31/10/2012

1

Transporte ativo Transporte ativo e e ATPasesATPases

Profa. Jennifer Lowe

IBCCF – UFRJ

lowe@biof.ufrj.br

Composição e Estrutura Molecular das Membranas Biológicas

31/10/2012

2

Modelo do Mosaico FluidoSinger e Nicolson (1972)

COMPONENT INTRACELLULAR CONCENTRATION (mM)

EXTRACELLULAR CONCENTRATION (mM)

Cations

Na+ 5-15 145

K+ 140 5

Mg2+ 0.5 1-2

Ca2+ 10-4 1-2

H+ 7 × 10-5 (10-7.2 M or pH 7.2) 4 × 10-5 (10-7.4 M or pH 7.4)

Anions*

Cl- 5-15 110

* The cell must contain equal quantities of positive and negative charges (that is, be electrically neutral). Thus, in addition to Cl-, the cell contains many other anions not listed in this table; in fact, most cellular constituents are negatively charged (HCO3

-, PO43-, proteins, nucleic acids, metabolites carrying phosphate and carboxyl

groups, etc.). The concentrations of Ca2+ and Mg2+ given are for the free ions. There is a total of about 20 mM Mg2+ and 1-2 mM Ca2+ in cells, but this is mostly bound to proteins and other substances and, for Ca2+, stored within various organelles.

Comparação da Concentração de ÍonsIntra e Extracelular (mamífero):

31/10/2012

3

Composição dos CompartimentosIntracelular e Extracelular

Tipos de Transporte Através das Membranas Biológicas

Transporte passivo Transporte ativo

31/10/2012

4

Classes de Transportadores

•Número de substratos transportados•Direção na qual é transportado.

Transportador de glicose em eritrócitos

Trocador cloreto-bicarbonado emeritrócitos

Transportador de glicose em célulasde epitélio intestinal

Transporte AtivoMovimento de moléculas através da membrana contra um gradiente de concentração ou gradiente eletroquímico.

Primário Secundário

ATPases: P, V, F e ABC Na+ e H+

31/10/2012

5

Transporte ativo secundário- transportadores acoplados –

O gradiente iônico fornece energia para o transporte ativo secundário

Transporte Ativo SecundárioPresente em Praticamente Todos os Organismos

Captação de lactose em bactéria E. coli.

31/10/2012

6

Molécula de ATP

Ligação fosfo-anidro

ATP

• Usado direta e indiretamente como fonte de energia química nos sistemas biológicos.

• Todos os tipos celulares são impermeáveis ao ATP –reciclado dentro da célula.

• Todas as células catalisam o ciclo de síntese e hidrólise de ATP.

31/10/2012

7

31/10/2012

8

Transferência de fosforila

• Utilizada para impulsionar reações, que sem ela seriam endergônicas.

• ATP é um carreador ativado de fosforilas porque a transferência de fosforila é um processo exergônico.

• Altera a energia de conformação de uma proteína ou serve como sinal para modificar a atividade de uma proteína.

Moeda Energética da Célula- Reações acopladas -

31/10/2012

9

ATPases

• Enzimas que se ligam a molécula de ATP, hidrolisam esta molécula para realizar suas funções em uma célula.

– Manutenção dos gradientes eletroquímicos (ATPases )– Enovelamento de proteínas (HSPs)– Função intracelular (miosina)– Função extracelular (ecto-ATPases)– Função nuclear

• ATPases não transportadoras e ATPases transportadoras.

ATPases Transportadoras

• Proteínas integrais de membrana responsáveis por diversos processos biológicos e/ou fisiológicos por serem capazes de fornecer a energia necessária por elas requeridas.

– Controle do volume celular– Potencial de repouso e sua recuperação– Relaxamento muscular– Balanço do pH intracelular– Digestão de alimentos– Transporte vetorial entre dois compartimentos celulares

contra gradiente de potencial eletroquímico

31/10/2012

10

ATPases Transportadoras

• Grande estudo nos últimos 50-60 anos por diversas razões:

– Facilmente classificadas em poucas categorias (famílias)

– ATPases transportadoras tem papel relevante em doenças humanas

– Estudos de relação estrutura-função

– Prêmio Nobel de Química

Importâncias da ATPases na Fisiologia Humana

• Manutenção dos potenciais de membrana

• Regulação da composição e volume dos fluidos corporais

• Manutenção dos gradientes eletroquímicos (transporte ativo primário e consequentemente o transporte ativo secundário)

– Captação de nutrientes

– Excreção de metabólitos, de substâncias estranhas e/ou tóxicas ao organismo

31/10/2012

11

Alterações funcionais de sistemas biológicos

• Mutações nos genes

• Doenças genéticas Proteínas

– Não-funcionais– Parcialmente funcionais– Falhas no endereçamento de proteínas– Falhas no enovelamento de proteínas– Alteração nos processos regulatórios

Classificação das ATPases

• F-ATPases

• P-ATPases

• V-ATPases

• ABC-ATPases

31/10/2012

12

Estrutura Geral das ATPases

F-ATPases - ATPsintase

ADP + Pi ATP

H+H+

H+ H+

Mit.

