Transformasi

Terdapat beberapa metode transformasi. Pemilihan metode yang digunakan bergantung sel

inang yang digunakan. Transformasi DNA dapat dilakukan dengan metode CaCl2 dan

elektroporasi, dengan perantara Agrobacterium tumefaciens, biolistik atau particle

bombartment, mikroinjeksi, dan transfer dengan polietilen glikol (PEG) (Wong 1997: 133).

Penggunaan CaCl2 pada metode CaCl2 yang dipicu kejutan panas (heat shock) dapat

menyebabkan DNA menempel pada membran luar sel kompeten, setelah diberi kejutan panas

DNA dapat masuk kedalam sel kompeten (Wong 1997 133-134). Efisiensi transformasi

metode kejutan panas berkisar antara 105 -- 106 transforman/μg (Sambrook & Russell 2001:

1.24) Transformasi dengan metode elektroporasi memanfaatkan kejutan listrik langsung pada

sel kompeten. Teknik elektroporasi dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut

elektroporator. Energi yang digunakan pada teknik elektroporasi dapat mencapai hingga

50.000 V. Kejutan listrik tersebut akan mengganggu kestabilan membran E.coli sehingga

akan terbentuk pori-pori pada membran sel. Pori-pori tersebut memungkinkan membran sel

terbuka serta membuatnya menjadi permeabel. Hal tersebut menyebabkan molekul DNA

dapat masuk ke dalam sel (Wong 1997: 134). Efisiensi transformasi yang diperoleh antara

107 -- 109 transforman/μg DNA (Sambrook & Russell 2001: 1.25-1.26).

Mekanisme ekspresi gen asing dalam sel prokariot seperti E.coli dapat dilakukan melalui

induksi Isopropil-1-tio- β-galaktosidase (IPTG). IPTG merupakan senyawa yang srukturnya

mirip dengan laktosa tetapi tidak dimetabolisme oleh sel dan dapat digunakan untuk

menginduksi ekspresi suatu gen di bawah kontrol promotor lac (Yildir dkk. 1998: 221).

Proses induksi IPTG dimulai dengan terikatnya IPTG pada situs pengikatan induser yang

terdapat pada protein represor. Adanya kompleks induser (IPTG) represor menyebabkan

terjadinya perubahan struktural sehingga dapat merubah situs pengikatan protein represor

dengan situs pengikatan represor pada operator.

Proses transformasi akan dilakukan dengan metode Heat Shock menurut Sambrook et al

(1989). Prosedur kerjanya sebagai berikut:

26 Ligation mix (baik untuk produk PCR maupun kontrol) sebanyak 4 μl ditambah dengan sel

kompeten E.coli DH5_ sebanyak 50 μl dimasukkan dalam tabung steril 1,5 ml dan dilakukan

proses inkubasi selama 30 menit dalam es. Heat Shock dilakukan pada suhu 42 °C dalam

waterbath selama 100 detik dan secara cepat langsung diinkubasi dalam es selama 2 menit.

Media LB sebanyak 950 μl ditambahkan ke dalam campuran dan dilakukan inkubasi dalam

inkubator shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 2 jam pada suhu 37 °C. Hasil

transformasi sebanyak 40 μl dipindah ke dalam media LB padat yang telah diberi antibiotik

ampisilin, IPTG dan X-Gal solution. Proses inkubasi akan dilakukan selama 16 jam pada

suhu 37 °C.