Administracin de fructosa rpidamente induce el estrs oxidativo que provoca cambios compensatorios metablica heptica. Se evalu el efecto de un antioxidante, R/S--lipoico en estrs oxidativo inducido por fructosa y cambios del metabolismo de carbohidratos.Mtodos: Ratas Wistar fueron alimentadas con una dieta comercial estndar, la misma dieta ms 10% de fructosa en agua potable, o inyectado con R/S--lipoico (35 mg/kg, i.p.) (control L y fructosa L). Tres semanas despus, la sangre muestras fueron dibujadas a medida de glucosa, triglicridos, insulina y la homeostasis modelo evaluacin-insulina Matsuda ndices y resistencia (HOMA-IR). En el hgado, medimos la expresin gnica, contenido de protena y la actividad de varias enzimas y metabolitos concentracin.Resultados: Cambios de peso Comparable y de caloras se registraron en todos los grupos despus de los tratamientos.Fructosa alimentado ratas tena hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, mayor HOMA-IR y lowerMatsuda ndices comparados para controlar los animales. Fructosa alimentado ratas mostraron fructoquinasa aumento de la expresin gnica, contenido y actividad de la protena, glucokinase y glucosa-6-fosfatasa gene expresin y actividad, almacenamiento de glucgeno, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mRNA y actividad enzimtica, (NAD (P) H oxidasa subunidades gp91phox y p22phox) gene expresin y concentracin de la protena y contenido proteico de Fosfofructoquinasa-2 de controlan de ratas. Todos estos cambios fueron prevenidos por R/S--lipoico cido co-administracin.CONCLUSIONES: Fructosa induce cambios metablicos hepticos que presumiblemente comienzan con fructosa crecientefosforilacin por fructoquinasa, seguida de cambios adaptativos que intentan cambiar el flujo de sustrato del metabolismo mitocondrialpara almacenamiento de energa. Estos cambios pueden prevenirse efectivamente por la administracin concomitante de cidoR/S--lipoico.Significado general: Control del estrs oxidativo podra ser una estrategia til para evitar que la transicin de la deterioradatolerancia a la glucosa a diabetes tipo 2.

IntroduccinVarios autores han sugerido que el aumento del uso de los carbohidratos refinados como jarabes ricos en fructosa ha contribuido enormemente a las epidemias de de la obesidad y la diabetes tipo 2 [1,2]. Adems, muchos investigadores han demostrado que la administracin de dietas ricas en fructosa para ratas normales induce varias disfunciones metablicas y endocrinas, afectando muchos tejidos y rganos [3-6]. Puesto que el hgado es principalmente responsable para la absorcin de la fructosa y el metabolismo, un nmero de estudios ha versado sobre su efecto en el metabolismo de la glucosa heptica [7,8]. Aunque no el mecanismo subyacente de efectos perjudiciales inducida por fructosa es completamente entendida evidencia experimental sugiere que el estrs oxidativo podra desempear un papel clave [9-12]. En este sentido, tenemos previamente demostr que la administracin de fructosa a corto plazo en ratas normales induce una mejora significativa de los marcadores de estrs oxidativo en varios rganos incluyendo el hgado [3,4], asociados a resistencia a la insulina, un interruptor de metabolismo heptico de carbohidratos y lpidos hacia su camino anablico e intolerancia a la glucosa [5,6,13,14]. Si los cambios habian mencionado que estaban vinculados especficamente a fructosa-inducidos oxidativo estrs, entonces la administracin de un agente antioxidante debera evitar/aliviar el desarrollo del estrs oxidativo. Apoyando esta hiptesis, previamente hemos demostrado la coadministracin de un antioxidante, R/S--lipoico a fructosa consumieron previene tanto estrs oxidativo y la mayora de las disfunciones endocrino-metablica provocadas por fructosa [15]. No sabemos, sin embargo, el potencial vnculo molecular entre estrs oxidativo inducido por fructosa y el metabolismo de los carbohidratos deterioro resultante. En la serie de experimentos descritos en este documento se examin el efecto de R/S--lipoico cido co-administracin en metabolismo de carbohidratos en fructosa consumieron para clarificar los mecanismos adaptativos involucrados en inducido por fructosa oxidativo estrs que puede ser la base para las estrategias para la comprensin de la de la obesidad y tipo 2 diabetesmellitus frecuentemente asociados con consumo de alta fructosa.

