transformation des obligat biotrophen rostpilzes uromyces
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Transformation des obligat biotrophen Rostpilzes
Uromyces fabae
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
Vorgelegt von
Alma Djulić
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion
Fachbereich Biologie
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Dezember 2012
1. Referent: Prof. Dr. Ralf Vögele
2. Referent: Prof. Dr. Kurt Mendgen
„Die Erfahrung hat mich gelehrt, dass das, was man sich
selbst nicht erklären kann, anderen gesagt werden muss.
Ein Selbst kann getäuscht werden, durch Teile der Bilder
die sich aufdrängen, schwer aussprechbarem Gefühl weil
es sich vor der Qual der Erkenntnis versteckt und flüchtet
in den Nebel, in den Rausch der keinen Sinn sucht. Ein
anderer verlangt nach genauem Wort, deshalb suchst du
es, fühlst es irgendwo in dir und jagst es, das Wort oder
sein Schatten, erkennst es am Gesicht des anderen, im
Blick des anderen, wenn er beginnt zu begreifen. Zuhörer
ist die Hebamme bei schwieriger Geburt des Wortes.
Oder noch Wichtigeres. Sollte der andere begreifen
wollen.“
(Bosnischer Schriftsteller) Mesa Selimovic – Die Festung
"Iskustvo me naučilo da ono što se ne može objasniti
samome sebi, treba govoriti drugome. Sebe možeš
obmanuti nekim dijelom slike koji se nametne, teško
izrečivim osjećanjem, jer se skriva pred mukom
saznavanja i bježi u omaglicu, u opijenost koja ne traži
smisao. Drugome je neophodna tačna riječ, zato je i
tražiš, osječas da je negdje u tebi, i loviš je, nju ili njenu
sjenku, prepoznaješ je na tuđem licu, u tuđem pogledu,
kad počne da shvata. Slušalac je babica u teškom
porođaju riječi. Ili nešto još važnije. Ako taj drugi želi da
razumije."
Meša Selimović - Tvrdjava
Folgende Publikation ist aus dieser Arbeit hervorgegangen:
Djulic A., Schmid A., Lenz H., Sharma P., Koch C., Wirsel S. G., Voegele R. T. (2011).
Transient transformation of the obligate biotrophic rust fungus Uromyces fabae
using biolistics. Fungal Biol. 117: 633-642.
VERZEICHNISSE INHALT I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ....................................................................................................................... 1
1.1 Rostpilze ...................................................................................................... 1
1.2 Uromyces fabae ........................................................................................... 2
1.2.1 Sporenarten und Verbreitung ....................................................................... 2
1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze .................................................................. 3
1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis ........................................................... 6
1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze ......................................... 6
1.3.1 Transformationsmethoden .......................................................................... 7
1.3.1.1 Biolistik ....................................................................................................... 7
1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation .................................................. 9
1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen ..................................................... 9
1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen ........................................ 10
1.4 Zielsetzung ................................................................................................ 11
2. Material und Methoden ............................................................................................... 12
2.1 Chemikalien ............................................................................................... 12
2.2 Verwendete Organismen ........................................................................... 12
2.2.1 Bakterienstämme ...................................................................................... 12
2.2.1.1 Escherichia coli .......................................................................................... 12
2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens ....................................................................... 13
2.2.2 Verwendete Kulturmedien ......................................................................... 13
2.2.2.1 Für E. coli ................................................................................................... 13
2.2.2.2 Für A. tumefaciens ..................................................................................... 13
2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial .......................................................................... 14
2.2.3.1 Pilzmaterial ............................................................................................... 14
2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen ............... 14
2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl ........................................................ 15
2.2.3.4 Pflanzenmaterial ........................................................................................ 15
2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba .................................................... 15
2.3 Verwendete Plasmide ................................................................................ 16
2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik ....................................................... 17
2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ...................... 18
2.4 Transformationsmethoden ........................................................................ 18
2.4.1 Biolistik ..................................................................................................... 18
2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) .................................... 19
2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema ........................... 20
2.5 Molekularbiologische Methoden ................................................................ 21
2.5.1 DNA-Präparation ....................................................................................... 21
2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial ................................................................................. 21
VERZEICHNISSE INHALT II
2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen ........................................................................... 21
2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen ............................................................................... 21
2.5.1.4 Amplifikation genomischer DNA mit REPLIg ................................................ 22
2.5.1.5 Plasmidpräparation aus E. coli .................................................................... 22
2.5.1.6 DNA-Konzentrationsmessungen ................................................................. 22
2.5.2 PCR-Methoden .......................................................................................... 22
2.5.2.1 Oligonukleotide ......................................................................................... 23
2.5.2.2 Standard und Nested-PCR .......................................................................... 24
2.5.2.3 Nested-PCR ................................................................................................ 25
2.5.2.4 Kolonie-PCR ............................................................................................... 25
2.5.2.5 SNP-PCR .................................................................................................... 25
2.5.2.6 Reinigung von PCR Produkten und DNA aus Restriktionsansätzen ............... 26
2.5.2.7 Sequenzierung von PCR Produkten ............................................................. 26
2.5.3 Agarosegel-Elektrophorese ........................................................................ 26
2.5.4 Klonierung von DNA ................................................................................... 27
2.5.4.1 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen........................................................ 27
2.5.4.2 Ligation verdauter DNA .............................................................................. 28
2.5.5 Kompetente Zellen und Transformation ..................................................... 28
2.5.5.1 E. coli SEM-kompetente Zellen ................................................................... 28
2.5.5.2 Hitzeschocktransformation ........................................................................ 29
2.5.5.3 Agrobacterium tumefaciens elektrokompetente Zellen ............................... 29
2.5.5.4 Transformation durch Elektroporation ....................................................... 29
2.5.6 Southern Blot ............................................................................................ 30
2.5.6.1 Herstellung von DIG-markierten Sonden ..................................................... 30
2.5.6.2 32P-markierte Sonden ................................................................................. 30
2.5.6.3 Vorbereitung und DNA-Transfer ................................................................. 31
2.5.6.4 Hybridisierung und DNA Detektion ............................................................. 31
2.6 Mikroskopische Methoden ......................................................................... 32
2.6.1 Durchlichtmikroskopie ............................................................................... 32
2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie ............................................................................. 33
2.7 Verwendete Software ................................................................................ 33
3. Ergebnisse .................................................................................................................... 34
3.1 Auswahl der Methoden für die Transformation von Uromyces fabae .......... 34
3.2. Plasmidkonstrukte für die Transformation .................................................. 34
3.3 Biolistische Transformation von U. fabae ................................................... 36
3.4 Detektion der Transformationsereignisse in vitro ....................................... 36
3.4.1 Farbmarker Selektion ................................................................................. 37
3.4.1.1 GUS-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae .................. 37
3.4.1.2 GFP-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae .................. 38
VERZEICHNISSE INHALT III
3.4.1.3 DsRed-Farbmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ........... 39
3.4.1.4 Fungizidmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ................ 41
3.4.1.5 Kombination der Farb- und Fungizidmarker bei Biolistischer Transformation von U. fabae .............................................................................................. 43
3.5 Etablierung der Selektion in planta ............................................................. 44
3.5.1 Fungizidmarker .......................................................................................... 45
3.5.1.1 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin ................................ 45
3.5.1.2 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps mit Benomyl .................................... 46
3.5.1.3 Selektionsschema in planta ........................................................................ 47
3.6 U. fabae Transformanten-Linien, Selektion und molekulare Analyse ........... 48
3.6.1 Selektion mit Benomyl ............................................................................... 49
3.6.2 Selektion mit Carboxin ............................................................................... 50
3.6.2.1 Biolistische Transformation mit den Plasmidkonstrukten pRV111 und pRV113 ................................................................................................................. 50
3.6.2.2 Biolistische Transformation mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed ...... 52
3.6.2.3 Biolistische Transformation mit Kassette aus pRV111 und pRV113 .............. 54
3.7 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von U. fabae ........ 60
3.7.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die Transformationseffizienz............. 61
3.7.1.1 Induktion mit Acetosyringon ...................................................................... 61
3.7.1.2 Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen .................................................... 63
3.7.1.3 Weitere Faktoren für die ATMT .................................................................. 64
3.7.1.4 Einfluss der Agrobakterien-Stämme ........................................................... 65
3.7.2 ATMT Transformantenlinien in vitro ........................................................... 65
3.7.3 Selektion der ATMT-Transformanten mit Fungiziden in planta .................... 67
3.7.3.1 Selektion mit Benomyl ............................................................................... 67
3.7.3.2 Selektion mit Carboxin ............................................................................... 68
3.7.4 Molekularer Nachweis der Transformation in den ATMT-Linien .................. 69
3.8 Southern Blot Nachweis der Transformation .............................................. 71
4. Diskussion .................................................................................................................... 72
4.1 Etablierung der Transformation von U. fabae in vitro .................................. 72
4.1.1 Ermittlung der optimalen Parameter für die Biolistik .................................. 73
4.1.2 Regulatorische Elemente ............................................................................ 73
4.1.3 Farbmarker ................................................................................................ 74
4.2 Transformationsansätze für in planta Versuche .......................................... 76
4.2.1 Fungizidmarker .......................................................................................... 76
4.2.2 Selektionsschema ...................................................................................... 78
4.2.2.1 Problematik der ersten Selektion (S1) ......................................................... 78
4.2.2.2 Propagation der Transformantenlinien in planta......................................... 79
4.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation (ATMT) ................... 80
4.3.1 Parameter für die ATMT von U. fabae ........................................................ 80
VERZEICHNISSE INHALT IV
4.4 Mögliche Ursachen der Problematik bei der Propagation von Transformantenlinien ................................................................................ 84
4.5 Analyse der Transformation auf molekularer Ebene .................................... 85
4.5.1 Southern Blot Analyse ................................................................................ 90
4.6 Stabilität der transformierten Uredosporen ................................................ 91
4.7 Vergleich der Transformationsmethoden Biolistik und ATMT ...................... 92
4.8 Ausblick ..................................................................................................... 94
4.8.1 Anwendung weiterer molekulare Methoden .............................................. 94
4.8.2 Modifizierung und Erweiterung der Plasmidkonstukte ................................ 95
4.8.3 Optimierung der Propagation bei der Selektion in planta ............................ 95
5. Zusammenfassung ........................................................................................................ 96
6. Summary ...................................................................................................................... 98
7. Literatur ...................................................................................................................... 100
8. Anhang ........................................................................................................................ 112
8.1 Propagation einzelner Uredia aus S1 für S2 ................................................ 112
8.2 Zählungen einzelner Uredia (Biolistik) aus S1 ............................................. 113
8.3 Zählungen einzelner Uredia (ATMT) aus S1 ................................................ 115
8.4 Abbildungen verschiedener Selektionen in planta ..................................... 118
8.5 Southern Blot Analysen ............................................................................. 120
8.5.1 Verschiedene DNA-Menge und –Präparation für DIG-Markierung .............. 120
8.5.2 Vergleich von DIG und 32P Sonden-Markierung .......................................... 121
8.5.3 32P Markierung.......................................................................................... 122
9. Danksagung ................................................................................................................. 123
VERZEICHNISSE ABBILDUNGEN V
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus .................................................................................. 3
Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae ................................................................ 5
Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur ........................................................................................ 8
Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle .................................................. 10
Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System ............ 19
Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta......................................................................... 20
Abbildung 3.1: GUS Transformation in vitro ........................................................................ 37
Abbildung 3.2: iGFP Transformanten in vitro ...................................................................... 38
Abbildung 3.3: DsRed Transformanten in vitro ................................................................... 40
Abbildung 3.4: DsRed-NLS Transformanten von U. fabae .................................................... 41
Abbildung 3.5: Keimung von Uredosporen auf angerauter PE-Folie ..................................... 42
Abbildung 3.6: Transformation mit Doppelkonstrukt pRV111::DsRed .................................. 44
Abbildung 3.7: In genomische U. fabae DNA eingeführte Punktmutationen ........................ 45
Abbildung 3.8: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin in planta................... 46
Abbildung 3.9: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps in planta durch das Fungizid Benomyl 47
Abbildung 3.10: Selektionsschema für Transformanten von U. fabae in planta .................... 48
Abbildung 3.11: Aufbringen von Benomyl auf Bohnenblätter ............................................... 50
Abbildung 3.12: Selektion und molekularer Nachweis der biolistischen Transformation ....... 52
Abbildung 3.13: PCR Nachweis von selektionierten Sporenlinien nach Transformation mit pRV111::DsRed .......................................................................................... 53
Abbildung 3.14: Plasmidkassette tPMA1-mut-SucDH1-pPMA1 ............................................. 54
Abbildung 3.15: PCR Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien in der S1 ... 56
Abbildung 3.16: PCR-Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien von S2 bis S9 ................................................................................................................. 57
Abbildung 3.17: Möglichkeiten der Integration von Transgenen in das U. fabae Genom ....... 58
Abbildung 3.18: Nachweis des Einbaus in das Genom von U. fabae mittels SNP-PCR (Single nucleotid polymorphism-PCR) .................................................................... 59
Abbildung 3.19: Nachweis der Punktmutation in den Transformantenlinien ........................ 60
Abbildung 3.20 Einfluss der Induktionsdauer auf die Transformationseffizienz .................... 62
Abbildung 3.21: Einfluss von Acetosyringon (AS) auf die Transformationseffizienz ............... 63
Abbildung 3.22: Einfluss des Verhältnisses von Agrobakterien : Uredosporen auf die Transformationseffizienz ............................................................................ 64
Abbildung 3.23: Einfluss des Agrobacterium-Stammes auf die Transformationseffizienz....... 65
Abbildung 3.24: Mikroskopische Screens nach ATMT von U. fabae in vitro ........................... 66
Abbildung 3.25: ATMT-Transformanten von U. fabae aus S1 und S2 mit Carboxin ................ 69
Abbildung 3.26: ATMT-Linien S2 bis S8 ................................................................................ 69
Abbildung 3.27: PCR-Nachweis des pBIN20-Backbone ......................................................... 70
Abbildung 3.28: Southern Blot-Analyse von Uf-SucDH1 ....................................................... 71
VERZEICHNISSE ABBILDUNGEN VI
Abbildung 4.1: Übersicht über die Propagation von Transformantenlinien während der Selektion in planta ..................................................................................... 83
Abbildung 4.2: Nested-PCR Modell für den Nachweis der transgenen SucDH1 in U. fabae Transformanten ......................................................................................... 86
Abbildung 4.3: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom nach der Biolistik ............................................................................................... 87
Abbildung 4.4: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom bei Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens ................................... 89
Abbildung 8.1: Ausbringung von Einzelrostpusteln auf Ackerbohnenblätter ....................... 112
Abbildung 8.2: Gradient-PCR für SNP-PCR Primer. ............................................................. 114
Abbildung 8.3: Zeitlicher Unterschied in der Keimung zwischen WT und Transformanten ... 118
Abbildung 8.4: Erste Selektion (S1) mit Carboxin ............................................................... 118
Abbildung 8.5: Propagierte Transformationslinien in planta nach ATMT ............................ 119
Abbildung 8.6: Propagierte Transformationslinien in planta nach Biolistik ......................... 119
Abbildung 8.7: Southern Blot mit verschiedenen Mengen und Präparationen von U. fabae WT-DNA ................................................................................................... 120
Abbildung 8.8: Southern Blot-Vergleich der Sonden-Markierung DIG / 32P ......................... 121
Abbildung 8.9: 32P-Markierung von genomischer und Plasmid DNA ................................... 122
VERZEICHNISSE TABELLEN VII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien ............................................................... 12
Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm ........................................................................... 12
Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae ............................... 13
Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten ................................................................................................................. 15
Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae ................... 16
Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae ................................. 18
Tabelle 2.7: Verwendete Oligonukleotide ......................................................................... 23
Tabelle 2.8: Standardprotokoll für PCR-Reaktion .............................................................. 24
Tabelle 2.9: PCR Univ Programme..................................................................................... 25
Tabelle 2.10: Verwendete Restriktionsenzyme ................................................................... 27
Tabelle 2.11: Herstellung 32P-markierter Sonden ................................................................ 30
Tabelle 2.12: Auflistung der verwendeten Software............................................................ 33
Tabelle 3.1: Verwendete Plasmidkonstrukte für die Transformation von U. fabae ............. 35
Tabelle 3.2: Parameter für Transformation von U. fabae mittels Biolistik .......................... 36
Tabelle 3.3: Anzahl iGFP Transformanten von U. fabae in vitro .......................................... 39
Tabelle 3.4: Anzahl selektionierten DsRed-Transformanten in vitro ................................... 39
Tabelle 3.5: Anzahl von pRV111::DsRed-Transformanten in vitro....................................... 43
Tabelle 3.6.: Selektion von U. fabae Transformanten durch Benomyl in planta ................... 49
Tabelle 3.7: Selektion von U. fabae Transformanten durch Carboxin in planta ................... 51
Tabelle 3.8: Transformanten-Linien mit pRV111:DsRed in planta ...................................... 53
Tabelle 3.9: Erste Selektion in planta nach Beschuss mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 .......................................................................................................... 55
Tabelle 3.10: Zweite Selektion nach biolistischer Transformation ........................................ 55
Tabelle 3.11: Selektionierte Transformantenlinien nach Biolistik in planta .......................... 56
Tabelle 3.12: Parameter für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ....................... 61
Tabelle 3.13: Selektionierte Transformantenlinien nach der ATMT in planta ....................... 67
Tabelle 3.14: S1 nach ATMT mit drei Agrobacterium-Stämmen ........................................... 68
Tabelle 3.15: Selektionierte S2- bis S8-Transformantenlinien (ATMT) in planta.................... 68
Tabelle 4.1: Biolistik und Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) im Vergleich 93
Tabelle 8.1: Biolistische Transformation mit pRV111 und pRV113 .................................... 113
Tabelle 8.2: Biolistische Transformation mit dem Doppelkonstrukt pRV111::DsRed .......... 113
Tabelle 8.3: Biolistische Transformation mit der Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 113
Tabelle 8.4: Biolistische Transformation mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 ........... 114
Tabelle 8.5: Auszählung der Uredosporenlager in der S1 nach Transformation mit pRV101 Plasmid durch ATMT ..................................................................................... 115
Tabelle 8.6: Einfluss von Acetosyringon auf die Induktion der Agrobacterium-Stämme ..... 115
Tabelle 8.7: Einfluss des Verhältnisses Agrobakterien zu Uredosporen bei ATMT .............. 116
Tabelle 8.8: ATMT mit drei verschiedenen Stämmen ........................................................ 117
VERZEICHNISSE ABKÜRZUNGEN VIII
Abkürzungen
ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
ATPase Adenosintriphosphatase
bp Basenpaar(e)
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
CSPD Dinatrium 3-(4-methoxyspiro {l,2-dioxetan-3,2'-(5'chloro)tricyclo[3.3.1.1 3,7]-
decan}-4-yl) phenylphosphat
DIG Digoxigenin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
DsRed Red Fluorescent Protein
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraacetat
glm generalized linear model (Generalisierte Lineare Modelle)
GUS β-Glucuronidase
iGFP intron Green fluorescent protein
kb Kilobasen(paare)
OD optische Dichte
PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaktion)
RT Raumtemperatur
SB Southern Blot
Sx Selektionsrunde x
Tx Transformantenlinie x
üN über Nacht
UV ultraviolettes Licht
WT Wildtyp
95%CI 95 % confidence interval
EINLEITUNG 1
1. Einleitung
1.1 Rostpilze
Rostpilze, die durch ihre unterschiedlich großen Pusteln mit rostbraunen bis schwarzen
Sporen auch als „Rost“ bezeichnet werden, sind mit über 7000 beschriebenen Arten (Maier
et al. 2003) die größte Gruppe der Basidiomyceten. Sie bilden die Ordnung Uredinales. Diese
obligat biotrophen Pilze sind wichtige Pflanzenpathogene mit einem breiten Spektrum an
Wirtspflanzen, insbesondere auch an wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen, und
verursachen weltweit dramatische Verluste in der Pflanzenproduktion. Die beiden für die
menschliche Ernährung wichtigsten Pflanzenfamilien Poaceae (Getreide) und Fabaceae
(Leguminosen) sind bedeutende Wirte der Rostpilze (Voegele, 2006). Neben dem im
Ackerbau ständig präsenten Getreiderost Puccinia graminis sind Kaffeerost (Hemileia
vastatrix) und der vor allem in den USA auftretende asiatische Sojabohnenrost Phakopsora
pachyrhizi (Schneider et al. 2005) von großer ökonomischer Bedeutung. Verschiedene
Vertreter der Gattung Uromyces, z.B.: U. appendiculatus (Gemeiner Bohnenrost), U. fabae
(Ackerbohnenrost), U. striatus (Alfalfarost) und U. vignae (Kuhbohnenrost), (Agrios 2005),
haben weltweit große Bedeutung für die Forschung und die Entwicklung neuer
Bekämpfungsstrategien im Leguminosenanbau.
Als Modellorganismen für die Erforschung der Infektionsmechanismen, der biochemischen
und molekularbiologischen Vorgänge während der Wirt-Pathogen-Interaktion Interaktion
sowie der Möglichkeiten der genetischen Modifikation, haben sich hauptsächlich fünf
Vertreter der Rostpilze etabliert (Voegele 2006). Bereits 1956 wurde von Flor für die
Aufstellung der Gen-für-Gen Hypothese (Flor 1956) das Modellsystem Melampsora lini –
Linum usitatissimum genutzt. Zahlreiche der nachfolgenden Erkenntnisse über die Lebens-
weise und Verbreitung der Rostpilze wurden an den Modellsystemen U. fabae – Vicia faba
(Deising et al. 1991; Hahn und Mendgen 1997; Voegele 2006) sowie U. appendiculatus auf
Phaseolus vulgaris (Harder und Mendgen 1982; Mendgen et al. 1996) gewonnen. Des
Weiteren wurde Puccinia gramminis in zahlreichen zytologischen und physiologischen
Arbeiten zur Aufklärung vieler in Rostpilzen vorkommender Prozesse herangezogen (Zhou et
al. 1991; Leonard und Szabo 2005).
EINLEITUNG 2
1.2 Uromyces fabae
Der Ackerbohnenrost U. fabae und seine Wirtspflanze V. faba dienten bereits zur Aufklärung
vieler Vorgänge hinsichtlich der Biochemie, Zytologie sowie Molekularbiologie während der
Wirt-Pathogen Interaktion (Freytag und Mendgen 1991; Deising et al. 1991; Mendgen und
Deising 1993; Mendgen et al. 1996; Hoffmann und Mendgen 1998; Hahn und Mendgen
2001; Voegele et al. 2001; Wirsel et al. 2004; Voegele 2006). Die obligat biotrophe
Lebensweise des Pilzes mit einem Wirtspflanzenspektrum von über 50 anderen Vicia sowie
20 Lathyrus Arten (Conner und Bernier 1982) ist ein wichtiger Aspekt zur Analyse der Wirt-
Pathogen-Interaktionen und Entwicklung möglicher Bekämpfungsstrategien in der Praxis.
Auf seiner bedeutendsten Wirtspflanze V. faba, ist der Ackerbohnenrost autözisch und bildet
alle fünf für Rostpilze bekannte Sporenarten: Basidiosporen, Pyknosporen, Aecidiosporen,
Uredosporen und Teleutosporen (Mendgen 1997).
1.2.1 Sporenarten und Verbreitung
Während einem vollständigen Lebenszyklus werden alle fünf Sporenarten von U. fabae auf
einer Pflanze (autözisch) gebildet. Die als Überwinterungsform gebildeten diploiden
Teleutosporen keimen im Frühjahr mit einem Metabasidium aus, wo unter
Reduktionsteilung vier haploide Basidiosporen entstehen. Diese Basidiosporen besitzen zwei
unterschiedliche Paarungstypen: (plus (B+) und minus (B–, Abb. 1.1)) welche bei
gegenseitigen Paarung das Pflanzenblatt infizieren und die Fruchtkörper Pyknidien, mit
ebenfalls verschieden gepaarten Pyknosporen bilden. Das haploide Myzel durchdringt das
Blatt und bildet auf der Unterseite nach Plasmogamie Aecidiosporenlager mit dikaryotischen
Aecidiosporen. Nach einer Infektion neuer Pflanzenblätter keimen Aecidiosporen aus und es
werden Uredosporenlager (Uredia) mit diploiden Uredosporen gebildet. Diese stellen die
Hauptverbreitungsform dar und werden während der Vegetationsperiode in großer Zahl
produziert. Urdosporen können leicht mit dem Wind und über längeren Distanzen verbreitet
werden. Im Herbst, kommt es unter Umwelteinflüssen wie Tageslänge und niedrigere
Temperatur zur Bildung von Teleutosporenlagern aus der Uredia. Die Zellkerne
verschmelzen während der Sporogenesis und einzellige diploide Teleutosporen werden als
Überwinterungsform gebildet (Voegele 2006). Aufgrund der schnellen und hohen Produktion
von Uredosporen während der Vegetationsperiode, wurden die Uredosporen und die von
EINLEITUNG 3
ihnen ausgehenden Infektionsstrukturen für die meisten biochemischen und
molekularbiologischen Untersuchungen genutzt (Voegele 2006). Auch im Rahmen dieser
Arbeit wurden Uredosporen für die Transformation von U. fabae verwendet.
Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus. Teleutosporen (T), Metabasidium (M), Basidiosporen (B),
Pyknidium (P); Aecidiosporen (A) und Uredosporen (U). 2n = diploid; n = haploid. Verändert nach Mendgen 1997.
1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze
Uredosporen sind die Hauptform der asexuellen Vermehrung von Rostpilzen und werden
durch wiederholte Infektion der Wirtspflanzen während Sommers in großen Mengen
produziert (Voegele 2006). Eine mäßige Infektion resultiert in Produktion von 1012-1013
Uredosporen pro Tag und Hektar (Deising et al. 2002). Die Verbreitung erfolgt mit der
Windströmung über große Distanzen, so dass eine interkontinentale Übertragung, wie am
Beispiel von Hemileia vastatrix (Kaffeerost) beschrieben (Bowden et al. 1971), auch in
anderen Regionen vorkommen kann (Brown und Hovmøller, 2002). Auf der Wirtspflanze
haften sich die Sporen meistens als Cluster (Clement 1994) oder vereinzelt an die
M
B+ B‒ P
A U
T
Frühling
Winter
Herbst
Sommer
EINLEITUNG 4
Blattoberfläche an und bilden bei genügend hoher Luftfeuchtigkeit durch Sekretion
glykolisierter Polypeptide, niedermolekularer Kohlenhydrate (Clement 1993) sowie von
Cuticula-abbauenden Enzymen wie Esterasen und Cutinasen ein Adhäsionskissen (Deising et
al. 1992). Anschließend beginnt die Keimung. Dabei orientiert sich der Keimschlauch an
topographischen Signalen und differenziert bei einer Erhebung welcher der Vorhofleiste der
Spaltöffnung entspricht, zu einem Appressorium und arretiert in diesem Stadium bis das
Stoma sich öffnet. Daraufhin wird eine Penetrationshyphe gebildet, die in die Atemhöhle
eindringt und dort ein substomatäres Vesikel ausbildet. Von den Polen dieser
Infektionsstruktur differenzieren Interzellularhyphen, die benachbarten Zellen des
Blattmesophylls penetrieren. Dabei wird eine Haustorienmutterzelle gebildet aus der das
Haustorium in die Pflanzenzelle eingesenkt wird. Diese Einsenkung erfolgt mittels
Durchdringung der Zellwand und Einstülpung der Plasmamembran wodurch ein sehr enger
Kontakt zwischen pflanzlichem und pilzlichen Zytoplasma entsteht. Diese sind lediglich durch
die pilzliche Zellmembran (Haustorienmembran), die modifizierte Zellmembran der Pflanze
(extrahaustorielle Membran) sowie durch den Zwischenraum, die extrahaustorielle Matrix,
getrennt. Die Ausbildung von Haustorien ist ein komplexer Prozess für den bisher
unbekannte Signale der Wirtspflanze essentiell sind (Mendgen et al. 2000).
Auf künstliche Oberflächen aufgesprüht bilden Uredosporen an befeuchteten Unterlagen
Keimschläuche, die sich in alle Richtungen antasten. Bei Vorhandensein von künstlichen
Erhebungen, z.B. Kratzer auf der Oberfläche einer Polyethylen-Folie, werden diese von
keimenden Uredosporen erkannt und es wird die Bildung von Appressorien eingeleitet. Auf
einem künstlichen Blattabdruck mit dreidimensionaler Struktur können die Uredosporen bis
zur Haustorienmutterzelle differenzieren. Demnach können die Infektionsstrukturen in der
Penetrationsphase bis zur Haustorienmutterzelle auf künstlichen Oberflächen in vitro
induziert werden (Deising et al. 1991), jedoch verhindern fehlende pflanzlichen Signale die
Ausbildung von Haustorien. Verglichen mit Uredosporen besitzen Basidiosporen (Abb. 1.2 B)
eine dünne Zellwand und eine glatte Oberfläche. Es gibt keine Hinweise auf eine
topographische Erkennung der Wirtsoberfläche. Basidiosporen infizieren die Pflanze durch
direkte Penetration der Epidermiszellen (Mendgen 1997). Die Infektionsstrukturen wie das
Appressorium, das substomatäres Vesikel und das Haustorium sind vorhanden, jedoch im
Vergleich zu Uredosporen wesentlich schwächer differenziert (Abb. 1.2).
EINLEITUNG 5
[A] [B]
Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae. Ausgehend von Uredosporen (A) und Basidiosporen (B). Spore (S); Keimschlauch (KS); Appressorium (A); Penetrationshyphe (P); substomatäres Vesikel (SV); Interzellularhyphen (I); Haustorienmutterzelle (HM); Haustorium (H).
Haustorien haben eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der parasitischen Interaktion
durch die Unterdrückung pflanzlicher Abwehr während der biotrophen Phase (Mendgen et
al. 2000). Die meisten biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen an U.
fabae betreffen daher die Aufklärung der Haustorienfunktion (Voegele 2006). Es wurden u.a.
mehrere Aminosäuretransporter in der Haustorienmembran gefunden (Hahn et al. 1997;
Struck et al. 2002). Ebenso konnte eine H+-ATPase identifiziert werden, welche durch das
Zusammenspiel mit einem Hexose-Symporter eine wesentliche Rolle der Haustorien in der
Nährstoffaufnahme offenbart (Struck et al. 1996; Voegele et al. 2001). Die Interaktion mit
der Pflanze und die Unterdrückung der Abwehrreaktion wird auch durch eine Reihe
sekretierter Proteine beeinflusst (Link und Voegele 2008). Die Charakterisierung von Rust
Transferred Protein 1 (RTP1p) zeigte einen Übergang eines pilzlichen Proteins vom
Haustorium in die pflanzliche Wirtszelle, was in Zusammenhang mit der Unterdrückung der
pflanzlichen Abwehr in Zusammenhang stehen könnte (Kemen et al. 2005). Es konnte eine
Reihe von RTPp-Homologen in anderen Rostpilzen identifiziert werden, welche
möglicherweise eine Funktion als Protease-Inhibitor haben (Pretsch 2012). Zudem sind
verschiedene sekretierte Proteine identifiziert worden, die das Potenzial besitzen, die
pflanzliche Abwehr während der biotrophen Interaktion zu beeinflussen (Link 2009).
EINLEITUNG 6
1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis
Beim Befall von V. faba durch U. fabae an handelt es sich um eine kompatible Interaktion,
ein Resistenzmechanismus ist bisher unbekannt, so dass die Züchtung U. fabae resistenter
Bohnensorten bisher nicht erfolgreich war.
