后，使用 UHPLC-MS /MS 分析鸡蛋中的

莫能菌素 (5ppb) 的 SRM 离子流图 (693.5 → 675.6)

UHPLC 分离时，使用 Acclaim PolarAdvantage II 色谱柱，该色

谱柱可以实现所有目标分析物的基线分离 ( 图 7)。

9

9

Matrix Standard needed to be injected at least three times each and dispersed to different stages of the sequence. Typically, quality control of eggs starts with a screening approach, checking the samples for critical amounts of coccidiostats close to the regulatory limits. Calibration of the screening sequences was done by external calibration with calibration standards spiked to blank eggs which had been worked up following the sample preparation procedure. Any suspicious samples were then explicitly quantified based on peak areas by standard addition of the Calibration Standard solutions. All calibration curves showed excellent linearity with correlation coefficients r between 0.9879 (robenidin) and 0.9993 (DNC), see Figure 8.

Quantitative Analysis - Screening of Egg SamplesLinearity and SensitivityEach Blank Value and External Standard dissolved in solvent was first injected in duplicate using method 1. For method verification, the External Standard, the Control Standard, and the Matrix Standard were injected at least three times and dispersed to different stages of the sequence. After all samples were analyzed by method 1, the system was equilibrated to the conditions given by method 2. After starting with at least two blank runs for equilibration purposes, each Blank Value and External Standard was injected in duplicate using method 2. Again, the External Standard, the Control Standard, and the

Figure 7. srm traces of coccidiostats.

定量分析 – 鸡蛋样品的筛查

线性和灵敏度

在分析开始时，先进样空白和外标溶液 ( 使用溶剂溶解 )，

每样品进样 2 针，使用方法 1 进行分析。进样外标溶液、

控制标准品和基质标准品至少 3 针，且这几次进样应在

进样序列中均匀分布。在所有样品均使用方法 1 分析结

束之后，使用方法 2 的条件平衡系统。之后，至少运行

两针空白，平衡系统；然后先进样空白和外标溶液，每

样品进样 2针，使用方法 2进行分析。同样，进样外标溶液、

控制标准品和基质标准品至少 3 针，且这几次进样应在

进样序列中均匀分布。对鸡蛋进行质量控制，通常情况

下是先进行筛查，检查样品中的抗球虫药物的含量是否

接近法规限量，筛查序列的 数据通常使用外标法 ( 空白

鸡蛋加标标准品，按照样品制备步骤进行制备 ) 进行校准。

然后，对于任何可疑样品，使用标准添加的校正标准溶

液的峰面积对样品中的药物含量进行准确定量。所有校

正曲线都具有非常好的线性，相关系数为 0.9879（氯苯胍）

和 0.9993(DNC) 之间，见图 8。

10

10

Identification of precursor and product ions in the positive and negative electrospray mode and preliminary optimization of instrument settings were performed by continuous infusion of the individual coccidiostats at 0.1 µg/mL dissolved in 50% methanol in water containing 0.1%formicacid.Quantitationwasdonewiththemostintense product ion. Identification of each coccidiostat was confirmed with its ion ratio and enhanced product ion (Figure 9). An injection volume of 10 μL was selected for sensitivity reasons. As an analytical method used for official control in compliance with European legislation,

a single laboratory validation of the method was carried out and passed according to Commission Decision 2002/657/EC.9 Limits of detection (LOD) ranged from 0.02–0.5µg/kg,thelimitsofquantitation(LOQ)from0.06–1.5 µg/kg, thus being 5–10 times lower than the allowed maximum residue levels of coccidiostats in eggs, with very good recovery rates for all relevant analytes (Table 5).

Figure 8. Calibration plots of lasalocid and DnC.

Figure 9. the enhanced product ion of lasalocid.

LOD [µg/kg]

LOQ [µg/kg]

MRL [µg/kg]

Recovery (at 30 μg/kg) [%]

Measurement uncertainty [%]

Clopidol 0.08 0.25 2.0* 100 10

Robenidin 0.5 1.5 25.0 92.0 13

Halofuginone 0.1 0.3 6.0 90.4 10

Decoquinate 0.05 0.15 20.0 98.2 13

Lasalocid 0.4 1.2 5.0 (150) 101 13

Monensin 0.06 0.2 2.0 93.0 18

Salinomycin 0.07 0.22 3.0 104 28

Narasin 0.02 0.06 2.0 107 37

Maduramicin 0.1 0.3 2.0 118 30

Nicarbazin (DNC) 0.15 0.45 50.0 96.1 11

Diclazuril 0.13 0.4 2.0 98.7 16

*MRL of clopidol with respect to [10]

Lasalocidr = 0.9982

DNCr = 0.9982

Lasalocid

10

Identification of precursor and product ions in the positive and negative electrospray mode and preliminary optimization of instrument settings were performed by continuous infusion of the individual coccidiostats at 0.1 µg/mL dissolved in 50% methanol in water containing 0.1%formicacid.Quantitationwasdonewiththemostintense product ion. Identification of each coccidiostat was confirmed with its ion ratio and enhanced product ion (Figure 9). An injection volume of 10 μL was selected for sensitivity reasons. As an analytical method used for official control in compliance with European legislation,

a single laboratory validation of the method was carried out and passed according to Commission Decision 2002/657/EC.9 Limits of detection (LOD) ranged from 0.02–0.5µg/kg,thelimitsofquantitation(LOQ)from0.06–1.5 µg/kg, thus being 5–10 times lower than the allowed maximum residue levels of coccidiostats in eggs, with very good recovery rates for all relevant analytes (Table 5).