Materiales y mtodos2.1. Los productos qumicos y medicamentos reactivos del grado ms puro disponible se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Estados Unidos). Una solucin inyectable (Megatioc ) de R/S--lipoico fue adquirida de John Martin S.R.L (Buenos Aires-Argentina).2.2. animalesWistar macho Normal ratas (150 180 g) fueron mantenidas a 23 C con un ciclo fijo de oscuros 12 h (6:00 18:00 h) y divididas en 4 grupos de: dieta comercial estndar ad libitum y agua del grifo (control),la misma dieta ms el 10% de fructosa en los agua potable (fructosa) y grupos de dos adicionales que fueron inyectados con R/S--lipoico (35 mg/kgi.p) (control L y fructosa L) durante los ltimos cinco das de del tratamiento. Control y fructosa animales fueron inyectados con el mismo volumen de tampn salino. La ingesta de agua se midi diariamente, y se registr el peso de cuerpo individual semanal. Este procedimiento fue Replica 5 veces (en total, 20 animales por grupo). Veintin das despus de este tratamiento, las muestras de sangre de animales ayunas 4-h fueron extradas del plexo retroorbital bajo luz halotano anestesia y recogidas en tubos heparinizados para medir la glucosa en la sangre, suero nivel immunoreactive de la insulina y triglicridos. Despus, los animales fueron asesinados por decapitacin y una porcin del lbulo medio del hgado fue quitada para realizar todos los ensayos. Cuando los ensayos no fueron realizado inmediatamente, el lbulo estaba inmerso rpidamente en nitrgeno lquido y posteriormente almacenado en una congeladora en el C 80; todas las actividades de la enzima se midieron en una semana. Los experimentos con animales y manejo fueron realizada segn los "principios ticos y directrices para los animales de experimentacin" (3 edicin 2005) de la Academia Suiza de medicinaCiencias.

2.3. sricasGlucosa se midi con la glucosa oxidasa Dios-PAPmethod (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), se determinaron los niveles de triglicridos con un kit comercial (color TG GPO/PAP AA, Wiener lab, Argentina) y los niveles de insulina inmunorreactiva fueron determinado mediante radioinmunoensayo (Linco Research Inc., IN, USA). Valores de glucemia insulina y ayuno suero fueron utilizados para estimar la resistencia la homeostasis modelo evaluacin de la insulina (HOMA-IR) (suero insulina (U/ml) ayuno de glucosa en sangre (mM)) / 22.5 [16]. El ndice de Matsuda (sensibilidad a la insulina heptica) fue calculado con la frmula k / ayuno plasma insulina (FPI) ayuno de plasma glucosa (FPG), donde k: 22.5 18 [17].2.6. Western blot anlisisInmunodeteccin de glucoquinasa, 2 Fosfofructoquinasa (PFK-2), fructoquinasa, p22phox y -actina fue hecho en homogenados del hgado. Protena concentracin se cuantific mediante los anlisis de protena de Bio-Rad [20]. Posteriormente, ditiotreitol y azul de bromofenol se aadieron a una concentracin final de de 100 mM y 0,1%, respectivamente. Unin inespecfica sitios de las membranas fueron bloqueados por la incubacin durante la noche anterior con leche en polvo descremada a 4 C. Enzima identificacin y cuantificacin se realizaron utilizando anticuerpos primarios (cuadro 2). Diaminobenzidina (Sigma Co.) o quimioluminescencia mejorada (GE Healthcare, UK) fue utilizada para desarrollo del color. Finalmente, las bandas fueron cuantificado por densitometra sea utilizando el analizador de Gel-Pro software. -actina densidad fue utilizada para normalizar el contenido de protena: el contenido relativo de objetivo protena fue dividido por el nivel de protena -actina relativa de cada grupo.2.7. hgado glucgeno que contenidoTrozos de hgado fresco (400 mg) fueron colocados en 1 ml de 33% KOH y se incubaron durante 20 min a 100 C. Entonces, 1,25 ml de etanol ha sido aadido a cada tubo y la mezcla se incub durante 48 h a 4 C y por ltimo se centrifug a 700 g por 20 min. El obtainedwere de pellets resuspendi en 1 ml de agua destilada y 3 ml de solucin de antrona (0,1% en el 84%H2SO4) y se