Die Ackerbohne (Vicia faba), auch als Saubohne, Dicke Bohne, Faberbohne oder Puffbohne
bekannt, ist der wirtschaftlich bedeutendste Vertreter der Gattung Vicia. Mit einem Ertrag
von 4,1 Millionen Tonnen pro Jahr und 2,5 Millionen ha Anbaufläche weltweit (Akibode und
Maredia 2011) zählt die Ackerbohne zu den 10 ökonomisch wichtigsten Körnerleguminosen.
Die größten Erzeuger im weltweiten Vergleich in den Jahren 2006-2008 waren China (930
000 ha) sowie Frankreich (60 000 ha) und UK (50 000 ha) in Europa (Akibode und Maredia
2011). Der Ackerbohnenrost ist neben dem Falschen Mehltau (Peronospora viciae var.
fabae), der Wurzelhals- und Stängelfäule (Rhizotonia solani), der Schokoladenflecken-
krankheit (Botrytis fabae) und der Weißstängeligkeit (Sclerotonia trifoliorum) eine der
wichtigsten Krankheiten der Ackerbohne. Demnach nimmt die Bekämpfung von U. fabae
eine wichtige Stellung im Pflanzenbau ein. Ein derzeit zugelassenes Fungizid gegen den
Ackerbohnenrost ist Folicur (Wirkstoff Tebuconazol, Bayer, Leverkusen). Gegen andere
Roste im Getreideanbau wird der Wirkstoff Carbendazim (Harvesan, DuPont, Wilmington,
USA) eingesetzt. Die potentielle Gefahr einer Resistenzbildung seitens des Pathogens ist
ständig präsent und stellt eine große Herausforderung in der Fungizidforschung und -ent-
wicklung dar. Die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die allen heutigen Anforderungen der
Gesetzgebung gerecht werden, ist mit der Erforschung von essentiellen Stoffwechselwegen
verbunden, die eine Wirt-Pathogen-Interaktion aufrechterhalten. Hierfür ist vor allem die
Etablierung neuer Methoden zur Aufklärung molekularer und genetischen Vorgänge im
Pathogen das primäre Ziel.
1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze
Obligat biotrophe Pilze wie der Fasche Mehltau und die Rostpilze liegen aufgrund einer
Reihe ungeklärter Prozesse während der Wirt-Pathogen-Interaktion, im besonderen
Interesse der Forschung. Die Schwierigkeiten bei der Erforschung der Mechanismen
berühren hauptsächlich auf zwei Tatsachen: 1) die fehlende Möglichkeit zur Erzeugung einer
EINLEITUNG 7
authentischen Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro und 2) das Fehlen einer erfolgreichen
Methode zur stabilen Transformation von obligat biotrophen Pilzen.
Es gab zwar bereits Veröffentlichungen über eine stabile Transformation von Erysiphe
graminis (Chaure et al. 2000), bislang jedoch keine weiteren Publikationen über den Erfolg
dieser Methode bei anderen Pilzen. In jüngster Vergangenheit ist es Lawrence et al.
gelungen, ein System für die Transformation von Melampsora lini, den Erreger des Flachs-
rostes, zu etablieren (Lawrence et al. 2010). Dieses System basiert auf einer Agrobacterium
tumefaciens-vermittelten Transformation unter Ausnutzung des RNAi Silencing eines
Avirulenzgens als Selektionsmarker. Demnach ist diese Methode nur in gut charakterisierten
Systemen wie der Flachs-Flachsrost Interaktion anwendbar. Im System Ackerbohnenrost-
Ackerbohne, sowie in zahlreichen anderen Wirt-Pathogen-Interaktionen, bei denen wenig
über Avirulenzgene bekannt ist, ist dieses System bislang nicht anwendbar. Verschiedene
Berichte über die genetische Modifikation der obligat biotrophen Rostpilze beziehen sich auf
eine transiente Transformation. Beispiele für die Transformation von Uromyces
appendiculatus beruhen auf der Mikroinjektion von Antisense Primern (Barja et al. 1998)
oder biolistischem Beschuss mit dem -Glucuronidase (GUS)-Gen als Farbmarker (Bhairi und
Staples 1992; Li et al. 1993). Auch für Puccinia graminis f. sp. tritici wurde eine transiente
Transformation beschrieben (Schillberg et al. 2000). Allen gemeinsam war die Benützung von
in vitro erzeugten Infektionsstrukturen und somit die fehlende Möglichkeit, einen
vollständigen Lebenszyklus oder die Propagation der gewonnenen Transformanten zu
erzeugen. Um das Ziel zu verfolgen, ein System für eine stabile Transformation von U. fabae
zu etablieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Transformationsmethoden gewählt: 1)
Biolistik, die in den meisten Fällen für eine transiente Transformation der Rostpilze als
erfolgreich beschrieben wurde (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993; Schillberg et al. 2000)
und 2) Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation als bedeutende Methode für
die Transformation zahlreicher filamentöse Pilze (Michielse et al. 2005; Frandsen 2011).
1.3.1 Transformationsmethoden
1.3.1.1 Biolistik
Die Particle oder Gene Gun (Genkanone), ursprünglich für Transformation von Pflanzen
entwickelt (Stanford et al. 1987) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genetische
EINLEITUNG 8
Modifikation nahezu aller Zelltypen und richtet sich nicht nur auf Zellkerne sondern auch
andere Organellen wie Mitochondrien (Johnston et al. 1988) oder Chloroplasten (Boynton et
al. 1988). Diese Methode, meistens als Bioballistik oder Biolistik bezeichnet, fand sehr
schnell ihre Anwendung bei der Transformation von Bakterien und Pilzen (Smith et al. 1992,
Johnston et al. 1988, Armaleo et al. 1990). Der Mechanismus basiert auf einem Beschuss von
Zielzellen oder –Organellen unter hohem Druck mit Partikeln (Microcarrier), meistens Gold
(0,6 µM oder 1,0 µM Durchmesser) oder Wolfram (0,4 µM oder 0,7 µM) die mit Plasmid-
DNA, welche die Zielgene enthält, umhüllt sind. Aufgrund ihrer einheitlichen Größe und
chemischen Inertheit werden als Microcarrier bevorzugt Goldpartikel benutzt. Zusätzlich
werden die Partikel für eine bessere Adsorption der DNA mit Spermidin beschichtet. Für die
Erzeugung des hohen Drucks wird das Gas Helium verwendet. Die Etablierung einer Reihe
von Parametern ist für jeden Zielorganismus notwendig um eine effiziente Transformation
mittels Biolistik (Abb. 1.3) zu erreichen. Dazu gehört der entsprechende Helium-Druck, um
eine Beschädigung der beschossenen Zellen zu vermeiden, die passende Größe und Art der
Microcarrier sowie die Beschussdistanz zwischen „Stopping Screen“ und Zielzellen (s.a. Abb.
2.1 Abschnitt 2.4.1). Die Vorteile der biolistischen Methode sind eine leichtere Handhabung
Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur (Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories).
EINLEITUNG 9
und Durchführung im Vergleich zu arbeitsaufwändigeren Methoden, die eine
Protoplastierung der Zellen oder eine Mikroinjektion erfordern. Die beschossenen Zellen
werden nur wenig beschädigt und es sind geringe Mengen an DNA notwendig um sowohl
eine transiente als auch stabile Transformation zu erreichen. Ein Nachteil sind lediglich hohe
Anschaffungskosten der Biolistik Apparatur. Die Patentrechte für Genkanone wurden im Jahr
1990 an die Firma DuPont (Wilmington, USA) verkauft und der Vertrieb wurde an die Firma
Bio-Rad übertragen.
1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation
Agrobakterien sind bodenbürtige gramnegative Bakterien aus der Klasse der
Alphaproteobacteria. Die meisten Agrobacterium-Spezies leben saprophytisch, einige sind
pathogen und verursachen neoplastische Erkrankungen wie Wurzelhalsgallen (A.
tumefaciens) oder die Haarwurzelkrankheit (A. rhizogenes) bei einem breiten Spektrum an
dikotyledonen und manchen monokotyledonen Pflanzen (DeCleene and DeLay, 1976).
1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen
Die Bildung von Tumoren wird durch die artübergreifende Genübertragung (horizontaler
Gentransfer) des bakteriellen Ti-Plasmid in die Pflanze verursacht. Die Induktion der
Virulenzmaschinerie von Agrobacterium (vir-Gene) wird durch sekundäre Pflanzenstoffe wie
Acetosyringon und andere phenolischen Verbindungen ausgelöst (Stachel et al. 1986). Die zu
übertragende bakterielle T-DNA (transferred DNA) ist Teil des ca. 200 kb großen Tumor
induzierenden (Ti) Plasmids und kodiert Gene für die Auxin- und Cytokininsynthese, die ein
unkontrolliertes Zellwachstum und schließlich die Tumorbildung in der Pflanze auslösen.
Neben Auxin- und Cytokinin- kodierenden Sequenzen trägt die T-DNA Gene für die Synthese
von Opinen, stickstoffreichen Molekülen, welche von der Pflanze produziert und in die
Umgebung sekretiert werden und von Agrobacterium als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle
genutzt werden. Flankierende kurze, repetitive Sequenzen (25 bp) der T-DNA werden als left
und right border (LB, RB) bezeichnet. Vor einem T-DNA-Transfer wird die ca. 20 kb große T-
DNA durch einen durch Endonukleasen (VirD, Abb. 1.4) verursachten Einzelstrangbruch
innerhalb der RB, für den Transfer vorbereitet. (Lacroix 2006; Citovsky 2007; Frandsen 2011).
Der Transfer der einzelsträngigen T-DNA erfolgt über das bakterielle Typ IV-
EINLEITUNG 10
Sekretionssystem (Christie 2004). In der Wirtszelle entsteht der „mature T-complex“, der mit
Hilfe verschiedener bakterieller und pflanzlicher Faktoren (Tzfira und Citovsky 2002) entlang
des Cytoskeletts in den pflanzlichen Zellkern transportiert wird. Die Integration der T-DNA
ins pflanzliche Genom ist bis heute nicht gänzlich verstanden (Tzfira 2004; Lacroix 2006),
erfolgt jedoch eher unspezifisch, begünstigt durch bestimmte Tandemwiederholungen.
Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle. Abbildung aus Citovsky et al. (2007). Dar-stellung der wichtigsten molekularen Vorgänge bei der Übertragung und Integration der T-DNA von Agrobacterium in das Pflanzengenom.
1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen
Die natürliche Fähigkeit der Agrobakterien zur Übertragung von genetischem Material in die
Wirtspflanze wird in der Forschung seit 1977 gezielt für genetische Modifikation von
Pflanzen zur Erzeugung einer ortsspezifischen oder zufälligen Mutagenese („random
mutagenesis“) und zur heterologen Expression genutzt (Schell und Van Montagu 1977).
Durch die Modifikation des Ti-Plasmids und Konstruktion binärer Vektoren (Bevan 1984),
konnte eine erhöhte Effizienz dieser Transformationsmethode unter Laborbedingungen auch
bei vielen Pilzen (Bundock et al. 1995; de Groot et al. 1998; Michielse et al. 2005; Frandsen
EINLEITUNG 11
2011) erreicht werden. Inzwischen sind eine Reihe von Agrobakterien-Stämmen verfügbar,
die für die Transformation von Pilzen eingesetzt werden, z.B. LBA1100 (Beijersbergen et al.
1992), EHA105 (Hood et al. 1993), GV3101 (Koncz and Shell, 1986) oder AGL1 (Lazo et al.
1991). Die Zahl der mittels Agrobacterium transformierbaren Pilze nimmt ständig zu
(Frandsen 2011). Neben den Ascomyceten: Botrytis cinerea (Rolland et al. 2003), Aspergillus
sp. (Gouka et al. 1999; Michielse et al. 2008; Sugui et al. 2005), Colletotrichum sp. (Münch et
al. 2011; Talhinhas et al. 2008), Fusarium sp. (Mullins et al. 2001; Liu et al. 2009) u.a.,
gehören zahlreiche Vertreter der Basiodiomyceten wie: Agaricus bisporus (de Groot et al.
1998; Chen et al. 2000), Laccaria bicolor (Kemppainen et al. 2008), Melampsora lini
(Lawrence et al. 2010), Rhizoctonia solani (Wu and O’Brien 2009) oder Ustilago maydis (Ji et
al. 2010) zu den durch Agrobacterium transformierbaren Pilzen. Auch die Transformation
von Oomyceten wie Phytophthora infestans wurde mittels Agrobacterium erreicht (Vijn and
Govers, 2003).
1.4 Zielsetzung
Die molekularbiologische Untersuchung des Rostpilzes Uromyces fabae und damit die
Erforschung der biotrophen Lebensweise ist bislang erschwert, da kein System für eine
stabile Transformation verfügbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mittels zweier
unterschiedlicher Methoden, Biolistik und Agrobacterium tumefaciens-vermittelter
Transformation (ATMT) die Möglichkeit geschaffen werden, U. fabae genetisch zu
modifizieren. Für die Visualisierung der Transformationsereignisse in vitro, sollten die
Farbmarker iGFP, DsRed bzw. GUS verwendet werden, um optimale Parameter für beide
Transformationsmethoden in vitro zu etablieren. Einzelne Punktmutationen in bereits
charakterisierten Genen für Tubulin (Uf-TBB1) und die Succinat Dehydrogenase (Uf-SucDH1),
die eine Resistenz gegenüber den Fungiziden Benomyl bzw. Carboxin vermitteln, sollten als
Marker benutzt werden, um eine Propagation und Selektion der U. fabae-Transformanten in
planta zu ermöglichen. Unter diesen Bedingungen sollten möglichst viele
Transformantenlinien in V. faba Pflanzen unter Selektionsdruck propagiert werden.
Desweiteren sollten molekularbiologische Methoden wie PCR und Southern Blot für die
Analyse der selektionierten Transformanten von U. fabae, etabliert werden.
MATERIAL UND METHODEN 12
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien und ihre Herkunft sind im Text angegeben. Die Hersteller-Liste
ist Tabelle 2.1 zu entnehmen.
Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien.
Firma Firmenstandort
Becton Dickinson GmbH
Heidelberg
Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe
Chem Service Inc West Chester, USA
GE Healthcare München
Invitrogen Karlsruhe
Merck KGaA Darmstadt
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH Taufkirchen
SERVA Electrophoresis GmbH Heidelberg
2.2 Verwendete Organismen
Die in dieser Arbeit verwendeten Organismen sowie ihre Kultivierung sind den folgenden
Abschnitten zu entnehmen.
2.2.1 Bakterienstämme
2.2.1.1 Escherichia coli
Für Klonierung und Plasmidvermehrung wurde der in Tabelle 2.2 beschriebene E. coli-Stamm verwendet. Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm.
Stammbezeichnung Genotyp Herkunft
DH5
F-, ϕ80lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1,
endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44 λ-, thi-1 gyrA96,
relA1
Invitrogen
MATERIAL UND METHODEN 13
2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens
Die für die Transformation von U. fabae verwendeten Agrobacterium-Stämme sind in Tabelle 2.3 aufgelistet. Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae.
Stamm Genotyp Referenz
AGL-1 AGL0 (C58 pTiBo542) recA::bla, T-region deleted Mop(+); RifR, CbR Lazo et al. 1991
GV3103 C58-C1 pTiC58; GmR Holsters et al. 1980
LBA1100 C58-C1 with a disarmed octopine-type pTiB6 plasmid; SpR
Beijersbergen et al. 1992
2.2.2 Verwendete Kulturmedien
Im Folgenden wird Zusammensetzungen der Flüssigmedien für Bakterienkulturen
angegeben. Wenn nicht anders angegeben wurden für Kulturplatten Flüssigmedien mit 1,5 %
(w/v) Agar angesetzt.
2.2.2.1 Für E. coli
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambrook und Russell, 2001)
Bacto Trypton 1,0 % (w/v)
Hefeextrakt 0,5 % (w/v)
NaCl 171,1 mM
Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.
Zur Herstellung von Selektivmedien wurden nach dem Autoklavieren zusätzlich folgende
Antibiotika zugegeben:
Ampicillin 100 µg/ml
Kanamycin 50 µg/ml
2.2.2.2 Für A. tumefaciens
LBMC-Medium
Zum LB-Medium wurde zusätzlich zugegeben:
MgSO4 2,5 mM
CaCl2 2,5 mM
MATERIAL UND METHODEN 14
Antibiotika für die Selektion der entsprechenden Agrobacterium-Stämme:
AGL-1 Rifampicin 10 µg/ml
Carbenicillin 75 µg/ml
LBA1100 Spectinomycin 100 µg/ml
GV3103 Gentamycin 25 µg/ml
Für die Vermehrung von Agrobakterien welche die Plasmide für die Transformation tragen
wurde zusätzlich Kanamycin (25 µg/ml) zugegeben.
Induktionsmedium (AS-Medium)
MgCl2 10 mM
MES/KOH pH5,6 10 mM
Acetosyringon 200 µM
2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial
2.2.3.1 Pilzmaterial
Für alle Experimente wurde der Ackerbohnenrost, Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER
(Rasse I2) verwendet.
2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen
Wenn nicht anders angegeben wurden die Uredosporen für in vitro Untersuchungen in 0,01
% Tween20 für 2 h unter starkem Rühren hydriert. Nach der Vakuum-Filtration wurden die
trockenen Sporen vorsichtig in einem entsprechenden Flüssigkeitsvolumen aufgenommen
und mit einer Airbrush-Pistole (HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf in
Petrischalen eingebettete Objektträger (1976 mm2) mit oder ohne PE Membran gesprüht.
Die luftdichten, feuchten Petrischalen (Ø 9 cm) wurden für 16-22 h bei 24 °C im Dunkeln
inkubiert. Zur Differenzierung der Infektionsstrukturen wurden die PE-Folien zusätzlich
mittels einer Stahlbürste angeraut.
MATERIAL UND METHODEN 15
2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl
Bei der Vorbereitung von Sporen für Transformationsansätze wurden mehrere Präparations-
schritte von Hydrierung über Filtration, gefolgt vom Beschuss während der Biolistik und
schließlich dem Aufsprühen notwendig. Dabei entstanden jeweils Verluste an
Sporenmaterial. Um die genaue Sporenzahl bei jeden Schritt zu bestimmen wurden diese vor
dem Aufsprühen in einer Neubauer Zählkammer (BRAND GmbH + Co KG, Wertheim) bzw.
nach Aufsprühen auf dem Objektträger bestimmt. Die Sporenzahlen für jeden Schritt sind in
Tabelle 2.4 dargestellt.
Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten. 350 mg Sporen wurden hydriert und filtriert. Pro Beschuss und Objektträger (Pflanzenblatt) wurden 23,3 mg verwendet. Anzahl der Sporen I: nach Hydrierung; II: nach Filtration; III: nach Biolistik; IV: nach Aufsprühen auf Objektträger (1976 mm2).
Sporenmenge I II III IV
350 mg 1,1 x 108 4,6 x 107
-- --
23,3 mg
-- -- 2,67 x 106 4,4 x 105
1 g
3,1 x 108 1,3 x 108 1,1 x 108
1,9 x 107
2.2.3.4 Pflanzenmaterial
Saatgut von Vicia faba 'Witkiem Manita' wurde von agri-Saaten GmbH, Bad Essen bezogen.
Die Aussaat der Ackerbohnen erfolgte in gedämpftem Substrat (Einheitserde Typ T,
Gebrüder Patzer GmbH & Co. KG, Buchenberg) und anschließender Anzucht für 21 Tage bei
21 °C, 90 % rel. Luftfeuchtigkeit und Tag-/Nacht-Periode von 16/8 h in einer Phytokammer
(Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S).
2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba
Für die Inokulation mit U. fabae Uredosporen wurden für alle Versuche drei Wochen alte
Ackerbohnenpflanzen verwendet. Bei größeren Sporenmengen und für eine Vermehrung in
größerem Maßstab wurden Uredosporen (350 mg/100 ml) in 0,01 % Tween20 für 2 Stunden
unter ständigem Rühren hydriert. Nach Filtration wurde eine Suspension mit einer
Sporendichte von 155 mg/ml in 0,01 % Tween20 angesetzt und mittels der Airbrush Pistole
(HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf die Pflanzen gesprüht. Für eine optimale
MATERIAL UND METHODEN 16
Sporenkeimung wurden so behandelte Pflanzen für 24 h bei hoher Luftfeuchtigkeit und 21 °C
inkubiert. Anschließend wurden die mit U. fabae infizierte Pflanzen im Gewächshaus bei fol-
genden Bedingungen kultiviert: Heiztemperatur Tag 20 °C / Nacht 16 °C, Lüftung Tag 25 °C /
Nacht 22 °C, Zusatzbeleuchtung 18-22 Uhr. Die Ernte der Uredosporen erfolgte nach 10 bis
15 Tagen durch Schütteln der infizierten Pflanzen. Die Lagerung der Sporen erfolgte bei -70
°C.
2.3 Verwendete Plasmide
Alle für die Transformation von U. fabae verwendeten Plasmide sind in Tab. 2.5 angegeben.
Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae.
Bezeichnung Gen Selektion Verwendung Referenz
pBluescript II KS – AmpR Vektor Short et al., 1988
pBIN20 – KanR Vektor Hennegan und Danna, 1998
pPgpd-DsRed DsRed AmpR DsRed-Marker Mikkelsen et al. 2003
pSW3386 mut-TBB1 (TBB1-E198A)
AmpR Biolistik Stefan Wirsel
pSW3534 GFP AmpR Biolistik Stefan Wirsel
pRV101 (4) mut-TBB1 (TBB1-E198A)
KanR ATMT Heike Lenz
pRV102 GFP KanR ATMT Ralf Vögele
pRV103 GUS AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV111 mut-SucDH1 (SucDH1-H254Y)
AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV112 mut-SucDH1 (SucDH1-H254Y)
KanR ATMT Ralf Vögele
pRV113 mut-SucDH1 (SucDH1-H254L)
AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV114 mut-SucDH1 (SucDH1-H254L)
KanR ATMT Ralf Vögele
pRV115 DsRed AmpR Biolistik Heike Lenz
pRV115-NLS DsRed-NLS AmpR Biolistik Diese Arbeit
pRV116 DsRed KanR ATMT Heike Lenz
pRV116-NLS DsRed-NLS KanR ATMT Diese Arbeit
pRV117 iGFP AmpR Biolistik Ralf Vögele
pRV111-DsRed SucDH1-H254Y-DsRed
AmpR Biolistik Heike Lenz
pRV112::DsRed SucDH1-H254Y-DsRed
KanR ATMT Heike Lenz
MATERIAL UND METHODEN 17
2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik
Für die Konstruktion der Plasmide für die biolistische Transformation wurde der pBluescript
II KS-Vektor (X52327) verwendet (Größe 2961 bp, Short et al., 1988).
Für die Kontrolle der Expression der verwendeten Markergene wurden endogene
regulatorische Elemente, die Promoter (p)- und Terminator (t)-Sequenzen der U. fabae
Plasmamembran-ATPase (Uf-PMA1), verwendet, welche in allen von Uredosporen
ausgehenden Infektionsstrukturen konstitutiv exprimiert wird (Struck et al., 1998).
Farbmarker
Insgesamt vier verschiedene Farbmarker, GUS, eGFP, iGFP und DsRed wurden in den
pBluescript II KS Vektor eingefügt. Das erste Konstrukt wurde mit einheitlichen
Restriktionsschnittstellen versehen, die ein späteres Austauschen der einzelnen Markergen-
kassetten erleichterten. So wurden bei tPMA1 Schnittstellen für NotI (5‘) und SacI (3‘)
eingeführt, bei pPMA1 XmaI (5‘) und NcoI (3‘). Der Farbmarker eGFP (aus dem Plasmid
pEFGF-N1, Clontech, Mountain View, CA) wurde in das oben beschriebenen Konstrukt zum
Plasmid pSW3534 ligiert. Für alle anderen Farbmarker wurde von Plasmid pSW3534
ausgehend durch den Austausch der Markergene über die einheitlichen Schnittstellen
gearbeitet und somit die Plasmide pRV103 (GUS), pRV115 (DsRed) und pRV117 (iGFP)
konstruiert. Ein Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal, NLS) basierend auf dem
SV40 Large T-antigen NLS (PKKKKRKV), (Kalderon et al., 1984) wurde mit den
Oligonukleotiden NLS-Rev und NLS-Fwd (Tab. 2.7) amplifiziert. Nach der Dephosphorylierung
wurde die NLS-Sequenz in das mit dem Enzym NcoI linearisiete pRV115 Plasmid ligiert. Das
entstandene Plasmid wurde mit pRV115-NLS bezeichnet.
Fungizidmarker
Die bereits modifizierte Uf-SucDH1 mit jeweils einer Punktmutation in SucDH1-H254Y
(pRV111) und SucDH1-H254L (pRV113), wurde für die Selektion mit dem Fungizid Carboxin
verwendet. Für die Selektion mit Benomyl wurden Plasmide mit dem modifizierten Tubulin
Gen (TBB1-E198A) verwendet (pSW3386, Wirsel et al. 2004).
MATERIAL UND METHODEN 18
2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation
Als Ausgangsvektor für die ATMT-Plasmidkonstrukte wurde der binäre Vektor pBIN20
(Hennegan und Danna 1998) verwendet (Größe 12040 bp). Analog zu Plasmidkonstruktion
für die Biolistik wurden die Markergene durch Austausch über einheitliche
Restriktionsschnittstellen zwischen Left- und Right-Border von pBIN20 eingefügt.
2.4 Transformationsmethoden
2.4.1 Biolistik
Für die Transformation von U. fabae mittels Biolistik wurde die PDS-1000/He Particle
Delivery System (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) verwendet.
Hydrierte Uredosporen (350 mg, 4,6 x 107) wurden in 2,25 ml 0,01 % Tween20 resuspendiert
und 150 µl der Sporensuspension in der Mitte einer Petrischale (Ø 9 cm) pipettiert. Die
Plasmid DNA, linearisiert oder zirkulär, wurde wie folgt mit Goldpartikeln gekoppelt
(Microcarrier) und auf Macrocarrier gegeben: 0,06 g Gold (1 µM Durchmesser) wurden nach
Hersteller Anleitung gewaschen und in 1 ml sterilem 50 % Glycerin resuspendiert. Nach
gründlichen Vortexen wurden 50 µl der Goldsuspension unter weiterem kontinuierlichen
Vortexen mit 5 µl Plasmid-DNA (1 µg/ml), 50 µl 2,5 M CaCl2 und 20 µl 0,1 M Spermidin
gemischt. Die Ansätze wurden kurz zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet
mit 140 µl 70 % Ethanol gewaschen. Dieser Waschschritt wurde mit 100 % Ethanol
wiederholt, das Pellet in 50 µl 100 % Ethanol resuspendiert und 8 µl Aliquots auf die
Macrocarrier pipettiert. Der Beschuss erfolgte unter den in Tabelle 2.6 angegebenen
Parametern.
Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae. Optimale Parameter sind hervorgehoben.
Parameter Variation
Microcarrier (Typ und Durchmesser) [µm] Gold, 1 Wolfram 0,4 / 0,7
Heliumdruck [bar] 62, 93, 107, 138, 152
Target-Distanz [cm] 3, 6, 9, 12
Vakuum in der Kammer [bar] 0,153
MATERIAL UND METHODEN 19
Für die Veranschaulichung des Bombardierungsprozesses dient Abbildung 2.1.
Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System. Distanz von Rupture Disk zu Macrocarrier (A, konstant), Macrocarrier-Distanz zum Stopping Screen (B, konstant), Distanz zwischen Stopping Screen und Target Cells (Uredosporen), (C, veränderbar). (Verändert nach Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland)
Nach dem Beschuss wurde die Sporensuspension (3 x 106 Uredosporen) mit 300 µl 0,01 %
Tween20 von der Petrischale gewaschen und zum Aufsprühen auf die Pflanzen oder für in
vitro Versuche verwendet.
2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT)
Transformierte Agrobakterien wurden von Kulturplatten in Flüssigkultur umgesetzt. Dazu
wurde eine Kolonie in 10 ml LBMC Medium überführt und für 24 h bei 28 °C und 250 rpm
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch eine Zentrifugation (15 min, 4000 rpm, RT)
pelletiert und das Pellet in 5 bis 10 ml Induktionsmedium (AS-Medium) schonend
resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in sterile 50-100 ml Kolben überführt und für 6
Stunden bei 28 °C und 200 rpm inkubiert. Durch eine OD600-Messung wurde die
Bakterienzahl bestimmt und die Zellen mit den hydrierten Uredosporen in gegebenem
Verhältnis (1 : 38,5; 1 : 100 oder 1 : 200 Uredosporen : Agrobakterien) gemischt. Die
Uredosporen-Agrobakterien-Suspension wurde anschließend wie beschrieben (2.2.3.2 und
2.4.3.) auf Objektträger oder Pflanzen wie beschrieben aufgesprüht.
MATERIAL UND METHODEN 20
Pflanze 1 Pflanze 2 Pflanze 3
Keine Selektion 1. Fungizid-Selektion 2. Fungizid-Selektion
2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema
Das Aufsprühen der Sporensuspension auf V. faba Blätter nach der biolistischen
Transformation, richtete sich nach der Sporendichte die für in vitro Screens benutzt wurde (3
x 106 Sporen pro Objektträger). Nach 10 bis 15 Tagen (s. 2.2.2.5) wurden die Uredosporen
durch Schütteln der Pflanzenblätter geerntet, wobei Wildtyp- und potentiell transformierten
Sporen nicht getrennt wurden (Abb. 2.2). Für eine Selektion in einem weiteren Schritt
wurden die zu inokulierenden Ackerbohnenblätter mit Fungizid besprüht und zum
Abtrocknen stehen gelassen. Für eine Selektion mit Carboxin wurden 400 µl (50 µg/ml) und
für Benomyl 400 µl (10 mg/ml) des Fungizids pro Blatt aufgesprüht.
Die vorhydrierten Sporen wurden wie beschreiben auf die mit Fungizid vorbehandelten
Blätter gesprüht. Zur Ausbringung von einzelnen Rostpusteln (Pflanze 2) für eine weitere
Selektion (Pflanze 3) wurden die Sporen trocken auf mit Fungizid vorbehandelte Blätter
gegeben und mit einer Pipettenspitze oder einem Laborlöffel auf dem Blatt verteilt.
Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta. Ausführliche Erklärung siehe Abb. 3.10.
MATERIAL UND METHODEN 21
2.5 Molekularbiologische Methoden
2.5.1 DNA-Präparation
2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial
Die DNA Isolation aus gesundem oder mit U. fabae infiziertem Blattmaterial wurde mittels
Chelex-Methode durchgeführt. Dafür wurde das Pflanzenmaterial in flüssigem N2 10 min
gemörsert und anschließend mit 500 µl 10 % Chelex100 (Bio-Rad Laboratories GmbH,
München) versetzt. Die Proben wurden für 60 min bei 65 °C inkubiert und anschließend für 5
min auf 95 °C erhitzt. Nach einer Zentrifugation bei 14 000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge,
Vmax) wurde der Überstand abgenommen und die DNA-Konzentration in BioPhotometer
(Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Die Aufbewahrung der Proben für die weitere Verwendung
erfolgte bei 4 °C.
2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen
Bei kleineren Sporenmengen wurden die Sporen in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt und in einer Kugelmühle homogenisiert. Dafür wurden je 2 Keramikkugeln (5 mm
Durchmesser) pro Reaktionsgefäß verwendet und die Proben für 3 bis 4 min bei maximaler
Geschwindigkeit in einer Kugelmühle (Retch MM, 1/30 S) geschüttelt. Der
Homogenisierungsgrad bzw. das Aufbrechen der Sporen wurde mikroskopisch überprüft. Die
DNA-Präparation aus aufgebrochenen Sporen wurde mit dem InnuPREP Plant DNA Kit
(Analytik Jena) nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Die Proben wurden nach der
Elution der DNA in einer SpeedVac eingeengt und eine DNA-Konzentrationsmessung
durchgeführt.