Citosol.

ADP + PiATP

31/10/2012

13

31/10/2012

14

Once transported inside a tumor cell, 3-BrPA inhibits ATP production by glycolysis by inhibiting mitochondrially bound hexokinase , a metabolic feature of many highly malignant tumors, and by inhibiting also ATP production by oxidative phosphorylation.

Geschwind JF, Ko YH, Torbenson MS, Magee C, Pedersen PL. Novel therapy for liver cancer: direct intraarterial injection of a potent inhibitor of ATP production.Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):3909-13.

3-Bromopyruvate

Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 5;324(1):269-75. Advanced Cancers: eradication in all cases using 3-bromopyruvate therapy to deplete ATP.

Ko YH, Smith BL, Wang Y, Pomper MG, Rini DA, Torbenson MS, Hullihen J, Pedersen PL.

Complete regression of an advanced abdominal tumor (HCC) after 3-BrPA Therapy. (A) Advanced HCC in “Two Dottie.” (B) Human equivalent. (C) Different treatment stages. (D) Tumor histopathology.

31/10/2012

15

P-ATPases

• P1: ATPases de metais pesados– Cd2+-ATPase

– Cu+-ATPase

– Hg2+-ATPase

– Zn2+-ATPase

• P2: ATPases clássicas– Na+,K+-ATPase

– Ca2+-ATPase (PMCA e SERCA)

– H+,K+-ATPase

• P3: ATPases bacterianas– K+-ATPases

Lutsenko e Kaplan, 1995

Biochemistry 34(48):15607-13

Axelsen, K.B. & Palmgren, M.G., 1998

J. Mol. Evol. 46464646: 84-101

Bacterianas

Metais pesados

Fosfolipideos

Sem especificidade

Ca2+, Mn2+; SERCA

Ca2+; PMCA

Na+/K+; H+/K+

H+

Mg2+

Na+?; Ca2+?

Árvore filogenética das P- ATPases

31/10/2012

16

P-ATPases

• Formam um intermediário fosforilado durante seu ciclo catalítico;

Catalytic cycle of P-type ATPases. The bold arrows correspond to the forward cycle of P-ATPases requiring ATP. The four steps are reversible. cyt., cytoplasmic; extra-cyt., extracytoplasmic.

Catty, P. et al., 2011. J

Biol Chem. 2011 21;286(42):36188-97.

Resíduo de ácido aspártico altamente conservado entre todas as P-ATPases (motif DKTGT)

31/10/2012

17

Acil-fosfato e Ester-fosfato

Serine(Threonine/Tyrosine)

Ester-phosphate

OHIC=O

OIC=O

Aspartate Acyl-phosphate

Catalytic phosphorylation

Regulatory phosphorylation

Hydroxylamine

P-ATPases

Na+,K+-ATPase

Bomba eletrogênica - 3Na+ para fora da célula e 2K+ para dentro da célula. Jens Skou, 1957

31/10/2012

18

Na+,K+-ATPase

• Doenças humanas relacionadas:

• Doença do rim policístico – Mutação do gene PKD1 promove alteração da localização da Na+,K+-ATPase. Assim há formação de cistos difusos, incontáveis e atingem os dois rins. É responsável por 10% dos casos de insuficiência renal terminal. Manifesta-se geralmente por cistos renais na 3ª - 4ª década de vida, podendo ser detectada antes dos 20 anos.

P-ATPases

Ca2+-ATPase

SERCA - Única ATPase cristalizada transporta 2Ca2+

para dentro doretículo.

Toyoshima et al., 2000

31/10/2012

19

Ca2+-ATPase

• Função

• Manter os níveis Ca2+ intracelulares baixos

• Responsável pela formação e manutenção dos estoques intracelulares de Ca2+

31/10/2012

20

Ca2+-ATPase

• Doenças relacionadas:

Doença de Brody – doença genética rara de origem muscular, devido a deficiência da captação de Ca2+

no retículo sarcoplasmático. Pacientes sofrem de intenso relaxamento muscular. Mutação no geneATP2A1 altera a expressão de SERCA1, a isoforma da Ca2+-ATPase de músculo estriado.