incubaron durante 20 min a 100 C. La absorbancia fue medido fotomtricamente a 620 nm y los resultados se expresaron como mol de glucgeno/mg de tejido [21].2.8. hgado fructoquinasa actividadPedazos de liverwere homogeneizaron en bfer que contiene 25 mMHEPES (pH 7.1), 100 mM KCl, 1 mM DTT y 0,1 mM EDTA; eran entonces girar a 10.000 g a 4 C durante 20 min y alcuotas del sobrenadante fueron congelados para el ensayo de actividad adicional. Para medir el FK actividad utilizamos un acoplado ensayo enzimtico basado en mtodos existentes [22]. Brevemente, 10 20 l de la muestra fueron agregados a 200 l de la que contiene reactionmixture de 25 mM HEPES (pH 7.1), 6 mM MgCl2, 25 mM KCl, 10 mM NaF, 5 mM D-fructosa, 0.2mm NADH, fosfoenolpiruvato 1 mM, 40 U/ml piruvato quinasa, 40 U/ml lactato deshidrogenasa y 50 mM n-acetil-D-glucosamina (para inhibir la hexoquinasa pero conservan fructoquinasa actividad). La reaccin fue iniciada por aadir 10 l de ATP (concentracin de final de 5 mM) y medir cuantitativamente por consiguiente una disminucin de la densidad ptica a 340 nm durante 30 min.2.9. heptica glucoquinasa actividadHgado trozos extrados de los animales se homogeneizaron en icecold PBS con 0,1 mM PMSF, benzamidine 0,1 mM, 2 mM DTT, 4 g/ml aprotinina y 0,3 Msucrose, pH 7,5. Alcuotas de los homogenados se centrifugaron a 600 g para separar la fraccin nuclear. El sobrenadante de se centrifug a 8000 y 100.000 g a 4 C, y el sobrenadante resultante fue recogido e identificado como la fraccin citoslica (cf), que contiene la forma funcional activa de la enzima. Despus de eso, la fraccin nuclear, que contiene la forma inactiva de glucokinase debido a su unin con la protena reguladora, se resuspendido y se incub durante 12 minutos a 20 C en un permeabilizingmedium que contienen 150 mmol/ml KCl, 3 mmol/l Hepes, 2 mmol/l de TDT y digitonin de 0,04 mg/ml, pH 7.2. Al final de la incubacin, las muestras fueron centrifugados (600 g) y el sobrenadante digitonin fue eliminado y recogidos por otras determinaciones (nf). Digitonin tratamiento permiteel lanzamiento de glucoquinasa de su protena reguladora, renderizado una glucokinase soluble y activo. Glucokinase actividad fue finalmente medido en alcuotas de las fracciones del hgado y el coeficiente de actividad para cf/nf considerada como una medida indirecta de translocacin de ncleo/citosol [5]. Tasas de la fosforilacin de la glucosa en ambos fractionsweremeasured 37 C, pH 7,4, registrando el aumento de la absorbancia a 340 nm en un bien establecida Enzima-juntada fotomtrico ensayo [5,23]. Glucokinase actividad se obtuvo restando la actividad medida en glucosa 1 mM (hexoquinasa) desde que medido en glucosa 100 mM. La actividad enzimtica se expresa como m-unidades/mg de protena. Una unidad de enzima actividad se defini como 1 mol de glucosa-6-fosfato formado de glucosa y ATP/min a 37 C.

Resultados3.1. Consumo de agua y peso de cuerpoComparable cuerpo peso cambios se registraron en todos los grupos sobre el perodo de 3 semanas de estudio (cuadro 3). Alimentados con fructosa y animales fructosa L bebieron un mayor volumen de agua que control y L (55 11 y 47 12 vs 29 2 y 28 2 ml/da, respectivamente; b p 0.05). Por el contrario, control y control L ratas comieron significativamente alimento ms slido de fructosa y fructosa L ratas (21 1 y 22 1 vs 16 1 y 17 1 g/animal/da; b p 0.05). En consecuencia, mientras que el diario era de ingesta de nutrientes (expresado como porcentaje) diferente en los grupos experimentales (hidratos de carbono/protena/lpidos 45:43:12 para el control y control L comparado con 59:32:9 y 57:34:9 para la fructosa y fructosa L respectivamente), sus caloras intakewas comparable (control: 58 3; control L: 65 2 fructosa: 66 5; fructosa L: 66 4 kcal/da). La ingesta diaria de caloras se calcul con base en la cantidad de ingesta diaria de nutrientes (alimentos slidos adems de la fructosa en el agua) haba multiplicado por 4 (carbohidratos y protenas) o 9 (grasa) caloras.