2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen
Bei größeren Sporenmengen (> 100 mg) wurde die Präparation genomischer DNA nach der
von Hahn und Mendgen etablierten Methode (1997) durchgeführt.
Nach Hydrierung für mehrere Stunden unter starkem Rühren wurden gekeimte Sporen für
10 min in flüssigem Stickstoff im gekühlten Mörser zu einem feinen Pulver zerrieben und in
SS34 Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zugabe von 5 ml TES (100 mM Tris-HCl, 10
MATERIAL UND METHODEN 22
mM EDTA, 2 % SDS, pH 8) und 50 µg in Wasser gelöster RNAse A wurde die Mischung kräftig
geschüttelt und bei 37 °C für 60 min inkubiert. Danach wurde 75 µg Proteinase K zugegeben
und für 60 min bei 58 °C inkubiert. Die Suspension wurde gemischt und anschließend
zentrifugiert (5 min, 3000 g), der Überstand mit 5 ml Phenol (pH 8) versetzt und die
Phasentrennung durch Zentrifugation (5 min, 3000 g) herbeigeführt. Der Schritt wurde mit 5
ml Phenol/Chloroform (1:1) wiederholt und die obere wässrige Phase zur DNA-Fällung in ein
neues Röhrchen überführt. Die Fällung wurde mit 1/10 Volumen NaOAC (pH 5,2) und 1
Volumen Isopropanol für 30 min bei 4 °C durchgeführt. Durch eine Zentrifugation (5 min,
23000 g, 4 °C) wurde die DNA pelletiert und mit 2 ml 70 % Ethanol gewaschen. Nach dem
Waschschritt wurde die genomische DNA für 15 min bei RT getrocknet und schließlich in 0,2
ml Wasser gelöst. Die Aufbewahrung der DNA-Proben erfolgte bei 4 °C.
2.5.1.4 Amplifikation genomischer DNA mit REPLIg
Konnten nur geringe DNA Mengen aus wenigen Sporen (einer Rostpustel) isoliert werden,
wurde die präparierte DNA mit dem REPLIg-Kit (REPLI-g Mini Kit, QIAGEN GmbH, Hilden)
amplifiziert. Dafür wurden 25 ng genomischer DNA (U. fabae) verwendet und nach
Herstellerangaben (REPLI-g® Mini/Midi Handbook, Qiagen) amplifiziert. Die vervielfältigte
DNA wurde ohne Konzentrationsmessung in einer Verdünnung 1:10 und 1:100 für die PCR
verwendet.
2.5.1.5 Plasmidpräparation aus E. coli
Für Plasmid-DNA Präparationen wurde das E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit II (Peqlab,
Erlangen) verwendet. Die Bakterienkulturen wurden in Selektivmedium bei 37 °C angezogen
und nach Herstellerangaben zur DNA-Präparation verwendet.
2.5.1.6 DNA-Konzentrationsmessungen
Eine Messung der DNA Konzentration erfolgte in einem BioPhotometer (Eppendorf,
Hamburg) bei 260 und 280 nm. Die Reinheit der DNA Proben wurde durch den Quotienten
OD 260/280 bestimmt.
2.5.2 PCR-Methoden
Die Polymerase Kettenreaktion (Saiki et al. 1988; Sambrook und Russel 2001) wurde für den
Nachweis von Gensequenzen in Plasmiden, genomischer DNA von U. fabae sowie
MATERIAL UND METHODEN 23
transformierten Bakterien verwendet. Dabei wurden drei Protokolle für Standard-, Nested-
und Kolonie-PCR verwendet, die in folgenden Abschnitten beschrieben werden.
2.5.2.1 Oligonukleotide
Die für diese Arbeit verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 2.7 zusammengefasst
Tabelle 2.7: Verwendete Oligonukleotide.
Name Sequenz (5' – 3') Verwendung
PMA1T.F1 TTG CGG CCG CTA CTT CCC CAG ATG TCC Klonierung
PMA1T.R1 TTT GAG CTC GCT ACA GCC TGG AGT CAC AAT Klonierung
PMA1P.F1 TTT CCC GGG CGC AGA ATT TTG AAA CTT G Klonierung
PMA1P.R1 TTC CAT GGT GAT TAG TAA TTA AGA GAT GAT Klonierung
GUS-5-NcoI CCA TCC ATG GTA CGT CCT GTA GAA ACC CCA AC Klonierung
GUS-3-NotI GGA TGC GGC CGC GAG AGT TGT TGA TTC ATT G Klonierung
GFP-Intron-NcoI CCA TCC ATG GCG GTC AGT ACA CCA CAC AGC Klonierung
GFP-Intron-NotI GAG TCG CGG CCG CTT ACT TGT ACA GCT CGT CC Klonierung
DsRed-Fwd CGC CAC CAT GGC CTC CTC CGA GGA CGT C Klonierung
DsRed-Rev GAG TCG CGG CCG CTA CAG GAA CAG GTG G Klonierung
SucDH-5-BspHI CCA TTC ATG ATC AAC ATT CCG AAT TC Klonierung
SucDH-3-NotI GGT AGC GGC CGC CAT TTC AGG CTG ATG CCA TC Klonierung
SucDH-H254Y-Rev GAA AAT TGT GTA ACA TCT GTA G Mutation H254Y
SucDH-H254Y-Fwd CTA CAG ATG TTA CAC AAT TTT C Mutation H254Y
SucDH-H254L-Rev GAA AAT TGT GAG ACA TCT GTA G Mutation H254L
SucDH-H254L-Fwd CTA CAG ATG TCT CAC AAT TTT C Mutation H254L
NLS-Fwd CAT GGT CGA GCC TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT CGA ATT CGC
Klonierung
NLS-Rev CAT GGC GAA TTC GAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG AGG CTC GAC
Klonierung
PGP-F GAT CCT CGA GCG CTA CAG CCT GGA GTC AC Klonierung
PGP-R GAT CCT CGA GCG CAG AAT TTT GAA ACT TGA G Klonierung
3534-3 GAC AAA AAG TAC AAA CCG CCC Klonierung
SucDH4 GAT GGT GTC AAC ACG CTG GC Klonierung
114-F1 CTG AAG ATG GCT GTT TAC C Nested PCR
114-F2 CCC GCA ACC GAT GAC AAC G Nested PCR
114-R2 GTT TTC AAT TTA ATC ACA AG Nested PCR
3534-1 GTG TCT TCT ATT GCT AAA CTT G Nested PCR
MATERIAL UND METHODEN 24
SucDH1 GGG TGG CAA AAG AGG ATG AG Nested PCR
pPMA1_rev GTCCATTCCCCATCCGTTG Nested PCR
SucDH3-2 GGT GTC TTC GCT TCA TTT C SB Sonde
H130.R1 CAG TTA CTG GTG GAA TCA AGA TG SB Sonde
Uf-PMA1gen Fwd 1 GAG TAG TTC CGA GTT GGT G Nested PCR
Uf-PMA1gen Rev 1 GTA CTT CAC TGC TTT CTC TGC Nested PCR
Uf-PMA1gen Fwd 2 CAC TTG TCT TGG CGC TCT G Nested PCR
Uf-PMA1gen Rev 2 GCG GAA GGA GAA TCA CAA AG Nested PCR
RB_Fwd_1 GTC GTT TCC CGC CTT CAG Nested PCR
RB_Fwd_2 GAC AGG ATA TAT TGG CGG G Nested PCR
pBIN20 Rev1 CGG ATC ACT GTA TTC GGC TG Nested PCR
pBIN20 Rev2 CAA TCG GAC CAG CGG AGG Nested PCR
SucDH1 nested forward 1 CTT GTT CAA TGT AGA TGG ATG G SNP-PCR
SucDH1 SNPrev1 CAA GAG ACA CCA ATG AAG CC SNP-PCR
SucDH1 SNPrev2 GCT TTA GCA CCA GGC AGT G SNP-PCR
SNP Primer Suc GCT CTC TCT CTA CAG ATG TT SNP-PCR
SNP Suc WT GCT CTC TCT CTA CAG ATG TC SNP-PCR
2.5.2.2 Standard und Nested-PCR
Für einen Nachweis bekannter Sequenzen in Plasmiden, nach Transformationsexperimenten
sowie zur Herstellung von der DNA Amplifikate für Southern Blot-Sonden wurde die
Polymerase Kettenreaktion (Saiki et al. 1988; Sambrook und Russel 2001) angewandt. Die
dafür verwendeten Komponenten sind in Tabelle 2.8 zusammengefasst.
Tabelle 2.8: Standardprotokoll für PCR-Reaktion.
Komponente Endkonzentration
10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x
MgCl2 2,5 mM
BSA 10 µg
dNTPs 0,2 mM
Primer 5 0,5 µM
Primer 3 0,5 µM
Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,05 U/µl
H2O Millipore variabel
Template (DNA 20-500 ng) variabel
MATERIAL UND METHODEN 25
Die Amplifikation von DNA-Fragmenten wurde in einer Standard PCR-Reaktion mit dem High
Fidelity PCR-Enzyme Mix (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) durchgeführt. Die dazu
verwendeten PCR-Programme (UNIV), variierten in der Annealing-Temperatur abhängig von
der Primer-Hybridisierungstemperatur sowie in der Elongationszeit je nach Größe des zu
amplifizierenden Fragments (30 sec/500 bp). Weitere Faktoren sind Tab. 2.9 zu entnehmen.
Tabelle 2.9: PCR Univ Programme.
Schritt Temperatur [°C] Dauer [min]
1. Denaturierung 95 3:00
2. Denaturierung 95 0:30
3. Annealing 50-65 0:30
4. Elongation 72 0:30-4:00
5. Wiederholung der Schritte 2.-4. (bis 30x)
6. Endelongation 72 3:00
7. Kühlung 8
2.5.2.3 Nested-PCR
Bei geringen DNA-Mengen (< 100 ng) wurde eine geschachtelte Standardreaktion, eine
sogenannte Nested-PCR, durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte aus der ersten PCR
wurden als Template (1:10 bis 1:100 verdünnt) für die zweite Reaktion verwendet. Dabei
wurde Schritt 5. (Tab. 2.9) variiert (19 Zyklen in Reaktion 1 bzw. 29 Zyklen für Reaktion 2).
2.5.2.4 Kolonie-PCR
Für die Überprüfung des Transformationserfolgs bei E. coli bzw. A. tumefaciens wurde eine
Kolonie-PCR durchgeführt. Dafür wurde eine kleine Menge Zellen mittels eines sterilen
Zahnstochers aus einer Bakterienkolonie entnommen und in den PCR-Ansatz (Tab. 2.8)
überführt. Anschließend wurde die PCR Reaktion (Tab. 2.9) durchgeführt.
2.5.2.5 SNP-PCR
Bei Vorliegen eines Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism (SNP))
wie bei der mut-SucDH1-Variante, wurde für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und
MATERIAL UND METHODEN 26
Transformanten-DNA die SNP-PCR angewandt (Ye et al. 2001). Dabei wurde ein modifiziertes
Protokoll für eine Nested-PCR erarbeitet (s.a. Abb. 3.18), in welchem in der ersten PCR-
Reaktion ein spezifisches Fragment der SucDH1 mit den Oligos SucDH1 nested forward 1 und
SucDH1SNPrev1 amplifiziert wurde. Das Amplikon aus der ersten Reaktion wurde als
Template für den SNP-spezifischen Schritt mit den Oligos für den WT-SucDH1 (SNP_Suc WT
und SucDH1 SNPrev2) sowie mut-SucDH1 in potentiellen Transformanten (Oligos SNP_Suc
und SucDH1 SNPrev2). Die Reaktion wurde als Nested PCR mit modifizierten Standard-
Programmen (Tab. 2.9) durchgeführt. Die amplifizierte DNA aus der PCR 1 wurde für die
zweite Reaktion 1:10 verdünnt und davon 2 µl in die PCR 2 überführt.
2.5.2.6 Reinigung von PCR Produkten und DNA aus Restriktionsansätzen
Für die Aufreinigung der DNA aus PCR-Ansätzen wurde das DNA Clean&Concentrator TM -5
Kit (Zymo Research Corp., Orange, USA) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach
Herstellerangaben.
Die Aufreinigung von größeren Mengen an genomischer DNA nach Behandlung mit
Restriktionsenzymen wurde durch eine NaOAc/EtOH-Fällung (Natriumacetat pH 5,2) üN
durchgeführt.
2.5.2.7 Sequenzierung von PCR Produkten
Die Sequenzierung von PCR Produkten und Plasmiden wurde durch die Firma GATC Biotech
AG (Konstanz) durchgeführt. Die Vorbereitung der DNA-Proben erfolgte nach
Firmenangaben.
2.5.3 Agarosegel-Elektrophorese
Die Größe und das Vorhandensein der amplifizierten DNA Fragmente in einer PCR-Reaktion
wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese überprüft (Sambrook und Russel 2001). Dabei
variierte die Konzentration der Agarose (Agarose NEEO Ultra-Qualität, Carl Roth GmbH + Co.
KG, Karlsruhe) in den Gelen zwischen 0,8 und 2 % (w/v) in 1x TAE Puffer (40 mM TrisBase,
1,14‰ Eisessig, 1 mM Na-EDTA, pH 8). Die PCR-Proben wurden mit 6x Loading Dye
(Fermentas, 10 mM Tris-HCl, 0,03 % Bromphenolblau, 0,03 % Xylencyanol FF, 60 % Glycerin,
60 mM ETDA) versetzt und für die Auftrennung in die Geltaschen pipettiert (0,2x
MATERIAL UND METHODEN 27
Probenvolumen), wobei als Größenstandard der GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (0,5 mg
DNA/ml, Fermentas) oder GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (0,5 mg DNA/ml, Fermentas)
verwendet wurde. Als Laufpuffer wurde 1x TAE verwendet, die Elektrophorese erfolgte bei
einer Stromspannung von 60 V für Southern Blot- bzw. 100 V für Standard PCR Gele. Die
Gele wurden anschließend für 10-20 min in einem Ethidiumbromidbad (2 mg/l) schüttelnd
inkubiert. Nach 10minütigen Waschen der Gele in einem Wasserbad wurden die DNA-
Fragmente unter UV-Anregung mit Hilfe eines Molecular Imager ® GelDoc TM XR-System
(Bio-Rad Laboratories GmbH, München) sichtbar gemacht und dokumentiert.
2.5.4 Klonierung von DNA
2.5.4.1 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen
Für die Linearisierung der verwendeten Plasmide, das Schneiden von Genomischer DNA für
Southern Blot-Analysen sowie zur Klonierung von PCR Produkten und Plasmidsequenzen
wurde ein DNA-Verdau mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen durchgeführt (Sambrook
und Russell 2001). Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme sind in Tab. 2.10 aufgelistet. Die
Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben. Die Inaktivierung der Enzyme erfolgte durch
eine Inkubation bei 65 oder 80 °C für 20 min. Die verdaute DNA wurde anschließend
aufgereinigt und für weitere Arbeiten verwendet. Bei Plasmiden, die für Klonierungen
linearisiert wurden, erfolgte eine anschließende Behandlung mit SAP (Shrimp Alkaline
Phosphatase, USB Europe GmbH, Staufen) um eine Religation zu verhindern. Die
Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben für 1 h bei 37 °C, gefolgt von einer
Inaktivierung für 20 min bei 65 °C. Die DNA Proben wurden anschließend erneut
aufgereinigt.
Tabelle 2.10: Verwendete Restriktionsenzyme.
Enzym Hersteller
BamHI Fermentas, St. Leon-Rot
EcoRI Fermentas, St. Leon-Rot
EcoRV Fermentas, St. Leon-Rot
HindIII Fermentas, St. Leon-Rot
NcoI Fermentas, St. Leon-Rot
MATERIAL UND METHODEN 28
NotI Fermentas, St. Leon-Rot
SacI New England Biolabs GmbH, Frankfurt
XhoI Fermentas, St. Leon-Rot
XmaI New England Biolabs GmbH, Frankfurt
2.5.4.2 Ligation verdauter DNA
Die mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Fragmente und Vektoren wurden mit T4 DNA-
Ligase (1 Weiss-Unit/µl, Fermentas, St. Leon-Rot) ligiert. Die Reaktion wurde nach
Herstellerangaben über Nacht bei 16 °C durchgeführt. Eine anschließende Inhibierung der
DNA Ligase erfolgte bei 65 °C für 20 min. Die hergestellten Konstrukte wurden ohne
Aufreinigung für die Transformation von E. coli verwendet.
2.5.5 Kompetente Zellen und Transformation
2.5.5.1 E. coli SEM-kompetente Zellen
Chemisch kompetente Zellen wurden nach dem SEM-Protokoll hergestellt (Simple and
Efficient Method; Inoue et al. 1990). Dafür wurden 5 ml einer E. coli üN-Kultur in 250 ml
SOB-Medium überführt und bei 18-24 °C und 180 rpm kultiviert bis OD600 von 0,55-0,6
erreicht war. Anschließend erfolgte eine Abkühlung der Zellen für 10 min auf Eis und eine
Zentrifugation für 10 min bei 2500x g und 4 °C. Der Überstand wurde verworfen und das
Pellet in 80 ml eiskaltem Transformationspuffer (TB), (10 mM Pipes-Na2, 15 mM CaCl2 , 250
mM KCl, 55 mM MnCl2, pH 6,7) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut 10 min auf Eis
gekühlt und anschließend wie oben beschreiben zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des
Überstandes wurde das Pellet in 20 ml eiskaltem TB aufgenommen und DMSO (7 %
Endkonzentration) zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation auf Eis für 10 min wurden
500 µl-Aliquots in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten DH5 E.
coli Zellen erfolgte bei -70 °C.
MATERIAL UND METHODEN 29
2.5.5.2 Hitzeschocktransformation
SEM-kompetente Zellen (100 µl) wurden in vorgekühlte 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt
und mit 5 µl Ligationsansatz gemischt. Anschließend wurde 15 min auf Eis inkubiert und
danach ein Hitzeschock (90 sec. bei 42 °C) durchgeführt. Erneuert erfolgte eine Inkubation
auf Eis für 5 min und die abschließende Zugabe von 900 µl LB-Medium. Dieser Ansatz wurde
1 h bei 37 °C inkubiert bevor zwischen 100-300 µl Bakteriensuspension auf entsprechende
Selektionskulturplatten ausgebracht und üN bei 37 °C inkubiert wurde.
2.5.5.3 Agrobacterium tumefaciens elektrokompetente Zellen
100 µl einer A. tumefaciens üN-Kultur (28 °C, 270 rpm) wurden in 250 ml LB-Medium mit
dem entsprechenden Antibiotikum gegeben und bei 28 °C und 270 rpm kultiviert bis eine
OD600 = 0,5 erreicht war (üN, jedoch nicht länger als 12 Stunden). Am nächsten Tag wurden
die Zellen für 15-30 min auf Eis gekühlt, in vorgekühlte GSA-Zentrifugenröhrchen überführt
und zentrifugiert (15 min, 4000x g, 4 °C). Alle darauf folgenden Schritte wurden auf Eis
durchgeführt. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet wie folgt gewaschen:
Waschschritt 1: 500 ml 1 mM HEPES pH 7,4, Waschschritt 2: 250 ml 1 mM HEPES pH 7,4 und
Waschschritt 3: 10 ml 1 mM HEPES pH 7,4. Zwischen den Waschschritten erfolgte eine
Abnahme des Überstandes und eine Zentrifugation bei 4 °C, 4000x g für 15 min. Nach dem
letzten Waschschritt wurden die Zellen in SS-34-Röhrchen überführt und erneuert wie oben
beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 2 ml eiskaltem 10 %
Glycerin resuspendiert und zu 40 µl aliquotiert. Nach Schockfrieren in flüssigen Stickstoff
wurden die kompetenten Agrobakterien bei -70 °C gelagert.
2.5.5.4 Transformation durch Elektroporation
Elektrokompetente Bakterienzellen wurden auf Eis aufgetaut und 40 µl in eine vorgekühlte
Elektroporationsküvette (Peqlab, Erlangen) pipettiert. Dazu wurde 1 µl des gewünschten
Plasmids gegeben, gemischt und auf Eis gehalten. Die Elektroporation erfolgte mit einem
Elektroporationsgerät (Gene PulserTM, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit den
Einstellungen: 200 Ω, 2,5 kV und 25 µF. Unverzüglich danach wurde 1 ml LB-Medium
zugegeben, der Ansatz in 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Transformationsansätze wurden danach zu 10 µl bzw. 100 µl auf
MATERIAL UND METHODEN 30
entsprechendes Kulturmedium ausgebracht und für zwei Tage bei 28 °C inkubiert. Die
Kolonien wurden mittels Kolonie-PCR getestet.
2.5.6 Southern Blot
Für eine zusätzliche Untersuchung der Integration der transformierten Zielgene in das U.
fabae-Genom wurden Southern Blot Analysen durchgeführt. In dieser Arbeit wurden für die
Detektion der DNA Signale zwei Markierungstechniken verwendet: 1) Labeling durch
Digoxigenin (DIG-11-dUTP, Roche, Mannheim. und 2) radioaktive Markierung mittels [alpha
32P]-dATP (Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig).
2.5.6.1 Herstellung von DIG-markierten Sonden
In einer Standard-PCR wurden 200 ng genomischer DNA mit 25 mM dNPTs amplifiziert, bei
denen 30 % des dTTP durch DIG-dUTP (Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridin-5’-triphosphat,
alkalilabil) ersetzt waren. Die Sonden wurden für eine Wiederverwendung bei -20 °C
aufbewahrt.
2.5.6.2 32P-markierte Sonden
Für die radioaktive Markierung der DNA wurde ein modifiziertes Protokoll (Tab. 2.11) für die
Markierung mit dATP, [alpha 32 P]- (Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig) angewandt.
Tabelle 2.11: Herstellung 32P-markierter Sonden.
Komponente Endkonzentration
10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x
MgCl2 2,5 mM
-32P-dATP (3000 Ci/mmol) 50 µCi
dGTC-TP Mix 40 µM
dATP (non radioactive) 20 µM
Primer 5 1 µM
Primer 3 1 µM
Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,1 U/µl
H2O Millipore variabel
Template (DNA 200 ng) variabel
MATERIAL UND METHODEN 31
2.5.6.3 Vorbereitung und DNA-Transfer
Die für Southern Blot-Analysen verwendete genomische DNA (10-60 µg) wurde mit
Restriktionsenzymen üN verdaut und anschließend aufgereinigt (siehe 2.5.2.6). Vor dem
Auftragen auf Agarose-Gele (0,8 %) wurde den Proben 6x Loading Dye (Fermentas, St. Leon-
Rot, Deutschland) zugegeben und die DNA anschließend bei 60 V für 4 h aufgetrennt. Das
Gel mit der aufgetrennten DNA wurde für 20 min in Ethidiumbromid (2 mg/l) gefärbt und in
Wasserbad für 15 min entfärbt. Eine Dokumentation erfolgte unter UV-Licht mit angelegtem
Lineal. Zur Hydrolyse großer DNA Fragmente wurde ein Waschschritt für maximal 10 min in
0,25 M HCl durchgeführt, wonach eine Denaturierung für zweimal 15 min in 0,5 M NaOH, 1,5
M NaCl folgte. Das Gel wurde dann zum Neutralisieren zweimal bei RT für 15 min in 0,5 M
Tris/HCl pH 7,5, 3 M NaCl inkubiert. Alle Waschschritte erfolgten auf einem
Horizontalschüttler und nach jedem Zwischenschritt wurde das Gel kurz in H2O geschwenkt.
Der DNA-Transfer wurden nach Southern durchgeführt (Southern 1975) wobei in einem
„upward“-Kapillartransfer die DNA aus dem Gel auf eine Hybond N+-Nylonmembran (GE
Healthcare, München) transferiert wurde. Als Transferpuffer wurde 10x SSC (1,5 M NaCl, 150
mM Na-Citrat, pH 7) verwendet. Der Transfer erfolgte üN. Eine Fixierung der DNA auf der
Membran wurde durch backen bei 120 °C für 30 min erreicht. Die Transfereffizienz wurde
unter UV-Licht kontrolliert.
2.5.6.4 Hybridisierung und DNA Detektion
Digoxigenin-markierte Sonden
Vor einer Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden wurde eine Prähybridisierung
durchgeführt. Dafür wurde die mit DNA beladene Membran für 2 h in 40 ml
Prähybridisierungslösung (0,25 M Natriumphosphatpuffer, pH 7, 1 mM EDTA, 0,5 % Blocking
Reagenz (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), 17,5 % SDS) bei 58-65 °C in einem Hybridi-
sierungsofen rollend inkubiert. Die anschließende Hybridisierung erfolgte üN in 10 ml vorher
aufgekochter Hybridisierungslösung (2,5 µl DIG-markierte Sonde in 10 ml
Prähybridisierungslösung) ebenfalls rollend im Hybridisierungsofen mit gegebener
Hybridisierungstemperatur. Am nächsten Tag wurde die Membran gewaschen und für die
Detektion vorbereitet. Hybridisierungslösung wurde für nochmalige Verwendung bei -20 °C
aufbewahrt. Die Waschschritte erfolgten auf einem Horizontalschüttler und wurden wie
MATERIAL UND METHODEN 32
folgt durchgeführt. Nach 10 minütigen Waschen in Waschpuffer (0,1 % SDS, 2x SSC) bei
gegebener Hybridisierungstemperatur folgte mehrmaliges Waschen für 20 min und RT im
gleichen Waschpuffer. Danach wurde die Membran für 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 3
M NaCl, 0,3 % Tween20, pH 8,0) geschwenkt. Es folgte eine Inkubation für 60 min bei RT in
Blockierungspuffer (MAB, 0,5 % oder 1 % Blocking Reagenz). Durch eine Inkubation (30 min,
RT) in 1:15000 verdünnter Lösung mit Anti-DIG-Antikörper gekoppelter alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), wurde die DIG-Sonde auf der Membran
markiert. Die Membran wurde anschließend 4x für je 10 min bei RT in MAB gewaschen. Es
folgte eine Inkubation (5 min, RT) in Substratpuffer (0,1 M Tris/HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl). Für
die anschließende Detektion mit CSPD-Lösung (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wurde
die Membran auf eine Folie gelegt, mit CSPD-Lösung (10 µl CSPD in 10 ml Substratpuffer)
benetzt und abschließend eingeschweißt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min. Im
Dunkeln wurde ein Hyperfilm ECL (GE Healthcare, München) auf die Membran gelegt und für
1 h bis mehrere Tage exponiert. Mit Hilfe eines Entwicklungsautomaten (SRX-201, Konica,
München) wurden die exponierten Filme entwickelt und ausgewertet.
32P-markierte Sonden
Für eine radioaktive Markierung der DNA Proben wurde Protokoll nach Mertz und
Rashtchian, 1994 angewandt. Alternativ wurden verschiedene Variationen von
Hybridisierungspuffer und Waschschritten der Membran ausgetestet.
2.6 Mikroskopische Methoden
Zur Überprüfung der Sporenkeimung in vitro sowie nach Transformation der Uredosporen
mit Farbmarker-Konstrukten wurden Licht- und Fluoreszenzmikroskopie angewandt.
2.6.1 Durchlichtmikroskopie
Die Keimungs- oder Homogenisierungsrate der Uredosporen wurde mit Hilfe von Durchlicht-
mikroskopie überprüft. Dafür wurde ein Zeiss Axioskop 50 Mikroskop ausgestattet mit Plan-
NEUFLUAR 16/0,5 (Zeiss, Göttingen) und F140/1,30 Öllinsen (Leitz, Wetzlar) verwendet. Für
MATERIAL UND METHODEN 33
Aufnahmen der Präparate wurde eine MC 80 Kamera (Zeiss) sowie der Diafilm Precisa CT
100 oder 200 ASA (Agfa-Gevaert AG, Leverkusen) verwendet.
2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie
Screens für Transformanten, die DsRed- oder GFP-Konstrukte trugen wurden mit einem Zeiss
Axioplan 2 Mikroskop (Karl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen) durchgeführt. Die
verwendeten Filtersätze waren Exciter: HQ 565/30, Emitter: HQ620/60, Beamsplitter: Q581p
für DsRed und der GFP-Filtersatz Excitation: 545/30, Emission: 610/75, Beamsplitter: 565 LP.
Für die Bilddokumentation wurde die Axio Vision LE Release 4.5 Software (Zeiss) verwendet.
2.7 Verwendete Software
Die für Durchführung und Datenauswertung verwendeten Computerprogramme (Software)
sind in Tabelle 2.12 aufgeführt.
Tabelle 2.12: Auflistung der verwendeten Software.
Programm Quelle Verwendung
AdobeAcrobat X 10
Adobe Systems, Mountain View, USA Textbearbeitung
Axio Vision LE 4.5 Karl Zeiss, Göttingen Bildbearbeitung
Corel Draw 12 Corel Corporation, Unterschleißheim Bildbearbeitung
BioEdit Hall 1999; http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html
DNA-Sequenzen
DNASTAR Paket DNAstar Inc., Madison, USA DNA-Sequenzen
EndNoteX Thomson ISI Research Soft, Berkeley, USA Literatur-Datenbank
Gene Runner 3.05 Hastings Software, Inc., Hudson, USA DNA-Sequenzen
GraphPad Prism 3.00
GraphPad Software, San Diego, US Statistik und Grafik
Microsoft Office 2007
Microsoft Corporation, Unterschleißheim Text-/Bildbearbeitung
Mozilla Firefox Mozilla Foundation, Mountain View, USA Web browser
pDRAW32 AcaClone Software, http://www.acaclone.com
DNA-Sequenzen
Quantity One 4.0 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Geldokumentation
R 2.15.1 The R Foundation for Statistical Computing, USA Statistik
ERGEBNISSE 34
3. Ergebnisse
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Transformationsmethoden, Biolistik und
Agrobakterien vermittelte Transformation (Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation (ATMT)) erarbeitet, um eine stabile Transformation des obligat biotrophen
Rostpilzes Uromyces fabae zu erzielen. Diesem Vorhaben lag die Tatsache zu Grunde, dass
für diesen Rostpilz bisher keine erfolgreiche stabile Transformation erreicht werden konnte.
3.1 Auswahl der Methoden für die Transformation von Uromyces fabae
Anfängliche Versuche einer Transformation von U. fabae mittels Elektroporation waren ohne
Erfolg, weshalb andere methodische Verfahren ausgewählt werden sollten. Berichte über
eine erfolgreiche transiente Transformation anderer Rostpilze mittels Biolistik (Bhairi, et al.
1992; Schillberg, et al. 2000) führten zu einer Anpassung dieser Methode auf U. fabae. Eine
weitere Methode, die bei vielen filamentösen Pilzen als effizientere hinsichtlich der Anzahl
der Transformanten beschrieben wurde, ist die Agrobakterien-vermittelte Transformation.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei Methoden, Biolistik und ATMT parallel gearbeitet.
Dafür wurde ein Set von Plasmiden konstruiert, die eine Selektion potentieller
Transformanten ermöglichen sollten. Zur besseren Übersicht werden die Ergebnisse nach
diesen zwei Methoden gegliedert.
3.2. Plasmidkonstrukte für die Transformation
Alle in dieser Arbeit benutzten Plasmidkonstrukte wurden wie in 2.3.1 beschrieben
hergestellt. In Tabelle 3.1 sind Plasmidkarten abgebildet, die zur weiteren Verdeutlichung
dienen sollen.
ERGEBNISSE 35
Tabelle 3.1: Verwendete Plasmidkonstrukte für die Transformation von U. fabae. Biolistik (A) und A. tumefaciens-mediated Transformation, ATMT (B). 1)Plasmide pRV111 und pRV112 vergleichbar mit pRV113 und pRV114 (SucDH1(H254L)).
