全式金 张宏晓

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细胞凋亡概念

细胞凋亡影响

细胞凋亡检测方法

实验细节

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• 凋亡（apoptosis）是细胞对环境的生理性病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

• 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。

• 两者在形态变化、生物化学特征、分子调节机制等诸多方面有本质区别，但在形态学和生化机制上有时有交叉，并具有某些共同的特征。

细胞凋亡与细胞坏死

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细胞凋亡与细胞坏死

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细胞凋亡与细胞坏死

细胞凋亡 细胞坏死

形态特征

生理或病理性 膜结构改变，膜的完整性逐步丧失 染色质皱缩 细胞器完整 形成凋亡小体

多为病理性或外界因素导致 膜完整性迅速丧失 染色质呈絮状 细胞肿胀、溶解 无凋亡小体形成

生化特征

过程中需要能量 DNA断裂为非随机，逐渐断裂成180-200

bp DNA片段 一般需要基因调节

非能量依赖过程 DNA随机断裂，发生较晚 一般不需要基因调节

生理状态 多为单个细胞死亡 巨噬细胞或邻近细胞吞噬 无炎症反应

多为细胞群体死亡 巨噬细胞吞噬 有明显的炎症反应

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• 确保正常发育、生长；

• 具有修复功能 如：清除受损、衰老的细胞；

• 防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡；

细胞凋亡的生理意义

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细胞凋亡失衡 • 凋亡不足

癌症：肿瘤细胞过度生长

自身免疫性疾病：类风湿性关节炎

• 凋亡过度

神经元退行性疾病：阿尔茨海默氏病

心肌缺血、再灌注损伤

• 凋亡过度与凋亡不足

动脉粥样硬化：平滑肌凋亡不足，内皮细胞凋亡过度

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细胞凋亡的过程 • 形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的。

• 细胞体积缩小，连接消失。

• 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C

到胞浆。

• 胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍

然完整。

• 核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180 bp-200 bp片段。

• 最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，凋亡小体可迅速被

周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

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细胞凋亡检测方法

• 形态学检测（细胞整体状态）

• 核染色检测（细胞核形态）

• 线粒体膜电势检测（JC-1、JC-10）

• 特定蛋白检测（凋亡相关蛋白检测）

• 流式细胞术（Annexin V）

• 核酸检测（TUNEL、电泳）

• ……

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正常细胞 凋亡细胞

细胞凋亡检测方法-形态学检测

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细胞凋亡检测方法-核染色检测

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细胞凋亡通路

Xiong, S.B., et al., 2014. Mitochondria-mediated apoptosis in mammals. Protein & Cell, 5(10), 737-749.

Obexer, P., and Ausserlechner, M.J., 2014. X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein – A Critical Death Resistance Regulator and Therapeutic

Target for Personalized Cancer Therapy. Front Oncol, 4, 197.

内源性 外源性

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细胞凋亡检测--特定蛋白检测

[1] Li Zhang, et al., Scientific Reports, 2017

[2] Qing Dongz, et al., Cellular Physiology and Biochemistry,2018

Fucoxanthin suppressed TBI-induced apoptosis and oxidative stress

Mst1-mediated mitochondrial fission impairs the ESCs viability and migration by activating the

mitochondrial apoptosis pathway and releasing HtrA2/Omi

Cytochrome C

Caspase 3

Caspase 9

Bcl2

Bax

......

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细胞凋亡检测—早期凋亡检测

TransDetect® Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit； TransDetect® Annexin V-EGFP/PI Cell Apoptosis Detection Kit； TransDetect® Annexin V-PE/TransDG Cell Apoptosis Detection Kit； TransDetect® Annexin V-PE/7-AAD Cell Apoptosis Detection Kit；

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• Annexin V

• 是检测早期细胞凋亡的最灵敏指标之一。Annexin V是一种与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力的

Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，因此能够利用Annexin V与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)相结

合的性质，检测细胞的早期凋亡。

• 碘化丙啶 (PI)

• 是一种核酸染料，它不能透过具备完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞，但能够透过凋亡

中晚期的细胞和坏死细胞的细胞膜而将细胞核染色，在特定激发光条件下呈现红色。

细胞凋亡检测—Annexin V/PI

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FITC

PI

Annexin V 结果分析

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Annexin V 结果展示

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Annexin V实验细节

• 细胞状态

• 细胞操作

• 细胞消化

• 对照设置

• 细胞自发荧光

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• 细胞状态

• 细胞操作

• 细胞消化

• 对照设置

• 细胞自发荧光 阴性对照（不染色） 单染FITC对照 单染PI对照

Annexin V实验细节

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• 细胞状态

• 细胞操作

• 细胞消化

• 对照设置

• 细胞自发荧光

Annexin V实验细节

补偿调节前 补偿调节后

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• 细胞状态

• 细胞操作

• 细胞消化

• 对照设置

• 细胞自发荧光

Annexin V实验细节

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细胞凋亡检测—电泳检测

NIH-3T3凋亡细胞系中DNA梯形条带的快速检测

Lane M：分子量标准（1Kb） Lane 1: 未处理细胞 Lane 2: H2O2处理细胞。

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单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis, SCGE）又称为彗星电泳（comet assay），是一种以“彗星”出现多少，彗尾的荧光长度和强度等作为指标，来检测细胞凋亡程度的方法。 其原理是用细胞裂解液破坏细胞生物膜后，蛋白质等成份扩散到裂解液中，而核DNA仍可附在核骨架上。SCGE时，凋亡细胞的断裂DNA迁移速度和迁移距离数倍于正常细胞的核DNA，向凝胶阳极伸展，呈现脱离细胞核、具有头部和尾部的“彗星”状；而DNA未受损伤细胞，因DNA相对分子质量大而停留在核基质中，无拖尾现象。

细胞凋亡—彗星电泳检测

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细胞凋亡—TUNEL法检测 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 来源：牛胸腺（Bos DNTT） 表达：大肠杆菌 特点：一种无需模板的DNA聚合酶，随机地催化脱氧核苷酸（dNTP）结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单、双链DNA分子均可作为TdT的底物。

TransDetect® In Situ Fluorescein TUNEL Cell Apoptosis Detection Kit

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Terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP Nick End Labeling (末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法 )

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp整数倍的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在 TdT的催化下连接上荧光素标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

细胞凋亡—TUNEL法原理

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利用TdT酶的催化，以细胞内断裂的DNA作为底物，将暴露的DNA 3’-OH与dUTP 连接，其催化反应的结果为将断裂DNA的3’末端延伸、标记为带有荧光标记的脱氧核苷酸单链。本产品可用于原位或非原位的标记断裂的DNA分子。

细胞凋亡—TUNEL法应用

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细胞凋亡—TUNEL法结果展示

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细胞凋亡概念

细胞凋亡影响

细胞凋亡检测方法

实验细节

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