3.2. sricasFructosa-ratas alimentadas tenan concentraciones ms altas del suero insulina y triglicridos que las ratas control (cuadro 3). El alto ndice de Matsuda y HOMAIR los valores medidos en fructosa consumieron demostraron la presencia de una disminucin de de la sensibilidad a la insulina en el hgado y en los otros tejidos perifricos as como (cuadro 3). La administracin concomitante de R/S--lipoico cido a estas ratas previno el desarrollo de todos los metablicos y endocrinos cambios, as como el respuesta disminuida general y heptica a la insulina; en consecuencia, los diferentes parmetros probaron valores logrados comparables a los registrados en las ratas control; este effectwas an mayor para los triglicridos, en cual triglicridos concentraciones fueron baje que los registrados en las ratas control (cuadro 3).4. discusinPreviamente hemos demostrado que normalWistar ratas alimentadas con fructosa para 21 das desarroll varios desordenes generalizados metablicos y endocrinos [6]. Estos changeswere acompaado por aument concentracin heptica de marcadores de estrs oxidativo y cambios significativos en el metabolismo de carbohidratos y lpidos que canalizara metabolitos del hgado preferencial a almacenamiento de energa en lugar de oxidacin mitocondrial de [5,6,14]. Adems, utilizando el mismo modelo animal, recientemente demostramos que R/S--lipoico cido co-administracin previno el desarrollo de las concentraciones sricas de triglicridos altos y contenido heptica, probablemente por la disminucin de PPAR y su objetivo expresin de genes lipognicos [15]. As, estos cambios seran parte del los mecanismos por los cual hgado compensa la sobrecarga de sustratos lpidos [26], tal como ocurre en el modelo rico en fructosa. Como hemos informado anteriormente [5], fructosa tambin induce un aumento en la actividad heptica glucoquinasa. Puesto que no era la actividad realzada acompaada de cambios significativos en la concentracin de protena glucokinase gene expresin/ , el efecto principalmente el resultado de un aumento significativo de en la translocacin de ncleo/citosol glucokinase as como un aumento en la concentracin de PFK2, un activador glucokinase citoslica [5].Los datos actuales apoyan esos resultados y demostraron que la coadministracin de R/S--lipoico a fructosa consumieron condujo los valores de relacin nuclear citosol y PFK2 contenido a los registrados en el control de animales. Especulamos que la fructosa inducida por aumento de la produccin de especies reactivas de oxgeno desempea un papel modulador activo en hgado glucokinase actividad.Puesto que la insulina estimula la expresin gnica glucokinase va PI3K [27-29] y las ratas alimentados con fructosa tienen hiperinsulinemia, podra argumentarse que la hiperinsulinemia tambin contribuye al aumento glucokinase actividad. Sin embargo, puesto que estas ratas demostraron disminucin de insulina sensibilidad (HOMA-IR mayor y menores ndices de Matsuda en alimentados con fructosa en comparacin con ratas control), esta posibilidad parece menos probable .Mientras que el rango normal de de esos ndices es confuso en roedores, la significativa diferencia entre los dos grupos sugiere fuertemente que la fructosetreated los animales tienen una sensibilidad de insulina disminuida como en comparacin con las ratas de control no slo en el hgado (ndice de Matsuda) pero tambin global (HOMA-IR).Se ha alegado que oportuna y rpida adaptacin metablica a cambios en la fuente de hidratos de carbono es fundamental para mantener la homeostasis de energa y esa glucosa heptica ftil ciclismo desempea un papel importante en ese proceso de [30]. Tambin se ha demostrado que en los ratones, reciclaje de glucosa-6-fosfato glucosa heptica/ compensa glucosa perifrica disposicin, con el fin de preservar la homeostasis de la glucosa [31]. Un comparable aumento de glucoquinasa y actividad de glucosa-6-fosfatasa fue medido en nuestras ratas alimentados con fructosa (107 y 141% sobre el control de los valores, respectivamente), por lo tanto, lo que sugiere que este ciclo ftil podra ser activamente operando en nuestro modelo, disminuye el metabolismo de la glucosa y el flujo del hgado sustratos a las mitocondrias para especies reactivas del oxgeno produccin. Del mismo modo, el aumento de la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (enzima de la lanzadera de las pentosas fosfato limitando) la actividady de depsito