[A] Biolistik [B] ATMT
[A] pSW3386 (7930 bp) pRV103 (6467 bp) pSW3534 (5363 bp) pRV117 (5429 bp) pRV115
(5319 bp) pRV1111)
(5884 bp) pRV111::DsRed (8285 bp)
[B] pRV101 (17009 bp) pRV104 (15360) -- -- pRV116
(14440 bp) pRV1121)
(14777 bp) pRV112::DsRed (17178 bp)
[a-1]
pPMA1 tPMA1
5 TR 3 TR
[b-1; b-2; b-3; b-4; b-5]
RBLB
pBS II KS
2,9 kb
pBIN20
12,0 kb
TBB1(E198A)
GUS
GFP
iGFP
DsRed
SucDH1(H254Y)
[a-1] 2000 bp
[b-1] 1822 bp
[b-2] 718 bp
[b-3] 784 bp
[b-4] 674 bp
[b-5] 1239 bp
[c-1] 1895 bp
ERGEBNISSE 36
3.3 Biolistische Transformation von U. fabae
Alle Versuche mit Biolistik wurden mit dem Standard PDS-1000/He System (Bio-Rad,
München) durchgeführt. 350 mg Uredosporen (4,6 x 107) wurden in 0,01 % Tween20 für 2
Stunden unter starkem Rühren hydriert und wie in 2.2.3.2 beschrieben für den Beschuss
vorbereitet. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Parameter orientierten sich an den
Ergebnissen von Lenz 2005 (Tab. 3.2).
Tabelle 3.2: Parameter für Transformation von U. fabae mittels Biolistik. Für die Verbesserung der Transformationseffizienz wurden verschiedene Einflussgrößen geprüft (Lenz 2005). Optimale Parameter sind hervorgehoben.
Während bei der Verwendung von Wolfram als Microcarrier keine Transformation der
Uredosporen in vitro beobachtet werden konnte, war die Verwendung von 1 µM Gold bei
einem geeigneten Heliumdruck von 152 bar (2200 psi) erfolgreich. Die verwendete DNA-
Menge die auf einen Microcarrier geladen wurde, betrug 0,8 µg. Die Distanz zwischen
Microcarrier und Petrischale mit den hydrierten Uredosporen (Beschussdistanz) ist in der
Biolistik-Apparatur veränderbar und wurde zwischen 3 und 12 cm variiert. Nur bei einer
Beschussdistanz von 6 cm konnten Transformationsereignisse identifiziert werden (Lenz
2005).
3.4 Detektion der Transformationsereignisse in vitro
Für die mikroskopische Visualisierung der transformierten Uredosporen nach der Keimung
auf Objektträgern, wurde je nach verwendetem Marker die entsprechende Vorbehandlung
zur Mikroskopie durchgeführt. In folgenden werden die Ergebnisse des biolistischen
Beschusses mit Plasmidkonstrukten, die Farb- und Fungizidmarker tragen dargestellt.
Parameter Variation
Microcarrier (Typ und Durchmesser) [µm]
Gold, 1 Wolfram 0,4; 0,7
DNA-Menge pro Beschuss [µg] 0,8
Heliumdruck [bar] 62, 93, 107, 138, 152
Beschussdistanz [cm] 3, 6, 9, 12
Kammer-Vakuum [bar] 0,153
ERGEBNISSE 37
pRV103 (3)6467 bp
pPM A1
GU
S
tP
MA
1
[C]
Abbildung 3.1: GUS Trans-formation in vitro. A: Nach 18 h Keimung der Sporen mit anschließender Färbung für 3 Tage in GUS-Lösung; B: 2 Tage lange Färbung der Sporen in frisch angesetzter GUS-Färbelösung; C: Verwendetes Plasmid. Weißer Balken = 25 µm. Quelle: Lenz 2005.
[A]
[B]
3.4.1 Farbmarker Selektion
Nach dem Beschuss mit den Plasmidkonstrukten, die GUS-Farbmarker trugen (pRV103)
erfolgte eine GUS-Färbung (Schillberg et al., 2000), und für mit iGFP-Konstrukten
beschossenen Uredosporen eine Inkubation der Objektträger für 2 Stunden bei 37 °C vor der
Mikroskopie.
3.4.1.1 GUS-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae
Die Verwendung des ß-Glucuronidase-Nachweises bei erfolgreicher Transformation erwies
sich für das System als mühsam und mit hohem Verlust verbunden. Nach den Vorversuchen
zur Etablierung der optimalen biolistischen Parameter konnten wiederholt erfolgreiche U.
fabae Transformanten selektiert werden, die mit dem Plasmid pRV103 beschossen worden
waren (Lenz 2005). Die GUS-tragenden Transformanten (Abb. 3.1) wurden in vitro
erfolgreich vereinzelt gescreent.
ERGEBNISSE 38
pRV117 (3)5429 bp
tPM
A1
intr
on
GF
P
pPMA1
[A]
[B]
[C]
Die mit der Prozedur der GUS-Färbung verbundenen Verluste an lebendem Sporenmaterial
waren für die Überprüfung der Transformationseffizienz nicht akzeptabel, weshalb diese
Methode als ineffizient betrachtet wurde und auf weniger aufwendige Fluoreszenzfarb-
marker wie GFP und DsRed umgestellt wurde.
3.4.1.2 GFP-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae
Der Fluoreszenzfarbmarker iGFP in dem Plasmidkonstrukt pRV117 konnte erfolgreich in
keimenden Uredosporen identifiziert werden. Nach Inkubation der Objektträger mit den
gekeimten Uredosporen bei 37 °C für 2 h zeigen die mikroskopischen Aufnahmen (Abb. 3.2)
eine deutliche grüne Färbung der Uredosporen in vitro.
Abb. 3.2: iGFP Transforman-ten in vitro. Mikroskopische Aufnahmen von gekeimten Uredosporen nach einem Be-schuss mit pRV117 und 40x Vergrößerung. (A,B). Ver-wendetes Plasmid (C). Messbalken = 20 µm.
[C]
Abbildung 3.2: iGFP Trans-formanten in vitro. Mikro-skopische Aufnahmen von gekeimten Uredosporen nach einem Beschuss mit pRV117 und 40x Vergrößerung. (A,B). C: Verwendetes Plasmid. Weißer Balken = 20 µm.
ERGEBNISSE 39
Auf einigen gescreenten Objektträgern konnte eine starke Autofluoreszenz der Sporen
festgestellt werden so dass eine sichere Selektion der iGFP-Transformanten nicht in allen
Situationen gewährleistet war. Diese Objektträger wurden für die Bestimmung der
Transformationseffizienz nicht in Betracht gezogen. Eindeutig identifizierbare
Transformationsereignisse wurden auf allen Objektträger ausgezählt (Tab. 3.3)
Tabelle 3.3: Anzahl iGFP Transformanten von U. fabae in vitro. 4,4 x 105 Sporen pro Objektträger wurden gescreent.
Transformations-Ansatz
Anzahl iGFP-Transformanten
Transformationseffizienz
1
2
3
4
5
6 ± 4
13 ± 7
11 ± 5
8 ± 4
9 ± 6
1,4 x 10-5
2,9 x 10-5
2,5 x 10-5
1,8 x 10-5
2,0 x 10-5
3.4.1.3 DsRed-Farbmarker für die biolistische Transformation von U. fabae
Als weiterer Fluoreszenzfarbmarker für die Selektion von U. fabae-Transformanten wurde
DsRed gewählt. Auch wenn die Transformationseffizienz mit der iGFP Transformation
vergleichbar ist, ist ein Vorteil von DsRed, dass keine Vorbeihandlung der Objektträger für
mikroskopische Screens notwendig ist. Wie in Abbildung 3.3 dargestellt, konnte die rote
Fluoreszenz der ausgekeimten Uredosporen, die mit pRV115 beschossen worden waren,
eindeutig von nicht transformierten, farblosen WT-Keimschläuchen unterschieden werden.
Mehrere Objektträger wurden gescreent und die Mittelwerte der einzelnen
Transformationsansätze bestimmt (Tab. 3.4). Daraus ergab sich eine mittlere
Transformationseffizienz aller mit DsRed durchgeführten Ansätze von 2,9 x 10-5 (n = 30).
Tabelle 3.4: Anzahl der selektionierten DsRed-Transformanten in vitro.
Transformations-Ansatz
Anzahl DsRed-Transformanten
Transformationseffizienz
1
2
3
4
5
20 ± 6
5 ± 3
18 ± 10
9 ± 4
12 ± 5
4,5 x 10-5
1,1 x 10-5
4,1 x 10-5
2,0 x 10-5
2,7 x 10-5
ERGEBNISSE 40
[A]
[B] pRV115 (1)
5319 bp
Ds
Re
d
pPM A1
tPM
A1
Um einen endgültigen Nachweis der realen Fluoreszenz in U. fabae-Keimschläuchen zu
erbringen, wurde das Plasmidkonstrukt pRV115-NLS verwendet. Durch die Fusion eines NLS-
Signals an die DsRed Sequenz und die anschließende biolistische Transformation konnte
gezeigt werden, dass die rote Fluoreszenz eindeutig in den Zellkernen lokalisierbar ist (Abb.
3.4).
Die Transformationseffizienz war im Durchschnitt vergleichbar mit den pRV115
Transformanten. Eine ausführliche Auszählung wurde jedoch nicht durchgeführt. Die längere
Exposition der Objektträger, die für Screens mit Fluoreszenzmikroskop und DsRed Filter
notwendig war, führte zum Platzen mehrerer rotleuchtender Zellkerne, was die genaue
Auszählung oder Berechnung der Transformationseffizienz verhinderte. Auch hier konnte
vereinzelt eine schwache Autofluoreszenz der Sporen festgestellt werden, was jedoch die
Screens für die pRV115-NLS Transformanten in keiner Weise beeinflusste.
Abbildung 3.3: DsRed Transfor-manten in vitro. (A,B): Gekeimte Uredosporen auf Objektträger be-schossen mit Plasmid pRV115 (C). Weißer Balken = 20 µm. Quelle: Lenz 2005.
[C]
ERGEBNISSE 41
pRV115-NLS (1)5361 bp
pPMA1
tPM
A1
NLS
Ds
Re
d
3.4.1.4 Fungizidmarker für die biolistische Transformation von U. fabae
Für die Überprüfung der Keimungshemmung von U. fabae wurden hydrierte Uredosporen
auf Objektträger aufgesprüht und für 3 h inkubiert. Anschließend wurden die Fungizide
Carboxin oder Benomyl appliziert und die Ansätze weiter üN inkubiert. Anschließende
mikroskopische Screens zeigten in beiden Fällen eine dosisabhängige Hemmung des
Wachstums der behandelten Sporen (Abb. 3.5), die steigende Wachstumshemmung
korrelierte mit der Erhöhung der Fungizidkonzentration. Phänotypisch konnten bereits
wenige Stunden nach der Applikation von 50 µg/ml Carboxin granulierte Strukturen bzw. ein
Absterben der Keimschläuche beobachtet werden. Bei niedrigerer Fungiziddosis konnten
noch vitale Keimschläuche gescreent werden. Die Benomylapplikation erfolgte in einer
Konzentrationsreihe zwischen 0,1 und 10 mg/ml.
[A]
[B]
Abbildung 3.4: DsRed-NLS Transformanten von U. fabae. (A,B): Kernlokalisierung mittels des NLS-Signals im DsRed-Plasmid (C). Weißer Balken = 20 µm.
[C]
ERGEBNISSE 42
gF
A
gF
A B
C D
E F
S
Erst bei einer Konzentration von 5 mg/ml konnte anhand der Granulierung der
Keimschläuche und der Stagnation des Wachstums eine etwa 10 %ige Hemmung der
Keimung beobachtet werden. Bei den restlichen 90 % der gekeimten Sporen dieser Variante
wurden unverändert Appressorien gebildet (Abb. 3.5, E). Die vollständige Unterdrückung der
Abbildung 3.5: Keimung von Uredosporen auf angerauter PE-Folie. Applikation von Carboxin und Benomyl auf gekeimte Uredosporen. A, B: Erfolgreiche Hemmung der Sporenkeimung nach dem Aufsprühen von 50 µg/ml Carboxin auf angerauter PE-Folie. C, D: mit Wasser behandelte Kontrolle. Behandlungen mit Benomyl E: 5 mg/ml und F: 10 mg/ml. S: Spore mit Keimschlauch; gF: angeraute Folie; A: Appressorium bildet sich auf der Erhebung von gF. Mikroskopische Aufnahmen mit Lichtmikroskop, Vergrößerung 40x.
ERGEBNISSE 43
Keimung mittels Benomyl konnte bei einer Konzentration von 10 mg/ml erzielt werden (Abb.
3.5, F).
3.4.1.5 Kombination der Farb- und Fungizidmarker bei Biolistischer Transformation von U.
fabae
Für eine spätere Selektion von U. fabae-Transformanten auf V. faba Pflanzen wurden
Plasmide konstruiert, die eine Kombination von Farb- (DsRed) und Fungizidmarker
(SucDH1(H254Y), TBB1) trugen. Die mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed beschossenen
Uredosporen wurden auf Objektträgern auf positive Transformanten gescreent (Tab. 3.5.).
Die Transformationseffizienz war im Vergleich zum Einfachkonstrukt pRV115 (DsRed), mit
durchschnittlich 4,5 x 10-6 (zwei transformierten Sporen pro Objektträger bzw. 4,4 x 105
Sporen) niedriger. Unter den identifizierten rotleuchtenden Transformanten konnten vitale
Keimschläuche und die Bildung von Appressorien beobachtet werden (Abb. 3.6, A und B). Bei
einer Anwendung von 50 µg/ml Carboxin spiegelte sich das erwartete Bild aus den
Kontrolluntersuchungen mit Wildtypsporen auf aufgerauter PE-Folie wieder. Zusätzlich
konnten DsRed tragende Keimschläuche identifiziert werden, die bei einer Applikation des
Fungizids ihr Wachstum einstellten (Abb. 3.6 C und D). Nach der Ausbildung relativ kurzer
Keimschläuche waren die granulierten rotleuchtenden Infektionsstrukturen deutlich
erkennbar. Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass es in den mit pRV111::DsRed
transformierten Uredosporen nur zur einer Expression der Farbmarker kam. Da die
Prozessierung der beschossenen DNA-Konstrukte in diesem Stadium nicht überprüft werden
konnte und die Uredosporen eindeutig DsRed enthielten, wurden diese Transformanten
nicht in die Auszählungen für die Transformationseffizienz einbezogen.
Tabelle 3.5: Anzahl von pRV111::DsRed-Transformanten in vitro. Auflistung der Transformations-effizienz auf den ausgewerteten Objektträgern.
Transformations-Ansatz
Anzahl DsRed-Transformanten
Transformationseffizienz
1
2
3
4
5
1
3
1
2
3
2,3 x 10-6
6,8 x 10-6
2,3 x 10-6
4,5 x 10-6
6,8 x 10-6
ERGEBNISSE 44
pRV111::DsRed8285 bp
Su
cD
H
pPM
A1
tPMA
1
DsRed
pP
MA
1
tPMA1
Abbildung 3.6: Transformation mit Doppelkonstrukt pRV111::DsRed. Rot leuchtende Keimschläuche der Transformanten (A, B): mit ausgebildeten Appressorien an der Erhebung der aufgerauten PE-Folie in vitro nach Applikation von Carboxin. (C, D): Mit Fungizid behandelte Transformanten mit rotleuchtenden granulierten Keimschläuchen. E: Verwendetes Plasmid .Weißer Balken = 20 µm. E: Verwendetes Plasmid.
A B
C D
3.5 Etablierung der Selektion in planta
Die erfolgreiche Transformation von U. fabae in vitro, die bei allen verwendeten Farbmarker
bestätigt wurde, kann aufgrund der obligat biotrophen Lebensweise des Rostpilzes nur als
transient bezeichnet werden. Weil die Reproduktion und Vermehrung der Uredosporen nur
auf der Wirtspflanze V. faba stattfinden kann, wurde ein im folgenden beschriebenes
Schema zur Selektion der transformierten Rostpusteln entwickelt und für alle nachfolgenden
Versuche auf V. faba Pflanzen angewandt.
[E]
ERGEBNISSE 45
3.5.1 Fungizidmarker
Für Etablierung einer Methode zur stabilen Transformation von U. fabae wurden in planta
die Experimente unter Verwendung von Plasmidkonstrukten, welche Marker für die
Fungizide Carboxin (pRV111 und pRV113) und Benomyl (pSW3386) enthalten, durchgeführt.
Abbildung 3.7 zeigt die bei der Plasmidkonstruktion eingeführten Punktmutationen.
Abbildung 3.7: In genomische U. fabae DNA eingeführte Punktmutationen. A: An der Stelle H254Y und H254L mutierte Uf-SucDH1 (Plasmid pRV111 bzw. pRV113) vermittelt die Resistenz gegen das
Fungizid Carboxin. B: Durch Punktmutation in U. fabae -Tubulin (Uf-TBB1) an der Position E198A und Einführung der Sequenz in Plasmid pSW3386 (Wirsel et al. 2004) wurde die Voraussetzung für eine Benomyl-Resistenz gewährleistet.
3.5.1.1 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin
Für die vollständige Unterdrückung der Keimung und des Wachstums von U. fabae-
Wildtypsporen war eine bestimmte Konzentration der Fungizide Carboxin (50 µg/ml) und
Benomyl (10 mg/ml) notwendig um in vitro erzeugten Infektionsstrukturen gänzlich zu
hemmen (3.4.1.4). Es wurde daher für beide Fungizide die Konzentrationsabhängige Wirkung
auf Uredosporen getestet, die in Pflanzen aufgesprüht und zur Keimung gebracht wurden
(Abb. 3.8).
Uf-SucDH1 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTCA CACAATTTTC ~~~~~~ pRV111 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTTA CACAATTTTC ~~~~~~ pRV113 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTCT CACAATTTTC ~~~~~~
*
[A]
[B]
Uf-TBB1 ~~~~~~~ TTATCGATAC AAAAAGTTTC ATCCGAGTTT TCAACCAATT ~~~~~~ pSW3386 ~~~~~~~ TTATCGATAC AAAAAGTAGC ATCCGAGTTT TCAACCAATT ~~~~~~
RTV oder Wirsel fragen nach genauer Mut-PCR wo die mut. ist (E198A)
*
ERGEBNISSE 46
Abbildung 3.8: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin in planta. A: Darstellung der ausgezählten Uredosporenlager pro Pflanzenblatt in Abhängigkeit der Carboxinkonzentration. B: H2O-Kontrolle; (C): 50 µg/ml Carboxin.
Eine sichere Unterdrückung der von Wildtypsporen ausgehenden Infektion von V. faba
Blättern wurde wiederholt bei 50 µg/ml Carboxin beobachtet. Folglich wurde diese
Fungizidkonzentration für alle weiteren Versuche verwendet.
3.5.1.2 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps mit Benomyl
Durch den Entzug der Zulassung von Benomyl für Deutschland, erwies sich die Beschaffung
diesen systemischen Fungizids für Versuchszwecke als schwierig. Schließlich stellte die Fa.
Helm AG aus Hamburg, eine kleinere Charge von 250 mg kostenfrei zur Verfügung.
Wie in Abschnitt 3.6.1 dargestellt wird, erwies sich die Löslichkeit von Benomyl in allen
verwendeten Konzentrationen als schwierig. Beim Aufsprühen der Fungizid-Suspension
bildete sich auf den Blättern ein weißlicher Belag, welcher zusätzlich zur chemischen
Unterdrückung des Uredosporenwachstums, eine künstliche Barriere auf der Blattoberfläche
darstellt, welche die Keimung und Wachstum des Pilzes zusätzlich beeinträchtigen könnte.
Bereits bei niedrigen Konzentrationen (Abb. 3.9) war eine starke Reduzierung der Anzahl von
Uredia pro Bohnenblatt festzustellen. Mit im Durchschnitt 102 verbliebenen
Uredosporenlagern pro Blatt ist eine Diskriminierung von Wildtyp und Transformanten
jedoch nicht akzeptabel. Bei Verwendung von 10 mg/ml des Fungizids konnte der Wildtyp
vollständig unterdrückt werden (Abb. 3.9).
[A] [B]
[C]
[C]
0 5 10 25 500
1000
2000
3000
2033
1110
1310 0
Carboxin [µg/ml]
Ure
dia
pro
Bla
tt
ERGEBNISSE 47
0 1 2,5 5 7,5 100
1000
2000
3000
4000
102
2867
45 22 1 0
Benomyl [mg/ml]
Ure
dia
pro
Bla
tt
1 2,5 5 7,5 100
50
100
150
Benomyl [mg/ml]
Ure
dia
pro
Bla
tt
[A]
[B]
Abbildung 3.9: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps in planta durch das Fungizid Benomyl. A: Vergleich mit unbehandelten Kontrollblättern: B: Vergrößerter Ausschnitt der Benomylvarianten.
3.5.1.3 Selektionsschema in planta
Für alle Versuche mit Transformationslinien wurde ein Selektionsschema in planta etabliert,
das eine Selektion zwischen Wildtyp und potentiell transformierten Sporen mit dem
entsprechenden Fungizid ermöglicht (Abb. 3.10). Basierend auf den Erkenntnissen der
Vorversuche, wurde im ersten Vermehrungsschritt kein Fungizid appliziert, um ein
Zeitfenster für die Expression der Transgene zu schaffen. Somit wurde im ersten Schritt auf
der ersten Pflanze, eine Mischung aus Wildtyp- und potentiell transformierten Sporen
vermehrt, geerntet und anschließend für die erste Selektion auf eine zweite Pflanze
ERGEBNISSE 48
Pflanze 1 Pflanze 2 Pflanze 3
Keine Selektion 1. Fungizid-Selektion 2. Fungizid-Selektion
Abb. 3.10: Selektionsschema für Transformanten von U. fabae in planta. Aufsprühen der Transformationsansätze auf ganze Bohnenpflanzen (Pflanze 1) und der hydrierten Uredosporen nach der Ernte von Pflanze 1 auf einzelne, mit Carboxin vorbehandelten Blätter (Pflanze 2). Nach der 1. Fungizid-Selektion Picken von Einzel-Linien und Übertragung auf Pflanze 3. für die nächste Selektionsrunde. Der letzte Schritt wurde für alle folgenden Pflanzen wiederholt.
ausgebracht (erste Selektion, S1, Abb. 3.10). Dies brachte deutliche Fortschritte hinsichtlich
der Anzahl der gebildeten Uredosporenlager in der S1-Generation.
3.6 U. fabae Transformanten-Linien, Selektion und molekulare Analyse
Bei den biolistischen Transformationen wurden folgende Plasmidkonstrukte verwendet und
für eine Selektion auf potentielle Transformanten in planta überprüft. Die
Einfachkonstrukte: pSW3386 (TBB1-E128A), pRV111 (SucDH1-H254Y) und pRV113 (SucDH1-
ERGEBNISSE 49
H254L) sowie das Doppelkonstrukt pRV111::DsRed. Im Folgenden werden Ergebnisse mit
den einzelnen Plasmidkonstrukten dargestellt.
3.6.1 Selektion mit Benomyl
Eine Selektion mit dem Fungizid Benomyl erwies sich als schwierig und brachte kein
eindeutiges Ergebnis. In der ersten Selektionsrunde wurde nur ein geringes
Sporenwachstum festgestellt. Mehrere Wiederholungen des Experiments erbrachten
dasselbe Ergebnis (Tab. 3.6), weshalb die Selektion durch das Fungizid Benomyl als nicht
geeignet für das System betrachtet wurde. Neben der schweren Löslichkeit und
Verteilbarkeit auf den Bohnenblättern, stellte der weise Fungizidbelag (Abb. 3.11) vermutlich
eine zusätzliche Barriere für das Auskeimen potentiell transformierter Sporen dar. Im
Vergleich zu später selektionierten, transformierten Uredosporen, die gegen Carboxin
resistent waren, waren die mit Benomyl selektionierten Rostpusteln kleiner und in deutlich
geringerer Anzahl vorhanden (Tab. 3.6).
Tabelle 3.6.: Selektion von U. fabae Transformanten durch Benomyl in planta. Biolistische Transformation mit dem Plasmid pRV103 und Selektion in Runde 1 (S1) und 2 (S2).
Keine der Transformantenlinien aus der S1 konnte in der nachfolgenden Selektionsrunde
(S2) auf Benomylbehandelten Blätter propagiert werden.
Transformations-Ansatz
Ausbringung Anzahl Uredosporenlager
in S1 Anzahl
Uredosporenlager in S2
I 1 2
1 0
0 0
II 1 2 3
0 0 2
0 0 0
III 1 2
1 0
0 0
ERGEBNISSE 50
[A]
[B]
[C]
pSW33867930 bp
Tubulin-ch
5'-tub
ulin
reg
ion3'-tu
bu
lin region
Abbildung 3.11: Aufbringen von Benomyl auf Bohnenblätter. A: Die für die Selektion vor-behandelten Pflanzenblätter zeigen einen weißen Belag aus Fungizidrückständen. B: Durchlichtauf-nahme mit sichtbaren Uredosporenlager. C: Verwendetes Plasmid.
3.6.2 Selektion mit Carboxin
3.6.2.1 Biolistische Transformation mit den Plasmidkonstrukten pRV111 und pRV113
Die beiden Konstrukte pRV113 und pRV113 wurden für den biolistischen Beschuss von
Uredosporen verwendet und die Transformanten nach dem oben beschriebenen
Selektionsschema (Abb. 3.10) in V. faba Pflanzen vermehrt. Eine Verbesserung im Vergleich
zu Benomyl war bereits bei der Handhabung des Fungizids Carboxin gegeben. Die Löslichkeit
des Fungizids war besser, Rückstände auf den Blättern traten hier nicht auf. Tabelle 3.7 zeigt
durchschnittliche Anzahl der Uredia pro Blatt nach Ausbringen verschiedener
Transformationsansätze. Eine ausführliche Auflistung der selektionierten Uredosporenlager
der S1 befindet sich im Anhang (Tab. 8.1).
ERGEBNISSE 51
Tabelle 3.7: Selektion von U. fabae Transformanten durch Carboxin in planta. Biolistische Transformation mit den Plasmiden pRV111 und pRV113. Ausbringung und Selektion in den Runden 1 (S1), 2 (S2) und 3 (S3). a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.
Transformations-Ansatz
Ausbringung Anzahl Urediaa)
Transformations-effizienz S1 S2 S3
A. (pRV111) I II
8 4
2 1
0 0
1,4 x 10-5
B. (pRV111) I II
13 9
3 3
0 0
2,5 x 10-5
C. (pRV111) I II
15 7
4 1
0 0
2,5 x 10-5
A. (pRV113) I II
2 2
0 0
-- --
4,5 x 10-6
B. (pRV113) I II
5 8
0 0
-- --
1,5 x 10-5
Die Transformationseffizienz aus allen Auszählungen der S1 nach Behandlung mit Carboxin
beträgt für pRV111 2,1 x 10-5 bei einer durchschnittlicher Anzahl Uredia von 9 ± 7 (n = 36)
bzw. 9,7 x 10-6 für pRV113 mit 4 ± 5 (n = 24) Uredia im Mittelwert. Auch wenn die Anzahl der
selektionierten U. fabae Transformanten mit modifizierter SucDH1 ein besseres Ergebnis
erbrachte als mit TBB1, konnte keine der Linien nach der dritten Selektion auf Pflanzen
propagiert werden.
Die Menge der Uredosporen, die mit pRV111 und pRV113 transformiert und nach der
Selektion mit Carboxin vermehrt werden konnten (Tab. 3.7) war sehr gering, so dass auch
nur geringe DNA-Mengen extrahiert werden konnten. Für den Nachweis der Transgene
mittels PCR-Reaktion war die DNA-Menge unzureichend, weshalb das REPLI-g Kit (QIAGEN
GmbH, Hilden) zur Amplifikation der vorhandenen genomischen DNA verwendet wurde. Für
den Nachweis der Transformation wurden Primer gewählt, die nur bei einer Kombination
der Sequenzen von SucDH1-tPMA1 ein Amplifikationsprodukt ergab. Beim Wildtyp ist diese
Kombination im Genom nicht vorhanden, weshalb hier auch keine Amplifikation stattfinden
kann. Bei zwei der untersuchten Transformanten-Linien (T1, T2, Abb. 3.12 B) konnte gezeigt
werden, dass im Vergleich zum Wildtyp ein DNA-Fragment in Größe von 758 bp amplifiziert
wurde.
ERGEBNISSE 52
bp
1000 800
500
Pflanze 2 (S1)
M T1 T2 W1 W2 K
pSucDH1 SucDH1(H254Y) tSucDH1
pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1 T
W
[A] [B]
[C]
T1
T2
Abbildung 3.12: Selektion und molekularer Nachweis der biolistischen Transformation. A: Nach der biolistischen Transformation wurden die ausgebrachten Sporen bestehend aus WT und potentiellen Transformanten geerntet und für die erste Selektion (S1) auf eine zweite Pflanze ausgebracht. B: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises, schwarzer Balken zeigt das zu erwartende PCR-
Amplifikationsprodukt. C: Agarosegel mit PCR-Proben. Transformanten-Linien T1 und T2, Wildtyp
W1 und W2 und Wasserkontrolle K.
3.6.2.2 Biolistische Transformation mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed
Die Selektion des Dopplekonstrukts, dass das SucDH1(H254Y)- und DsRed-Gen trägt, erfolgte
in planta mit dem Fungizid Carboxin. Die selektionierten Uredosporen wurden auf
Objektträgern zur Keimung gebracht und mikroskopisch auf ein Vorhandensein der roten
Fluoreszenz gescreent. In keiner der gescreenten Varianten konnte eine Fluoreszenz
detektiert werden. In Tabelle 3.8 sind die ermittelten Mittelwerte aus der Auszählung der
Uredosporenlager auf einzelnen Blättern in S1 (Anhang, Tab. 8.2) dargestellt. Uredosporen,
die mit dem Doppelkonstrukt pRV111::DsRed beschossen worden waren, zeigten in der
ersten Selektion (S1) eine durchschnittliche Anzahl von 14 ± 6 Uredia (n = 16), was eine
Transformationseffizienz von 3,2 x 10-5 ergab. Einzelne selektionierte Linien konnten in der
S2 propagiert werden, keine jedoch konnte nach weiterem Ausbringen mit Carboxin in der
S3 vermehrt werden.
ERGEBNISSE 53
P1 + P2 P3 + P4
kb
1000 750
500
M1 ‒1 ‒2 WT S2 S2 + S1 S1 S1 S1 S1 M2
T
W
701 bp
pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1
P1 P3
P4 P2
pSucDH1 SucDH1(H254Y) tSucDH1
P4 P2
[A]
[B]
Tabelle 3.8: Transformanten-Linien mit pRV111::DsRed in planta. a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.
Transformations-Ansatz
Ausbringung Anzahl Urediaa)
Transformations-effizienz S1 S2 S3
pRV111::DsRed I II
15 13
2 2
0 0
3,2 x 10-5
Die Überprüfung auf das Vorhandensein des tPMA1-SucDH1-Konstrukts im U. fabae Genom
wurde in allen Linien der zweiten Selektion (S2) wie in der dazugehörigen Vorselektion (S1)
durchgeführt. In allen getesteten Ansätzen konnte das Amplifikationsprodukt nachgewiesen
werden (Abb. 3.13). Zwei von vier Linien aus der S1, die nicht weiter in der S2 propagiert
werden konnten, zeigen ebenfalls das Vorhandensein des tPMA1-SucDH1-Konstukts. Alle
Versuche, mit dem gleichen PCR-Verfahren das Vorhandensein von DsRed in Uredosporen
die mit pRV111::DsRed transformiert wurden waren nachzuweisen, waren ohne Erfolg. Auch
nach Aufsprühen von selektionierten Sporenlinien auf Objektträger konnte kein Fluoreszenz-
Signal detektiert werden. Demnach war anzunehmen, dass keine Integration von DsRed aus
dem Konstrukt pRV111::DsRed nicht erfolgt war. Keine der Linien konnte in der S3
propagiert werden.