Figure 8. Calibration plots of lasalocid and DnC.

Figure 9. the enhanced product ion of lasalocid.

LOD [µg/kg]

LOQ [µg/kg]

MRL [µg/kg]

Recovery (at 30 μg/kg) [%]

Measurement uncertainty [%]

Clopidol 0.08 0.25 2.0* 100 10

Robenidin 0.5 1.5 25.0 92.0 13

Halofuginone 0.1 0.3 6.0 90.4 10

Decoquinate 0.05 0.15 20.0 98.2 13

Lasalocid 0.4 1.2 5.0 (150) 101 13

Monensin 0.06 0.2 2.0 93.0 18

Salinomycin 0.07 0.22 3.0 104 28

Narasin 0.02 0.06 2.0 107 37

Maduramicin 0.1 0.3 2.0 118 30

Nicarbazin (DNC) 0.15 0.45 50.0 96.1 11

Diclazuril 0.13 0.4 2.0 98.7 16

*MRL of clopidol with respect to [10]

Lasalocidr = 0.9982

DNCr = 0.9982

Lasalocid

图 8. 氯苯胍和 DNC 的校正曲线

图 9. 拉沙里菌素的增强型离子在正离子和负离子 ( 电喷雾电离 ) 模式下鉴定抗球虫药的

母离子和子离子，通过连续进样抗球虫药单体 (0.1μg/mL,

溶于 50% 甲醇 - 水溶液中，含 0.1% 甲酸 )，对仪器的设置

进行优化。使用丰度最高的子离子进行定量。通过比较

离子强度比和增强型子离子，对抗球虫药进行鉴别 ( 图 9)。

出于灵敏度的考虑，将进样量设置为 10uL。由于本方法

将用于正式质检，根据欧盟法规，对方法进行了单一实

验室认证，根据欧盟委员会的 2002/657/EC 决议，通过认

证 9。方法的检测限为 (LOD) 0.02–0.5μg/kg，定量限 (LOQ) 为

0.06–1.5μg/kg，这一定量限比规定的鸡蛋中的抗球虫药残

留的最高限量低了 5-10 倍，而且对于所有相关的分析物，

都具有非常 好的回收率 ( 表 5)。

LOD[µg/kg]

LOQ[µg/kg]

MRL[µg/kg]

回收率(30 µg/kg) [%]

测量的不准确性[%]

氯吡多 0.08 0.25 2.0* 100 10

氯苯胍 0.5 1.5 25.0 92.0 13

常山酮 0.1 0.3 6.0 90.4 10

癸氧喹酯 0.05 0.15 20.0 98.2 13

拉沙里菌素 0.4 1.2 5.0 (150) 101 13

莫能菌素 0.06 0.2 2.0 93.0 18

沙利霉素 0.07 0.22 3.0 104 28

那拉霉素 0.02 0.06 2.0 107 37

马杜霉素 0.1 0.3 2.0 118 30

尼卡巴嗪 (DNC) 0.15 0.45 50.0 96.1 11

地克珠利 0.13 0.4 2.0 98.7 16

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结论

一种简单的、可靠的在线固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联

质谱方法 ( 在线 SPE–UHPLC–MS/MS)，可用于检测鸡蛋中的

11 种痕量抗球虫药。在线 SPE 法与离线 SPE 法相比的最

大好处是可以使通量提高两倍——在相同的时间里，使

用典型的离线 SPE-HPLC 法只能得到一个样品的结果，而

使用在线 SPE 则可得到两个样品的结果。使用加标基质进

行外标校准，进行常规筛查，可以识别出可疑样品，然

后使用标准添加法进行校准，消除基质效应的影响，进

行更准确的定量。这一方法进行了单一实验室验证，符

合欧盟法规的所有要求 9。两种方法均具有非常好的灵敏

度、精密度和准确度。因此，本方法可以用于正式质检，

用于上述 11 中抗球虫药 ( 目标量和痕量 ) 的筛查和定量。

致谢

非常感谢 Thermo Fisher Scientific 的合作。此外，感谢 Lorenz

Muralt 的讨论，感谢 Dr. Daniel Kull 撰写这篇应用报告。

参考文献

1. OJEU. Regulation (EC) No 1831/2003 OF THEEUROPEAN

PARLIAMENT AND OF THE COUNCILon additives for use in

animal nutrition. [Online]September 22, 2003, 268, 29–30. http://

irmm.jrc.ec.europa.eu/SiteCollectionDocuments/EC-1831-2003.

pdf (accessed May 15, 2013).

2. OJEU. Directive 70/524/EEC, [Online] 2003, 268,29–43. http://

irmm.jrc.ec.europa.eu/SiteCollection-Documents/EC-1831-2003.

pdf (accessed May 15,2013).

3. OJEU. Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December

2009 on pharmacologically activesubstances and their maximum

residue limits in foodstuffs of animal origin. [Online] January

20, 2010, 15, 1-76. http://ec.europa.eu/health/files/mrl/

mrl_20101212_consol.pdf (accessed May 15, 2013).

4. OJEU. COMMISSION REGULATION (EC) No 124/2009 of 10

February 2009 setting maximum levels for the presence of

coccidiostats or histomonostats in food resulting from the

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10.OJEU. Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990

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11.“Kokzidiostatika in Geflügelfleisch und Eiern; LC-MS/MS”

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