Berchtold et al., 2000. Physiological Reviews, 80(3): 1215-1265

Doença de Darier – doença genética rara cutânea, devido a mutação no gene ATP2A2, que codifica aisoforma SERCA2. Doença caracterizada por dermatoses e acantólise (diminuição ou perda da uniãoentre as células). Importância da sinalização do Ca2+ na homeostasia da epiderme.

Hovnanian A. 2004 Biochem Biophys Res Commun. 322(4):1237-44.

Cu+ ATPase

DEFICIÊNCIA DE COBRE

Kinky hair

Hipotonia Má formação de tecido conectivo

ACUMÚLO DE COBRE

Anéis de Kayser-Fleischer

Hepatotoxicidade

DOENÇAS DE MENKES E WILSON

Doença genética causada por mutações nas diferentes Cu+-ATPases

31/10/2012

21

Outras P-ATPases:

• H+,K+-ATPase

• H+-ATPase

• ATPases de Metais Pesados Não Essenciais– Cd2+

– Hg2+

– Pb2+

H+,K+-ATPase gástrica

31/10/2012

22

Omeprazol

• Inibidor específico da bomba de prótons gástrica, responsável pela produção de HCl nas células parietais.

• O medicamento Losec foi o fármaco mais vendido do mundo durante vários anos.

• US$ 6,3 bilhões, equivalem a quase metade do mercado norte-americano de remédios para doenças gastrointestinais e do metabolismo.

Metal pesado não essencial- resistência em plantas e bactérias -

• Mercúrio:

– Operon mer

– Fitoremediação: uso das plantas para degradar, remover ou estabilizar substâncias tóxicas do solo ou das águas contaminadas.

31/10/2012

23

Importância das P-ATPasesTransportadoras de Íons

Transporte de íons através das membranas biológicas, seja mediado ou contragradiente eletroquímico, são processos de fundamentai importância nas áreasda biofísica e bioquímica.

Os avanços mais recentes sobre a caracterização da estrutura da bomba SERCAem diferentes estágios fisiológicos desencadearam o entusiasmo paradesvendar os detalhes mecanísticos de processos de antitransporte de íonsnas ATPases do tipo P.

Caraterização computacional, mutacional, cristalografia de raios-X ou outrastécnicas estruturais fornecem valiosas informações para entender a variaçãode estados fisiológicos caracterizados pela ligação de cátions, de inibidores esítios de ligação de nucleotídeos, assim como suas consequências funcionais.

Inibidores que bloqueiam uma bomba de íons em um determinado estágiodefinido parece ter uma grande relevância terapêutica.

31/10/2012

24

V-ATPases

Transportadora de H+, diminuindo o pH de organelas e assim ativando proteases e outras enzimas hidrolíticas.

V-ATPases

Nishi & Forgac (2002)

Nature Reviews MolecularCell Biology 3; 94-103

Papel fisiológico

31/10/2012

25

V-ATPases

Função na membrana plasmática

Nishi & Forgac (2002)

Nature Reviews MolecularCell Biology 3; 94-103

31/10/2012

26

Transportadores do tipo ABC

ABC-ATPases(ATP Binding Cassete)

CFTR

Transporta íons cloreto em diversas células para formar muco (pulmão, pâncreas, intestino, fígado e etc)

ΔF508

G542X

G551D

N1303K

W1282X

Não enovela corretamente e é degradada rapidamente.

31/10/2012

27

Fibrose Cística

• Ou mucoviscidose afeta principalmente os pulmões e o tubo digestivo. Estimam-se que 2,5 milhões de pessoas no Brasil possam transmiti-la.

• É a principal doença diagnosticada pelo teste do pezinho, porque é a mais comum entre as doenças genéticas graves da infância.

• Se manifesta principalmente pela tosse crônica encatarrada, pneumonias freqüentes, obstrução intestinal nos primeiros dias após o nascimento, baixo peso e altura, fezes volumosas, mal digeridas e com restos de alimentos e excesso de gordura.

• Suor salgado é a característica do paciente (menor reabsorção de sódio pelas glândulas). Os portadores também têm uma mistura de sintomas respiratórios e gastrointestinais de graus variáveis (muco espesso).

Resistência a Múltipla DrogasTransportadores do tipo ABC e enzimas de detoxificação em hepatócitos

31/10/2012

28

Glicoproteína P(ex.: extrusão de quimioterápicos)