Abbildung 3.13: PCR Nachweis von selektionierten Sporenlinien nach Transformation mit pRV111::DsRed. A: Amplifikation von Transformantenlinien mit P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1) Primer in der zweiten Reaktion der Nested PCR. Plasmid-Kontrolle (+), Wildtyp U.f. (WT), Wasserkontrolle aus Reaktionen 1. und 2 (‒1 und ‒2), 100 bp (M1) und 1 kb Marker (M2). B: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises.
ERGEBNISSE 54
3.6.2.3 Biolistische Transformation mit Kassette aus pRV111 und pRV113
Während in den in vitro Versuchen die Plasmidkonstrukte entweder zirkulär oder linearisiert
für den biolistischen Beschuss verwendeten wurden, wurde bei in planta Versuchen nur die
linearisierte Form der Plasmide verwendet. Auch wenn keine signifikanten Unterschiede in
der Transformationseffizienz festzustellen waren, war eine leichte Tendenz zu einer höheren
Anzahl transformierter Uredosporen bei vorrangegangener Linearisierung der DNA gegeben.
Der Einfluss des Plasmid-Backbone auf die Transformationseffizienz wurde durch folgenden
Ansatz überprüft. Aus den Plasmidkonstrukten wurde die Genkassette tPMA1-
SucDH1(H254Y)-pPMA1 bzw. tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 ausgeschnitten und für einen
biolistischen Beschuss verwendet, um festzustellen, ob es zu einem leichteren Einbau in das
Genom kommt, da potentiell störende flankierende Sequenzen fehlen (Abb. 3.14). Im ersten
Selektionsschritt wuchsen auf allen inokulierten V. faba Blättern vereinzelte
Uredosporenlager, die potentiell SucDH1(H254Y) bzw. SucDH1(H254L) trugen und dadurch
Carboxinresistent waren. Aus jedem Transformationsansatz mit pRV111 und pRV113 wurden
mehrere Linien aus der S1 (Tab. 3.10) für die weitere Vermehrung unter Carboxin-
Selektionsdruck ausgewählt. Die Anzahl der Linien mit der dazugehörigen Auszählungen der
Uredosporenlager ist in Tabelle 8.4. (Anhang) dargestellt.
Abbildung 3.14: Plasmidkassette tPMA1-mut-SucDH1-pPMA1.
Bereits in der ersten Selektion (S1) zeigte sich eine deutlich höhere Zahl von
Uredosporenlagern bei den Plasmidkassetten pRV111 bzw. pRV113 (Tab. 3.9) im Vergleich
zur Verwendung ganzer Plasmide (durchschnittlich ca. 12 (n = 16) bzw. 10 Uredia pro Blatt (n
= 20)).
ERGEBNISSE 55
Tabelle 3.9: Erste Selektion in planta nach Beschuss mit der Kassette aus pRV111 und pRV113. a: Zahl der selektierten Linien b: Mittelwert aus der Zahl der Uredosporenlager pro Blatt; c: Anzahl der behandelten Blätter und d: Transformationseffizienz.
Transformations-Ansatz a b c d
tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 188 12 16 7,1 x 10-5
tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 195 10 20 5,3 x 10-5
Jeweils ausgesuchte Linien aus der S1 wurden auf weiteren Pflanzen für eine zweite
Selektionsrunde unter Selektionsdruck mit Carboxin ausgebracht. Dieser Schritt wurde an
zwei zeitlich unabhängigen Terminen wiederholt (I und II, Tab. 3.9). Bei der Transformation
mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 wurden von insgesamt 17 (I) bzw. 13 (II) ausgebrachten
S1-Linien 7 bzw. 9 Linien in der nächsten Selektion (S3) propagiert. Vergleichbare Werte für
die Propagation in der S3 wurden mit den tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1-Linien erzielt (Tab.
3.10). Die durchschnittliche Zahl der Uredosporenlager variierte für beide Konstrukte
zwischen 1 und 29. Eine ausführliche Tabelle mit allen ausgezählten Uredia aus allen
Selektionsrunden ist dem Anhang (8.4) zu entnehmen.
Tabelle 3.10: Zweite Selektion nach biolistischer Transformation. (A): Zahl der ausgebrachten Linien von der S1 auf die S2. (B): Davon selektionierte Linien. C: Mittelwert der Zahl der Uredosporenlager pro Blatt.
Transformations-Ansatz Ausbringung A B C
tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 I 17 7 4,3
II 13 9 8,6
tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 I 17 6 2,5
II 12 5 3,4
Alle weiteren Selektionsrunden sind in Tabelle 3.11 zusammengefasst. Es konnten insgesamt
bis zu 10 Selektionsrunden (10 Generationen) mit einzelnen Transformantenlinien von U.
fabae erzielt werden.
ERGEBNISSE 56
[A]
[B]
M T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 WT + –1 –2 M bp
1000 700 500
bp
1000
700
500
Tabelle 3.11: Selektionierte Transformantenlinien nach Biolistik in planta. Selektionsrunden 3 bis 10 (Sx) und dazugehörige Anzahl ausgebrachter Linien (a) sowie Anzahl der selektierten/weiter propagierten Linien (b).
Transformations-Ansatz S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
a b a b a b a b a b a b a b a b
tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 9 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 0
tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1
Die Beständigkeit der einzelnen Transformationslinien bei Verwendung von Plasmid-
kassetten zeigte sich in einer hohen Anzahl von Selektionsrunden im Vergleich zu einer
geringeren Selektionsrundenzahl bei Beschuss mit ganzen Plasmiden in zirkulärer oder
linearisierter Form. Diese Beständigkeit bis zur 10. Selektionsrunde deutete auf eine stabile
Integration des mutierten SucDH1 in das U. fabae Genom. Um dies zu überprüfen, wurde die
aus U. fabae Transformanten isolierte DNA mittels Nested-PCR analysiert. Die
Standardüberprüfung wurde mit dem Konstrukt-spezifischen Nachweis durchgeführt (s. Abb.
3.13 (B), 3.6.2.2). Alle überprüften Linien zeigten ein spezifisches Amplifikationsprodukt für
die Kombination pPMA1-SucDH1, welche beim WT nicht vorkommt (Abb. 3.15).
Abbildung 3.15: PCR Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien in der S1. A: pRV111 und B: pRV113 Transformanten von U. fabae, selektioniert in S1 in planta. Reaktion II der Nested PCR mit dem Primerpaar P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1), 701 bp (Vgl. Abb. 3.13 B).
ERGEBNISSE 57
Die Analyse der einzelnen Linien aus weiteren Selektionsrunden zeigt ebenfalls das
spezifische Amplifikationsprodukt für die pPMA1-SucDH1 Kombination (s. Abb. 3.16)
Abbildung 3.16: PCR-Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien von S2 bis S9. Zweite Reaktion der Nested-PCR mit dem Primerpaar P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1). A: pRV111- und pRV113-Transformationslinien aus den Selektionsrunden 2, 3 und 4 die in der S5 nicht weitergewachsen sind. B: Transformationslinie die über 9 (pRV111) bzw. 8 (pRV113) Selektionsrunden in planta propagiert wurde.
Bei dem oben beschriebenen Nested-PCR-Nachweis zeigte die analysierte Transformanten-
DNA ein spezifisches Signal (701 bp). Es kann jedoch nicht mit Sicherheit davon ausgegangen
werden, dass die nachgewiesenen Sequenzen tatsächlich in das U. fabae Genom integriert
wurden. Aufgrund der geringen Sporenmenge und der daraus resultierend ungenügenden
Menge an DNA für einen Southern Blot-Nachweis (s.a. 3.8 und Anhang 8.5.1) war die
Notwendigkeit für weitere PCR-Analysen gegeben. Dabei wurden zwei unterschiedliche
Möglichkeiten zum Einbau von Transgenen in das U. fabae Genom über homologe
Sequenzen analysiert (Abb. 3.17). Zum einen kann der Einbau der mut-SucDH1 aus beiden
verwendeten Konstruktkassetten durch homologe Rekombination in die WT-SucDH1
erfolgen (Abb. 3.17, 1). Im zweiten Fall kann der Einbau durch die Rekombination homologer
Sequenzen der regulatorischen Elemente tPMA1 und pPMA1 in der Uf-PMA1-Region (Abb.
3.17, 2) erfolgen.
[A]
[B]
bp
1000
700 500
M1 S2 S3 S4 WT1 S2 S3 S4 WT2 + ‒1 ‒2 M2
pRV111 pRV113
bp
1000
700 500
M1 S2 S4 S6 S8 S9 WT1 S2 S4 S6 S8 WT2 + ‒1 ‒2 M2
pRV111 pRV113
ERGEBNISSE 58
Abbildung 3.17: Möglichkeiten der Integration von Transgenen in das U. fabae Genom. Unterschiedliche Vorbereitung der Plasmid-DNA vor dem biolistischen Beschuss. A: Linearisierung durch Restriktionsenzyme; B: Zirkulär, unbehandelt; C: Ausschneiden und Beschuss mit der Kassette tPMA1-SucDH1(254Y)-pPMA1. Farbcode: Gelb (Vektor pKS II); Weiß (regulatorische Elemente); Braun (SucDH1(H254Y)); Orange (WT-SucDH1); Grau (Uf-PMA1).
Die Analyse der Uf-PMA1 Region erfolgte in Wildtyp- und Transformanten-DNA mit den
Primer Uf-PMA1_Fwd2- und Uf-PMA1_Rew2. Nach Einbau der mut-SucDH1 in die WT-PMA1
über regulatorische Elemente (tPMA1, pPMA1) sollte mit diesen Primerpaar ein Fragment
von ca. 3,3 kb entstehen. Im Vergleich dazu sollte sich für die WT-PMA1-Region ein
Fragment mit ca. 5,5 kb ergeben. Dieser Größenunterschied konnte in keiner der
analysierten Transformantenlinien gefunden werden, weshalb ein Einbau über homologe
Sequenzen der Uf-SucDH1 vermutet werden konnte. Um diese Vermutung zu überprüfen,
wurde eine Analyse mittels SNP-PCR (Single nucleotide polymorphism, Yang et al, 2006)
durchgeführt. Dabei sollte das Vorhandensein der Punktmutation H254Y im Wildtyp
nachgewiesen werden (Abb. 3.18). Eine spezifische Unterscheidung der
Amplifikationsprodukte aus der Reaktion mit den Primern P1 + P2 kann in der zweiten
[A]
[B]
[C]
[1]
[2]
ERGEBNISSE 59
Reaktion der Nested PCR durch die unterschiedlichen Schmelztemperaturen (Tm) der
spezifischen Primer P4 und P5 erreicht werden.
Abbildung 3.18: Nachweis des Einbaus in das Genom von U. fabae mittels SNP-PCR (Single nucleotid polymorphism-PCR). (Verändert nach Yang et al. 2006). Primer: SucDH1 nested for (P1); SucDH1 SNPrev1 (P2); SucDH1 SNPrev2 (P3); SNP Primer Suc (P4); SNP Suc WT (P5). Temperatur Tm 65,9 oder 66,5 °C.
Drei Linien aus der Transformation mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 aus den Selektionen
S9 (T1, T2, Abb. 3.19) und S4 (T3) wurden für die SNP-PCR verwendet. Im Vergleich zum WT
konnte bei spezifischer Tm eine Punktmutation in der Uf-SuDH1(H254Y) der getesteten
Transformations-Linien nachgewiesen werden (Abb. 3.19, A). Nach der Amplifikation des
SucDH1-Abschnitts mit P1- und P2-Primern (786 bp) wurde diese als Template für die zweite
PCR-Reaktion verwendet. Die Allel-spezifischen Primer P3 und P4 amplifizieren in der
zweiten PCR-Reaktion bei einer Tm von 65,9 und 66,5 °C nur in Uf-SucDH1(H254Y) und nicht
in Uf-SucDH1 ein 506 bp großes Fragment (Abb. 3.19, A). Dagegen können die Primer P3 und
P5 bei den verwendeten Tm in beiden Varianten ein Amplifikationsprodukt ergeben (Abb.
PCR-Produkt mut-SucDH1 WT-SucDH1
P1 + P2
P3+P4 (65,9-66,5 °C)
P3 + P5 (65,9-66,5 °C)
mut-SucDH1
WT-SucDH1
G
T
C G
P1
P2
P4
P5
T A
P1
P2
P4 T
P5 G
PCR
P3
P3
ERGEBNISSE 60
bp
1000
700 500
T1 T2 T3 +1 +2 WT –1 –2 M T1 T2 T3 +1 +2 WT –1 –2
Tm 1 [°C] Tm 2 [°C]
[A]
[B] bp
1000
700 500
3.19, B). Die spezifische Tm der Primer wurde mittels Gradienten-PCR ermittelt (s. a. Anhang
Abb. 8.2).
Abbildung 3.19: Nachweis der Punktmutation in den Transformantenlinien. (T1, T2 und T3) mittels SNP-PCR mit den Primern P3 + P4 (A) und P3 + P5 (B). Kontrollen: –1 und –2 entsprechen H2O-
Kontrollen aus den Reaktionen I und II der Nested-PCR; Plasmid pRV111: +1 (50 ng) und +2 (10 ng), WT (ca. 200 ng). Es wurde jeweils die gleiche Menge an DNA (ca. 200 ng) bei Transformantenlinien verwendet. Tm 1 = 65,9 °C; Tm 2 = 66,5 °C.
Mit dem SNP-PCR-Nachweis konnte somit endgültig eine Integration der Uf-SuDH1(H254Y)
in das Genom der selektionierten U. fabae-Transformationslinien, die aus der biolistischen
Transformation mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 Kassette (Plasmid pRV111) stammen
nachgewiesen werden.
3.7 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von U. fabae
Für die Agrobakterien-vermittelte oder Agrobacterium tumefaciens-mediated
Transformation (ATMT) von U. fabae wurden die drei Agrobakterien-Stämme: AGL-1,
GV3103 und LBA1100 verwendet, mit denen bereits andere Pilze erfolgreich transformiert
wurden (Frandsen 2011). Alle drei Stämme wurden mit Plasmiden pRV112 bzw. pRV114 für
eine Selektion der U. fabae-Transformanten mit Carboxin sowie mit pRV101 für eine
ERGEBNISSE 61
Selektion mit Benomyl, transformiert. Es wurden verschiedene Parameter getestet, um
einen optimierten Transformationsansatz für U. fabae zu etablieren (Tab. 3.12). Die
Überprüfung der Transformationseffizienz wurde durch Veränderung der verschiedenen
Faktoren durchgeführt. Zunächst wurde der Einfluss der Anzahl verwendeter Bakterien im
Verhältnis zur Zahl der Uredosporen ermittelt. Hierfür wurden die für erfolgreiche
Transformationen anderer filamentösen Pilze beschriebenen Verhältnisse verwendet (1 :
100 und 1 : 200). Desweiteren wurde ein Verhältnis von 1 : 38,5 getestet. Die Versuche
erfolgten nach Einstellen der Agrobakterien-Zelldichte auf OD600 = 0,25. Der Einfluss von
Acetosyringon im Induktionsmedium wurde ebenfalls getestet. Die Unterscheidung erfolgte
in zwei Varianten: Vorkultur im Induktionsmedium mit 200 µM Acetosyringon
Induktionsmedium ohne Acetosyringon. Nach der Durchführung der Experimente wurden
die optimalen Parameter: 1 : 100 (Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen), 200 µM
Acetosyringon und 6 Stunden Induktion, für weitere Transformation verwendet.
Tabelle 3.12. Parameter für die Agrobacterium-vermittelte Transformation. Die hervorgehobenen Parameter wurden bei weiteren Versuchen verwendet.
Parameter Variation
Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen 38,5 / 100 / 200
Acetosyringon-Konzentration [µM] 0 / 200
Kultivierung von A. tumefaciens in Induktionsmedium [h] 0 / 6 / 24
Kokultivierung A. tumefaciens mit Uredosporen Konstant (unveränderbar)
3.7.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die Transformationseffizienz
Die wichtigsten Parameter für die ATMT, die für das U. fabae System eine maximale Effizienz
liefern, wurden in den Vorversuchen ermittelt. Im Folgenden wird die Ermittlung der
einzelnen Faktoren (Tab. 3.12) dargestellt.
3.7.1.1 Induktion mit Acetosyringon
Die Zugabe von 200 µM Acetosyringon zum Kulturmedium der Agrobakterien
(Induktionsmedium) aktiviert die Virulenzmaschinerie der Bakterien. Um einen Einfluss der
Kultivierungsdauer von Agrobakterien im Induktionsmedium zu überprüfen, wurde eine
ERGEBNISSE 62
Zeitreihe von 6, 12 und 24 Stunden im Induktionsmedium mit dem Stamm AGL-1pRV111
durchgeführt (Abb. 3.20). Die induzierten Agrobakterienkulturen wurden anschließend mit
Uredosporen gemischt und auf V. faba Pflanzen aufgesprüht. Die Selektion mit Carboxin
erfolgte in der S1 auf der zweiten Pflanze.
Abbildung 3.20: Einfluss der Induktionsdauer auf die Transformationseffizienz. Zahl der Uredosporenlager in der S1 auf Ackerbohnenblättern. Mit AGL-1pRV112 transformierte Uredosporen wurden mit Carboxin in der S1 selektioniert und die durchschnittliche Anzahl der auf Ackerbohnenblättern (n = 16) wachsenden Uredia dargestellt. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (glm poisson; p < 0,05).
Nach 6 Stunden zeigten die Bakterien die signifikant höchste Virulenz auf Uredosporen,
gezeigt weshalb für weitere Versuche die verwendeten Agrobacterium-Stämme für 6
Stunden induziert wurden.
Zusätzlich wurde in Vorversuchen auch der Einfluss von 200 µM Acetosyringon im
Kulturmedium auf Virulenz der Agrobakterien überprüft. (Abb. 3.21 und Anhang 8.6).
AGL-1 Stamm zeigte die Tendenz zur höchsten Effizienz mit einem durchschnittlichen
Urediazahl pro Pflanzenblatt von 3,6 x 10-5 (16 Uredia) gefolgt von GV3103 mit 2,5 x 10-5 und
1,4 x 10-5 bei LBA1100 Stamm. Als Kontrolle wurde U. fabae zusätzlich mit AGL-1
transformiert dass keinen pRV-Vektor enthielt transformiert. Erwartungsgemäß ergab diese
Kontrollvariante keine Uredia auf den mit Carboxin behandelten Blätter (n = 14).
6 h 12 h 24 h0
10
20
14
8
5
a
b
c
Induktionsdauer mit AS
Mit
telw
ert
Ure
dia
pro
Bla
tt
ERGEBNISSE 63
Abbildung 3.21: Einfluss von Acetosyringon (AS) auf die Transformationseffizienz. A: Vorkultur (6 h) von verschiedenen Agrobakterium-Stämmen die das Plasmid pRV112 tragen, im Induktionsmedium mit AS (200 µM) oder ohne AS. Kontrollpflanzen infiziert mit WT U. fabae auf vorbehandelten Blättern (n = 16) mit Carboxin (50 µg/ml) oder Wasser (0 µg/ml). B: Transformationskontrolle mit AGL-1 Stamm (mit pRV112 transformiert) im Vergleich zu AGL-1 (ohne Vektor für U. fabae Transformation). Standardabweichung in 95%CI angegeben.
3.7.1.2 Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen
Ein optimales Verhältnis von Sporen und Agrobakterien ist für jedes Transformationsystem
für eine effiziente Transformation entscheidend (Michielse et al. 2005). Um die höchste
Transformationseffizienz für das U. fabae-System zu ermitteln, wurden verschiedene
Verhältnisse getestet. Das Verhältnis 1 : 38,5 ergab sich durch Einstellen des OD600-Wertes
der Agrobakterienkulturen in Induktionsmedium auf einen Wert von 0,5. Die Bakterien
wurden mit der maximal ausbringbaren Menge an Uredosporen für die Ausbringung auf eine
ganze Ackerbohnenpflanze gemischt. Bei den Verhältnissen 1 : 100 und 1 : 200 wurde eine
definierte Anzahl von Uredosporen mit den induzierten Agrobakterien gemischt. Alle drei
Agrobakterien-Stämme, die das Plasmid pRV112 tragen, wurden für die Untersuchung
benutzt. Während beim niedrigsten Verhältnis von Agrobakterien zu Uredosporen nur
wenige Rostpusteln selektioniert werden konnten, hob sich das Verhältnis 1 : 100 deutlich
hervor. Es ergab sich eine signifikant höhere Anzahl von Uredosporenlager in der S1, wenn
dieses Verhältnis von Sporen und Agrobakterien verwendet wurde. Eine höhere Anzahl von
Agrobakterien in Bezug auf eine Uredosporen (1 : 200) ergab eine signifikant niedrigere
Agrobacterium-Stamm Transformationskontrolle
[A] [B]
AGL-1pRV111 AGL-10
5
10
15
20
25
0
5
10
15
20
25
18
0
Variante
AGL-1pRV111 AGL-10
5
10
15
20
25
0
5
10
15
20
25
18
0
Variante
LBA1100 AGL1 GV31030
5
10
15
20
25
6
16
11
1 1 1
+ AS - AS
Mit
telw
ert
Ure
dia
pro
Bla
tt
ERGEBNISSE 64
Anzahl der Uredia pro Pflanzenblatt. Das niedrigste Verhältnis von 1 : 38,5 ergab die
niedrigste Anzahl der Uredosporenlager in der S1 (Abb. 3.22 und Anhang Tab. 8.7). Folglich
wurde ein Verhältnis von 100 Agrobakterien auf eine Uredospore (1 : 100) als optimaler
Parameter für die Transformation von U. fabae für alle weiteren Versuche verwendet.
Abbildung 3.22: Einfluss des Verhältnisses von Agrobakterien : Uredosporen auf die Transfor-mationseffizienz. Anzahl der Uredia in der ersten Selektion mit Carboxin (n = 32-40). Die jeweiligen Mittelwerte sind in Zahlen oberhalb der Diagrammbalken dargestellt. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (Tukey's Multiple Comparison Test; p < 0,05).
3.7.1.3 Weitere Faktoren für die ATMT
Durch den Einsatz verschiedener Agrobakterien-Stämme und Plasmide ergab sich eine
unterschiedliche Transformationseffizienz bei den jeweiligen Varianten. Dieser Einfluss wird
im Abschnitt 3.7.1.4 dargestellt. Ein weiterer essentieller Parameter einer effizienten ATMT
ist die Dauer der Kokultivierung von Uredosporen und Agrobakterien. Dieser Schritt kann für
U. fabae nur in planta durchgeführt werden, was gleichzeitig einen limitierenden Faktor
darstellt. Die Zeit zwischen dem Ausbringen und der Keimung bzw. Penetration der
Uredosporen in das Pflanzenblatt ist begrenzt und beträgt unter optimalen Bedingungen
etwa 6 Stunden. Diese Tatsache ist ohne zusätzlichen Behandlung mit keimungshemmenden
Substanzen nicht veränderbar und wurde auch so belassen.
1 : 38,5 1 : 100 1 : 2000
5
10
15
20LBA1100pRV112
AGL-1pRV112
GV3103pRV112
1 1 1
1
6
14
Verhältnis Uredosporen : Agrobakterien
Mit
telw
ert
Ure
dia
pro
Bla
tt
8
3 34a
b
c
ERGEBNISSE 65
LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV1120
5
10
15
20
a
b
c
5
15
10
Agrobacterium-Stamm
Mit
telw
ert
Ure
dia
pro
Bla
tt
3.7.1.4 Einfluss der Agrobakterien-Stämme
Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Agrobakterien-Stämme verwendet: LBA1100, AGL-1
und GV3103, die mit Plasmiden für Farb- und Fungizidmarker transformiert wurden. Nach
anfänglichen Arbeiten mit LBA1100 zeigten die beiden anderen Stämme ein tendenziell
zufriedenstellenderes Bild nach der ersten Selektion mit Carboxin. Die statistische
Auswertung (ANOVA) und das Diagramm in Abbildung 3.23 zeigen, dass die Anzahl der
einzelnen Uredosporenlager in der S1 bei allen drei Stämmen signifikant unterschiedlich
waren. Demnach ist die Transformationseffizienz mit AGL1pRV112 (n = 70) signifikant höher
im Vergleich zu den anderen verwendeten Stämmen LBA1100 (n = 70) und GV3103 (n = 66).
Die Ergebnisse aller Auszählungen sind im Anhang (Tab. 8.8) dargestellt.
Abbildung 3.23: Einfluss des Agrobacterium-Stammes auf die Transformationseffizienz. Darstellung der Mittelwerte ausgezählter Uredosporenlager selektioniert in der S1 mit Carboxin. Alle Stämme tragen das Plasmid pRV112. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (Tukey's Multiple Comparison Test; p < 0,05).
3.7.2 ATMT Transformantenlinien in vitro
Auch wenn das primäre Ziel der Agrobakterien-vermittelten Transformation die Etablierung
einer stabilen Transformation in planta war, wurden auch in vitro Untersuchungen mit den
DsRed-Farbmarkerkonstrukten durchgeführt, um einen Vergleich zu den erfolgreichen
biolistischen in vitro Experimenten zu haben. Es wurden zahlreiche Screens durchgeführt, es
konnte jedoch nur vereinzelt eine schwache Fluoreszenz der Keimschläuche beobachtet
werden. Weder mit pRV116 noch mit pRV116-NLS transformierte Uredosporen konnten für
eine Auszählung bzw. die Bestimmung der Transformationseffizienz herangezogen werden.
ERGEBNISSE 66
A B
C D
Auch erschwerte die starke Autofluoreszenz der Sporen die Unterscheidung der potentiellen
Transformanten vom Wildtyp. Die Transformation von Uredosporen mit
LBA1100pRV112::DsRed ergab schließlich identifizierbare Transformanten mit schwach
leuchtenden, roten Keimschläuchen (Abb. 3.24 A, B). Die Überprüfung der Konstrukte
pRV116 und pRV116-NLS erfolgte durch biolistischen Beschuss von Uredosporen mit diesen
Plasmiden. Bei diesen Experimenten konnten sowohl eindeutig eine rote Fluoreszenz der in
vitro keimenden Uredosporen identifiziert werden (Abb. 3.24, C) wie auch eine subzelluläre
Lokalisierung der Expression von pRV116-NLS in den Zellkernen (Abb. 3.24., D) festgestellt
Abbildung 3.24: Mikroskopische Screens nach ATMT von U. fabae in vitro. (A,B): LBA1100pRV112::DsRed-Transformanten, Pfeile zeigen eine schwache aber deutlich sichtbare rote Fluoreszenz der Keimschläuche. C: Mit pRV116 und D: pRV116-NLS beschossene Uredosporen zur Überprüfung der Plasmid-konstukte. Pfeile zeigen jeweils die Transformations-Ereignisse. Weißer Balken: 20 µM. E: Verwendetes Plasmid.
[E]
ERGEBNISSE 67
werden. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass die Größe der ursprünglich für die ATMT
konstruierten Plasmide von ca. 17,2 kb kein Hindernis für eine biolistische Transformation
darstellt.
3.7.3 Selektion der ATMT-Transformanten mit Fungiziden in planta
Analog zur biolistischen Transformation wurden auch für die ATMT die beiden Fungizide
Benomyl und Carboxin für die Selektion der potentiellen U. fabae Transformanten in planta
verwendet.
3.7.3.1 Selektion mit Benomyl
Alle drei Agrobakterien-Stämme (AGL-1, LBA1100 und GV3103) die das Plasmid pRV101
(TBB1-E198A) tragen, wurden mit Uredosporen wie in 2.4.2. beschrieben gemischt und für
eine Selektion mit Benomyl auf die Pflanzen ausgebracht. Die Ergebnisse aller Auszählungen
der Uredosporenlager sind im Anhang dargestellt (Tab. 8.5).
Auch bei dieser Transformationsmethode wurden nur wenige U. fabae-
Transformantenlinien in der zweiten Selektionsrunde propagiert, weitere Selektionsschritte
waren nicht erfolgreich (Tab. 3.13). Von den Ausgebrachten einzelnen Uredosporenlager aus
der ersten Selektion (S1), wuchsen nur einige wenigen Uredia in der nachfolgenden
Selektionsrunde (S2). Keine der weiter propagierten Sporenlinien wuchsen in der S3.
Auszählungen der Uredosporenlager aus der S1 sind im Anhang (Tab. 8.5) dargestellt. In
keiner der analysierten Transformantenlinien konnte ein eindeutig positives PCR-
Amplifikationsprodukt identifiziert werden und wird daher nicht gezeigt.
Tabelle 3.13: Selektionierte Transformantenlinien nach der ATMT in planta. a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.
Agrobacterium-Stamm
Transformations-Ansatz
Anzahl Urediaa)
S1 S2 S3
LBA1100pRV101 I II
2 23
0 1
0 0
AGL-1pRV101 I II
3 43
0 1
0 0
GV3103pRV101 I II
3 83
0 1
0 0
ERGEBNISSE 68
3.7.3.2 Selektion mit Carboxin
Die Agrobakterien-Stämme AGL-1, LBA1100 und GV3103 wurden mit den Plasmiden pRV112
und pRV114 transformiert und für eine Selektion mit dem Fungizid Carboxin wie in 2.4.2
beschrieben mit Uredosporen gemischt. Schon in den Vorversuchen war die Zahl von
potentiell transformierten Uredosporenlager in der ersten Selektion (S1) größer. Die
Propagation ausgewählter Uredia aus der S1 konnte in einzelnen Linien bis zur S8 fortgeführt
werden. Die Transformationseffizienz der verschiedenen Agrobakterium-Stämme ist in
Tabelle 3.14 dargestellt, eine Übersicht über die Zahl der Selektionsrunden findet sich in
Tabelle 3.15. Auszählung einzelner Uredia ist in der Tabelle 8.8 des Anhangs gezeigt. Die
höchste Transformationseffizienz (3,4 x 10-5) wurde mit dem AGL-1 Stamm erreicht.
Tabelle 3.14: S1 nach ATMT mit drei Agrobacterium-Stämmen. Erste Selektion in planta (S1) nach Transformation mit 3 verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, die entweder pRV112 oder pRV114 trugen. a: Anzahl selektierter Linien b: Mittelwert der Anzahl der Uredosporenlager pro Blatt; c: Anzahl behandelter Blätter; d: Transformationseffizienz.
Agrobacterium-Stamm a b c d
LBA1100 377 5 70 1,1 x 10-5
AGL1 1026 15 70 3,4 x 10-5
GV3103 648 10 66 2,3 x 10-5
Tabelle 3.15: Selektionierte S2- bis S8-Transformantenlinien (ATMT) in planta. Selektionsrunden 2 bis 8 (Sx) und dazugehörige Linien aus der Transformation mit drei Agrobakterien-Stämmen, die das Plasmid pRV112 oder pRV114 trugen. a: Anzahl ausgebrachter Linien und b: Anzahl selektierter/weiter propagierter Linien. Angaben der jeweiligen Prozentzahl der Transformantenlinien, die aus der Vorrunde in der nächsten Selektion propagiert wurden.
Agrobacterium-Stamm S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
a b a b a B a b a b a b a b
LBA1100 100 45 40 26 20 3 3 0 -- -- -- -- -- --
45 % 65 % 15 % 0 % -- -- --
AGL-1 100 63 50 24 20 8 8 3 3 1 -- -- -- --
63 % 48 % 40 % 38 % 33 % 0 % --
GV3103 100 58 45 23 20 14 14 6 6 3 3 1 1 0
58 % 51 % 70 % 43 % 50 % 33 % 0 %
ERGEBNISSE 69
M T1 T2 T3 T4 T5 T6 WT ‒1 + ‒2 M
bp 1000
700 500
300 100
S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2
Abbildung 3.25: ATMT-Transformanten von U. fabae aus S1 und S2 mit Carboxin. Nested-PCR mit Transformanten DNA (Tx) mit den Primern 3534-1 (P3) und SucDH1 (P4) in der Reaktion II. Die Reaktion I wurde mit pPMA1_rev (P1) und 114-F1 (P2) durchgeführt. M: DNA Ladder; WT: Wildtyp; H2O-Kontrollen der PCR I und II; (+): Plasmidkontrolle pRV112.