de glucgeno y grasa en el hgado sera parte del proceso de adaptacin porque al mismo tiempo disminuye la sobrecarga de sustratos a la mitocondria y refuerza el poder redox por aumentar la produccin de NAD (P) H [32]. NAD (P) H juega un antioxidante importante papel por un complexmechanism que incluye la reduccin de glutatin oxidado a glutatin reducido a travs de la enzima glutatin reductasa, actuando como coenzymefor peroxidasas (a travs de glutatin) y ha exigido para la estabilizacin de la catalasa [32-34]. Refuerza el hecho de que R/S--lipoico co-administracin evitado todos estos cambios nuestra interpretacin original. El hecho de que R/S--lipoico cido co-administracin Mellado el fructosa inducida por el gen mayor expresin y protena de NAD (P) H oxidasa subunidad p22phox (hubo una reduccin simultnea de significativa en gp91phox) tambin sugiere la existencia de una relacin entre la produccin de especies reactivas de oxgeno mitocondrial y citoslica. Esta posibilidad merece mayor investigacin. Nuestro consumieron fructosa tuvo un aumento significativo de fructoquinasa mRNA, nivel de protena y apoya los hallazgos de otros o dietas ricas en fructosa o sacarosa [35 37] usando la actividad. Por otro lado , fructosa indujo aumentos en la expresin gnica fructoquinasa, protena nivel y actividad en los hepatocitos cultivados [22]. Adems, dispone de se ha demostrado que fructosa estimula su propio metabolismo mediante la induccin de fructoquinasa heptica expresin [38,39] y establecer un ciclo vicioso de , es decir, aumento de fosforilacin y aumento del metabolismo, as potenciar el efecto deletreo de fructosa sobre metabolismo heptico [40]. Consistente con estos datos, los pacientes con enfermedad de del hgado graso no alcohlico (EHGNA) retratan la actividad fructoquinasa dos veces ms alta que la poblacin general asociada a un consumo significativamente mayor de de bebidas azucaradas (rico en fructosa) [22]. El hecho de que R/S-- lipoic cido co-administracin a nuestro consumieron fructosa impidi que los cambios fructoquinasa fuertemente sugiere que la actividad enzimtica no slo depende de la sobrecarga de fructosa sino adems de la retroalimentacin positiva efecto de algn metabolito rio abajo o seal. En este sentido, el estado redox de los hepatocitos podra ser un candidato potencial: convincente evidencia indica que mejora los niveles de radicales de oxgenoespecies pueden modificar la actividad de la protena o incluso alterar su conformacin [41]. Sin embargo, una alteracin especfica mediada por estrs oxidativa en fructoquinasa estructura es slo hipottica y necesita ms apoyo experimental.5. conclusinEn breve, nuestros resultados demostrar fructosa inducesmanymetabolic cambios en el hgado que es probable que comienzan con un aumento en la fosforilacin de la fructosa por fructoquinasa seguida de cambios adaptativos que intentan cambiar el flujo de sustrato del metabolismo mitocondrial para almacenamiento de energa. Todos estos cambios son esencialmente prevenidos por la administracin concomitante de cido lipoico R/S-- . Por lo tanto, el estrs oxidativo junto con fructoquinasa aparecen ser keymediators de themetabolic cambios inducidos por la fructosa. La reduccin de la actividad fructoquinasa por R/S--lipoico sugiere que algunos compuestos de estrs oxidativo o un metabolito producido posteriormente acta como una regeneracin positiva mantenga su alto nivel en ratas alimentados con fructosa. Identificacin de tal un enlace activo y el efecto de antioxidantes en la prevencin de de la transicin de la tolerancia deteriorada de la glucosa a diabetes merece estudios adicionales.

El ndice HOMA (Homeostasis Model Assessment) propuesto por Mathews y colaboradores, en 1985,19es el mtodo ms utilizado para diagnosticar RI en la poblacin peditrica. Se deriva de la interaccin entre la funcin celular y la sensibilidad a la insulina en un modelo matemtico donde se utilizan las concentraciones de glucosa e insulina en ayuno. El modelo se calibra con una funcin celular de 100% y una resistencia a la insulina normal de 1 de acuerdo con la siguiente frmula:HOMA-IR= [insulina plasmtica en ayuno (U/ ml)*glucosa plasmtica en ayuno (mmol/L)]/22.5.20El ndice HOMA tambin puede utilizarse para evaluar la funcin de la clula pancretica utilizando el siguiente modelo matemtico:HOMA-%= [20*insulina plasmtica en ayuno (U/ ml)] / [glucosa plasmtica en ayuno (mmol/L) 3.5].