T
W
701 bp
pSucDH1 SucDH1(H254Y) pSucDH1
P4 P2
pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1
P1 P3
P4 P2
Die Propagation der ausgewählten Transformantenlinien der S1 konnte mit GV3103pRV114
bis zur S7, mit AGL-1pRV112 bis zur S6 und mit LBA1100pRV112 bis in die S5 fortgeführt
werden. Die prozentualen Angaben in Tabelle 3.15 stellen den Anteil der in der nächsten
Selektionsrunder weiter propagierten Linien dar.
3.7.4 Molekularer Nachweis der Transformation in den ATMT-Linien
Analog zu den Nachweisen nach der biolistischen Transformation wurde auch für die ATMT
der Nested-PCR-Nachweis zur Überprüfung der tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1-Abschnitte
durchgeführt. Bei ungenügender Menge oder Qualität der Template-DNA konnten keine
positiven PCR-Signale für die S1 oder S2 detektiert werden (Bsp. T3, T4 und T5, Abb. 3.25),
auch wenn die selektionierten Transformantenlinien bis zur S5 mit Carboxin propagiert
werden konnten. Der molekulare Nachweis ausgewählter Linien der U. fabae ATMT-
Transformanten aus weiteren Selektionsrunden ist in Abbildung 3.25 dargestellt.
Abbildung 3.26: ATMT-Linien S2 bis S8. Nested-PCR Reaktion II (vgl. Abb. 3.25).
M1 S3 S3 S4 S4 WT1 S3 S4 S5 S5 WT2 S3 S5 S6 S7 + ‒1 ‒2 M2
LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV114 bp
1000
700 500
ERGEBNISSE 70
pRV114 (2)14777 bp
==> pBIN20_Rev_1 - 1977 - Tm=60,2°C
==> pBIN20_Rev_2 - 2076 - Tm=62,1°C
Right Border - 2357<== RB_Fwd_2 - 2459 - Tm=56,7°C
<== RB_Fwd_1 - 2496 - Tm=58,9°C
Left Border - 8735
pPMA1 SucDHtP
MA
1
RB
LB
pRV114 (2)14777 bp
==> pBIN20_Rev_1 - 1977 - Tm=60,2°C
==> pBIN20_Rev_2 - 2076 - Tm=62,1°C
Right Border - 2357<== RB_Fwd_2 - 2459 - Tm=56,7°C
<== RB_Fwd_1 - 2496 - Tm=58,9°C
Left Border - 8735
pPMA1 SucDHtP
MA
1
RB
LB
[A]
[B] [C]
bp
1000
500 400 300
100
M 1 2 3 4 5 WT ‒1 ‒2 + M
Die nach der S2 unter Carboxindruck gebildeten Uredosporenlager wurden ebenfalls durch
PCR analysiert (Abb. 3.26).
Neben der Übertragung von T-DNA auf Zielzellen, besteht auch die Möglichkeit, dass bei der
Transformation mittels Agrobakterien ganze Plasmide übertragen werden (Bundock et al.
1995). Um zu überprüfen, ob U. fabae ATMT-Transformanten durch Übertragung
vollständiger Plasmide entstanden sind, welche sich dann autonom in U. fabae replizieren
und eine Fungizidresistenz aufrechterhalten, wurden mehrere Transformantenlinien einer
Nested-PCR Analyse unterzogen. Die gewählten Primer amplifizierten ausgehend von der RB
der T-DNA einen Teil des pBIN20-Backbone. Einzelne Transformantenlinien aus
verschiedenen Selektionsrunden wurden mit unterschiedlicher DNA-Menge geprüft (Abb.
3.27). In einigen Proben konnte mittels Nested-PCR die Plasmid-Backbone detektiert werden
(Abb. 3.27, Probe 3).
Abbildung 3.27: PCR-Nachweis des pBIN20-Backbone. A: EtBr-gefärbtes Agarosegel mit DNA-Proben aus der zweiten Reaktion der Nested PCR. Primer Reaktion 1: RB_Fwd_1 + pBIN20 Rev1 (555 bp) und Reaktion 2: Fwd_2 + pBIN20 Rev2 (418 bp). M: DNA Ladder, Transformantenlinien (Tx) aus verschiedenen Selektionsrunden, transformiert mit AGL1pRV114. 1,2: S3; 3,4: S5, (T1); 5: S7, (T2). Wildtyp (WT); H2O-Kontrollen (‒1 und ‒2) und Plasmid-Kontrolle pRV114 (+). B: Für die Transformation verwendetes Plasmid mit Primer-Region für (A). C: Vergrößerter Ausschnitt aus der Primer-Region im Plasmid pRV114.
ERGEBNISSE 71
kb
10
6
4
3
2
1
a b
3.8 Southern Blot Nachweis der Transformation
Parallel zu den PCR Analysen wurde eine Southern Blot-Analyse zum Nachweis der
Transformation etabliert. Aufgrund der nur geringen DNA-Menge, die aus einzelnen
Uredosporenlagern isoliert werden konnte, erwies sich der Southern Blot-Nachweis als
problematisch. Für einen eindeutigen Nachweis der Uf-SucDH1 war eine DNA-Menge von
mindestens 30 µg notwendig (Abb. 3.28 und Anhang, Abb. 8.7). Die Amplifizierung der DNA
mit dem Repli-g Kit brachte keine Verbesserung des Nachweises (Abb. 8.7). Nach zahlreichen
Versuchen mit DIG-markierten Sonden wurde versucht durch einen radioaktiven Nachweis
mit 32P eine sensitivere Methode zu etablieren. Es zeigte sich jedoch im direkten Vergleich
zur DIG-Markierung, dass die radioaktive Methode für dieses System keine Verbesserung
bringt (Anhang, Abb. 8.8). Die verfügbare DNA-Menge aus einer Probe war bedingt durch
nur wenige propagierte Uredosporenlager in planta auf unter 10 µg beschränkt.
Abbildung 3.28: Southern Blot-Analyse von Uf-SucDH1. a: Jeweils 30 µg genomischer DNA verdaut mit den gekennzeichneten Restriktions-enzymen wurden aufgetragen. b: Plasmid-Kontrolle (pRV112, 20 ng). Die verwendete Sonde wurde mit den Primern SucDH3-2 und H130.R1 hergestellt.
DISKUSSION 72
4. Diskussion
Obligat biotrophe Organismen wie Rostpilze und die Erreger des Falschen Mehltaus stellen
weltweit eine wichtige Gruppe von Phytopathogenen speziell von wirtschaftlich
bedeutenden Kulturpflanzen dar. Molekularbiologische Untersuchungen der Rostpilze
wurden bisher dadurch erschwert, dass kein universell funktionierendes System für eine
stabile Transformation existiert. Moderne genetische Methoden wie Überexpression,
Silencing oder Tagging von Genen sind daher nicht anwendbar. Für Rostpilze wurden bisher
hauptsächlich transiente Transformationsereignisse in der Literatur beschrieben. Für eine
genetische Modifikation zahlreicher filamentösen Pilze, die auf künstlichen Medien
kultivierbar sind, existieren dagegen zahlreiche Berichte über erfolgreiche Transformation.
Die meisten früheren Versuche nutzten die Inkubation von Protoplasten mit CaCl2 / PEG
oder die Elektroporation intakter Zellen (Hynes 1996). Diese Methoden sind jedoch
zeitaufwändig und in vielen Systemen ohne Erfolg geblieben vor allem aufgrund der
schwierigen Protoplastierung pilzlicher Zellen (Goosen et al. 1991). Bei filamentösen Pilzen,
die auf diese Weise erfolgreich transformiert wurden, zeigte sich zudem eine niedrige
Transformationseffizienz (Leung et al. 1990; Durand et al. 1991; Marmeisse et al. 1992). In
den letzten 15 Jahren wurden die meisten Erfolge mittels zweier Methoden erreicht, der
Biolistik und der „Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation“. Es lag demnach
nahe, diese zwei Methoden für das U. fabae System zu etablieren. Für beide Methoden
wurde ein Set von Plasmiden konstruiert, welches es ermöglichen sollte, sowohl die
optimalen Parameter für die Transformation von U. fabae in vitro mittels Farbmarkern zu
ermitteln, als auch die spätere Selektion stabiler Transformanten in planta zu ermöglichen.
4.1 Etablierung der Transformation von U. fabae in vitro
Die meisten Publikationen über die transiente Transformation (in vitro) von Rostpilzen
schließen einen Gentransfer mittels Genkanone ein (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993;
Schillberg et al. 2000). Auch wenn in allen Fällen die gleiche Biolistik-Apparatur verwendet
wurde, variieren die verwendeten Parameter wie der Heliumdruck oder die Beschussdistanz
(Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993). Die Gemeinsamkeit in diesen Arbeiten war, dass als
Zielzellen für den Beschuss die Uredosporen verwendet wurden oder wie im Fall von Barja et
al. 1998 die von Uredosporen ausgehenden Infektionsstrukturen (Mikroinjektion), auch
DISKUSSION 73
wenn die transformierten Rostpilzarten makrozyklisch waren. Basidio- und Pyknosporen sind
haploid und wären ein ideales Target für Transformation, jedoch sind diese im Vergleich zu
anderen Sporenarten nicht robust und können darüber hinaus nicht in ausreichender Menge
produziert werden. Uredosporen dagegen sind sehr robust und werden in großen Mengen
während der Vegetationsperiode produziert (Deising et al. 2002). Ein weiterer bedeutender
Grund, Uredosporen für die Transformation von U. fabae zu nutzen ist, dass die meisten
biochemischen, molekularen und zytologischen Arbeiten über Rostpilze mit Uredosporen
und deren Infektionsstrukturen durchgeführt wurden (Heath 2000; Szabo und Bushnell
2001; Voegele 2006; Ellis et al. 2007).
4.1.1 Ermittlung der optimalen Parameter für die Biolistik
Die Ermittlung der optimalen Parameter für die biolistische Transformation richtet sich nach
der Natur der Zielzellen (Konidien, Myzel usw.) und der physikochemischen Intensität der
Zellwand. Die gründliche Ermittlung der Faktoren für Biolistik bei U. fabae (Lenz 2005) hat
sich bereits am Anfang dieser Arbeit als positiv bestätigt. Als Microcarrier wurden 1 µM
Goldpartikeln bei einem Heilumdruck von 2200 psi (152 bar) und einer Beschussdistanz von
6 cm verwendet. Bei Uromyces appendiculates z.B. waren ein Heliumdruck von 1550 psi und
eine kürzere Beschussdistanz von 2,5 cm bereits ausreichend für eine transiente
Transformation (Li et al. 1993). Bei allen in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten
wurden Uredosporen von U. fabae benutzt. Auch die Hydrierung der Sporen vor dem
Beschuss und eine optimale Verteilung durch das Aufsprühen auf Objektträger mittels einer
Airbrush HP-200 nach der Biolistik, haben wichtige Voraussetzungen für die optimale
Vereinzelung und Keimung der Uredosporen geschaffen.
4.1.2 Regulatorische Elemente
Ein wichtiger Faktor für die erfolgreiche Expression von Transgenen stellt die Auswahl von
Promotor und Terminator dar. Die Expression der Fremd-Gene in anderen Rostpilzen wurde
unter Kontrolle von, entweder endogenen regulatorischen Elementen (Bhairi und Staples
1992; Schillberg et al. 2000), regulatorischen Elementen von nahe verwandten Pilzen (Webb
et al. 2006) oder dem CaMV 35S Promotor-Fragment (Li et al. 1993) durchgeführt. In
Anbetracht möglicher Schwierigkeiten bei der Benutzung von heterologen regulatorischen
DISKUSSION 74
Elementen (Christiansen et al. 1995) und der Tatsache, dass Informationen über genetische
Elemente in U. fabae zur Verfügung standen (Voegele 2006), wurden für die Transformation
von U. fabae endogene Promotor- und Terminator-Sequenzen gewählt. Für Uf-TBB1(E198A)
wurde der gesamte genomische Bereich mit den eigenen regulatorischen Elementen
verwendet. Für die Expression aller anderen Transgene wurden die Promotor- und
Terminatorsequenzen aus Uf-PMA1 (Struck et al. 1996) gewählt. Für die Plasmamembran
ATPase (PMA1) konnte gezeigt werden, dass sie in allen Stadien der von Uredosporen
ausgehenden Infektionsstrukturen, diese konstitutiv exprimiert wird (Wirsel et al. 2001).
Dies ergab eine gute Voraussetzung für die Transformation von U. fabae.
4.1.3 Farbmarker
Bei Uromyces appendiculatus (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993), Puccinia graminis f. sp.
tritici (Schillberg et al., 2000) sowie Puccinia triticina (Webb et al. 2006) wurde mittels
Biolistik das Gen für die β-Glucuronidase (GUS) in vitro transformiert. Anfangs wurde auch
bei der biolistischen Transformation von U. fabae mit dem GUS-Farbmarker gearbeitet (Lenz
2005). Die Arbeiten waren zwar erfolgreich, jedoch sprachen die zeitaufwändige GUS-
Färbung auf Objektträgern für die anschließenden Screens, die großen Verluste an
gekeimten Sporen sowie die Tatsache, dass dieses System nicht für ein in vivo-Markierung
geeignet ist, für die Verwendung weiterer Farbmarker. Fluoreszenzproteine wie GFP oder
DsRed haben den wesentlichen Vorteil, dass keine Vorbehandlung zur Visualisierung
notwendig ist und die Möglichkeit zur in vivo-Markierung ohne Beeinflussung der Vitalität
der Infektionsstrukturen besteht. Die erste Transformation von filamentösen Pilzen mit GFP
wurden bei dem Basiodiomyceten Ustilago maydis durchgeführt (Spellig et al. 1996). Dieser
Marker wird weiterhin z.B. für Puccinia graminis f. sp. tritici erfolgreich eingesetzt (Fehser
und Moerschbacher 2010). Varianten des Green fluorescent protein wie eGFP (Enhanced
GFP) und iGFP (Intron GFP), die sich durch eine stärkere Fluoreszenz und dadurch leichtere
Visualisierung im Vergleich zu GFP auszeichnen, wurden auch für U. fabae in Betracht
gezogen. Für GFP (Lenz 2005) und eGFP wurde festgestellt, dass bei der
Anregungswellenlänge für GFP gleichzeitig eine starke Autofluoreszenz der Sporen auftritt.
Für iGFP konnte gezeigt werden (Lugones et al. 1999, Burns et al. 2005), dass Einführung
eines Introns in GFP notwendig ist um die Fluoreszenzstärke zu erhöhen. Durch diese Intron-
Einführung wird die Effizienz der RNA 3‘ Prozessierung erhöht und in Folge auch die Menge
DISKUSSION 75
an cytoplasmatischer RNA (Huang und Gorman, 1990), was die Erhöhung der
Fluoreszenzintensität bei iGFP erklärt. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit das
Plasmidkonstrukt pRV117 mit iGFP als Marker in der biolistischer Transformation geprüft. Es
war schnell festzustellen, dass auch in diesem System die Einführung eines Intron in die GFP-
Sequenz eine wesentliche Verbesserung für die Screens der Transformanten darstellt, da nur
eine deutlich schwächere Autofluoreszenz der Sporen auftritt. Eine zusätzliche Verbesserung
der Fluoreszenz wurde durch eine Inkubation der Objektträger vor der Mikroskopie bei 37 °C
für 2 h erzielt (Abb. 3.2).
Parallel dazu wurde mit einem zweiten Fluoreszenzfarbmarker, DsRed, gearbeitet. Eine
etwas höhere Transformationseffizienz von 13 ± 10 (2,9 x 10 -5) im Vergleich zu iGFP mit 10 ±
7 (2,4 x 10-5) Transformanten im Mittelwert der 4,4 x 105 gescreenten Sporen pro
Objektträger, sowie die leichtere Identifizierung der Transformationsereignisse während den
Screens sprachen für DsRed als Farbmarker. Auch eine höhere Stabilität von DsRed bezüglich
der Ausbleichung der Fluoreszenz während der Anregung im Fluoreszenzmikroskop (Baird et
al., 2000) hat sich als positive Eigenschaft gegenüber iGFP in U. fabae Transformanten
hervorgehoben und auch in unseren Screens bestätigt. Beispiele für die Transformation
anderer Pilze mit DsRed sind Saccharomyces cerevisiae (Rodrigues et al. 2001) oder Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici (Nahalkova und Fatehi 2003). Mehrere Ascomyceten wurden mit
einer Variante von DsRed von Mikkelsen et al. 2003 erfolgreich transformiert. Nach
erfolgreicher Transformation von U. fabae mit pRV115 Plasmid (DsRed, Abb. 3.3), ein
weiterer Schritt sollte gemacht werden um zu zeigen, dass die transiente Transformation
von U. fabae mit DsRed in vitro tatsächlich ein reelles Transformationsereignis ist und die
identifizierten rotleuchtenden Keimschläuche das DsRed Protein exprimieren. Dafür wurde
dem Plasmid pRV115 ein Kernlokalisierungssignal (NLS) hinzugefügt und die Uredosporen
mit diesem Plasmid (pRV115-NLS) beschossen. Die Transformation war erfolgreich (Abb.
3.4). In allen transformierten, auf Objektträgern gekeimten Uredosporen konnte eine
subzelluläre Lokalisierung von DsRed in den Kernen festgestellt werden. Die rote Fluoreszenz
war eindeutig den Zellkernen zuzuordnen, so dass eine DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindol)–
Gegenfärbung nicht notwendig war. Zudem wurde eine weitere Behandlung der
Objektträger durch DAPI-Färbung die Vitalität der gekeimten Sporen stark beeinflussen und
einen Verlust der Fluoreszenz beifügen. Somit konnte mit dem pRV115-NLS-
DISKUSSION 76
Plasmidkonstrukt eindeutig gezeigt werden, dass die rote Fluoreszenz dem Farbmarker
DsRed zuzuordnen ist und die selektionierten Uredosporen tatsächlich transformiert sind.
Zu den Einfachkonstrukten, die nur einen Farbmarker trugen wurden anschließend die
beschriebenen Fungizidmarker (Abschnitt 4.2) hinzugefügt, um eine Doppelselektion mit
zusätzlicher Fungizidapplikation für eine Vermehrung in planta zu ermöglichen.
Doppelkonstrukt pRV111::DsRed wurde bereits in vitro untersucht und es konnte festgestellt
werden, dass so transformierte Sporen beim Besprühen auf Objektträger und zusätzlichen
Behandlung mit Carboxin den Wachstum mit rot fluoreszierenden Keimschläuchen einstellen
und schließlich absterben (Abb. 3.6). Ohne Fungizidapplikation konnten diese Sporen
ungehindert weiterwachsen und sich auf einer strukturierten Unterlage (aufgeraute PE-
Folie) unter Bildung von Appressorien differenzieren.
4.2 Transformationsansätze für in planta Versuche
4.2.1 Fungizidmarker
Die Auswahl der Marker für eine Selektion der transformierten Uredosporen in planta war
einer der wichtigsten Punkte für diese Arbeit. Auch wenn bereits Versuche für eine
Transformation von V. faba durchgeführt worden sind (Böttinger et al. 2001), konnten keine
Hygromycin B-resistenten Bohnenpflanzen erzeugt werden, womit diese Selektions-
möglichkeit nicht zur Verfügung steht. Aufgrund der Hygromycin B-Sensibilität von V. faba
Pflanzen wurde daher auf dieses Antibiotikum als Marker für die Transformation verzichtet.
Es war daher naheliegend, die Auswahl der Marker auf Fungizide zu beschränken, welche die
Wirtspflanze nicht schädigen. Für andere Systeme war bekannt, dass die Einführung von
Punktmutationen in das -Tubulin- bzw. Succinat-Dehydrogenase-Gen eine Resistenz
gegenüber den Fungiziden Benomyl bzw. Carboxin vermittelt. Der Wirkort des Fungizids
Benomyl sind die Mikrotubuli, was dazu führt, dass wichtige Prozesse wie der intrazelluläre
Transport und die Zellteilung nicht mehr ablaufen. Benomyl wirkt dabei selektiv und bindet
bevorzugt an Mikrotubuli pilzlichen Ursprungs (Ohkawa et al. 2007). Benomyl wurde 1968
von Fa. DuPont entwickelt und erfolgreich gegen pathogene Pilze im Pflanzenbau
angewandt. Für dieses Benzimidazol wurde im Jahr 2003 vom Bundesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) die Zulassung widerrufen
(www.bvl.bund.de/infopsm). Ein gezielter Aminosäureaustausch im -Tubulin-Gen bewirkt
DISKUSSION 77
eine Resistenz gegen Benomyl (Jung et al. 1992; Reijo et al. 1994). Bei der Succinat-
Dehydrogenase handelt es sich um einen Enzymkomplex aus dem Citratzyklus, der aus
mehreren Einheiten besteht und in die Elektronentransportkette der inneren
Mitochondrienmembran eingebunden ist. Als Angriffspunkt von Carboxin wird eine Eisen-
Schwefel-Untereinheit (Fe-S) beschrieben (Ackrell et al. 1977, Skinner et al. 1998).
Punktmutationen im dritten Cystein-reichen Cluster der Fe-S Untereinheit bewirken eine
Resistenz gegen das Fungizid Carboxin (Broomfield und Hargreaves 1992; Matsson et al.
1998; Honda et al. 2000). Durch die Charakterisierung der Gene Uf-TBB1 und Uf-SucDH1
(Wirsel et al. 2004) konnten die entsprechende Punktmutationen eingeführt werden (Abb.
3.7) und die Gensequenzen für die Plasmidkonstruktion benutzt werden. In der Handhabung
waren deutliche Unterschiede zwischen den beiden verwendeten Fungiziden für die U. fabae
Transformanten festzustellen. Für Carboxin und Benomyl. wurde zunächst eine
Konzentrationsreihe in vitro und anschließend in planta durchgeführt, um die notwendige
Menge zu ermitteln, die eine sichere Unterdrückung der Keimung des Wildtyps
gewährleistet. Dabei standen bereits erste Erfahrungswerte aus den von Wirsel et al. 2004
durchgeführten Experimenten zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass
eine Konzentration von 250 µg/ml Carboxin notwendig ist, um die Bildung von WT-Uredia in
inokulierten V. faba Pflanzen vollständig zu unterdrücken, wenn die Fungizidapplikation
durch Aufsprühen 3 Stunden nach der Inokulation durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu
zeigt die vorliegende Arbeit, dass bereits 25 bis 50 µg/ml Carboxin völlig ausreichend sind,
um den WT in planta vollständig zu unterdrücken (Abb.3.8). Auch die in vitro Ergebnisse mit
Carboxin lieferten ein ähnliches Bild (Abb. 3.5 A, B). Für Benomyl präsentierte sich ein
anderes Verhältnis, hier waren deutlich höhere Konzentrationen notwendig, um den Wildtyp
zu unterdrücken. Die von Wirsel et al. als ausreichend beschriebene Konzentration von 2,5
mg/ml (in planta) und 5 mg/ml (in vitro) von Benomyl, führte nur zu einer unzureichenden
Unterdrückung der Keimung der WT-Sporen. Sowohl in vitro (Abb. 3.5 E, F) als auch in planta
(Abb. 3.9) konnte festgestellt werden, dass mindestens 10 mg/ml Benomyl notwendig sind,
um eine vollständige Unterdrückung der Sporenkeimung zu erzielen. Zudem stellte sich die
Löslichkeit von Benomyl bei höheren Konzentrationen problematisch dar. Bereits ab 5
mg/ml war eine sichtbare kristalline Ausfällung in der Benomyllösung feststellbar. Die 10
mg/ml konzentrierte Fungizidlösung hinterließ zusätzlich einen Belag auf den behandelten
Blättern, was eine zusätzliche Barriere für die Keimung potentieller Transformanten
DISKUSSION 78
darzustellen schien (Abb. 3.11). Die insgesamt unzufriedenstellende Handhabung, die nur
wenigen selektionierten Uredosporenlager als potentielle Träger des Uf-TBB1(E198A) und
die Tatsache, dass dieses Fungizid europaweit nicht mehr zugelassen und damit schwierig zu
beschaffen ist, führte dazu, den Schwerpunkt der Experimente in dieser Arbeit auf die
Carboxin-Selektionen zu legen.
4.2.2 Selektionsschema
Das Ausbringen der Transformationsansätze auf V. faba Pflanzen mit einer Airbrush HP-200
führt zu einer optimalen Verteilung der Sporen und einer gezielten Inokulation der einzelnen
Blätter. Ebenso ergibt sich durch das Versprühen der Fungizide für die Selektion der
transformierten Uredosporen mittels Airbrush eine gleichmäßige Benetzung der Blätter, die
wichtig für eine lückenlose Behandlung aller ausgebrachten Sporen ist. Anfänglich wurde die
Fungizidbehandlung der Pflanzen für die Diskriminierung von Wildtyp- und potentiell
transformierten Sporen, analog zu den in vitro Versuchen, drei Stunden nach der
Ausbringung der Transformationsansätze durchgeführt. Es konnte wiederholt festgestellt
werden, dass gar keine oder nur vereinzelt Uredosporenlager gebildet werden. Erst nach
dem Verzicht auf eine Selektion in diesem ersten Schritt der Uredosporenvermehrung
konnten erste Erfolge erzielt werden. Auch die Beobachtung, dass bei unter Selektionsdruck
wachsenden potentiellen Transformanten das Durchbrechen durch die Blattoberfläche und
das sichtbare Öffnen der Uredia im Vergleich zum WT mit einer Verzögerung von ca. 2 Tagen
auftritt (Anhang, Abb. 8.3), unterstützten die Entscheidung, die erste Selektion erst auf der
zweiten Pflanze durchzuführen, um für alle potentiellen Transformanten die notwendige Zeit
zur vollständigen Entwicklung auf der ersten Pflanze zu gewährleisten. Somit wurde nach 10-
14 Tagen von der Pflanze eine Mischung aus WT- und transformierten Uredosporen
gesammelt und im nächsten Vermehrungsschritt auf der „zweiten Pflanze“ für eine erste
Selektion (S1) erneut ausgebracht.
4.2.2.1 Problematik der ersten Selektion (S1)
Der Schritt der ersten Selektion auf der zweiten Pflanze stellte sich als kritischster Schritt des
gesamten Selektionsschemas in planta dar. Die einzelnen Uredia stellen in der S1 jeweils
einen Genotyp dar und wurden einzeln gesammelt, um für spätere Selektionsrunden jeweils
DISKUSSION 79
eine Transformationslinie zu bilden. Aufgrund der geringen Sporenmenge und der
schwierigen Handhabung, vor allem aufgrund der starken Hydrophobizität der
Sporenoberfläche auf. Desweiteren ist die Wiederausbringung der einzelnen Uredia im
nächsten Selektionsschritt problematisch. Mehrere methodische Verbesserungen wurden
erprobt, um möglichst wenig Verlust zu verursachen und optimale Bedingungen dafür zu
schaffen, dass im nächsten Selektionsschritt (S2) möglichst viele Uredosporenlager gebildet
werden (Anhang, Abb. 8.1). Kerosin eignet sich aufgrund der polaren chemischen
Eigenschaft als ideales Medium für Aufnahme und Verteilung von Sporen, jedoch verursacht
es bei einem Volumen von > 50 µl pro Blatt eine starke Nekrotisierung der Pflanze und die
teilweise oder ganze Zerstörung des Blattes. Bei der Anwendung von weniger als 50 µl
reichte die Flüssigkeitsmenge nicht aus, um alle aufgenommenen Sporen mittels Airbrush
auf das Blatt zu sprühen, womit inakzeptable Verluste auftraten. Eine andere Möglichkeit
ergibt sich, wenn die einzelnen Uredia aus dem Zentrifugengefäß auf die befeuchteten
Pflanzenblätter gegeben wurden und die Sporen dann mit einem Laborlöffel (oder einem
Gegenstand mit glatter Oberfläche) verteilt wurden (Abb. 8.1, C). Diese Methode wurde,
sofern die Sporenmenge nicht für eine Vorhydrierung ausreichte, bei allen weiteren
Selektionsschritten angewandt.
4.2.2.2 Propagation der Transformantenlinien in planta
Nach der Ausbringung einzelner Uredosporenlager aus der S1 mit Carboxin war eine
Vermehrung in der Größenordnung von durchschnittlich ca. 50 Uredia zu erwarten, wie
bereits für den WT und bei der selben Art der Ausbringung ermittelt (Abb. 8.1). Dies war
jedoch nicht der Fall. In der zweiten Selektionsrunde (S2) zeigte sich ein sehr heterogenes
Bild der Urediadichte pro Blatt. Die Transformationslinien, die unter Carboxindruck weiter
gewachsen waren, ergaben eine Streuung in der Anzahl der Uredia pro Blatt von 1 bis 100
wobei die meisten im Bereich zwischen 1 und 20 propagierten Uredosporenlager lagen.
Wurden diese Sporen geerntet, um sie anschließend in einem weiteren Selektionsschritt (S3)
zu propagieren, ergab sich ein ähnliches Bild wie bei der Propagation mit einzelnen
Uredosporenlager. Die Anzahl der propagierten Uredia stieg nur gering an, blieb gleich oder
reduzierte sich von 20 auf z.B. 1 bis 2. Diese Beobachtung ergab sich in allen in planta
Experimenten, unabhängig von Transformationsmethode und Selektionsschritt. Daraus lässt
sich vermuten, dass im ersten Selektionsschritt bei der Vermehrung einzelner Uredia in der
DISKUSSION 80
S2, nicht alle potentiell transformierten Uredosporenlager propagierbar waren, bedingt
durch Ausbringungsart und Selektionsbedingungen. Ein Aussetzen des Selektionsdrucks zum
Beispiel in der vierten Selektion (S4) auf die S5 und eine Anreicherung der Sporen als
Zwischenschritt, um eine größere Menge erneut für die S5 ausbringen zu können, resultierte
meistens im Ausfall aller getesteten Ansätze. Die erneut mit Carboxin behandelten
Uredosporen keimten in drei von vier Fällen nicht wieder aus. Demnach schienen die U.
fabae Transformanten die potentiell in das Genom eingebaute SucDH1(H254L) bzw.
SucDH1(H254Y) herunter zu regulieren oder auszuschalten.
4.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation (ATMT)
Zusätzlich zu den ersten Erfolgen nach der biolistischen Transformation von U. fabae und der
Etablierung einer transienten Transformation in vitro wurde als eine zweite Methode, für
eine stabile Transformation, die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation
verwendet. In der Literatur finden sich zunehmend Berichte über eine erfolgreiche
Transformation von filamentösen Pilzen durch ATMT, dabei gliedern sich die Ziele in drei
Gruppen: 1) „Forward genetics“ (z.B. zufällige Mutagenese), 2) „Reverse genetics“ (z.B.
gezielte Modifikation des Genoms und zufällige Integration in das Genom) und 3) Einführung
von Reportergenen wie GUS, GFP oder RFP für ein in situ Monitoring (Frandsen 2011). Seit
dem ersten Bericht über die ATMT (de Groot et al. 1998) wurde diese Methode bis heute für
mehr als 125 verschiedene Pilzarten angewandt, die aus verschiedenen Klassen stammen,
von den Ascomyceten, Basidiomyceten bis den Zygomyceten sowie Vertretern der Abteilung
Glomeromycota und Oomycota (Frandsen 2011). Für diese Arbeit wurde eine Kombination
der Protokolle aus verschiedenen Systemen geprüft. Dabei wurden insbesondere die
Auswahl des Agrobacterium-Stammes, die Induktionsdauer der Agrobakterien für die
Transformation sowie das Verhältnis von Agrobakterien und Uredosporen zur Kokultivierung
geprüft.
4.3.1 Parameter für die ATMT von U. fabae
Insgesamt drei Agrobacterium-Stämme wurden für diese Arbeit verwendet: LBA1100
(Beijersbergen et al. 1992), AGL-1 (Lazo et al. 1991) und GV3103 (Holsters et al. 1980). Die
optimale Kultivierungstemperatur für Agrobakterien liegt bei 28 °C, jedoch wird die
DISKUSSION 81
Temperatur für Kokultivierung mit Pilzen und die Übertragung der T-DNA mit 22-25 °C als
optimal beschrieben (Michielse et al. 2005; Ando et al. 2009). Die mikroskopische
Auswertung der Versuche zur Keimung von U. fabae in vitro bei verschiedenen
Temperaturen zeigten, dass 96-98 % der Sporen bei Temperaturen zwischen 20 und 24 °C
Keimschläuche ausbilden und somit die optimale Temperatur in diesen Bereich liegt. Bei 24
°C beginnt eine stressbedingte Verzweigung der Keimschläuche, die Keimungsrate wird
jedoch nicht beeinflusst. Oberhalb von 27 °C kommt es mit durchschnittlich 84 % zur
deutlichen Abnahme der Anzahl gekeimter Sporen und zur Reduzierung der
Keimschlauchlänge. Bei 29 °C keimen nur noch 34 % der Sporen auf den Objektträgern.
Darüber hinaus wird bei Temperatur höher als 28 °C die T-DNA-Maschinerie der
Agrobakterien negativ beeinflusst (Fullner und Nester 1996). Bei 24 °C für Kokultivierung
liegt somit das Optimum für die Kultivierung beider Organismen vor. Problematisch dagegen
ist die Dauer der Kokultivierung von Agrobakterien und Uredosporen, die in U. fabae System
nicht veränderbar ist. Bei nicht obligat biotrophen Pilzen ist die Kokultivierung in
Kulturmedium, um die höchste Transformationseffizienz zu erzielen, unbegrenzt möglich
und variiert bei verschiedenen transformierten Pilzen zwischen einem und mehreren Tagen
(Michielse et al. 2005). Für eine Propagation von U. fabae müssen die Experimente zur
stabilen Transformation jedoch in planta durchgeführt werden. Etwa 6 Stunden nach
Inokulation der Pflanzen haben sich die Keimschläuche mit Appressorien gebildet und der
Pilz beginnt die Pflanze zu penetrieren (Deising et al. 1991). Diese Zeitspanne muss für die
Agrobakterien ausreichen, um eine Übertragung der T-DNA in U. fabae zu vollziehen.
Narasimhulu et al. 1996 konnten für BY2 Tabakzellen die mit Agrobacterium transformiert
wurden zeigen, dass nur 2 Stunden für einen T-DNA Transfer und die erfolgreiche
Transformation ausreichend sind.
Die Zugabe von Acetosyringon (AS) von bis zu 500 µM in der Vorkultur der Agrobakterien
erhöht in den meisten Fällen die Transformationseffizienz, was darauf deutet, dass die
Induktion der vir-Gene in Agrobacterium notwendig für eine T-DNA Übertragung ist. Dies hat
sich jedoch nicht in jedem System bestätigt. So ergab sich bei Hebeloma cylindrosporum und
Colletotrichum trifolii keinen Unterschied in der Transformationseffizienz, wenn die
Agrobakterien mit AS im Kulturmedium vorkultiviert worden waren (Combier et al. 2003;
Takahara et al. 2004). Eine deutliche Erhöhung der Anzahl transformierter Zellen konnte
dagegen in Magnaporthe grisea, Fusarium oxysporum, Beauveria bassiana, Aspergillus
DISKUSSION 82
awamori oder Mortierella alpina bei Induktion mit AS erzielt werden (Rho et al. 2001;
Mullins et al. 2001; Leclerque et al. 2003; Michielse et al. 2008; Ando et al. 2009). Bei U.
fabae konnte eine deutliche Erhöhung der Transformationseffizienz festgestellt werden,
wenn 200 µM AS zum Vorkulturmedium gegeben wurde (Abb. 3.21).
Die Dauer der Induktion mit Acetosyringon wurde mit AGL-1pRV112 in drei Varianten
getestet, 6, 12 und 24 Sunden der Inkubation im Induktionsmedium. In der Literatur sind
unterschiedlich lange Zeiten für Induktion der Agrobakterien vor der Kokultivierung mit den
Zielzellen beschrieben. Die meisten Protokolle beziehen sich auf eine Induktionszeit von 6
Stunden (Rho et al. 2001; Mullins et al. 2001; Degefu und Hanif 2003; Meyer et al. 2003;
Rogers et al. 2004; Talhinhas et al. 2008; Kemppainen und Pardo 2011). In anderen Arbeiten
wurde die Dauer der Agrobakterien-Induktion mit AS zwischen 0 und 24 Stunden variiert
(Leclerque et al. 2004; Ando et al. 2009). In U. fabae System wurde bestätigt, dass Induktion
von Agrobakterien für 6 Stunden signifikant höchste Transformationseffizienz erweist (Abb.
3.20). Die stark zurückgegangene Aktivität der vir-Gene in anderen Varianten (12 und 24 h)
könnte auf eine Stressreaktion der Agrobakterien während der andauernden Induktion mit
Acetosyringon hindeuten.
Ein weiterer Faktor, der entscheidend für eine erfolgreiche Transformation sein kann, ist das
Verhältnis der Anzahl verwendeter Agrobakterien zu Uredosporen in einem
Transformationsansatz. Verschiedene andere Studien haben gezeigt, dass für jeden Pilz eine
optimale Anzahl von Agrobakterien besteht, mit der Tendenz, dass bei einer größeren Zahl
der Bakterien pro Empfängerpilzzelle auch eine höhere Transformationseffizienz eingeht
(Michielse et al. 2005). Es existiert jedoch eine Obergrenze für dieses Verhältnis und eine zu
hohe Anzahl von Agrobakterien kann die Transformationseffizienz reduzieren. Bei U. fabae
konnte mit einem Verhältnis von 1 : 100 im Vergleich zu 1 : 200 eine signifikant höhere
Anzahl potentieller Transformanten erzielt werden (Abb. 3.22). Bei Aspergillus giganteus
wurde eine vergleichbare Tendenz festgestellt. Bei einem Verhältnis von über 1 : 120 wurde
hier eine sinkende Anzahl von Transformanten gezählt (Meyer et al. 2003).
Die Auswahl der Agrobakterien-Stämme für die Transformation von U. fabae richtete sich
nach Literaturhinweisen. Nach den ersten Experimenten in vitro und in planta, wurden
neben dem Stamm LBA1100 auch die Stämme GV3103 und AGL-1 mit Plasmidkonstrukten
für U. fabae transformiert. Deutlich hervorgehoben hat sich in den Versuchen in planta der
Stamm AGL-1 mit einer signifikant höheren Effizienz (3,6 x 10-5) im Vergleich zu
DISKUSSION 83
Transformation mit LBA1100 (1,4 x 10-5) und GV3103 (2,5 x 10-5). Die Darstellung in Tabelle
3.14 gibt die Anzahl der erzeugten Transformationslinien von U. fabae mit allen drei
Stämmen wieder. Um die relativen Zahlen zu verdeutlichen dient die Abbildung 4.1 mit einer
Übersicht zum Anteil der weiter propagierten Linien von der ersten Selektion bis zum Verlust
der Transformanten.
Abbildung 4.1: Übersicht über die Propagation von Transformantenlinien während der Selektion in planta. Die Darstellung bezieht sich auf Tabelle 3.15.
Von jeweils 100 ausgebrachten einzelnen Uredosporenlager aus der ersten für die zweite
Selektion (S2), nach Transformation mit LBA1100pRV112 (Abb. 4.1), wurden 45 Linien
propagiert, 55 von 100 Linien fielen während der Selektion mit Carboxin in der S2 aus. Für
die nächste Selektionsrunde wurden 40 von vorhandenen 55 Linien ausgebracht. Die 40
ausgebrachten Linien wuchsen in der S3 zu 65 % weiter (26 Transformationslinien) und 14
Linien fielen aus. Diese Verluste traten in allen Versuchen und Selektionsrunden in planta
mit verschiedenen Stämmen und Plasmidkonstrukten auf. Analog zu der Erfahrung mit den
biolistischen Transformanten in planta war auch bei der ATMT nur eine geringe Anzahl an
Uredosporenlager in der jeweilig nächsten Generation, unter Selektionsdruck propagiert, zu
finden. Schließlich fielen die einzelnen Linien nach 3 bis 8 Selektionsrunden ganz aus. Die
Ursache für diese Verluste ist nicht vollständig klärbar. Mehrere Gründe können hierzu
beigetragen haben. Einerseits die Art und Bedingungen während der Propagation in planta,
S1 S2
S3
S4
S5
S6 S7
S8
S1 S2
S3
S4
S5
S6 S7
S8
LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV114
100
45 55
26 14
3 17
100
63 37
24 26
8 12
3 5
1 2
100
58 42
23 22
14 6
6 8
3 3
1 2
DISKUSSION 84
anderseits die Prozessierung auf molekularer Ebene, die nicht vollständig verfolgt werden
kann.
4.4 Mögliche Ursachen der Problematik bei der Propagation von Transformantenlinien
Für die beiden verwendeten Methoden zur Transformation von U. fabae trat die gleiche
Problematik bei der Propagation bzw. Fortführung der gewonnenen Transformantenlinien
aus der ersten Selektion (S1) auf. Obwohl zahlreiche Optimierungsschritte zur Ausbringung
der potentiell transformierten Uredosporen durchgeführt wurden, schien das Verfahren
einen negativen Einfluss auf die Anreicherung der Uredosporenlager unter Selektionsdruck
mit Carboxin zu haben. Nachdem Wildtyp-Sporen, die auf gleicher Weise gehandhabt
wurden, jedoch mit Wasser statt Fungizid behandelt worden waren, die zu erwartende
Propagationsrate aufwiesen (Abb. 8.1), ist zu vermuten, dass die Ursache in der
Carboxinkonzentration liegt. Anfänglich wurde anhand der Konzentrationsreihe festgestellt
(Abb. 3.8), dass 25 bis 50 µg/ml Carboxin notwendig sind, um eine Keimung der WT-Sporen
in planta zu unterdrücken. In vitro Experimente zeigten, dass 50 µg/ml für eine vollständige
Keimungshemmung benötigt werden, da in den mit 25 µg/ml behandelten Varianten immer
wieder vereinzelt ausgekeimte Sporen zu finden waren die Ihr Wachstum fortgesetzt haben.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Wirsel et al. 2004, bildeten einige Uredosporen in
dieser Arbeit auch bei Konzentrationen oberhalb von 50 µg/ml (bis 500 µg/ml) Carboxin in
vitro Keimschläuche, die jedoch sichtbar abstarben und nicht weiter wuchsen. Die
Verwendung von weniger als 50 µg/ml Carboxin in Selektionsschritten nach der S1 könnte
eventuell Abhilfe verschaffen. Dies muss jedoch experimentell ermittelt werden und wurde
aus Zeitgründen im Rahmen dieser Arbeit nicht getestet. Ein zweiter Grund, warum
transformierte Uredosporen nicht mit einer höheren Keimungsrate in planta propagieret
werden konnten, ist auf molekularer Ebene zu suchen. Die Integration der Transgene in das
U. fabae-Genom ist nur begrenzt nachweisbar und die Lokalisierung der Geninsertion kann
aufgrund der fehlenden Genomsequenz nur schwer analysiert werden. Auch ist unbekannt,
welcher Mechanismus der Integration der mutierten Succinat-Dehydrogenase im jeweiligen
Fall vorliegt.
DISKUSSION 85
4.5 Analyse der Transformation auf molekularer Ebene
Die Analyse der DNA transformierter Uredosporen wurde primär mittels PCR durchgeführt.
Die Versuche, in vitro Transformanten, die mit Farbmarker (DsRed, iGFP) beschossen wurden
zu analysieren, erwiesen sich als schwierig. Nach Abnehmen der gekeimten Sporen, die
DsRed-Transformanten enthielten, von den Objektträgern und einer anschließende DNA-
Präparation ergaben sich in der PCR-Analyse keine Unterschiede zwischen DsRed
Transformanten und dem Plasmid pRV115. Nach dem Beschuss von Uredosporen mit den
Farbmarkerplasmiden (pRV115; pRV117) befanden sich im Transformationsansatz, der zur
Keimung und für die spätere mikroskopische Auswertung auf Objektträger aufgesprüht
wurde, Plasmidreste bzw. ganze Plasmide, die nicht in die Zellen gelangt waren. Die PCR-
Analysen mit einem DsRed spezifischen Primerpaar haben gezeigt, dass nicht zwischen
transformierten Uredosporen, die DsRed tragen und dem schwachen, aber präsenten
Hintergrundsignalen der DsRed-Plasmide die sich auf dem Objektträger befanden,
unterschieden werden kann (Ergebnisse nicht gezeigt). Somit wurden alle Analysen des
Genoms von U. fabae mit DNA aus Uredosporen, aus in planta Experimenten durchgeführt.
Für die Untersuchung der potentiellen Transformaten in der ersten Selektion konnte nur auf
die limitierte Sporenmenge aus einzelnen Uredosporenlager zurückgegriffen werden. Die
DNA Präparation ergab in vielen Fällen eine Konzentration und Gesamtmenge, die nicht
ausreichend für die PCR war. Amplifikation des gesamten Genoms mittels REPLI-g Kit brachte
zunächst Erfolge (Abb. 3.12), konnte aber aufgrund der hohen Kosten nicht bei allen zu
prüfenden angewandt werden. Der nächste Schritt war deshalb die Etablierung einer Nested
PCR-Analyse zum Nachweis der transgenen Succinat-Dehydrogenase in den selektionierten
Sporen. Mit spezifischen Primern, die nur bei einer Kombination von regulatorischen
Elementen der Plasmidkonstrukte (pPMA1-SucDH1(H254Y) ein Amplifikationsprodukt
ergeben, kann eine eindeutige Unterscheidung zum Wildtyp getroffen werden (Abb. 4.2).
Somit konnte mit dieser Methode eine große Anzahl von Transformantenlinien auf das
Vorhandensein der transgenen Succinat-Dehydrogenase überprüft werden. So konnte
gleichzeitig auch eine Auswahl der Transformantenlinien erfolgen, die mittels Southern Blot
analysiert werden sollten (s. Abschnitt 4.5.1). Für die Analyse der Transformanten-DNA
wurden zudem andere PCR Methoden erprobt. Den zuverlässigsten Nachweis lieferte die
SNP-PCR-Analyse für die biolistische Transformanten (Abb. 3.18 und 3.19).
DISKUSSION 86
P1 + P2 P3 + P4
T
WT
P1 P3
P4 P2
pSucDH1 SucDH1(H254Y) tSucDH1
pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1
P4 P2
Abbildung 4.2: Nested-PCR Modell für den Nachweis der transgenen SucDH1 in U. fabae Transformanten. Mit der verwendeten Primerkombination kann aufgrund der Kombination der Gene mit regulatorischen Elementen nur in U. f. Transformanten-DNA ein Amplifikationsprodukt in der erwarteten Größe entstehen.
Nachdem ein Unterscheid in den Integrationsprozessen von Transgenen nach Biolistik bzw.
ATMT vorliegt, wurde diese Methode nur für die biolistischen Transformanten verwendet.
Nach ATMT wurde jedoch zusätzlich eine Untersuchung zum Vorhandensein der ganzen
Plasmide durchgeführt (Abb. 3.27). Einen Überblick über die verwendeten Methoden geben
die Abbildungen. 4.3 und 4.4.
Biolistik
Es besteht die Möglichkeit, dass die transgene SucDH1 über die homologen Sequenzen der
Uf-PMA1 und/oder der Uf-SucDH1 integriert wird (Abb. 4.3). Die Länge der homologen
Abschnitte in den Plasmidkonstrukten (ca. 600 bp und ca. 1100 bp in den regulatorischen
Elementen sowie homologe Sequenzen der Gene Uf-TBB1 und Uf-SucDH1) stellt eine gute
Voraussetzung für die Integration über eine homologe Rekombination dar. Im Fall A (Abb.
4.3) findet eine Rekombination über die regulatorischen Elemente der WT-PMA1 statt, was
eine mittels PCR-Analyse feststellbare Größenänderung der Gensequenz zur Folge hat. Die
verwendeten Uf-PMA1-spezifischen Primer amplifizieren ein Fragment von 5,5 kb im WT und
von 3,3 kb in den Transformanten.
Keine der analysierten Transformanten zeigte Abweichung in der Größe des 5,5 kb-
Amplifikationsproduktes, das der Wildtyp-PMA1 entspricht. Die SNP-PCR-Analysen brachten
dagegen klare Hinweise auf das Vorhandensein einer Punktmutation in der SucDH1 (Abb.
3.18 und 3.19) und damit auf die Integration der transgenen SucDH1(H254Y). Somit konnte
gezeigt werden, dass in den analysierten Transformantenlinien der Einbau in das U. fabae
Genom bevorzugt über homologe Sequenzen der Succinat-Dehydrogenase erfolgte.
DISKUSSION 87
PCR Nachweis (Unterscheidung der Größe)
1. Nested-PCR Nachweis der Plasmidkassette
2. SNP-PCR
A: Integration über Uf-PMA1 B: Integration über Uf-SucDH1
Abbildung 4.3: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom nach der Biolistik. Integration über A: homologe Sequenzen der Uf-PMA1 und B: Uf-SuDH1.
Aufgrund der Tatsache, dass die mit SNP-PCR positiv getesteten Transformanten auch ein
Signal in der Nested-PCR lieferten, besteht dennoch eine Unklarheit. Wenn die Integration
der SucDH1(H254Y) über die Uf-SucDH1 erfolgt, kann es keine Kombination der Elemente
pPMA1-SucDH1 in der Integrationsstelle geben. Es könnte jedoch zur Integration multipler
Kopien der transgenen Succinat-Dehydrogenase ins Genom von U. fabae gekommen sein,
sowohl durch homologe Rekombination als auch durch zufällige Integration in das Genom.
Beide Ereignisse können dann mit den zwei unterschiedlichen PCR Analysen identifiziert
werden.
ATMT
Bei Agrobacterium-vermittelten Transformation sind die komplexen Vorgänge und die
Integration der T-DNA in das Genom der Wirtszellen bis heute wenig verstanden. Mehrere
Modelle für die ATMT wurden entwickelt, hauptsächlich basierend auf Untersuchungen in
Pflanzen (Tzfira 2006; Lacroix et al. 2006b; Citovsky et al. 2007; Dafny-Yelin et al. 2008). Die
pilzliche Transformation mittels Agrobacterium wurde in Bezug auf Hefe (Saccharomyces
cerevisiae) tiefgehender berichtet als in filamentösen Pilzen. Während es in Pflanzen primär
zur zufälligen Integration der T-DNA in verschiedenen Loci im Genom über nichthomologe
Rekombination (non-homologous recombination, NHR) kommt, geschieht die Integration der
T-DNA in Hefe bevorzugt über homologe Rekombination (homologous recombination, HR),
DISKUSSION 88
(van Attikum und Hooykaas 2003). Frandsen et al. haben die unterschiedliche Möglichkeiten
und Verläufe der Rekombinationsereignisse in Pilzen, die durch Mitwirkung von DNA-
Reparaturmechanismen oder Schutzsystemen der Wirtszelle geschehen (anhand Berichten
für Hefe) zusammengefasst: 1) Integration über HR via Doppel-Crossover; 2) Degradation
durch Exonukleasen; 3) Bildung zirkulärer doppelsträngiger DNA und autonome Replikation;
4) zufällige Integration im Genom via „non-homologous end joining“ (NHEJ); 5) Integration
über HR via Single-Crossover zwischen „upstream“ oder „downstream“ der homologen
Sequenzen in T-DNA und Target Locus (Zielort im Genom); 6) Kombination der aufgezählten
Ereignisse (Frandsen et al. 2012). Bezogen auf U. fabae, wo es sich um eine Transformation
mit Genkonstrukten mit zum „target locus“ homologen Sequenzen handelt, kann die erste
Möglichkeit als unwahrscheinlich angenommen werden, weil es sich bei der Vermehrung der
potentiell transformierten Uredosporen um eine asexuelle Reproduktion bzw. mitotische
Teilung handelt. Der bei Pilzen beschriebene parasexuelle Zyklus, in dem eine
Rekombination nicht während der Meiose, sondern im Verlauf der mitotischen Teilung
stattfindet, hat nur bei den Fungi Imperfecti, die Ihre Fähigkeit zur sexuellen Vermehrung
verloren haben oder deren sexuelle Form noch nicht gefunden wurde, größere Bedeutung.
Folglich bleiben, abgesehen von der möglichen Degradation der in die Uredosporen
gelangten Transgene und damit dem Verlust der T-DNA, die Möglichkeiten 3), 4) und 5),
sowie die Kombination aus diesen. Die Abbildung 3.4. soll diese möglichen Ereignisse
verdeutlichen.
Die meisten Analysen der ATMT in dieser Arbeit wurden mittels Nested-PCR mit für das
Fragment pPMA1-SucDH1(H254Y) spezifischen Primern (Abb. 4.3; 3.25 und 3.26)
durchgeführt. Dieser Nachweis kann nur eine Aussage über das Vorhandensein der T-DNA in
der analysierten genomischen DNA und nicht über den Integrationsort oder ein mögliches
extrachromosomales Vorliegen der Transgene liefern. Aufgrund der Tatsache, dass das U.
fabae Genom noch nicht sequenziert wurde, ist ein genaueres Bestimmen der
Integrationsorte sehr schwierig. Der Versuch, eine SiteFinding-PCR (Tan et al. 2005) für das
System zu etablieren, erwies sich als schwierig, da die nur in geringer Zahl entstandenen
Amplifikationsprodukte aufgrund der zu geringen DNA-Menge nicht erfolgreich sequenziert
werden konnten. Die Schwierigkeiten bei der Anwendung dieser Methode in U. fabae
könnten durch die Spezifität der SiteFinder-Primer begründet sein, die in Kombination mit
den Right Border-spezifischen Primern ein Amplifikationsprodukt bilden sollten. Die mittels
DISKUSSION 89
1. Übertragung der T-DNA
a)
b)
2. Übertragung ganzer Ti-Plasmide
a) Homologe Rekombination (HR)
b) Zufällige Integration im Genom (NHEJ)
Ti-Plasmid
Uredospore
RB SucDH1(H254Y) LB
Ti-Plasmid
T-DNA
Uf-SucDH1 SucDH1(H254Y)
Abbildung 4.4: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom bei Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens.
Nested-PCR analysierten Transformantenlinien zeigten dennoch ein Vorliegen der T-DNA
und die Uredosporen wuchsen in planta über mehrere Selektionsrunden mit Carboxin. Es
kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zu Bildung zirkulärer doppelsträngigen
DNA oder zur Übertragung ganzer Ti-Plasmide durch die Agrobakterien und somit zur
autonomen Replikation der T-DNA in den Uredosporen kommt. Untersuchungen in Hefe
haben gezeigt, dass ein unterschiedlicher Anteil an ganzen Ti-Plasmiden durch
DISKUSSION 90
Agrobacterium in die Wirtszellen übertragen wird (Bundock et al. 1995;). Neueste
Untersuchungen in der Pflanzen-ATMT zeigen, dass die Bildung komplexer
extrachromosomaler T-DNA sowie, deren Zirkularisierung und autonome Replikation viel
häufiger auftreten als bisher angenommen (Singer et al. 2012). Zur Überprüfung der U.
fabae Transformanten hinsichtlich des Vorliegens des verwendeten Ti-Plasmids wurden in
einer Nested-PCR spezifische Primer für das pBIN20-Backbone und die RB-Sequenzen
verwendet. In einigen analysierten Transformanten konnten schwache, aber eindeutige
Signale für die spezifischen Amplifikate identifiziert werden (Abb. 3.27), was darauf
schließen lässt, dass auch in U. fabae teilweise eine extrachromosomale Vermehrung und
Expression der mutierten Succinat-Dehydrogenase vorkommt und die Degradation der
extrachromosomalen DNA eine eventuelle Erklärung für den Verlust der einzelnen
Transformantenlinien in frühen Selektionsrunden darstellt. Ob es in einigen Fällen zur
späteren Integration ins Genom gekommen ist und welchen prozentualen Anteil diese
Transformanten an der Gesamtzahl aller selektionierten Linien einnehmen, konnte aus
Zeitgründen im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr überprüft werden.
4.5.1 Southern Blot Analyse
Zum endgültigen Nachweis einer stabilen Transformation und der Integration von
Transgenen in U. fabae sollte die Southern Blot Analyse dienen. Aus früheren Experimenten
war bekannt, dass für U. fabae eine Menge von mindestens 30 µg DNA benötigt wird, um
klare Signale in der Southern Blot Analyse zu bekommen (Abb. 3.28). Diese DNA-Menge war
bei Präparation potentiell transformierten Uredosporen aufgrund der geringen
Sporenmenge nicht zu gewinnen. Verschiedene Mengen und Präparationen der
genomischen DNA wurden getestet, es konnte jedoch in keiner der analysierten
Transformanten eine eindeutige Markierung der SucDH1 bei der verwendeten DNA-Menge
erreicht werden. Durch die Amplifikation der gesamten genomischen DNA durch das Repli-g
Kit ist es möglich, die verfügbare DNA Menge zu erhöhen, jedoch nach Herstellerangaben
auf maximal 10 µg pro Ansatz, für U. fabae lag der Wert bei maximal 6 µg. Da die DNA-
Konzentration in den amplifizierten Ansätzen aus einzelnen Repli-g Reaktionen mit der
herkömmlichen photometrischen Messungen nicht zu bestimmen sind, wurde die
Bestimmung der vorhandenen DNA im Rahmen dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff
SYBR Green (Bindung an doppelsträngige DNA, Adsorption λmax = 494 nm, Emission λmax =
DISKUSSION 91
521 nm) durchgeführt und DNA-Mengen von weit unter 10 µg pro Ansatz gemessen. Auch
die Agarosegel-Analyse zeigte eine nicht gleichmäßig gute Ausbeute an Repli-g-amplifizierter
DNA, so dass auch das Vereinigen mehrerer Ansätze keine entscheidende Verbesserung für
die Southern Blot Analyse brachte (Abb. 8.7). Aus diesen Gründen wurde versucht, mit der
radioaktiven Markierung der Sonden (32P) eine sensitivere Southern Blot-Analyse zu
etablieren. Es zeigte sich jedoch, dass eine Markierung der verwendeten Sonden mit [alpha
32P]-dATP für die Detektion der Succinat-Dehydrogenase keine sensitivere Methode für
unseren System darstellt (Abb. 8.9). Dies konnte im direkten Vergleich mit der DIG-
Markierung festgestellt werden. Die mit 32P markierte Sonde band bevorzugt an Plasmid
DNA und die Expositionszeiten für die Erzeugung einer vergleichbaren Signalstärke waren
deutlich länger als bei der CSPD-Detektion (Abb. 8.8). Die Southern Blot-Analyse stellt somit
keine adäquate Methode zum Nachweis der Transformation in U. fabae dar.
4.6 Stabilität der transformierten Uredosporen
Sowohl bei der biolistischen wie auch bei der Agrobacterium-vermittelten Transformation
konnten die selektionierten Linien nach einer unterschiedlichen Zahl von Generationen in
planta unter Selektionsdruck mit Carboxin nicht weiter propagiert werden. Welche
Mechanismen hier zu Grunde liegen, ist unklar. Die Transformation von dikaryotischen
Uredosporen bedeutet, dass einer oder beide Kerne die Transgene empfangen können. Dies
ist bei der ATMT wahrscheinlicher als bei der Biolistik, weil eine große Anzahl von
Agrobakterien pro Uredospore zur Verfügung steht und diese die Möglichkeit haben, eine
unterschiedliche Anzahl von Kopien der T-DNA in einen oder beide Kerne zu übertragen.
Somit können beide Kerne als Integrationsort dienen. Ein Beschuss mittels Biolistik dagegen
ist auf das gezielte Treffen der Spore bzw. Zellkerne angewiesen.
Im Falle einer stabilen Integration in das Genom von U. fabae ist unklar, warum die
Propagation der selektionierten Uredosporen nicht länger als 10 Generationen möglich ist.
Bei der Integration der SucDH1(H254Y) oder SucDH1(H254L) in nur einen der zwei Zellkerne
kommt es eventuell nicht zu einer signifikanten Dominanz des Resistenz-Allels über das
Wildtyp-Allel was dazu führt, dass eine Selektion mit Carboxin schwierig ist. Falls es sich
jedoch um Transformanten handelt, die extrachromosomale T-DNA tragen, kann es zu
unbestimmten Zeitpunkten in verschiedenen Generationen zu einer Degradation dieser
Strukturen kommen, wodurch die Resistenz verloren geht. Nachdem im U. fabae-System
DISKUSSION 92
bezüglich des genauen Locus der Transgene keine Aussage getroffen werden kann, sind
beide Situationen vorstellbar. Ob es sich bei den biolistischen Transformanten ebenfalls um
eine Degradation handelt, ist nicht sicher. Die höchste Transformationseffizienz wurde bei
Beschuss mit der Plasmid-Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 erzielt. Die Ausbildung
extrachromosomaler Strukturen aus den für Beschuss verwendeten DNA-Abschnitten, die
über mehrere Generationen die Resistenz vermitteln, ist aufgrund der fehlenden
Mechanismen für die Autoreplikation, unwahrscheinlich.
Die Überprüfung einiger biolistischer Transformantenlinien auf die mitotische Stabilität der
eingebrachten Gene wurde durch Aussetzen der Selektion mit Carboxin in einer Generation
durchgeführt. Eine von vier geprüften Transformantenlinien erzeugte neue
Uredosporenlager bei Wiederapplikation des Fungizids. Dies wiederspricht der Theorie einer
stabilen Transformation, es müssten jedoch mehrere Wiederholungen mit verschiedenen
Transformantenlinien durchgeführt werden um eine definitive Aussage treffen zu können.
Eine während der Propagation von potentiell transformierten Uredosporen in planta
aufgetretene Mutation im SucDH1 Gen, die eine natürlich erworbene Resistenz gegen das
Fungizid Carboxin vermitteln würde, kann mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen
werden. Zum einen gibt es keine vergleichbaren Literaturberichte und zum anderen wurden
einige U. fabae Transformanten analysiert. Das Auftreten spontaner Punktmutationen in der
Uf-SucDH1 wurde überprüft. Es wurden Primer verwendet, die spezifisch die WT-Succinat-
Dehydrogenase amplifizieren und die in PCR amplifizierten Sequenzen anschließend
analysiert. Keine der analysierten Proben zeigte eine Abweichung der Sequenz zum WT.
4.7 Vergleich der Transformationsmethoden Biolistik und ATMT
Mit beiden verwendeten Methoden für die Transformation von U. fabae wurden Erfolge
erzielt. Während sich die Biolistik vor allem bei Verwendung von DsRed als Farbmarker gut
für ein in vivo Monitoring von Infektionsstrukturen der Uredosporen eignet, ist die
transiente Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens für diesen Zweck im U. fabae-
System nicht geeignet. Für die Etablierung des Selektionsschemas in planta mit dem Ziel der
stabilen Transformation, diente die Agrobacterium-vermittelte Transformation, weil sich bei
dieser Methode, verglichen mit den anfänglichen biolistischen Arbeiten eine deutlich höhere
Transformationseffizienz zeigte. Erst nachdem für den biolistischen Beschuss die Plasmid-
Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 verwendet wurde, ergab sich eine sehr gute
DISKUSSION 93
Transformationseffizienz und eine deutlich höhere Anzahl der Generationen propagierter
Uredosporen. Der Vorteil dieser Methode verglichen mit der anfänglichen Benutzung von
ganzen Plasmiden ist zudem, dass extrachromosomale, selbstreplizierende Strukturen kaum
auftreten können und es sich dadurch bei den gewonnenen Linien, die mit der Genkassette
biolistisch transformiert wurden, höchstwahrscheinlich um eine Integration der Transgene in
das U. fabae Genom handelt. Tabelle 4.1 gibt ein Gesamtbild der Charakteristika beider
Transformationsmethoden bezogen auf die Anwendung im U. fabae-System.
Tabelle 4.1: Biolistik und Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) im Vergleich. Unterschiede und Ähnlichkeiten beider Methoden bei der Transformation der Pilze mit einem Bezug auf das U. fabae-System.
Biolistik ATMT
Empfänger:
Sporen, Myzel
Sporen
Donor:
Plasmid-DNA
Agrobacterium (T-DNA)
Vorbehandlung:
Plasmid-DNA Präparation (1 h)
Evtl. Keimung von Sporen (Hydrierung)
Beschuss und Ausbringung
Agrobacterium Vorkultur u. Induktion (ca. 3 d)
Hydrierung von Uredosporen
Mischung und Ausbringung (Kokultivierung)
Kosten
Ca. 22000 EUR (Biolistik-Apparatur)
Niedrig (Agrobakterien Kultivierung)
Integration ins Genom:
Homologe Rekombination (HR) Illegitime Rekombination (NHEJ)
HR (Single-Crossover) Illegitime Rekombination (NHEJ)
Autonome Replikation der T-DNA
Transformationseffizienz in planta
Beschuss ganzer Plasmide 4,5 x 10-6 – 3,2 x 10-5 Beschuss mit Plasmid-Kassette 5,3 x 10-5 – 7,1 x 10-5
Agrobacterium-Stämme:
3,6 x 10-5 (AGL-1)
2,5 x 10-5 (GV3103)
1,4 x 10-5 (LBA1100)
Anzahl Generationen (Selektionsrunden)
2 (bei Beschuss mit ganzen Plasmiden) 10 (bei Beschuss mit Kassette)
6 (AGL-1)
8 (GV3103)
4 (LBA1100)
DISKUSSION 94
Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, konnte mit beiden benutzten Methoden,
Biolistik und ATMT eine transiente Transformation von U. fabae erzielt werden. Bei der der
biolistischen Transformation mit den Fluoreszenzfarbmarkern DsRed und iGFP ist ein System
für in vivo Monitoring von Infektionsstrukturen der Uredosporen von U. fabae geschaffen
worden. Das Fungizid Carboxin wurde erfolgreich für Biolistik und ATMT für die Selektion
und Propagation der U. fabae-Transformanten unter Selektionsdruck in planta etabliert.
Darüber hinaus konnten durch molekulare Analysen, konkrete Hinweise auf eine Integration
der Transgene in das U. fabae Genom, als Voraussetzung für eine stabile Transformation,
gezeigt werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit für U. fabae etablierten Transformationsmethoden können
zudem auf andere Rostpilze übertragen werden, womit ein wichtiges Werkzeug für
zukünftige Charakterisierung von Genen, Proteinen und Reaktionen, welche die obligat
biotrophe Interaktion steuern, auf molekularen Ebene benutzt werden kann.
4.8 Ausblick
Die vorliegende Arbeit umfasst umfangreiche Untersuchungen und Möglichkeiten, den
obligat biotrophen Rostpilz U. fabae mittels zweier Methoden, Biolistik und ATMT, genetisch
zu modifizieren. Gleichzeitig liefert es eine breite Basis für weitere Untersuchungen der
molekularen Vorgänge in den erzeugten Transformantenlinien sowie für die Herstellung und
Prüfung weiterer Plasmidkonstrukte für die Agrobacterium-vermittelte bzw. biolistische
Transformation. Es sind weitere Arbeiten notwendig, um eine Integration der Transgene zu
bestätigen und den Integrationsort im Genom zu identifizieren. Darüber hinaus ist es von
großer Bedeutung, die Propagation der gewonnenen Transformantenlinien zu überprüfen,
um genügend Sporenmaterial für weitere Analysen zu gewinnen.
4.8.1 Anwendung weiterer molekulare Methoden
Die bereits erprobte SFP-PCR Methode könnte optimiert werden, um Integrationsereignisse
bei der ATMT zu bestätigen. Von der Right Border (RB) der T-DNA ausgehend sollte weiter
versucht werden, entsprechende unspezifische Primer zu finden um den Integrationsort
nach der ATMT von U. fabae zu identifizieren. Auch weitere PCR-Methoden wie die Uneven-
PCR nach Chen und Wu (1997) oder die vor kurzem patentierte Methode der LAM-PCR
DISKUSSION 95
(lineare amplifikationsvermittelte Polymerasekettenreaktion, Schmidt et al. 2007) wären
dafür geeignet. Eine Sequenzierung des Genoms von U. fabae wäre von entscheidender
Bedeutung für den molekularen Nachweis der Transformanten.
4.8.2 Modifizierung und Erweiterung der Plasmidkonstukte
Die Plasmidkonstruktion sollte in Richtung der Erweiterung der vorhandenen Plasmide um
Sequenzen für relevanten Gene, die Proteine wie RTP1p exprimieren, die von einer hohen
Bedeutung in der U. fabae – V. faba Interaktion sind, verfolgt werden. Um eine mögliche
Übertragung ganzer Ti-Plasmide bei der ATMT zu verhindern, könnte versucht werden, die
verwendeten Plasmidkonstrukte zu modifizieren. Eine sehr gute Zusammenstellung
verschiedener Möglichkeiten der Plasmidkonstruktion für die ATMT wurde vor kurzem
veröffentlicht (Frandsen et al. 2012).
4.8.3 Optimierung der Propagation bei der Selektion in planta
Durch Biolistik und ATMT gewonnene Transformationslinien sollen als Basis für Experimente
in planta dienen, mit dem Ziel eine größere Anzahl propagierter Uredosporenlager nach der
ersten Selektion zu erhalten. Es sollte untersucht werden, ob dies mit einer niedrigeren
Konzentration des Fungizids Carboxin wie z.B. 25 µg/ml besser funktioniert, gleichzeitig
sollte Überprüft werden, ob die Unterdrückung von Wildtypsporen die durch eine eventuelle
Kontamination im Gewächshaus möglich ist, gewährleistet wird. Darüber hinaus sollte die
Propagation der einzelnen Uredia aus der S1 für die S2 überdacht werden. Um die
Unterscheidung einzelner Genotypen zu gewährleisten, wurden in Rahmen dieser Arbeit
einzelne Uredosporenlager aus der ersten Selektion geerntet und weiter propagiert. Es gibt
Berichte, dass bei Verwendung bestimmter ATMT-Protokolle für Fusarium graminearum
keine Notwendigkeit der „single spore cultures“ besteht (Frandsen et al. 2006; Frandsen et
al. 2012). Mittels PCR und Southern Blot-Analyse wurde dort festgestellt, dass die
Gesamtheit der stabil transformierten Pilzsporen den gleichen Genotyp aufweist.
Nach der Optimierung dieses Schritts wird es möglich sein, mit den so in einzelnen
Generationen gewonnenen, größeren Sporenmengen, die molekularen Methoden wie
Southern Blot-Analyse anzuwenden.
ZUSAMMENFASSUNG 96
5. Zusammenfassung
Rostpilze, die Hauptvertreter der Basidiomyceten, sind obligat biotrophe Parasiten und
stellen weltweit eine wichtige Gruppe von Phytopathogenen an wirtschaftlich bedeutenden
Kulturpflanzen dar. Der Rostpilz Uromyces fabae wurde als Modellorganismus intensiv
erforscht, um zytologische, biochemische und molekulare Vorgänge während der Interaktion
mit der Wirtspflanze Vicia faba aufzuklären. Die Untersuchung wichtiger molekularer
Vorgänge in obligat biotrophen Pilzen wird jedoch aufgrund der Tatsachen erschwert, dass
erstens diese Organismen in künstlichen Medien nicht kultivierbar sind und keine
authentische Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro hergestellt werden kann sowie zweitens
kein universell funktionierendes System für eine stabile Transformation von obligat
biotrophen Pilzen existiert. Moderne genetische Methoden wie Überexpression, Silencing
oder Tagging von Genen sind daher nicht anwendbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden, Biolistik und
Agrobacterium tumefaciens mediierter Transformation (ATMT), eine transiente
Transformation von U. fabae erreicht und eine Basis für ein stabiles Transformationssystem
geschaffen. Es wurde ein Set von Plasmiden erstellt, welche Farb- und/oder Fungizidmarker
zur Selektion tragen, die unter die Kontrolle von endogenen regulatorischen Elementen
gesetzt wurden. Promotor- und Terminator-Elemente von Uf-PMA1 (U. fabae
Plasmamembran ATPase) wurden benutzt, um die Expression der Farbmarker iGFP (intron
green fluorescent protein) und DsRed (red fluorescent protein) sowie des Fungizidmarkers
mut-SucDH1 (mutierte Succinat-Dehydrogenase) zu kontrollieren.
Die erfolgreiche Transformation mit den Fluoreszenzfarbmarkern iGFP und DsRed in vitro
wurde durch die subzelluläre Lokalisierung der DsRed-NLS Expression in den Zellkernen
eindeutig bewiesen.
Als Fungizidmarker wurden Punktmutationen in die Uf-SucDH1 (H254Y für Plasmidkonstrukt
pRV111 und H254L für pRV113) und Uf-TBB1 (E198A) eingefügt, welche die Resistenz gegen
die Fungizide Carboxin und Benomyl vermitteln. Für die Expression von Uf-TBB1(E198A)
wurde der gesamte genomische Bereich mit endogenen regulatorischen Elementen
verwendet. Die beiden Fungizide konnten erfolgreich für eine Selektion der Transformanten
in planta etabliert werden. Mit dem angepassten Selektionsschema konnten wichtige
Parameter für die ATMT ermittelt werden, sowie durch Verwendung von drei
ZUSAMMENFASSUNG 97
Agrobacterium-Stämmen die Faktoren optimiert werden, die eine Erhöhung der
Transformationseffizienz gewärleisten. Mittels Biolistik oder Agrobakterien transformierte
Uredosporen konnten somit in großer Anzahl als Transformantenlinien erzeugt und über
mehrere Generationen in planta propagiert werden.
Bei der Biolistik wurde für die Plasmide pRV111 (tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1) und
pRV113 (H254L) eine Transformationseffizienz von 7,1 x 10-5 bzw. 5,3 x 10-5 erreicht. Bei der
ATMT konnte mit dem gleichen Transgen je nach verwendetem Agrobacterium Stamm eine
Effizienz von 3,6 x 10-5 (AGL-1), 2,5 x 10-5 (GV3103) und 1,4 x 10-5 (LBA1100) erzielt werden.
Molekulare Analysen der potentiell transformierten Uredosporen ergaben unterschiedliche
Nachweise der Transformation, basierend auf der Amplifikation der Gen-Kassette und
schließlich dem Nachweis der Punktmutation und damit einer wahrscheinlichen Integration
der transgenen SucDH1(H254Y).
SUMMARY 98
6. Summary
Obligate biotrophic fungi like the rust- and the powdery mildew fungi are important plant
pathogens and consequently of high economical interest. The rust fungus Uromyces fabae
and the interaction with its host plant Vicia faba have been an important model system for
biochemical, molecular and cytological studies for several years. However, the analysis of
the molecular details underlying obligate biotrophic host-parasite interactions has proven
difficult. The challenge is mainly based on two facts: 1) the impossibility of producing
authentic host-parasite interface in vitro and 2) the lack of a universal system to stably
transform obligate biotrophs. This excludes them from the application of a variety of
modern techniques successfully used with other pathogens, such as gene overexpression,
silencing or gene targeting.
This work presents the transformation of the obligate biotrophic rust fungus Uromyces fabae
using two methods, biolistics and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
(ATMT), the establishment of transient transformation and a basis for a stable
transformation system. A set of plasmids was used for expressing color and/or selection
markers under control of endogenous genetic elements. Promoter and terminator elements
which stem from the U. fabae gene Uf-PMA1 were used to drive expression of the color
markers iGFP (intron green fluorescent protein) and DsRed (red fluorescent protein) as well
as the selection marker mut-SucDH1 (succinate dehydrogenase). Biolistic bombardment of
urediospores with iGFP and DsRed in vitro and a DsRed-NLS variant targeted to the nucleus
resulted in successful transient transformation of U. fabae. Similar numbers of
transformants were obtained in vitro with constructs carrying carying the fluorescent marker
genes iGFP (2,4 x 10-5) and DsRed (2,9 x 10-5).
Additionally, we were able to show that the fungicides Benomyl and Carboxin can be
successfully used for in planta selection of potential transformants. The genes encoding the
targets for Benomyl, ß-tubulin (Uf-TBB1), and Carboxin, Succinate Dehydrogenase (Uf-
SucDH1) were used and single point mutations responsible for conferring resistance to these
fungicides in other organisms were introduced into the respective U. fabae genes obtaining
plasmids pRV111 (SucDH1(H254Y) and pRV113 (H254L). Endogenous regulatory elements of
the Uf-TBB1 were used to drive expression of the Uf-TBB1(E198A) construct.
SUMMARY 99
After establishment and optimization of the selection procedure in planta, important
parameters for ATMT and higher efficiency were determined using three different
Agrobacterium strains. Hence, using both, biolistic and ATMT approach, a large number of
transformant urediosporelines were generated and propagated with the selective agent
Carboxin.
Transformation efficiency in planta was highest by biolistic bombardment with tPMA1-
SucDH1(H254Y)-pPMA1 (7,1 x 10-5) and H254L (5,3 x 10-5). Using the same tPMA1-
SucDH1(H254Y)-pPMA1 gene in ATMT, different efficiencies were found depending on the
used strain: 3,6 x 10-5 (AGL-1), 2,5 x 10-5 (GV3103) and 1,4 x 10-5 (LBA1100). Molecular
analysis of potential transformants resulted in different proofs of transformation, based on
amplification of the transformation cassette and finally the proof of the point mutation in
the SucDH1(H254Y) gene. The latter is the best evidence so far for a possible integration of
the used transgenes in the U. fabae genome.
LITERATUR 100
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ANHANG 112
8. Anhang
8.1 Propagation einzelner Uredia aus S1 für S2
Abbildung 8.1: Ausbringung von Einzelrostpusteln auf Ackerbohnenblätter. (A): Resuspendieren in 50 µl Kerosin und Aufsprühen mittels Airbrush-Pistole HP-200; (B): In 50 µl resuspendierte Sporen wurden auf Pflanzenblätter pipettiert und mit gewöhnlichen Laborlöffel verstrichen; (C): Einzelrospustel wurde auf mit Wasser angefeuchteten Pflanzenblätter gegeben und mit einem Laborlöffel verstrichen. Die Uredosporenlager wurden ausgezählt, (n = 8 pro Variante), dabei ergaben sich folgende Mittelwerte: A = 6, B = 17, C = 51 Uredia pro Blatt. Demnach hat die Ausbringungsmethode (C) die besten Ergebnisse und wurde für alle weiteren Versuche verwendet.
[A] [B] [C]
a
ANHANG 113
Tabelle 8.1: Biolistische Trans-formation mit pRV111 und pRV113. Anzahl der Uredo-sporenlager in S1 mit Carboxin. Jeweils sechs Blätter entsprechend sechs biolistischen Beschüssen mit den Plasmiden pRV111 und pRV113.
A B
B1 1 2 B2 0 0 B3 1 1 B4 11 1 B5 12 3 B6 25 5 B7 0 1 B8 0 2 B9 9 1 B10 11 4 B11 1 0 B12 0 1 B13 2 12 B14 5 9 B15 20 3 B16 13 0 B17 20 1 B18 17 2 B19 6 0 B20 12 6 B21 11 7 B22 5 15 B23 10 1 B24 8 18 B25 26
B26 12 B27 9 B28 18 B29 15 B30 7 B31 6 B32 5 B33 14 B34 11 B35 5 B36 2
Tabelle 8.3: Biolistische Trans-formation mit der Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1. Verwendete Plasmide für Präparation A: pRV111 (n = 16) und B: pRV113 (n = 20), Zahl der selektionierten Uredia in der S1 mit Carboxin.
Tabelle 8.2: Biolistische Trans-formation mit dem Doppelkon-strukt pRV111::DsRed. Anzahl der Uredia aus S1 mit Carboxin für zwei Transformations-ansätze mit je 10 Beschüssen.
8.2 Zählungen einzelner Uredia (Biolistik) aus S1
A B
B1 0 10 B2 9 0 B3 42 1 B4 1 0
B5 3 6 B6 0 17 B7 100 29 B8 41 0
B9 6 28 B10 31 19
B11 7 10
B12 1 0 B13 25 3 B14 1 2 B15 14 1 B16 7 0
B17
50 B18
0
B19
19 B20
0
C
B1 11 B2 12 B3 25
B4 9 B5 11 B6 13 B7 20
B8 17
B9 14 B10 10 B11 6 B12 23 B13 19 B14 4 B15 11
B16 15
ANHANG 114
Abbildung 8.2: Gradient-PCR für SNP-PCR Primer. U.f. WT-DNA aus verschiedenen Präparationen: (a) Kugelmühle mit ungekeimten Sporen und (b) Präparation aus gekeimten Sporen; Proben 1: 87 ng (a); 2: 174 ng (a); 3: 86 ng (b); 4: H2O-Kontrolle. A: Primer SNP Suc WT + SucDH1 SNPrev2 (P3 + P5); B: Primer SucDH1 SNPrev2 + SNP Primer Suc (P3 + P4). Vgl. Abb. 3.18.
bp
1000
700 500
bp
1000
700 500
[A]
[B]
65,1 °C 65,5 °C 65,9 °C 66,5 °C
65,1 °C 65,5 °C 65,9 °C 66,5 °C
M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Tabelle 8.4: Biolistische Transformation mit der Kassette aus pRV111 und pRV113. Anzahl der Uredosporenlager aus den einzelnen Selektionsrunden in planta. L: Transformanten-Linie; Sx: Selektionsrunde X.
pRV111 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 L1 3 0
L2 2 0 L3 2 0 L4 27 2 L5 17 0 L6 10 6 42 3 10 9 9 0
L7 4 0 L8 2 1 6 1 1 8 4 10 0
L9 11 0
pRV113 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 L1 2 0
L2 1 2 11 23 3 10 50 5 23 L3 3 0
L4 8 0 L5 3 0
Oligos:
SNP Suc + SucDH1 rev2
ANHANG 115
8.3 Zählungen einzelner Uredia (ATMT) aus S1
Tabelle 8.5: Auszählung der Uredosporenlager in der S1 nach Transformation mit pRV101 Plasmid durch ATMT. Agrobakterien Stämme (links) und dazugehörige Auszählungen auf den Pflanzenblättern sind gekennzeichnet mit B1 (Blatt 1) bis B30 (Blatt Nr. 30).
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30
AGL-1pRV101 1 35 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 4 0 0 0
LBA1100pRV101 1 0 1 10 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0
GV3103pRV101 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 25 0 3 0 0 0 1 0 0 25 15 0 0
Tabelle 8.6: Einfluss von Acetosyringon auf die Induktion der Agrobacterium-Stämme. Anzahl von Uredosporenlagern in der ersten Selektionsrunde mit Carboxin. Varianten (Var.): Induktionsmedium mit 200 µM Acetosyringon (+ AS) und ohne Acetosyringon-Zugabe (- AS); n = 16 Blätter (B1-B16).
Stamm Var. B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16
LBA1100 + AS 3 5 8 0 10 6 5 1 0 5 8 18 13 7 5 0
‒ AS 0 0 0 1 0 2 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0
AGL-1 + AS 24 6 13 10 4 1 0 19 21 25 18 29 19 20 26 16 ‒ AS 0 1 0 0 0 3 1 2 1 3 1 0 1 1 0 0
GV3103 + AS 6 7 0 0 1 0 8 16 18 23 24 1 21 16 14 20
‒ AS 0 0 0 0 0 1 2 0 1 0 1 1 1 0 2 1
ANHANG 116
Tabelle 8.7: Einfluss des Verhältnisses Agrobakterien zu Uredosporen bei ATMT. Anzahl der Uredosporenlager in der ersten Selektion (S1) mit Carboxin. Mit pRV112 transformierte Agrobacterium-Stämme: AL112 (LBA1100); AA112 (AGL-1) und AG112 (GV3103). Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen 1 : 38,5 (a), 1 : 100 (b) und 1 : 200 (c) mit errechneten Mittelwerten (MTW) und Standardabweichung (STDEV).
AL112 a b c
AA112 a b c
AG112 a b c B1 0 26 3
B1 0 15 1
B1 1 13 2
B2 0 7 1
B2 1 1 3
B2 1 2 4 B3 0 5 1
B3 0 24 5
B3 1 9 12
B4 0 1 2
B4 0 3 0
B4 0 0 6 B5 0 1 1
B5 2 8 0
B5 1 18 7
B6 1 1 0
B6 0 16 0
B6 2 0 1 B7 1 3 0
B7 0 6 8
B7 0 19 0
B8 1 16 0
B8 1 12 1
B8 0 5 0 B9 3 0 1
B9 0 0 0
B9 0 1 0
B10 0 1 6
B10 3 1 7
B10 1 4 2 B11 1 15 4
B11 0 15 6
B11 4 15 5
B12 1 23 8
B12 1 24 2
B12 1 8 3 B13 1 13 5
B13 0 0 5
B13 0 17 1
B14 1 9 2
B14 0 9 1
B14 0 0 0 B15 2 1 1
B15 9 0 0
B15 1 13 0
B16 1 2 1
B16 0 29 16
B16 0 12 2 B17 0 0 0
B17 0 0 3
B17 5 2 3
B18 0 1 1
B18 0 24 5
B18 1 16 5 B19 3 21 0
B19 1 19 2
B19 0 14 7
B20 4 14 3
B20 0 31 0
B20 1 1 11 B21 1 6 5
B21 1 8 2
B21 2 0 5
B22 1 17 4
B22 0 27 11
B22 1 13 4 B23 1 5 9
B23 6 18 1
B23 0 0 1
B24 0 2 12
B24 1 0 0
B24 0 1 0 B25 2 0 2
B25 0 35 0
B25 0 2 6
B26 0 0 1
B26 5 4 6
B26 1 19 3 B27 0 1 1
B27 1 11 0
B27 1 0 9
B28 1 0 0
B28 0 23 7
B28 2 6 2 B29 0 2 0
B29 1 18 0
B29 1 1 7
B30 0 0 1
B30 2 0 9
B30 0 11 13 B31 1 6 3
B31 0 25 17
B31 0 8 3
B32 1 17 0
B32 4 1 14
B32 0 17 0 B33 1 0 5
B33 0 6 1
B33 -- 0 0
B34 3 1 5
B34 0 19 0
B34 -- 16 0 B35 4 3 13
B35 0 22 2
B35 -- 12 1
B36 5 16 10
B36 2 16 7
B36 -- 5 1 B37 2 2 6
B37 0 0 --
B37 -- -- 5
B38 2 0 1
B38 0 38 --
B38 -- -- 0 B39 -- 0 2
B39 -- 19 --
B39 -- -- 0
B40 -- 1 1
B40 -- 26 --
B40 -- -- 1
MTW 1 6 3
MTW 1 14 4
MTW 1 8 3 STDEV 1,3 7,4 3,4
STDEV 1,9 11,0 4,7
STDEV 1,1 6,7 3,5
ANHANG 117
Tabelle 8.8: ATMT mit drei verschiedenen Stämmen. Auszählungen der selektionierten Uredia in S1 nach Selektion mit Carboxin. Bezeichnungen AL112: LBA1100pRV112 (n = 70); AA112: AGL-1pRV112 (n = 70) und AG112: GV3103pRV112 (n = 66).
AL112
AA112
AG112 B1 26 B36 16
B1 15 B36 16
B1 13 B36 5
B2 7 B37 2
B2 1 B37 0
B2 2 B37 21
B3 5 B38 0
B3 24 B38 38
B3 9 B38 15
B4 1 B39 0
B4 3 B39 19
B4 0 B39 11
B5 1 B40 1
B5 8 B40 26
B5 18 B40 6
B6 1 B41 2
B6 16 B41 18
B6 0 B41 2
B7 3 B42 1
B7 6 B42 7
B7 19 B42 13
B8 16 B43 1
B8 12 B43 22
B8 5 B43 9
B9 0 B44 3
B9 0 B44 10
B9 1 B44 15
B10 1 B45 12
B10 1 B45 8
B10 4 B45 20
B11 15 B46 23
B11 15 B46 6
B11 15 B46 18
B12 23 B47 6
B12 24 B47 12
B12 8 B47 32
B13 13 B48 0
B13 0 B48 16
B13 17 B48 12
B14 9 B49 21
B14 9 B49 29
B14 0 B49 26
B15 1 B50 3
B15 0 B50 38
B15 13 B50 5
B16 2 B51 1
B16 29 B51 6
B16 12 B51 3
B17 0 B52 0
B17 0 B52 17
B17 2 B52 11
B18 1 B53 6
B18 24 B53 1
B18 16 B53 10
B19 21 B54 2
B19 19 B54 5
B19 14 B54 9
B20 14 B55 5
B20 31 B55 36
B20 1 B55 6
B21 6 B56 1
B21 8 B56 29
B21 0 B56 25
B22 17 B57 1
B22 27 B57 16
B22 13 B57 14
B23 5 B58 0
B23 18 B58 18
B23 0 B58 12
B24 2 B59 1
B24 0 B59 2
B24 1 B59 5
B25 0 B60 14
B25 35 B60 9
B25 2 B60 4
B26 0 B61 5
B26 4 B61 21
B26 19 B61 1
B27 1 B62 0
B27 11 B62 25
B27 0 B62 0
B28 0 B63 18
B28 23 B63 26
B28 6 B63 12
B29 2 B64 4
B29 18 B64 16
B29 1 B64 27
B30 0 B65 1
B30 0 B65 11
B30 11 B65 23
B31 6 B66 0
B31 25 B66 15
B31 8 B66 1
B32 17 B67 5
B32 1 B67 18
B32 17 B67 --
B33 0 B68 0
B33 6 B68 9
B33 0 B68 --
B34 1 B69 1
B34 19 B69 12
B34 16 B69 --
B35 3 B70 1
B35 22 B70 15
B35 12 B70 --
MTW 5
MTW 15
MTW 10 STDEV 7
STDEV 10
STDEV 8
ANHANG 118
T
WT
[A] [B]
Abbildung 8.4: Erste Selektion (S1) mit Carboxin. Transformiert mit A: Biolistik; B: ATMT Methode.
8.4 Abbildungen verschiedener Selektionen in planta
Abbildung 8.3: Zeitlicher Unterschied in der Kei-mung zwischen WT und Transformanten. Bildung von Uredosporenlagern bei U. fabae Transformanten (links, T) und Wildtyp (rechts, WT). Das um einige Tage verzögerte Wachstum konnte bei jeder Transfor-mantenlinie festgestellt werden.
ANHANG 119
[A]
[B]
[A] [B]
Abbildung 8.5: Propagierte Transformationslinien in planta nach ATMT. Gleiche Linie propagiert in A: S2 und B: S3.
Abbildung 8.6: Propagierte Transformationslinien in planta nach Biolistik. Gleiche Linie propagiert in A: S6; B: S7.
ANHANG 120
DNA-Präparationen und Behandlung:
(a): Aus gekeimten Sporen
(b): Aus ungekeimten Sporen
(c): mit Präparation- Kit
(d): mit REPLI-g amplifiziert
Probenauftragung:
1: 60 µg (a)
2: 6 µg (a)
3: 0,6 µg (a)
4: 6 µg (c)
5: 6 µg (c)
6: 6 µg (b)
7: 6 µg (b)
8: (c) + (d)
9: (c) + (d)
10: (b) + (d)
11: (b) + (d)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 kb
3
2,4
1
[A]
[B]
8.5 Southern Blot Analysen
8.5.1 Verschiedene DNA-Menge und –Präparation für DIG-Markierung
Abbildung 8.7: Southern Blot mit verschiedenen Mengen und Präparationen von U. fabae WT-DNA. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B: Southern Blot (Autoradiographische Aufnahme).
ANHANG 121
Probenauftragung:
1: U.f. x EcoRI 60 µg
2: U.f. x EcoRI 30 µg
3: U.f. x EcoRI 10 µg
4: pRV112 x EcoRI 10 ng
[A]
[B] [C] [D]
kb 2,4
kb 2,4
kb 2,4
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M
8.5.2 Vergleich von DIG und 32P Sonden-Markierung
Abbildung 8.8: Southern Blot-Vergleich der Sonden-Markierung DIG / 32P. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B: Autoradiographische Aufnahmen des Southern Blot, DIG- Markierung, Exposition für 3 h; C: 32P-Markierung, Exposition 3 h und D: 32P-Markierung, Exposition 60 h.
ANHANG 122
8.5.3 32P Markierung
Abbildung 8.9: 32P-Markierung von genomischer und Plasmid DNA. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B, C: Autoradiographische Aufnahmen.
kb
4 3
2,4
1
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Probenauftragung:
1: 60 µg U.f.
2: 30 µg U.f.
3: 15 µg U.f.
4: 10 µg U.f. (unverdaut)
5: 10 ng pRV112
6: 20 ng pRV112
7: 50 ng pRV112
8: 100 ng pRV112
9: 20 ng pRV112
[A]
[B] [C]
texp.
2 h
5 h
DANKSAGUNG 123
9. Danksagung
Mein Dank gilt vielen Personen der Arbeitsgruppe Prof. Mendgen und Prof. Voegele sowie
der ganzen Universität Konstanz und der Universität Hohenheim. Natürlich möchte ich
einige Personen hier hervorheben denen mein besonderer Dank gilt.
Prof. Mendgen danke ich sehr für die Möglichkeit zur Promotion an seinem Lehrstuhl und an
seinem stetigen Interesse an meiner Arbeit und hilfreichen Anregungen und Diskussionen.
Prof. Vögele möchte ich besonders danken für die Betreuung, Unterstützung, Diskussionen,
Geduld und darüber hinaus offenem Ohr für alle Angelegenheiten. Trotz seinem turbulenten
Karriereverlauf und zahlreichen Verpflichtungen war es stets immer da wenn man ihn
wirklich gebraucht hat.
Prof. van Kleunen Danke ich für die Möglichkeit, meine Arbeit in seinem Labor fortzusetzen
und für eine sehr nette Atmosphäre in seinem Labor.
Großer Dank gilt Dipl.-Ing. Heinz Vahlenkamp für seine überaus hilfreiche, pragmatische,
sehr engagierte und freundliche Art die mich in allen Schritten meiner Arbeit begleitet hat.
Annette Schmid gilt an dieser Stelle besonderer Dank für die gemeinsame Zeit im Labor und
für Ihre große Unterstützung in experimentellen und vielen anderen Angelegenheiten.
Christine Giele Danke ich für Erweiterung meiner Mikroskopischen Fähigkeiten und Arbeiten
mit Uredosporen, und Elisabeth Rehn für ihre große Unterstützung in organisatorischen
Fragen und Antworten.
Verena Geyer und besonders Otmar Ficht danke ich für die Betreuung von Pflanzen im
Gewächshaus und vielen Hilfestellungen und praktischen Lösungen.
Allen Kollegen die mich mit Diskussionen, Anregungen, Ermunterung und Grillabenden
begleitet haben vor allem Klara Pretsch, Tobias Link, Jan Nechwatal, Stefan Kunz, Carolin
Bogs und Michael Ernst, ein großer Dank sowie allen anderen Mitgliedern der AG Mendgen,
für die sehr schöne Zeit in und außerhalb des Labors.
Mitarbeitern der AG Cook: Dr. David Schleheck, Sabine Lehmann und anderen sowie der AG
van Kleunen danke ich für Ratschläge und Unterstützung in allen Fragen.